DE2703938A1 - Antibioticmischung, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende zubereitungen - Google Patents

Antibioticmischung, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende zubereitungen

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DE2703938A1 DE19772703938 DE2703938A DE2703938A1 DE 2703938 A1 DE2703938 A1 DE 2703938A1 DE 19772703938 DE19772703938 DE 19772703938 DE 2703938 A DE2703938 A DE 2703938A DE 2703938 A1 DE2703938 A1 DE 2703938A1
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Description

Die Erfindung betrifft die Antxbioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Züchten des neuen Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 unter submersen, aeroben Bedingungen, die Abtrennung dieser Mischung und die Isolierung der Faktoren A, B und C, ein Verfahren zur Herstellung dieser Antibioticmischung sowie diese Antibioticmischung enthaltende Zubereitungen zur Förderung des Wachstums und zur Behandlung von Zahnkaries und Akne. Sie betrifft ferner die Cj-C.-Alkylester, die C1-C5-ACyI-ester und die Thiol-C^-C^-carbonsäurederivate der A-7413 Faktoren A, B und C sowie die physiologisch verträglichen Salze der A-7413 Faktoren A, B und C und ihrer Cj-C^-Acylester und ihrer Thiol-C2-C4-carbonsäurederivate. Die Antibioticmischung A-7413 und die A-7413-Verbindungen stellen nützliche Mittel zur Förderung des Wachstums und zur Behandlung von Zahnkaries und von Akne dar.
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Die Antibiotica A-7413 sind neue Vertreter der schwefelhaltigen Thiostreptonfamilie der Antibiotica. Andere Vertreter dieser Familie sind Siomycin, Taitornycin, Thiostrepton und Thiopeptin B.
Die Gruppe der erfindungsgemäßen schwefelhaltigen Antibiotica wird als Gruppe der Antibiotica A-7413 bezeichnet.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Antibioticmischung A-7413, die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D, die C.-C.-Alkylester, die C.-C5-ACylester und die Thiol-C^-C.-carbonsäurederivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C und die physiologisch verträglichen Salze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C und deren C.-C5-ACylester und deren Thiol-C_-C4-carbonsäuradarivate bereitzustellen. Die Aufgabe der Erfindung ist ferner darin zu sehen, ein Verfahren zur Herstellung der Antibioticmischung A-7413 durch Züchten des neuen Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122, Abtrennen der Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium, Isolieren der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D und Herstellung der C.-C .-Alkylester, C1-C5-ACylester und der Thiol-C2-C4~carbonsäurederivate, der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C und der physiologisch verträglichen Salze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C und ihrer C.-C -Acylester und ihrer Thiol-C~-C.-Carbonsäurederivate anzugeben.
Die Erfindung betrifft nun eine Antibioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält; das Antibioticum A-7413 Faktor A, das Antibioticum A-7413 Faktor B, das Antibioticum A-7413 Faktor C und das Antibioticum A-7413 Faktor D; die Cj-C^Alkylester, die C^-C^Acylester und die Thiol-C_-C .-carbonsäurederivate der Faktoren A, B und C und die physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C und ihrer C.-C1.-Acylester und ihrer Thiol-C^C^carbonsäurederivate.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Antibioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält; des Antibioticums A-7413 Faktor A, des Antibioticums A-7413 Faktor B, des Antibioticums A-7413 C und des Antibioticums Λ-7Ί13 D; der C1-C.-Alkylester, der C1-C5-ACylester und der Thiol-C?-C4-carbonsäurederivate der Faktoren A, B und C und der physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C und ihrer C.-Cj.-Acylester und ihrer Thiol-C_-C4-carbonsäurederivate, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) den Mikroorganismus Antinoplanes sp. NRRL 8122 odar eine das Antibioticum A-7413 bildende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibioticums gebildet ist;
(b) gegebenenfalls die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt;
(c) gegebenenfalls aus der Antibioticmischung A-7413 die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C oder D isoliert;
(d) gegebenenfalls die C.-C4-Alkylester, die Cj-C^-Acylester oder die Thiol-C2-C--carbonsäurec
Faktoren A, B oder C bildet; und
oder die Thiol-C^-C.-carbonsaurederivate der Antibiotica A-7413
(e) gegebenenfalls die physiologisch verträglichen Salze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B oder C oder ihrer C1-Cc-ACyI-ester oder ihrer Thiol-C^C^-carbonsäurederivate herstellt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Zubereitung zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit einer ausgebildeten Pansenfunktion, die ein Trägermaterial und als Yfirkstoff die Antibioticmischung A-7413, das Antibioticum A-7413 Faktor A, das Antibioticum Λ-7413 Faktor B, das Antibioticum A-7413 Faktor C und das Antibioticum A-7413 Faktor D; einen Cj-C^
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ester, einen C1-Cc-ACylester oder ein Thiol-C^-C.-carbonsäurederivat der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B oder C; oder ein physiologisch verträgliches Salz der Antibiotica A-74 13 Faktoren A, B oder C oder eines C.-C^-Acylesters oder eines Thiol-C^-C.-Carbonsäurederivates der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B oder C enthält.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit einer ausgebildeten Pansenfunktion, das darin besteht, daß man den Tieren eine Propionat-steigernde Menge der Antibioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, des Anibioticums A-7413 Faktor A, des Antibioticums A-7413 Faktor B, des Antibioticums A-7413 Faktor C oder des Antibioticums A-7413 Faktor D; eines C..-C .-Alkylesters, eines C.-C5-ACylesters oder eines Thiol-C_-C4-carbonsäurederivats der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B oder C; oder eines physiologisch verträglichen Salzes eines Antibioticas A-7413 Faktoren A, B oder C oder eines C^-C^-Acylesters oder eines Thiol-C_-C.-carbonsäurederivats der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B oder C verabreicht.
V/eitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile ergeben sich aus der v/eiteren Beschreibung und den Beispielen, in denen auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen ist.
Die Zeichnungen zeigen die Infrarotabsprotionsspektra der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C, die mit KBr-Preßlingen erhalten wurden, und zwar:
Figur 1: Antibioticum A-7413 Faktor A Figur 2: Antibioticum A-7413 Faktor B Figur 3: Antibioticum A-7413 Faktor C
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Man erhält die Mischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, durch Züchten des neuen Mikroorganismusstammes Actinoplanes sp. NRRL 8122 unter bestimmten Bedingungen.
Wie es bei vielen Antibiotica liefernden Kulturen der Fall ist, führt die Fermentierung oder Züchtung eines das Antibioticum A-7413 liefernden Stammes des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 zur Bildung einer Vielzahl von antibiotischen Substanzen. Das Antibioticum A-7413 Faktor A ist der von dieser Kultur gebildete Hauptfaktor, während die Faktoren B, C und D drei in geringerer Menge gebildete Faktoren darstellen. Andere Faktoren sind nur in sehr geringen Mengen vorhanden oder sind relativ instabil.
Die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D werden gleichzeitig während der Züchtung bzw. Fermentation gebildet und als Antibioticmischung A-7413 erhalten. Das Verhältnis, in dem die einzelnen Faktoren in der Antibioticmischung gebildet werden, variiert in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen. Die einzelnen Antibioticfaktoren werden in der nachfolgend beschriebenen Weise voneinander getrennt und als Einzenverbindungen isoliert.
Antibioticum A-7413 Faktor A
Das Antibioticum A-7413 Faktor A ist ein weißes bis hellgelbes kristallines Material, das unter Zersetzung bei etwa 205 bis 212 0C schmilzt. Das Antibioticum A-7413 Faktor A kristallisiert aus Äthanol, Chloroform/Äthanol-Mischungen und Dimethylformamid/Aceton-Mischungen.
Das Antibioticum A-7413 Faktor A ist in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich; in Äthanol und wäßrigem Äthanol wenig löslich; und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Diäthylather und Wasser unlöslich. Die
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Elementaranalyse des Antibioticums A-7413 Faktor A weist auf die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Mittelwert) hin: 51,92 % Kohlenstoff, 5,25 % Wasserstoff, 9,85 % Stickstoff, 22,63 % Sauerstoff und 9,6 6 % Schv/efel. Die für das Antibioticum A-7413 Faktor A vorgeschlagene ungefähre Summenformel ist folgende: C73Hg7N12O23S5.
Das durch Titration bestimmte Molekulargewicht des Antibioticums A-7413 Faktor A beträgt etwa 1308.
Das in einem K3r-Preßling aufgezeichnete Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticums A-7413 Faktor A ist in der Figur 1 dargestellt. Es sind die folgenden Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,93 (Schulter), 2,98 (mittel), 3,24 (schwach), 3,38 (Schulter), 3,44 (mittel), 3,53 (schwach), 5,78 (schwach), 6,03 (stark), 6,56 (stark), 6,79 (mittel), 7,03 (mittel), 7,27 (schwach), 7,49 (schwach), 7,65 (schwach), 8,08 (mittel), 8,41 (schwach), 8,62 (schwach), 8,81 (mittel), 9,03 (schwach), 9,35 (mittel), 9,60 (mittel), 9,92 (schwach), 10,20 (schwach), 12,05 (schwach), 12,G6 (schwach) und 13,51 ,um (schwach).
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibioticums A-7413 Faktor P^ zeigt die folgenden Absorptionsmaxima:
a) in neutralem, 95-prozentigem wäßrigem Äthanol: 215 nm (EJ*m = 485);
260 nm (Schulter; e]% = 2 40);
l cm
300 nm (Schulter; e]% = 170);
1 cm
358 nm (Schulter; E ^ = 112,5);
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b) in saurem Äthanol:
217 nm (e]% = 440); 1 cm
265 nm (e]% = 227,5) ; 1 cm
293 nra (E^ = 210) ; 358 nm (Eicm * 95);
c) in basischem Methanol:
278 nm (Schulter; E]cm = 255);
403 nm (E?% = 80). ι cm
Die elektrometrische Titration des Antibioticums A-7413 Faktor Λ in 80-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid weist auf die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von 7,9 hin.
Die nach der sauren Hydrolyse durchgeführte Aminosäureanalyse des Antibioticums A-7413 Faktor A weist auf die Anwesenheit von Ammoniak (1,03 ,u Mol/mg), Glycin (0,33 ,u Mol/mg), Threonin (0,40 ,u Mol/mg), Asparaginsäure (0,1 ,u Mol/mg) und eine noch nicht identifizierte Aminosäure (etwa 0,4 -u Mol/mg) hin.
Das Antibioticum A-7413 Faktor A besitzt einen spezifischen Drehwert /alpha/^5von + 54,5° (c = 2,0, CHCl3).
Da-3 aus einer Chloroform/Äthanol-Mischung kristallisierte Antibioticum ?λ-7413 Faktor A besitzt das folgende charakteristische Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm: (Cu -Strahlung, 1,5405 lambda, Nickelfilter, d = Netzebenenabstand in AVigström)
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Relative Intensität
12,44 100
10,77 7O
7,96 100
5,71 50
5,09 80
4,53 100
4.2 5 80 3,38 80 3,61 10 3,44 10
3.03 5
Antibioticum Λ-7413 Faktor B
Das Antibioticum A-7413 Faktor B ist ein weißes bis hellgelbes
amorphes )
schmilzt.
amorphes Material, das bei einer Temperatur von mehr als 300 C
Das Antibioticum A-7413 Faktor B ist in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dinethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wäßrigem Äthanol wenig löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Xthylacetat, Diäthyläther und Wasser unlöslich.
Die Elementaranalyse des Antibioticums A-7413 Faktor B weist auf folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung hin: 66,34 % Kohlenstoff, 3,73 % Viasserstoff, 2,98 % Stickstoff, 19,39 % Sauerstoff und 2,83 % Schwefel.
Das in einem KBr-Preßling aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktor B ist in der Figur 2 dargestellt. Es sind die folgenden Absorptionsmaxima zu beobachten:
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2,97 (stark), 3,38 (stark), 3,42 (stark), 3,50 (stark), 5,73 (Schulter), 5,99 (mittel), 6,50 (mittel), 6,80 (mittel), 6,90 (Schulter), 7,00 (Schulter), 7,22 (mittel), 7,27 (Schulter), 7,42 (schwach), 7,58 (schwach), 7,78 (Schulter), 7,97 (mittel), 8,33 (Schulter), 8,53 (mittel), 9,00 (Schulter), 9,26 (stark), 9,71 (stark), 11,11 (schwach), 11,79 (schwach), 12,35 (schwach) und 13,25 ,um (schwach).
Das Ultraviolettabsorpticnsspektrum des Antibioticums A-7413 Faktor B weist folgende Absorptionsmaxima auf:
a) in neutralem, 95-prozentigem wässrigen Äthanol:
268 nm (E^*m = 104,3);
357 nm (Schulter; E]Jm = 30);
b) in saurem Äthanol:
268 nm ^}% m = 108,5);
357 nm (Schulter; En = 35);
c) in basischem Äthanol:
268 nm (Schulter; E]*m = 178,6).
Das Antibioticum A-7413 Faktor B besitzt einen spezifischen Drehwert ^alpha/*T von -26,2° (c = 7,5, Dimethylsulfoxid).
Die nach der sauren Hydrolyse durchgeführte Aminosäureanalyse des Antibioticums A-7413 Faktor B weist auf die Anwesenheit von Ammoniak (0,46 ^u Mol/mg), Glycin (0,1 ,u Mol/mg), Threonin (0,1 .u Mol/mg), Asparaginsäure (0,02 .u Mol/mg) und einer bislang nicht identifizierten Aminosäure (etwa 0,11 ,u Mol/mg) hi
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Antibioticum Λ-7413 Faktor C
Das Antibioticum A-7413 Faktor C ist ein weißes bis hellgelbes amorphes Material, das bei mehr als 250 C schmilzt.
Das Antibioticum 7413 Faktor C ist in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wässrigem Äthanol schwach löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Äthylacetat, DiHthyläther und Wasser unlöslich.
Die Elementaranalyse des Antibioticums A-7413 Faktor C läßt auf die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung schließen: 69,38 % Kohlenstoff, 9,92 % Wasserstoff, 2,34 % Stickstoff, 16,58 % Sauerstoff und 1,73 % Schwefel.
Das in einem K3r-Preßling aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticums A-7413 Faktor C ist in der Figur 3 dargestellt. Es sind die folgenden Absorptionsrnaxima zu beobachten:
3,00 (mittel), 3,38 (Schulter), 3,42 (stark), 3,51 (stark), 5,73 (mittel), 6,02 (mittel), 6,14 (Schulter), 6,52 (schwach), 6,56 (schwach), 6,77 (mittel), 6,80 (Schulter), 6,97 (schwach), 7,20 (schwach), 8,25 (schwach), 8,33 (schwach), 8,40 (schwach), 8,86 (schwach), 9,39 (schwach), 10,05 (schwach), 10,53 (schwach), 10,70 (schwach), 11 ,77 (schwach) und 13,66 ,um (schwach).
Die nach der sauren Hydrolyse durchgeführte Aminosäureanalyse des Antibioticums A-7413 Faktor C weist auf die Anwesenheit von Ammoniak (0,24 .u Mol/mg), Glycin (O,05 ,u Mol/mg), Threonin (0,04 ,u Mol/mg), Asparaginsäure (0,01 ,u Mol/mg und Phenylalanin (0,05 ,u Mol/mg) hin.
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Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibioticums A-7413 Faktor C besitzt folgende Absorptionstnaxima:
a) in neutralem, 95-prozentigem wäßrigem Äthanol: 205 nm (E^*m = 356);
235 nm (Schulter; E^*m = 180); 260 nm. (Schulter; e]% = 127);
ι cm
290 nm (Schulter; e]% = 104);
π cm
b) in saurem Äthanol:
205 nm (e]% = 356);
ι cm
235 nm (Schulter; E]*m = 180); 260 nm (Schulter; E^*m = 127); 290 nm (Schulter; E^*m = 103); 355 nm (Schulter; ε]* = 40);
c) in basischem Äthanol:
260 nm (Schulter; e]* = 268); 325 nm (Schulter; e]^ = 139).
Die mit verschiedenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 663 als Nachweisorganismus ermittelten Rf-Werte der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:
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Tabelle I
Rf-Werte
Lösungsmitte!system
A7413-A A7413-B A7413-C
A7413D
mit Wasser gesättigtes Butanol
Methylisobutylketon/Butanol/ Wasser-Mischung (25/21/4)
Methanol/Wasser-Mischung (1/1)
Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (12/3/1); mit NH4OH auf einen pH-Wert von 10,5 gestellt und dann mit H-.PO. auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht 0,57
0,49 0,62
0,46
0,33
0,58
0,82
0,90
0,31
0,61
0,61
0,62
0,30
0,26
0,06
0,20
Methanol/0,1n-HCl-Mischung (3/1) 0,71
0,71
0,42
0,71
O CO CD CO CD
• Xi.
Die auf zwei dünnschichtchromatographischen Systemen auf Kieselgel (vorbeschichtete Platten, E. Merck, Darmstadt, F-2 54, Schichtdicke = 0,2 5 nm) wiederum unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus ermittelten Rf-tierte der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt:
Tabelle II Lösungsmittelsystem A-7413 A A-7413 B A-7413 C A-7413 D
Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) 0,26 0,09 0,46 0,55
Aceton!tril/Wasser-Mischung (9/1) 0,23 0,03 0,42 0,48
Jedes der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C besitzt eine Säurefunktion, die für die Bildung von Salzen und Estern geeignet ist.
Die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C sowie ihre C1-C5-ACyI-ester und ihre Thiol-^-C^j-carbonsäurederivate können Salze bilden. Die physiologisch verträglichen Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und Aminsalze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C, der C1-C5-ACylesterderivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C und der Thiol-C2-C.-carbonsäurederivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. "Physiologisch verträgliche Salze" sind Salze, die auch pharmazeutisch annahmbar sind, d. h. Salze, die die Toxizität der Verbindung als ganzer gegenüber der nicht in Salzform vorliegenden Verbindung nicht erhöhen. Repräsentative und geeignete Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze sind die Natrium-, Kalium-, Lithium, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Geeignete Aminsalze sind
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sind die Ammoniumsalze, die primären, sekundären und tertiären C.-C.-AlkylammoniuiTisalze und die Hydroxy-C_-C .-alkylammoniumsalze. Beispiele für Aminsalze sind die durch Umsetzung mit Ammoniumhydroxid, see.-Butylamin, Isopropylamin, Diäthylamin, Diisopropylamin, Ethanolamin, Triäthylamin und dergleichen gebildeten Salze.
Die mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen als Kationen gebildeten Salze erhält man unter Anwendung von Verfahren, wie sie üblicherweise für die Herstellung von kationischen Salzen angewandt werden. Beispielsweise löst man das Antibioticum A-7413 Faktor A in Form der freien Säure in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Äthanol, und versetzt diese Lösung mit einer Lösung, die die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base enthält. Das in dieser Weise gebildete Salz kann in üblicher Weise isoliert werden, beispielsweise durch Filtration oder durch Verdampfen des Lösungsmittels.
Die mit organischen Aminen gebildeten Salze können in ähnlicher Weise bereitet werden. Beispielsweise kann man das Amin zu einer Lösung des Antibioticums A-7413 Faktor A in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol, zusetzen und dann das Lösungsmittel und das überschüssige Amin durch Verdampfen entfernen.
Die Cj-C.-Alkylesterderivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Diese Esterderivate bereitet man in üblicher Weise.
Jedes der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C besitzt mindestens eine Hydroxylgruppe, die für die Bildung von Acylesterderivaten geeignet ist. Die C. -C^-Acylesterderivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C werden ebenfalls nach Standard-Methoden hergestellt. Beispielweise setzt man das Antibioticum A-7413 Faktor A in Form der freien Säure in einem geeigneten Lösungsmittel mit dem entsprechenden Säureanhydrid während einer geeigneten Zeitdauer um, die dazu ausreicht, das gewünschte Acylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A zu bilden.
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Die Antibiotica Λ-7413 Faktoren A, B und C können ferner mit Thiocarbonsäuren Derivate bilden. Diese Derivate stellt man nach den Verfahren von M. Ebata et al. (J. Antibiotics 22 (10) (1969) 451 - 4 56) her. Obwohl der genaue Aufbau dieser Derivate nicht bekannt ist, weisen die Derivate mindestens eine Carboxylgruppe auf und können daher Salze bilden. Die Thiol-C2-C .-carbonsHurederivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind, umfassen beispielsweise die mit Mercaptoessigsaure (Thioglykolsäure), 2-Mercaptopropions'iure (Thiomilchsäure) , 3-Mercaptopropionsäure, Mercaptobernsteinsäure (Thioapfelsäure) und L-Cystein gebildeten Derivate.
Der neu aufgefundene und bislang nicht beschriebene Mikroorganismus, der den Antibiotickomplex A-7413 bildet, konnte taxonomisch als eine Species des Genus Actinoplanes charakterisiert v/erden. Die Gattung Actinoplanes ist eine Gruppe der Familie der Actinoplanaceaa. Die Actinoplanaceae stellen eic Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales dar, die zuerst von Couch beschrieben wurden /J. Elisha Mitchell Sei., Soc., 65, 315-318 (1949); 66, 87-92 (1950); Trans. New York Acad. Sei., 16, 315-318 (1954); J. Elisha Mitchell Sei. Soc, 71, 148-155 und 269 (1955); "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology," 8th Edition, 706-711 (1974); J. Elisha Mitchell Sei. Soc., 79, 53-70 (1963)_/.
Eine Kultur des das Antibioticum A-7413 bildenden Mikroorganismus ist in der ständigen Sammlung des Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Reserarch Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, USA, unter der Hinterlegungsnummer NRRL 8122 hinterlegt worden.
Die kennzeichnenden Merkmale des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 sind im folgenden angegeben. Neben gewissen
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zusätzlichen Untersuchungen wurden zur Ermittlung der Kennzeichen die Methoden angewandt, die von den International Streptomyces Project (E. B. Shirling und D. Gottleib, Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16 (1966) 313-340) zur Charakterisierung der Streptomycesarten empfohlen wurden. Die Farben wurden gemäß der I.S.C.C.-N.B.S.-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S. Dept. of Commerce Circular No. 553, Washington, D. C, USA) bezeichnet. Die Farbblöcke nach Masrz und Paul (A. Maerz und M. R. Paul "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y. (1950), USA) sind in Klammern angegeben.
Morphologie
Auf Storaxpollen (Liquidambar) v/erden in großem Umfang vegetative Myzelien und Sporangien gebildet. Es gibt keinen Hinweis auf die Pollen durchdringende Hyphen. Auf Pinuspollen werden keine Sporangien gebildet.
Die Sporangien besitzen üblicherweise einen Durchmesser von 9 bis 14 ,um und sind kugelig bis subkugelig bis unregelmäßig geformt. Di Hauptform ist unregelmäßig. Die Sporen sind sphärisch mit vielen Geißeln und besitzen eine Größe von 1,4 .um bis 1,7 .um; nur wenige Sporen sind beweglich.
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Züchtungsverhalten (nach 21 Tagen bei 300C)
Hefe-Malz (ICP No. 2) starkes Wachstum, hellbraun (1218); kein lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet
Agar nach Czapek starkes Wachstum, mäßig orange (11J8); kein lösliches Pigment; es werden keine Sporangien gebildet
Hafermehl-Agar (ICP Mo. 3)
mittleres Wachstum, hellgelbgrün (10B1); kein lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet
Anorganische Salze-Stärke (ICP No. 4) mäßiges Wachstum, bräunlichorange (13A10); schwach bräunliches lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet
Glycerin-Asparagin (ICP No. 5)
starkes Wachstum, mittelrötlichoranges Medium (10A10); kein lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet
Medium nach Bennett
Tomatenmark-Hafermehl
Tyrosin-Agar mittleres Wachstum, hellgelb (11C1); es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet
schwaches Wachstum, es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet
mittleres Wachstum, gelblichgrau (12A2); es werden weder Sporangien noch ein lösliches Pigment gebildet
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He feextrak t-Agar
-VS-
• J*.
starkes Wachstum, bräunlichorange (13B9); es v/erden v/eder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet
Glucose-Asparagin mäßiges Wachstum, hellorangegelb (11A4); es v/erden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet
Calciummalat
mäßiges Wachstum, hellgelblichrosa (1OA2); es werden weder Sporangien noch ein lösliches Pigment gebildet
Nährstoff-Agar schwaches Wachstum, es werden weder ein lösliches Pigment noch Luft-Hyphen gebildet
Agar nach Emerson mittleres Wachstum, hellbraun (13F8); schwach rötlichbraunes Pigment; es werden keine Sporangien gebildet
Wirkung auf Magermilch kein Wachstum
Nitratreduktion positiv
Gelatineverflüssigung keine nach 21 Tagen
Melaminbildung auf Pepton- positiv Eisen-Agar (ICP No. 6)
Temperaturanforderungen auf Glycerin-Asparagin-Ag ar
gutes Wachstum bei 26 bis 37 C, intensivste rötlichorange Färbung bei 2 6 °C; kein Wachstum bei 4 3 °C
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_ ΛΛ _
Kohlenstoffverwertung
Bev;ertung:
Verwertung
wahrscheinliche Verwertung zweifelhafte Verwertung keine Verwertung
Rhamnose Cellobiose i-Inosit Cellulose Melezitose Fructose Dextrose D-Xylose D-Mannit Raffinose Saccharose Maltose L-Arabinose Lactose
.Minus Kohlenstoff (Minus Carbon)
V7ie bei anderen Organismen unterliegen die Eigenschaften der das Antibioticum A-7413 bildenden Kultur, nämlich Actinoplanes sp. NRRL 8122, der Variation. Beispielsweise kann man durch die Behandlang mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten Wellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien künstliche Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 8122 bilden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu dieser Species Actinoplanes gehören und Antibiotica A-7413 bilden, können erfindungsgemäß verwendet werden.
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Zur Züchtung des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 kann man irgendeines der vielen Kulturmedien verwenden. Wegen der wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute bezüglich des Antibioticums, und einer leichten Produktisolierung sind jedoch gewisse Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise die für die Fermentation in großem Maßstab vorzugsweise angewandte KohlenhydratqueHe Dextrin, wenngleich man auch Glucose, Fruktose, Maltose, Saccharose oder dergleichen verwenden kann. Obwohl es für das Wachstum nicht erforderlich ist/ wird die Bildung des Antibioticums durch ein Öl, wie Maisöl, gefördert. V/eitere geeignete Kohlenstoff quellen sind Erdnußöl, Sojaöl, Fischöl und dergleichen. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist Sojabohnenmehl, obwohl man auch Sojabohnengrieß, Peptone, Hafermehl, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Baumollsamenöl, Aminosäuren und dergleichen verwenden kann. Als anorganische Salze setzt man dem Kulturmedium die üblichen löslichen Salze zu, die Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat-Ionen und dergleichen liefern.
Die für das Wachstum und die Entv/icklung des Mikroorganismus erforderlichen Spurenelemente sollten ebenfalls in dem Kulturmedium vorhanden sein. Diese Spurenelemente treten üblicherweise als Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums in solchen Mengen auf, daß die Anforderungen des Mikroorganismus erfüllt werden.
Wenn das Schäumen der Medien bei einer Fermentation in großem Maßstab ein Problem darstellt, kann es erforderlich sein, ein Antischaummittel, wie Polypropylenglycol, in geringer Menge (d. h. in einer Menge von 0,2 ml/1) einzusetzen.
Für die Bildung erheblicher Mengen der Antibiotica A-7413 ist eine submerse, aerobe Fermentation in Tanks oder Behältern
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bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotica A-7413 kann man auch durch Schüttelflaschenkulturen herstellen. Wegen der Zeitverzögerung, die bei der Antibioticbildung auftritt, wenn man große Tanks oder Behälter mit den Sporen des Mikroorganismus animpft, ist es bevorzugt, ein vegetatives Inokulum bzw. eine vegetative Impfkultur zu verwenden. Die vegetative Impfkultur bereitet man durch Animpfen eines geringen Volumens des Kulturmediums mit den Sporen oder mit Myzelfragmenten des Organismus, so daß man eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Die vegetative Impfkultur wird dann in einen größeren Behälter überführt. Das für das Wachstum der vegetativen Impfkultur verwendete Medium kann das gleiche sein, das man für die Fermentation in größerem Maßstab verwendet, wenngleich man hierzu auch andere Medien einsetzen kann.
Der die Antibiotica A-7413 bildende Organismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 C und etwa 37 C gezüchtet werden. Die optimale Bildung der Antibiotica A-7413 scheint bei einer Temperatur von etwa 2 5 bis 30 C zu erfolgen.
Wie bei submersen, aeroben Züchtungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Um ein wirksames Wachstum des Organismus zu erreichen, soll das bei der Tankzüchtung angewandte Luftvolumen vorzugsweise dazu ausreichen, die Sättigung an gelöstem Sauerstoff bei mehr als 20 % zu halten.
Der Anfangs-pH-Wert des nichtangeimpften Kulturmediums variiert mit dem eingesetzten Medium. Im allgemeinen sollte der pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 liegen. Gegen Ende der Fermentation liegt der bei der Gewinnung angewandte pH-Wert geringfügig niedriger und im Bereich von 6,0 bis 7,0.
Während der Fermentation oder der Züchtung kann man die Bildung der Antibiotica dadurch verfolgen, daß man Proben der Kulturbrühe oder von Extrakten der Myzel-Feststoffe in Bezug auf ihre antibiotische Wirkung untersucht. Für diesen Zweck sind Organismen geeignet, von denen bekannt ist, daß sie auf die Antibiotica
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A-7413 empfindlich reagieren. Ein besonders geeigneter Nachweisorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Die biologische Analyse wird in üblicher Weise auf Papierscheiben oder Agar-Platten durchgeführt.
Im allgemeinen läßt sich die antibiotische Aktivität am zweiten Fermentationstag nachweisen. Die maximale Entfaltung der antibiotischen Aktivität tritt üblicherweise zwischen dem dritten und dem zehnten Tag auf. Nach ihrer Bildung unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen können die oben beschriebenen Antibiotica A-7413 in üblicher Weise aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Die während der Züchtung die Antibiotica A-7413 bildenden Organismen erzeugten Anibiotica finden sich überv/iegend in der Myzelmasse. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung der Antibiotica A-7413 besteht somit in der Extraktion des abgetrennten Myzels. Die Extraktion der Myzelmasse erreicht man am besten mit Methanol, obwohl man auch andere niedrigmolekulare Alkohole und Chloroform verwenden kann. Die Antibiotica A-74I3 werden mit Hilfe von Routineverfahren aus dem Extraktionslösungsungsmittel gewonnen, so daß man eine Mischung der Antibiotica A-7413, d. h. die Antibioticmischung A-7413 erhält.
Die Antibioticmischung A-7413 kann weiter gereinigt werden, und man kann die einzelnen Faktoren der Antibioticmischung A-7430 unter Anwendung verschiedenartiger anerkannter Verfahren trennen, beispielsweise durch Extraktionsverfahren und Adsorptionsverfahren. Mit Vorteil verwendet man adsorptive Materialien, wie Aluminiumoxid, Kieselgel, Ionenaustauscherharze, Cellulose, vernetztes Dextran (Sephadex) und dergleichen. Beispielsweise kann man zur Trennung der Faktoren A, B, C und D eine präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel unter Verwendung einer Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) als Lösungsmittelsystem durchführen, wobei man jeden Faktor durch Elution mit Methanol erhält. Zur Trennung der Faktoren in großem Maßstab führt man
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vorzugsweise eine Säulenchromatographie durch. Bei dieser Säulentrennung verwendet man vorzugsweise als Absorptionsmittel Kieselgel und als Lösungsmittelsystem eine Chloroform/Methanol-Mischung (19/1). Der Faktor A, d. h. der Hauptfaktor, kann ohne weiteres mit dieser Methode abgetrennt werden. Die Reinigung der in geringerer Menge vorhandenen Faktoren B, C und D erfordert jedoch eine anschließende Säulentrennung der angereicherten Fraktionen. Erneut verwendet man als bevorzugtes Adsorptionsmittel Kieselgel und als bevorzugtes Lösungsmittelsystem eine Chloroform/Methanol-Mischung (19/1).
Zur Vereinfachung der folgenden Ausführungen dient der Ausdruck "Verbindung A-7413" zur Bezeichnung einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C, die Alkylester, die Acylester und die Thiolcarbonsäurederivate der Antibiotica A-7413, Faktoren A, B und C und die physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C und der Alkylester, der Acylester und der Thiolcarbonsäurederivate der Faktoren A, B und C umfaßt.
Die Verbindungen A-7413 sind antimikrobielle Mittel und sind besonders x^irksam gegen grampositive Mikroorganismen. Die Antibiotica A-7413, Faktoren A, B und C wurden unter Anwendung der Standard-Scheiben-Untersuchungsmethode auf ihre antimikrobielle Wirkung untersucht, wobei man sie in Mengen von 1 mg/ml auf Scheiben mit einem Durchmesser von 6,35 ml einsetzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die als Durchmesser der beobachteten Inhibierungszone in Millimeter angegeben sind, sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.
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HC
Tabelle III
A-7413 Λ-7413 A-7413
Testorganisrus Faktor A Faktor B Faktor C
Staphylokokkus aureus 23 20 14
Bacillus subtilis 21 18 16
Sarcina lutea 22 19 16
Wenn man das Antibioticum A-7413 Faktor A subkutan an Mäuse injiziert, so übt das Material in-vivo eine antimikrobielle Wirkung aus. Es wurden zwei Dosierungen des Antibioticums A-7413 Faktor A an Mäuse verabreicht, die bestimmte Infektionen aufwiesen. Der hierdurch erreichte Schutz wird als EDr -Wert gemessen, d. h. die wirksame Dosis, die dazu ausreicht, 50 % der Versuchstiere zu schützen (vgl. Warren Wick et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 223 - 235). Die mit dem Antibioticum A-7413 Faktor A gegen diese Infektionen erreichten ED1. -Werte sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt:
Tabelle
IV
Streptokokkus pyogene: Diplokokkus pneumonia«; Staphvlokokkus aureus
ED5 -Wert Toxizität
(mg/kg χ 2) LD50
0,42 161
0,39 387
31 ,00 4000
Behandlung eine und fünf Stunden nach der Infektion
Ein besonderer Vorteil der Verbindungen A-7413 ist ihre Fähigkeit, Mikroorganismen zu inhibieren, die gegen andere Antibiotica resistant sind. In der folgenden Tabelle V sind die Ergebnisse
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von Standard-Agar-Verdünnungsuntersuchungen (die unter Anwendung der ICS-Methode durchgeführt wurden) zusammengestellt, bei denen die Wirkung des Antibioticums Λ-7413 Faktor A gegen verschiedene Staphylokokkus aureus-Stämme untersucht wurden. Die Ergebnisse sind als minimale inhibierende Konzentration angegeben, bei der eine Inhibierung des S. aureus-Stammes auftritt. Die bei der gleichen Untersuchung mit dem bekannten Antibioticum Vancomycin erzielten Ergebnisse sind zu Vergleichszwecken ebenfalls angegeben.
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• η.
Tabelle
S. aureus Stamm
3055
3123"1
H29O"1
3074"
H43"
H114" H54V
3125 3130 3131 3132 3133 3134 3135 3136 3137 3138 3139 3140
minimale inhibierende Konzentration
( ,ug/ml)
A-7413 Faktor A Vancomycin
0,125 1,0
0,125 1,0
0,125 1,0
0,125 1,0
0,125 1,O
0,125 1,0
0,062 1,O
0,125 1,0
0,062 1,0
0,062 1,0
0,062 1,0
0,062 1,0
0,062 1,0
0,062 0,5
0,125 O,5
0,125 1,0
0,062 1,0
0,125 1,0
0,125 0,5
+ spricht auf Penicillin G an
++ gegen Penicillin G resistent; spricht auf Methicillin an
+++ resistent gegen Penicillin G und Methicillin
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• η.
In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse von Agar-Verdünnungsuntersuchungen zusammengestellt, bei denen die Wirkung des Antibioticums A-7413 Faktor A gegen verschiedene Streptokokkus-Arten untersucht wurden. Bei diesem Versuchen wurde ein Trypticase-Soja-Agar plus Blut in Form einer 10 -Verdünnung einer über-Nacht-Kulturbrühe, in 0,3 % Agar als Impfkultur verv/endet, die zu etwa 5000 Bakterien pro 7,5 mm Agaroberflache führt. Erneut sind zum Vergleich die bei der gleichen Untersuchung mit Leucomycin erzielten Ergebnisse angegeben. Alle unersuchten Stämme sind gegen Penicillin G resistente Stämme der Gruppe D-Streptokokkus.
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Tabelle
minimale inhibierende Konzentration
( ,ug/ml) Vancomycin
Streptokokkus sp. A-7413 Faktor A 2,0
238 0,25 2,0
282 0,25 4,0
9901 0,125 2,O
9913 0,25 8,0
9933 0,25 4,0
9960 0,25 2,0
12253F 0,125 4,0
Shrigley 0,125 4,0
Mitis 0,125 4,0
55992 0,125 4,0
8043 0,125
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Weiterhin ist das Antibioticum A-7413 Faktor A wirksam gegen Neisseria meningitides. Bei Agar-Verdünnungsuntersuchungen, bei denen Trypticase-Sojaagar mit 5 % Kaninchenblut und 1 % Isovitalex und eine 1:100-Verdünnung einer über Nacht gewonnenen Kulturbrühe als Impfkultur eingesetzt wurden, zeigt das Antibioticum A-7413 Faktor A die folgenden Werte für die minimale inhibierende Konzentration:
N. meningitides-Kultur
Os Sabderlin
minimale inhibierende Konzentration (^ug/ml)
4,0 2,0
Die Verbindungen A-7413 sind relativ wenig toxisch. Beispielsweise liegt die akute Toxizität des durch intraperitoneale Injektion an Mäuse verabreichten Antibioticums A-7413 Faktor A bei mehr als 400 mg/kg.
Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft des Antibiotlc-Komplexes A-7413 und der Verbindungen A-7413 ist ihre Fähigkeit, Propionibacterium acnes, ein pathogenes Bakterium, das zusammen mit Akne auftritt, zu inhibieren. Es wird das repräsentative Antibioticum A-7413 Faktor A auf seine Wirkung gegen P. acnes in der folgenden Weise untersucht:
Man bereitet zweifache Serienverdünnungen der zu untersuchenden Verbindungen in Actinomyces-Brühe (Baltimore Biological Laboratories). Jedes Röhrchen impft man mit p. acnes derart
4
an, daß es 10 Organismen pro Milliliter enthält. Nach einer
Inkubationszeit von 4 Tagen bei 37 0C untersucht man die Röhrchen. Die geringste Konzentration, in der die untersuchte Verbindung das Wachstum unterbindet, wird als minimale inhibierende Konzentration ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle VII zusammengestellt.
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Tabelle VII
P. Acnes-Kultur
ATCC 6919
klinisches Isolat 1 klinisches Isolat 2
minimale inhibierende Konzentration des Antibioticums A-7413 Faktor A ( .ug/ml)
-C 1 ,25 2,50
< 1 ,25
Die Antibioticmischung A-7413 und die Verbindungen A-7413 inhibieren ferner das Wachstum von Mikroorganismen, die zur Erkrankung der Zahnwurzelhaut beitragen. In der Tabelle VIII ist die Wirkung des Antibioticums A-7413 Faktor A gegen repräsentative Mundbakterien angegeben. Die Wirkung wurde mit Hilfe der üblichen Agar-Verdünnungsmethode gemessen, wobei die minimale inhibierende Konzentration nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden ermittelt v/urde.
Tabelle VIII
Organismus
Streptokokkus mutans Lactobacillus casei Neisseria perflava
minimale inhibierende Konzentration ( .ug/ml)
< 0,25
< 0,25 32,0
untersucht auf Mitis Salivarius-Agar unter Zusatz von Tellurit und Thioglykolsäure
untersucht auf einem Gehirn-Herz-Infusions-Agar
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Zusätzlich zeigt die Antibioticmischung A-7413 und das Antibioticum A-7413 Faktor A bei Untersuchungen, bei denen ein künstliches S. mutens-Plattensystem verv/endet wird, eine Inhibierung der Plattenbildung bei Dosierungen von lediglich 0,01 %.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Antibioticmischung A-7413 und der Verbindungen A-7313 ist ihre Fähigkeit, die Futterverwertung von Tieren zu verbessern. Bespielsweise fördern die Antibiotica A-7413 die Futterverwertung oder Futterausnutzung von Wiederkäuern mit einer ausgebildeten Pansenfunktion.
Es ist bekannt, daß die Kohlenhydratverwertung bei Wiederkäuern dadurch gesteuert werden kann, daß man die Pansenflora der Tiere reizt, so daß sie statt Acetat- oder Butyratverbindungen Propionatverbindungen bildet (bezüglich einer genaueren Diskussion sei auf Church et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Band 2 (1971), Seiten 622 und 625 verwiesen).
Die Futterverwertung oder die Wirksamkeit der Futterausnutzung kann dadurch überwacht werden, daß man die Bildung und die Konzentration von Propionatverbindung im Pansen mit der von Arthur P. Raun in der US-PS 3 79 4 732 (vgl. Beispiel 5) beschriebenen Methode beobachtet. In der folgenden Tabelle IX sind die bei dieser Untersuchung ermittelten Verhältnisse der Konzentrationen der flüchtigen Fettsäuren in den mit dem erfindungsgemäßen Antibioticum A-7413 Faktor A behandelten Kolben und in den Kontrollkolben angegeben.
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Tabelle IX
O O GO
Antibioticum A-7413 Faktor A (/U/ml)
10,00 2,00 1,00 0,50 0,25
Verhältnis der behandelten Proben zu den Kontrollproben
Molprozent
Propionat		 Molprozent
Acetat		 Molprozent
Butyrat		 Gesamtmenge der
flüchtigen Fett
säuren (mMol/1)
1 ,23 0,95 0,95 1,02
1,17 0,96 0,98 1,03
1,24 0,98 0,84 1,05
1,05 1,00 0,94 1 ,04 ·
1,07 0,99 0,98 1 ,04 ^
Die Kohlenhydratverwertung wird ferner mit in vivo-Untersuchungen bestimmt, die an Tieren durchgeführt v/erden, in deren Pansen eine Fistel angeordnet ist, die es ermöglicht, Proben des Panseninhalts zu entnehmen.
Das zur Untersuchung von Rindern angewandten Verfahren ist ebenfalls in der erwähnten US-PS 3 794 732 (Beispiel 7) beschrieben.
In der folgenden Tabelle X sind die Ergebnisse dieser Untersuchung des Antibioticums A-7413 Faktor A agegeben, wobei die mittlere prozentuale Zunahme der Propionsäurekonzentration des Pansens als Mittelwert von sechs Analysen bei einer Behandlungsdauer von 14 Tagen aufgeführt ist.
Tabelle
Steigerung ge- relative Steige-
Propionsäure- genüber den rung gegenüber Behandlung konzentration (%) Kontrolltieren den Kontrol!tieren
Kontrolle 20,8 Antibioticum
A-7413
Faktor A
100 mg/Tag 25,4 4,6 22,1 %
Bei einer ähnlichen Untersuchung an Schafen, bei der mit Fisteln versehene Hammel eingesetzt wurden, zeigt die Antibioticmischung A-7413 ebenfalls eine gesteigerte Futterverwertung. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle XI angegeben .
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Behandlung
Kontrolle
Antibioticmischung
A-7413
(30 mg/Tag)
Molprozent Propionat
24,0
26,2
-Vr-
Tabelle
XI
Steigerung ge- relative Steige-
genüber den rung gegenüber Kontrolltieren den Kontrolltieren
8,3 %
Proben von 6 Tagen, die während der Behandlungsdauer von 17 Tagen genommen wurden
Die Antibioticmischung A-7413 und die Verbindungen A-7413 führen zu einer wirksamen Steigerung der Propionatbildung und daher zu einer verbesserten Futterverwertung, wenn sie täglich in Dosierungen von etwa 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg oral an Wiederkäuer verabreicht werden. Die besten Ergebnisse erzielt man bei einer Dosis von etwa 1 mg pro kg pro Tag. Eine bevorzugte Methode zur Verabreichung der Antibioticmischung A-7413 oder der Verbindung A-7413 besteht darin, die Wirkstoffe mit dem Tierfutter zu vermischen. Man kann den Wirkstoff jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise als Tablette, als Arzneimittelpräparat, als Bolus oder als Kapsel. Die Formulierung in diesen verschiedenen Dosierungsformen kann unter Anwendung bekannter veterinärpharmazeutischer Methoden erreicht werden. Jede einzelne Dosiseinheit sollte eine Menge der Verbindung A-7413 oder der Antibioticmischung A-7413 enthalten, die in direkter Beziehung steht zu einer geeigneten Tagesdosis für das zu behandelnde Tier.
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Ein Beispiel der nützlichen wachstumsfördernden Wirkung der Antibioticmischung A-7413 und der Verbindungen A-7413 zeigt sich bei Geflügel. Bei Innengehegeuntersuchungen unter Verwendung von Brathähnchen, bei denen das Antibioticum A-7413 Faktor A in einer Menge von 10 g pro Tonne des Futters dem Futter zugesetzt wird, wird eine signifikante Verbesserung der Gewichtszunahme und der Futterverwertung beobachtet. Die Antibioticmischung A-7413 und die Verbindungen A-7413 zeigen eine typische Wirksamkeit zur Förderung des Wachstums von Geflügel, wenn die Wirkstoffe in Dosierungen von 0,5 bis 50 g der Antibioticmischung A-7413 oder der Verbindung A-7413 pro Tonne des Tierfutters in das Futter eingearbeitet werden. Die günstigsten Ergebnisse erzielt man dann, wenn man die Antibioticmischung A-7413 oder die Verbindung A-7413 in einer Menge von 2,5 bis 10 g in eine Tonne des Tierfutters einarbeitet.
Man kann die beim Züchten der Mikroorganismen gewonnenen Feststoffe einschließlich der Bastandteile des Mediums und des Myzels ohne Extraktion oder Trennung, vorzugsweise jedoch nach der Abtrennung von Wasser, als Ausgangsmaterial für die Antibioticmischung A-7413 verwenden. Bespielsweise kann man nach der Entwicklung der antibiotischen Aktivität des Antibioticums A-7413 das Kulturmedium durch Gefriertrocknen trocknen, worauf man das gefriergetrocknete Medium direkt mit einer Futter-Vormischung vermischen kann.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
A. Schüttelkolbenfermentation zur Gewinnung des Antibioticums A-7413
Man bereitet eine Kultur des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 durch Züchten des Organismus auf einem geneigten
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Agar-Medium mit den Abmessungen 18 χ 150 mm und der folgenden Zusammensetzung:
Bestandteil
Saccharose 30 g
Pepton 5 g
K2HPO4 1 g
Mineralgemisch-
lösung nach Czapek		 5 ml
Agar 25 g
entionisiertes Wasser ad 1 Liter
Mineralgemischlösung nach Czapek
100 g KCl
100 g MgSO4.7H2O 2 g FeSO4.7H2O Auffüllen mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter
Man impft das geneigte Medium mit dem Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 10 bis 14 Tagen bei 2 5 C. Die gereifte Kultur bedeckt man mit Wasser und kratzt die Oberfläche mit einer sterilen öse ab, um das Myzel zu lösen und zu zerkleinern und die Sporen aus den Sporangien freizusetzen. Man verwendet die Hafte der erhaltenen Suspension zum Animpfen von 50 ml eines flüssigen vegetativen Mediums der folgenden Zusammensetzung:
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Bestandteil
Glucose 10 g
Dextrin 20 g
Sojabohnenmehl 25 g
Hefeextrakt 2,5 g
CaCO3 2,5 g
entionisiertes Wasser ad 1000 ml
Das angeimpfte vegetative Medium inkubiert man während 72 Stunden bei 25 C in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben, der auf einer Schüttelenrichtung befestigt ist, die um einen Bogen mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 inches) mit einer Drehzahl von
250 min" in Rotation versetzt wird.
Dieses inkubierte vegetative Medium kann man direkt dazu verwenden, das vegetative Medium der zweiten Stufe anzuimpfen.
Alternativ und vorzugsweise kann man das inkubierte Medium zur späteren Verwendung lagern, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Kultur wird zum Zwecke dieser Lagerung in viele kleine Ampullen verteilt. Hierzu bringt man in jede Ampulle 2 ml des inkubierten vegetativen Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung der folgenden
Zusammensetzung ein:
Bestandteil
Glycerin 20 %
Lactose 10 %
entionisiertes Wasser 70 %
Die bereiteten Suspensionen lagert man in der Dampfphase von
flüssigem Stickstoff.
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• Pt.
Man verwendet 1 ml einer in dieser Weise bereiteten und gelagerten Suspension zum Animpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben beschriebene vegetative Medium besitzt. Das angeimpfte vegetative Medium der ersten Stufe inkubiert man während 72 Stunden bei 25 0C in einem 2 50 ml-Weithalserlenmeyerkolben/ der auf einer Schütteleinrichtung befestigt ist, die bei 250 min einen Bogen mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 inches) durchläuft.
B. Tankfermentation zur Gewinnung des Antibioticums A-7413
Zur Bereitung eines größeren Volumens der Impfkultur verwendet man 40 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Animpfen von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung besitzt wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Dieses angeimpfte vegetative Medium der zweiten Stufe wird während etwa 48 Stunden bei 4 5 0C in einem 2 Liter-Kolben auf einer Schütteleinrichtung inkubiert, die bei 250 min um einen Bogen von 5,08 cm (2 inches) bewegt wird.
Dann verwendet man 1 1 der in dieser Weise gebildeten vegetativen Impfkultur der zweiten Stufe zum Animpfen von 100 1 eines sterilen Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung:
Bestandteil
Sojabohnenmehl
Maisöl
MgSO4.7H2O CaCO3
FeCl2.4H2O entionisiertes Wasser
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• ST*
Nach dem Sterilisieren durch Erhitzen während 30 Minuten auf 120 0C beträgt der pH-Wert des Mediums 7,O. Man läßt das angeimpfte Produktionsmedium, das in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 165 1 vorliegt, während etwa 7 Tagen bei einer Temperatur von 25 0C gären. Man belüftet das Fermentationsmedium mit steriler Luft in einer Menge von etwa 0,5 bis 1,0 Volumen Luft pro Volumen des Kulturmediums pro Minute. Man rührt das Medium mit üblichen Rührern, die bei 250 min betrieben werden.
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Beispiel
Man bereitet die Antibiotica A-7413 nach der in Beispiel 1 be schriebenen Verfahrensweise, wozu man jedoch ein geneigtes Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung dazu verwendet, die Sporen oder das Myzel für die Anfangsimpfkultur zu bilden:
Bestandteil Menge
Na?S~O-, 0,5 g
Hefeextrakt 2,0 g
CaCO3 3,0 g
Gemüsesaft 200 ml
entionisiertes Wasser 800 ml
Durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung stellt man den pH-Wert auf 7,2 ein.
V-8 Saft der Firma Campbell Soup Company, Camden, N. J. O81O1, USA
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Beispiel 3
Man bereitet die Antibiotica A-7413 nach der Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei man jedoch ein vegetatives Medium und ein vegetatives Medium der zweiten Stufe der folgenden Zusam mensetzung verwendet:
Bestandteil Meng e g
Glucose 10,0 g
Dextrin 20,0 9
Sojabohnenmehl 15,0 g
Hefeextrakt 2,5 g
Sojabohnenöl (raffiniert) 5,0 g
CaCO3 2,5 1
entionisiertes Wasser ad 1
Beispiel 4 Abtrennung der Antibioticmischung A-7413
Man stellt die gemäß Beispiel 1 hergestellte gesamte Fermentationsbrühe (200 1) durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure sauer (auf einen pH-Wert von 3,5). Die gerührte angesäuerte
Brühe filtriert man unter Verwendung eines Filterhilfsmittels (Hyflo Super-cel, einer von der Firma Johns-ManviHe Products Corp. vertriebenen Diatomeenerde). Dann setzt man 100 1 Methanol zu dem abgetrennten Myzelkuchen zu und rührt die gebildete Methanolsuspension während 30 Minuten, worauf man sie filtriert.
Man versetzt den abgetrennten Myzelkuchen erneut mit 100 1
Methanol, rührt während 30 Minuten und filtriert wieder. Die beiden Methanolextrakte engt man im Vakuum ein, so daß man
nach der Entfernung des Methanols 10,5 1 eines wässrigen
Konzentrats erhält. Dieses wässrige Konzentrat kühlt man
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während 2 4 Stunden auf 5 0C. Die dabei gebildete ölige obere Schicht wird abgetrennt und verworfen. Die untere wässrige Schicht (2 1) stellt man durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,3 ein. Man extrahiert die gebildete Lösung zweimal mit der Hälfte des Volumens einer Chloroform/Methanol-Mischung (4/1). Diese beiden Extrakte vereinigt man und dampft sie im Vakuum zur Trockne ein. Den in dieser Weise erhaltenen Rückstand löst man in 150 ml Chloroform und gibt diese Lösung zu 1500 ml n-Pentan. Den gebildeten Niederschlag zentrifugiert man ab und trocknet ihn im Vakuum, wobei man 15,8 g der Antibioticmischung A-7413 in Form eines braunen Pulvers erhält.
Beispiel 5 Isolierung der Faktoren der Antibioticmischung Λ-7413
Man löst 26,4 g der gemäß Beispiel 4 erhaltenen Antibioticmischung A-7413 in 200 ml einer Chloroform/Methanol-Lösung (19/1). Man trägt die erhaltene Lösung auf eine mit Kieselgel (Matheson, Qualität 62, mit 5 % Wasser äquilibriert) beschickte Säule (5,8 χ 94,0 cm) auf, die man mit einer Chloroform/Methanol-Mischung (19/1) bereitet hat. Man entwickelt unter Vervrendung einer Chloroform/Methanol-Mischung (19/1), wobei man 150 ml-Fraktionen auffängt. Man überwacht die Elution der Säule durch Bewerten der Wirkung der Fraktionen gegen Staphylokokkus aureus, Bacillus subtilis und Sarcina lutea und durch dünnschichtchromatographische Bioautographie unter Verwendung von S. lutea als Nachweisorganismus. Man vereinigt die Fraktionen entsprechend dem Faktorgehalt und der nachgewiesenen Aktivität. Die vereinigten Fraktionen dampft man im Vakuum zur Trockne ein. Jeden der in dieser Weise erhaltenen Rückstände löst man in 50 ml Chloroform und versetzt jede Chloroformlösung mit 500 ml n-Pentan, um den gewünschten Faktor auszufällen. Die Ergebnisse der Säulenfraktionierung sind die folgenden:
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erhaltener
Faktor		 Fraktionen Ausbeute ungefähre Reinheit
A 18-23 10,153 g rein
A 24-30 597,6 mg 60 %
B 31-43 278,8 mg 80 %
C 49-56 218,4 mg 60 %
Die unreinen Faktoren werden einer weiteren Chromatographie über Kieselgelsäulen unter Anwendung der obigen Verfahrensweise unterzogen, so daß man die gereinigten Faktoren B und C und eine zusätzliche Menge des gereinigten Faktors A erhält.
Beispiel 6 Kristallisation des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man löst 1 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen gereinigten Faktors A in 10 ml Chloroform. Dann gibt man 10 ml absolutes Äthanol (das 0,5 % Benzol enthält) zu. Man läßt die erhaltene Lösung während 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen und kühlt sie dann über Nacht auf 5 0C ab. Die gebildeten Kristalle v/erden abzentrifugiert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet, wobei man 513 mg des kristallinen Antibioticums A-7413 Faktor A erhält.
Das Antibioticum A-7413 Faktor A kristallisiert in ähnlicher Weise bei Verwendung der folgenden Lösungsmittelmischungen:
Chloroform/sec.-Butanol Chloroform/n-Propanol Chloroform/Isopropylalkohol Dimethylformamid/Aceton Aceton/Äthanol wnßriges Äthanol
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* 60.
Beispiel 7
Aminoniumsalz des Antibiotlcums A-7413 Faktor A
Man gibt 200 mg des nach Beispiel 6 bereiteten Antibioticums A-7413 Faktor A zu 10 ml einer 0,01 η Ammoniumhydroxidlosung. Man rührt die Suspension während 20 Minuten unter Verwendung einer Mischeinrichtung (Virtis blender). Dann trennt man das unlösliche Material durch Zentrifugieren ab und verwirft es. Die überstehende Lösung wird gefriergetrocknet und ergibt 158,7 mg des Ammoniumsalzes des Antibioticums A-7413 Faktor A in Form eines gelben wasserlöslichen Pulvers.
Beispiel 8 Kaliumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man suspendiert 3 g des gemäß Beispiel 6 bereiteten Antibioticums A-7413 Faktor A in 150 ml Wasser. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension beträgt 4,3 und wird durch Zugabe von 41 ml einer 0,05 η Kaliumhydroxidlösung auf einen Wert von 9,5 eingestellt. Diese Lösung rührt man unter Verwendung einer Mischeinrichtung während 30 Minuten. Dann trennt man das unlösliche Material durch Zentrifugieren ab. Die überstehende Lösung wird gefriergetrocknet und ergibt 2,61 g des Kaliumsalzes des Antibioticums A-7413 Faktor A in Form eines gelben wasserlöslichen Pulvers.
Das Kaliumsalz wird weiter gereinigt und kristallisiert, indem man 200 mg dieses Pulvers in 8 ml Methanol löst, die unlöslichen Verunreinigungen abzentrifugiert, Diäthyläther zu der abgetrennten überstehenden Lösung zusetzt und das Material während 3 Tagen bei 5 0C kühlt. Die gebildeten Kristalle werden abzentrifugiert und getrocknet und ergeben 141,8 mg des kristallinen Kaliumsalzes des Antibioticums A-7413 Faktor A.
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Beispiel 9 Calclumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man löst 2OO mg des gemäß Beispiel 6 bereiteten Antibioticums A-7413 Faktor A in 20 ml Methanol und setut der methanolischen Lösung unter Rühren langsam eine 0,1 η Calciumhydroxidlösung zu, bis die Lösung einen pH-Wert von 9,1 besitzt. Dann versetzt man die gebildete Lösung mit 6 Volumen Diäthylather, um das Salz auszufällen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und getrocknet und ergibt 80,1 mg des Calciumsalzes des Antibioticums A-7413 Faktor A. Die Analyse des Materials durch Atomabsorption zeigt, daß das Produkt 1,81 % Calcium enthält.
Beispiel 10 Triäthylaminsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man behandelt 200 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A nach der Verfahrensweise des Beispiels 7, jedoch unter Verwendung einer 0,01 η Triäthylaminlösung, und erhält 122,2 mg des Triäthy!ammoniumsalzes des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Beispiel 1 Dinatrlumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man behandelt 300 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A nach der Verfahrensweise von Beispiel 7, jedoch unter Verwendung von 30 ml einer 0,01 η Natriumhydroxidlösung, und erhält 260 mg des Dinatrlumsalzes des Antibioticums A-7413, Faktor A in Form einer gelben wasserlöslichen Verbindung (die gemäß der Analyse durch Atomabsorption 2,67 % Natrium enthält).
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Beispiel 12 Mononatriumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man behandelt 200 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A nach der Verfahrensweise von Beispiel 9, jedoch unter Verwendung einer 0,1 η Natriumhydroxidlösung, um den pH-Wert der Lösung auf 8,6 einzustellen, um erhält 151,6 mg des Mononatriumsalzes des Antibioticums A-7413 Faktor A in Form einer wasserlöslichen Verbindung (die gemäß der Atomabsorptionsanalyse 1,43 % Natrium enthält).
Beispiele 13 - 18
Man bereitet das Dinatriumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor B nach der Verfahrensweise des Beispiels 8, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor B und von 0,01 η Natriumhydroxidlösung.
Man bereitet das Ammoniumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor B nach der Verfahrensweise des Beispiels 7, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor B.
Man bereitet das Bariumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor B nach der Verfahrensweise des Beispiels 9, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor B und einer 0,1 η Bariumhydroxidlösung .
Man bereitet das Mononatriumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor C nach der Verfahrensweise des Beispiels 9, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor C und einer 0,1 η Natriumhydroxidlösung.
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Man bereitet das Isopropylaminsalz des Antibioticums A-7413 Faktor C nach der Verfahrensweise des Beispiels 10, jedoch unter Verv/endung des Antibioticums A-7413 Faktor C und einer 0,01 η Isopropylaminlösung.
Man bereitet das Magnesiumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor C nach der Verfahrensweise des Beispiels 9, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor C und einer 0,1 η Magnesiumhydroxidlösung.
Beispiel 19 Acetylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man löst 500 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A in 20 ml Dimethylsulfoxid. Dann versetzt man die Lösung mit 8 ml Essigsäureanhydrid und läßt die Mischung während 2 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann engt man die Mischung im Vakuum auf ein Volumen von etwa 15 ml ein, versetzt das Konzentrat mit 15 ml Methanol und gibt die gebildete Mischung zu 2 40 ml Diäthyläther. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet und ergibt 216 mg des Acetylesterderivats des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Beispiel 20 Acetylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man löst 500 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A in 20 ml Pyridin. Dan gibt man 8 ml Essigsäureanhydrid zu der Lösung und läßt die Mischung während 2 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen, worauf man die Mischung im Vakuum zur Trockne eindampft. Man löst den Rückstand in 4 ml Chloroform und gibt die Lösung zu 60 ml n-Pentan. Der gebildete Niederschlag
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• Vt.
wird abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet und ergibt 421 rng des Acetylesterderivats des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Beispiele 21 - 25
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 bereitet man das Propionylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A unter Verwendung von Propionsäureanhydrid.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 bereitet man unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor B und von n-Buttersäureanhydrid das n-Butyrylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor B.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 bereitet man unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor C und von η-VaIeriansäureanhydrid das n-Valerylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor C.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20/ jedoch unter Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid, bereitet man das Succinylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 und unter Verwendung des gemischten Essigsäure-ameisensäureanhydrids bereitet man das Formylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor B.
Beispiel 26 .Methylester des Antibioticums A-7413 Faktor A
Man löst 100 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A in einer Mischung aus 5 ml Methanol und 0,6 ml Chloroform. Dann gibt
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man 7 ml einer Lösung von Diazomethan in Äther zu der Lösung des Antibioticums A-7413 Faktor A. Die gebildete Lösung rührt man während 30 Minuten und läßt sie dann während 4,5 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man dampft die Lösung im Vakuum zur Trockne ein, löst den erhaltenen Rückstand in 4 ml Methanol und dampft die Lösung im Vakuum zur Trockne ein. Den gebildeten Rückstand löst man in 3 ml Chloroform, worauf man die Chloroformlösung zu 30 ml n-Pentan zugibt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und getrocknet und ergibt 87 mg des Methylester und des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Beispiele 27 - 29
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 26, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor B und von Diazoäthan bereitet man den Diäthylester des Antibioticums A-7413 Faktor B.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 26, jedoch unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor C und von Diazo-2-propan bereitet man den 2-Propylester des Antibioticums A-7413 Faktor C.
Unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Entwässerungsmittel bereitet man durch Umsetzung des Antibioticums A-7413 Faktor A mit n-Butanol unter Anwendung üblicher Verfahren den n-Buty!ester des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Beispiel 30 Bis(mercaptoessigsäure)derivat des Antibioticums A-7413 Faktor B
Man löst 200 mg des Antibioticums A-7413 Faktor A in Form der freien Säure in 2,8 ml Ν,Ν-Dimethylformamid. Dann versetzt man
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• Ct.
die Lösung mit 200 mg Mercaptoessigsäure. Die gebildete Lösung sättigt man mit Stickstoff durch Einleiten des Stickstoffs in die Lösung während 30 Minuten, worauf man die Lösung während 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen läßt. Man engt die Lösung auf ein geringes Volumen ein und trägt die konzentrierte Lösung in 25 Volumen Diäthyläther ein. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet und ergibt 179 mg des Bis(mercaptoessigsäure) derivats des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Beispiele 31 - 35
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 bereitet man unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor B und von 2-Mercaptopropionsäure das Bis(2-mercaptopropionsäure)derivat des Antibioticums A-7413 Faktor B.
Unter Verwendung des Antibioticums A-7413 Faktor C und 3-MercaptopropionsHure bereitet man nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 das Bis(3-mercaptopropionsäure)derivat des Antibioticums A-7413 Faktor C.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 bereitet man unter Einsatz von Mercaptobernsteinsäure das Bis(mercaptobernsteinsäure) derivat des Antibioticums A-7413 Faktor A.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 33 bereitet man das Mono(mercaptobernsteinsäure)derivat des Antibioticums A-7413 Faktor A, wobei man die Lösung während einer Zeit von lediglich 6 Stunden stehen läßt.
Nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 bereitet man das L-Cysterinderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A, wozu man L-Cystein verwendet und das Produkt chromatographisch reinigt.
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Antibioticmischung A-7413, enthaltend die Faktoren A, B, C und D; das Antibioticum A 7413 Faktor A, das Antibioticum A-7413 Faktor B, das Antibioticum A-7413 Faktor C und das Antibioticum A-7413 Faktor D; die C1-C.-Alkylester, die Cj-Cc-Acylester und die Thiol-Cj-C--carbonsäurederivate der Faktoren A, B und C; sowie die physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C und ihrer C1-C5-ACyI-ester und ihrer Thiol-C_-C.-carbonsäurederivate.
    2 4
    Antibioticum A-7413 Faktor A, gekennzeichnet durch ein nach der Kristallisation aus Äthanol weißes bis hellgelbes kristallines Material, das in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wäßrigem Äthanol schwach löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Di chlorine than, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Diäthylather und Wasser unlöslich ist, bei etwa 205 bis 212 0C schmilzt und
    A) ein durch Titration bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1308 aufweist,
    B) gemäß der Elementaranalyse etwa 51,92 % Kohlenstoff, 5,2 5 % Wasserstoff, 9,85 % Stickstoff, 22,63 Sauerstoff und 9,66 % Schwefel enthält,
    C) die Summenformel C72Hg7N13O23S5 aufweist,
    D) einen spezifischen Drehwert ^alpha/D von +54,5° (c = 2,0 in CHCl3) besitzt,
    E) ein Infrarot-Absorptionsspektrum, gemessen in einem KBr-Preßling mit den folgenden Absorptionsmaxima besitzt:
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    ORIGINAL INSPECTED
    2,9 3 (Schulter), 2,9 8 (mittel), 3,2 4 (schv/ach)/ 3,38 (Schulter), 3,44 (mittel), 3,53 (schv/ach), 5,78 (schwach), 6,03 (stark), 6,56 (stark), 6,79 (mittel), 7,08 (mittel), 7,27 (schv/ach), 7,49 (schwach), 7,65 (schwach), 8,08 (mittel), 8,41 (schwach), 8,62 (schwach), 8,81 (mittel), 9,03 (schwach), 9,35 (mittel), 9,60 (mittel), 9,92 (schwach), 10,20 (schwach), 12,05 (schwach), 12,66 (schwach) und 13,51 ,um (schwach),
    F) ein Ultraviolettabsorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:
    a) in neutralem, 95-prozentigem v/äßrigem Äthanol: 215 nm (eJ* = 485); 260 nm (Schulter; e]% = 240);
    1 cm
    300 nm (Schulter; e]% = 170);
    1 cm
    358 nm (Schulter; e]% = 112,5);
    1 cm
    b) in saurem Äthanol:
    217 nm (eJ* = 440); 265 nm (E]*m = 227,5) ; 293 nm <E]*m = 210); 358 nm (E^ = 95);
    c) in basischem Methanol:
    273 nm (Schulter; EJ*m = 255); 408 nm (e]* = 80);
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    ei
    80-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid besitzt,
    G) eine titrierbare Gruppe mit einem pK -Wert von 7,9 in
    H) dessen Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse die Anwesenheit von Ammoniak, Glycin, Threonin, Asparaginsäure und einer noch nicht identifizierten Aminosäure erkennen läßt,
    I) ein charakteristisches Röntgen-Pulverbeugungsdiagramm (Cu++-Strahlung, 1,54505 lambda, Nickelfilter) mit den folgenden Netzebenenabständen d in Sngström besitzt:
    d Relative Intensität
    12,44 100
    10,77 70
    7,96 100
    5,71 50
    5,09 80
    4,5 3 100
    4,25 80
    3,88 80
    3,61 10
    3,44 10
    3,03 5
    J) die folgenden R,-Vierte bei der Papierchromatographie mit den im folgenden angegebenen Werten unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus besitzt:
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    Rf -Viert O ,57 O ,49 O ,62 O ,30
    " ** " ^703938
    'I.
    Lösungsnittelsystem
    mit Wasser gesättigtes Butanol
    Methylisobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    Methanol/Wasser-iMischung (1/1)
    Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (1 2/3/1) mit NH4H auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und dann mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht
    0,71 Methanol/0,1 η HCl-Mischung (3/1)
    K) die folgenden Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung der im folgenden angegebenen Systeme unter Verwendung von Bacillus subtilis als Nachweisorganismus besitzt:
    Lösungsmittelsystern
    Rf -Wert 0 ,26 0 ,23
    Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) Acetonitril/Wasser-Mischung (9/1)
    L) eine Säurefunktion aufweist, die die Bildung von Salzen und Esterderivaten ermöglicht,
    M) mindestens eine Hydroxylgruppe aufweist, die zur Veresterung geeignet ist, und
    N) die Fähigkeit besitzt, mit ThiolcarbonsHuren Derivate zu bilden,
    sowie dessen C. -C.-Alkylester, dessen C. -C^-Acylester und deren Thiol-C^-C^-carbonsäurederivate,
    und die physiologisch verträglichen Salze des Antibioticums A-7413 Faktor A und seiner Acylester und seiner Thiolcarbonsäurederivate.
    709832/10Ü8
    27Ü3938
    3. Antibioticum A-7413 Faktor A.
    4. Ammoniumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    5. Kaliumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    6. Calciumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    7. Triäthylaminsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    8. Dinatriumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    9. Mononatriumsalz des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    10. Acetylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    11. Methylester des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    12. Bis(Mercaptoessigsäure)derivat des Antibioticums A-7413 Faktor A.
    13. Antibioticum A-7413 Faktor B, gekennzeichnet durch ein weißes bis hellgelbes amorphes Material, das bei einer Temperatur von mehr als 300 0C schmilzt und das in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wäßrigem Äthanol
    709832/ 1008
    Ό.
    schwach löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Diäthylather und Wasser unlöslich ist, und
    A) bei der Elementaranalyse etwa folgende Zusammensetzung zeigt:
    66.34 % Kohlenstoff, 8,73 % Wasserstoff, 2,98 % Stickstoff, 19,39 % Sauerstoff und 2,33 % Schwefel,
    B) einen spezifischen Drehwert /alpha/ von -26,2 (c = 7,5, Dimethylsulfoxid) aufweist,
    C) ein in einem KBr-Preßling aufgenommenes Infrarot-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima besitzt:
    2,97 (stark), 3,38 (stark), 3,42 (stark), 3,50 (stark), 5,78 (Schulter), 5,99 (mittel), 6,50 (mittel), 6,80 (mittel), 6,90 (Schulter), 7,00 (Schulter), 7,22 (mittel), 7,27 (Schulter), 7,42 (schwach), 7,58 (schwach), 7,78 (Schulter), 7,9"? (mittel), 8,33-(Schulter), 8,53 (mittel), 9,00 (Schulter), 9,26 (stark), 9,71 (stark), 11,11 (schwach), 11,79 (schwach),
    12.35 (schwach und 13,25 ,um (schwach),
    D) ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima besitzt:
    a) in neutralem, 95-prozentigem wäßrigen Äthanol:
    268 nm (E]*m = 104,3);
    357 nm (Schulter; ^\\m - 30);
    b) in saurem Äthanol:
    263 nm (E % = 103,5); 357 nm (Schulter; E^% = 35);
    709832/10 0 8
    c) in basischem Äthanol:
    268 nm (Schulter; E]*m = 178,6)
    E) eine Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse besitzt, die die Anwesenheit von Ammoniak, Glycin, Threonin, Aspara ginsäure und einer noch nicht identifizierten Aminosäure anzeigt,
    F) bei Anwendung der im folgenden angegebenen papierchromatographischen Systeme unter der Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus die folgenden R.c-Werte besitzt:
    R_-Wert Lösungsmittelsystem 0,4 6 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,33 Methylisobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    0,5 8 Methanol/Wasser-Mischung (1/1)
    0,26 Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (12/3/1),
    mit ΝΗ,ΟΗ auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und dann mit Η-,ΡΟ. auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht
    0,71 Methanol/0,1 η HCl-Mischung (3/1)
    G) bsi Anwendung der im folgenden angegebenen Kieselgel-Dünnschichtchromatographiesysteme und bei Verwendung von Bacillus subtilis als Nachweisorganismus die folgenden Rf-Werte besitzt:
    R--Wert Lösungsmittelsystem
    O,09 Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) 0,03 Acetonitril/VJasser-Mischung (9/1)
    709832/10 0
    II) eine Säurefunktion aufweist, die die Bildung von Salzen und Esterderivaten ermöglicht,
    I) mindestens eine Hydroxylgruppe trägt, die verestert werden kann, und
    J) mit Thiolcarbonsäuren Derivate bildet,
    sowie die C1-C.-Alkylester, die C1-C^-Acylester und die Thiol-C--C .-carbonsäurederivate davon,
    und die physiologisch verträglichen Salze des Antibioticums A-7413 Faktor B und der Acylester und der Thiolcarbonsäurederivate davon.
    14. Antibioticum A-7413 Faktor B.
    15. Antibioticum A-7413 Faktor C, gekennzeichnet durch ein weißes bis hellgelbes amorphes Material, das oberhalb 250 0C schmilzt und das in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wäßrigem Äthanol schwach löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Diäthylather und Wasser unlöslich ist, und
    A) bei der Elementaranalyse etwa folgende Zusammensetzung besitzt; 69,38 % Kohlenstoff, 9,92 % Viasserstoff, 2,34 % Stickstoff, 16,53 % Sauerstoff und 1,73 % Schwefel,
    B) ein in einem KBr-Preßling aufgenommenes Infrarot-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:
    709832/10 0 8
    •J·
    3,00 (mittel), 3,38 (Schulter), 3,42 (stark), 3,51 (stark), 5,73 (mittel), 6,02 (mittel), 6,14 (Schulter), 6,52 (schwach), 6,56 (schwach), 6,77 (mittel), 6,80 (Schulter), 6/97 (schwach), 7,20 (schwach), 8,25 (schwach), 8,33 (schwach), 8,40 (schwach), 8,86 (schwach), 9,39 (schwach), 10,O5 (schwach), 10,53 (schwach), 10,70 (schwach), 11,77 (schwach) und 13,66 ,um (schwach),
    C) ein Untraviolett-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima aufweist:
    a) in neutralem, 95-prozentigem wäßrigem Äthanol: 205 nm (E]*m = 356);
    235 nm (Schulter; E]*m = 180); 260 nm (Schulter; EJ*m = 127); 290 nm (Schulter; e]% = 104);
    lern
    b) in saurem Äthanol:
    205 nm (E]J1n = 356) ;
    235 nm (Schulter; e]% = 180);
    ι cm
    260 nm (Schulter; eJ* = 127); 290 nm (Schulter; E]Jm = 103); 355 nm (Schulter; E]*m = 40);
    c) in basischem Äthanol:
    260 nm (Schulter; E]*m = 268); 325 nm (Schulter; F.]*m = 189);
    709832/1008
    D) dessen Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse die Anwesenheit von Ammoniak, Glycin, Threonin, Asparaginsäure und Phenylalanin anzeigt,
    E) bei Anwendung der im folgenden angegebenen papierchromatographischen Systeme und unter Benutzung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus die folgenden R^-Werte besitzt:
    Lösungsmittelsystem
    Rf -Wert O ,82 O ,90 O ,31 O ,06
    mit Wasser gesättigtes Butanol
    Methylisobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    Methanol/Wasser-Mischung (1/1)
    Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (12/3/1) , mit NH.OH auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und dann mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht
    0,42 Methanol/0,1 η HCl-Mischung (3/1)
    F) unter Verwendung der im folgenden angegebenen Kieselgel-Dünnschichtchromatographiesysteme und bei Anwendung von Bacillus subtilis als Nachweisorganismus die folgenden R^-Werte besitzt:
    Lösungsmittelsystem
    Rf -Wert 0 ,46 0 ,42
    Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) Acetonitril/Wasser-Mischung (9/1)
    G) eine Säurefunktion aufweist, die zur Bildung von Salzen und Esterderivaten geeignet ist,
    709832/ 1008
    27Ü3938
    H) mindestens eine Hydroxylgruppe aufweist, die eine Veresterung ermöglicht, und
    I) mit Thiolcarbonsäure Derivate bildet,
    sowie C1-C.-Alkylester, die C.-C5-ACylester und die ThXoI-C2-C4-carbonsäurederivate davon,
    und die physiologisch verträglichen Salze des Antibioticums A-7413 Faktor C und der Acylester und der Thiolcarbonsäurederivate davon.
    16. Antibioticum A-7413 Faktor C.
    17. Antibioticum A-7413 Faktor D, das
    h) bei den im folgenden angegebenen papierchromatographischen Systemen und bei Verv/endung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus die folgenden Rf-Werte besitzt:
    R--Wert Lösungsmittelsystem 0,61 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,61 Methylisobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    0,62 Methanol/Wasser-Mischung (1/1)
    0,20 Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (12/3/1),
    mit NH-OH auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und dann mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht
    0,71 Methanol/0,1 η HCl-Mischung (3/1) und
    709832/10 0 8
    -«*- 27Ü3938
    B) bei Verwendung der im folgenden angegebenen Kieselgel-Dünnschichtchromatographiesysteme und bei Anwendung von Bacillus subtilis als Nachweisorganismus die folgenden R,-Werte besitzt:
    Lösungsmittelsystem
    Rf -Wert 0 ,55 0 ,48
    Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) Acetonitril/Wasser-Mischung (9/1).
    18. Verfahren zur Herstellung der Antibioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, des Antibioticums A-7413 Faktor A, des Antibioticums A-7413 Faktor B, des Antibioticums A-7413 Faktor C und des Antibioticums A-7413 Faktor D, der C1-C--Alkylester, der C.-C^-Acylester und der Thiol-C_-C.-carbonsäurederivate der Faktoren A, B und C, und der physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C und ihrer C.-Cr-Acylester und ihrer Thiol-C_-C.-carbonsäurederivate, dadurch gekennzeichnet , daß man
    a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 oder eine das Antibioticum A-7413 bildende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibioticums gebildet ist,
    b) gegebenenfalls die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt,
    c) gegebenenfalls die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C oder D aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert,
    709832/ 1 008
    d) gegebenenfalls die C1-C.-Alkylester, die C.-C5-ACylester oder die Thiol-C^-C.-carbonsäurederivat
    A-7413 Faktoren A, B oder C bildet, und
    oder die Thiol-C^-C.-carbonsäurederivate der Antibiotica
    e) gegebenenfalls physiologisch verträgliche Salze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C oder ihrer C1-Cc
    ester oder ihrer Thiol-C^-C^-carbonsäurederivate bildet.
    19. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung einer abgetrennten Antibioticmischung A-7413, dadurch ge kennzeichnet , daß man
    a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 oder eine das Antibioticum A-7413 bildende Mutante davon züchtet,
    b) die Antibioticmischung A-7413 aus dem Kulturmedium abtrennt.
    20. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung des Antibioticums A-7413 Faktor A, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 oder eine das Antibioticum A-7413 bildende Mutante davon züchtet,
    b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt, und
    c) das Antibioticum A-7413 Faktor A aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert.
    709832/1008
    21. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung des Methylesters des Antibioticums A-7413 Faktor A, dadurch gekennzeichnet , daß man
    a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 oder eine das Antibioticum A-7413 bildende Mutante davon züchtet,
    b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt,
    c) das Antibioticum A-7413 Faktor A aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert, und
    d) den Hethy!ester des Antibioticums A-7413 Faktor A bildet.
    22. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung des Acetylesterderivats des Antibioticums A-7413 Faktor A, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 oder eine das Antibioticum A-7413 bildende Mutante davon züchtet,
    b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt,
    c) das Antibioticum A-7413 Faktor A aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert, und
    d) das Acetylesterderivat des Antibioticums A-7413 Faktor A bildet.
    23. Mittel zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit ausgebildeter Pansenfunktion, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Trägermatrial und als Wirkstoff die Antibioticmischung A-7413, das Antibioticum
    709832/1008
    A-7413 Faktor Λ, das Antibioticum A-7413 Faktor B, das Antibioticum A-7413 Faktor C oder das Anibioticum A-7413 Faktor D, oder einen C.-C4-Alkylester, einen C. -Cp-Acylester oder ein
    Thiol~C2-C.-carbonsäurederivat des Antibioticums A-7413 Faktor A, B oder C oder ein physiologisch verträgliches Salz des Antibioticums A-7413 Faktor A, B oder C oder eines Acylesters oder eines Thiolcarbonsäurederivates des Antibioticums A-7413 Faktor A, B oder C enthält.
    24. Mittel nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff die Antibioticmischung A-7413 enthält.
    25. Mittel nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Antibioticum A-7413 Faktor A oder ein physiologisch verträgliches Salz davon enthält.
    26. Verfahren zur Steigerung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit ausgebildeter Pansenfunktion, dadurch gekennzeichnet , daß man den Tieren auf oralem Wege eine die Propionatbildung steigernde Menge der Antibioticmischung A-7413, des Antibioticums A-7413 Faktoren A, B, C oder D, eines C. -C,-Alkylesters, eines C.-C--Acylesters oder eines Thiol-C^-C.-carbonsaurederivats des Antibioticums A-7413 Faktor A, 3 oder C oder ein physiologisch verträgliches Salz des Antibioticums A-7413 Faktor A, B oder C oder eines Acylesters oder eines Thiolcarbonsäureesters des Antibioticums A-7413
    Faktor A, B oder C verabreicht.
    27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß man als Wirkstoff die Antibioticmischung A-7413 verabreicht.
    709832/10 0 8
    23. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß nan als Wirkstoff das Antibioticum A-7413 Faktor A oder ein physiologisch vertragliches Salz davon verwendet.
    7 0 9 8 3 2 / 1 Ü Ü 8
DE2703938A 1976-02-04 1977-01-31 Antibiotikamischung A-7413, Antibiotikum A-7413 Faktoren A, B, C und D und Verwendung der Antibiotikamischung oder ihrer isolierten Faktoren A, B, C und D als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel Expired DE2703938C2 (de)

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