CH634598A5

CH634598A5 - Process for preparing the antibiotic mixture A-7413

Info

Publication number: CH634598A5
Application number: CH133677A
Authority: CH
Inventors: Robert L Hamill; William Max Stark
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1976-02-04
Filing date: 1977-02-03
Publication date: 1983-02-15
Also published as: DE2703938A1; IE45014B1; FR2340325B1; NL7701176A; JPS6017515B2; CA1090728A; GB1574023A; FR2340325A1; JPS52108094A; IE45014L; BE850899A; DE2703938C2; IL51277A; IL51277A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Antibioticmischung A-7413. Das erfindungsge-mässe Verfahren zur Herstellung der Antibioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, und der physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C, ist dadurch gekennzeichnet, dass man den neuen Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibioticums gebildet ist, und gegebenenfalls physiologisch verträgliche Salze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C bildet.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Antibioticmischung A-7413 und die nach dem Verfahren erhaltenen Verbindungen A-7413 sind beispielsweise nützliche Mittel zur Wachstumsförderung und zur Bekämpfung von Zahnkaries und von Akne.

Die Antibiotica A-7413 sind neue Vertreter der schwefelhaltigen Thiostreptonfamilie der Antibiotica. Andere Vertreter dieser Familie sind beispielsweise Siomycin, Taitomycin, Thio-strepton und Thiopeptin B.

Die erfindungsgemässe Gruppe von schwefelhaltigen Antibiotica wird als die Gruppe der Antibiotica A-7413 bezeichnet.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile ergeben sich aus der weiteren Beschreibung und den Beispielen, in denen auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen ist.

Die Zeichnungen zeigen die Infrarotabsorptionsspektra der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C, die mit KBr-Press-lingen erhalten wurden, und zwar:

Figur 1 : Antibioticum A-7413 Faktor A,

Figur 2: Antibioticum A-7413 Faktor B,

Figur 3: Antibioticum A-7413 Faktor C.

Man erhält die Mischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, durch Züchten des neuen Mikroorganismusstammes Actinoplanes sp. NRRL 8122 unter bestimmten Bedingungen.

Wie es bei vielen Antibiotica liefernden Kulturen gewöhnlich der Fall ist, führt die Fermentierung oder Züchtung eines das Antibioticum A-7413 liefernden Stammes des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 zur Bildung einer Vielzahl von antibiotischen Substanzen. Der Antibioticum A-7413 Faktor A ist im allgemeinen der von dieser Kultur gebildete Hauptfaktor, während die Faktoren B, C und D drei in geringerer Menge gebildete Faktoren darstellen. Andere Faktoren sind üblicherweise nur in sehr geringen Mengen vorhanden oder sind relativ instabil.

Die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D werden gleichzeitig während der Züchtung bzw. Fermentation gebildet und als Antibioticmischung A-7413 erhalten. Das Verhältnis, in dem die einzelnen Faktoren in der Antibioticmischung gebildet werden, variiert im allgemeinen in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen. Die einzelnen Antibioticfaktoren werden vorzugsweise in der nachfolgend beschriebenen Weise voneinander getrennt und als Einzelverbindungen isoliert:

Antibioticum A-7413 Faktor A

Der Antibioticum A-7413 Faktor A ist ein weisses bis hellgelbes kristallines Material, das unter Zersetzung bei etwa 205 bis 212 °C schmilzt. Der Antibioticum A-7413 Faktor A kristallisiert aus Äthanol, Chloroform/Äthanol-Mischungen und Dimet-hylformamid/Aceton-Mischungen.

Der Antibioticum A-7413 Faktor A ist in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich; in Äthanol und wässrigem Äthanol wenig löslich; und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methyl-isobutylketon, Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser unlöslich. Die Elementaranalyse des Antibioticum A-7413 Faktors A weist auf die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Mittelwert) hin: 51,92% Kohlenstoff, 5,25% Wasserstoff, 9,85% Stickstoff, 22,63% Sauerstoff und 9,66% Schwefel. Die für den Antibioticum A-7413 Faktor A vorgeschlagene ungefähre Summenformel ist folgende: C72H87N12O23S5.

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Das durch Titration bestimmte Molekulargewicht des Antibioticum A-7413 Faktors A beträgt etwa 1308.

Das in einem KBr-Pressling aufgezeichnete Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktors A ist in der Figur 1 dargestellt. Es sind die folgenden Absorptionsma- 5 xima zu beobachten:

2,93 (Schulter), 2,98 (mittel), 3,24 (schwach),3,38 (Schulter), 3,44 (mittel), 3,53 (schwach), 5,78 (schwach), 6,03 (stark), 6,56 (stark), 6,79 (mittel), 7,08 (mittel), 7,27 (schwach), 7,49 (schwach), 7,65 (schwach), 8,08 (mittel), 8,41 (schwach), 8,62 (schwach), 8,81 io (mittel), 9,03 (schwach), 9,35 (mittel), 9,60 (mittel), 9,92 (schwach), 10,20 (schwach), 12,05 (schwach), 12,66 (schwach) und 13,51 (im (schwach).

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktors A zeigt die folgenden Absorptionsmaxima: is a) in neutralem, 95prozentigem wässrigen Äthanol: 215nm(E,™ = 485);

260 nm (Schulter; EiJ-m = 240);

300 nm (Schulter; Eiè™ = 170);

358 nm (Schulter; E^m = 112,5); 20

b) in saurem Äthanol:

217nm(E,S = 440);

265 nm(El11cm= 227,5);

293 nm (ES =210);

358 nm (E^ = 95); 25

c) in basischem Methanol:

278 nm (Schulter; Eièm = 255);

408nm(E1ä=80).

Die elektrometrische Titration des Antibioticum A-7413 Faktors A in 80prozentigem wässrigem Dimethylformamid 30 weist auf die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 7,9 hin.

Die nach der sauren Hydrolyse durchgeführte Aminosäureanalyse des Antibioticum A-7413 Faktors A weist auf die Anwesenheit von Ammoniak (1,03 p, Mol/mg), Glycin (0,33 |i 35 Mol/mg), Threonin (0,40 |i Mol/mg), Asparaginsäure (0,1 p Mol/mg) und eine noch nicht identifizierte Aminosäure (etwa 0,4 (X Mol/mg) hin.

Die Antibioticum A-7413 Faktor A besitzt einen spezifischen Drehwert [alpha]o von + 54,5° (c = 2,0, CHCb). 40

Der aus einer Chloroform/Äthanol-Mischung kristallisierte Antibioticum A-7413 Faktor A besitzt das folgende charakteristische Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm: (Cu++-Strahlung, 1,5405 lambda, Nickelfilter, d = Netzebenenabstand in Angstrom):

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d Relative Intensität

12,44 100

10,77 70

7,96 100

5,71 50

5,09 80

4,53 100

4,25 80

3,88 80

3,61 10

3,44 10

3,03 5

Antibioticum A-7413 Faktor B 60

Der Antibioticum A-7413 Faktor B ist ein weisses bis hellgelbes amorphes Material, das bei einer Temperatur von mehr als 300 °C schmilzt.

Der Antibioticum A-7413 Faktor B ist in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid 65 löslich, in Äthanol und wässrigem Äthanol wenig löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methyl-isobutylketon, Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser unlöslich.

Die Elementaranalyse des Antibioticum A-7413 Faktors B weist auf folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung hin: 66,34% Kohlenstoff, 8,73% Wasserstoff, 2,98% Stickstoff, 19,39% Sauerstoff und 2,83% Schwefel.

Das in einem KBr-Pressling aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktors B ist in der Fig. 2 dargestellt. Es sind die folgenden Absorptionsmaxima zu beobachten:

2,97 (stark), 3,38 (stark), 3,42 (stark), 3,50 (stark), 5,78 (Schulter), 5,99 (mittel), 6,50 (mittel), 6,80 (mittel), 6,90 (Schulter), 7,00 (Schulter), 7,22 (mittel), 7,27 (Schulter), 7,42 (schwach), 7,58 (schwach), 7,78 (Schulter), 7,97 (mittel), 8,33 (Schulter), 8,53 (mittel), 9,00 (Schulter), 9,26 (stark), 9,71 (stark), 11,11 (schwach), 11,79 (schwach), 12,35 (schwach) und 13,25 um (schwach).

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktors B weist folgende Absorptionsmaxima auf:

a) in neutralem, 95prozentigem wässrigen Äthanol: 268nm(E,^= 104,3);

357 nm (Schulter; E^ = 30);

b) in saurem Äthanol:

268 nm(E,™= 108,5);

357 nm (Schulter; Eicm = 35);

c) in basischem Äthanol:

268 nm (Schulter; E!cm= 178,6).

Der Antibioticum A-7413 Faktor B besitzt einen spezifischen Drehwert [alpha^ von -26,2° (c = 7,5, Dimethylsulfoxid).

Die nach der sauren Hydrolyse durchgeführte Aminosäureanalyse des Antibioticum A-7413 Faktors B weist auf die Anwesenheit von Ammoniak (0,46 p, Mol/mg), Glycin (0,1 p Mol/mg), Threonin (0,1 n Mol/mg), Asparaginsäure (0,02 jj, Mol/mg) und einer bislang nicht identifizierten Aminosäure (etwa 0,11 n, Mol/mg) hin.

Antibioticum A-7413 Faktor C

Der Antibioticum A-7413 Faktor C ist ein weisses bis hellgelbes amorphes Material, das bei mehr als 250 °C schmilzt.

Der Antibioticum 7413 Faktor C ist in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan und Dimethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wässrigem Äthanol schwach löslich und in Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser unlöslich.

Die Elementaranalyse des Antibioticum A-7413 Faktors C lässt auf die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung schliessen: 69,38% Kohlenstoff, 9,92% Wasserstoff, 2,34% Stickstoff, 16,58% Sauerstoff und 1,73% Schwefel.

Das in einem KBr-Pressling aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktors C ist in der Fig. 3 dargestellt. Es sind die folgenden Absorptionsmaxima zu beobachten:

3,00 (mittel), 3,38 (Schulter), 3,42 (stark), 3,51 (stark), 5,73 (mittel), 6,02 (mittel), 6,14 (Schulter), 6,52 (schwach), 6,56 (schwach), 6,77 (mittel), 6,80 (Schulter), 6,97 (schwach), 7,20 (schwach), 8,25 (schwach), 8,33 (schwach), 8,40 (schwach), 8,86 (schwach), 9,39 (schwach), 10,05 (schwach), 10,53 (schwach), 10,70 (schwach), 11,77 (schwach) und 13,66 um (schwach).

Die nach der sauren Hydrolyse durchgeführte Aminosäureanalyse des Antibioticum A-7413 Faktors C weist auf die Anwesenheit von Ammoniak (0,24 |i Mol/mg), Glycin (0,05 |x Mol/mg), Threonin (0,04 ji Mol/mg), Asparaginsäure (0,01 p. Mol/mg und Phenylalanin (0,05 p Mol/mg) hin.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibioticum A-7413 Faktors C besitzt folgende Absorptionsmaxima:

a) in neutralem, 95prozentigem wässrigem Äthanol: 205 nm (E,J.m = 356);

235 nm (Schulter; Eicm= 180);

260 nm (Schulter; Eicm= 127);

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290 nm (Schulten E,^ = 104);

b) m saurem Äthanol:

205 nm(Eicm= 356);

235 nm (Schulter; Ei1c„ = 180);

260 nm (Schulter; E^m = 127);

290 nm (Schulter; Ei1c°m= 103);

355 nm (Schulter; Eièm = 40);

c) in basischem Äthanol:

260 nm (Schulter; = 268);

325 nm (Schulter; Eicm= 189).

Die mit verschiedenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 663 als Nachweisorganismus ermittelten RrWerte der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:

Tabelle I

Lösungsmittelsystem

A7413-A

A7413-B

A7413-C

A7413-D

mit Wasser gesättigtes

0,57

0,46

0,82

0,61

Butanol

Methylisobutylketon/

0,49

0,33

0,90

0,61

Butanol/Wasser-

Mischung (25/21/4)

Methanol/Wasser-

0,62

0,58

0,31

0,62

Mischung (1/1)

Wasser/Methanol/Ace-

0,30

0,26

0,06

0,20

ton-Mischung(12/3/l);

mit NBtOH auf einen

pH-Wert von 10,5

gestellt und dann mit

H3PO4 auf einen

pH-Wert von 7,5

gebracht

Methanol/0,ln-HCl-

0,71

0,42

0,71

Mischung(3/1)

Die auf zwei dünnschichtchromatographischen Systemen auf Kieselgel (vorbeschichtete Platten, E. Merck, Darmstadt, F-254, Schichtdicke = 0,25 nm) wiederum unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus ermittelten RrWerte der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B, C und D sind in der folgenden Tabelle II zusammengefasst:

Tabelle!!

Lösungsmittel- A-7413 A system

A-7413 B

A-7413 C

A-7413 D

Chloroform/Me- 0,26

0,09

0,46

0,55

thanol-Mischung

(9/1)

Acetonitril/Was- 0,23

0,03

0,42

0,48

ser-Mischung (9/1 )

Jeder der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C besitzt eine Säurefunktion, die für die Bildung von Salzen und Estern geeignet ist.

Die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C sowie beispielsweise ihre Ci-C5-Acylester und ihre Thiol-C2-Ct-carbon-säurederivate können Salze bilden. Die physiologisch verträglichen Salze, z.B. die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und Aminsalze, der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. «Physiologisch verträgliche Salze» sind vorzugsweise Salze, die auch pharmazeutisch annehmbar sind, d.h. Salze, die die Toxizität der Verbindung als ganzer gegenüber der nicht in Salzform vorliegenden Verbindung nicht erhöhen. Repräsentative und geeignete Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze sind die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rudibium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Geeignete Aminsalze sind die Ammoniumsalze, die primären, sekundären und tertiären Ci-Gi-Alkylammonium-salze und die Hydroxy-C2-C4-alkylammoniumsalze. Beispiele für Aminsalze sind die durch Umsetzung mit Ammoniumhydroxid, sec.-Butylamin, Isopropylamin, Diäthylamin, Diisopropyl-amin, Äthanolamin, Triäthylamin und dergleichen gebildeten Salze.

Die mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen als Kationen gebildeten Salze erhält man beispielsweise unter Anwendung von Verfahren, wie sie üblicherweise für die Herstellung von kationischen Salzen angewandt werden. Beispielsweise löst man den Antibioticum A-7413 Faktor A in Form der freien Säure in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Äthanol, und versetzt diese Lösung mit einer Lösung, die die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base enthält. Das in dieser Weise gebildete Salz kann in üblicher Weise isoliert werden, beispielsweise durch Filtration oder durch Verdampfen des Lösungsmittels.

Die mit organischen Aminen gebildeten Salze können in ähnlicher Weise bereitet werden. Beispielsweise kann man das Amin zu einer Lösung des Antibioticum A-7413 Faktors A in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol zusetzen und dann das Lösungsmittel und das überschüssige Amin durch Verdampfen entfernen.

Die Ci-C4-Alkylesterderivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C kann man in üblicher Weise herstellen.

Jeder der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C besitzt mindestens eine Hydroxylgruppe, die beispielsweise für die Bildung von Acylesterderivaten geeignet ist. Die Ci-G>-Acyl-esterderivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C können ebenfalls nach Standardmethoden hergestellt werden. Beispielsweise setzt man den Antibioticum A-7413 Faktor A in Form der freien Säure in einem geeigneten Lösungsmittel mit dem entsprechenden Säureanhydrid während einer geeigneten Zeitdauer um, die dazu ausreicht, das gewünschte Acylesterde-rivat des Antibioticum A-7413 Faktors A zu bilden.

Die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C können ferner mit Thiolcarbonsäuren Derivate bilden. Diese Derivate stellt man beispielsweise nach dem Verfahren von M. Ebata et al. (J. * Antibiotics 22 (10) (1969) 451-456) her. Obwohl der genaue Aufbau dieser Derivate im allgemeinen nicht bekannt ist, weisen die Derivate mindestens eine Carboxylgruppe auf und können daher Salze bilden. Die Thiol-C2-C»-carbonsäurederivate der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C umfassen beispielsweise die mit Mercaptoessigsäure (Thioglykolsäure), 2-Mercap-topropionsäure (Thiomilchsäure), 3-Mercaptopropionsäure, Mercaptobernsteinsäure (Thioapfelsäure) und L-Cystein gebildeten Derivate.

Der neu aufgefundene und bislang nicht beschriebene Mikroorganismus, der den Antibiotickomplex A-7413 bildet, konnte taxonomisch als eine Species des Genus Actinoplanes charakterisiert werden. Die Gattung Actinoplanes ist eine Gruppe der Familie der Actinoplanaceae. Die Actinoplana-ceae stellen eine Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales dar, die zuerst von Couch beschrieben wurden [J. Elisha Mitchell Sei., Soc, 65,315,-318 (1949); 66,87-92 (1950); Trans. New York Acad. Sei, 16,315-318 (1954); J. Elisha Mitchell Sei. Soc, 71,148-155 und 269 (1955); «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», 8th Edition, 706-711 (1974); J. Elisha Mitchell Sei. Soc, 79,53-70 (1963)].

Eine Kultur des das Antibioticum A-7413 bildenden Mikroorganismus ist in der ständigen Sammlung des Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, USA, unter der Hinterlegungsnummer NRRL 8122 am 17. Oktober

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1975 hinterlegt worden. Einschränkungen betreffend die Erhältlichkeit von Kulturen wurden am 2. November 1976 beseitigt.

Die kennzeichnenden Merkmale des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 sind im folgenden angegeben: Neben gewissen zusätzlichen Untersuchungen wurden zur Ermittlung der Kennzeichen die Methoden angewandt, die von den International Streptomyces Project (E.B. Shirling und D. Gottleib, Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16 (1966) 313-340) zur Charakterisierung der Streptomycesarten empfohlen wurden. Die Farben wurden gemäss der I.S.C.C.-N.B.S.-Methode (K L Kelly und D.B. Judd, «The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names», U.S. Dept. of Commerce Circular No. 553, Washington, D.C, USA) bezeichnet. Die Farbblöcke nach Maerz und Paul (A. Maerz und M.R. Paul is «Dictionary of Color», McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y. (1950), USA) sind in Klammern angegeben.

Morphologie

Auf Storaxpollen (Liquidambar) werden in grossem 20

Umfang vegetative Myzelien und Sporangien gebildet. Es gibt keinen Hinweis auf die Pollen durchdringende Hyphen. Auf Pinuspollen werden keine Sporangien gebildet.

Die Sporangien besitzen üblicherweise einen Durchmesser von 9 bis 14 um und sind kugelig bis subkugelig bis unregelmäs- 25 sig geformt. Die Hauptform ist unregelmässig. Die Sporen sind sphärisch mit vielen Geissein und besitzen eine Grösse von 1,4 bis 1,7 p.m; nur wenige Sporen sind beweglich.

Züchtungsverhalten (nach 21 Tagen bei 30 °C) 30

Hefe-Malz (ICP Nr. 2)

Agar nach Czapek

Hafermehl-Agar (ICP Nr. 3)

Anorganische Salze-Stärke (ICP Nr. 4)

Glycerin-Asparagin (ICP Nr. 5)

Medium nach Bennett

Tomatenmark-Hafer-mehl

Tyrosin-Agar

Hefeextrakt-Agar

Glucose-Asparagin

Calciummalat

Nährstoff-Agar

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starkes Wachstum, hellbraun (1218); kein lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet starkes Wachstum, mässig orange (11J8); kein lösliches Pigment; es werden keine Sporangien gebildet mittleres Wachstum, hellgelbgrün (10B1); kein lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet mässiges Wachstum,

bräunlichorange (13A10); schwach bräunliches lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet starkes Wachstum, mittelrötlichoranges Medium (10A10); kein lösliches Pigment; es werden Sporangien gebildet mittleres Wachstum, hellgelb (1 ICI); es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet 50 schwaches Wachstum, es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet mittleres Wachstum, gelblichgrau (12A2); es werden weder Sporangien 55 noch ein lösliches Pigment gebildet starkes Wachstum, bräunlichorange (13B9); es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet mässiges Wachstum, hellorangegelb (11 A4); es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet mässiges Wachstum, hellgelblichrosa (10A2); es werden weder Sporangien noch ein lösliches Pigment gebildet schwaches Wachstum, es werden weder einlösliches Pigment noch Luft-Hyphen gebildet

Agar nach Emerson

Wirkung auf

Magermilch

Nitratreduktion

Gelatineverflüssigung

Melaminbildung auf

Pepton-Eisen-Agar

(ICP Nr. 6)

T emperaturanforderun-gen auf

Glycerin-Asparagin-Agar

Kohlenstoffverwertung

Bewertung: +

(+)

(-)

(")

Rhamnose Cellobiose i-Inosit Cellulose Melezitose Fructose Dextrose D.-Xylose mittleres Wachstum, hellbraun (13F8); schwach rötlichbraunes Pigment; es werden keine Sporangien gebildet kein Wachstum positiv keine nach 21 Tagen positiv gutes Wachstum bei 26 bis 37 °C, intensivste rötlichorange Färbung bei 26 °C; kein Wachstum bei 43 °C

Verwertung wahrscheinliche Verwertung zweifelhafte Verwertung keine Verwertung

(+) (~) (~)

(+) (+) (+)

(+)

D-Mannit Raffinose Saccharose Maltose L-Arabinose Lactose Minus Kohlenstoff (Minus Carbon) -

+

(-) (") (+)

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Wie bei anderen Organismen unterliegen üblicherweise die Eigenschaften der das Antibioticum A-7413 bildenden Kultur, nämlich Actinoplanes sp. NRRL 8122, der Variation. Beispielsweise kann man durch die Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten Wellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien künstliche Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 8122 bilden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu dieser Species Actinoplanes gehören und Antibiotica A-7413 bilden, können erfindungsgemäss verwendet werden.

Zur Züchtung des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 kann man irgendeines der vielen Kulturmedien verwenden. Wegen der wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute bezüglich des Antibioticums, und einer leichten Produktisolierung sind jedoch gewisse Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise die für die Fermentation in grossem Massstab vorzugsweise angewandte Kohlenhydrat-quelle Dextrin, wenngleich man auch Glucose, Fruktose, Maltose, Saccharose oder dergleichen verwenden kann. Obwohl es für das Wachstum gewöhnlich nicht erforderlich ist, wird die Bildung des Antibioticums durch ein öl wie Maisöl gefördert. Weitere geeignete Kohlenstoffquellen sind Erdnussöl, Sojaöl, Fischöl und dergleichen. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist Sojabohnenmehl, obwohl man auch Sojabohnengriess, Peptone, Hafermehl, Erdnussmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsa-menöl, Aminosäuren und dergleichen verwenden kann. Als anorganische Salze setzt man dem Kulturmedium normalerweise die üblichen löslichen Salze zu, die Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat-Ionen und dergleichen liefern.

Die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlichen Spurenelemente sollten vorzugsweise ebenfalls in dem Kulturmedium vorhanden sein. Diese Spurenelemente treten üblicherweise als Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums in solchen Mengen auf, dass die

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Anforderungen des Mikroorganismus erfüllt werden.

Wenn das Schäumen der Medien bei einer Fermentation in grossem Massstab ein Problem darstellt, kann es erforderlich sein, ein Antischäummittel wie Polypropylenglycol in geringer Menge (d.h. in einer Menge von 0,2 ml/1) einzusetzen.

Für die Bildung erheblicher Mengen der Antibiotica A-7413 ist eine submerse, aerobe Fermentation in Tanks oder Behältern bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotica A-7413 kann man auch durch Schüttelflaschenkulturen herstellen. Wegen der Zeitverzögerung, die bei der Antibioticbildung auftritt, wenn man grosse Tanks oder Behälter mit den Sporen des Mikroorganismus animpft, ist es bevorzugt, ein vegetatives Inokulum bzw. eine vegetative Impfkultur zu verwenden. Die vegetative Impfkultur bereitet man gewöhnlich durch Animpfen eines geringen Volumens des Kulturmediums mit den Sporen oder mit Myzelfragmenten des Organismus, so dass man eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Die vegetative Impfkultur wird dann normalerweise in einen grösseren Behälter überführt. Das für das Wachstum der vegetativen Impfkultur verwendete Medium kann das gleiche sein, das man für die Fermentation in grösserem Massstab verwendet, wenngleich man hierzu auch andere Medien einsetzen kann.

Der die Antibiotica A-7413 bildende Organismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 37 °C gezüchtet werden. Die optimale Bildung der Antibiotica A-7413 scheint vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 25 bis 30 °C zu erfolgen.

Wie bei submersen, aeroben Züchtungsverfahren üblich, wird üblicherweise sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Um ein wirksames Wachstum des Organismus zu erreichen, soll das bei der Tankzüchtung angewandte Luftvolumen vorzugsweise dazu ausreichen, die Sättigung an gelöstem Sauerstoff bei mehr als 20% zu halten.

Der Anfangs-pH-Wert des nichtangeimpften Kulturmediums variiert normalerweise mit dem eingesetzten Medium. Im allgemeinen sollte der pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 liegen. Gegen Ende der Fermentation liegt gewöhnlich der bei der Gewinnung angewandte pH-Wert geringfügig niedriger und im Bereich von 6,0 bis 7,0.

Während der Fermentation oder der Züchtung kann man die Bildung der Antibiotica dadurch verfolgen, dass man Proben der Kulturbrühe oder von Extrakten der Myzel-Feststoffe in Bezug auf ihre antibiotische Wirkung untersucht. Für diesen Zweck sind beispielsweise Organismen geeignet, von denen bekannt ist, dass sie auf die Antibiotica A-7413 empfindlich reagieren. Ein besonders geeigneter Nachweisorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Die biologische Analyse wird normalerweise in üblicher Weise auf Papierscheiben oder Agar-Platten durchgeführt.

Im allgemeinen lässt sich die antibiotische Aktivität am zweiten Fermentationstag nachweisen. Die maximale Entfaltung der antibiotischen Aktivität tritt üblicherweise zwischen dem dritten und dem zehnten Tag auf. Nach ihrer Bildung unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen können die oben beschriebenen Antibiotica A-7413 in üblicher Weise aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Die während der Züchtung die Antibiotica A-7413 bildenden Organismen erzeugten Antibiotica finden sich normalerweise überwiegend in der Myzelmasse. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung der Antibiotica A-7413 besteht somit in der Extraktion des abgetrennten Myzels. Die Extraktion der Myzelmasse erreicht man am besten mit Methanol, obwohl man auch andere niedrigmolekulare Alkohole und Chloroform verwenden kann. Die Antibiotica A-7413 werden normalerweise mit Hilfe von Routineverfahren aus dem Extraktionslösungsmittel gewonnen, so dass man eine Mischung der Antibiotica A-7413, d.h. die Antibioticmischung A-7413 erhält.

Die Antibioticmischung A-7413 kann weiter gereinigt werden, und man kann die einzelnen Faktoren der Antibioticmischung A-7413 unter Anwendung verschiedenartiger anerkannter Verfahren trennen, beispielsweise durch Extraktionsverfahren und Adsorptionsverfahren. Mit Vorteil verwendet man adsorptive Materialien, wie Aluminiumoxid, Kieselgel, Ionenaustauscherharze, Cellulose, vernetztes Dextran (Sephadex) und dergleichen. Beispielsweise kann man zur Trennung der Faktoren A, B, C und D eine präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel unter Verwendung einer Chloroform/ Methanol-Mischung (9/1) als Lösungsmittelsystem durchführen, wobei man jeden Faktor durch Elution mit Methanol erhält. Zur Trennung der Faktoren in grossem Massstab führt man vorzugsweise eine Säulenchromatographie durch. Bei dieser Säulentrennung verwendet man vorzugsweise als Absorptionsmittel Kieselgel und als Lösungsmittelsystem eine Chloroform/Methanol-Mischung (19/1). Der Faktor A, d.h. der Hauptfaktor, kann ohne weiteres mit dieser Methode abgetrennt werden. Die Reinigung der in geringerer Menge vorhandenen Faktoren B, C und D erfordert im allgemeinen jedoch eine anschliessende Säulentrennung der angereicherten Fraktionen. Erneut verwendet man als bevorzugtes Adsorptionsmittel Kieselgel und als bevorzugtes Lösungsmittelsystem eine Chloroform/Methanol-Mischung (19/1).

Zur Vereinfachung der folgenden Ausführungen dient gewöhnlich der Ausdruck «Verbindung A-7413» zur Bezeichnung einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C, die Alkylester, die Acylester und die Thiolcarbonsäurederivate der Antibiotica A-7413, Faktoren A, B und C und die physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C und der Alkylester, der Acylester und der Thiolcarbonsäurederivate der Faktoren A, B und C umfasst.

Die Verbindungen A-7413 sind beispielsweise antimikro-bielle Mittel und sind besonders wirksam gegen grampositive Mikroorganismen. Die Antibiotica A-7413, Faktoren A, B und C wurden in der Regel unter Anwendung der Standard-Scheiben-Untersuchungsmethode auf ihre antimikrobielle Wirkung untersucht, wobei man sie in Mengen von 1 mg/ml auf Scheiben mit einem Durchmesser von 6,35 ml einsetzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die als Durchmesser der beobachteten Inhibierungszone in Millimeter angegeben sind, sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt:

Tabelle III

Testorganismus

A-7413

Faktor A

Faktor B

Faktor C

Staphylokokkus aureus

23

20

14

Bacillus subtilis

21

18

16

Sarcina lutea

22

19

16

Wenn man den Antibioticum A-7413 Faktor A subkutan an Mäuse injiziert, so übt das Material in vivo im allgemeinen eine antimikrobielle Wirkung aus. Es wurden zwei Dosierungen des Antibioticum A-7413 Faktors A an Mäuse verabreicht, die bestimmte Infektionen aufwiesen. Der hierdurch erreichte Schutz wird als EDso-Wert gemessen, d.h. die wirksame Dosis, die dazu ausreicht, 50% der Versuchstiere zu schützen (vgl. Warren Wiek et al, J. Bacteriol. 81 [1961] 223-235). Die mit dem Antibioticum A-7413 Faktor A gegen diese Infektionen erreichten EDso-Werte sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt:

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

634598

Tabelle IV

EDso-Wert*

Toxizität

(mg/kg x 2)

LD50

Streptokokkus pyogenes 0,42

161

Diplokokkus 0,39

387

pneumoniae

Staphylokokkus aureus 31,00

4000

* Behandlung eine und fünf Stunden nach der Infektion.

Ein besonderer Vorteil der Verbindungen A-7413 ist beispielsweise ihre Fähigkeit, Mikroorganismen zu inhibieren, die gegen andere Antibiotica resistent sind. In der folgenden Tabelle V sind die Ergebnisse von Standard-Agar-Verdün-nungsuntersuchungen (die unter Anwendung der ICS-Methode durchgeführt wurden) zusammengestellt, bei denen die Wirkung des Antibioticum A-7413 Faktors A gegen verschiedene Staphylokokkus-aureus-Stämme untersucht wurden. Die Ergebnisse sind als minimale inhibierende Konzentration angegeben, bei der eine Inhibierung des S.-aureus-Stammes auftritt. Die bei der gleichen Untersuchung mit dem bekannten Antibioticum Vancomycin erzielten Ergebnisse sind zu Vergleichszwecken ebenfalls angegeben.

Tabelle V

minimale inhibierende Konzentration (p.g/ml)

S.-aureus-Stamm A-7413 Faktor A Vancomycin

3055*

0,125

1,0

3123*

0,125

1.0

H290*

0,125

1,0

3074**

0,125

1,0

H43**

0,125

1,0

Hl 14**

0,125

1,0

H541**

0,062

1,0

3125***

0,125

1,0

3130***

0,062

1,0

3131***

0,062

1,0

3132***

0,062

1,0

3133***

0,062

1,0

3134***

0,062

1,0

3135***

0,062

0,5

3136***

0,125

0,5

3137***

0,125

1,0

3138***

0,062

1,0

3139***

0,125

1,0

3140***

0,125

0,5

* spricht auf Penicillin G an

** gegen Penicillin G resistent; spricht auf Methicillin an *** resistent gegen Penicillin G und Methicillin

In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse von Agar-Verdünnungsuntersuchungen zusammengestellt, bei denen die , Wirkung des Antibioticum A-7413 Faktors A gegen verschiedene Streptokokkus-Arten untersucht wurden. Bei diesen Versuchen wurde ein Trypticase-Soja-Agar plus Blut in Form einer 10-2-Verdünnung einer Über-Nacht-Kulturbrühe, in 0,3% Agar als Impfkultur verwendet, die zu etwa 5000 Bakterien pro 7,5 mm Agaroberfläche führt. Erneut sind zum Vergleich die bei der gleichen Untersuchung mit Leucomycin erzielten Ergebnisse angegeben. Alle untersuchten Stämme sind gegen Penicillin G resistente Stämme der Gruppe D-Streptokokkus.

Tabelle VI

minimale inhibierende Konzentration (|xg/ml)

Streptokokkus sp. A-7413 Faktor A Vancomycin

238

0,25

2,0

282

0,25

2,0

9901

0,125

4,0

9913

0,25

2,0

9933

0,25

8,0

9960

0,25

4,0

12253F

0,125

2,0

Shrigley

0,125

4,0

Mitis

0,125

4,0

55992

0,125

4,0

8043

0,125

4,0

Weiterhin ist der Antibioticum A-7413 Faktor A wirksam gegen Neisseria meningitides. Bei Agar-Verdünnungsuntersu-chungen, bei denen Trypticase-Sojaagar mit 5% Kaninchenblut und 1% Isovitalex und eine 1:100-Verdünnung einer über Nacht gewonnenen Kulturbrühe als Impfkultur eingesetzt wurden, zeigt der Antibioticum A-7413 Faktor A die folgenden Werte für die minimale inhibierende Konzentration:

N.-meningitides-

minimale inhibierende Konzentration

Kultur

(pg/ml)

Os

4,0

Sabderlin

2,0

Die Verbindungen A-7413 sind im allgemeinn relativ wenig toxisch. Beispielsweise liegt die akute Toxizität des durch intraperitoneale Injektion an Mäuse verabreichten Antibioticum A-7413 Faktors A bei mehr als 400 mg/kg.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft des Antibiotic-Kom-plexes A-7413 und der Verbindungen A-7413 ist beispielsweise ihre Fähigkeit, Propionibacterium acnes, ein pathogenes Bakterium, das zusammen mit Akne auftritt, zu inhibieren. Es wird der repräsentative Antibioticum A-7413 Faktor A auf seine Wirkung gegen P. acnes beispielsweise in der folgenden Weise untersucht:

Man bereitet zweifache Serienverdünnungen der zu untersuchenden Verbindungen in Actinomyces-Brühe (Baltimore Biological Laboratories). Jedes Röhrchen impft man mit P. acnes derart an, dass es 104 Organismen pro Milliliter enthält. Nach einer Inkubationszeit von 4 Tagen bei 37 °C untersucht man die Röhrchen. Die geringste Konzentration, in der die untersuchte Verbindung das Wachstum unterbindet, wird als minimale inhibierende Konzentration ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle VII zusammengestellt:

Tabelle VII

P.-Acnes-Kultur minimale inhibierende Konzentration

des Antibioticums A-7413 Faktors A

(pg/ml)

ATCC 6919

^ 1,25

klinisches Isolât 1

2,50

klinisches Isolât 2

^ 1,25

Die Antibioticmischung A-7413 und die Verbindungen A-7413 inhibieren ferner beispielsweise das Wachstum von

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

634598

Mikroorganismen, die zur Erkrankung der Zahnwurzelhaut beitragen. In der Tabelle VIII ist die Wirkung des Antibioticum A-7413 Faktors A gegen repräsentative Mundbakterien angegeben. Die Wirkung wurde mit Hilfe der üblichen Agar-Ver-dünnungsmethode gemessen, wobei die minimale inhibierende Konzentration nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden ermittelt wurde.

Tabelle VIII

Organismus minimale inhibierende Konzentration (jxg/ml)

Streptokokkus mutans*

^ 0,25

Lactobacillus casei**

2 0,25

Neisseria perflava**

32,00

* untersucht auf Mitis-Salivarius-Agar unter Zusatz von Tellu-

rit und Thioglykolsäure ** untersucht auf einem Gehirn-Herz-Infusions-Agar

Zusätzlich zeigt die Antibioticmischung A-7413 und der Antibioticum A-7413 Faktor A bei Untersuchungen, bei denen ein künstliches S.-mutens-Plattensystem verwendet wird, beispielsweise eine Inhibierung der Plattenbildung bei Dosierungen von lediglich 0,01%.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Antibioticmischung A-7413 und der Verbindungen A-7413 ist beispielsweise ihre Fähigkeit, die Futterverwertung von Tieren zu verbessern. Beispielsweise fördern die Antibiotica A-7413 die Futterverwer-5 tung oder Futterausnutzung von Wiederkäuern mit einer ausgebildeten Pansenfunktion.

Es ist bekannt, dass die Kohlenhydratverwertung bei Wiederkäuern dadurch gesteuert werden kann, dass man die Pansenflora der Tiere reizt, so dass sie statt Acetat- oder Buty-10 ratverbindungen Propionatverbindungen bildet (bezüglich einer genaueren Diskussion sei auf Church et al. in «Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants», Band 2 (1971), Seiten 622 und 625 verwiesen).

Die Futterverwertung oder die Wirksamkeit der Futteraus-,5 nutzung kann dadurch überwacht werden, dass man die Bildung und die Konzentration von Propionatverbindung im Pansen mit der von Arthur P. Raun in der US-PS 3 794 732 (vgl. Beispiel 5) beschriebenen Methode beobachtet. In der folgenden Tabelle IX sind die bei dieser Untersuchung ermittelten Ver-20 hältnisse der Konzentrationen der flüchtigen Fettsäuren in den mit dem erfindungsgemäss herstellbaren Antibioticum A-7413 Faktor A behandelten Kolben und in den Kontrollkolben angegeben:

25

Tabelle IX

Antibioticum A-7413 Faktor A (|i/ml)

Verhältnis der behandelten Proben zu den Kontrollproben

Molprozent Molprozent Molprozent Gesamtmenge der Propionat Acetat Butyrat flüchtigen Fettsäure

(mMol/1)

10,00

1,23

0,95

1,02

2,00

1,17

0,96

0,98

1,03

1,00

1,24

0,98

0,84

1,05

0,50

1,05

1,00

0,94

1,04

0,25

1,07

0,99

0,98

1,04

Die Kohlenhydratverwertung wird ferner beispielsweise mit In-vivo-Untersuchungen bestimmt, die an Tieren durchgeführt werden, in deren Pansen eine Fistel angeordnet ist, die es ermöglicht, Proben des Panseninhalts zu entnehmen.

Das zur Untersuchung von Rindern angewandten Verfahren ist ebenfalls in der erwähnten US-PS 3 794 732 (Beispiel 7) beschrieben.

In der folgenden Tabelle X sind die Ergebnisse dieser Untersuchung des Antibioticum A-7413 Faktors A angegeben, wobei die mittlere prozentuale Zunahme der Propionsäurekon-zentration des Pansens als Mittelwert von sechs Analysen bei einer Behandlungsdauer von 14 Tagen aufgeführt ist.

Tabelle X

lieh die Antibioticmischung A-7413 ebenfalls eine gesteigerte Futterverwertung. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle XI angegeben:

45 Tabelle XI

Behandlung

Propionsäure-konzentration (%)

Steigerung gegenüber den Kontrolltieren relative Steigerung gegenüber den Kontrolltieren

Kontrolle

20,8

Antibioticum

A-7413

Faktor A

100 mg/Tag

25,4

4,6

22,1%

Behandlung

Molprozent Propionat

Steigerung . gegenüber den Kontroll tieren relative Steigerung gegenüber den Kontrolltieren

50

Kontrolle Antibioticmischung A-7413 55 (30 mg/Tag)*

24,0 26,2

2,0

8,3%

Bei einer ähnlichen Untersuchung an Schafen, bei der mit Fisteln versehene Hammel eingesetzt wurden, zeigt gewöhn-

* Proben von 6 Tagen, die während der Behandlungsdauer von 17 Tagen genommen wurden.

60

Die Antibioticmischung A-7413 und die Verbindungen A-7413 führen zu einer wirksamen Steigerung der Propionatbil-dung und daher zu einer verbesserten Futterverwertung, wenn sie vorzugsweise täglich in Dosierungen von etwa 0,05 mg/kg 6? bis etwa 10 mg/kg oral an Wiederkäuer verabreicht werden. Die besten Ergebnisse erzielt man in der Regel bei einer Dosis von etwa 1 mg pro kg pro Tag. Eine bevorzugte Methode zur Verabreichung der Antibioticmischung A-7413 oder der Ver-

634598

bindung A-7413 besteht darin, die Wirkstoffe mit dem Tierfutter zu vermischen. Man kann den Wirkstoff jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise als Tablette, als Arzneimittelpräparat, als Bolus oder als Kapsel. Die Formulierung in diesen verschiedenen Dosierungsformen kann unter 5 Anwendung bekannter veterinärpharmazeutischer Methoden erreicht werden, jede einzelne Dosiseinheit sollte im allgemeinen eine Menge der Verbindung A-7413 oder der Antibioticmischung A-7413 enthalten, die in direkter Beziehung steht zu einer geeigneten Tagesdosis für das zu behandelnde Tier. 10

Ein Beispiel der nützlichen wachstumsfördernden Wirkung der Antibioticmischung A-7413 und der Verbindungen A-7413 zeigt sich bei Geflügel. Bei Innengehegeuntersuchungen unter Verwendung von Brathähnchen, bei denen das Antibioticum A-7413 Faktor A in einer Menge von 10 g pro Tonne des Fut- 15 ters dem Futter zugesetzt wird, wird im allgemeinen eine signifikante Verbesserung der Gewichtszunahme und der Futterverwertung beobachtet. Die Antibioticmischung A-7413 und die Verbindungen A-7413 zeigen eine typische Wirksamkeit zur Förderung des Wachstums von Geflügel, wenn die Wirkstoffe 20 beispielsweise in Dosierungen von 0,5 bis 50 g der Antibioticmischung A-7413 oder der Verbindung A-7413 pro Tonne des Tierfutters in das Futter eingearbeitet werden. Die günstigsten Ergebnisse erzielt man in der Regel dann, wenn man die Antibioticmischung A-7413 oder die Verbindung A-7413 in einer 25 Menge von 2,5 bis 10 g in eine Tonne des Tierfutters einarbeitet.

Man kann die beim Züchten der Mikroorganismen gewonnenen Feststoffe einschliesslich der Bestandteile des Mediums und des Myzels ohne Extraktion oder Trennung, vorzugsweise 30 jedoch nach der Abtrennung von Wasser, als Ausgangsmaterial für die Antibioticmischung A-7413 verwenden. Beispielsweise kann man nach der Entwicklung der antibiotischen Aktivität des Antibioticums A-7413 das Kulturmedium durch Gefriertrocknen trocknen, worauf man das gefriergetrocknete 35 Medium direkt mit einer Futter-Vormischung vermischen kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 40

eines flüssigen vegetativen Mediums der folgenden Zusammensetzung:

Bestandteil

Glucose

Dextrin

Sojabohnenmehl

Hefeextrakt

CaCCh entionisiertes Wasser ad

Menge 10g 20 g 25 g 2,5 g 25 e-1000 ml

Das angeimpfte vegetative Medium inkubiert man während 72 Stunden bei 25 °C in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben, der auf einer Schütteleinrichtung befestigt ist, die um einen Bogen mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 inches) mit einer Drehzahl von 250 min-1 in Rotation versetzt wird.

Dieses inkubierte vegetative Medium kann man direkt dazu verwenden, das vegetative Medium der zweiten Stufe anzuimp-fen. Alternativ und vorzugsweise kann man das inkubierte Medium zur späteren Verwendung lagern, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Kultur wird zum Zwecke dieser Lagerung in viele kleine Ampullen verteilt. Hierzu bringt man in jede Ampulle 2 ml des inkubierten vegetativen Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lac-tose-Lösung der folgenden Zusammensetzung ein:

Bestandteil

Glycerin

Lactose entionisiertes Wasser

Menge 20% 10% 70%

A. Schüttelkolbenfermentation zur Gewinnung des Antibioticums A-7413

Man bereitet eine Kultur des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 durch Züchten des Organismus auf einem 45 geneigten Agar-Medium mit den Abmessungen 18 x 150 mm und der folgenden Zusammensetzung:

Bestandteil Menge

Saccharose 30 g 50

Pepton 5 g

K2HPO4 1 g

Mineralgemischlösung nach Czapek* 5 ml

Agar 25 g entionisiertes Wasser ad 1 Liter 55

* Mineralgemischlösung nach Czapek 100 g KCl

100gMgS04-7H20 2gFeS04.7H20 Auffüllen mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter 60

Man impft das geneigte Medium mit dem Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 10 bis 14 Tagen bei 25 °C. Die gereifte Kultur bedeckt man mit Wasser und kratzt die Oberfläche mit einer 65 sterilen Öse ab, um das Myzel zu lösen und zu zerkleinern und die Sporen aus den Sporangien freizusetzen. Man verwendet die Hälfte der erhaltnen Suspension zum Animpfen von 50 ml

Die bereiteten Suspensionen lagert man in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff.

Man verwendet 1 ml einer in dieser Weise bereiteten und gelagerten Suspension zum Animpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben beschriebene vegetative Medium besitzt. Das angeimpfte vegetative Medium der ersten Stufe inkubiert man während 72 Stunden bei 25 °C in einem 250-ml-Weithalser-lenmeyerkolben, der auf einer Schütteleinrichtung befestigt ist, die bei 250 min-1 einen Bogen mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 inches) durchläuft.

B. Tankfermentation zur Gewinnung des Antibioticums A-7413

Zur Bereitung eines grösseren Volumens der Impfkultur verwendet man 40 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Animpfen von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung besitzt wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Dieses angeimpfte vegetative Medium der zweiten Stufe wird während etwa 48 Stunden bei 45 °C in einem 2-Liter-Kolben auf einer Schütteleinrichtung inkubiert, die bei 250 min-1 um einen Bogen von 5,08 cm (2 inches) bewegt wird.

Dann verwendet man 11 der in dieser Weise gebildeten vegetativen Impfkultur der zweiten Stufe zum Animpfen von 1001 eines sterilen Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung:

Bestandteil Soj abohnenmehl Maisöl

MgS04-7H20 CaCOî FeCl2-4H20 entionisiertes Wasser ad

Menge 35 g 40 g 2g 2g 0,06 g 11

Nach dem Sterilisieren durch Erhitzen während 30 Minuten auf 120 °C beträgt der pH-Wert des Mediums 7,0. Man lässt das

634598

10

angeimpfte Produktionsmedium, das in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 1651 vorliegt, während etwa 7 Tagen bei einer Temperatur von 25 °C gären. Man belüftet das Fermentationsmedium mit steriler Luft in einer Menge von etwa 0,5 bis 1,0 Volumen Luft pro Volumen des Kulturmediums pro Minute. Man rührt das Medium mit üblichen Rührern, die bei 250 min _1 betrieben werden.

Beispiel 2

Man bereitet die Antibiotica A-7413 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise, wozu man jedoch ein geneigtes Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung dazu verwendet, die Sporen oder das Myzel für die Anfangsimpfkultur zu bilden:

Bestandteil

NaiSiOi

Hefeextrakt

CaCC>3

Gemüsesaft*

entionisiertes Wasser

Menge 0,5 g 2,0 g 3,0 g 200 ml 800 ml

Durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung stellt man den pH-Wert auf 7,2 ein.

* V-8 Saft der Firma Campbell Soup Company, Camden, N.J. 08101, USA.

und trocknet ihn im Vakuum, wobei man 15,8 g der Antibioticmischung A-7413 in Form eines braunen Pulvers erhält.

Beispiel 5

5 Isolierung der Faktoren der Antibioticmischung A-7413

Man löst 26,4 g der gemäss Beispiel 4 erhaltenen Antibioticmischung A-7413 in 200 ml einer Chloroform/Methanol-Lösung (19/1). Man trägt die erhaltene Lösung auf eine mit Kieselgel (Matheson, Qualität 62, mit 5% Wasser äquilibriert) beschickte 10 Säule (5,8x94,0 cm) auf, die man mit einer Chloroform/Metha-nol-Mischung (19/1) bereitet hat. Man entwickelt unter Verwendung einer Chloroform/Methanol-Mischung (19/1), wobei man 150-ml-Fraktionen auffängt. Man überwacht die Elution der Säule durch Bewerten der Wirkung der Fraktionen gegen Sta-i5 phylokokkus aureus, Bacillus subtilis und Sarcina lutea und durch dünnschichtchromatographische Bioautographie unter Verwendung von S. lutea als Nachweisorganismus. Man vereinigt die Fraktionen entsprechend dem Faktorgehalt und der nachgewiesenen Aktivität. Die vereinigten Fraktionen dampft 20 man im Vakuum zur Trockne ein. Jeden der in dieser Weise erhaltenen Rückstände löst man in 50 ml Chloroform und versetzt jede Chloroformlösung mit 500 ml n-Pentan, um den gewünschten Faktor auszufällen. Die Ergebnisse der Säulen-fraktionierung sind die folgenden:

25

Beispiel 3

Man bereitet die Antibiotica A-7413 nach der Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei man jedoch ein vegetatives 30 Medium und ein vegetatives Medium der zweiten Stufe der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

Glucose

Dextrin

Sojabohnenmehl Hefeextrakt

Sojabohnenöl (raffiniert) CaCOä

entionisiertes Wasser ad

Menge 10,0 g 20,0 g 15,0 g 2,5 g 5,0 g 2,5 g 11

erhaltener

Fraktionen

Ausbeute ungefähre

Faktor

Reinheit

A

18-23

10,153 g rein

A

24-30

597,6 mg

60%

B

31-43

278,8 mg

80%

C

49-56

218,4 mg

60%

35

Beispiel 4

Abtrennung der Antibioticmischung A-7413

Man stellt die gemäss Beispiel 1 hergestellte gesamte Fermentationsbrühe (2001) durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure sauer (auf einen pH-Wert von 3,5). Die gerührte angesäuerte Brühe filtriert man unter Verwendung eines Filterhilfsmittels (Hyflo Super-cel, einer von der Firma Johns-Manville Products Corp. vertriebenen Diatomeenerde). Dann setzt man 1001 Methanol zu dem abgetrennten Myzelkuchen zu und rührt die gebildete Methanolsuspension während 30 Minuten, worauf man sie filtriert. Man versetzt den abgetrennten Myzelkuchen erneut mit 1001 Methanol, rührt während 30 Minuten und filtriert wieder. Die beiden Methanolextrakte engt man im Vakuum ein, so dass man nach der Entfernung des Methanols 10,51 eines wässrigen Konzentrats erhält. Dieses wässrige Konzentrat kühlt man während 24 Stunden auf 5 °C. Die dabei gebildete ölige obere Schicht wird abgetrennt und verworfen. Die untere wässrige Schicht (21) stellt man durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,3 ein. Man extrahiert die gebildete Lösung zweimal mit der Hälfte des Volumens einer Chloroform/Methanol-Mischung (4/1). Diese beiden Extrakte vereinigt man und dampft sie im Vakuum zur Trockne ein. Den in dieser Weise erhaltenen Rückstand löst man in 150 ml Chloroform und gibt diese Lösung zu 1500 ml n-Pentan. Den gebildeten Niederschlag zentrifugiert man ab

45

50

55

60

65

Die unreinen Faktoren werden einer weiteren Chromato-graphieüber Kieselgelsäulen unter Anwendung der obigen Verfahrensweise unterzogen, so dass man die gereinigten Faktoren B und C und eine zusätzliche Menge des gereinigten Faktors A erhält.

Beispiel 6

Kristallisation des Antibioticum A-7413 Faktors A

Man löst 1 g des gemäss Beispiel 1 erhaltenen gereinigten Faktors A in 10 ml Chloroform. Dann gibt man 10 ml absolutes Äthanol (das 0,5% Benzol enthält) zu. Man lässt die erhaltene Lösung während 2 Stunden bei Raumtemperâtur stehen und kühlt sie dann über Nacht auf 5 °C ab. Die gebildeten Kristalle werden abzentrifugiert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet, wobei man 513 mg des kristallinen Antibioticum A-7413 Faktors A erhält.

Der Antibioticum A-7413 Faktor A kristallisiert in ähnlicher Weise bei Verwendung der folgenden Lösungsmittelmischungen:

Chloroform/sec.-Butanol

Chloroform/n-PropanoI

Chloroform/Isopropylalkohol

Dimethylformamid/Aceton

Aceton/Äthanol wässriges Äthanol

Beispiel 7

Ammoniumsalz des Antibioticum A-7413 Faktors A

Man gibt 200 mg des nach Beispiel 6 bereiteten Antibioticum A-7413 Faktors A zu 10 ml einer 0,01 n Ammoniumhydroxidlösung. Man rührt die Suspension während 20 Minuten unter Verwendung einer Mischeinrichtung (Virtis blender). Dann trennt man das unlösliche Material durch Zentrifugieren ab

11 634598

und verwirft es. Die überstehende Lösung wird gefriergetrock- Faktors B nach der Verfahrensweise des Beispiels 8, jedoch net und ergibt 158,7 mg des Ammoniumsalzes des Antibioticum unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors B und von A-7413 Faktors A in Form eines gelben wasserlöslichen Pulvers. 0,01 n Natriumhydroxidlösung.

Man bereitet das Ammoniumsalz des Antibioticum A-7413 Beispiel 8 5 Faktors B nach der Verfahrensweise des Beispiels 7, jedoch

Kaliumsalz des Antibioticum A-7413 Faktors A unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors B.

Man suspendiert 3 g des gemäss Beispiel 6 bereiteten Anti- Man bereitet das Bariumsalz des Antibioticum A-7413 Fak-bioticum A-7413 Faktors A in 150 ml Wasser. Der pH-Wert der tors B nach der Verfahrenweise des Beispiels 9, jedoch unter erhaltenen Suspension beträgt 4,3 und wird durch Zugabe von Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors B und einer 41 ml einer 0,05 n Kaliumhydroxidlösung auf einen Wert von io o,l n Bariumhydroxidlösung.

9,5 eingestellt. Diese Lösung rührt man unter Verwendung Man bereitet das Mononatriumsalz des Antibioticum einer Mischeinrichtung während 30 Minuten. Dann trennt man A-7413 Faktors C nach der Verfahrensweise des Beispiels 9, das unlösliche Material durch Zentrifugieren ab. Die überste- jedoch unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors C hende Lösung wird gefriergetrocknet und ergibt 2,61 g des und einer 0,1 n Natriumhydroxidlösung.

Kaliumsalzes des Antibioticum A-7413 Faktors A in Form eines 15 Man bereitet das Isopropylaminsalz des Antibioticum gelben wasserlöslichen Pulvers. A-7413 Faktors C nach der Verfahrensweise des Beispiels 10,

Das Kaliumsalz wird weiter gereinigt und kristallisiert, jedoch unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors C

indem man 200 mg dieses Pulvers in 8 ml Methanol löst, die und einer 0,01 n Isopropylaminlösung.

unlöslichen Verunreinigungen abzentrifugiert, Diäthyläther zu Man bereitet das Magnesiumsalz des Antibioticum A-7413 der abgetrennten überstehenden Lösung zusetzt und das Mate- 20 Faktors C nach der Verfahrensweise des Beispiels 9, jedoch rial während 3 Tagen bei 5 °C kühlt. Die gebildeten Kristalle unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors C und werden abzentrifugiert und getrocknet und ergeben 141,8 mg einer 0,1 n Magnesiumhydroxidlösung.

des kristallinen Kaliumsalzes des Antibioticum A-7413 Faktors A.

25 Beispiel 19

Beispiel 9 Acetylesterderivat des Antibioticum A-7413 Faktors A

Calciumsalz des Antibioticum A-7413 Faktors A löst 500 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A in

Man löst 200 mg des gemäss Beispiel 6 bereiteten Antibioti- 20 ml Dimethylsulfoxid Dann versetzt man die Lösung mit 8 ml cum A-7413 Faktors A in 20 ml Methanol und setzt der metha- Essigsäureanhydrid und lässt die Mischung während 22 Stun-

nolischen Lösung unter Rühren langsam eine 0,1 n Calciumhy- 30 ^erî J3®1 Raumtf™peratur stehen. Dann engt man die Mischung droxidlösung zu, bis die Lösung einen pH-Wert von 9,1 besitzt. ™ Vakuum auf e™ Volumen von etwa 15 ml ein versetzt das

Dann versetzt man die gebildete Lösung mit 6 Volumen Di- Konzentrat mit 15 ml Methanol und gibt die gebildete

äthyläther, um das Salz auszufällen. Der Niederschlag wird ^cbung zu 240 ml Diäthyläther. Der gebildete Niederschlag abzentrifugiert und getrocknet und ergibt 80,1 mg des Calcium- wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet und ergibt 216 mg salzes des Antibioticum A-7413 Faktors A. Die Analyse des 35 es Acetylesterdenvats des Antibioticum A-7413 Faktors A.

Materials durch Atomabsorption zeigt, dass das Produkt 1,81%

Calcium enthält. „ . . ,

Beispiel 20

Beispiel 10 Acetylesterderivat des Antibioticum A-7413 Faktors A

Triäthylaminsalz des Antibioticum A-7413 Faktors A 4o _ ^an löst 500 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A in

Man behandelt 200 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A f. ml Pyridin. Dann gibt man 8 ml Essigsäureanhydrid zu der nach der Verfahrensweise des Beispiels 7, jedoch unter Ver- LosunS und Iasf die Mischung während 22 Stunden bei Raumwendung einer 0,01 n Triäthylaminlösung, und erhält 122,2 mg Temperatur stehen worauf man die Mischung im Vakuum zur des Triäthylammoniumsalzes des Antibioticum A-7413 Faktors Trockne eindampft. Man lost den Rückstand in 4 ml Chloro-^ 45 form und gibt die Losung zu 60 ml n-Pentan. Der gebildete

Niederschlag wird abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet Beispiel 11 und er£ibt 421 mg des Acetylesterderivats des Antibioticum

Dinatriumsalz des Antibioticum A-7413 Faktors A A-7413 Faktors A.

Man behandelt 300 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A nach der Verfahrensweise von Beispiel 7, jedoch unter Verwen- 50 Beispiele 21-25

dung von 30 ml einer 0,01 n Natriumhydroxidlösung, und erhält Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 bereitet man 260 mg des Dinatriumsalzes des Antibioticum A-7413 Faktors das Propionylesterderivat des Antibioticum A-7413 Faktors A A in Form einer gelben wasserlöslichen Verbindung (die unter Verwendung von Propionsäureanhydrid.

gemäss der Analyse durch Atomabsorption 2,67% Natrium ent- Nach der Verfahrenweise des Beispiels 20 bereitet man hält). 55 unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors B und von n-Buttersäureanhydid das n-Butyrylesterderivat des Antibioti-Beispiell2 cums A-7413 Faktors B.

Mononatriumsalz des Antibioticum A-7413 Faktors A Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 bereitet man

Man behandelt 200 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors C und von nach der Verfahrensweise von Beispiel 9, jedoch unter Verwen- 60 n-Valeriansäureanhydrid das n-Valerylesterderivat des Antibio-dung einer 0,1 n Natriumhydroxidlösung, um den pH-Wert der ticum A-7413 Faktors C.

Lösung auf 8,6 einzustellen, und erhält 151,6 mg des Mononatri- Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20, jedoch unter umsalzes des Antibioticum A-7413 Faktors A in Form einer Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid, bereitet man das wasserlöslichen Verbindung (die gemäss der Atomabsorptions- Succinylesterderivat des Antibioticum A-7413 Faktors A. analyse 1,43% Natrium enthält). 65 Nach der Verfahrensweise des Beispiels 20 und unter Ver wendung des gemischten Essigsäure-Ameisensäureanhydrids Beispiele 13-18 bereitet man das Formylesterderivat des Antibioticum A-7413

Man bereitet das Dinatriumsalz des Antibioticum A-7413 Faktors B.

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Beispiel 26

Methylester des Antibioticum A-7413 Faktors A Man löst 100 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A in einer Mischung aus 5 ml Methanol und 0,6 ml Chloroform. Dann gibt man 7 ml einer Lösung von Diazomethan in Äther zu der Lösung des Antibioticum A-7413 Faktors A. Die gebildete Lösung rührt man während 30 Minuten und lässt sie dann während 4,5 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man dampft die Lösung im Vakuum zur Trockne ein, löst den erhaltenen Rückstand in 4 ml Methanol und dampft die Lösung im Vakuum zur Trockne ein. Den gebildeten Rückstand löst man in 3 ml Chloroform, worauf man die Chloroformlösung zu 30 ml n-Pentan zugibt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und getrocknet und ergibt 87 mg des Methylester und des Antibioticum A-7413 Faktors A.

Beispiele 27-29

Nach der Verfahrensweise des Beispiels 26, jedoch unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors B und von Di-azoäthan bereitet man den Diäthylester des Antibioticum A-7413 Faktors B.

Nach der Verfahrensweise des Beispiels 26, jedoch unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors C und von Diazo-2-propan bereitet man den 2-Propylester des Antibioticum A-7413 Faktors C.

Unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Entwässerungsmittel bereitet man durch Umsetzung des Antibioticum A-7413 Faktors A mit n-Butanol unter Anwendung üblicher Verfahren den n-Butylester des Antibioticum A-7413 Faktors A.

Beispiel 30

Bis(mercaptoessigsäure)derivat des Antibioticum A-7413 Faktors B

Man löst 200 mg des Antibioticum A-7413 Faktors A in Form der freien Säure in 2,8 ml N,N-Dimethylformamid. Dann versetzt man die Lösung mit 200 mg Mercaptoessigsäure. Die gebildete Lösung sättigt man mit Stickstoff durch Einleiten des s Stickstoffs in die Lösung während 30 Minuten, worauf man die Lösung während 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen lässt. Man engt die Lösung auf ein geringes Volumen ein und trägt die konzentrierte Lösung in 25 Volumen Diäthyläther ein. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet und io ergibt 179 mg des Bis(mercaptoessigsäure)derivats des Antibioticum A-7413 Faktors A.

Beispiele 31-35

Nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 bereitet man t5 unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors B und von

2-Mercaptopropionsäure des Bis(2-mercaptopropion-säure)derivat des Antibioticum A-7413 Faktors B.

Unter Verwendung des Antibioticum A-7413 Faktors C und

3-Mercaptopropionsäure bereitet man nach der Verfahrens-

20 weise des Beispiels 30 das Bis(3-mercaptopropionsäure)derivat des Antibioticum A-7413 Faktors C.

Nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 bereitet man unter Einsatz von Mercaptobernsteinsäure das Bis(mercapto-bernsteinsäure)derivat des Antibioticum A-7413 Faktors A. 25 Nach der Verfahrensweise des Beispiels 33 bereitet man das Mono(mercaptobernsteinsäure)derivat des Antibioticum A-7413 Faktors A, wobei man die Lösung während einer Zeit von lediglich 6 Stunden stehen lässt.

Nach der Verfahrensweise des Beispiels 30 bereitet man 30 das L-Cysterinderivat des Antibioticum A-7413 Faktors A, wozu man L-Cystein verwendet und das Produkt chromatographisch reinigt.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung der Antibioticmischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält, und der physiologisch verträglichen Salze der Faktoren A, B und C, dadurch gekennzeichnet, dass man den neuen Mikroorganismus Actino-planes sp. NRRL 8122 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibioticums gebildet ist, und gegebenenfalls physiologisch verträgliche Salze der Antibiotica A-7413 Faktoren A, B und C bildet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Antibiotica A-7413 Faktor A isoliert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Antibiotica A-7413 Faktor B isoliert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Antibiotica A-7413 Faktor C isoliert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung der abgetrennten Antibioticmischung A-7413, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 züchtet und b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 6 zur Herstellung des Antibioticum A-7413 Faktors A, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 züchtet,

b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt und c) den Antibioticum A-7413 Faktor A aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,4 oder 6 zur Herstellung des Antibioticum A-7413 Faktors B, dadurch gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 züchtet,

b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt und c) den Antibioticum A-7413 Faktor B aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,5 oder 6 zur Herstellung des Antibioticum A-7413 Faktors C, dadurch • gekennzeichnet, dass man a) den Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 züchtet,

b) die Antibioticmischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt und c) den Antibioticum A-7413 Faktor C aus der Antibioticmischung A-7413 isoliert.