DE2252937A1 - Antibioticum a477 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Eil Lilly and Company/ Indianapolis, Indiana, V.St.A. Antibioticum A4 77 und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibioticum und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze, die sich zur Bekämpfung des Wachstums cariogener Organismen und zur Förderung des Wachstums von Hühnern eignen.

Das neue Antibioticum wird als A477 bezeichnet und wird durch Züchten von Antinoplanes sp. NRRL 3884 unter submers aeroben Fermentationsbedingungen hergestellt.

Gegenstand der Erfindung ist das Antibioticum A477, eine weiße amorphe feste Substanz mit einem spezifischen Drehwert von /alpha/» -66,6 (c=1% in 50-prozentigem wässrigem Methanol), etwa der folgenden Elementarzusammensetzung 53,06 % Kohlenstoff, 6,18 % Wasserstoff, 5,79 % Stickstoff, 31,40 % Sauerstoff und 3,39 % Chlor; das in Form seines Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Substanz ist, die bei 207 - 212 C schmizt, in warmem Wasser und in 50-prozentigem

ORIGINAL INSPECTED

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RRD - ϊ -

wässrigen Methanol löslich ist und vier titrierbare Gruppen aufweist, von denen zwei pK¹ -Werte von 7,0 und 9,7 und zwei pk' -Werte von über 11 bei der Bestimmung durch elektrometrische Titration in 66-prozentigen wässrigen Methylforrnaraid haben sowie eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 55,16% Kohlenstoff, 6,02 % Wasserstoff, 5,73 % Stickstoff, 28,99 % Sauerstoff, 4,52 % Gesamtchlor und 1,28 % anorganisches Chlor und ein durch Dampfdruckosmometrie bestimmtes ungefähres Molekulargewicht von 1480 hat, in Mineralölaufschlämmung folgende unterscheidbare Banden im Infrarotabsorptionsspektrum zeigt: 3,0, 5,8, 6,02, 6,3, 6,62, 6,84, 7,02, 7,26, 7,32, 7,7, 8,1, 8,27, 8,52, 8,97, 9,35, 9,7, 9,8 und 10,1 Micron, in wässrigsauren und neutralen Lösungen im Ultraviolettgebiet mit einem Ab-

1 %

sorptiongsmaximum bei 283 m/U von E.,⁰ 70 absorbiert und in

/ι cm

wässrigbasischer Lösung im Ultraviolettgebiet mit Ab-

1 %

sorptionsmaxima bei 300 m ,u von H, 60 und 362 m,u von ig. / 1 cm /

E₁ 5 3 absorbiert.
1 cm

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung des Antibioticums A477 durch Züchten eines A477 erzeugenden Stamms eines Actinoplanes-Organismus (NRRL 3884) unter submers aeroben Bedingungen in einem für die Züchtung geeigneten Medium, bis dieses Medium eine bträchtliche antibiotische Aktivität enthält. Das Antibioticum kann nach verschiedenen allgemein angewandten und dem Fachmann geläufigen Isolierungs- und Reinigungsverfahren gewonnen werden.

Das Antinioticum A477 ist ein basisches Antibioticum, das zur Bildung von Salzen in üblicher Weise mit Mineralsäuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure sowie verschiedenen organischen Säuren zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, p-ToHiolsulfonsäure und Nikotinsäure fähig ist.

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Als freie Base ist das Antibioticum A477 eine weiße amorphe feste Substanz mit folgenden bei der Elementaranalyse erhaltenen Werten: 53,O6 % Kohlenstoff, 6,18 % Wasserstoff, 5,79 % Stickstoff, 31,40 % Sauerstoff, 3,39 % Chlor. Der spezifische Drehwert des Antibioticums A477 beträgt -66,6 ° bei einer Temperatur von 25 ⁰C in 50-prozentiger wässriger Mefchanollösung bei einer Konzentration des Antibioticums von 1 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen der Lösung.

Das Hydrochlorid von A477 ist eine Weiße kristalline Substanz mit einen Schmelzpunkt von 207 - 212 ⁰C. Es ist in warmem Wasser löslich und in warmem 50-prosentigen wässrigen Methanol rstark löslich. Das Hydrochloric! von A4 7 7 ist bei Temperaturen von bis zu etwa 27 ⁰C in Lösung in einem pH-Wertbereich von etwa 1 bis 10 beständig. Die elektrometrische Titration von A477.-Hydrochlorid in Wasser zeigt die Gegenwart von einer Gruppe mit einem pK¹ -Wert von 6,2 und von 5 oder mehr Gruppen mit pK¹ -Werten zwischen 8 und 10,5 an. Die elektrometrische Titration von A477-Hydrochlorid in Dimethylformamid/^asser (2:1) ergibt die Gegenwart von zwei Gruppen mit pK¹ -Werten von 7,0 bzw. 9,7 und von zwei oder mehr Gruppen mit pK¹ Werten über 11.

Die Holekulargewichtsbestimmung von A477-Hydrochlorid durch eine os^.otische Dampfdruckmessung ergibt ein Hindestmolekulargevicht von etwa 1480.

x\ufgrund der bei mehreren Elementaranalysen erhaltenen Durchschnittswerte hat Antibioticum A477-Hy^rOChIOrId etwa folgende Zusammensetzung:

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55,36 % Kohlenstoff, 6,02 % Wasserstoff, 5,73 % Stickstoff, 28,99 % Sauerstoff, 4,52 % Gesamtchlor und 1,28 % anorganisches Chlor.

Die Infrarotabsorptionskurve des Hydrochlorids von A477 in einer Mineralölaufschlämmung ist in der beigefügten Zeichnung dargestellt. Es sind folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima zu, beobachten:3,0, 5,8, 6,02, 6,3 6,62, 6,84, 7,02, 7,26, 7,32, 7,7, 8,1, 8,27, 8,52, 8,97, 9,35, 9,7, 9,8, 10,1 Micron.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum, von Antibioticum A477-Hydrochlorid in saurer und neutraler v/ässriger Lösung zeigt ein Absorptionsmaximum bei 283 n\/U mit einem Wert für

1 %
E' von 70. In alkalischer Lösung zeigt A477-Hydrochlorid Absorptionsmaxima bei 300 und 362 m,u mit Werten für

1 %
^E1 cm ^{Von 60 bzw}* ⁵³*

In den unten angegebenen Papierchromatographiesystemen zeigt das Antibioticum A477-Hydrochlorid bei Verwendung von Bacillus subtiles als Testorganismus folgende R_f-Werte:

R^-Wert Lösungsmittelsystem

0,05 mit Wasser gesättigtes Butanol

0,26 mit Wasser gesättigtes Butanol;

2 % p-Toluolsulfonsäure

0,84 19 Teile Methanol, 6 Teile Ace

ton, 75 Teile Wasser

0,40 3 Teile Methanol, 1 Teil 0,1η

HCl

0,62 mit Methylisobutylketon ge

sättigtes Wasser; 1 % p-Toluolsulfonsäure

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A477 hat eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von bestimmten Microorganismen. Die Konzentrationen, bei denen das Wachstum beispielhafter Organismen inhibiert wird, sind in der Tabelle I angegeben.

Tabelle Antimicrobielle Aktivität von A477-Hydrochlorid

minimale inhibierende Test-Organismus Konzentration (mcg/ml)

Staphylococcus aureus 25,O^a

Bacillus subtilis 1,56^a

Mycobacterium avium 25,0^a

Streptococcus faecalis 3,12^a

Vibrio coli (Iowa 10) 25,0^b

Mycoplasma gallisepticum 50,0

Pasteurella multocida 50,0

Pasteurella hemolytica 50,0

^a = Agarverdünnung
= Brüheverdünnung

Die acute Toxizität von A477-Hydrochlorid bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse beträgt als LDc₀ 350 mg/kg.

Bei Verabreichung an Mäuse durch subcutane Injektion zeigt A477-Hydrochlorid in vivo eine antimicrobielle Wirkung gegen Infektionen verursachende Organismen* Die

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Q (den Schutz von 50 % der Versuchstiere bewirkende Dosis) für beispielhafte Infektionen sind bei der Anwendung von zwei Dosen folgende:

Staphylococcus aureus 3055 83 mg/kg Streptococcus pyogenes ^1*0 mg/kg

Diplococcus pneumoniae ^5,1 mg/kg

Eine andere bedeutsame Eigenschaft des Antibioticums A477 ist seine Fähigkeit, das Wachstum von Microorganismen zu inhibieren, die zur Entwicklung von Periodontitis beitragen. In einem Brüheverdünnungstest führt eine Konzentration von 1,0 mcg/ml von A477-Hydrochlorid zur Inhibierung des Wachstums des cariogenen Organismus Odontomyces viscosus.

Eine Lösung von A477-Hydrochlorid zeigt antimicrobielle Aktivität gegen cariogene Organismen, was durch den folgenden Test veranschaulicht wird: 5 % Saccharose enthaltende Nährlösung in Röhrchen wird mit cariogenen Microorganismen inokuliert. Dann wird ein dünner Glasstab so eingebracht, dass er sich unter die Oberfläche der Nährlösung erstreckt. Mach Inkubieren bei 37 ⁰C über Nacht bildet sich auf der Oberfläche dar Stäbe eine Flecken- oder Plaque-Schicht (hauptsächlich Zellen und Dextran) aus. Die Stäbe werden dann in Lösungen überführt, die unterschiedliche Konzentrationen von A477-Hydrochlorid enthalten, und 5, 10 bzw. 15 Minuten in der Lösung belassen. Nach der entsprechenden Zeitspanne werden die Stäbe mit sterilem deionisiertem Wasser gespült und 18 bis 24 Stunden bei 37 ⁰C in nichtinoculiertem Medium inkubiert. Eine Farbänderung von Bromthymolblau von blau nach gelb infolge der Säurebildung des Organismus, ist eine Anzeige für positives Wachstum.

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Eine Lösung von A477-Hydrochlorid mit einer Konzentration von 0,1 % war gegen eine cariogene Streptococcus sp. wirksam, nachdem sie 5 Minuten mit den Zellen in Berührung war. Das Wachstum einer anderen Species von cariogenem Streptococcus wurde durch 5 Minuten lange Behandlung der Zellen mit einer 1-prozentigen Lösung verhindert.

In einem Brüheverdünnungstest wurden drei Species von cariogenem Streptococcus durch A477-Hydrochlorid in einer Konzentration von 5 mcg/ml inhibiert. Eine andere Species von cariogenen Organis1en (fadenförmiger Stäbchentyp) wurde durch A477-Hydrochlorid in einem Brüheverdünnungstest bei einer Konzentration von 1 mcg/ml inhibiert.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft von Antibioticum Λ477 ist seine Fähigkeit, das Wachstum von Tieren zu fördern. Nach Zugabe von A477-Hydrochlorid zu dem Futter von im Wachstum befindlichen Hühnern in einer Menge von 45,4 g/t beläuft sich die mittlere Gewichtszunahme nach 10 Tagen auf 154,2 g gegenüber einem Wert von nur 147 g für die Vergleichstiere. Die. Futterverwertung durch die Hühner, die das Antibioticum A477-Hydrochloricl erhielten, liegt bei 1,43, während die Futterverwertung der Vergleichsgruppe 1,53 beträgt.

Wie aus den vorstehend beschriebenen Eigenschaften des Antibioticums $477 ersichtlich, eignet es sich zur Unterdrückung des Wachstums von pathogenen Organismen. Beispielsweise können Lösungen mit entsprechenden Konzentrationen des Antibioticums zum Desinfizieren von chirurgischen und Dentalinstrumenten und Glaswaren verwendet werden. Das Antibioticum kann auch in Form von Lösungen zum Desinfizieren von Oberflächen, zum Beispiel Wänden, Fußböden und Tischen dort verwendet werden, wo es auf die Aufrechterhaltung von sterilen Bedingungen ankommt, beispielsweise in

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Krankenhäusern und Räumen, in denen Nahrungsmittel und Speisen zubereitet v/erden.

Infolge seiner Wirksamkeit gegen cariogene Organismen und Organismen, die an der Entstehung von Periodontitis beteiligt sind, kann A477 in inhibierenden Konzentrationen in Präparate eingebracht werden, die zur ^Tiundhygiene verwendet werden, zum Beispiel in Zahnpasten, Zahnpulver und Mundwässer.

Die Fähigkeit des Antibioticums, die Gewichtszunahme von Tieren zu fördern, macht es für diesen Verwendungszweck besonders gut geeignet. Wenn es als wachsturnsförderndes Mittel eingesetzt wird, wird das Antibioticum in geeigneten Konzentrationen in die normale Futterzuteilung für die Tiere eingebracht. Stattdessen kann auch ein lösliches Salz des Antibioticums im Trinkwasser der Tiere gelöst werden.

Bei allen vorstehend beschriebenen Anwendungen kann das Antibioticum entweder als freie Base oder als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz eingesetzt werden. Die Wahl richtet sich nach den physikalischen Eigenschaften des Antibioticums oder anderen Faktoren, ist jedoch nicht durch die biologischen Aktivitäten bestimmt, die für die freie Base und die Säureadditionssalze die gleichen sind.

Der zur Herstellung des Antibioticums A477 geeignete Mikroorganismus ist eine Species des Genus Actinoplanes der Familie Actinoplanaceae. Die Actinoplanaceae sind eine neuerdings charakterisierte Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales und wurden zum erstenmal beschrieben von Couch, /Jour. Rlisha Mitchell Sei. Soc., 65, 315-318 (1949); 66, 87-92 (1950); Trans. New York Acad. Sei., 16, 315-318 (1954); Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc, 71. 148-155 und 269 (1955); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Aufl., S. 825-829 (1957); Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc, 75, 53-70 (1963J_/.

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Eine für die Erzeugung des Antibioticums A477 geeignete Actinoplanes-Kultur ist ohne jede Beschränkung in der Kulturensammlung der Northern ülitization Research and Development Division, U.S. Dept. of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, V.St.A. hinterlegt worden, wo sie unter der Nummer NRRL 3884 für jedermann erhältlich ist.

Die für die taxonomischen Untersuchungen des A477 erzeugenden Stamms von Actinoplanes angewandten Methoden entsprechen denjenigen, die vom International Streptomyces Project empfohlen wurden. Daneben wurden noch Ergänzungstests angewandt, wie sie auf dem Gebiet der Taxonomie üblich sind. (Shirling, E. B., und D. Gottlieb, 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. International Bull. Systemic Bacteriol. 16 : 313 - 340). Die Farbbezeichnungen wurden entsprechend der ISCC-NBS-Methode zugeordnet. (Kelly, K. L. und D. B. Judd, 1955, The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names. U.S. Department of Commerce, Circular Number 553. Washington, D.C.). Die in Klammern angegebenen Zahlen beziehen sich auf Farbblöcke in Maerz und Paul, Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Company, Inc., New York.

Mikroskopisch beobachtete Morphologie

Das vegetative Mycel auf Amberbaumpollen in Tfasser ist spärlich. Die Palisadenhyphen haben eine Durchschnittsgröße von 1,3 χ 13 /u und weisen nur gelegentlich Verzweigungen auf. Auf Pollenmedium und dem International Streptomyces Project No. 3 Medium (Shirling und Gottlieb) werden Sporangien nur spärlich gebildet. Die Sporangien haben kugelähnliche Form mit einem Durchschnittsdurchmesser von 7,5 ,u und einer unregelmäßigen Oberfläche. Auf Elektronenmikrographien erscheinen die Sporen birnenförmig mit vielen Flagellen, beweglich und mit Abmessungen von 1,7 χ 1,2 ,u.

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Wachstumseigenschaften

Die Beobachtungen wurden nach 21 tagiger Züchtung bei 30 C gemacht. Die Bezeichnungen ISP beziehen sich auf International Streptomyces Project Media (Shirling und Gottlieb).

Hefe-Malz-Agar (ISP Nr. 2) Reichliches Wachstum, hellbraun

(13F0). Kein lösliches Pigment.

Czapek-Agar Reichliches Wachstum; Medium orange (10F7). Kein lösliches Pigment.

Ilafermehlagar (ISP Nr. 3) Gutes Wachstum; Medium orangegelb (11B7). Kein lösliches Pigment.

Anorganische Salze-Stärke (ISP Nr. 4) Reichliches Wachstum; bräunlichorange. Hellbraunes lösliches Pigment.

Glycerin-Asparagin (ISP Nr. 5) Reichliches Wachstum; Medium orange (10P7). Kein lösliches Pigment.

Glycerin-Glycin Sehr schwaches Wachstum. Kein lösliches Pigment.

Bennett-Medium Gutes Wachstum; gräulich rötliches Orange (11A8). Kein lösliches Picrment.

Tomatenmark-Hafermehl Reichliches Wachstum; bräunlichorange (12B9). Braunes löslic^os Pigment.

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Tyrosinagar Gutes Wachstum; hellgräulichgelblich-braun (13B3) . Kein lösliches Pigment.

Hefeextraktagar Iläßiges Wachstum;, stark gelblich braun (13H8). Braunes lösliches Pigment.

Glucose-Asparagin Reichliches Wachstum; blaßorangegelb (9E7). Kein lösliches Pigment .

Calciummalat Sehr schwaches Wachstum. Kein lösliches Pioment.

IJäh rag ar Spärliches Wachstum; blaßorangegelb (12B3). Geringes braunes lösliches Pigment.

Emerson's Agar Mäßiges Wachstum; mittelbraun (7E11). Lösliches Pigment, dunkelrötlich-braun.

Physiologie 'laciermilch: Ilach 21 Tagen trat weder eine Koagulation noch eine Klärung ein; hellbraunes Pigment.

Nitratreduktion: Positiv.

latino: Vollständige Verflüssigung nach Taaen.

'lelaninbildung: Positi" auf Pepton-Eisen-Agar (ISP-Fr. G) nach 24 Stunden.

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Temperaturerfordernisse

Glycerin-Asparagin-Agar Wachstum mäßig bis reichlich von

26 - 37 ⁰C. Kein Wachstum bei 43 ⁰C,

In Tabelle II sind die Ergebnisse der Kohlenstoffverwertungs· tests zusammengestellt, die mit dem A477 erzeugenden Stamm von Actinoplanes sp. NRRL 3884 durchgeführt wurden. Die in der Tabelle verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

Verwertung mögliche Verwertung zweifelhafte Verwertung keine Verwertung

Tabelle II Kohlenstoffverwertung von Actinoplanes sp. NRRL 3884 Kohlenstoffquelle Kohlenstoffquelle

Rhamnose (+) d-Xylose

Cellobiose (+) d-Mannit

Cellulose - Raffinose

i-Inosit - Saccharose

Melezitose - Maltose

D-Fructose + 1-Arabinose

D-Dextrose + Lactose

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Zur Züchtung von Actinoplanes sp. NRRL 3884 zur Erzeugung des Antibioticums A477 können die verschiedensten bekannten Medien verwendet werden. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Produktion, einer möglichst hohen Ausbeute und einer möglichst einfachen Isolierung des Antibioticums sind jedoch bestimmte Medien bevorzugt. So ist beispielsweise Dextrose eine der bevorzugten Kohlenhydratquellen, und Sojabohnenmehl ist eine der bevorzugten Stickstoffquellen.

Zu den anorganischen Salzen für das Nährmedium gehören die üblichen Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat, Carbonat und dergleichen in Ionenform liefernden Salze. Außerdem können noch Quellen für Wachstumfaktoren wie Distiller's Solubles und Hefeextrakte mit guten Ergebnissen mitverwendet werden.

Essentielle Spurenelemente, wie sie auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich sind, sollen auch in das Medium für die Züchtung des Actinoplanes sp. NRPJj 3884 aufgenommen werden. Solche Spurenelemente liegen üblicherweise als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums vor.

Der Anfangs-pH-Wert des Züchtungsmediums kann in weiten Grenzen schwanken. Vor dem Inokulieren mit dem Organis1us ist es jedoch zweckmäßig, den pH-Wert des Kulturmediums auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,3 je nach der Art des verwendeten Mediums einzustellen. Der End-pH-Wert wird wenigstens teilweise durch den Anfangs-pH-Wert des Mediums, die in dem Medium vorhandenen Puffer und die Dauer der Züchtung des Organismus bestimmt.

Zur Erzeugung beträchtlicher Mengen des Antibioticums A477 wird vorzugsweise eine submerse aerobe Fermentation in großen Tanks angewandt. Kleine Mengen des

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Antibioticums werden durch Schüttelflaschenkultur erhalten. Wegen der zeltlichen Verzögerung der Antibioticumbildung, die üblicherweise auftritt, wenn große Tanks mit der Sporenform des 0rg8nisraus inokuliert werden, wird vorzugsweise ein vegetatives Inokulum angewandt. Das vegetative Inokulum wird durch Inokulieren eines kleinen Volumens des Züchtungsmediums mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organisius hergestellt, wodurch eine frische, sich gut vermehrende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in die größeren Tanks überführt. Das für die Züchtung des vegetativen Inokulums verwendete Medium kann das gleiche sein, das für die Fermentation im größeren Maßstab verwendet wird, doch können auch andere Medien eingesetzt werden.

Der A477 erzeugende Organismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 40 C gezüchtet werden. Eine optimale A477-Erzeugung erfolgt offenbar bei einer Temperatur von etwa 30 ⁰C.

Wie bei submersen aeroben Kulturverfahren üblich, wi7d durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Zur Erzielung eines guten Wachstums des Organismus und einer leistungsfähigen A477-Erzeugung liegt das bei der Tankproduktion von A477 angewandte Luftvolumen vorzugsweise bei über 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium.

Die Erzeugung der antibiotisehen Aktivität während der Fermentation kann durch Untersuchung von Proben der Fermentationsmaische auf ihre antibiotische Aktivität gegen Organismen verfolgt werden, von denen festgestellt wurde, daß sie gegenüber dem Antibioticum empfindlich sind. Ein solcher für die erfindungsgemäße ?wecke

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brauchbarer Prüf Organismus ist Bacillus subtilis·. Die biologische Prüfung kann in zweckmäßiger Weise durch die Papierscheibenmethode auf Ägar-Platten durchgeführt werden.

Im allgemeinen erfolgt eine maximale Erzeugung des Antibioticums innerhalb von 2 bis G Tagen bei Fermentationen in großen Tanks oder Schüttelkolben. Die maximale Produktion der antibiotischen Aktivität ist in der Regel innerhalb von 48 bis 96 Stunden erreicht.

Das Antibioticum A 477 kann aus dem Medium durch extraktive und adsorptive' Arbeitsweisen gewonnen und von anderen möglicherweise vorhandenen Substanzen abgetrennt werden. Derzeit sind Adsorptionsverfahren für die Gewinnung von A 477 bevorzugt, weil hierbei die verhältnismäßig großen Volumina von Lösungsmitteln entfallen, die bei extraktiven Arbeitsweisen erforderlich sind. Kohle ist ein geeignetes Adsorbens für die Abtrennung des Antibioticums aus der filtrierten Gärbrühe, doch sind auch andere üblicherweise verwendete Adsorbentien in gleichem fiaße brauchbar. Die an das Adsorptionsmittel gebundene antibiotische Substanz wird durch übliche Elutionsverfahren gewonnen. Zur weiteren Reinigung von A477 können Adsorptions- und Elutionsverfahren unter Verwendung adsorptiver Stoffe wie Polyamidharze, Aluminiumoxidgele für Filtrationen und dergleichen nit Vorteil verwendet werden. Auch Ionenaustauscherharze können für die Reinigung von A477 verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

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Beispiel 1 A. Herstellung von Λ477 durch Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Actinoplanes sp. NRRL 3884 wurde auf einem Schrägager mit folgender Zusammensetzung hergestellt und erhalten:

Bestandteil

vorgekochtes Hafermehl 60,0 g

Hefe 2,5 g

K₅HPO₄- 1,0 g

1)
Czapek's Mineralmischung 5,0 ml

Agar 25,Og

entionisiertes Wasser 1 Liter

'Czapek's Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung:

KCl 100 g

MgSO₄.7H₂O 100 g

FeSO..7H₉O 2 g (gelöst in

⁴ 2ip1 konz.

HCl)

entionisiertes Wasser 1 Liter

Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydrojtidlösung auf pH 7,3 eingestellt. Nach der Sterilisation im Autoklaven bei 120 ⁰C während 30 Minuten bei 1 bis 1,4 atü (15 - 20 pounds pressure) betrug der pH-Wert des Mediums 6,7.

Der Schrägagar wurde mit Actinoplanes sp. NRRL 3884 inokuliert und 7 bis 10 Tage bei 30 ⁰C inkubiert. Das Mycelwachstum wurde mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt,

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und die Oberfläche des Schrägagars wurde zum Ablösen der Organismen geschabt. Da die Kultur nicht sporuliert, ist es zweckmäßig, die Mycelschicht mit einer abgeflachten geschärften Impfnadel oder -lanzette zu zerkleinern, um die Zahl der möglichen Wachsturnsζentren zu erhöhen. Die Hälfte einer so hergestellten Schrägagarkultur wurde zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

Glucose 10,0 g

Stärke 20,0 g

Sojamehl 20,0 g

Hefe 2,0 g

CaCO₃ 2,0 g

Leitungswasser 1,1 Liter

Das inokulierte vegetative Medium wurde 72 Stunden bei 30 °c auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 250 UpM inkubiert. 10 ml der Fermentationsmischung wurden zum Beimpfen von 100 ml eines zweiten vegetativen Züchtungsmediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

Glucose	10,0-	g
Kartoffeldextrin	20,0	g
Sojamehl	20,0	g
autolysierte Brauereihefe	3,0	g
CaCO,,	4,0	g
Leitungswasser	1,1	Liter

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Das inokulierte Medium wurde 48 Stunden bei 20 °c auf einer Rundschüttelvorrichtung (250 UpM) inkubiert, dieses zweite vegetative Medium wurde zum Beimpfen von 30 ml eines sterilen Produktionsmediums folgender Zusammensetzung in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet:

Bestandteil 5

Dextrose 1,0

Starke 2,0

Mannit 1,0

Sojamehl 1,5

autolysierte Brauereihefe 0,1

CaCO₃ 0,2

Leitungswasser auf 1 Liter

Das inokulierte Medium in dem Erlenmeyer-Kolben wurde 72 bis Stunden bei 30 ⁰C auf einer RundschUttelvorrichtung (250 UpM) gehalten. Der End-pH-Wert betrug 7,0 bis 7,5.

B. Tankfermentation

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wurde bin einschließlich der Herstellung des vegetativen Mediums der zweiten Stufe wiederholt. 2OO ml dieses vegetativen Mediums wurdön zum Beimpfen von 25 Liter eines sterilen Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil £

Dextrose 1 ,0

Starke 2,0

Mannit 1,0

Sojamehl 1 ,5

autolysierte Brauereihefe 0,1

CaCO₃ O,2

Entschäumer 0,02

Wasser 25 Liter

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Nach dem Sterilisieren im Autoklaven bei 120 ⁰C und einem Druck von 1 bis 1,4 atü während 30 Minuten lag der pH-Wert des Mediums bei 7,3 bis 7,4. Das beimpfte Produktionsmedium wurde 5 Tage bei einer Temperatur von 30 ⁰C in einem 25 Liter-Fermentor belas+en. Während der Fermentation wurde sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 1/2 Volumen Luft pro Volumen Züchtungsmedium und Minute zugeführt. Außerdem wurde mit herkömmlichen Rühreinrichtungen bei 500 UpM gerührt.

C. Isolierung von A477

Die Gesamt-Gärmaischen aus zwei 25 Liter-Tanks, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden vereinigt und zur Einstellung des pH-Werts auf 10,5 mit 5n Natriumhydroxid versetzt. Hach Filtrieren mit einer Filterhilfe wurde der Mycelrückstand in Wasser suspendiert und eine Stunde gerührt. Dann wurde vom Mycel abfiltriert, das verworfen wurde. Die Filtrate wurden vereinigt und ergaben ein Gesamtvolumen von 66,5 Liter. Der pH-Wert der vereinigten Filtrate wurde mit 3n Salzsäure auf 8,0 eingestellt. Die vereinigten Filrate wurden durch eine mit granulierter Kohle (Korngröße 1,68 χ 0,42 mm) in Wasser gefüllte Säule geleitet. Die Säule wurde mit 15 Liter Wasser gewaschen, wobei die austretende Flüssigkeit verworfen wurde. Dann wurde die Säule nit 20 Liter wässriger Salzsäure mit einen pH von 2,5 gewaschen, und die austretende Flüssigkeit wurde gleichfalls verworfen. Die Kohlesäule wurde mit. 4 Liter einer Aceton-Wassor(1:1)-Lösung eluiert, din nit 3n Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt worden war. Der pH-Wert des Eluats wurde mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 3,0 eingestellt. Das die A477-Äktivitnt enthaltende Eluat wurde auf ein volumen von 1700 ml eingeengt und in einer 7 :r CO cn-SMule an mit Wasser gewaschenes Polyamitfharz adsorbiert.

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Die Polyamidharzsäule wurde mit 8 Liter Wasser eluiert, wobei das Eluat in einer Mehrzahl von Fraktionen aufgefangen wurde. Die A477-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf ein kleines Volumen eingeengt. Das Konzentrat wurde mit vier Volumina Methanol und anschließend einem gleichen Volumen Kther versetzt, wodurch das Antibioticum A 477 ausgefällt wurde, das filtriert und getrocknet wurde. Man erhielt 1,1 g.

Eine weitere Menge an A477 wurde durch Eluieren der Polyamidsäule mit einer Mischung von Methanol und Wasser (1:1) gewonnen. Die A477-Aktivität enthaltenden Eluate wurden vereinigt und auf ein kleines Volumen eingeengt. Das Konzentrat wurde mit vier Volumina Methanol versetzt, und das Antibioticum wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens zither ausgefällt. Der Miederschlag wurde durch Filtrieren gewonnen und belief sich auf 3,0 g.

Beispiel 2 Reinigung des Antibioticum« A477 unter Verwendung

von Aluminiumoxid

nie in Beispiel 1, Teil C, für die Isolierung des Antibioticum A477 beschriebene Arbeitsweise wurde bis einschließlich der Flution der Kohlesäule wiederholt. Der pH-Wert des Eluats wurde mit 5n-Hatriumhydroxirl-Lösung auf 7,5 bis P,0 eingestellt, worauf das Fluat auf ein Volumen von 200 ml eingeengt wurde.

100 ml dieses die A477-Aktivitnt enthaltenden eingeengten Eluats wurden auf eine 2,7 χ 80 cm-Säule aufgegeben, die mit Säure gewaschenes Aluminiumoxid in rasser enthielt. nie S'iule wurde dann mit z'/ei Liter Methanol gewaschen.

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Das austretende Methanol wurde verworfen. Die A477~Aktivität wurde mit wässrigem Methanol (1:1) aus der Säule eluiert, und die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft* Der trockne Rückstand wurde in 100 ml wässrigem Methanol (1:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wurde zu 2 Litern Aceton gegeben, um das gereinigte A477 zu fällen. Ausbeute: 2,2 g.

Beispiel 3 Herstellung von A477-Hydrochlorld

500 mg des wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben hergestellten A477 wurden in 20 ml 50-prozentigem wässrigem Methanol gelöst. Die Lösung wurde mit In HCl auf pH 1,5 eingestellt und unter Rühren zu 400 ml Aceton gegeben, um das A477-Hydrochloridsalz zu fällen. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Die Ausbeute an A477-Hydrochlorid betrug 420 mg.

Beispiel 4 Herstellung von A477-Picrat

Eine Lösung von 500 mg A477 in 20 ml Wasser wurde mit 20 ml einer gesättigten wässrigen PicrinsäurelÖsung versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei 5 ⁰C stehengelassen. Es bildete sich ein gelber Niederschlag, der abfiltriert wurde. Man erhielt 505 mg des gelben A477-Picrats.

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Beispiel 5 Herstellung von A477-Hyd.rochlorid aus A477-Plcrat

Eine Lösung von 505 mg A477-Picrat in 25 ml Methanol wurde mit 1n Salzsäure versetzt, bis der pH-Wert 1,5 erreicht hatte. Die erhaltene saure Lösung wurde unter Rühren zu 500 ml Diäthylather gegeben, um das A477-Hydrochlorid auszufällen. Der so erhaltene Miederschlag wurde abfiltriert und getrocknet und ergab 442 mg A 47 7-Hydrochlorid.

Beispiel 6 Herstellung von A477-freier Base aus A477-Hydrochlorid

Eine Lösung von 500 mg A477-Kydrochlorid in 20 ml Wasser wurde durch ein Ionenaustauscherharz (OH ) in einer 1 χ 10 cm-Glassäule geleitet. Die austretende Flüssigkeit wurde aufgefangen, und die Säule wurde mit Wasser eluiert. Das wässrige Eluat und die zunächst ausgetretene Flüssigkeit wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml 50-prozentigem wässrigem Methanol gelöst und unter Rühren zu 4OO ml Aceton gegeben, wodurch die freie Base von A477 ausfiel.

Der so gebildete Niederschlag wurde filtriert und getrocknet. Man erhielt 225 mg A-177.

Beispiel 7 Herstellung von A477-Sulfat

Eine Lösung von 500 mg A477-Hydrochlorid in 20 ml Wasser wurde durch eine 1 cm χ 10 cm-Säule mit einem Ionenaustauscherharz im Hydroxylzy'ilus geleitet. Die Säule wurde

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mit Wasser gewaschen, und die aktiven Fraktionen wurden
vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene getrocknete Rückstand wurde in 20 ml 50~prozentigem wässrigem Methanol gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde nit 1n H„SO* auf,
1,5 eingestellt, und die angesäuerte Lösung wurde zu 400 ml
Aceton gegeben. Das A477-Sufat fiel aus und wurde durch Filtrieren gewonnen. Ausbeute: 331 mg.

Beispiel B
Herstellung des ^T'ethylorange-Salzes von M77

nine-Lösung von SOO ng Λ477 in 2o :n] Fasser wirrte mit 20 nl
einer gesättigten Lösung von Methylorange in Wasser versetzt, Die erhaltene Lösung" wurde über Hacht stehengelassen, wonach die Fällung des A477-Ilethylorange-Salzes vollständig war.
Das Salz wurde durch Filtrieren gev/qnnen und getrocknet.
Ausbeute: 521 mg.

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Claims (18)

1. DRD - 24 -

   Patentansprüche

   . Das Antibioticum A477 und seine Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibioticum als freie Base eine weiße amorphe feste Substanz mit einem spezifischen Drehwert von /alpha/« -66,6 °(c=1% in 50-prozentigem wässrigem Methanol und etwa der folgenden Elementarzusammensetzung 53,06 % Kohlenstoff, 6,18 % Wasserstoff, 5,79 % Stickstoff, 31,40 % Sauerstoff und 3,39 % Chlor; und in Form seines Hydrochloridsalzes, eine weiße kristalline Substanz ist, die bei 207 - 212 ⁰C schmilzt, in warmem Wasser und in 50-prozentigem wässrigen Methanol löslich ist und vier titrierbare Gruppen aufweist, von denen zwei pK¹ Werte von 7,0 und 9,7 und zwei pK¹ -Werte von über 11 bei der Bestimmung durch elektrometrische Titration in 66-prozentigom wässrigen riethylformamid haben, sowie eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 55,36 % Kohlenstoff, 6,02 % Wasserstoff, 5,73 % Stickstoff, 20,99 % Sauerstoff, 4,52 % Oesamtchlor und 1,28 % anorganisches Chlor und ein durch Dampfdruckosirometrie bestimmtes ungefähres Molekulargewicht von 1480 hat, in Mineralölauf schlärrarung folgende unterscheidbare Banden im Infrarotabsorptionsspoktrum zeigt: 3,0, 5,P, 6,02, 6,3, C₁ 62, 6,84, 7,02, 7,26, 7,32, 7,7, 8,1, Π,27, 8,52, 8,97, 9,35, 9,7, 9,8 und 10,1 Ilicron, in wässrigsauren und neutralen Lösungen in Ultraviolettqobiet mit einer Ab-

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   3 0 9 8 1 8 / 1 2 (U

   BRD - 25 -
2. 2. Das Hydrochlorid von Antibioticum A4?7.
3. 3. Das Pic.rat von Antibioticum A477.
4. 4. Das Sulfat von Antibioticum A477.
5. 5« Das Methylorangesalz von Antibioticum A477,
6. 6. Verfahren zur Herstellung des in Anspruch 1 definierten Antibioticums A477 und seiner Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes sp. NRRL 3 in einen assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthaltenden Medium unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis in dem riedium eine beträchtliche Menge an A477 von dem Organismus gebildet worden ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibioticum A477 aus der Gärmaische gewinnt,
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem das Antibioticum A477 in ein pharmazeutisch annehmbares Salz überführt.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man es in das HydrochloridScilz überführt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man es in das Picratsalz überführb.

    3098187120-4

    DPD - 26 -
11. 11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es in das Sulfatsalz überführt.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man es in das Methylorange-Salz überführt.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Medium bei einer Temperatur von 20 bis 40 ⁰C hält und die Fermentation 2 bis 6 Tage durchführt.
14. 14. Verwendung des Antibioticums A477 oder seiner Säureadditionssalze als Wirkstoff für die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen.
15. 15. Beifuttermittel enthaltend das Antibioticum A477 oder eines seiner Sfiureadditionssalze.
16. 16. Anticariogenes Mittel enthaltend das Antibioticum A477 oder eines seiner Säureadditionssalze.
17. 17. Anticariogenes Mittel nach Anspruch 16 in Form einer Zahnreinigungsmasse.
18. 18. Anticariogenes Mittel nach Anspruch 16 in Form eines Mundwassers.

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