DE2019838C3

DE2019838C3 - 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2019838C3
Application number: DE2019838A
Authority: DE
Inventors: Marvin Martin Hoehn; Robert Howard Williams
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-04-23
Filing date: 1970-04-23
Publication date: 1978-12-14
Also published as: GB1281452A; DE2019838A1; FR2042367B1; BR6915071D0; FR2042367A1; NL7005784A; DK128458B; US3674774A; JPS496677B1; DE2019838B2

Description

Skala nut 1 +,2+, 3+,4+ und negativ folgendermaßen bewertet:

4+ Dunkelgefärbte Gebiete, die bei mikroskopischer Untersuchung gesunde Zellen ohi>e sichtbare Virus- oder Wirkstoffschäden zeigen.

3 + Weniger dunkel gefärbte Gebiete, die keine Virusoder Wirkstoffschäden zeigen, aber weniger gesund aussehen.

2+ Gebiete, die gesunde Zellen mit mäßigem Virusdurchbruch zeigen.

1+ Gebiete, die gesunde Zellen mit stärkerem Virusdurchbruch zeigen.

— Keine lebenden Zellen.

Die folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Prüfung von Salzen der erfindungsgemäßen Verbindung gegen Masern-Viren (Edmondston-Stamm), Kuhpokken-Viren (VI Lindeman), Coxsackie-Viren und Herpessimplex-Viren. Spalte 1 der Tabelle gibt die Konzentration in Mikrogramm/Milliliter an, in der der Wirkstoff auf die Filterpapierscheiben aufgebracht wird, Spalte 2 den Durchmesser der Zone der Virusinhibierung durch die Testverbindung in mm, Spalte 3 die Bewertung von gefärbten Gebieten und Spalte 4 den Namen des Virus, gegen das die Verbindung getestet wird.

Tabelle I

Antivirale Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung in vitro

(mcg/ml)

Zone

(mm)

Mikroskopische Untersuchung

Virus

60
50
50
50
50
40
25
22
20
28
35
33
30
30
25
22

4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+

Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex

10

15

20

25

30

Konz.

(mcg/ml)

Zone

(mm)

Mikroskopische Untersuchung

Virus

1000

3,5
1,5
0,75
1000
500
250
125
62
31
15
7
3,5

12
10
50
43
43
37
30
37
30
22
20
15
H
33
35
33
30
30
30
15
15
11

2+ 2+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 1 + 1 + 1 + 1 +

Hsrpes simplex

Herpes simplex

Masem

Masern

Coxsackie

Die antiviraien Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindung und des dem nächstvergleichbaren Stand der Technik angehörenden Antibiotikums Formycin werden gegenüber einer Anzahl von Viren verglichen.

Hierzu sind in der folgenden Tabelle die Konzentrationen in mcg/ml, die akuten Toxizitäten der zu untersuchenden Verbindungen bei den angegebenen Konzentrationen, die Durchmesser der Zonen der Virusinhibierung durch die Testverbindungen in rrm als Maß für die Aktivität sowie die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung der behandelten Zellen in Form der nachfolgenden qualitativen Bewertung wiedergegeben:

4+ Gesunde Zellen ohne Virus- oder Wirkstoffschä-

den.

+ Gesunde Zellen mit vermindertem Stoffwechsel.

+ Hauptanteil der Zellen gesund mit leichtem Virusdurchbruch.

+ Geringer Teil der Zellen gesund mit stärkerem

Virusdurchbruch.

Je höher der numerische Wert, um so größer die antivirale Aktivität.

Tabelie Il

Vergleich der antiviraien Aktivitäten in vitro von Formycin und der erfindungsgemäßen Verbindung

Konz. Gegenüber

Toxizität

(mcg/ml) Formycin erf. Verbindung Aktivität, Zone (mm)

Formycin erf.Verbindung

Mikroskopische Untersuchung

Formycin erf. Verbindung

1. Kuhpocken

1000 500

14 12 32
30

60
50

4+ 4+

5	Fortsetzung	Konz.	20 19	838	Aktivität,	6	Mikroskopische Untersuchung	erf. Ver bindung
	(mcg/ml)			Formycin		Formycin	4+
	250	Gegenüber Toxizität		24	Zone (mm)	+	4+
	125	Formycin	erf. Ver bindung	20	erf.Ver- bindung	+	2+
	1000	10	—	24	50	+	2+
2. Coxsackie A 21	500	-	-	20	50	+	2+
	250	14	-	14	33	+	2+
	125	10	-	14	35	+	4+
	1000	7	-	34	33	2+	4+
3. Virus 5 AP 305	500	-	-	30	30	2+	4+
	250	22	20	24	50	2+	4+
	125	18	13	20	40	2+	4+
	1000	13	8	40	30	3+	4+
4. Virus Adeno (SA-7)	500	11	7	35	30	3+	4+
	250	23	-	24	50	3+	4+
	125	15	-	20	40	3+	4+
	1000	10	-	40	30	3+	4+
5. Virus Maryland B	500	-	-	35	30	3+	4+
	250	23	20	24	50	3+	4+
	125	20	13	20	40	3+
	14	8	30
	11	7	30

Diese Versuche erfolgten in vitro an Gewebekulturen. Bei der Untersuchung betreffend die Viren Nr. 1 und 4 wurde eine Affennierengewebekultur verwendet, die mit der Abkürzung BSC-I bezeichnet wird. Der Virus Nr. 2 wurde in menschlichem Fruchtwasser (als AV₂ bezeichnet) untersucht, während die Viren Nr. 3 und 5 an Zellen von Hundenieren (als MCDK bezeichnet) untersucht wurden. Die bei den verschiedenen Konzentrationen angegebenen Toxizitätswerte wurden im Anschluß an die Untersuchungen durch mikroskopische Bewertung der Gewebekulturen ermittelt Die angegebenen Werte stehen für den Durchmesser der toxischen Zone in Millimeter, so daß die Toxizität um so günstiger ist, je kleiner die angegebene Zahl ist so

Aus den angegebenen Toxizitätswerten ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum eine geringere Toxizität als das Vergleichsantibiotikum Formycin besitzt Weiterhin entfaltet das erfindungsgemäße Antibiotikum eine erheblich größere Wirkung, was aus den Aktivitätszahlen und den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung ersichtlich ist Zum Beispiel betragen für den Virus Nr. 1 die bei der mikroskopischen Untersuchung erhaltenen Werte für die erfindungsgemäße Verbindung bei allen Konzentrationen 4+, während die mit Formycin erhaltenen Ergebnisse nichtsignifikant waren, was durch das in der Tabelle des Versuchsberichts angegebenen Pluszeichen verdeutlicht ist Weiterhin ergibt sich ein erheblicher Aktivitätsunterschied im Fall des Virus Nr. 2, nämlich des Coxsackie-Virus A 21, der gegenüber der erfindungsgemäßen Verbindung eine Aktivität von 2+ entfaltet, während Formycin wiederum zu nichtsignifikanten Ergebnissen führt (+). Selbst im Fall der Viren Nr. 4 und 5 zeigt sich das erfindungsgemäße Antibiotikum bei allen Konzentrationen erheblich aktiver als Formycin.

Der Mikroorganismus Streptomyces candidus wurde erstmals aus aus Indien stammenden Bodenproben folgendermaßen isoliert

Anteile der Bodenproben wurden in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspensionen wurden in Streifen auf Nähragarplatten aufgetragen. Die angeimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 30° C inkubiert. Am Ende der Inkubationsdauer wurden Kolonien der die erfindungsgemäße Verbindung produzierenden Organismen mi) Hilfe einer sterilen Platinschlinge auf Schrägagai überführt. Die inokulierten Agarschrägkulturen wurden dann zur Erzielung größerer Mengen Inokulum für die Produktion der Substanz inkubiert

Der neue Mikroorganismus wurde ohne Beschränkung bei der Kultursammking der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (früher Northern Regional Research Laboratories] Peoria, Illinois hinterlegt und ist für jedermann unter dei Kulturnummer NRRL 3601 erhältlich.

Wegen der Schwierigkeiten von taxonomischer Bestimmungen bei Mikroorganismen der Gruppe Streptomyces ist die Klassifizierung eines neu aufgefundenen Organismus stets mit einer gewissen Unsicherheit behaftet Der die erfindungsgemäße Verbindung produzierende Organismus steht jedoch offenbar ir seinen wichtigsten Merkmalen dem Mikroorganismus Streptomyces candidus (Krassilnikov) Waksmar aufgrund einer veröffentlichten Beschreibung diese:

Mikroorganismus von W a k s m a η, The Actionmycetes, Bd. 2, Classification, Identification and Description of Genera and Species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Maryland (1963) am nächsten.

Die Kultur NRRL 3601 wird der Sektion Rectus-flexibilis, Weiß-Serie nach Pridham et al. (Pridham et al., »A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups«, Applied Microbiol. 6: 52—79 [1958]) sowie ferner entweder der Weiß-Serie oder der Gelb-Serie des Systems nach Tresner and Backus (»System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy«, Applied Microbiol. 11: 335—338 [1963]) zugeordnet. Wie oben angegeben, wurde der Mikroorganismus als Stamm von Streptomyces candidus klassifiziert. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß andere Spezies, nämlich Streptomyces alboflavus und Streptomyces longissimus ebenfalls Streptomyces candidus NRRL 3601 ähnlich sind. Generell bildet Streptomyces candidus NRRL 3601 gewellte Sporophoren und zylindrische glatte Sporen, die en masse weiß bis blaßgelb sind. Das vegetative Mycel ist gelb bis orangegelb. Ein hellgelbes bis hellbraunes lösliches Pigment ist in zwei Medien vorhanden und fehlt in allen anderen Medien. Auf den meisten Medien kommen Büschel von Luftmycel und sclerotische Bildungen vor.

Für die taxonomischen Untersuchungen des die

Tabelle III

Beschreibung der Kultur NRRL 3601

erfindungsgemäße Verbindung produzierenden Stamms von S. cancidus wurden die Methoden, die für das internationale Streptomycesprojekt, beschrieben von S h i r I i η g und G ο 111 i e b, »Methods for Characteri-) zation of Streptomyces Species«, Intern. Bull. Systemic Bacteriol.: 16, 313—340 (1966), empfohlen werden, zusammen mit weiteren Hilfstests angewandt. Kohlenstoffverwertungstests wurden nach der Methode durchgeführt, die von Pridham und G ο 111 i e b,

ι ο J. Bac. 56:107 (1948) beschrieben wurde. Die Ergebnisse der taxonomischen Bestimmungen sind nachstehend in Tabelle III angegeben. Farbnamen wurden nach der ISCC-N BS-Methode (K e 11 y und J u d d, »The ISCC-NBS-Method of Designating Colors and a Dictionary of

15 Color Names«. U.S. Dept. of Commerce Circ. 553, Washington, D. C.) zugeordnet. Angaben in runden Klammern beziehen sich auf die Farbreihe nach Tresner und Backus (Tresner und Backus, »System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy«,

20 Appld. Microbiol. 11:335—338 [1966]), Farbblocks nach Maerz und Paul (Maerz und Paul, Dictionary of Color, McGraw-Hill, New York [1950]) sind in eckigen Klammern angegeben. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Kulturen 14 Tage bei 30° C

25 gezüchtet

Beobachtete Eigenschaft

Charakteristika von NRRL 3601

Morphologie

Kulturmerkmale auf:
Hefe-Malz-Agrar

Hafermehl-Agrar
Inorganische Salze und Stärke

Glycerin-Asparagin-Agar
Czapeks Agar

Tabelle III (Fortsetzung)
Beschreibung der Kultur NRRL 3601

gewellte Sporophoren werden auf gebüscheltem Luftmycel gebildet; die Sporen sind cyrlindrisch, Abmessungen 0,67-1,0 μ · 1,7-2,7 μ, mit glatten Sporenoberflächen (elektronenmikroskopische Aufnahme)

Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6]; Luftmycel und Sporulation mäßig, weiß (W) a; kein lösliches Pigment; Sclerotiabildung

Wachstum mäßig, Revers gelblichweiß [9Cl]; Luftmycel und Sporulation mäßig, weiß (W) a; kein lösliches Pigment; Sclerotiabildung

Wachstum mäßig, Revers mittelgelb [10H4]; Luftmycel mäßig, Sporulation mittel, gelblichweiß (Y) 2ba [9D2]; lösliches Pigment spärlich braun;

Sclerotia vorhanden Wachstum mäßig, Revers lebhaftgelb [9J5]; Luftmycel und Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers lebhaftgelb [11J5]; Luftmycel mittel, weiß

(W) a, keine Sporulation; kein lösliches Pigment

Beobachtete Eigenschaft

Charakteristika von NRRL 3601

Glucose-Asparagin
Tyrosin-Agar

Nähr-Agar
Calciummalat

Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6]; Luftmycel reichlich, Sporulation mittel, blaßgelb (Y) 2ba [9D2]; kein lösliches Pigment

Wachstum mäßig, Revers hellgräulichbraun [11B2]; Luftmycel mäßig, weiß (W) a, Sporulation gering, kein lösliches Pigment; Sclerotia vorhanden

Wachstum mäßig, Revers blaßgelbgrün [10Bl]; Luftmycel spärlich, keine Sporulation; kein lösliches Pigment; Sclerotia vorhanden

Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [10J5]; Luftmycel und Sporulation mäßig, blaßorangegelb (R) 3ca [9E3]; lösliches Pigment hellgelb

ίο

Fortsetzung

Beobachtete Eigenschaft

Glycerin-Glycin

Tomatenpaste-Hafermehl

Emersons Agar
Bennetts Agar

Wirkung auf Milch
Nitratreduktion

Melaninbildung auf:

Pepton-Eisen-A gar
Trypton-Hefeextrakt-Brühe
Gelatineverflüssigung
Temperaturanforderungen

Reaktion der Substratfarbe auf
pH-Änderung

	C-Quellenverwertung
t;	L-Arabinose
I	Saccharose
I	D-Xylose
f	D-Fructose
	i-Inosit
	D-Mannit
Ϊ	D-Dextrose
t	Maltose
	Melizitose
	Cellulose
Kein Kohlenstoff (Kontrolle)

Charakteristika von NRRL 3601

Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6]; Luftmycel mäßig, Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers mitttelorange bis mittelorangegelb [10J7]; Luftmycel und Sporulation reichlich, blaßgelb (Y) 2ba [9D2]; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers hellgelb [10G3]; Luftmycel spärlich, keine Sporulation; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers mittelorangegelb [1016]; Luftmycel reichlich, Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

schwache Koagulation und gewisse Klärung in 14 Tagen
schwache Reduktion in 14 Tagen

negativ
negativ
vollständig in 14 Tagen

Wachstum auf Hefe-Malz-Agar von 26"¹C bis 37"C; kein Wachstum bei 43⁰C

unbeeinflußt

Erläuterung: + Verwertung positiv. (+) Verwertung wahrscheinlich. (-) Verwertung fraglich. - keine Verwertung.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindung so durch Züchtung des oben beschriebenen Mikroorganismus können zahlreiche Medien verwendet werden, da, wie aus den vorstehenden Verwertungstests zu ersehen ist, der Organismus verschiedene Energiequellen zu verwerten vermag. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Produktion, einer maximalen Ausbeute an Antibiotikum und einer leichten Isolierung des Antibiotikums sind jedoch einige verhältnismäßig einfache Nährmedien vorzuziehen. Beispielsweise enthalten die Medien, die für die Produktion des Antibiotikums vorteilhaft sind, ω eine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Dextrose, Dextrin, Glycerin und dergleichen. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Dextrose. Ferner enthalten verwendbare Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, z. B. Soyabohnenmehl, Maisquellwasserfeststoffe, Hefe, Baumwollsamenmehl, Rindfleischextrakt, Peptone (aus Fleisch oder Soyabohnen), Casein, Aminosäuregemische und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Hefeextrakte, Aminosäuregemische und dergleichen. Zu den anorganischen Nährsalzen, die in die Züchtungsmedien eingebracht werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen und ähnliche Ionen liefern.

Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindung verwendeten Organismus erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich in den anderen Bestandteilen des Mediums als Verunreinigungen in genügenden Mengen enthalten, um den Wachstumsbedarf des für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendeten Actinomyceten zu erfüllen.

Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann schwanken. Als zweckmäßig hat sich jedoch ein Anfangs-pH-Wert des Mediums zwischen etwa 6,0 und

etwa 7,5 erwiesen. Wie bei anderen Actinomyceten steigt der pH-Wert des Mediums während der Wachslumperiode des Organismus, in der das Antibiotikum erzeugt wird, allmählich an und kann einen Wert von etwa 6,5 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der End-pH-Wert wenigstens zum Teil von dem AnfangspH-Wert des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Zeitdauer abhängt, während der Organismus wachsengelassen wird.

Submers-aerobe Züchtungsbedingungen sind die Bedingungen der Wahl zur Produktion des gewünschten Antibiotikums. Zur Erzeugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolbenkulturen und Oberflächenkulturen in Flaschen angewandt werden. Zur Herstellung großer Mengen dagegen wird eine submers-aerobe Züchtung in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension inokuliert werden. Wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Verwendung einer Sporensuspension als Inokulum beobachtet wird, wird jedoch die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Indem so die Wachstumsverzögerung vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt. Es ist daher zweckmäßig, zuerst durch Inokulieren einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus ein vegetatives Inokulum zu erzeugen, und, wenn ein junges, vegetatives Inokulum erhalten worden ist, das vegetative Inokulum aseptisch in den großen Tank zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, jo kann entweder das gleiche Medium oder ein anderes Medium als das Medium sein, das zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindung in großem Maßstab verwendet wird.

Der eingesetzte Organismus wächst innerhalb eines weiten Temperaturbereichs von 25 bis 37° C. Optimale Produktion an erfindungsgemäßer Verbindung erfolgt offenbar bei Temperaturen von 25 bis 30⁰C. Im allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion des Antibiotikums innerhalb etwa 48 bis 72 Stunden nach dem Inokulieren des Kulturmediums.

Wie es bei aeroben Submers-Kulturverfahren üblich ist, wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Zur Erzielung eines wirksamen Wachstums des Organismus und einer entsprechenden Wirkstoffproduktion wird bei der Tankproduktion ein Luftvolumen von 035 bis 0,80 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumenteil Kultur angewandt Bevorzugt werden 0,40 Volumenteile Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium.

Die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht durch Prüfung von Proben des Kulturmediums auf ihre inhibierende Wirkung auf das Wachstum von Organismen, die durch Anwesenheit der erfindungsgemäßen Verbindung inhibiert werden, leicht verfolgt werden. Der Organismus Neurospora spp. hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Prüfung der Proben kann nach dem bekannten Diffusionsverfahren mit Agarnäpfchen erfolgen.

Bei submers-aeroben Kulturen oder Schüttelkolbenkulturen erfolgt im allgemeinen eine maximale Produktion an gewünschter Substanz innerhalb etwa 2 bis 3 Tagen nach Inokulieren des Kulturmediums.

Die während der Fermentation der Verbindung erzeugte antibiotische Aktivität kann entweder in der antibiotischen Brühe und/oder im Mycel vorliegen. Daher sind die bei der Produktion des Wirkstoffs angewandten Isolierungsmethoden so ausgelegt, daß eine maximale Gewinnung des Antibiotikums aus jeder der beiden Quellen oder beiden Quellen ermöglicht wird. So kann beispielsweise die Fermentationsbrühe, so wie sie erhalten wird, filtriert und das Antibiotikum durch Adsorption aus dem Filtrat mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, zum Beispiel Kohle, und Eluieren der Aktivität aus dem Adsorptionsmittel, beispielsweise mit Acetop/Wasser als Eluiermittel, gewonnen werden. Das rohe Antibiotikum wird durch lonenaustauschchromatographie und Gelfiltration weiter gereinigt. Außerdem kann das restliche Antibiotikum, das in dem Mycelkuchen enthalten ist, durch gründliche Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel Methanol, gewonnen werden. 75 bis 95% der Aktivität wurden jedoch in der Brühe gefunden.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Schüttelkolbenproduktion der erfindungsgemäßen Verbindung

Sporen von Streptomyces candidus NRRL 3601 werden auf Nähragarschrägkulturen inokuliert. Das Nähragarmedium besteht aus 10 g Dextrin, 2 g enzymatisch abgebautem Casein, 1 g Rindfleischextrakt, 1 g Hefeextrakt, 20 g Agar und destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter. Die Schrägkulturen werden mit Sporen von Streptomyces candidus NRRL 3601 inokuliert und 4 bis 6 Tage bei 30⁰C inkubiert. Die reifen Schrägkulturen werden mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und vorsichtig mit einer Schlinge abgeschabt, um die Sporen abzulösen und eine wäßrige Sporensuspension zu erzeugen. 1 ml der erhaltenen Sporensuspension wird zum Inokulieren von jeweils 100 ml vegetativem Medium verwendet.

Das vegetative Kulturmedium wird aus 15 g Glucose, 15 g Sojabohnenmehl, 5 g Maisquellwasserfeststoffen, 2 g Calciumcarbonat, 5 g Natriumchlorid und Leitungswasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter bereitet

Das vegetative Inokulum wird 48 Stunden bei 30⁰C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2") bei 108 UpM geschüttelt. Das so bereitete Inokulum wird dann wie folgt für die Produktion des gewünschten Antibiotikums verwendet.

Es wird ein Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung bereitet:

Sojabohnenmehl	15 g/l
Casein	lg/1
NaNO₃	3 g/l
Glucosesirup	20 g/l
CaCO₃	2,5 g/l
Leitungswasser

Anteile des Produktionsmediums von 100 ml werden in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, die dann 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert werden. Nach dem Abkühlen wird jeder Kolben mit 5% eines wie oben bereiteten vegetativen Inokulums inokuliert

Die Produktionskolben werden 48 Stunden bei 30⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem Bogenausschlag von 5 cm (2") geschüttelt, die mit 250 UpM betrieben wird. Der pH-Wert des nichtinokulierten Mediums reicht von 6,0 bis 7,5. Der pH-Wert am Ende des Fermentationszyklus liegt zwischen 6,5 und 8,0. Die antifungale und antivirale Wirkstoffaktivität

wird sowohl in der Brühe als auch im Mycel gefunden. Die Aktivität wird durch Prüfung der Brühe und des Mycel gegen Neurospora spp. nachgewiesen. Die Isolierung der Substanz wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführ.

Beispiel 2
Halbtechnische Produktion des Antibiotikums

Die Produktion des erfindungsgemäßen Antibiotikums durch Submers-Fermentation in halbtechnischem Maßstab zeigt das folgende Beispiel:

In einen 250-ml-Kolben, der 50 ml eines vegetativen Mediums aus 10 g/l Dextrose, 25 g/l Dextrin, 20 g/l Sojapepton, 5 g/l lösliche Anteile von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung und Leitungswasser mit einem pH-Wert von 6,6 enthält, wird ein lyophiles Kügelchen gegeben, das aus den in Beispiel 1 beschriebenen reifen Nähragarschrägkulturen hergestellt ist

Das inokulierte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 30⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem Bodendurchmesser von 5 cm (2") inkubiert die mit 250 UpM betrieben wird. Der End-pH-Wert des Mediums wird mit 7,0 bestimmt. Ein Anteil der so erhaltenen vegetativen Kultur von 20 ml wird zum Inokulieren eines 1-Liter-Kolbens verwendet der 100 ml des vegetativen Mediums enthält Das inokulierte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 30°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem Bogendurchmesser von 5 cm (2") inkubiert, die mit 250 UpM betrieben wird.

Der End-pH-Wert am Ende der zweiten Stufe beträgt 7,4. Ein Anteil der so erhaltenen vegetativen Kultur von 500 ml wird zum Inokulieren eines 40-Liter-Fermenters verwendet der 25 Liter sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium aus 0,2 g/l Entschäumer, 20 g/l Glycerin, 5 g/l Sojapeption, 2 g/l Calciumnitrat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 3 g/l lösliche Anteile von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung und Leitungswasser bis zu einem Volumen von 25 Liter enthält. Nach dem Inokulieren wird die Fermentation 42 Stunden bei einer Temperatur von 30° C durchgeführt. Während der

Fermentation wird mit einer Geschwindigkeit von 42C UpM gerührt. Die Belüftung während der Fermentation erfolgt mit 0,4 Kubikmeter Luft pro Kubikmetei Medium und pro Minute. Der End-pH-Wert beträgt 7,6.

Die Fermentationsmischung wird geerntet und die gesamte Brühe wird filtriert Zu 25 Liter filtrierter Brühe werden 10% (Gewicht/Volumen) 1,68 χ 0,42 mm Ak tiv-Kohle gegeben. Nach 30 Minuten langem Rührer wird die Mischung filtriert und mit Wasser gewaschen Die Aktivität wird aus der Kohle durch dre aufeinanderfolgende Behandlungen mit 9 Liter 1:1-Aceton-Wasser-Lösungsmittelmischung eluiert Die Aceton-Wasser-Eluate werden vereinigt und auf eir Volumen von etwa 500 ml eingeengt Dann wird da; Konzentrat durch eine Kolonne mit 250 ecm start saurem Ionenaustauscherharz (H +-Form) geleitet unc die Kolonne wird mit Wasser gewaschen. Die Aktivitäi wird an dem Harz nicht ausgetauscht und daher in deir abfließenden Volumen und in dem anschließender Waschwasser aufgefangen. Der Abfluß und das Waschwasser werden vereinigt, und der pH-Wert wire auf etwa 7,0 eingestellt. Dann wird die Lösung eingeengi und auf eine 5,0 χ 80-cm-Kolonne mit Dextrangel ir Wasser aufgegeben.

Die Kolonne wird mit Wasser eluiert Die aktiver Fraktionen (durch Prüfung gegen Neurospora spp X-846 nach dem Agar-Näpfchen-Diffusionsverfahrer ermittelt) werden vereinigt eingeengt und gefrierge trocknet Die Endreinigung erfolgt durch Säulenchro matographie an einer Cellulose-Kolonne, die mi 7O°/oigem Propanol equilibriert und eluiert wird. Da! gefriergetrocknete aktive Präparat aus der Dextrangel Kolonne wird in der Mindestmenge 70%igem Propano gelöst und auf eine 2,2 χ öO-cm-Cellulose-Kolonn« aufgegeben. Die aktiven Fraktionen werden vereinig und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt und kristall] sierengelassen, wodurch 850 mg erfindungsgemäßf Verbindung vom Schmelzpunkt 108 bis 113°C erhalt« werden, pK„' = 6,9 (Wasser).

Analyse für C₉H₁₃N₃O₆:

Ber.: C 41,70, H 5,00, N 16,20, 0 37,10%;
gef.: C 41,56, H 5,25, N 16,02, 0 36,25%.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1.4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid der Formel

HOCH_{2 o}

HO

N-NH

OH

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces candidus NRRL 3601 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37° C und während einer Dauer von etwa 24 bis etwa 72 Stunden züchtet und die gebildete Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kulturmedium isoliert

Die Erfindung betrifft die antibiotische Verbindung 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Das neue Antibiotikum hat die Formel

Il c

H₂N

HO

HOH₂C

HO

OH

und wird dadurch hergestellt, daß man Streptomyces candidus NRRL 3601 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37° C und während einer Dauer von etwa 24 bis etwa 72 Stunden züchtet und die gebildete Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kulturmedium isoliert.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine farblose kristalline Substanz vom Schmelzpunkt 108 bis 113⁰C, die in Wasser, Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol löslich, in Äthylacetat wenig löslich und in Kohlenwasserstofflösungsmitteln und Diäthyläther unlöslich ist. Sie besitzt einen optischen Drehwert [a] f von —45,5° [C = 0,78% (GewVVol.), Wasser], eine ungefähre Zusammensetzung von 41,56% Kohlenstoff, 5,25 % Wasserstoff, 16,0% Stickstoff und 36,25% Sauerstoff, eine litrierbare Gruppe von pK_a' = 6,9, ein massenspektroskopisch berechnetes Molekulargewicht von 259 und eine empirische Formel C₉H₁₃NsOe- Bei Messung als Kaliumbromidpreßling im Infrarotabsorptionsspektrum über den Bereich von 2,0 bis 15,0 Mikron weist die Verbindung folgende unterscheidbare Banden auf: 3,10; 3,40; 6,04; 6,21; 6,51; 6,80; 7,00; 8,50; 9,00; 930; 9,80; 11,2G; 11,70; 12,90; 13,60 und 14,00 Mikron.

Der spezifische optische Drehwert [«] I? der kristallinen erfindungsgemäßen Verbindung ist an einer Probe

ίο bestimmt, die vorher etwa 15 Stunden bei Raumtemperatur im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet wird. Die Gegenwart der einen titerbaren Gruppe vom pK_a'=6,9 ist durch elektrometrische Titration in wäßriger Lösung ermittelt Das Infrarotabis Sorptionsspektrum der Verbindung als Kaliumbromidpreßling ist in F i g. 1 dargestellt Das in saurem und neutralem Äthanol erhabene Ultraviolettspektrum der erfindungsgemäßen Verbindung zeigt folgende Maxima: 232 πιμ (ε = 7,4 - ΙΟ³) und 263 ΐημ (ε=6,2 · ΙΟ³). Bei 213 und 242 ηιμ sind Minima vorhanden. Bei Zusatz von Base verschiebt sich das Spektrum zu Maxima bei 235 πιμ (ε=5,1 · ΙΟ³) und 207 ΐημ (ε=5,1 · ΙΟ³) und einem Minimum bei 257 ΐημ. Ein Röntgenbeugungspulverdiagramm dieser Verbindung unter Verwendung von ungefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2^896 A zur Berechnung der Netzebenenabstände liefert die in der DE-OS 2019 838 auf Seite 4 angegebenen Werte.

Die erfindungsgemäße Verbindung weist antifungale Aktivität gegenüber Neurosporaarten auf und kann daher, wenn sie in Waschlösungen und dergleichen eingebracht wird, mit Vorteil dazu verwendet werden, Wände und andere Oberflächen in Krankenhäusern, Schwimmbädern und dergleichen frei von Befall durch solche Pilze zu halten.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist in vivo gegen Kuhpocken und Herpes simplex wirksam und zur Behandlung von Vireninfektionen, zum Beispiel Pocken und Gesichtsherpes, in Tagesdosen von 0,5 bis 250 mg/kg vorteilhaft. Sie kann an Warmblüter, zum Beispiel Mäuse, Ratten, Hunde und dergleichen, entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Die In-Vitro-Aktivität dieses Stoffs gegen Virenwachstum in Gewebekulturen wurde an einer Reihe von Viren, darunter Masernviren, Herpes-simplex-Viren, Kuhpokken-Viren und Coxsackie-Viren, nachgewiesen.

Die Fähigkeit der Bekämpfung des Viruswachstums in vitro läßt sich leicht mit Hilfe eines ähnlichen Fleckensuppressionstests nachweisen, wie er von S i m i η ο f f, Applied Microbiology, 9,66 - 72(1961) und von De Lo ng et al., »Biological Evaluation of A 10598«, Annual of N. Y. Academy of Science 130, 44-48 (1965) beschrieben worden ist. Bei der Prüfung auf antivirale Aktivität sind Flecken in den Gebieten der Platte zu sehen, in denen das Virus die Zellen infiziert und sich in den Zellen reproduziert hat. Toxizitätszonen, deren Durchmesser in mm gemessen wird, werden ebenfalls beobachtet, wenn die Testverbindung eine letale cytologische Wirkung auf Wirtzellen unterhalb und um die Filterpapierscheibe hat. Antivirale Aktivität der Testverbindung wird Fehlen von Flecken und eines stärkeren Wachstums von Zellen in einer Zone unter und um eine Filterpapierscheibe nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Zone wird in mm gemessen. Die

b5 Zellen in einer Aktivitätszone werden mit einem Mikroskop untersucht, um das Auftreten und das Ausmaß von Schäden durch Wirkstoff und/oder Virus zu ermitteln. Die Färbung wird nach einer abgestuften