DD247023A5

DD247023A5 - Verfahren zur herstellung des cyclopeptidantibiotikumkomplexes a-21978c oder von faktoren hiervon

Info

Publication number: DD247023A5
Application number: DD86288284A
Authority: DD
Inventors: Floyd M Huber; Richard L Pieper; Joseph A Tietz; Tom E Eaton; Lynda M Ford; Otis W Godfrey Jr; Huber Mary L Braun; Milton J Zmijewski Jr
Original assignee: ��@��@��@��k��
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1987-06-24
Also published as: DK457585A; CS276978B6; IE58655B1; HUT39782A; DK148791A; DD238068A5; GR852432B; JPH0787796B2; FI82075B; DK165416B; FI82075C; AU4837785A; ES8700862A1; HK24292A; EP0178152A2; ATE67788T1; DK165757B; IL76608A0; DK165416C; CS276983B6

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Cyclopeptidantibiotikumkomplexes A-21978C oder von Faktoren hiervon durch Zuechtung des neuen Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder einer Mutante, Variante oder Rekombinante hiervon in an sich bekannter Weise unter anschiessender Abtrennung des Komplexes oder Auftrennung in die gewuenschten Einzelfaktoren.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Cyclopeptidantibiotikumkomplexes A-21978C oder von Faktoren hiervon, insbesondere der Einzelfaktoren C₀, Ci, C₂, C₃, C₄ oder C₆.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung * _; ^

Die der Familie A-21978C angehörenden Cyclopeptidantibiotika sind ausgezeichnete antibakterielle Mittel. Eine besonders wichtige Gruppe von Derivaten von A-21978C sind die Verbindungen der Formel (I)

Hz ' . ~ Γ

_H ^COnHs

HOel/

worin R für eine Ca-Cu-Alkanoylgruppe steht (siehe auch Bernhard J. Abbott, DavisS.Fukuda und Manuel Debono, US-PS 4537717).

Der Cyclopeptidantibiotikumkomplex A-21978C und somit auch seine Einzelfaktoren können nach den bekannten Verfahren nur inunbefriedigenden Ausbeuten hergestellt werden, und gleiches gilt daher auch für die Aikanoyiderivate der oben angegebenen

Formel (I). .

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung dieses Cyclopeptidantibiotikumkomplexes und seiner Einzelfaktoren, gegebenenfalls auch unter Einschluß der Alkanoylderivate der Formel (I), das diese Antibiotika in stark verbesserter Ausbeute ergibt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß nun dadurch gelöst, daß man Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine A-21978C produzierende Mutante, Variante oder Rekombinante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff undanorganischeSalze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung der Antibiotika A-21978C züchtet und gewünschtenfalls den gebildeten Komplex A-21978 C abtrennt und gewünschtenfalls ferner die einzelnen Faktoren von A-21978 C, insbesondere die Einzelfaktoren C₀, C₁, C₂, C₃, C₄ oder C₅, aus dem Komplex auftrennt.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende neue Stamm NRRL 15998 (A-21978.65) ist eine Mutante des bekannten Stamms NRRL 11379 von Streptomyces roseosporus. Beide Stämmesind Teil der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, V. St. A., wovon sie unter den Bezugsnummern NRRL 11379 und NRRL 15998 frei erhältlich sind. Die Kulturen Streptomyces roseosporus NRRL 11379 und die Bedingungen ihrer Anwendung zur Herstellung der Antibiotika A-21978C werden von Robert L. Hamill und Marvin M. Hoehn in US-PS 4331 594 beschrieben, welche hiermit eingeführt wird.

Der beim vorliegenden Verfahren bevorzugte Mikroorganismenstamm ist zwar der Stamm mit der Bezeichnung A-21978.65 (NRRL 15998), doch läßt sich hierbei auch jede A-21978C produzierende Mutante, Variante oder Rekombinante hiervon verwenden, wie dies für den Fachmann ohne weiteres erkennbar ist. .

• Die in US-PS 4331594 beschriebenen und in der Natur vorkommenden Faktoren von A-21978 C sind die Faktoren C₀₁C₁₇Ca₁C₃₁C₄ oder C₅. Bei den Faktoren C₁," C₂, C₃, C₄ und Cj ist der Substituent R in der Formel (1) eine spezielle Cio-C^-Alkanoylgruppe. Der Faktor C₀ von A-21978 C, von dem früher angenommen wurde, daß er eine besondere verzweigte C-io-Alkanoylseitenkette hat, hat sich als ein Gemisch aus zwei Komponenten in einem Verhältnis von 2:1 erwiesen. Die vorherrschende Komponente hat eine verzweigte C₁₀-Seitenkette, während die untergeordnete Komponente die gerade C₁₀-Seitenkette aufweist. Zur Erfindung gehört auch ein Kulturmedium zur Durchführung des obigen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es den Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine Mutante, eine Variante oder eine Rekombinante hiervon und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Antibiotikumkomplex A-21978 C kann aus der Fermentationsbrühe und aus dem Mycel mit polaren organischen Lösungsmitteln extrahiert werden. Ferner kann man auch die Einzelfaktoren von A-21978C unter Anwendung bekannter Techniken, wie Säulenchromatographie, abtrennen und weiter reinigen. Die aus dem natürlichen Zustand (nämlich dem sogenannten wilden Typus) isolierte Kultur bildet das Antibiotikum gewöhnlich in niedriger Ausbeute. Die Bildung des Antibiotikums ist oft unberechenbar. Stämme mit verbesserter Stärke und Stämme, die das Antibiotkum gleichmäßig produzieren, sind daher von großem Wert. Das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung des neuen Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 15998 ergibt den Antibiotikumkomplex A-21978C nun in hoher Ausbeute und stellt daher einen bedeutenden technischen Fortschritt dar.

Der neue Mikroorganismus NRRL 15998 wird auch als A-21978.65 bezeichnet. Dieser Stamm ist durch Stammselektion und Stammutation aus einer Kultur entwickelt worden, die als A-21978.6 (NRRL 11379) bezeichnet wird. Der Stamm A-21978.6, der von Frederick P. Mertz und-Ralph E. Kastner der Lilly Research Laboratories untersucht und charakterisiert worden ist, ist wiederum aus einem Elternstamm entwickelt worden, welcher aus Erde vom Berg Ararat in der Türkei isoliert worden ist. Der Stamm A-21978.6 wird als neuer Stamm von Streptomyces roseosporus, Falcao de Moriasund Daliä Maia 1961, klassifiziert. Diese Klassifizierung erfolgte nach Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen (R.E.Buchanan und N.E.Gibbons, „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams and Wilkins Company, 8. Auflage, 1974; und E.B.Shirling und D. Gottlieb, „Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces", Intern. Journal of Systematic Bacteriol.,808 bis 809 [1972]). Die Klassifizierung beruhte auf Methoden, wie sie für das Internationale Streptomyces Projekt (E. B. Shirling und D. Gottlieb, „Methods of Characterization of Streptomyces Species", Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16,313 bis 340 [1966]) empfohlen werden, zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersuchungen. Die Kohlenstoffverwertung wurde auf Grundmedium ISP Nr. 9 bestimmt, welchem Kohlenstoffquellen bis zu'einer Endkonzentration von 1,0% zugesetzt wurden. Die Kohlenstoffquellen wurden durch Filtration sterilisiert. Das Grundmedium wurde durch Autoklavierung sterilisiert. Die Platten wurden nach 14tägiger Bebrütung bei 30°C abgelesen. Die Zellwandzucker wurden unter Anwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Lechevalier bestimmt (M. P. Lechevalier, „Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera", Seminar des Unterkomitees über Acetinomyceten der American Society of Microbiology unter Leitung von Dr.Thomas G.Pridham am Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971). Das Isomere der Diaminopimelinsäure wurde unter Anwendung der Methode von Becker et al. bestimmt (B. Becker, et al., „Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 11,421 bis 423 [1964]). Die Aminosäureanalyse wurde anhand gewaschener Zellwandfragmente durchgeführt. Die Melanoidpigmente wurden unter Anwendung der Medien ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), ISP Nr.7 (Tyrosin-Agar), modifiziertes ISP Nr.7 (ISP Nr.7 ohne Tyrosin) und eines Tyrosinversuchs bestimmt (Yuzuru Mikami, et al., „Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces", Intern.'Journal öf Systematic Bacteriol. 27 [3], 290 977]). Die Stärkehydrolyse wurde durch Testung bezüglich der Anwesenheit von Stärke mit Iod bestimmt. Der Temperaturbereich, der NaCI-Verträglichkeit, der pH-Bereich und die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurden unter Verwendung des Agar-Mediums ISP Nr. 2 ermittelt. Hierbei ergab sich folgender Temperaturbereich: 25°C, 28°C, 3OX, 34⁰C, 37⁰C, 40⁰C, 45°C, 5O⁰C und 55°C. Zur Messung der NaCI-Verträglichkeit wurde der Agar mit folgenden Mengen an NaCI versetzt: 0%, 1%, 2%,3%,4%;5%, 6%, 8%, 10% und 12%. Es erfolgte eine Bebrütung bei 30⁰C. Zur Messung des pH-Bereiches wurde der Agar unmittelbar vor dem Gießen in Anteilen von jeweils.1 ,OpH-Einheiten von pH 3,0 auf pH 11,0 eingestellt. Die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde unter Verwendung von Empfindlichkeitsscheiben bestimmt, die auf angeimpfte Agar-Platten geklotzt waren. .

Die Zuordnung der Farbnamen erfolgte nach der Methode ISCC-NBS (K. L Kelly und D. B. Judd, „The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D. C, 1955).

Die eingeschobenen Zahlen beziehen sich auf die Farbreihe von Tresner und Backus (H.D.Tresner und E. J. Backus, „System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol. 11, 335 bis 338 [1956]). Die Bezeichnungen der Farbtafeln sind unterstrichen. Die Farbblöcke von Maerz und Paul sind in Klammern angegeben (A. Maerz und M. R. Paul, „Dictionary of Color", McGraw-Hill BookCompany, Inc., New York, N. Y., 1950).

Morphologie

Die Morphologie der Kultur A-21978.6 besteht aus Sporophoren, die der Klassifikation Rectus-Flexibilis(RF) angehören. Die Sporenketten haben mehr als 10 Sporen pro Kette. Die Sporenoberfläche ist glatt.

Die Kultur A-21978.6 ist gekennzeichnet durch die Produktion einer vorwiegend rot gefärbten Luftsporenmasse mit einer rötlichbraun gefärbten Unterseite, Ferner ist auch ein hellbraunes wasserlösliches Pigment vorhanden. Diese Eigenschaften zeigen sich auf drei der vierzehn Agar-Beschichtungsmedien (nämlich auf ISP Nr. 2, ISP Nr.7 und TPO). Diese drei sind die einzigen Medien, die ein reichliches aeriales und vegetatives Wachstum unterstützen.

Zwei Agar-Beschichtungsmedien, nämlich ISP Nr.4 und Glucose-Asparagin-Agar, bilden eine weiß bis grau gefärbte Luftsporenmasse mit einer gelb gefärbten Unterseite. Es läßt sich kein wasserlösliches Pigment beobachten. Diese beiden Medien unterstützen ein gutes, jedoch nicht übermäßiges, aeriales und vegetatives Wachstum.

Es werden auch neun andere Agar-Beschichtungsmedien verwendet, wobei hierWachstum und Sporulation jedoch nurschwach oder überhaupt nicht gegeben sind. Falls überhaupt eine Luftsporenmasse vorhanden ist, dann ist diese nur spärlich zugegen und weiß bis grau gefärbt.

Melanoidpigmente fehlen. Die vorwiegenden Bestandteile der Zellwand sind LL-DAP, Glycin, Glucose und Ribose. Dies bedeutet eine Zellwand vom Typ I und ein Zuckermuster vom Typ C (Herausgeber R. E. Buchanan und N. E. Gibbons, „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams & Wilkins Company, 8. Auflage, 1974, Seite 658).

Die folgenden fünf Kulturen werden in Laborversuchen mit A-21978.6verglichen:

Streptomyces albovinaceous ISP 5136;· ATCC 15833

Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC19891 ' .

Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443 — /

Streptomyces roseosporus ISP 5'122; ATCC 23958

Streptomyces setonii IP 5395; ATCC 25497 .

Diese Kulturen gehören den Farbreihen weiß und rot an, haben eine Sporophorenmorphologie vom Typ RF, weisen eine glatte Sporenoberflächenornamentation auf und sind nach ISP-Beschreibungen melanin-negativ und haben keine unterscheidungsfähige Unterseitenfarbe oder wasserlösliche Pigmente. Diese Eigenschaften passen, zusammen mit dem Kohlenstoffverwertungsmuster und anderen Sekundärmerkmalen, zu denen der Kultur A-21978.6. Vergleicht man diese Kulturen unter Laborbedingungen mit A-219.78.6, dann scheiden hierbei vier Kulturen aus. Streptomyces candidus und Streptomyces setonii weisen auf vielen Medien eine gelbe Luftsporenmasse auf, wodurch sie sich von der Kultur A-21978.6 unterscheiden. Streptomyces albovinaceous und Streptomyces moderatus sind an ihrer Unterseite unterscheidungskräftig dunkel gefärbt, ergeben wasserlösliche Pigmente und bilden Melanoidpigmente, wodurch sie sich insgesamt von der Kultur A-21978.6 unterscheiden. Streptomyces moderatus ergibt nach der Beschreibung ISP eine rötlichbraun oder stark braun gefärbte Unterseite, während Streptomyces albovinaceous dieses Merkmal nicht aufweist. Keine dieser Kulturen ist melanin-positiv. Die Kultur A-21978.6 wird klassifiziert als ein Stamm von Streptomyces roseosporus, Falcao de Moriasund Daliä Maia 1961. Diese Klassifizierung beruhtauf einem Vergleich mit veröffentlichten Beschreibungen und direkten Laborvergleichen. Die folgenden Kulturcharakteristiken stellen eine Zusammenfassung der direkten Vergleichsstudien dar.

Kulturcharakteristiken

Morphologie

A-21978.6 Streptomyces roseosporus

Die Sporophoren sind gerade bis gewunden (RF), wobei sich weder Haken, noch Schlaufen, noch Spiralen beobachten lassen. Die Sporenketten haben mehr als 10 Sporen. Durch Abtastelektronenmikroskopie ergibt sich, daß die Sporenoberfläche glatt ist. ' '

Sporen: Länglich bis oval Länglich bis zylindrisch ·

Mittlere Größe: 0,85x1,78/xm 1,01 x 2,47 μσι

Größenbereich: 0,65-0,97 x 0,97-2,6μιτι 0,97-1,3 x 1,63-3,25 μιη

Aerial: Vegetativ:

Aerial Vegetativ:

Aerial:

Aerial: Vegetativ:

Kulturcharakteristiken (Fortsetzung)

A-21978.6 . . Streptomyces roseosporus Wachstum Farbe Wachstum Farbe Karottenstöpsel

gut grau c pink keines . keine

reichlich braun gut gelbbraun

kein lösliches Pigment kein lösliches Pigment

Kartoffelstöpsei

gut grau c pink

reichlich braun

dunkelbraunes lösliches Pigment

Medium ISP Nr.

. (Trypton-Hefeextrakt-Agar)

ausreichend (W)aweiß

gut [10-A1] schwach

gelbgrün kein lösliches Pigment

Medium ISP Nr.2 (H ef e-M a Izextra kt-Ag a r) reichlich (R)5cbgrau gelb

keines keine

ausreichend orangebraun

kein lösliches Pigment

reichlich

[5D10]he11 rotbraun

hellbraunes lösliches Pigment

Medium ISP Nr.3 ¹. ' · (Hafermehl-Agar) ausreichend (W)aweiß

ausreichend [10 A2] schwach gelbpink

hellbraunes lösliches Pigment

Medium ISP Nr.4 • (Anorganische Salze-Stärke-Agar)

schwach	(W)aweiß	reichlich	(R) 3 ca schwach
schwach	[10 B 2] schwach		orangegelb
	gelbgrün	reichlich	[12L7]hell olive
kein lösliches Pigment		braun
hellbraunes lösliches Pigment

schwach (W)aweiß

ausreichend schwach.grüngrau

kein lösliches Pigment

gut

(W)bweiß

hellbraunes lösliches Pigment

Medium ISP Nr. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar) ausreichend (W) 13 ba purpurweiß

gut [3B7]graugelbpink

g ra upi nkes lösl iches Pigment

Medium ISP Nr.7

(Tyrosin-Agar)

reichlich (R)5cbgraugelbpink

reichlich · [7 L12] mittelrotbraun

dunkelbraunes lösliches Pigment

Modifizierter Bennet-Agar

keines

schwach - fahlgelbbraun

kein lösliches Pigment

Calcium-Malat-Agar

keines

ausreichend [7 L12] mittelrotbraun

hellbraunes lösliches Pigment

Czapek-Lösung-Agar schwach (W)aweiß

schwach weißlich

kein lösliches Pigment ^!

Emerson-Agar

gut · (R) 3 c2 schwach-

orangegelb kein lösliches Pigment

ausreichend (W) b weiß

gut [10C2] gräulichgelb

hellbraunes lösliches Pigment

reichlich (R)5cbgraugelbpink

reichlich [11 E 5] gelbbraun

hellbraunes lösliches Pigment

reichlich (R)5cbgraugelbpink

reichlich [11 D4] gräulichgelb

hellbraunes lösliches Pigment

schwach (W)aweiß

schwach schwach gelbgrün

schwach gelbgrünes lösliches Pigment

keines keines

schwach reichlich

gut gut

schwach reichlich

[13L6] kein lösliches Pigment

Glucose-Asparagin-Agar

(W) b weiß [12B2]graugelb

kein lösliches Pigment

Glycerin-Glycin-Agar

reichlich (R)5cbgraugel bpi nk

reichlich [1115] g rau gelb,

hellbraunes lösliches Pigment

ausreichend gut

(W)bweiß [12 B 2] schwach gelbgrün kein lösliches Pigment

[8L12]d-unkelgraubraun braunes lösliches Pigment

reichlich (W)bweiß

reichlich [10 G 3] hellgelb

hellbraunes lösliches Pigment

Kulturcharakteristiken (Fortsetzung)

A-21978.6 Streptomyces roseospurus Wachstum Farbe Wachstum Farbe

Nähr-Agar

Aerial: . keines ausreichend (W)bweiß

Vegetativ: schwach heligelbgrau gurt hellgelbgrau

kein lösliches Pigment kein lösliches Pigment

Tomatenpaste-Hafermehi-Agar Aerial: reichlich (R)5cbg rau ge Ib- reichlich (R)5cbg rau gel b-

° pink · ' pink

Vegetativ: reichlich [8L12]dunkelgraubrau η reichlich [12'L7}gelbbraun

braunes lösliches Pigment braunes lösliches Pigment

Kohlenstoffverwertung Substrat · A-21978.6 . Streptomyces roseosporus

L-Arabinose + + · "'

D-Fructose + —

D-Galactose + +

D-Glucose + . ' +

Isoinosit — —

D-Mannit . + —

D-Raffinose - - , - ' . -

L-Rhamnose + +

Salicin ' + - +

Saccharose — —

D-Xylose + + . . · Schlüssel: + = Positive Verwertung . — = Negative Verwertung

Charakteristik ' . A-21978.6 Streptomyces roseosporus

Melanoid Pigmente

ISPNr. 1 (Trypton-Hefeextrakt) - -

ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen)

ISPNr. 7(Tyrosin-Agar) - -

ISP Nr. 7 modifiziert (ISP Nr. 7 minus Pyrosin) - -

Tyrosin-Versuch — —

Gelatineverflüssigung ' + · +

Magermilch-Einwirkung schwache Hydrolyse schwache Hydrolyse Stärke-Hydrolyse + +

pH-Bereich 5-11 5-11

Temperatur-Bereich 25-4O⁰C 25-45 °C Nitrat-Reduktion — . +

NaCl-Verträglichkeit; Wachstum bis zu 10% 6%

Antibiotische Empfindlichkeit Streptomyces roseosporus

Antibiotikum	Konzentration/Scheibe	Klasse	A-21978.6
Erythromycin	15^g	Makrolid	+
Cephalotin	30 ,ng	/3-Lactam	+
Lincomycin	1 p.g	Glycosid	-
Nystatin	100 Einheiten	Polyen	-
Polymyxin B	300 Einheiten	Peptid	+
Streptomycin	10Mg	Aminoglycosid	+
Tetracyclin	30/xg	Tetracyclin	+
Vancomycin	30/xg	Glycopeptid	+
+ = Empfindlich	(Hemmzonen)
- = Resistent (Keine Hemmzonen)

Bestimmte Charakteristiken des Stammes A-21978.6 unterscheiden sich von den für Streptomyces roseosporus veröffentlichten Charakteristiken. Die Kultur A-21978.6 unterscheidet sich vom veröffentlichen Stamm in der Sporengröße, dem Wachstum auf Karotten- und Kartoffelstöpseln, der NaCl-Verträglichkeit und der Nitrat-Reduktion.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende neue Stamm A-21978.65 (NRRL 15998) hat die identifizierenden Eigenschaften des bekannten Stammes A-21978.6 (NRRL 11379), unterscheidet sich davon jedoch in der Menge an gebildeten AntibiotikaA-21978C. Der frühere Stamm produzierte im besten Fall nicht mehr als 100 μ-g der Antibiotika A-21978C pro ml Fermentationsmedium. Der verbesserte erfindungsgemäße Stamm A-21978.65 produziert wenigstens das 2,5fache dieser Menge bei Tankfermentationen und bei einer Schüttelkolbenfermentation bereits bis zum 18fachen dieser Menge. Durch dieses verbesserte Produktionsverhalten von A-21978 C ermöglicht dieser neue Stamm ein stark verbessertes Verfahren zur Herstellu ng dieser Antibiotika.

Wie andere Organismen, so sind auch die Eigenschaften der neuen A-21978C produzierenden erfindungsgemäßen Kultur, nämlich von Streptomyces roseosporus NRRL 15998, einer Variation zugänglich. Rekombinanten, Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 15998 lassen sich durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen erhalten, wie durch Einwirkung von Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien. Natürliche und induzierte Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces roseosporus NRRL 15998, welche die Eigenschaft der Bildung der Antibiotika A-21978C in hoher Ausbeute beibehalten, können erfindungsgemäß ebenfalls angewandt werden. Das zum Wachsenlassen der Kultur Streptomyces roseosporus NRRL 15998 angewandte Kulturmedium kann irgendeines aus einer Reihe von Medien sein. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Eine'für eine großtechnische Fermentation bevorzugte Kohlenstoffquelle ist. beispielsweise Tapioca-Dextrin, obwohl sich stattdessen auch Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Mannose, Baumwollsaatöl, Methyloleat, Glycerin, gereinigtes Sojabohnenöl und dergleichen verwenden lassen. Eine bevorzugte Stickstoffquelle istenzymhydrolysiertes Casein, obwohl sich stattdessen auch lösliches Fleischpepton, Sojabohnenmehl, Sdjabohnenhydrolysat, Sojabohnenschrot, Hefe, Aminosäuren wie L-Asparagin und DL-Leucin, und dergleichen eignen. Anorganische Nährsalze, die dem Kulturmedium beigegeben werden können, sind die löslichen Salze, welche Kalium-, Ammonium-, Chlorid-, Sulfat-, Nitrat- und ähnliche Ionen ergeben. Von diesen Salzen ist ^SO₄ZUr Bildung des Antibiotikums besonders brauchbar. Ferner eignen sich auch Melasseasche, Aschedialysat und Synthesemineralmischungen. Zur Produktion der Antibiotika A-21978C wird im Fermentationsmedium vorzugsweise destilliertes oder deionisiertes Wasser verwendet. Einige im Leitungswasser vorhandene Mineralien, wie beispielsweise Calcium und Carbonat, scheinen die Bildung des Antibiotikums zu stören.

Im Kulturmedium sollen auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für das Wachstum, und die Entwicklung des Organismus ebenfalls notwendig sind. Solche Spurenelemente kommen in anderen Bestandteilen des Mediums gewöhnlich als Verunreinigungen in Mengen vor, die den Wachstumserfordernissen des Organismus genügen.

Wird die Schaumbildung zu einem Problem, dann kann der Zusatz geringer Mengen (beispielsweise Mengen von 0,2 ml/l) eines Antischaummittel, wie Polypropylenglycol, zu großtechnischen Fermentationsmedien notwendig sein. Zur Bildung wesentlicher Mengen der Antibiotika A-21978C ist eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen der Antibiotika A-21978 C lassen sich jedoch auch durch Schüttelkolbenkultur erhalten. Infolge der zeitlich verzögerten Bildung des Antibiotikums, zu der es gewöhnlich bei einer Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus kommt, wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Das vegetative Impfgut wird hergestellt, indem man ein kleines'Volumen an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus beimpft und so zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das vegetative Impfgut wird dann in einen größeren Tank übertragen. Man kann den neuen A-21978C produzierenden Organismus bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 40°C wachsen lassen. Zu einer optimalen Produktion an A-21978C scheint es bei Temperaturen von etwa 30 bis 32°C zu kommen. Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch beim vorliegenden Verfahren sterile Luft in das Kulturmedium eingeblasen. Für eine wirksame Produktion der Antibiotika A-21978C soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion oberhalb 20%, und vorzugsweise oberhalb 30% (bei 30⁰C und einer Atmosphäre Druck) liegen. Bei einer Tankproduktion hält man den pH-Wert des Fermentationsmediums vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 7,0. Dies läßt sich erreichen, indem man geeignete Mengen an beispielsweise Natriumhydroxid (in den frühen Stufen) und Chlorwasserstoffsäure (in den späteren Stufen) zugibt.

Die Produktion der Antibiotika A-21978 C läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Kulturbrühe oder von Extrakten der Mycelfeststoffe bezüglich ihrer antibiotischen Wirksamkeit gegenüber Organismen prüft, von denen man weiß, daß sie antibiotikaempfindlich sind. Ein zur Prüfung dieser Antibiotika geeigneter Versuchsorganismus ist Micrococcus luteus. Der Bioversuch wird vorzugsweise als Papierscheibenversuch auf Agarplatten durchgeführt.

Wahlweise kann man die Kulturfeststoffe unter Einschluß der Bestandteile des Mediums und des Mycels auch ohne Extraktion oder Abtrennung, jedoch vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Quelle für die Antibiotika A-21978C verwenden. Nach Produktion der antibiotischen Aktivität an A-21978C läßt sich das Kulturmedium beispielsweise durch Lyophilisierung trocknen und direkt in ein Futtervorgemisch einmischen

Die Verbindungen der Formel (I) sind ausgezeichnete antibakterielle Mittel.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen weiter erläutert, die nicht als beschränkt anzusehen sind.

Beispiel 1 Produktion des Komplexes A-21978C

In der Gasphase von flüssigem Stickstoff wird eine Stammkultur hergestellt und gehalten. Mit der ursprünglich in der Gasphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrten Kultur Streptomyces roseosporus NRRL 15998 beimpft man 50 ml vegetatives Medium, das folgende Zusammensetzung hat:

Bestandteile Menge (%)

Trypticase Sojabrühe* 3,0

Dextrin 2,5

Wasser (deionisiert) 94,5

* Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD, V. St. A.

Das beimpfte Medium bebrütet man in einem 200 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 48 Stunden bei 3O⁰C auf einem Schüttler, der unter einem Bogen von etwa 5cm bei 250 UPm rotiert. Die reife vegetative Kultur wird in eine Reihe von Behältnissen (0,5 ml pro Behältnis) gegeben und in der Gasphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Zur Bildung eines größeren gleichförmigen Vorrats an aufbewahrtem Material beimpft man 80 ml des oben beschriebenen vegetativen Mediums mit 1 ml der in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Kultur. Das beimpfte vegetative Medium bebrütet man in einem 250ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 48 Stunden bei 30⁰C auf einem Schüttler, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von etwa 5cm bei 250 Upm rotiert.

Unter Verwendung von 10 ml einer solchen Kultur beimpft man dann 450 ml eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben beschriebene primäre vegetative Medium hat. Das Medium der zweiten Stufe bebrütet man in einem 21 fassenden Erlenmeyer-Kolben 24'Stunden bei 30°C auf einem Schüttler, der unter einem Bogen von etwa 5cm bei 250Upm rotiert.

Mit 1 Liter der vegetative« Kultur der zweiten Stufe beimpft man hieraus 39 Liter eines sterilen Entwicklungsmediums für das dritte Impfgut, das folgende Zusammensetzung hat:

Bestandteile Menge (%)

Sojabohnenmehl 0,5

Hefeextrakt³ 0,5

Calciumgluconat 1,0

KCI^b 0,02

MgSO₄- 7 H₂O" 0,02

FeSO₄-ZH₂O" . · 0,0004

Sag 471 (Antischaummittel)⁰ 0,03

Wasser 97,9296

a) Difco Laboratories, Detroit Ml, V.St.A.

b) DieSpurenmineralien werden wie folgt hergestellt: ""

Man löst FeSO₄ -7 H₂O (7,6 g) in konzentrierter HCl (76 ml). Hierauf gibt man MgSO₄ · 7H₂O (380 g), KCI (380 g) und deionisiertes Wasser in einer Menge zu, daß sich ein Gesamtvolumen von 3800ml ergibt. Durch Anwendung von 80ml dieser Lösung auf 39 Liter Entwicklungsmedium für ' das Inokulum der dritten Stufe ergeben sich die angeführten Mengen an Mineralien.

c) Union Carbide, Danbury CT, V.St.A.

Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei 30°C in einem Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl bebrütet. Das Reaktionsgefäß wird mit steriler Luft in einer Menge von 0,85Volumina pro Volumen Medium und pro Minute belüftet und mit herkömmlichen Rührern unter einer Geschwindigkeit von 350 bis 450 Upm gerührt. Der Druck im Reaktionsgefäß wird auf 0,35 bar über dem Atmosphärendruck gehalten.

Mit 1 Liter des bebrüteten Impfguts der dritten Stufe beimpft man dann 119 Liter eines sterilen Proäuktionsmediums, das folgende Zusammensetzung aufweist:

Bestandteile Menge{%)

Sojabohnenmehl 2,2

Fe(NH₄I₂SO₄-OH₂O 0,066

Dextrose 0,825

Sag 471 . 0,022

Kartoffelstärke '3,3 .

Melasse (Portwein) 0,275

Leitungswasser 93,312

Der pH-Wert wird nach Zugabe der ersten beiden Bestandteile und dann wieder nach Zusatz aller restlichen Bestandteile unmittelbar vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt.

Das beimpfte Produktionsmedium bebrütet man 6 Tage in einem Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl bei 30⁰C unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 0,5 Volumina pro Volumen Medium und pro Minute. Das Medium wird mit herkömmlichen Rührern zuerst 0 bis 15 Stunden bei 250 Upm und nach 15 Stunden bei 350 Upm gerührt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von Ammoniumhydroxidlösung auf oder über 6,5 gehalten. Die Ausbeute an Komplex A-21978 C beträgt am Ende der Fermentation 0,282 g pro Liter Brühe. Die Verteilung der einzelnen Faktoren ist wie folgt:

Komponenten von A-21978C (/ig/ml)^ab

Ct C₂ C3 C5 Cs Cg C10 Cn

77 113 72 7 — — 12 —

a) Die Konzentration der a'ntibiotischen Komponenten in der filtrierten Brühe wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatogräphie ermittelt. Die verschiedenen Komponenten werden durch Absorption von Ultraviolettlicht detektiert.

b) C₀, C₁₁C₂, C₃ und C₅ = in der Natur vorkommende Faktoren von A-21978C.

c) In der Natur vorkommender Faktor C₀. ' ' .

-a-

Beispiel 2 ^ . ·

Schütteikoibenproduktson des Komplexes A-21978C

Das im Beispiel 1 beschriebene allgemeineVerfahren wird unter Schüttelkolbenbedingungen und Verwendung des folgenden Fermentationsmediums wiederholt:

Bestandteile Menge (g/l)

Glucose 7,5

.Dextrin³ 30. .

EnzymhydrolysiertesCasein^b 5

Pepton⁰ 5 · '

Melasse 2,5

Deionisiertes Wasser' q.s. auf 1 Liter

a) Stadex11,A.E.StaleyCo., Decatur IL, V.St.A. .

b) NZ Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst NJ, V. St.A.

c) Biosate, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysviile MD, V.St.A. Die Ausbeute an Komplex A-21978C bei dieser Fermentation beträgt 1 800/^g pro ml Brühe.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes A-21978C oder von Faktoren hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine A-21978 C produzierende Mutante, Variante oder Rekombinante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung der Antibiotika A-21978 C züchtet und gewünschtenfalIs den

. gebildeten Komplex A-21978 C abtrennt und gewünschtenfalls ferner die einzelnen Faktoren von A-21978 C, insbesondere die Einzelfaktoren C₀, C₁, C₂, C₃, C₄ oder C₅, aus dem Komplex auftrennt.
2. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den Mikroorganismus Streptomyces roseosporus NRRL 15998 oder eine Mutante, eine, Variante oder eine Rekombinante hiervon und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält. .·, =