HU196845B - Process for producing a-21978 c derivatives - Google Patents

Process for producing a-21978 c derivatives Download PDF

Info

Publication number
HU196845B
HU196845B HU853912A HU391285A HU196845B HU 196845 B HU196845 B HU 196845B HU 853912 A HU853912 A HU 853912A HU 391285 A HU391285 A HU 391285A HU 196845 B HU196845 B HU 196845B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
fermentation
complex
acid
priority
factors
Prior art date
Application number
HU853912A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT39782A (en
Inventor
Floyd M Huber
Richard L Pieper
Antony J Tietz
Tom E Eaton
Lynda M Ford
Jun Otis W Godfrey
Mary L Huber
Jun Milton J Zmijewski
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT39782A publication Critical patent/HUT39782A/hu
Publication of HU196845B publication Critical patent/HU196845B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya javított eljárás az A-21978C (I) általános képletű' ciklusos pepiid antibiotikumok származékainak előállítására, ahol az általános képletben R jelentése 5-14 szénatomszámú alkanoil-csoport. Részletesebben a találmány tárgya eljárás, mely szerint
a) Streptomyccs reseosporus NRRL 15998 vagy NRRL 11379 törzset, vagy azok valamely mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat — valamint egy vagy több 5 14 szénalomos alkánkarbonsavat, ezek valamely észteréi vagy sóját — tartalmazó tápközegben süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük, vagy
b) a Cg-Cr faktorok és ezek komplexének előállítására a Streptomyces reseosporus NRRL 15598 törzset vagy annak valamely mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó tápközegben, süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük, a kapott antibiotikumot és/vagy komplexet izoláljuk, és kívánt esetben az egyes faktorokat kinyerjük a komplexből.
A találmány szerinti eljárás előnyei:
1. Az NRRL 15998 törzs esetén a komplexet és faktorokat magas hozammal nyerjük,
2. a korábbi eljáráshoz képest kevesebb lépést tartalmaz, és
3. kevesebb időt igényel.
Az A-21978C antibiotikum család kiváló baktériumellenes hatással rendelkezik. Különösen fontos csoportjuk az olyan A-21978C származékok, amelyek az (I) általános képlettel írhatók le (lásd még Bemard J, Abbot, Davis S. Fukuda és Manuel Debono, 4 537 717 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Korábban ezeknek a származékoknak az előállítása soklépéses folyamatot igényel, amely időigényes, nem jó termelésű és drága volt. A találmány tárgya javított eljárás az A-2I978C származékok közvetlen előállítására. A korábbi eljárás az (I) általános képletű származékok, mint például az A-21978C dekán oil-származéka előállítására, az alábbi:
1. Az A-21978C termelő kultúra fermentációja.
a, Folyékony nitrogénben tárolt törzzsel történő iniciálás.
b, Első inokulum stádium (48 óra) c, Második inokulum stádium (24 óra) d, Harmadik inokulum stádium (24 óra) e, Fermentálás (140 óra).
2. Szűrés, ioncserélő gyantán való adszorpció és eluálás, majd betöményítés.
3. t-Butoxi-karbonil-védőcsoporttal ellátott komplex előállítása,
4. A védett komplex betöményítése.
5. A dezacílczó, például Actinoplanes utahensist alkalmazó kultúra tenyésztése.
a, Folyékony nitrogénben tárolt törzzsel való iniciálás, b, Első inokulum stádium (72 óra) c, Második inokulum stádium (48 óra) d, Fermentáció (67 óra),
6. A komplex dezacilezése a dezacilező tenyészettel.
7. Szűrés, adszorbeió ioncserélő gyantán és eluálás, majd betöményítés.
8. Reacilezés.
9. A védöcsoport hidrolízise.
10. Végső tisztítás.
A találmány szerinti új eljárás során célszerűen egy 5 -14 szénatomszámú alkán-karbonsavat (R-OH) vegyületet, amelyben R a fenti) vagy ennek észterét vagy sóját, adagoljuk az A-911278C termelő tenyészethez a fermentáció termelési állapotában (1. e lépés) és így a megfelelő (I) általános képletű vegyületet kapjuk termékként. Ebben az eljárásban a 3., 4., 5., 6., 7., 8. és 9. lépés elhagyható. Ezen túlmenően az új eljárás jelentősen megnöveli a kívánt termék termelését.
A Streptomyces roseosporus NRRL 11379 (A-21978.6) és NRRL 15988 (A-21978.65) törzs, amely az NRRL 11379 egy mutáns törzse A-219-78C termelő kultúrák. Ezek a kultúrák a Northern Régiónál Research Center, US. Departement of Agriculture, Agricultural Service, Peoria, Illinois 61604, kultúra gyűjteményében megtalálhatók és a NRRL 11379 és NRRL 15998 számok alatt állnak az érdeklődök rendelkezésére. A S. roseosporus NRRL 11379 kultúrát és A-21978C antibiotikumok termelésére való felhasználásának körülményeit Róbert L. Hamill és Marvin M. Hoehn leírták az 4,331, 594 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyet itt mint szakirodalmi utalást idézünk.
A természetes A-21978C faktorokat a 4,331,594 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírták, és ezek:
CQ, Cj, C3> C, és Cj . A Cp Cj, Cy C4 és C$ faktorokban az (1) általános képletben R jelentése speciális 10-12 szénatomszámú alkanoil-csoport. A Co faktort korábban egy adott elágazó 10 szénatomszánrú alkanoil-oldalláncot tartalmazó komponensnek tulajdonították, később kimutatták, hogy két komponens 2 : 1 arányú keverékéből adódik.
A nagyobb komponens egy 10 szénatomszámú elágazó oldalláncot tartalmaz, a kisebb komponens egy 10 szénatomszámú egyenes oldalláncot tartalmaz.
A találmány szerinti eljárás leírásában az egyszerűség kedvéért a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet A-21978C faktornak is nevezzük. A természetes faktorok kivételével a faktor „megnevezésére az oldallánc hosszát alkalmazzuk. így például egy olyan (I) általános képletű vegyületet, amelyben R jelentése oktanoil-csoport, amennyiben a találmány szerinti eljárással állítottuk elő, A-21978Cg faktornak nevezzük.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott 5—14 szénatomszámú alkán-karbonsav, észtere vagy sója (a szubsztrát, egyenes vagy elágazó szénláncú lehet. A Cp C~ vagy C3 természetes faktorok előállítására egy s-metil-dekánsavat, 10-metil-dodekánsavat vagy 10-metil-undekánsavat illetve ezek észterét vagy sóját kellene alkalmazni. A találmány szerinti eljárásban az egyenes szénláncú 5-14 szénatomszámú savak, észterek vagy- sók alkalmazását javasoljuk, mert ezek könnyebben és olcsóbban rendelkezésre állnak. Különösen előnyös a találmány szerinti eljárásban alkalmazható szubsztrát a dodekánsav, ennek észterei vagy sói.
Amennyiben a találmány szerinti eljárásban 5-14 szénatomszámú alkán-karbonsav-észtert alkalmazunk, az 1-4 szénatomszámú alkil-alkán-karbonsav-észterek alkalmazása előnyös. Az ilyen észterekben az 14
-21.
szénatomszámú alkilcsoport lehet egyenes vagy elágazó szénláncú.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható 5-14 szénatomszámú alkán-karbonsav-sók lehetnek alkálifém-sók, és alkáli-földfém-sók, mint például nátrium-, kálium-, lítium-, cézium-, rubidium-, bárium-, kalcium- vagy magnéziumsók. Alkalmas aminnal képzett sók lehetnek elsőrendű-aminnal, másodrendű aminnal képzett sók és tercier-1-4 szénatomszámú alkil-aminónium-sók valamint hídroxi-14-szénatomszámú-alkil-ammónium-sók.
A szubsztrátot előnyösen a fermentáció során steril oldatként adagoljuk. Erre a célra különösen alkalmas oldószer a metil-oleát, de más oldószerek, például etanol, etilacetát és telítetlen zsírsavak 1-4-szénatornszámú észterei is alkalmazhatók. Amennyiben a szubsztrát alkalmas folyadék a fermentáció hőmérsékletén, közvetlenül is adagolható
A szubsztrát adagolásának sebessége olyan legyen, hogy elkerüljük a toxikus hatást a fermentációra, de elég nagy legyen ahhoz, hogy a kívánt (I) általános képletű vegyület termelését megnövelje. Általában körülbelül 0,05 0,5 ml (1 fermentlé) óra adagolási sebesség ajánlott. A körülbelül 0,1-0,2 ml (1 fermentlé) óra adagolási sebesség előnyös.
A szubsztrátot az A-21978C tenyészethez a termelési stádiumban a fermentáció során adagoljuk. Az adagolást körülbelül a 15-32 órában kezdjük és a fermentáció befejeződéséig folytatjuk. A szubsztrát különböző módszerekkel adagolható. Előnyösen olyan módszerrel adagoljuk, amely az állandó áramot a leginkább biztosítja.
A fermentációt követően, kívánt esetben, az (I) általános képletű vegyületet a szakirodalomban ismert eljárásokkal izolálhatjuk (lásd a 4 331 594 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
. A találmányhoz tartozik a korábban említett új mikroorganizmus, a Streptomyces rosesporus NRRL 15998 kitenyésztési eljárása. A mikroorganizmus A-21978C antibiotikumokat termel. A találmány tárgya részletesebben javított eljárás A-219-78C antibiotikumokat termel. A találmány tárgya részletesebben javított eljárás A-21978C antibiotikumok előállítására, melyre az jellemző, hogy új Streptomyces roseosporus NRRL 15998 törzset tenyésztünk szubmerz aerob fermentáció körülményei között, amíg jelentős mennyiségű A-21978C antibiotikum nem keletkezik. Az A-21978C antibiotikum komplex a fermentléből és a micéliumból poláros szerves oldószerekkel extrahálható. Az egyes A-21978C faktorok ismert eljárásokkal, mint például oszlopkromatográfiával elválaszthatók és tovább tisztíthatok.
Általában a természetes állapotban („vadon”) izolált tenyészet az antibiotikumot alacsony termeléssel állítja elő. Az antibiotikum termelése gyakran változott. A megnövelt potenciállal rendelkező törzsek és azok a törzsek, amelyek nagy mennyiségben termelik az antibiotikumot, nagy értékűek.
A találmány tárgya javított eljárás A-21978C antibiotikum előállítására, amelyre jellemző, hogy a Streptomyces roseosporus NRRL 15998 törzset vay A-21978C termelő mutánsát vagy variánsát tenyésztjük olyan közegben, amely asszimilálható szén-, nitrogén- és szervetlen só forrást tartalmaz, szubmerz aerob fermentációs körülmények között, amíg A-21978C antibiotikum termelés történik. Az A-2I978C antibiotikum komplex vagy ennek egyes faktorai különféle izolálási és tisztítási eljárásokkal különíthetők el, amely eljárások a szakirodalomban ismertek: lásd a 180746 sz. magyar szabadalmi leírást.
A találmány szerinti eljárás előző részében leírt mikroorganizmust Λ21978 .65. sz. törzsként írtuk le. Ezt a törzset törzskiválasztással és mutációval fejlesztettük ki az A21978.6 (NRRL 11379) törzsből. Az A21978.6 törzset Frederick P. Mertz és Ralph E. Kastner vizsgálta és jellemezte a Lilly Research Laboratories-ben, és ezt a Törökországban az Ararát begy talajából izolált törzsből fejlesztették ki. Az A21978.6 törzset mint új Streptomyces roseosporus törzset sorolta osztályba Falco de Morias és Dalia Maia 1961-ben. Az os/lályba sorolást közzétett leírásokkal való összehasonlítás alapján végezték. Ezek a leírások: R. E. Buchanan és N. E. Gibbons „Bergey’s Manual fór Determinative Bacteriology”, The Williams and Wilkins Company, Stíl Ed., 1974, és E. B. Shriling és D. Gottlieb, „Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces” Intem. Journal of Systematic Bacteriol. 808-809(1972).
Az osztályba sorolás a Nemzetközi Streptomyces Fejlesztési Program által ajánlott módszerekkel (E. B, Sbirling és D. Gottlieb, „Methods of Characterization of Streptomyces species” Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16.313-340 /1966/) és más kiegészítő tesztekkel történt. A szénfelhasználást ISP 9 alap táptalajon végezték, amelyhez annyi szénforrást adtak, hogy ennek végkoncentrációja 1,0% legyen. A szénforrásokat szűréssel sterilizálták, az alap táptalajt autoklávozás segítségével sterilizálták. A kísérleti laptenyészeteket 14 napos, 30°C -on történt inkubálás után értékelték ki. A sejtfal cukortartalmat Lechevalier módosított eljárásával határozták meg (Μ. P. Lechevalier, „Chemical Methods as Criteria fór the Separation of Actinomycetes intő Genera”, az American Society of Microbiology, Actynomicetes Alosztálya által rendezett munkaértekezlet, Dr. Thomas G. Pridham, Convenor, amelyet a The State University of Nex Yersey, New Brunswick, New Yersey, 1971 rendezett). Az izomer diamino-pimelinsavat Becker és munkatársai módszerével határozták meg (B. Becker és munkatársai, „Rapid Differentation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Cliromatography of Whole Cell Hydrolysates” Appl. Mícrobiol., 11,421 423 /1964/). Az aminosavanalizist mosott sejtfal fragmensekkel végezték. A melanoid pigmenteket ISP 1 (tripton-élesztő extraktum táptalaj), ISP jj6 (pepton-élesztő extraktum vas agar táptalaj), ISP 4% 7 (tirozin agar), módosított ISP^fc 7 (ISP #7 tirozin nélkül) táptalaj és tirozin vizsgálat (Yuzuru Mikami és munkatársai, „Modifíed Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streoptomices,” Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 27/3/290 /1977/) alkalmazásával határozták meg. A keményítő hidrolízist a keményítő jóddal való kimutatásával határozták meg.
ISP Vi 2 agar táptalajt alkalmazva meghatározták a hőmérséklet határokat, nátrium-klorid toleranciát, pH határokat, és antibiotikum aktivitást. A hőmér-31
196 845 séklet értékek 25, 28, 30, 34, 37,40, 45, 50 és 55°C voltak. A nátriutuklorid agar táptalajhoz való adagolásával határozták meg. Ezeket a próbákat 30°C-on in kubai ták.
A pH határokat az agar táptalaj közvetlenül öntés előtti pH érték beállításával mérték. A pH értékeket 3,0 és 11,0 között egységenként változtatták. Az antibiotikum érzékenységet érzékenység mérő korongokkal mérték, amelyeket a laptenyészetre helyeztek.
A szín elnevezéseket ISCC-NGS módszer szerint végezték. (K. L. Kelly és D. B. Judd, „The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names”, U. S. Departement of Commerce Circ. 553, Washington, D. C., 1955).
Az alábbi táblázatban zárójelben megadott jelzések a Tresner és Backus féle színskálában található elnevezést jelzik (H. D. Tresner és E. J. Backus, „System of Color Wheels fór Streptoinieete Taxonomy”, Appl. Microbiol. 11,335-338 /1956/). A színsor megnevezését aláhúzták. A Maerz és Paul színsorozatjelzését zárójelben adtuk meg (A. Maerz és M. R. Paul, „Dictionary of Color”, McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N. Y., 1950).
Morfológia
Az A-21978.6 tenyészet morfológiai jellemzője hogy a Rectus-Flexibilis (RF) osztályba tartozó spórahordozókból áll. A spóraláncok egyenként tíznél több spórából állnak. A spórák felülete sima.
Az A-21978.6 kultúra azzal jellemezhető, hogy piros légspóra keletkezik elsősorban, míg a hátoldali szín pirosasbarna. Világosbarna vízoldható pigmentet is tartalmaznak. Ezek a jellemzők mutatkoznak a 14 agar lemeztenyészetből hármon (ISPfr 2, 1SP # 7, TPO). Csak ez a három táptalaj tartalmazott nagy mennyiségű' légi és vegetatív növekményt.
Az ISP^4 és a glükóz-aszparagin agar táptalajon fehéres-szürke- légspóra fejlődött, míg a hátoldalt szín sárga volt. Nem tartalmaztak vízoldható festéket. Ez a két táptalaj nem bőséges, de jó légi és vegetatív növekedést mutatott.
Kilenc egyéb agar táptalajt is alkalmaztak, de ezeken gyenge vagy semmilyen növekedést illetve spóraképződést tapasztaltak. Amennyiben légspóra van jelen, habár ez gyenge, színe fehér-szürke.
A meianoid festékek jelenléte nem tapasztalható.
A sejtfal fő komponensei: LL-DAP, glicin, glükóz, és ribóz. Ez 1. Típusú sejtfalat mutat és C típusú cukorszerkezetet (R. E. Buchanan és N. E. Gibbons Eds, „Bergey’ s Manual of Determinative Bacteriology” The Williams and Wilkinson Company, 8th E<Jition, 1974, p. 658).
Az A-21978.6 törzset az alábbi kultúrákkal hasonlították össze laboratóriumi vizsgálatokban: Streptomyces albovinaceous ISP 5136, ATCC 15833 Streptomycescandidus ISP 5141, ATCC 19891
Streptomyces moderatus ISP 5529, ATCC 23443 Streptomyces roseosporus ISP 5122, ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395, ATCC 25497
Ezek a kultúrák a fehér és piros színű sorozathoz. tartoznak RF típusú spórahordozóik vannak, a spóráik felülete sima és az ISP leírás szerint malein negatívok és nem figyelhető meg a hátoldalon megkülönböztethető szín rajtuk, illetve nincs vízoldható festéktartalmuk. Ezek a jellemzők, valamint a szénfelhasználás formája és más másodlagos jellemzők azt mutatják, hogy az A-21978.6 törzs ezekhez a __ kultúrákhoz hasonló.
év A kultúrákat laboratóriumi kísérletben összehasonlítottuk az A-21978.6 törzzsel. Ennek során négyet kiejtettek. Az S. candidus és S. setonii bármely táptalajon sárga légspórával rendelkezett, és így nem azonos az A-21978.6 törzzsel. A S. albovinaceous <jq és az S. moderatus sötét megkülönböztethető hátoldali szint mutatott, és meianoid festéket tartalmazott, ennélfogva az A-21978.6 törzstől eltérő. Az ISP leírás szerint az S. moderatus pirosas-barna, vagy sötét hátoldali színt mutat, de ilyen jellemzőt a S. albovinaceous-ra nem ad meg. Egyik kultúráról sem írja, hogy melanin pozitívok lennének.
Ebből következően az A-21978.6 törzset 1961ben Falcao de Morias és Dalia Maia Streptomyces roseosporous törzsként sorolta osztályba. Ez a besorolás közzétett adatokkal és laboratóriumban kísérletileg végzett összzehasonlításokon alapult.
A közvetlen összehasonlítási tanulmányokat az alábbi tenyészet jellemzőkkel írhatjuk le.
Tenyészet jellemzői Morfológia
A21978.6 S. roseospuros
A spóratartók egyenesek vagy hajlottak (RF), hurkokkal vagy spirálokkal. A spóraszálak tíznél több spórát tartalmaznak. A spóra felülete elektronmikroszkópos vizsgálat szerint sima.
Spórák: Hosszúkástól oválisig Átlagos méret: 0,85 x 1,78 μΜ Nagysági ingadozás:
0,65 -0,97 x 0,97-2,6 μΜ
Hosszúkástól hengeresig 1,01 x 2,47 μΜ
0,97-1,3 x 3,25 μΜ
Növekedés Szín
Növekedés
Szín
Légi: jó szürke c rózsaszín
Vegetatív: tömeges barna nincs oldható színezék
Sárgarépa szelet nincs jő nincs oldható színezék nincs sárgás-barna
1% 845
Tenyészet jellemzői Morfológia
A21978.6
Növekedés
Szín
Növekedés
S. roseospuros
Szín
Burgonya szelet
Légi: jó szürke c rózsaszín
Vegetatív: tömeges barna sötétbarna oldható festék nincs gyenge nincs oldható festék nincs narancs-barna
ISP#1 (tripton-élesztő ext, agar)
Légi: gyenge Vegetatívjó nincs oldható színezék (W)a fehér jlOAl/ halvány sárga-zöld csekély csekély
Légi: jó
Vegetatív: tömeges /5D10/ világos pirosbarna ' világosbarna oldható színezék nincs oldható színezék 1SP#2 (Élesztő-maláta ext. agar) (R) 5cb sárgás-rózsaszín tömeges tömeges világosbarna oldható színezék
ISP#3 (Zabliszt agar) (W)a fehér /10B2/ halványsárga-zöld (R) 3ca halványsárgás-zöld /12L7/ világos öli vázold
Légi: gyenge Vegetatív: gyengéi (W)a fehér csekély /10 A2/ halvány sárga- gyenge rózsaszín világosbarna oldható színezék (W)a fehér halvány zöldesszürke
Légi: jó
Vegetatív:jó /1 OBI / halvány sárga zöld világosbarna oldható színezék nincs oldható színezék ,ISP#4 (Szervetlen sók agar) (W)b fehér . jó tömeges nincs oldható színezék
1SP#5 (Gliceroin-aszparagin agar) (R)3c2 halvány narancs-sárga /1115/ szürkéssárga
Légi: gyenge (W)13ba bíbor fehér
Vegetatív: jó /3B7/ gy. sárgarózsaszín gy. rózsaszín oldható színezék gyenge jó
Légi: tömeges (R)5cb gy. sárga, rózsaszín sötétbarna oldható színezék
Légi: nincs
Vegetatív: csekély nincs oldható színezék világosbarna oldható színezék ISP#7 (Tirozin agar) tömeges világosbarna oldható színezék Bennett féle módosított agar tömeges halvány sárga-barna tömeges (W)b fehér /I0C2/ szürkéssárga (R)5cb gy. sárgarózsaszín világosbarna oldható színezék (R)5cb szürke, sárgarózsaszín /1104/ szürkés-sárga
196 845
Tenyészet jellemzői Morfológia
A21978.6 S. roseospuros
Növekedés Szín Növekedés Szín
Kálcium-maleát agar
Légi: nincs Vegetatív: gyenge — - csekély /7L12/mód, piros-barna csekély (W)a fehér halvány sárga-zöld
világosbarna oldható festék halvány sárgás-barna oldható festék
Czapek féle oldat agar
Légi: csekély Vegetatív: csekély nincs oldható színezék (W)a fehér megtört fehér nincs nincs -
Emerson féle agar
Légi: csekély tömeges (R)5cb gy. sárga
rózsaszín
Vegetatív: tömeges /13L6/ tömeges /1115/ gy. sárga
nincs oldható színezék világosbarna oldható színezék
Glükóz-aszparagin agar
Légi: jó (W)b fehér gyenge (W)b fehér
Vegetatív: jó /12B2/ gy. sárga jó /12B2/ halvány
sárga-zöld
nincs oldható színezék nincs oldható színezék
Táp agar
Légi: nincs gyenge (W)b fehér
Vegetatív: csekély halvány sárga-szürke jó halvány sárga-szürke
nincs oldható színezék nincs oldható szinezék
Glicerin-glicin agar
Légi: gyenge tömeges (W)b fehér
Vegetatív: tömeges /8L12/ sötét gy .barna tömeges világos sárga
barna oldható színezék világosbarna oldható szinezék
Paradicsom-püré-zabliszt agar
Légi: tömeges (R)5cb gy .sárga tömeges (R)5cb gy .sárga
rózsaszín rózsaszín
Vegetatív: tömeges /8L12/ gy .barna tömeges /12L7/ sárga barna
barna oldható színezék barna oldható szinezék
196 845
Szén felhasználás
Szubsztrát A21978.6 S. roseosporus
L-Arabinóz 4 4
D-Fruktóz + —
D-Gal aktóz 4 +
D-Glükóz * ♦
i-Inozit
D-Mannit + _
D-Raffinóz _
L-Ramnóz 4 4
Szalicln + 4
Szacharóz — _
D-Xilóz 4 ♦
Jelkulcs:
+ = pozitív felhasználás - = negatív felhasználás
Jellemzők
A21978.6 S. roseosporus
Melanoid festékek
ISP#1 (tripton-élesztő ext.)
ISP#6 (pepton-élesztő ext. vas)
ISP#7 (tirozin agar)
ISP#7 módosított (ISP#7 tirozin nélkül)
Zselatin elfolyósítás hatás lefölözött tejre
Keményítő hidrolízis pH határérték
Hőmérséklet határérték
Nitrát redukció
NaCl tolerancia, felső határ + ♦ gyenge hidrolízis gyenge hidrolízis + ♦
5-11 5-11
25—40°C 25—45°C
10% 6%
Antibiotikum érzékenység
Antibiotikum Konc/Korona Osztály A21978.6 S. roseosporus
Eritromycin 15 Pg Makrolid 4 4
Cefalotin 30 Pg /3-Iaktám 4 4
Linkomycin 2 Pg Glükozid - -
Nistatin 100 egység Polién - -
Polimixin B 300 egység Pepiid + -
Streptomycin 10 pg Aminoglikozid 4 4
Tetraciklin 30 pg Tetraciklin * 4
Vankomycin 30 pg Glikopeptid 4 4
♦ = érzékeny (Inhibiciós zónák ♦ «rezisztens (nincs inhibiciós zóna)
Bizonyos A21978.6 törzs jellemzők eltérnek a
S. roscosporus törzsre közölt jellemzőktől. Az Λ21978.6 törzs eltérő a szakirodalomban közölt adatoktól a sárgarépa- és burgonya szeleten való növekedésben, a spóraméretben, a nátrium-kloridtoleranciában és a nitrát redukcióban.
A találmány szerinti eljáráshoz kifejlesztett és alkalmazott A21978.65 törzs tulajdonságai megegyeznek az A21978.6 törzsével. Ettől csak a termelt A21978C antibiotikumok mennyiségében tér el. A korábbi törzs legjobb esetben 100 meg A21978 antibiotikumot termelt fermentlé milliliterenként, míg a javított A21978.65 törzs legalább 2,5-ször nagyobb mennyiségű antibiotikumot termel, és rázott fermentációs edényben még 18-szoros mennyiség termelése is elérhető. A nagyban megnövelt A21978C termeléssel az új törzs nagyban javított módszert eredményez ezeknek az antibiotikumoknak az előállítására.
Mint más mikroorganizmusok esetében is, a találmány szerinti eljárásban alkalmazott új A21978C termelő Streptomyces roseosporus NRRL 15998 kultúra változatai is létezhetnek. Változatai és mutánsai kaphatók különböző szakirodalomban ismert technikák, mint ultraibolya besugárzás, röntgen besugárzás, nagyfrekvenciás hullámokkal való kezelés, radioaktív besugárzás és vegyszeres kezelés segítségével. A Streptomyces roseospurus NRRL 15998 neutrális és indukált variánsai és mutánsai, amelyek megtartják azt a jellemzőt, hogy nagy menynyiségben termelnek A-21978C antibiotikumokat, ugyancsak alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban.
A Streptomyces roseosporus NRRL 15998 tenyésztésére igen sokféle táptalajt alkalmazhatunk. Gazdaságossági okokból, hogy optimális termelést érjünk el, hogy a termék izolálása könnyű legy§n, bizonyos táptalajok előnyösen alkalmazhatók. így például nagy méretekben történő termelés esetében az előnyös szénforrás tapióka dextrin, de glükóz, fruktóz, galaktóz, maltóz, mannóz, gyapotmag olaj és hasonlók szénforrások ugyancsak alkalmazhatók. Előnyösen alkalmazható nitrogénforrás az enzim hidrolizált kazein, de’ oldható hús pepton, szójaliszt, szója hidrolizátum, szójamag por, élesztő, aminosavak, mint például L-aszparagin és DL-leucin valamint hasonló nitrogénforrások is alkalmazhatók. A táptalajba keverhető szervetlen tápsók olyan oldható sók, amelyek kálium, klorid, ammónium, szulfát, nitrát és hasonló ionokat képesek szolgáltatni. Ezek között különösen előnyösen alkalmazható antibiotikum termelésben a káliumszulfát. Melasz hamu, hamu dializátum és szintetikus ásványi só keverék ugyancsak alkalmazható.
Az A-21978C antibiotikumok termeléséhez előnyösen a fermentáció során desztillált vagy ionmentes vizet alkalmazunk.
Bizonyos ásványi anyagok, amelyek a csapvízben találhatók, mint például a kalcium és a karbonát ionok, előnytelenül befolyásolják az antibiotikum termelést.
A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez bizonyos nyomelemek jelenléte is szükséges a táptalajban. Ezek a nyomelemek általában mint szennyezések előfordulnak az egyéb összetevő anyagokban, cs mennyiségük elegendő a mikroorganizmus számára.
Kis mennyiségű (például 0,2 ml/1) habzásgátó anyag, mint például polipropilén-glikol adagolása szükséges lehet nagy méretekben végzett fermentáció során a habzás megakadályozására.
A jelentős mennyiségű A-21978C antibiotikumok termeléshez előnyösen szubmerz, aerob fermentációs technikát alkalmazunk. Azonban kis mennyiségű A-21978C.antibiotikumok rázott edényben tenyésztett kultúrákból is előállíthatok. Mivel az antibiotikum termelésben nagy késést, időigényt okozhat a mikroorganizmus spóra formájú alakjával való nagy fermentációs tartály Inokulálás, erre a célra általában előnyösen vegetatív inokulumot alkalmazunk. A vegetatív inokulumot úgy állítjuk elő, hogy kis mennyiségű táptalajt a mikroorganizmus spóra, vagy micélium formájával inokulálunk és így friss, aktívan növekedő tenyészetet kapunk. Ezután a vegetatív inokulumot a nagyobb tartályba inokuláljuk.
Az új A-21978C termelő mikroorganizmus körülbelül 20°C és körülbelül 40°C közötti hőmérsékleten képes növekedésre. Optimális A-21978C termelés körülbelül 30-32°C közötti hőmérsékleten történik.
Mint a szubmerz aerob tenyészetek esetében ez szokásos, a táptalajba steril levegőt vezetünk. A hatásos A-21978C termeléshez a tartály levegő telítettsége körülbelül 20% előnyösen 30% (30°C-on, atmoszférikus nyomáson) legyen.
A tartályban történő fermentáció során a fermentációs közeg pH értékét előnyösen körülbelül 6,57,0 érték körül tartjuk. Ezt megfelelő mennyiségű nátriumhidroxid (a kezdeti fermentációs szakaszban) és sósav (a későbbi fermentációs szakaszban) hozzáadásával érhetjük el.
A fermentáció során az A-21978C antibiotikum termelést a táptalaj vagy micélium extraktumok antibiotikus hatás vizsgálatával követhetjük, amelyet az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával végzünk. Például ilyen vizsgálati mikroorganizmus, amely az antibiotikumok termelésének követésére alkalmas, a Micrococcus luteus, A biotesztet előnyösen papír-korong agar lemezeken való vizsgálattal végezzük.
Á táptalaj szilárd részét, amely a micéliumot és a táptalaj szilárd alkotórészeit tartalmazza extrakció vagy elválasztás nélkül közvetlenül is felhasználhatjuk, de előnyösen a víz eltávolítása után alkalmazzuk A-21978C antibiotikum forrásként. Például megfelelő A-21978C antibiotikum aktivitás elérése után a táptalajt liofilizálással száríthatjuk, és közvetlenül a tápanyagként alkalmazott premix-be keverhetjük.
Az (I) általános képletű vegyületek kiváló antibiotikus hatású anyagok.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.
1. példa
A-21978C komplex előállítása Tárolt kultúra formát készítünk, amit folyékony nitrogén gőzterében tárolunk. A folyékony nitrogén gőzterében tárolt Streptomyces roseosporus, NRRL 15998 törzset alkalmazzuk 50 ml alábbi összetételű vegetatív táptalaj inokulálására.
196 845
Alkotórész Mennyiség
Triptikáz szója lé* 3,0
Dextrin 2,5
Víz (deionizált) 94,5 + Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD.
Az inokulált táptalajt 250 ml-es Erlenmeyer lombikban, 30°C-on, 48 óráig inkubáljuk körkörös rázógépen, amelynek fordulatszáma 5 cm átmérőjű íven 250 ford/perc. A kifejtett vegetatív kultúrát steril kémcsövekbe visszük át (0,5 ml/cső) és folyékony nitrogén gőzfázisban tároljuk.
Abból a célból, hogy nagyobb mennyiségű egységes tárolt anyagot kapjunk, 1 ml folyékony nitrogén gőzfázisában tárolt kultúrával 80 ml fent leírt vegetatív táptalajt inokulálunk. A táptalajt 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 30°C-on, 48 óráig 5 cm átmérőjű íven 250 ford/perc sebességgel mozgó rázógépen inkubáljuk.
Az így kapott tenyészet 10 ml-ével 450 ml második fázisú vegetatív táptalajt inokulálunk, amely táptalaj összetétele a fent megadott. A második jázisú közeget 2 1-es Erlenmeyer lombikban 30°C-on, 24 óráig, egy 5 cm átmérőjű íven 250 ford/perc sebességgel mozgó rázógépen inkubáljuk.
liter második fázisú vegetatív tenyészettel inokulálunk 39 1 steril harmadik fázisú kifejlesztő táptalajt, amelynek összetétele az alábbi:
Alkotórész Mennyiség
Szójabab liszt 0,5
Élesztő extraktuma 0,5
Kálcium-glükonát 1,0
KClb 0,02
MgSO4 · 7H2Ob 0,02
FeSO4.7 H20b 0,0004 . Ság 471 (habzásgátló)0 0,03
Viz 97.9296 aDifco Laboratories, Detroit MI b A nyom ásványi sók az alábbi módon készültek: 7,6 g FeSO4 . Ί H^O-t oldunk 76 ml tömény sósavban. Ehhez 380 MgSO. . 7H2O és 380 g KC1 adunk majd a térfogatot 3800 ml-re egészítjük ki ionmentes vízzel. Hogy a megadott ásványi só koncentrációt kapjuk, minden 39 1 harmadik fázisú kifejlesztő fermentációs táptalajhoz 80 ml ilyen oldatot adunk.
c Union Carbide, Danbury CT.
Az inokulált táptalajai 24 óráig rozsdamentes acél edényben 30°C-on inkubáljuk. Az edényt 0,85 térf/térf/perc sebességgel, steril levegővel levegőztetjük és szokásos keverőkkel 250-450 ford/perc sebességgel keverjük. A berendezésben a nyomást g 3,5 . 104 Pa értéken tartjuk.
Egy liter inkubált harmadik fázisú inokulummal
beoltunk 119 1 steril termelő táptalajt, aminek összetétele az alábbi:
Alkotórész Mennyiség (%)
Szójaliszt 2,2
Fe/NH4/2(SO4)2.6H2O -0,066 ,
Dextróz 0,825
Ság 471 0,022
Burgonya dextrin 3,3
Melasz (sötét) 0,275
Csapvíz 93,312
«
A pH értékét az első két alkotórész beadagolása után 7,0-re állítjuk be, majd ezt a pH beállítást valamennyi alkotórész beadagolása után is elvégezzük a sterilizálás előtt.
Az inokulált θ termelő táptalajt rozsdamentes acél edényben 30°C-on hat napig inkubáljuk, miközben 0,5 térf/térf/perc levegőztetés alkalmazunk. A táptalajt szokásos keverőkkel a 0-15 óra során 250 ford/perc sebességgel, ezután pedig 350 ford/ perc sebességgel keverjük. A pH értékét ammó35 nium-hidroxid-oldat hozzáadásával körülbelül 6,5 értéken tartjuk. Az A21978C komplex termelése a fermentáció végén 0,282 g/1 táptalaj volt. A komplexet a 180.476 sz. magyar szabadalmi leírás szerint izoláljuk és választjuk szét. A faktor-elosztást az I. táblázatban írjuk le. A nyert komplex mennyisége a
180.476 sz. magyar szabadalmi leírásban kapottnak (0,06 g/1) kb. ötszöröse.
Az A21978C komplex és faktorai (Na-só alakjában) KBR pelletben felvett IPR-spektruma a következő:
KOMPLEX C0 C1 C2 C3 C4 C5
3310 3300 3300 3300 3310- 3320 3300
3050 3050 3040 3050 3040 3050 3045
2910 2910 2910 2910 2910 2920 2910
2840 2840 2840 2840 2835 2850 2840
1655 1650 1650 1665 1650 1655 1650
1540 1540 1535 1535 1535 1525 1525
1450 1445 1450 1450 1450 1455 1445
1395 1395 ' 1395 1400 1395 1395 1390
1310
1240 1215 1220 1225 1225 1220 1215
1160 1155 1160 1160 1160 1160 1155
-91.
196 845
KOMPLEXEK CQ
1065
745
645
555 ,518
1060
745
1065
745
1065 1060
745 745
1065 1055
740 735
A faktorok optikai forgatóképessége:
A-21978C faktor Forgatóképessége:
Co *ll,9o(C = 0(7,H2O)
Cj *16,9°(c = 0,7,H2O)
C2 *18,6o(c = 0,9,H20)
C3 *20,9° (c = 0,4, H2O)
C4 *14,8° (c = 0,7, H2O)
C5 + 17,9°(c = 0,7, H2O) r
Az A-21978C komplex faktorait analitikai célra fordított fázisú szilikagél-vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel választhatjuk el és azonosíthatjuk. Előnyös oldószer a víz-metanol-acetonitril (45 : 15 :40) elegy, mely 0,2% piridint és 0,2% ecetsavat tartalmaz. Az Rfértékek a következők:
A-21978C faktor Rférték
C0 0.71
Cj , 0,64
C2 0,56
C3 0,47
C4 0,63
C5 0,53
A fenti eljárást különböző pH- és hőmérsékleti értékeken megismételjük a Streptomyces roseosporus NRRL 15998, illetve NRRL 11379 törzsekkel. A tenyésztési körülményeket és a komplex, illetve N-dekanoil-származék kitermelést és arányt az alábbi táblázatok szemléltetik, melyekből megállapítható, hogy az NRRL 15998 törzs lényegesen magasabb termelőképességgel rendelkezik.
Az A-21978C komplex termelése és az N-dekanoil-származék aránya különböző pH-értékeken NRRL
15598 törzsnél
pH érték óra titer %(N-
(Mg/ml) -dekanoil)
5,5 139 12 58
6,0 115 1153 28
6,5 139 1603 61
7,0 139 1526 58
7,5 139 1560 59
8,0 115 121 , 35
Az A-21978 komplex termelése és az N-dekanoil·
-származék aránya különböző hőmérsékleti értékeknél NRRL 15998 törzsnél
15 Hőmérséklet (°C) óra titer (Mg/ml) %(N- -dekanoil)
25 115 462 60
27 138 1188 50
30 138 1556 67
31 138 1730 47
32 138 1221 58
20 34 115 477 23
Az A-21978 komplex termelése és az N-dekanoil-származék aránya különböző pH-értékeken NRRL 11379 törzsnél
pH-érték óra titer %(N-
érték (Mg/ml) -dekanoil)
5,5 116 165 30
6,0 140 453 56
6,5 140 542 49
7,0 140 493 20
7,5 140 429 17
8,0 116 50 38
Az A-21978 komplex termelése és az N-dekanoll-származék aránya különböző hőmérsékleti értékek35 nél NRRL 11379 törzsnél
hőmérséklet CO óra titer (Mg/ml) %(N- dekanoil)
25 140 291 41
27 140 243 36
31 117 599 43
32 140 592 39
34 140 588 50
2. példa 40 A-2197 8C g javított előállítás
Az első fázisú, második fázisú és harmadik fázisú fermentációs lépéseket az 1. példa eljárása szerint végezzük. A termelési fermentációt az 1. példa eljárása szerint végezzük azzal a különbséggel, hogy a
5θ fermentálás 28. órájától kezdődően 50-50% (térf/ térf) oktánsav (kaprilsav) és metil-oleát elegyet táplálunk 0,13 ml (1 fermentlé) óra sebességgel a táptalajhoz addig, amíg a fermentáció 144 óra múlva be nem fejeződik. Az A-21978C komplex termelés 1,255 g/1 fermentlé, ami az 1. példához képest
445%-os növekedést jelent. Az A-21978Cg faktor (az olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben R jelentése oktanoil-csoport) a teljes ilyen eljárással előállított A-21978C komplex 9%-a, az 1. példa szerinti eljárással előállított A-21978C komplexben nem volt A-21978Co faktor. Az n-oktanoil-származék (C8) UV-spektruma: (H2O)\ max: 220 (47,500).
-101.
196 845
255 ( e 11,000), 262 ( e 10,500), 282 (e 4,950),
290 ( € 800), 365 (¢4,900 ) nm.
3. példa
A-21978C^ javított előállítása
Az első fázisú, második fázisú és harmadik fázisú fermentációs lépéseket az 1. példa szerinti eljárással végeztük. A termelési fermentációs lépést az 1. példa q szerinti eljárással végezzük, azzal a különbséggel, hogy a fermentáció 28. órájától kezdődően 25% térf. nonánsav és 75 térf% metil-oleát steril elegyét x tápláljuk 0,13' ml/1 fermentlé/óra sebességgel a fermen tíéhez, és ezt a betáplálást a fermentáció befejeződéséig, a 144. óráig fenntartjuk. Az A-21978C 15 komplex termelése 0,821 g/1 fermentlé, ami 293%-os növekedést jelent az 1. példa eredményéhez képest.
Az A-21978Cg faktor (amelyben az (I) általános képletben R jelentése nonanoil-csoport) a teljes ilyen módszerrel előállított A-21978C komplex 10%-a, az 1. példa eljárása szerint előállított A- 20 -21978C komplex nem tartalmazott A-21978CQ faktort.
Az n-nonaoil-származék (Cq) UV-spektruma: (H?O), λ max: 220 (e 46,000), 250 (e 9,500), 255 ( el 1,250), 261 (e 10,750), 280 ( e4,9/*5), 288 ( 4,250), és 364 (e 4,000) nm.
4. példa
A-21978Cjg faktor (az (I) általános képletben R jelentése dekanoil-csoport) javított előállítása
A vegetatív növekedés első fázisú és második 30 fázisú fermentációját az 1. példa eljárása szerint végezzük. A harmadik fermentációs fázisban 800 ml második fázisú inokulummal oltunk be 950 1 steril harmadik fázisú tele az alábbi:
Alkotórész .
Dextróz
Kálciumkarbonát Szójaliszt
Élesztő extraktum KCla
MgSO4.7H2Oa'
FeSO4 - 7H2Oa Ság 471 (habzásgátló)
Víz a Az ásványi nyomelemek oldatát az 1. példa eljárása szerint készítjük.
Az inokulált táptalajt rozsdamentes acél edényben en 30°C-on 24 óráig inkubáljuk. Az edényt 0,8 térf/térf/ perc sebességgel steril levegővel levegőztetjük és szokásos keverőkkei keveijük. Az így kapott harmadik fázisú tenyészet 1 1-vel inokulálunk 119 1 termelési táptalajt, amely az 1. példában megadott összetételű.
A termelési fermentációt az 1. példa eljárása szerint 55 végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a fermentáció 28. órájától kezdve 50% (térf/térf) dejcánsav (kaprinsav) és 50% (térf/térf) metil-oleát elegyét tápláljuk a fermentlébe 0,26 ml/I fermentlé/óra sebességgel.
A betáplálást a fermentáció befejeződéséig, a 283. óráig, ezzel a sebességgel végezzük. Az A-21978C 60 táptalajt, amelynek összeté35
Mennyiség (%)
2,0
0,2
2,0
0,1 40
0,02 0,02 0,0004
0,02 45
95,6396 komplex termelés 1.94 g/1 fermentlé, ez az 1. példa eredményéhez képest 687% növekedést jelent. Az A 21978C.Q faktor (az (I) általános képletben R jelentése déxanoil-csoport) termelés 1,63 g/1 fermentlé, vagy az A-21978 komplex 84%-a, ez az 1. példában előállított A-21978C,« faktorhoz képest 13583% növekedést jelent.
5. példa
Más eljárás A-21978C, «javított előállítására
Az első, második ésnarmadik fázisú inokulum kifejlesztését az 1. példa eljárása szerint végezzük. A termelési fázist az 1. példa eljárása szerint iniciáljuk, majd a 28. fermentációs órától kezdődően 25 térf% kaprinsav-etilészter (etil-kaprinát) és 75 térf% metil· -oleát elegyét adagoljuk 0,13 ml 1 fermentlé óra sebességgel a fermentléhez és ezt ezzel a sebességgel fenntartjuk a fermentáció befejeződéséig, azaz a 144. óráig. A-21978C komplex termelés 1,022 g/1 fermentlé, ami 362% növekedést jelent az 1-példában kapott eredményhez képest. Az A-21978C,« faktor koncentrációja 0,20 g/Iíter fermentlé, illetve a teljes A-21978C komplex 20%-a. Ez 1683% növekedést jelent az 1. példában kapott A-21978Cjq faktor termeléshez képest.
6. példa
Más eljárás az A-21978C,« faktor javított előállítására
Az első és második fázisú vegetatív növekedési fázisok tenyésztését az 1. példa eljárása szerint végezzük. A harmadik fázisú tenyésztést a 4. példa szerinti eljárással végezzük, azzal a különbséggel, hogy a táptalaj térfogata 1900 1 és a tenyésztés ideje 48 óra. A levegőztetés sebessége a 0-24 óra között 0,3 térf/ térf/perc, a 24-40 óra között 0,45 térf/térf/perc és a 40—48 óra között 0,90 térf/térf/perc. A termelési fermentációt az 1. példa eljárása szerint iniciáljuk. A tápoldat 3600 g gliceroint, 900 ml ionmentes vizet 1 1 kaprinsavat és 620 ml tömény ammóniumhidroxídot tartalmaz. A 23. fermentációs órában 0,0004% élesztő extraktum steril szuszpenzióját adjuk a fermentléhez. A 36. órától kezdve glicerin és ammónium-dekanoát oldatát adagoljuk 0,84 ml/1 fermentlé/óra sebességgel a fermentléhez.
A betáplálást ugyanezzel a sebességgel végezzük a fermentáció befejeződéséig, azaz a 143. óráig. Az A-21978C komplex termelése 1,772 g/1 fermentlé, ami 628% növekedést jelent az 1. példa hozamához képest. Az A-21978C,« faktor koncentrációja 0,739 g/1 fermentlé, illetve a teljes A-21978C komplex 42%-a. Ez 6158% növekedést jelent az 1. példában kapott A-21978Cjq koncentrációhoz képest.
A 4., 5. és 6. példában előállított n-dekanoil-származék fizikai állandói: Ms: M+ 1620, UV-spektrum: (EtOH): 223 ( e 53,819), 260 (e 9,531), 281 (66,029), 289(ξ 5,304), 365 (¢5,219) nm.
7. példa
Az A-21978C j j javított előállítása
Az első, második és harmadik inokulum fázis előállítását az 1. példa eljárása szerint végezzük. A termelési fermentációt az 1. példa eljárása szerint végezzük azzal az eltéréssel, hogy a 28. fermentációs órától kezdve 25térf% undekánsav és 75 tér% metil-oleát steril oldatát tápláljuk 0,13 ml/1 fermentlé/
-111
196.845 óra sebességgel a fennen tiéhez. Ezt a beptálálást azonos sebességen tartjuk a fermentáció befejeződóséig a 144. fermentációs óráig. Az A-21978C 0 komplex termelése 1,62 g/1 fcrmentlé, amely 574% növekedést jelent az 1. példa hozamához képest. Az A-21978Cji faktor koncentrációja (ahol az (I) általános képletben R jelentése undekanoil-csoport)
0,70 g/1 fcrmentlé vagy a teljes A-21978C komplex -,θ 43%-a. Az 1. példa szerinti eljárással előállított A-21978C komplexben nem mutatható ki A-219-78Cj j faktor
A kapott undekanoil-származék (Cii) UV-spektruma (IRO), χ max: 220 ( e 46,250), 249 (e 8,550),
255 ( e i0,500), 261 (e 10,250), 264 ( e 4,950), 15
288 (e 4,000), 264 (e 4,000) nm.
8. példa
A-21978Cr javított előállítása
Az első, második és harmadik inokulum fázist az 1. példa eljárása szerint készítjük. A termelési fermentációt az 1. példa eljárása szerint iniciáljuk, azzal a különbséggel, hogy a 28. fermentációs órától kezdve 25 térf% laurilsav és 75 térf% metil-oleát steril oldatát tápláljuk a fermentléhez 0,13 ml/1 fermentlé/óra sebességgel. Ezt a betáplálást fenntartjuk a fermentáció végéig a 144. óráig. Az A-219-78C komplex termelés 1,12 g/1 fermentlé, ami 400% növekedés az 1. példa hozamához képest. Az A-219-78Cj faktor (ahol az (1) általános képletben R jelentése dodekanoíl-csoport) koncentrációja 0,372 g/1 fermentlé, vagy a teljes A-21978C komplex 33%-a. Ez 5314%-kal nagyobb, mint az 1. példa eljárása szerint kapott A-21978C komplex A-21978Cj faktor tartalma.
A dodekanoil-származék (Cj2) fizikai állandó: megegyeznek az 1. példa szerinti A-21978C<faktoréval.
1. táblázat
A különböző zsírsav szubsztrátok hatása az A-21978C komponens termelésére kifejtett hatása
A-21978C komponens (g/ml)a’b
Példa Zsírsav szubsztrát C1 c2 C3 C5 OO C9 C10 C11
1, Nincs 77 113 72 7 - - 12 -
2. Kaprilsav 276 312 214 175 113 - 170 -
3. Nonánsav 147 177 125 192 83 90 -
4. Kaprinsav 135 50 48 77 - - - 1630d -
5. Káprinsav etilészter 168 246 156 251 - - - 2O2d -
6. Ammónium-dekanoát 335 371' 228 98 - - 739d —
7- Un dekán sav 163 206 158 273 - - 118 700
8. Laurilsav 204 236 141 372 - - 173 -
a A szűrt fermentlé antibiotikum komponens koncentrációit nagyfelbontású folyadékkromatográfia segítségével határoztuk meg, a különféle komponenseket ultraibolya fényabszorpcióval detektáltuk.
b Cj, C2, C3 és C5 = természetes A-21978C faktorok, Cg, Cg, Cjq és Cj j = (I) általános képletű vegyületek amelyekben sorrendben R jelentése Cg, Cg, Cjq és Cj j alkanoil-csoport. d lényegében R - dekanoil vegyület
9. példa
A-21978C komplex más úton való előállítása
A-21978C komplexet állítunk elő az 1. példa eljárása szerint azzal a különbséggel, hogy Streptomyces roseosporus NRRL 11379 kultúrát alkalmazunk.
10. példa
Más eljárás javított A-21978C. θ előállítására
A-21978Ciq- faktort állítunR elő a 6. példa eljárása szerint azzal a különbséggel, hogy Streptomyces roseosporus NRRL 11379 kultúrát alkalmazunk.
-121
196 845
11. példa
Rázóedényes eljárás A-21978C komplex előállítására Az 1. példában leírt általános eljárás szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy rázóedényt alkalmazunk az alábbi táptalajjal:
Alkotórészek Mennyiség (%)
Glükóz 7,5
Dextrin3 , 30
Enzim hidrolizált kazein” 5
Peptonc 5
Melasz - 2,5
Ionmentes víz kiegészítő 11-re a Stadex 11, A. E. Staley Co., Decatur IL ^NZ Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurat NJ 'cBiostate, Baltimore Biological Laboratories, Cockeyville MD
A fermentációban az A-21978C komplex termelés 1800 mcg/ml fermentlé.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű A21978C antibiotikum komplex és ennek faktorai előállítására, ahol R jelentése 5-14 szénatomos alkanoilcsoport, és a C faktor KBr-pelletben felvett IR-spektruma: 3300, 3050, 2910, 2840, 1650, 1540, 1445, 1395, 1215, 1155, 1060 és 745, optikai forgatóképessége: +11,9° (c « 0,7, Η2θ)> és R„ -értéke 0,71 víz-metanol-acetonitril elegyben, mely 0,
  2. 2% piridint és 0,2% ecetsavat tartalmaz, és a C4 faktor KBr-pelletben felvett IR-spektruma: 3320, 3050, 2920, 2850, 1655, 1455, 1395, 1220, 1160, 1065 és 740.
    optikai forgatóképessége: *14,8° (c - 0,7 H2O), és Rf-értéke 0,63 víz-metanol-acetonitril elegyben, mely 0,2% piridint és 0,2% ecetsavat tartalmaz, azzal j e 11 e m e z v e, hogy
    a) a Streptomyces roseosporus NRRL 15998 vagy NRRL 11379 törzset, vagy azok valamely mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat - valamint egy vagy több 5-14 szénatomos alkánkarbonsavat, ennek valamely
    5 észterét vagy sóját - tartalmazó tápközegben sülylyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük, vagy
    b) a C -Cr faktorok - a Cq és C, faktor fizikai állandói a tárgyi körben meghatározottak, a C,, C2, . _ Cj és Cr faktorok olyan (I) általános képletű vegyflleteket jelentenek, melyekben R jelentése 8-metil-dekanoil-, 10-metil-dodekanoil-, 10-metil-undekanoililletve dodekanoil-csoport — és ezek komplexének előállítására a Streoptomyces roseosporus NRRL 15998 törzset vagy annak valamely mutánsát vagy
    15 variánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó tápközegben süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük, a kapott antiotikumot és/vagy komplexet izoláljuk, és kívánt esetben az egyes faktorokat kinyerjük a komplexből. (Elsőbbsége: 1985.10.08.)
    20 2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként a Streptomyces roseosporus NRRL 11379 törzset, vagy annak valamely mutánsát vagy variánsát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984.10.09.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jel--25 I e m e z v e, hogy a tenyésztést egy vagy több 5-14 szénatomos alkánkarbonsav valamely 14 szénatomos alkilészterének jelenlétében végezzük. (Elsőbbsége: 1985.10.08.)
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal j e 11 eoq m e z v e, hogy a tenyésztést egy vagy több 5-14 szénatomos alkánkarbonsav valamely sójának jelenlétében végezzük. (Elsőbbsége: 1985. 10.08.)
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést kaprinsav, annak valamely észterének vagy sójának jelenlétében végez35 zük. (Elsőbbsége: 1985.10.08.)
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal j e 1 1 e m e z v e, hogy a tenyésztést kaprilsav, nonánsavundekánsav, laruilsav illetve azok valamely észterének vagy sójának jelenlétében végezzük. (Elsőbbsége: 1985.10.08.)
HU853912A 1984-10-09 1985-10-08 Process for producing a-21978 c derivatives HU196845B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US65897984A 1984-10-09 1984-10-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT39782A HUT39782A (en) 1986-10-29
HU196845B true HU196845B (en) 1989-01-30

Family

ID=24643546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU853912A HU196845B (en) 1984-10-09 1985-10-08 Process for producing a-21978 c derivatives

Country Status (27)

Country Link
EP (1) EP0178152B1 (hu)
JP (1) JPH0787796B2 (hu)
KR (1) KR890000800B1 (hu)
CN (2) CN1051200A (hu)
AT (1) ATE67788T1 (hu)
AU (2) AU4837785A (hu)
BG (1) BG47040A3 (hu)
CS (2) CS276983B6 (hu)
CY (1) CY1633A (hu)
DD (2) DD238068A5 (hu)
DE (1) DE3584218D1 (hu)
DK (2) DK165416C (hu)
EG (1) EG17619A (hu)
ES (2) ES8700862A1 (hu)
FI (1) FI82075C (hu)
GR (1) GR852432B (hu)
HK (1) HK24292A (hu)
HU (1) HU196845B (hu)
IE (1) IE58655B1 (hu)
IL (1) IL76608A (hu)
NZ (1) NZ213731A (hu)
PH (1) PH21217A (hu)
PL (1) PL152359B1 (hu)
PT (1) PT81265B (hu)
SG (1) SG3292G (hu)
SU (1) SU1452484A3 (hu)
ZA (1) ZA857759B (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0294990A3 (en) * 1987-06-10 1990-05-09 Eli Lilly And Company Chromatographic purification process
US4930494A (en) * 1988-03-09 1990-06-05 Olympus Optical Co., Ltd. Apparatus for bending an insertion section of an endoscope using a shape memory alloy
US4977083A (en) * 1988-04-11 1990-12-11 Eli Lilly And Company Processes for preparing A54145 compounds
DE3832362A1 (de) * 1988-09-23 1990-03-29 Sandoz Ag Neue cyclopeptolide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US7408025B2 (en) 1999-12-15 2008-08-05 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Lipopeptides as antibacterial agents
US6911525B2 (en) 1999-12-15 2005-06-28 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Lipopeptides as antibacterial agents
US6696412B1 (en) * 2000-01-20 2004-02-24 Cubist Pharmaceuticals, Inc. High purity lipopeptides, Lipopeptide micelles and processes for preparing same
US20060014674A1 (en) 2000-12-18 2006-01-19 Dennis Keith Methods for preparing purified lipopeptides
WO2010075215A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Novel antibacterial agents for the treatment of gram positive infections
RS57566B2 (sr) 2009-11-23 2023-12-29 Cubist Pharmaceuticals Llc Lipopeptidne kompozicije i postupci povezani sa njima
AU2012272804B2 (en) * 2011-06-22 2017-07-06 Vyome Therapeutics Limited Conjugate-based antifungal and antibacterial prodrugs
IT201600127655A1 (it) 2016-12-16 2018-06-16 Gnosis Spa Processo per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidici
CN107964557B (zh) * 2018-01-17 2020-11-20 自然资源部第三海洋研究所 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208403A (en) * 1978-10-16 1980-06-17 Eli Lilly And Company A-21978 Antibiotics and process for their production
IL68700A0 (en) * 1982-05-21 1983-09-30 Lilly Co Eli Improvements relating to a-21978c cyclic peptide derivatives and their production

Also Published As

Publication number Publication date
ES8800362A1 (es) 1987-11-01
ATE67788T1 (de) 1991-10-15
PL152359B1 (en) 1990-12-31
DE3584218D1 (de) 1991-10-31
CS276983B6 (en) 1992-11-18
PT81265A (en) 1985-11-01
EP0178152A3 (en) 1988-11-02
AU4837785A (en) 1986-04-17
EP0178152B1 (en) 1991-09-25
HK24292A (en) 1992-04-10
CY1633A (en) 1992-11-06
DK165757C (da) 1993-06-07
KR890000800B1 (ko) 1989-04-07
DK165416C (da) 1993-04-05
DK165757B (da) 1993-01-11
CN85107552A (zh) 1987-05-20
NZ213731A (en) 1988-04-29
DD238068A5 (de) 1986-08-06
DK457585D0 (da) 1985-10-08
FI853910A0 (fi) 1985-10-08
DK148791A (da) 1991-08-21
JPH0787796B2 (ja) 1995-09-27
IE852466L (en) 1986-04-09
IL76608A0 (en) 1986-02-28
PT81265B (pt) 1988-02-17
CN1051200A (zh) 1991-05-08
ES547689A0 (es) 1986-11-16
DK165416B (da) 1992-11-23
ES8700862A1 (es) 1986-11-16
PH21217A (en) 1987-08-21
DK148791D0 (da) 1991-08-21
DD247023A5 (de) 1987-06-24
EG17619A (en) 1991-03-30
DK457585A (da) 1986-04-10
HUT39782A (en) 1986-10-29
BG47040A3 (en) 1990-04-16
CS819286A3 (en) 1992-03-18
ZA857759B (en) 1987-05-27
IE58655B1 (en) 1993-11-03
FI82075B (fi) 1990-09-28
CS276978B6 (en) 1992-11-18
FI853910L (fi) 1986-04-10
GR852432B (hu) 1986-02-10
SG3292G (en) 1992-03-20
EP0178152A2 (en) 1986-04-16
PL255683A1 (en) 1986-07-29
ES553603A0 (es) 1987-11-01
FI82075C (fi) 1991-01-10
CS719885A3 (en) 1992-03-18
KR860003335A (ko) 1986-05-23
SU1452484A3 (ru) 1989-01-15
CN1013120B (zh) 1991-07-10
IL76608A (en) 1991-03-10
JPS6192588A (ja) 1986-05-10
AU5375290A (en) 1990-11-01
AU634766B2 (en) 1993-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU196845B (en) Process for producing a-21978 c derivatives
NL8001982A (nl) Antibiotisch werkzame stof en werkwijze ter bereiding en toepassing van deze stof en farmaceutisch preparaat, dat deze stof bevat.
US4800157A (en) Process for producing the A-21978C antibiotics
EP0185456B1 (en) Cl-1577d and cl-1577e antibiotic/antitumor compounds, their production and use
US4252898A (en) Antibiotics A6888C and A6888X
JPS6365679B2 (hu)
US4735903A (en) Micromonospora carbonacea var africana
US3592925A (en) Antibiotics ah272alpha2 and ah272beta2 and process for producing same
US4358584A (en) Antibiotics A6888C and A6888X
EP0034009B1 (en) Process for preparing polyether antibiotic
US4752605A (en) 7-chloro-4a-hydroxy-8-methoxytetracycline, antibiotic compositions containing them and a method of using
US4342829A (en) Process for preparing narasin
CA1046965A (en) Naphthyridinomycin antibiotics from streptomyces
US3647776A (en) 1-hydroxy- and acetyloxy-3-(1-hexenylazoxy)-2-butanone
US5096817A (en) Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E
US3650904A (en) Production of chloramphenicol, bottromycin and fradicin
EP0285805A2 (en) New heptaene antibiotic, V-28-3M
US2996435A (en) Process for producing azaserine
US2965547A (en) Process for the production of l-6-diazo-5-oxonorleucine
JP4235298B2 (ja) 抗生物質パレイン酸ａとその製造法
JPH10114777A (ja) 抗生物質スピロキシマイシンとその製造法
PL152518B1 (pl) Sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego A-21978C i jego czynników
IE45014B1 (en) Antibiotic a-7413 and process for preparation thereof
JPS6322799B2 (hu)
EP0195872A2 (en) Novel cell-cidal antibiotic 82-85-8A and its production

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628