PL152359B1

PL152359B1 - Method of obtaining derivatives of the a-21978c antibiotics

Info

Publication number: PL152359B1
Application number: PL1985255683A
Authority: PL
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1985-10-08
Publication date: 1990-12-31
Also published as: CS819286A3; PT81265A; ES8700862A1; CN85107552A; CS719885A3; FI853910A0; DK457585A; DK165757B; PH21217A; GR852432B; IL76608A0; AU5375290A; SG3292G; EP0178152B1; CS276978B6; JPS6192588A; AU634766B2; EP0178152A2; BG47040A3; ES8800362A1

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 359 POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 10 08 (P. 255683)

Int. Cl.⁵ C12P 21/04

Pierwszeństwo: 84 10 09 Stany Zjednoczone Ameryki

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 86 07 29

Opis patentowy opublikowano: 1991 06 28

CZYTELNIA

OGÓŁU

Twórcy wynalazku —

Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company,

Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania pochodnych antybiotyków A-21978C

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych antybiotyków A-21978C o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę C2-Ci4-alkanoilową, będących cyklicznymi peptydami.

Rodzina antybiotyków A-21978C to znakomite środki przeciwbakteryjne. Szczególnie ważną grupą pochodnych A-21978C są związki o wzorze przedstawionym na rysunku, ujawnione w opisie patentowym St.Zjedn. Am. nr 4 537 717. Dotychczas wytwarzano te pochodne w procesie wieloetapowym, który jest czasochłonny i drogi. Znany sposób wytwarzania pochodnych o wzorze przedstawionym na rysunku, takich jak pochodna n-dekanoilowa A-21978C, wymagał przeprowadzenia następujących etapów:

1/. Fermentacja szczepu wytwarzającego A-21978C; a) Inicjowanie procesu hodowlą z ampułki z ciekłym azotem, b) Etap pierwszego inokulum (48 godzin); c) Etap drugiego inokulum (24 godziny); d) Etap trzeciego inokulum (24 godziny); e) Fermentacja (140 godzin).

2/. Filtracja, adsorpcja na żywicy, elucja i zatężanie.

3/. Przygotowanie kompleksu zabezpieczonego grupą ΙΠ-rz.butoksykarbonylową (t-Boc).

4/. Zatężanie zabezpieczonego kompleksu.

5/. Fermentacja drobnoustroju dezacylującego, np. Actinoplanes utahensis: a) Inicjowanie procesu hodowlą z ampułki z ciekłym azotem; b) Etap pierwszego inokulum (72 godziny); c) Etap drugiego inokulum (48 godzin); d) Fermentacja (67 godzin).

6/. Dezacylacja kompleksu za pomocą drobnoustroju dezacyluj ącego.

7/. Filtracja, absorpcja na żywicy, elucja i zatężanie.

8/. Powtórne acylowanie.

9/. Hydroliza grupy zabezpieczającej.

10/. Końcowe oczyszczanie.

Sposób według wynalazku polega na tym, że do hodowli drobnoustroju wytwarzającego A-21978C podczas produkcyjnego stadium fermentacji (etap le), dodaje się kwas C2-Ci4-alkanokarboksylowy (związek o wzorze ROH, w którym R ma wyżej podane znaczenie) lub jego

152 359 ester lub sól, otrzymując odpowiedni związek o wzorze przedstawionym na rysunku. Sposób według wynalazku umożliwia bezpośrednie wytwarzanie pochodnych A-21978C. W sposobie tym etapy 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9 poprzednio omówionego znanego sposobu mogą być wyeliminowane. Ponadto, nowy sposób jest znacznie wydajniejszy w porównaniu z tym znanym sposobem. Tak więc nowy sposób ma duże zalety, gdyż obejmuje mniej etapów, zapewnia wyższą wydajność i jest mniej czasochłonny niż dotychczas.

Odpowiednimi drobnoustrojami wytwarzającymi A-21978C są szczepy Streptomyces roseosporus NRRL11379 (A-21978.6),NRRL 15998 (A-21978.65), mutant szczepu NRRL 11379. Szczepy te są zdeponowane w kolekcji szczepów Northern Regional Research Center, U.S. Departament of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, gdzie są one dostępne ogólnie pod numerami NRRL 11379 i NRRL 15998. Szczep S. roseosporus NRRL 11379 oraz warunki jego stosowania i wytwarzania antybiotyków A-21978C zostały opisane w opisie patentowym St.Zjed.Am. nr 4 331 594.

Aczkolwiek korzystne w sposobie według wynalazku są szczepy oznaczone symbolami A21978.6 lub A-21978.65, to również można stosować każdy szczep wytwarzający A-21978C. Specjaliści mogą ocenić, jakie szczepy są przydatne do tego celu.

Występującymi w naturze czynnikami A-21978C, opisanymi w opisie patentowym St.Zjedn. Am. nr 4 331 594, są czynniki Co, Ci, C2, C3, C4 i C5. W czynnikach Ci, C2, C3, C4 i C5 podstawnik R we wzorze przedstawionym na rysunku jest specyficzną grupę Cio-Ci2-alkanoilową. Czynnik Co kompleksu A-21978C, który jak sądzono zawierał rozgałęziony boczny łańcuch Cio-alkanoilowy, okazał się być mieszaniną dwóch składników w przybliżonym stosunku 2:1. Główny składnik zawiera rozgałęziony łańcuch boczny o 10 atomach węgla, a składnik pomniejszy zawiera prosty łańcuch boczny o 10 atomach węgla.

Dla wygody, przy omawianiu sposobu wytwarzania związku o wzorze przedstawionym na rysunku, nazywa się go także czynnikiem A-21978C. Poza występującymi w naturze czynnikami, do oznaczania czynników stosuje się liczby wskazujące długość łańcucha bocznego. Np. związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę oktanoilową, wytwarzany sposobem według wynalazku, określa się jako czynnik A-21978Ce.

Grupa alkilowa kwasu C2-Ci4-alkanokarboksylowego lub jego estru lub soli (substratu), stosowanego w sposobie według wynalazku, może być grupą o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym. W celu otrzymania występujących w naturze czynników Ci, C2 lub C3 kompleksu A-21978C można stosować np. kwas 8-metylokapronowy, 10-metylolaurynowy lub 10-metyloundecylowy kaprylowy lub ich estry lub sole. W sposobie według wynalazku zaleca się stosować kwasy C2-Ci4-alkanokarboksylowe o prostych łańcuchach lub ich estry lub sole, ze względu na ich dostępność i niższą cenę. Szczególnie korzystnym substratem jest kwas kaprynowy oraz jego estry i sole.

Gdy stosuje się ester kwasu C2-Ci4-alkanokarboksylowego, to korzystnie są to estry C1-C4alkilowe. W takim estrze grupa Ci-C4-alkilowa może być prosta lub rozgałęziona.

Przykładowymi odpowiednimi solami kwasów C2-Ci4-alkanokarboksylowych, które można stosować w sposobie według wynalazku, są sole metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, takie jak sól sodowa, potasowa, litowa, cezowa, rubidowa, barowa, wapniowa lub magnezowa. Odpowiednimi solami z aminami są sole amoniowe, pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowe sole Ci-C4-alkiloamoniowe i hydroksy-C2-C4-alkiloamoniowe.

Korzystnie, w procesie fermentacji stosuje się substrat w postaci jałowego roztworu. Szczególnie użytecznym rozpuszczalnikiem do tego celu jest oleinian metylu, chociaż mogą być stosowane także inne rozpuszczalniki, takie jak etanol, octan etylu i Ci-C4-estry nienasyconych kwasów tłuszczowych. Jeśli substrat jest odpowiednio płynny w temperaturze fermentacji, to można go dodawać bezpośrednio.

Szybkość dodawania substratu musi być dostatecznie mała, aby nie wywrzeć niekorzystnego wpływu na przebieg fermentacji, ale równocześnie dostatecznie duża dla zwiększenia wydajności pożądanego związku o wzorze przedstawionym na rysunku. Zalecana jest szybkość dodawania od około 0,05 do około 0,5 ml na litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę, korzystnie od około 0,1 do około 0,2 ml na litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę.

152 359

Substrat dodaje się podczas wzrostu szczepu wytwarzająego A-21978C w produkcyjnym stadium fermentacji rozpoczynając od około 15 do około 32 godziny i kontynuując dodawanie do zakończenia fermentacji. Substrat można dodawać różnymi metodami, lecz korzystnie metodą najlepiej zapewniającą przepływ ustalony. Po zakończeniu fermentacji wytworzony związek o wzorze przedstawionym na rysunku można wyodrębniać znanymi metodami (patrz np. opis patentowy St.Zjedn.Am. nr 4 331 594).

W szczególności, sposób wytwarzania antybiotyków A-21978C prowadzi się przy pomocy nowego szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998. Hodowlę szczepu prowadzi się w warunkach podpowierzchniowej fermentacji aerobowej aż do uzyskania znacznego poziomu antybiotyków A-21978C. Kompleks antybiotyczny A-21978C można ekstrahować z brzeczki fermentacyjnej i z grzybni polarnymi rozpuszczalnikami organicznymi. Poszczególne czynniki A-21978C można też rozdzielać i dalej oczyszczać znanymi metodami, np. metodą chromatografii kolumnowej.

Zazwyczaj drobnoustrój wyizolowany ze źródeł naturalnych („dziki) wytwarza antybiotyk z małą wydajnością. Często wytwarzanie antybiotyków nie przebiega prawidłowo, zatem szczep o zwiększonej aktywności oraz szczepy powtarzalnie wytwarzające antybiotyki przedstawiają wielką wartość.

Sposób według wynalazku jest znacznie ulepszonym sposobem wytwarzania antybiotyków A-21978C na drodze hodowania szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998 lub jego wytwarzającego A-21978C mutanta, warianta lub rekombinanta, w pożywce hodowlanej zawierającej przyswajalne źródła węgla, azotu i sole nieorganiczne w warunkach pozapowierzchniowej fermentacji aerobowej, aż do wytworzenia antybiotyków A-21978C. Kompleks antybiotyczny A-21978C lub poszczególne czynniki można wyodrębniać stosując różne znane metody wyodrębniania i oczyszczania.

Drobnoustrój stosowany w tej części wynalazku oznaczono symbolem A-21978.65. Szczep ten uzyskano drogą selekcji i mutacji z drobnoustroju oznaczonego symbolem A-21978.6 (NRRL 11379). Szczep A-21978.6, zbadany i scharakteryzowany przez Fredericka P.Mertza i Ralpha E.Kastnera z Lilly Research Laboratories, pochodzi z macierzystego szczepu wyizolowanego z gleby z góry Ararat w Turcji. Szczep A-21978.6 został sklasyfikowany jako nowy szczep Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias i Dalia Maia, 1961. Klasyfikacji dokonano na podstawie porównania z opublikowanymi opisami (R.E.Buchanan i N.E.Gibbons, „Bergey's Manuał of Determinative Bacteriology“. The Williams and Wilkins Company, wydanie 8, 1974; oraz E.B.Shirling i D. Gottlieb, „Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces, Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 808-809/1972/).

Klasyfikację oparto na metodach zalecanych dla „International Streptomyces Project [E.B.Shirling i D.Gottlieb, „Methods of Characterization of Streptomyces Species, Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 16, 313-340 /1966/] oraz na różnych dodatkowych testach. Przyswajanie węgla oznaczano na pożywce podstawowej ISP nr 9, do której dodano źródła węgla do końcowego stężenia 1,0%. Źródła węgla wyjałowiono przez sączenie, a pożywkę podstawową wyjałowiono w autoklawie. Płytki były gotowe po 14 dniach inkubowania w temperaturze 30°C. Cukry ściany komórkowej oznaczano stosując zmodyfikowaną metodę Lechevaliera (M.P. Lechevalier, „Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera. Praca sponsorowana była przez Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, przewodniczący dr Thomas G. Pridham; prowadzona w Institute of Microbiology, Rutgers University, The State Uniwersity of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971/. Izomer kwasu dwuaminopimelinowego oznaczano metodą Beckera i wsp.[B.Becker i wsp. [B.Becker i wsp., „Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Celi Hydrolysates, Appl. Microbiol., 11,421-423/1964]. Analizę aminokwasów przeprowadzono na przemytych fragmentach ściany komórkowej. Pigmenty melanoidowe oznaczano stosując pożywkę ISP nr 1 (trypton z wyciągiem drożdżowym), ISP nr 6 (agar żelazowy z peptonem i wyciągiem drożdżowym), ISP nr 7 (agar tyrożynowy), ISP nr 7 zmodyfikowana (ISP nr 7 bez tyrozyny) oraz próbę tyrozynową [Yuzuru Mikami i wsp., „Modified Arai and Mikani Melamin Formation Test of Streptomyces, Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 27/3/, 290/1977/]. Hydrolizę skrobi badano testując jodem na obecność skrobi.

152 359

1	2		3
9	P: brak; W: słaby; Brak rozpuszczalnego pigmentu	bladoiółtobrązowa	P. obfity; W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/ 5cb szarożółtoróżowa [11D4] szarawożółta
10	P: brak; W: umiarkowany; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	[7L12] umiarkowanie czerwono-brązowa	P. słaby; W: słaby; Bladożółto-zielony rozpuszczalny pigment	/W/a biała bladożółtozielona
11	P: słaby; W: słaby;	/W/a biała biaława	P; brak; W: brak;
12	P: słaby, W: obfity; Brak rozpuszczalnego pigmentu	[13L6]	P obfity; W: obfity; , Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/R/5ck gy. żółto-różowy [1115] gy. żółta *
13	P: dobry; W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	/W/b biała [12B2}gy. żółta	P umiarkowany; W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	W/h biała [12B2] bladożółtozielona
14	P: słaby; W:: obfity; Brązowy rozpuszczalny pigment	[8L12] ciemna gy. brązowa	P: obfity; W: obfity; Jasnobrązowy rozpuszczalny pigment	/W A biała [10G3] jasnożółta
15	P: brak; W: słaby; Brak rozpuszczalnego pigmentu	bladożółtotzara	P: umiarkowany; W: dobry; Brak rozpuszczalnego pigmentu	/WAbiała bladożółtotzara
16	P: obfity; W: obfity; Brązowy rozpuszczalny pigment	/R/5ck gy. żółto-różowa [8L12]dk.gy. brązowa	P obfity; W: obfity; Brązowy rozpuszczalny pigment	/R/5cbgy.żółto-różowa [12L7] żółtobrązowa

Tabela 3

Substrat	Przyswajanie węgla
A-21978.6	S.roseosporus
L-arabinoza	+	+
D-fruktoza	+	—
D-galaktoza	+	+
D-glukoza	+	+
i-Inozytol	—	—
D-mannitol	+	— '
D-rafinoza	—	—
L-ramnoza	+	+
Salicyna	+	+
Sacharoza	—	—
D-ksyloza	+	+
Tabela 4

Charakterystyka	A-21978.6	S. roseosporus
Pigmenty malanoidowe
ISP nr 1 (trypton - wyciąg drożdżowy)	—	— .
ISP nr 6 (pepton - wyciąg drożdżowy,	—	—
agar żelazowy
ISP nr 7 (agar tyrozynowy)	—	—
ISP nr 7 zmodyfikowana/ISP nr 7 bez	—	—
tyrozyny
Próba tyrozynowa	—	. —
Upłynnianie żelatyny	+	+
Działanie na mleko zbierane	słaba hydroliza	słaba hydroliza
Hydroliza skrobi	+	+
Zakres pH	5-11	5-11
Zakres temperatury	25-40°C	25-45°C
Redukcja azotanów, wzrost do stężenia	10%	6%

Tabela 5

Antybiotyk	Stężenie na krążku	Klasa	Wrażliwość na antybiotyki
A-21978.6	S.roseosporus
Erytromycyna	15 pg	makrolid	4-	+
Cefalotyna	30 pg	/Maktam	+	+
Linkomycyna	2pg	glikozyd	— .	—
Nystatyna	100 j.	polien	—	— ~ ·
Polimyksyna B	300j.	peptyd	+	—
Streptomycyna	10 pg.	aminoglikozyd	+	+
Tetracyklina	30pg	tetracyklina	+	+
Wankomycyna	30 pg	glokopeptyd	+	+

Pewne cechy szczepu A-21978.6 różnią się od cech opisanych dla S.roseosporus. Hodowlą szczepu A-21978.6 różni się od opisanego szczepu pod względem wielkości zarodników, wzrostu na marchwi i ziemniakach, tolerancji NaCl i redukcji azotanów.

Szczep A-21978.65 posiada cechy identyfikacyjne takie jak szczep A-21978.6, ale różni się pod względem ilości wytwarzanych antybiotyków A-21978C. Wcześniejszy szczep wytwarza w najlepszym przypadku nie więcej niż 100pg antybiotyków A-21978C w mililitrze brzeczki fermentacyjnej. Ulepszony szczep A-21978.65 wytwarza co najmniej 2,5 razy większą ilość w fermentatorach i aż 18 razy więcej podczas fermentacji w kolbach trzęsawkowych. Ta zwiększona zdolność wytwarzania A-21978C przez nowy szczep umożliwia otrzymywanie tych antybiotyków w znacznie lepszy sposób.

Jak to ma miejsce i w przypadku innych drobnoustrojów, cechy nowego szczepu wytwarzającego A-21978C, Streptomyces roseosporus NRRL15998, podlegają wariacjom. Rekombinanty, warianty i mutanty szczepu NRRL 15998 mogą być otrzymywane drogą działania różnymi znanymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promieniowanie UV, promieniowanie rentgenowskie, fale wysokiej częstotliwości, promieniowanie radioaktywne oraz czynniki chemiczne. Naturalne i indukowane warianty, mutanty i rekombinanty szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998, które zachowują zdolność wytwarzania z wysoką wydajnością antybiotyków A-21978C, mogą być również stosowane w sposobie według wynalazku.

Jako pożywkę dla wzrostu szczepu Streptomyces roseosporus NRRL 15998 można stosować dowolną wielu pożywek. Niektóre pożywki są jednak korzystne ze względu na ekonomikę procesu, optymalną wydajność i łatwość izolowania produktu. Np., korzystnym źródłem węgla w fermentacji w wielkiej skali jest dekstryna z tapioki, chociaż można również stosować glukozę, fruktozę, galaktozę, maltozę, olej z nasion bawełny, oleinian metylu, glicerynę, rafinowany olej sojowy i podobne. Korzystnym źródłem azotu jest enzymatyczny hydrolizat kazeiny, ale można także stosować rozpuszczalny pepton mięsny, mąkę sojową, hydrolizat sojowy, śrutę sojową, drożdże, aminokwasy, takie jak L-asparagina i DL-leucyna, i podobne. Do odżywczych soli nieorganicznych, które można dodawać do pożywek hodowlanych, należą rozpuszczalne sole zawierające jony potasowe, amoniowe, chlorkowe, siarczanowe, azotanowe i podobne. Szczególnie przydatny dla wytwarzania antybiotyków jest siarczan potasowy. Także przydatne są suszona melasa, dializat suszonej melasy i syntetyczne mieszanki mineralne.

W procesie wytwarzania antybiotyków A-21978C korzystne jest stosowanie destylowanej lub dejonizowanej wody, gdyż niektóre związki nieorganiczne zawarte w wodzie wodociągowej, np. zawierające jony wapnia i węglanowe, wydają się przeszkadzać wytwarzaniu antybiotyków.

Do pożywki trzeba dodawać podstawowe mikroelementy niezbędne dla wzrostu i rozwoju drobnoustroju. Zazwyczaj jednak te mikroelementy towarzyszą w postaci zanieczyszczeń innym składnikom pożywki w ilościach wystarczających na pokrycie wymagań wzrostowych drobnoustroju.

Może być niezbędne dodawanie małych ilości (np. 0,2ml/litr) środka przeciwpieniącego, takiego jak gligol polipropylenowy, w tym przypadku fermentacji w wielkiej skali, jeśli powstaje problem pienienia.

W przypadku wytwarzania znacznych ilości antybiotyków A-21978C korzystnie prowadzi się podpowierzchniową fermentację aerobową w fermentorach. Natomiast małe ilości antybiotyków

152 359

A-21978C można otrzymywać w hodowli w kolbach trzęsawkowych. Ze względu na opóźnienie w wytwarzaniu antybiotyku, zwykle związane ze szczepieniem dużych fermentorów zarodnikującą postacią drobnoustroju, korzystne jest stosowanie inokulum wegetatywnego. Inokulum wegetatywne przygotowuje się przez zaszczepienie małej ilości pożywki zarodnikującą postacią lub fragmentami grzybni drobnoustroju. Otrzymuje się w ten sposób świeżą, znajdującą się w fazie wzrostu hodowlę drobnoustroju. Inokulum wegetatywne przenosi się następnie do większego fermentora.

Nowy szczep wytwarzający A-21978C może wzrastać w zakresie temperatury od około 20°C do około 40°C. Optymalną wydajność A-21978C uzyskuje się w temperaturze około 30-32°C.

Jak to zwykle ma miejsce w procesach podpowierzchniowej hodowli aerobowej, przez pożywkę przepuszcza się jałowe powietrze. Dla zapewnienia efektywnego przebiegu procesu wytwarzania antybiotyków A-21978C, procent nasycenia powietrzem w fermentorach powinien być wyższy od 20%, korzystnie powyżej 30% (w temperaturze 30°C i pod ciśnieniem około 98,1 kPa).

W hodowli w fermentorach korzystne jest utrzymywanie wartości pH pożywki w zakresie około 6,5-7,0. Uzyskuje się tą drogą dodawania odpowiednich ilości, np. wodorotlenku sodowego we wcześniejszych stadiach oraz kwasu solnego w późniejszych stadiach.

Powstawanie antybiotyków A-21978C można śledzić w czasie fermentacji pobierając próbki brzeczki lub ekstraktów grzybni i oznaczając aktywność antybiotyczną wobec drobnoustrojów wrażliwych na te antybiotyki. Jednym z drobnoustrojów, użytecznych do testowania wytwarzanych antybiotyków jest Micrococcus luteus. Badanie biologiczne prowadzi się korzystnie stosując krążki bibułowe na płytkach z agarem.

Alternatywnie, stałe składniki pożywki, w tym zawierające grzybnię, można stosować bez ekstrakcji lub wyodrębniania, ale korzystnie po usunięciu wody, jako źródło antybiotyków A21978C. Np., po zakończeniu produkcji antybiotyków A-21978C brzeczkę można liofilizować i stosować bezpośrednio jako dodatek do przedmieszek paszowych.

Związki o wzorze przedstawionym na rysunku są doskonałymi środkami przeciwbakteryjnymi.

Sposób według wynalazku ilustrują przykłady.

Przykład I. Wytwarzanie kompleksu A-21978C. Przygotowano hodowlę podstawową i utrzymywano ją w parach ciekłego azotu. Streptomyces roseosporus NRRL 15998, utrzymywany uprzednio w parach ciekłego azotu, stosowano do zaszczepienia 50 ml pożywki wegetatywnej o następującym składzie.

Składnik Ilość (%)

Bulion tryptykazowo-sojowy* 3,0

Dekstryna 2,5

Woda dejonizowana 94,5 ^xBaltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD.

Zaszczepioną pożywkę inkubowano w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, na trzęsawce obrotowej o skoku około 5 cm i 250 obrotach/minutę. Dojrzałą hodowlę wegetatywną rozlano do wielu pojemników, po 0,5 ml /pojemniki przechowywano w parach ciekłego azotu.

W celu uzyskania większej jednorodnej ilości materiału, jeden mililitr hodowli utrzymywanej w ciekłym azocie stosowano do zaszczepienia 80 ml powyżej opisanej pożywki wegetatywnej. Zaszczepioną pożywkę wegetatywną inkubowano w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 ml, w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin, na trzęsawce obrotowej o skoku około 5 cm, przy 250 obrotach/minutę.

Dziesięć mililitrów powyższej hodowli stosowano do zaszczepienia 450 ml wegetatywnej pożywki wzrostowej drugiego stadium o takim samym składzie jak opisana powyżej pierwsza pożywka wegetatywna. Pożywkę w drugim stadium inkubowano w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 litrów, w ciągu 24 godzin, w temperaturze 30°C, na trzęsawce obrotowej o skoku 5 cm, przy 250 obrotach/minutę.

152 359 9

Jeden litr wegetatywnej hodowli z drugiego stadium stosowano do zaszczepienia 39 litrów jałowej pożywki wzrostowej trzeciego stadium o następującym składzie.

Składnik	Ilość %
Mąka sojowa	0,5
Wyciąg drożdżowy®	0,5
Glukonian wapniowy	1,0
KCl^b	0,02
MgSO₄-7H₂O^b	0,02
FeSO₄-7H₂O^b	0,0004
Sag 471 (środek przeciwpieniący)⁰	0,03
Woda	97,9296

'Difaco Laboratories, Detroit MI 'Roztwór zawierający pierwiastki śladowe przygotowano następująco: FeSO<*7H2O (7,6 g) rozpuszczono w 76 ml stężonego kwasu solnego, dodano 380 g MgSO₄‘7HiO,380g KCI i wodę dejonizowaną do objętości 3800 ml. Aby zapewnić właściwą ilość pierwiastków, stosowano 80 ml roztworu na 39 litrów pożywki wzrostowej trzeciego stadium.

'Union Carbide, Danbury CT.

Zaszczepioną pożywkę inkubowano w ciągu 24 godzin w fermentorze ze stali nierdzewnej w temperaturze 30°C, napowietrzając jałowym powietrzem z szybkością 0,85 objętości na objętość na minutę i mieszając typowym mieszadłem przy 350-350 obrotach/minutę. W fermentorze utrzymywano nadciśnienie około 34,5 kPa.

Jeden litr inkubowanego inokulum z trzeciego stadium stosowano do zaszczepiania 119 litrów jałowej pożywki produkcyjnej o następującym składzie.

Składnik Ilość (%)

Mąka sojowa 2,2

Fe/NH4/₂SO4-6H₂O 0,066

Dekstroza 0,825

Sag 471 0,022

Dekstryna ziemniaczana 3,3

Melasa 0,275

Woda wodociągowa 93,312

Wartość pH skorygowano do 7,0 po dodaniu pierwszych dwóch składników i powtórnie po dodaniu wszystkich składników, bezpośrednio przed sterylizacją.

Zaszczepioną pożywkę produkcyjną inkubowano w ciągu 6 dni w nierdzewnym stalowym fermentorze w temperaturze 30°C i napowietrzano jałowym powietrzem z szybkością 0,5 objętości objętość na minutę. Mieszano typowym mieszadłem przy 250 obrotach/minutę do piętnastej godziny i przy 350 obrotach/minutę po 15 godzinie. Wartość pH utrzymywano na poziomie 6,5 lub powyżej dodając roztwór wodorotlenku amonowego. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 0,282 g/litr brzeczki po zakończeniu fermentacji. Zawartość poszczególnych czynników podano w tabeli 6.

Przykład II. Wytwarzanie A-21978Ce. Pierwsze, drugie i trzecie stadia hodowli prowadzono tak jak to opisano w przykładzie I. Stadium produkcyjne rozpoczęto jak w przykładzie I, z tym, że poczynając od 28 godziny dodawano jałowy roztwór 50% objętościowych kwasu kaprylowego i 50% objętościowych oleinianu metylu z szybkością 0,13 ml/litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę i dodawanie z taką szybkością kontynuowano do zakończenia fermentacji w 144 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 1,255 g/litr brzeczki, co odpowiada zwiększeniu o 445% w porównaniu z przykładem I. Czynnik A-21978Ce (związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę oktanoilową) stanowił 9% całości kompleksu otrzymanego tą metodą. Nie wykryto natomiast czynnik A-21978Ce w kompleksie A-21978C wytworzonego sposobem opisanym w przykładzie I.

Przykład III. Wytwarzanie A-21978Ce. Pierwsze, drugie i trzecie stadia hodowli prowadzono tak jak opisano w przykładzie I. Stadium produkcyjne rozpoczęto jak w przykładzie I, z tym, że poczynając od 28 godziny dodawano jałowy roztwór zawierający 25% (objętość na objętość) kwasu pelargonowego i 75% oleinianu metylu z szybkością 0,13 ml/litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę i dodawanie z taką szybkością kontynuowano do zakończenia fermentacji w 144 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 0,821g/litr brzeczki, co odpowiada zwiększeniu wydajności o 293% w porównaniu z przykładem I. Czynnik A-21978C» (związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę nonanoilową) stanowił 10% całości kompleksu

152 359

A-21978C otrzymanego tą metodą. Nie wykryto natomiast czynnik A-21978Cg w kompleksie A-21978C wytworzonym sposobem opisanym w przykładzie I.

Przykład IV. Wytwarzanie czynnika A-21978Cio (związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę n-dekanoilową). Pierwsze i drugie stadium wzrostu wegetatywnego prowadzono jak w przykładzie I. W trzecim stadium stosowano 800 ml inokulum z drugiego stadium do zaszczepienia 950 litrów jałowej pożywki wzrostowej w etapie trzecim, mający następujący skład.

Składnik	Ilość (%)
Dekstroza	2,0
Węglan wapniowy	0,2
Mąka sojowa	2,0
Wyciąg drożdżowy	0,1
KCl^a	0,02
MgSO₄-7H₂O^a	0,02
FeSO₄-7H₂O^a	0,0004
Sag 471 (środek przeciwpieniący)	0,02
Woda	95,6396

^aRoztwór zawierający pierwiastki śladowe przygotowano tak jak w przykładzie I.

Zaszczepioną pożywkę inkubowano w ciągu 24 godzin w stalowym nierdzewnym fermentorze w temperaturze 30°C, napowietrzano jałowym powietrzem z szybkością 0,8 objętości na objętość na minutę i mieszano za pomocą typowego mieszadła. Jeden litr tego inokulum z trzeciego stadium stosowano do szczepienia 119 litrów pożywki produkcyjnej o składzie podanym w przykładzie I. Stadium produkcyjne inicjowano również jak w przykładzie I, z tym tylko, że poczynając od 28 godziny dodawano jałowy roztwór zawierający 50% objętościowych kwasu kaprynowego i 50% objętościowych oleinianu metylu z szybkością 0,26 ml/litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę i dodawanie z taką szybkością kontynuowano do zakończenia fermentacji w 283 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 1,94 g/litr brzeczki, co odpowiada zwiększeniu wydajności o 68% w porównaniu z przykładem I. Stężenie czynnika A-21978Cio (związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę n-dekanoilową) wynosiło 1,63 g/litr, czyli 84% całości kompleksu A-21978C. Było więc ono o 13583% wyższe niż stężenie czynnika A-21978Cio wytworzonego sposobem opisanym w przykładzie I.

Przykład V. Wytwarzanie A-21978Cio (sposób alternatywny). Pierwsze, drugie i trzecie stadia hodowli prowadzono w sposób podany w przykładzie I. Stadium produkcyjne rozpoczęto też według przykładu I, z tym tylko, że poczynając od 28 godziny dodawano jałowy roztwór zawierający 25% objętościowych estru etylowego kwasu kaprynowego i 75% objętościowych oleinianu metylu z szybkością 0,13 ml/litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę i dodawanie z taką szybkością kontynuowano do zakończenia fermentacji w 144 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 1,022 g/litr, co odpowiada zwiększeniu wydajności o 362% w porównaniu z przykładem I. Stężenie czynnika A-21978Cw wynosiło 0,202 g/litr, czyli 20% całości kompleksu A-21978C. Było więc ono o 168% wyższe niż stężenie czynnika A-21978Cio w przykładzie I.

Przykład VI. Wytwarzanie A-21978Cio (sposób alternatywny). Pierwsze i drugie stadium wzrostu wegetatywnego prowadzono jak w przykładzie I. W trzecim stadium inokulum hodowano jak w przykładzie IV, z tym tylko, że objętość pożywki wynosiła 1900 litrów, a czas hodowania przedłużono do 48 godzin. Szybkość napowietrzania wynosiła 0,3 objętości na objętość na minutę od 0 do 24 godziny, 0,45 objętości na objętość na minutę od 24 do 40 godziny oraz 0,90 objętości na objętość na minutę od 40 do 48 godziny. Stadium produkcyjne inicjowano jak w przykładzie I. W 23 godzinie dodano do fermentora jałową zawiesinę 0,004% wyciągu drożdżowego. Począwszy od 36 godziny dodawano roztwór gliceryny i kaprynianu amonowego z szybkością 0,84 ml/litr brzeczki fermentacyjnej na minutę. Roztwór zawierał 3600g gliceryny, 9000 ml wody dejonizowanej, 1 litr kwasu kaprynowego i 620 ml stężonego roztworu wodorotlenku amonowego. Dodawanie kontynuowano z powyżej podaną szybkością do zakończenia fermentacji w 143 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła l,772g/litr, co odpowiada zwiększeniu wydajności o 628% w porównaniu z przykładem I. Stężenie czynnika A-21978Cio wynosiła 0,739 g/litr, czyli 42% całości kompleksu A-21978C. Było więc ono o 6158% wyższe niż stężenie A-21978Cio w przykładzie I.

152 359

Przykład VII. Wytwarzanie A-21978Cn. Pierwsze, drugie i trzecie stadium inokulum prowadzono jak w przykładzie I. Stadium produkcyjne inicjowano jak w przykładzie I, z tym tylko, że począwszy od 28 godziny dodawano jałowy roztwór 25% objętościowych kwasu undekanowego i 75% objętościowych oleinianu metylu z szybkością 0,13ml/litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę aż do zakończenia fermentacji w 144 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 1,62 g/litr, co odpowiada zwiększeniu wydajności o 574% w porównaniu z przykładem I. Stężenie czynnika A-21978Gii (związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę undekanoilową) wynosiło 0,70 g/litr, czyli 43% całości kompleksu A-21978C. Czynnik A21978Cu nie został wykryty w kompleksie A-21978C otrzymanym w przykładziel.

Pr z y kła d VIII. Wytwarzanie A-21978C5. Pierwsze, drugie i trzecie stadium hodowli inokulum prowadzono jak w przykładziel. Stadium produkcyjne rozpoczęto też jak w przykładziel, z tym tylko, że począwszy od 28 godziny rozpoczęto dodawanie jałowego roztworu zawierającego 25% objętościowych kwasu laurynowego i 75% objętościowych oleinianu metylu z szybkością 0,13ml/litr brzeczki fermentacyjnej na godzinę. Dodawanie kontynuowano z tą szybkością do zakończenia fermentacji w 144 godzinie. Wydajność kompleksu A-21978C wynosiła 1,12 g/litr, co odpowiada zwiększeniu wydajności o 400% w porównaniu z przykładem I. Stężenie czynnika A-21978Cs (związek o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę dodekanoilową) wynosiło 0,372 g/litr, czyli 33% kompleksu A-21978C. Było więc ono o 5314% wyższe niż stężenie w kompleksie Ą-21978C otrzymanym w przykładzie I.

Tabela 6 ilustruje zależność składu kompleksu A-21978C od stosowanych różnych substratów lipidowych.

Tabela 6

Przykład	Substrat -	Składnik A-21978C (//g/ml) a, b
Ci	C₂	C₃	Ce	Ce	Ce	Cio	Cu
I	Brak	77	113	72	7	-	-	12®	-
II	Kwas kaprylowy	276	312	214	175	113	-	170	-
III	Kwas pelargonowy	147	177	125	192	-	83	90	-
IV	Kwas kaprynowy	135	50	48	77	-	-	1630^d	-
V	Ester etylowy kwasu kaprynowego	168	246	156	251			202^d
VI	Kaprynian amonu	335	371	228	98	-	-	739^d	-
VII	Kwas undecylowy	163	206	158	273	-	-	118	700
VIII	Kwas laurynowy	204	236	141	372	-	-	173	-

“Stężenie składników antybiotycznych w przesączonej brzeczce oznaczano metodą cieczowej chromatografii ciśnieniowej; poszczególne składniki wykrywano na podstawie aborcji w świetle ultrafioletowym.

^bCo, Ci, C₃ i C9 są występującymi w naturze czynnikami A-21978C; Ce, Cs, 10 i Cu są to związki o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza odpowiednio grupę Cs-, Cs-, Cio- i Cu-acylową.

®Naturalny czynnik Co.

^dStwierdzono, żc otrzymany produkt był przede wszystkim związkiem o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupę n-dekanoilową.

Przykład IX. Alternatywny sposób wytwarzania kompleksu A-21978C. Kompleks A21978C wytworzono sposobem opisanym w przykładziel, lecz stosując szczep Streptomyces roseosporus NRRL 11379.

Przykład X. Wytwarzanie A-21978Cio (sposób alternatywny). Wytworzono czynnik A21978C sposobem opisanym w przykładzie VI, lecz stosując szczep Streptomyces roseosporus NRRL 11379.

Przykład XI. Wytwarzanie kompleksu A-21978C w hodowli w kolbach na trzęsawce. Postępowano tak jak opisano w przykładzie I, lecz stosując do hodowli w kolbach na trzęsawce następującą pożywkę do fermentacji.

Składnik Ilość (g/litr)

Glukoza 7,5 ·

Dekstryna 30

Enzymatyczny hydrolizat kazeiny¹* 5

Pepton® 5

Melasa 2,5

Woda dejonizowana do 1 litra *Stadex 11, A.E.Staley Co., Decatur IL *NZ Aminę A, Humko Sheffield Chemical, Lyndurst NJ ^cBiosate, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD

152 359

Wydajność kompleksu A-21978C po fermentacji wynosiła 1800mkg/ml brzeczki.

Przykład XII. Wytwarzanie kompleksu A-21978C i jego czynników w różnych warunkach. Postępowano zasadniczo tak jak w poprzednich przykładach, stosując dwa różne szczepy drobnoustroju NRRL 15998 i wprowadzając następujące zmiany.

Prekursor wprowadzono w kwasie oleinowym w stężeniu 50% objętościowych, z taką szybkością by uniknąć jego nadmiaru. W celu wytworzenia odpowiedniego inokulum szczepu A21978.6 stosowano stadium hodowli na skosie z użyciem takiej samej pożywki jak w stadium wytwarzania pierwszego inokulum, lecz zestalonej agarem. Po inkubacji przez 7 dni w 30°C połowę hodowli z powierzchni skosu użyto do zaszczepienia pożywki w stadium wytwarzania pierwszego inokulum.

Przeprowadzono szereg doświadczeń w różnych warunkach temperatury i pH. Uzyskane wyniki podano w tabelach 7-10. Tabele 7 i 8 ilustrują wpływ odpowiednio pH i temperatury na przebieg procesu wytwarzania kompleksu A-21978 i jego czynnika LY146032 (wzór, w którym R oznacza n-kaprynoil), w przypadku użycia szczepu A-21978.6, a tabele 9 i 10 ilustrują wpływ pH i temperatury na przebieg procesu w przypadku użycia szczepu A-21978.65.

Tabela 7

PH	Czas (godziny)	Stężenie (//g/ml)	% LY 146032
5,5	116	165	30
6,0	140	453	56
6,5	140	542	49
7,0	140	493	20
7,5	140	429	17
8,0	116	50	38

Tabela 8

Temperatura (°C)	Czas (godziny)	Stężenie (//g/ml)	% LY 146032
25	140	291	41
27	140	243	36
31	117	599	43
32	140	592	39
34	140	588	50

Tabela 9

pH	Czas (godziny)	Stężenie (//g/ml)	% LY146032
5,5	139	12	58
6,0	115	1153	28
6,5	139	1603	61
7,0	139	1526	58
7,5	139	1560	59
8,0	115	121	35

Tabela 10

Temperatura (°C)	Czas (godziny)	Stężenie (//g/ml)	% LY 146032
25	115	462	60
27	138	1188	50
30	138	1556	67
31	138	1730	47
32	138	1221	58
34	115	477	23

152 359

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania pochodnych antybiotyków A-21978C o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza C2-Ci4-alkanoilową, drogą fermentacji z użyciem szczepu wytwarzającego A-21978C filtracji, adsorpcji na żywicy, elucji i zatężenia oraz oczyszczania, znamienny tym, że do hodowli drobnoustroju wytwarzającego A-21978C dodaje się odpowiedni kwas C2-i4-alkanokarboksylowy lub jego ester lub sól.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kwas C2-Ci4-alkanokarboksylowy.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się ester Ci-C4-alkilowy kwasu C2-14-alkanokarboksylowego.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sól kwasu C2-14-alkanokarboksylowego.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że stosuje się kwas kaprynowy lub jego ester lub sól.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kwas C2-i4-alkanokarboksylowy stosuje się kwas kaprylowy, kwas pelargonowy, kwas undecylowy, kwas laurynowy albo ich estry lub sole.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drobnoustrój wytwarzający A-21978C stosuje się Streptomyces roseosporus NRRL 11379 lub jego mutant, wariant albo rekombinat.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako drobnoustrój stosuje się Streptomyces roseosporus NRRL 15998 lub wytwarzający A-21978C mutant, wariant albo rekombinat tego szczepu.

Wzór