CS276978B6 - Process for preparing a-21978c antibiotic derivative - Google Patents

Process for preparing a-21978c antibiotic derivative Download PDF

Info

Publication number
CS276978B6
CS276978B6 CS857198A CS719885A CS276978B6 CS 276978 B6 CS276978 B6 CS 276978B6 CS 857198 A CS857198 A CS 857198A CS 719885 A CS719885 A CS 719885A CS 276978 B6 CS276978 B6 CS 276978B6
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
culture
fermentation
medium
hours
nrrl
Prior art date
Application number
CS857198A
Other languages
English (en)
Other versions
CS719885A3 (en
Inventor
Floyd Milton Huber
Richard Louis Pieper
Anthony Joseph Tietz
Tom Edward Eatom
Lynda Maxine Ford
Otis Webster Gofrey Jr
Mary Louise Braun Huber
Milton Joseph Zmijewvski
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of CS719885A3 publication Critical patent/CS719885A3/cs
Publication of CS276978B6 publication Critical patent/CS276978B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Description

Způsob výroby derivátů antibiotika A-21978C obecného vzorce I, kde R znamená alkanoylovou skupinu o 2 až 14 atomech uhlíku, pěstováním mikroorganismu v živném prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submersní kultuře za aerobních podmínek, tím, že se v živném prostředí pěstuje Streptomyces reseosporus NRRL 15998 nebo NRRL 11379 a do živného prostředí se přivádí v množství 0,6 až 5 ml na 1 litr živného prostředí odpovídající alkankyselina o 2 až 14 atomech uhlíku, jeji alkylester s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo její sůl s alkalickým kovem, kovem alkalických zemin nebo amonná sůl, kultura se pěstuje při teplotě 30 až 40 ‘C a pH 6,5 až 7,0 a výsledný produkt se ze živného prostředí popřípadě izoluje.
•=o
Vynález se týká zlepšeného způsobu výroby derivátů A-21978C cyklických peptidových antibiotik vzorce I
(I) kde R znamená alkanoylovou skupinu o 2 až 14 atomech uhlíku, pěstováním mikroorganismu v živném prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submersní kultuře za aerobních podmínek, vyznačující se tím, že se v živném prostředí pěstuje Streptomyces roseosporus NRRL 15998 nebo NRRL 11379 a do živného prostředí se přivádí v množství 0,5 až 5 ml na 1 litr živného prostředí odpovídající alkankyselina o 2 až 14 atomech uhlíku, její alkylaster s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo její sůl s alkalickým kovem, kovem alkalických zemin nebo amonná sůl, kultura se pěstuje při teplotě 20 až 40°C a pH 6,5 až 7,0 a výsledný produkt ze živného prostředí popřípadě izoluje. Výhodami tohoto způsobu je to, že
1/ je zahrnuto méně stupňů než ve známém způsobu,
2/ výtěžek produktu je zvýšen a
3/ je zapotřebí méně času.
Skupina antibiotik A-21978C jsou výborná antibakterální činidla. Zejména významnou skupinou derivátů A-21978C jsou látky vzorce 1/ viz také Bernard J. Abbott, David S. Fukuda a Manuel Debono, U.S. patent č. 4 437 717 /. Dříve příprava těchto derivátů vyžadovala mnohastupňový způsob, jenž byl náročný na čas, vedl ke ztrátám výtěžku a byl drahý. Tento vynález poskytuje zlepšený jednostupňový způsob výroby derivátů A-21978C. Předchozí způsoby pro přípravu derivátů vzorce I, jako je n-dekanoylderivát A-21978C vyžadoval následující stupně:
1. Fermentace kultury, produkující A-21978C
a. Zahájení s ampulí v tekutém dusíku
b. primární inokulační stadium (48 hodin)
c. sekundární inokulační stadium (24 hodin)
d. terciární anokulační stadium (24 hodin)
e. fermentace (140 hodin)
2. Filtrace, adsorpce na pryskyřici s elucí, a koncentrace
3. Příprava t-Boc (t-butoxykarbonylchráněného) komplexu
4. Koncentrace chráněného komplexu
5. Fermentace deacylující kultury s použitím například Actinoplanes utahensis
a. Zahájení s ampulí v tekutém dusíku
b. Primární inokulační stadium (7 2 hodin)
c. Sekundární inokulační stadium (48 hodin)
d. Fermentace (67 hodin)
6. Deacylace komplexu s pomocí deacylující kultury
7. Filtrace, adsorpce na pryskyřici s elucí a koncentrace
8. Reacylace
9. Hydrolýza ochranné skupiny
10. Konečné čištění
Nynější nový způsob pozůstává z přidání alkankyseliny o 2 až 14 atomech uhlíku (ROH sloučenina, kde R je jak svrchu definováno), nabo esteru nebo její soli ke kultuře produkující A-21978C v průběhu výrobního stadia fermentace (stupeň le), aby vznikla sloučenina odpovídající vzorci I. Při tomto způsobu stupně 3,4, 5, 6, 7, 8a9 podle předchozího způsobu mohou být vyloučeny. Nádavkem nový způsob podstatně zvyšuje výtěžky získané nad ty, které byly dosaženy s použitím předchozího způsobu.
Streptomvces roseosporus kmeny NRRL 11379 (A-219786) a NRRL 15998 (A-21978.65), mutanty kmene NRLL 11379, jsou užitečnými A-21978C produkujícími kulturami. Tyto kultury jsou součástí sbírky zásobních kultur Severního regionálního výzkumného centra (Nothern Regional Research Center, U.S. Department of Agricultura) Zemědělská výzkumná služba ( Agricultural Research Service), Peoria, Illinois 61604, ve které jsou přístupny veřejnosti pod přírůstkovými čísly NRRL 11379 a NRRL 15998.
Kultura Streptomyces roseosporus NRRL 11379 a podmínky pro její použití při výrobě A-21978C antibiotik je popsána Robertem L. Hamíliem a Marvinem M. Hoehnem v U.S. patentu 4 331594 zahrnutém zde jako odkaz.
Ačkoliv kmeny mikroorganismů preferované v současném způsobu jsou označeny A-21978.6 nebo A-21978.65, kterákoliv A-21978C produkující kultura může být použita. Odborník může odhadnout, které kmeny budou užitečné k tomuto účelu.
Přirozeně se vyskytující A-21978C faktory popsané v U.S. patentu 4 331 594 jsou faktory a C5. U faktorů , C2, C3, C4 a C5 je R ve vzorci I specifická alkanoylová skupina o 10 až 12 atomech uhlíku. A-21978C faktor CQ, dříve považovaná za to, že má jediný větvený alkanoylový postranní řetězec o 10 atomech uhlíku.
V případě, že sloučenina vzorce I je připravována způsobem podle vynálezu, je nazývána A-21978C faktorem. S výjimkou přirozeně se vyskytujících faktorů, délka postranního řetězce je užita k označení faktoru. Tak například, vzorec sloučeniny I, kde R = oktanoyl, když je připraven tímto způsobem, je označován jako A-21978Cg-faktor.
Alkylová část alkankyseliny o 2 až 14 atomech uhlíku, esteru nebo soli (substrát) použitá ve způsobu podle vynálezu, může mít přímý nebo větvený řetězec. K přípravě přirozeně se vyskytujícího A-21978C faktorů C, C2 nebo C3, může být užita například
8-methyldekanová, 10-methyldodekanová nebo 10-methylundekanová kyselina, ester nebo sůl. Kyseliny s 2 až 14 atomy uhlíku s přímým řetězcem, jejich estery a soli, jsou doporučovány pro použití při výrobě pro jejich dostupnost a nižší cenu. Speciálně preferovaným substrátem je n-dekankyselina, její estery nebo soli.
Používájí-li se estery alkankyseliny o 2 až 14 atomech uhlíku, jsou preferovány alkylestery o 1 až 4 atomech uhlíku. V takovém esteru alkylová skupina o 1 až 4 atomech uhlíku také může mít přímý nebo větvený řetězec.
Representativní vhodné seli alkankyselin o 2 až 14 atomech uhlíku, které mohou být použity ve způsobu podle vynálezu, zahrnují ty, jež jsou vytvářeny alkalickými kovy nebo kovy alkalických zemin, jako sodík, draslík, lithium, cesium, rubidium, baryum, kalcium nebo magnesium. Vhodné soli s aminy zahrnují ammoniak, primární, sekundární a terciární alkylamoniové soli o 1 až 4 atomech uhlíku a hydroxyalkylamoniové soli o 2 až 14 atomech uhlíku.
Výhodně je substrát přidáván do fermentace jako sterilní roztok. Zejména užitečným rozpouštědlem k tomuto účelu je methyloleát, ačkoliv ostatní rozpouštědla jako ethanol, ethylacetát a estery nenasycených alifatických kyselin o 1 až 4 atomech uhlíku v esterové části mohou být také použity. Je-li substrát tekutý při fermentační teplotě, může být přidán přímo.
Rychlost přidání substrátu musí být dostatečně pomalá, aby se předešlo vyvolání toxických účinků na fermentaci, ale dostatečně vysoká, aby vzrostl výtěžek žádané sloučeniny obecného vzorce I. Rychlost přidávání se doporučuje od 0,95 do 0,5 ml na litr fermentačního média, s výhodou rychlosti 0,1 až 0,2 ml na litr fermentačního média.
Substrát se přidává k rostoucí A-21978C produkující kultuře v průběhu produkčního stadia fermentace počínaje 15 do 32 hodiny a pokračuje, dokud fermentace není ukončena. Substrát může být přidáván různými způsoby, ale přednostně je přidáván způsobem, který nejlépe dosahuje stejnoměrného výstupu výsledného produktu.
Po fermentaci, je-li to žádáno, vyprodukovaná sloučenina vzorce I může být získána s použitím postupů známých v oboru (viz například U.S. patent 4 331 594).
Při provádění způsobu podle vynálezu se užívá zmíněného nového mikroorganismu Streptomyces reseosporus NRRL 15998. Tento mikroorganismus také produkuje A-21978C antibiotika. Zejména se tento vynález vztahuje na zlepšení způsobu k produkci A-21978C antibiotik pěstováním nového kmene Streptomyces roseosporus NRRL 15998, za podmínek submersní aerobní fermentace, dokud je produkována dostatečná úroveň A-21978C antibiotik. A-21978C antibiotický komplex může být extrahován z fermentačního média a z mycelia polárními organickými rozpouštědly. A-21978C jednotlivé faktory mohou být odděleny a dále čištěny způsoby známými v oboru jako je chromatografie na sloupci.
Všeobecně kultury isolované v přirozeném stavu (divoký typ) produkují antibiotikum s nízkými výtěžky. Často je ántibiotická produkce chybná. Kmeny mající zvýšenou schopnost a kmeny, které trvale produkují antibiotikum, jsou proto velmi hodnotné.
Předmětem vynálezu je značně zlepšený způsob přípravy A-21978C antibiotik kultivací Streptomyces roseorporus NRRL 15998, nebo její A-21978C produkující mutanty, varianty nebo rekombinanty v kultivačním médiu, obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí, za submersních aerobních podmínek, do nahromadění antibiotik A-21978C. Antibiotický komplex A-21978C nebo individuální faktory mohou být získány s použitím různých isolačních a čistících postupů známých v oboru.
Mikroorganismus byl označen A 21978.65. Tento kmen byl vyvinut kmenovou selekcí a mutací z kultury označené A-21978.6 (NRRL 11379). Kmen A-21978.6, který byl studován Frederikem P. Mertzem a Ralphem E. Kastnerem z Lilly Research Laboratories, byl vyvinut z rodičovského kmene z hory Ararat v Turecku. Kmen A-21978.6 byl klasifikován jako nový kmen Streptomyces roseispo-rus. Falcao de Morias a Dalia Maia 1961. Tato klasifikace byla učiněna po srov5 nání s publikovanými popisy ( R.E.Buchanan a N.E. Gibbons, Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology, The Williams and Wilkins Company, 8. vydání 1974; a E.B. Shirling a D. Gottlieb, CooperatiVe Description of Typ Strains of Streptomyces, Intern. Journal of Systematic Bacteriology, 808-809,1972).
Klasifikace byla založena na metodách dporučených pro Mezinárodní Streptomycetový projekt (E.B. Shirling a D. Gottlieb Methods of Characterisation of Streptomyces Species, Intern. Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340, 1966) současně s některými doplňkovými testy.
Využití uhlíku bylo stanoveno na ISP 9 basálním médiu, ke kterému uhlíkové zdroje byly přidány, aby vytvořily konečnou koncentraci 1,0 %. Uhlíkové zdroje byly sterilizovány filtrací, basální médium bylo sterilizováno v autoklávu. Plotny byly odčítány po 14 dnech inkubace při teplotě 30°C. Cukry buněčných stěn byly stanoveny s použitím modifikace metody podle Lechevaliera (M.P. Lechevalier, Chemical Methods as Criteria fir the Separation of Actinomycetes into Genera pracovní setkání uspořádané pod patronací Podvýboru aktinomycet Americké mikrobiologické společnosti Dr. Thomas G. Pridham, Convenor, konané na Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of Nev Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971. (Isomer diaminopimelové kyseliny byl stanoven s použitím methody Beckera a spol.- B. Becker et al., Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates , Appl. Microbiol. 11, 421-423, 1964). Analysa aminokyselin byla provedena s promytými fragmenty buněčných stěn. Melanoidní pigmenty byly určeny s použitím ISP1 (Tryptonový kvasinkový kultivační bujón ISP 6), peptonový kvasinkový železitý agar), ISP 7 (tyrosinový agar), ISP 7 modifikovaný (ISP 7 bez tyrosinu) a tyrosinovou zkouškou (Yuzuru Mikami a další, Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Dtreptomyces, Intern. Journal of Systematic Bacterioloqy. 27 (3). 290, 1977). Hydrolýza škrobu byla stanovena testováním přítomnosti škrobu jodem.
í
Teplotní rozsah tolerance chloridu sodného, rozsah pH a antibiotická citlivost byly provedeny s použitím ISP 2 agarového média. Rozsah teplot byl 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 a 55°C. Tolerance chloridu sodného byla měřena přidáním k agaru v podílu: O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 a 12%. Vzorky byly inkubovány při 30°C. Rozsah pH byl měřen úpravou agaru od pH 3,0 až 11,0 při přírůstcích o 1,0 pH jednotku, právě před nasypáním. Antibiotická citlivost byla určena s použitím kotoučů uložených na naočkované agarové plotny.
Jména barev byla určena podle ISCC-NBS metody (K.L.Kelly a D.B. Judd, The ISCC-NBS Methods ?f Designating Colors and a Dictionary of Colar Names, U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C.,1955).
Číslice v závorkách odkazují na Tresnerovy a Backusovy barevné série (H.D. Tresner and E.J.Backus, System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy, Appl, Microbiol.il. 335-338, 1956). Barevná typová označení jsou podtržena. Maerzovy a Paulovy barevné bloky jsou obsaženy v závorkách (A. Maerz a M.R.Paul, DietoCS 276978 B6 nary of Color, McGraw-Hill Book Company, lne., New York,
N.Y.,1950).
Morfologie
Morfologie kultury Á-21978.6 je tvořena sporoforami, jež jsou Rectus-Flexibilis (RF) klasifikace. Řetězce spor mají více než 10 spor na řetězec. Povrch spor je hladký.
Kultura A-21978.6 je charakterizována, a to vytvářením převážně červené vzdušné sporové masy s červenavěhnědou zadní stranou. Světle hnědý ve vodě rozpustný pigment je také přítomen. Tyto charakteristiky jsou vykazovány na třech ze 14 agarových růstových prostředí ISP 2, ISP 7, TPO. Tato tři prostředí jsou jediná, jež podporují abundantní vzdušný a vegetativní růst.
Dvě agarová růstová prostředí, ISP 4 a glukosoasparaginový agar, vytvářejí bílé až šedé vzdušné sporové hmoty se žlutou zadní stranou. Žádný ve vodě rozpustný pigment nebyl pozorován. Tato dvě média podporovala dobrý, ale ne abudantní vzdušný a vegetativní růst.
Devět dalších agarových růstových prostředí bylo užito, ale ty poskytovaly chudý až žádný růst a spoluraci. Barva vzdušného mycelia byla-li přítomna byla v bílé až šedé sérii.
Melanoidní pigmenty jsou nepřítomny. Hlavními složkami buněčné stěny jsou: LL-DAP, glycin, glukóza a ribóza. To značí typ I buněčné stěny a typ C cukrového obrazu (R.E.' Buchanan and N.E. Gibbons, Eds. Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology The Williams Willkins Company, 8th edition, 1974, str. 658).
Následujících pět kultur bylo porovnáno v laboratorních testech s A-21978.6:
Streptomyces albovinaceous ISP 5136, ATCC 15833
Streptomyces candidus ISP 5141, ATCC 19891
Streptomyces moderatus ISP 5529, ATCC 23443
Streptomyces roseosporus ISP 5122, ATCC 23958
Streptpmyces setonii ISP 5395, ATCC 25497
Tyto kultury patří k bílé a červené barevné sérii, mají RF typ sporofořové morfologie, hladkou povrchovou ornamentaci spor a podle ISP popisů jsou melamin negativní a nemají zvláštní barvu zadní strany nebo ve vodě rozpustné pigmenty. Tyto vlastnosti, spolu s utilisací uhlíku a ostatními druhotnými znaky odpovídají kultuře A-21978.6.
Když byly tyto kultury srovnány s A-21978.6 za laboratorních podmínek, čtyři byly zavrhnuty. S.candidus a S.setonii vykazovaly žluté vzdušné sporové masy na mnohých médiích, čímž se odlišovaly od kultury A-21978.6. S.albivinaceous a S.moderatus vykazovaly tmavou odlišitelnou barvu zadní strany, ve vodě rozpustné pigmen7
CSÍ 276978 B6 ty a produkovaly melanoidní pigmenty, které všechny byly odlišné od kultury A-21978.6. IPS popis S. moderatus vykazuje červeně hnědou nebo silně hnědou barvu základní strany, ale nevykazuje takové jaké jsou charakteristické pro S. albovinaceous. Žádná z kultur není uvedena jako melaminpositivní.
Kultura A-21978.6 byla klasifikována, proto jako kmen streptomyces reseosporus, Falcao de Morias a Dalia Maia 1961. Tato klasifikace je založena na srovnání s publikovanými popisy a přímými laboratorními srovnáními. Následující vlastnosti kultur sumarizují přímé srovnávací studie.
Vlastnosti kultur
Morfologie
A21978.6 S.roseosporus
Sporophory přímé až zahnuté (RF), bez pozorovaných háčků, kliček nebo spirál. Řetězce spor > 10. Povrch spor hladký, jak bylo stanoveno běžnou elektronovou mikroskopií.
Spory; podlouhlé až oválné
Průměr: 0,85 x 1,78 yuM
Rozsah: 0,65 až 0,97 x x 0,97 až 2,6 yUM
A21978.6 vzrůst barva podlouhlé až cylindrické
1,01 x 2,47 /UM
0,97 až 1,3 x x 1,63 až 3,25 /UM
S.roseosporus vzrůst barva vzdušný: žádný vegetativní: chudý
Živný agar dosti značený bledě žlutošedá dobrý žádný rozpustný pigment (W) b bílá bleděžlutošedá žádný rozpustný pigment
Agar s protlakem z rajčat a ovesnou moukou vzdušný: abudantní (R) 5cb gy. abundantní (R) 5cb gy.
žlutorůžová žlutorůžová vegetativní: abudantní [BL12] dk.gy. abundantní [12L7] hnědá žlutohnědá hnědý rozpustný pigment hnědý rozpustný pigment vlastnosti kultur (pokračování)
S. roseosporus
A21978.6 vzrůst barva vzrůst barva
Glukoso-asparaginovv agar vzdušný: dobrý (W) b bílá dosti značný (W) b bílá vegetativní: dobrý [12B2]gy.žlutá dobrý [12B2] bleděžlutozelená žádný rozpustný pigment žádný rozpustný pigment
Glvcerol-glvcinovy agar vzdušný: chudý —— abundantní (W) b bílá vegetativní: abundantní [8L12] tmavá gy. abundantní [10G3]světlehnědá žlutá hnědý rozpustný pigment světlehnědý rozpustný pigment
Agar s Czapkovvm roztokem vzdušný: chudý (W) a bílá žádný vegetativní: chudý štiplavě bílá žádný žádný rozpustný pigment
Emersonův agar
vzdušný: chudý ---- abundantní (R) 5cb gy
vegetativní: abundantní [13L6] abundantní [1115] gy. žlutá
žádný rozpustný světlehnědý rozpustný
pigment pigment
Bennettův modifikovaný agar
vzdušný: žádný abundantní (R) 5cb šedožlutorůžová
vegetativní: chudý bledě žlutohnědá abundantní [11D4] šedavé žlutá
žádný rozpustný světlehnědý rozpustný
pigment pigment
Jablečnovápenatv agar
vzdušný: žádný — chudý (W) a bílá
vegetativní:dosti značný [7L12] mod. chudý bledě- žlutozelená
světlehnědý rozpustný červenohnědý bleděžlutozelený rozpustný
pigment pigment
vlastnosti kultur (pokračování)
A21978.6 vzrůst
S. roseosporus vzrůst barva barva
ISP # (Glvcerol-asparaqinovv agar).
vzdušný: dosti značný (W)13ba nafialověle dosti značný (W)b bílá bílá vegetativní: dobrý [3B7] gy. žlutorůžová dobrý [10C2] šedavé žlutá růžový rozpustný pigment světlehnědý rozpustný pigment
ISP # (Tyrosinový agar) vzdušný: abudantní (R) 5cb gy. žlutorůžová abudantní (R) 5cb gy.
žlutorůžová vegetativní: abudantní [7L12] mod. červeno- abudantní [11E5] hnědá žlutohnědá tmavohnědý rozpustný pigment světlehnědý rozpustný pigment
ISP # (Agar s ovesnou moukou)
vzdušný: dosti značný (W) a bílá chudý (W) a bílá
vegetativní: dosti značný [10A2] bledě dosti značný bledě
žlutorůžová zelenavě šedá
světlehnědý rozpustný žádný rozpustný
pigment pigment
ISP # (Agar se škrobem a anorganickými solemi) vzdušný: dobrý (W) b bílá dobrý (R) 3c2 bledě oranžově žlutá vegetativní: dobrý [10B1] bledě žluto- abudantní [1115] zelená šedavé žlutá světlehnědý rozpustný pigment žádný rozpustný pigment
ISP # (Agar s tryptonem a extraktem z kvasnic) vzdušný: dosti značný vegetativní: dobrý žádný rozpustný pigment (W) a bílá [10A1] bledě chudý žlutozelená chudý žádný rozpustný pigment (W) a bílá [10B2]bleděžlutozelená vlastnosti kultur (pokračování)
A21978.6 vzrůst
S. roseosporus vzrůst barva barva
ISP # (Agar s extraktem z kvasnic a sladu) vzdušný: vegetativní:
abudantní abudantní světlehnědý rozpustný pigment (R) 5cb gy. žlutorůžová [5D10] lt. červenohnědá abudantní (R) 3ca bledě oránžovožlutá abudantní [12L7] lt. světlehnědý olivově rozpustný hnědá pigment řez mrkví vzdušný: vegetativní dobrý šedá (C) růžová abudantní hnědá žádný rozpustný pigment žádný žádný žádná dobrý žlutohnědá rozpustný pigment řez bramborem vzdušný: dobrý šedá (c) růžová žádný žádná vegetativní: abudantní dosti značný oranžohnědá vě hnědá tmavohnědý rozpustný pigment žádný rozpustný pigment
Substrát
L-arabinosa
D-fruktosa
D-galaktosa
D-glukosa i-Inositol
D-Mannitol
D-rafinosa
L-rhamnosa
Salicin
Sacharosa
Utilizace uhlíku
A21978.6 +
+ +
+
S.roseosporus +
+ +
+ + + +
D-xylosa + +
Klíč:
+ = positivní utilizace - - negativní utilizace
Vlastnost_A21978.6 S.roseosporus
Melanoidní pigmenty
ISP 1 (prostředí s tryptonem a extraktem z kvasnic
ISP 6 (prostředí s peptonem, železem a extraktem z kvasnic)
ISP 7 (tyrosinový agar)
ISP 7 mod. (ISP // 7 bez tyrosinu) Tyrosinová zkouška
Zkapalnění želatiny + +
Působení na odstředěné mléko lehká hydrolysa lehká hydrolysa
Hydrolysa škrobu + + pH rozmezí 5 až 11 5 až 11
Teplotní rozmezí 25 až 40 °C 25 až 45 °C
Redukce nitrátů - +
NaCl-tolerance; růst až do 10 % 6 %
Citlivost na antibiotika
Antibiotikum Koncentrace DISK Třída A21978.6 S.roseosporus
Erythromycin 15 /ug makrolidová + +
Cephalothin 30 /ug β-laktamová + +
Lincomycin 2 /ug glykosidová — —
Nystatin 100 jedn. polyenová —
Polymyxin B 300 jedn. peptidová + —
Streptomycin 10 ?ug minoglykosidová + +
Tetracyklin 30 /ug tetracyklinová + +
Vancomycin 30 /ug glykopeptidová + +
+ = sensitivní (zóny inhibice)
- = resitantní (žádné zóny inhibice)
Jisté vlastnosti kmene A-21978.6 se liší od vlastností publikovaných pro S.roseosporus. Kultura A-21978.6 se odlišuje od publikovaných kmenů velikosti spor, vzrůstem na bramboru a mrkvi, NaCl tolerancí a v redukci nitrátů.
A-21978.65 kmen podle tohoto vynálezu má identifikační vlastnosti kmene A-21978.6, ale liší se od něj v množství produkovaného antibiotika A-21978C. Předchozí kmen při nej lepším produkoval ne více než 100 ?ug antibiotika A-21978C na ml fermentačního média. Zlepšený A-21978.65 kmen podle tohoto vynálezu produkuje nejméně 2,5 x větší množství při fermentaci v tancích a produkoval více než.18 při fermentaci v třepacích lahvích. S touto zvýšenou A-21978C produkující vlastností nový kmen poskytuje značně zlepšenou methodu k získání těchto antibiotik.
Tak jako je to běžné i u ostatních organismů, vlastnosti nové A-21978C produkující kultury podle tohoto vynálezu, Streptomvces roseosporus NRRL 15998 podléhají změnám. Rekombinanty, varianty a mutanty kmene NRRL 15998 mohou být získaný různými mutageny jako ultrafialovými paprsky, X-paprsky, X-paprsky, vysokofrekvenčními vlnami, radioaktivním · zářením a chemikáliemi. Přirozené a indukované varianty, mutanty a rekombinanty Streptomvces roseosporus NRRL 15 998, které si podržují vlastnost produkce antibiotik A-21978C ve vysokém výtěžku, mohou být také použity při provádění způsobu podle vynálezu.
Živné prostředí, užité ke vzrůstu Streptomvces roseosporus NRRL 15 998 kultury, může být kterékoliv z řady médií. Pro ekonomii ve výrobě, optimální výtěžek a snadnost isolace produktu jsou však jistá kultivační média preferována. Tak například preferovaným zdrojem uhlíku při fermentaci ve velkém měřítku je tapiokový (západoindické ságo) dextrin, ačkoliv glukosa, fruktosa, galaktosa, maltosa, mannosa, olej z bavlněných semen, methyloleát, glycerol, čištěný sojový olej a podobně mohou být užity také. Preferovaným zdrojem dusíku je enzymaticky hydrolysovaný kasein, ačkoliv rozpustný masový pepton, sojová mouka, sojový hydrolysát, sojová krupice, kvasinky, aminokyseliny jako L-asparagin a DL-leucin a podobné jsou také užitečné. Živné anorganické sole, jež mohou být zahrnuty do kultivačního média, jsou rozpustné sole poskytující draslík, ammóniumchlorid, sulfát, nitrát a podobné ionty. Mezi nimi K2SO4 je zejména užitečný pro produkci antibiotika. Melasový popel, popelový dialysát a synthetická minerální směs jsou-také užitečné.
K výrobě antibiotika A-21978C je výhodné používat destilovanou nebo deionisovanou vodu do fermentačního média. Některé minerály ve vodě z vodovodu, jako je například kalcium a uhličitany, znesnadňují výrobu antibiotika.
Základní stopové prvky jsou také nezbytné pro růst a vývoj organismu a musí být obsaženy v kultivačním médiu. Takové stopové prvky obecně se objevují jako nečistoty v ostatních složkách média v množství dostatečném splnit růstové požadavky organismu. —
Přidání malého množství (například 0,2 ml/litr) protipěnového činidla, jakým je propylenglykol, k fermentačnímu médiu ve velkém může být nezbytné, když pěnění začne vytvářet těžkosti.
K výrobě velkých množství antibiotika A-21978C je s výhodou používáno submersní aerobní fermentace v tancích. Malá množství antibioti A-21978C mohou být získána z kultur v třepacích lahvích. Pro časové zpoždění v produkci antibiotika běžně spojeného s inokulací velkých tanků sporovou formou organismu je lepší použít vegetativní inokulum. Vegetativní inokulum se připraví inokulací malého objemu kultivačního média sporovou formou nebo myceliálními fragmenty organismu získanými z čerstvých, aktivně rostoucích kultur organismu. Vegetativní inokulum se potom přenese do větších tanků.
Nový A-21978C produkující- organismus, může být pěstován při teplotách mezi 20°C až do 40°C. Optimální produkce antibiotika A-21978C je při teplotách 30 až 32°C.
Jak je obvyklé při aerobním submersním kultivačním způsobu je sterilní vzduch proháněn kultivačním prostředím. K účinné produkci antibiotik A-21978C procento saturace vzduchem pro výrobu v tancích musí být nad 20 %, přednostně nad 30 % při 30 °C a atmosferickém tlaku.
Pro fermentaci v tanku je výhodné udržovat pH fermentačního média v rozsahu 6,5 až 7,0. To se dosáhne přidáním přiměřených množstvi, například hydroxidu sodného (v časných stadiích) a chlorovodíkové kyseliny (v pozdějších stadiích).
Výroba antibiotik A-21978C může být sledována v průběhu fermentace testováním vzorků média nebo extraktů mycelia na antibiotickou účinnost proti mikroorganismům, jež jsou na tato antibiotika citlivá. Jedním zkušebním mikroorganismem užitečným v testování těchto antibiotik je Micrococcus luteus. Biologická titrace je s výhodou prováděna pomocí stanovení papírovými disky na agarových plotnách.
Druhou možností je, že pevné části kultury počítaje v to složky média a mycelium, mohou být užity bez extrakce nebo separace, ale s výhodou po odstranění vody, jako zdroj antibiotik A-21978C. Například po prokázání A-21978C antibiotické aktivity kultivační médium může být sušeno lyofylisací a namícháno přímo do přísady do krmivá.
Sloučeniny vzorce X jsou výtečné antibakteriální látky.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady:
Příklad 1
Produkce komplexu A-21978C
Zásobní kultura se připraví a udržuje v parní fázi kapalného dusíku. Streptomyces roseosporus NRRL 15998, udržovaný v parní fázi kapalného dusíku se užije k naočkování 50 ml vegetativního živného prostředí následujícího složení:
Složka Množství %
Sójový bujón s tryptikázoux 3,0
Dextrin 2,5 voda (deionizovaná) 94,5 v
Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville MD
Naočkované živně prostředí se inkubuje v Erlenmeyerových buňkách při teplotě 30°C celkem 48 hodin na rotační třepačce s výkyvem 5 cm při 250 otáčkách/min. Zralá vegetativní kultura se rozdělí do většího počtu nádobek po 0,5 ml a nádobky se skladují v parní fázi kapalného dusíku.
K získání většího množství stejnorodého materiálu se užije ml kultury, skladované v kapalném dusíku k naočkování 80 ml svrchu uvedeného živného prostředí. Naočkované vegetativní prostředí se inkubuje v Erlanmezerových buňkách o objemu 250 ml celkem 48 hodin při teplotě 30°C na rotační třepačce o výkyvu 5 cm při 250 otáčkách/min.
ml takové kultury bylo použito k inokulaci 450 ml druhostupňového vegetativního růstového prostředí, které má stejné složení jako primární svrchu popsané vegetativní prostředí. Druhostupňové vegetativní prostředí bylo inkubováno v 2-litrových Erlenmayerových lahvích po dobu 24 hodin při teplotě 30°C na rotační třepačce rotující s výkyvem 5 cm při 250 otáčkách za minutu.
Jeden litr druhostupňové vegetativní kultury byl užit k inokulaci 39 litrů sterilního terciárního prostředí pro získání očkovací kultury s následujícím složením.
složka__množství (%) sojová mouka 0,5 extrakt z kvasnic a 0,5 kalciumglukonát 1,0
KClb 0,02
MgSO4.7H2Ob 0,02
FeSO4.7H2Ob 0,0004
Sag 471 (protipěnové činidlo)0 0,03 voda 97 9296 aDifco Laboratories, Detroit MI bStopové prvky byly připraveny takto:
FeSO4.7H2O (7,6 g) byl rozpuštěn v konc. HC1 (76 ml).
MgSO4.7H2O (380 g), KCl (380 g) a deionizované vodou byly přidány do celkového objemu 3 800 ml. Aby se získaly specifikované minerály, použije se 80 ml roztoku na 39 litrů terciárního stupně. cUnion Carbide, Danbury CT.
Inokulované prostředí bylo inkubováno 24 hodin v nádobě z nerezavé oceli při teplotě 30°C.
Prostředí bylo provzdušňováno sterilním vzduchem rychlostí 0,85 objemu na objem prostředí za minutu a mícháno běžným míchadlem při 250 otáčkách za minutu. Tlak v nádobě byl udržován na hodnotě 35 kPa.
Jeden litr inkubovaného terciárního stupně byl použit k inokulaci 119 litrů sterilního výrobního prostředí následujícího složení:
složka množství
sojová mouka 2,2
Fe(NH4)2S04.6H20 0,066
dextróza 0,825
Sag 471 0,022
Bramborový dextrin 3,3
Melasa (blackstrap) 0,275
Voda z vodovodu 93.312
pH bylo upraveno na 7,0 po přidání prvých dvou složek a potom opět po přidání všech složek bezprostředně před sterilizací.
Naočkované výrobní prostředí bylo inkubováno 6 dní v nerezové ocelové nádobě při 30 °C a provzdušňováno sterilním vzduchem rychlostí 0,5 objemu na objem prostředí (min). Médium bylo protřepáváno konvenčními míchadly při 250 otáčkách/min. od 0 do 15 hodin a při 350 otáčkách/min. po 15 hodinách. pH bylo udržované na nebo nad 6,5 přidáváním roztoku hydroxidu amonného. Výtěžek A21978C komplexu byl 0,282 g na litr média na konci fermentace. Faktor distribuce j e popsán v tabulce 1.
Příklad 2
Zvýšená výroba A-21978C8
Primární, sekundární a terciární růstové stupně byly provedeny jak je popsáno v příkladu 1.
Výrobní stadium bylo zahájeno jak- je popsáno v příkladu 1 s- tím rozdílem, že počínaje 28 hodinami sterilní roztok pozůstávající z kyseliny kaprylové (oktanové) a methyloleátu byl zaveden do fermentačního prostředí rychlostí 0,13 ml na litr fermentačního prostředí za hodinu a zachováván na této rychlosti do dokončení fermentace za 144 hodin. Výtěžek komplexu A21978C byl 1,255 g na litr prostředí, což je 445 % vzestup ve výtěžku proti výtěžku dosaženému v příkladě 1. Faktor A-21978C8 (sloučenina vzorce I, kde R = oktanoyl) representuje 9 % celkového množství komplexu A-21978C připraveného touto methodou. Žádný A-21978C8 nebyl zjištěn v A21978C komplexu připraveném způsobem podle příkladu 1.
Příklad 3
Zvýšená výroba A-21978C9
Primární, sekundární a terciární stupně vývoje očkovacího materiálu byly provedeny tak, jak je popsáno v příkladu 1. Výrobní stadium bylo zahájeno jak je popsáno v příkladu 1, až na to, že počínaje 28 hodinami sterilní roztok obsahující 25 % objemoCS 276978 B6 vých nonanové kyseliny a 75 % methyloleátu byl zaveden do fermentačního média rychlostí 0,13 ml na litr fermentačního prostředí za hodinu a ponechán při této rychlosti do konce fermentace za 144 hodin. Výtěžek komplexu A-21978C byl 0,821 g na litr prostředí, což je 293 % vzestup nad výtěžek získaný v příkladu 1. Faktor A-21978Cg (vzorce I : R = nonanoyl) tvoří 10 % celkového množství komplaxu A-21978C připraveného touto methodou. Žádný A-21978Cg nebyl prokázán v A-21978C komplexu připraveném podle způsobu v příkladu 1.
Příklad 4
Zvýšená výroba A-21978C1Q faktoru (vzorce I:R = n-dekanoyl)
Primární a sekundární stupeň vegetativních stadií růstu byl kultivován tak, jak je popsáno v příkladu 1. V terciárním “stadiu 800 ml sekundárního inokula kultury bylo užito k inokulaci 950 litrů sterilního terciárního prostředí pro získání očkovacího materiálu s následujícím složením:
složka' množství (%) dextróza uhličitan vápenatý sojová moučka extrakt z kvasnic
KCla
MgSO4.7H2OA
FeSO4.7H2Oa
Sag 471 (prostředek protipěnivý) voda
2,0
0,2
2,0
0,1
0,02
0,02
0,0004
0,02
95,6396 aRoztoky stopových prvků byly připraveny způsobem podle příkladu
1.
Inokulované médium bylo inkubováno v nádobě z nerezové oceli 24 hodin při 30 °C. Nádoba byla provzdušňována sterilním vzduchem rychlostí 0,8 objemu na objem prostředí 20 minut a promíchávána konvenčními míchadly. Jeden litr tohoto terciárního očkovacího materiálu byl použit k inokulaci 119 litrů prostředí výrobního stadia o složení popsaném v příkladu 1. Produkční stadium bylo také zahájeno jak je popsáno v příkladu 1 až na to, že počínaje 28 hodinami, sterilní roztok složený z 50 % objemových kyselin kaprinové (kyseliny n-decylové) a 50 % methyloleátu byl přiváděn do fermentačního prostředí rychlostí 0,26 ml na litr fermentačního prostředí za hodinu a ponechán na této rychlosti do dokončení fermentace za 283 hodin. Výtěžek komplexu A-21978C byl 1,94 g na litr prostředí, což je 687 % vzestup ve srovnání s výtěžkem zís17 kaným podle příkladu 1. Koncentrace faktoru A-21978Cf0 (vzorce I : R = dekanoyl) byl 1,63 g na litr neboli 84 % celkového množství komplexu A-21978C. Což je v 13 583 % větší množství než množství A-21978C10, vyrobeného s použitím postupu uvedeném v příkladě 1.
Alternativní methoda zvýšené výroby A-21978C10
Primární, sekundární a terciární stupně výroby očkovacího materiálu byly provedeny jak je popsáno v příkladu 1. Výrobní stadium bylo zahájeno jak je popsáno v příkladu 1. Výrobní stadium bylo zahájeno jak je popsáno v příkladu 1 až na to, že počínaje 28 hodinami, sterilní roztok pozůstávající z 25 % objemových v ethylesteru kyseliny kaprinové (ethylkaprinát) a 75 % methyloleátu byl zaveden do fermentace rychlostí 0,13 ml na litr fermentačního média za hodinu a ponechán na této rychlosti do dokončení fermentace za 144 hodin. Výtěžek komplexu A-21978C byl 1,022 g na litr, což představuje 362 % vzestup ve srovnání s výtěžkem získaným podle příkladu 1. Koncentrace faktoru A-21978C10 byla 0,202 g na litr neboli 20 % celkového množství komplexu A-21978C. Jde o 1 683 % vzestup ve srovnání s koncentrací A-21978C10 vyrobeného podle způsobu z příkladu 1.
Příklad 6
Alternativní methoda zvýšené výroby A-21978C10
Primární, sekundární stupeň vegetativních vzrůstových stadií byl kultivován tak, že je posáno v příkladu 1. Inokulum terciárního stupně bylo kultivováno jak je popsáno v příkladu 4 s tím rozdílem, že objem média byl 1 900 litrů a trvání tohoto stupně bylo prodlouženo na 48 hodin. Rychlost provzdušňování byla 0,3 objemu na objem prostředí za minutu od 0 až 24 hodin, 0,45 objemu na objem prostředí za minutu od 24 do 40 hodin a 0,90 objem prostředí za minutu od 40 do 48 hodin. Výrobní stadium bylo zahájeno jak je popsáno v příkladě 1. Od 23 hodin sterilní suspenze 0,004 % kvasinkového extraktu byla po vsázkách přidána k fermentačnímu prostředí. Počínaje 36 hodinami roztok glycerolu a dekanoátu amonného byl přidáván rychlostí 0,84 ml na litr fermentačního média za hodinu. Živný roztok obsahoval glycerol (3 600 g), deionisovanou vodu (9 000 ml), kyselinu kaprinovou (1 litr) a koncentrovaný roztok hydroxidu amonného (620 ml). Přidávání bylo ponecháno na této rychlosti dokud nebyla fermentace dokončena za 143 hodin. Výtěžek komplexu A-21978C byl 1,772 g na litr, což je 628 % vzestup ve srovnání s výtěžkem získaným v příkladu 1. Koncentrace faktoru 2-21978CfQ byla stanovena jako 0,739 g na litr, neboli 42 % celkového množství komplexu A-21978C. Toto množství je o 6158 % více než koncentrace A-21978C10 je-li vyrobena způsobem podle příkladu 1.
Příklad 7
Zvýšená výroba A-21978C11
Primární, sekundární a terciární stadia inokula byla prováděna tak, jak je popsáno v příkladu 1. Výrobní stadium bylo zahájeno jak je posáno v příkladu 1 s tím rozdílem, žě počínaje 28 hodinami sterilní roztok pozůstávající z 25 % objemových kyseliny undekanové a 75 % methyloleátu byl zaváděn do fermentačního prostředí rychlostí 0,13 ml na litr fermentačního média za hodinu do konce fermentace za 144 hodin. Výtěžek A-21978C komplexu byl 1,62 g na litr, což je 574 % vzestup na výtěžek získaný postupem podle příkladu 1. Koncentrace faktoru A-21978Cn·, (vzorec I:R = undekanoyl) byl stanoven 0,70 g na litr nebolí 43 % celkového množství komplexu A-21978C. Faktor A-21978C11 nemohl být prokázán v komplexu A-21978C připravovaném podle způsobu z příkladu 1.
Příklad 8
Zvýšená výroba A-21978C5
Primární, sekundární a terciární stadia výroby očkovacího materiálu byla provedena tak, jak je popsáno v příkladu 1. Výrobní stadium bylo zahájeno jak je popsáno v příkladu 1 s tím rozdílem, že počínaje 28 hodinami sterilní roztok pozůstávající z 25 % objemových kyseliny laurové a 75 % methyloleátu byl zaveden do fermentace rychlostí 0,13 ml na litr fermentačního média za hodí-------nu do konce fermentace za 144 hodin. Výtěžek komplexu A-21978C byl 1,12 g na litr, což je 400 % vzestup nad výtěžek dosažený podle příkladu 1. Koncentrace faktoru A-21978C5 (vzorec I:R = dodekanoyl) byla stanovena jako 0,372 g na litr neboli 33 % celkového množství komplexu A-21978C, což bylo 5 314 % více než koncentrace A-21978C5 nalezená v A-21978C komplexu vyrobeném podle způsobu popsaného v příkladu 1.
r-l ' r-l
O o
rM
O
1 1 í 1 1
1 1 1 1 1
Η r4
X)
E-i
a JO
oo «»
c— at
A z“*»
r-l r—f
CM S
4
•rl O
14 o
3 co
τί t~
o o\
k r-l
ft CM •i
cd SS •3 P '3 ř-i P CO Í3 3 CO
G\
O <30 o
CM
O
JS o
‘ř>>
>
o
Ό •rl ft •rl r-4
O jC o
o CM H O C- H Ό OJ O CM
O <0\ o n ra r-l
1 1 m ra 1 1
1 l 1 1
1 m Η 1 1 1
1 ι-l | I 1
c*- IA CM c— r-4
C* o\ c*” IA
H r4 CM
CM A CO ra
H CM A
CM r=4 1=4
CM ř*0 o ra
H r-5 c** A •φ
H · co r-| CM
ra c-= A . ra
c— co ra
CM r—{ r4 r—1
I •rl k
O*
Až až
& P s 3 a •rl
N Ό5 •rl C •rl r4
•3 $4 r4 •rl r-l O
P O r-4 4) 3
co CO υ 3 >»
> JS >s 3 >» J4
•rl 3 14 >5 14
r4 CO 14 Í4
> xfl -3 e
S^s > Ό > P
► O ► O 3
o r4 O C «
•a '>» >s c •rl r4
•rl s Si 3 b >s 'O
O. Ό 0. a O. Λ >
•rl '3 3 o 3 P o
hS >tS3 14 a 14 v c
Ό cd r-4 •p >fcl r-l CM
CO A fl pokračování tabulky rP f—I o
o
I—I o
cn ο
O
O
L—
Ό cn co m <n Η Γι'— rP r—)
co ο
ΙΛ
Ο co η cm σ\ c— t— cm rn o 00 ccn ι—I CM
CM
O rP
O *» 'OS
Fí
P os
CO
O
GJ •P cu •P t *ft
Ό
Ctí pp ύί
M >Ft
G
CO CO rM
CM ΙΛ
CM rP rH
pp Ό Ό
C· O n
n CM CM
m n -Μη co o n rP cm rt
G •P pp Ctí
•P rt G
'2 CO •pí
o g 5 rH C
cí CO
A o ft/·* > e?
GJ o
a G '3
3 ctí
Ή A! O
C Fu
o GJ 3
s C Λ
ctí 3 fp
VO L— CO
> O
3 o
O rH •ft
A CC cn
a ♦H o
fl
-P Ctí •ft
o P co
Ai •P o
O rP
co 3 ♦ •ft >3
^3 >3 G
> > P •pí
O G
ctí M •P 3
G O A! A
o G rt CO
> Fl <P
0 0 'rt
G CO ϋ >
2 G co o
«Ρ ctí c— rP
co cn &
>3 fl W
3 C CM
H 'S 1 1
>» > CM
G o fl
to M fl
M rt O o
Ό M
O o •Γ3 rt
>Fu Fu
+3 G -P O
co >3 fl
O P3 A o
Ff rP co
G >9 >3 •ft
13 > cn
S O
'rt >3 o
G kj (-M co •ft
a >t5 CO
> o >0) o rP
o rP G >3
Fu (0 GJ ;} O
P O c
rP xu P a ctí
♦P > M Ai
•P >P o rt
N fl G Ό GJ
•P A 1
o o li G
> G •ft
GJ Lf\ H II
A4 rt O O
v •Γ3 rt O a
>S1 rt O
o •ft P Fu O
r—l M m O O
05 •P o to -P ctí
6-j > Ai G
e rt •ft ctí Ό
o P CM ř3 «Η fl
rt £0 O G •Γ3
P O •P M rt
P P •ft G G CO
c rt fl rt G5
«5 o >O O rt
O ó 3 Fu GJ
G Fu O v+ Τ»
O O4 O rP ’P
O O CO. fU W
rt G O GJ
Příklad 9
Alternativní výroba komplexu A-21978C
Komplex A-21978C je vyráběn s použitím způsobu podle příkladu 1, ale je použita kultura Streptomyces roseosporus NRRL 11379.
Příklad 10
Alternativní methoda zvýšené výroby A-21978C10
Je vyráběn A-21978C10 s použitím způsobu podle příkladu 6, ale je použita kultura Streptomyces roseosporus NRRL 11379.
Příklad 11
Výroba komplexu A-21978C v třepacích lahvích
Obecný postup popsaný v příkladu 1 je použit, ale za podmínek použití třepacích lahví s následujícím fermentačním médiem: složka_množství (q/litr) glukóza dextrin3 enzymaticky hydrolyzovaný kasein b
Peptonc melasa deionizovaná voda
7,5
2,5 až do 1 litru aStader 11, A.E. Staley Co., Decatur IL bNZ amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst NJ cBiosata, Baltimore Biological Laboratories,
Cockeysville MD
Výtěžek komplexu A-21978C z této fermentace byl 1 800 ,ug na ml kultivačního média. 7
Biologická účinnost nových cyklických derivátů je uvedena v následuj ících tabulkách.
V tabulce 2 je uvedena antibakteriální účinnost na agarových plotnách, uvedeny jsou inhibiční zóny pro jednotlivé deriváty v mm.
V tabulce 3 je uvedena účinnost in vitro ve formě minimální inhibiční koncentrace /MIC/ v kapalném živném prostředí pro řadu mikroorganismů.
V tabulce 4 je uvedena účinnost cyklických derivátů in vivo, uvedeny jsou hodnoty EDg0 / dávka, chránící 50 % pokusných zvířat / pro krysu při podkožním i perorálním podání.
V tabulce 5 je uvedena toxicita pro myš při nitrožilním podání jako hodnota LD50 / 50 % uhynutí/. Je zřejmé, že pro většinu derivátů jsou dávky velmi vysoké, což zajišťuje vysoký therapeutický index.
Tabulka 2
Antibakteriální účinnost sloučenin vzorce I při difusi na agarových plotnách Inhibični zóna /mm/a
Slouč. č.R Staphylococcus aureus ATCC 6738P Bacillus subtilis ATCC 6633 Micrococcus B sub-
luteus ATCC9341 tilis ATCC 6633
i ch3/ch2/5co- 17 15 21 16
2 CH3/CH2/6C0- 23 18 23 20
3 CH3/CH2/7CO- 20 16 18 27
4 CH3/CH2/8CO- 24 20 22 29
5 CH3/CH2/9CO- 19 19 21 21
6 CH3/CH2/1OCO- 25 20 19 32
7 cn3/cn2/iico- 21 17 19 29
8 CH3/CH2/12CO- 22 21 21 28
a/ Sloučeniny byly uvedeny do suspense ve vodě v koncentraci 1 mg/ml, do suspense se ponoří kotouč o průměru 7 mm a uloží se na agar na ^24 až 48 hodin při 25 až 37 ĎC.
Tabulka 3
Antibiotickáúčinnost sloučenin vzorce I in vitro
Mikroorganismus
MIC v /ug/ml
Staphylococcus 1 2 3 4 5 6 7 8
aureus XI.1 8 4 2 1,0.5 0.25 0.5,0.5 0.125 0.5,1
Staphylococcus aureus V41 8 4 2 1,0.5 0.25 0.5,1 0.125 0.5,2
Staphylococcus aureus X400 8 8 4 2,1 0.5 1,1 0.5 1,2
Staphylococcus aureus S13E 8 4 2 1,0.5 0.5 0.5,0.5 0.25 1,2
Staphylococcus epidermidis EPII 16 8 4 2,1 0.5 1,1 0.5 1,4
Staphylococcus epidermidis EP12 8 4 2 1,0.5 0.5 1,1 0.5 2,2
Streptococcus pyogenes C2O3 2 1 0.25 0.25, 0.125 0.125 0.125 0.25 0.25 0.5,2
Streptococcus pneumoniae Parkl 8 8 2 1,0.5 0.25 0.25 0.25 0,25 0.03 0.125
Streptococcus pneumoniae skupina D X66 128 64 32 16,16 2 2,4 0.03 0.5,2
Streptococcus pneumoniae skupina 9960 128 16 8 2,2 0,5 0.5,0.5 32 0.125 >128
Streptococcus pyogenes
Tabulka 4
Účinnost sloučenin vzorce 1 u krys
ED
Staphylococcus aureus
Souč. č. R R1 R2 podkožně podkožně perorá
i ch3/ch2/5co- h H 2.65 1.49,5.1 NT1
2 CH3/CH2/6CO- H H 3.75,1.4 <2. 2,0,65,1.9 >200
3 CH3/CH2/7C0- H H 0.5 0. 14,0.243 92.117
4 CH3/CH2/8CO- H H 0.28 0.03 66
5 CH3/CH2/9CO- H H 0.37 0.13 138
6 CH3/CH2/10CO-H H 0.44 0.05 69
7 CH3/CH2/11CO-H H 0.54 0.046 45
8 CH3/CH2/12CO-H H 1.17,3.08 0 .98,0.20,<0.54 <50, <2.00
+nebylo provedeno
Tabulka 5
Toxicita sloučenin obecného vzorce I
Slouč. LD50/mg/kg/
č. R pro myš i.v.
i ch3/ch2/5co- >600
2 CH3/CH2/6CO- >600
3 CH3/CH2/7CO- >600
4 CH3/CH2/8CO- >300
5 CH3/CH2/9CO- >600
6 CH3/CH2/10CO- 144,265
7 CH3/CH2/1:lCO- 112.5
8 CH3/CH2/12C0- 62.5,<150

Claims (3)

  1. P A T E N T O V É NÁROKY kde R znamená alkanoylovou skupinu o 2 až 14 atomech uhlíku, pěstováním mikroorganismu v živném prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submersní kultuře za aerobních podmínek, vyznačující se tím, že se v živném prostředí pěstuje Streptomyces reseosporus NRRL 15998 nebo NRRL 11379 a do živného prostředí se přivádí v množství 0,5 až 5 ml na 1 litr živného·prostředí odpovídající alkankyselina o 2 až 14 atomech uhlíku, její alkylester s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo její sůl s alkalickým kovem, kovem alkalických zemin nebo amonná sůl, kultura se pěstuje při teplotě 20 až 40°C a pH 6,5 až 7,0 a výsledný produkt se ze živného prostředi popřípadě izoluje.
  2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se do fermentačního prostředí přidává kyselina kaprinová, její ester nebo její sůl.
  3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se do fermentačního prostředí přidává kyselina kaprylová nonanová, undekanová, laurová nebo estery nebo soli těchto kyselin.
CS857198A 1984-10-09 1985-10-08 Process for preparing a-21978c antibiotic derivative CS276978B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US65897984A 1984-10-09 1984-10-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS719885A3 CS719885A3 (en) 1992-03-18
CS276978B6 true CS276978B6 (en) 1992-11-18

Family

ID=24643546

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS868192A CS276983B6 (en) 1984-10-09 1985-10-08 Process for preparing a-21978c antibiotic in the form of a complex or its factors
CS857198A CS276978B6 (en) 1984-10-09 1985-10-08 Process for preparing a-21978c antibiotic derivative

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS868192A CS276983B6 (en) 1984-10-09 1985-10-08 Process for preparing a-21978c antibiotic in the form of a complex or its factors

Country Status (27)

Country Link
EP (1) EP0178152B1 (cs)
JP (1) JPH0787796B2 (cs)
KR (1) KR890000800B1 (cs)
CN (2) CN1013120B (cs)
AT (1) ATE67788T1 (cs)
AU (2) AU4837785A (cs)
BG (1) BG47040A3 (cs)
CS (2) CS276983B6 (cs)
CY (1) CY1633A (cs)
DD (2) DD238068A5 (cs)
DE (1) DE3584218D1 (cs)
DK (2) DK165416C (cs)
EG (1) EG17619A (cs)
ES (2) ES8700862A1 (cs)
FI (1) FI82075C (cs)
GR (1) GR852432B (cs)
HK (1) HK24292A (cs)
HU (1) HU196845B (cs)
IE (1) IE58655B1 (cs)
IL (1) IL76608A (cs)
NZ (1) NZ213731A (cs)
PH (1) PH21217A (cs)
PL (1) PL152359B1 (cs)
PT (1) PT81265B (cs)
SG (1) SG3292G (cs)
SU (1) SU1452484A3 (cs)
ZA (1) ZA857759B (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0294990A3 (en) * 1987-06-10 1990-05-09 Eli Lilly And Company Chromatographic purification process
US4930494A (en) * 1988-03-09 1990-06-05 Olympus Optical Co., Ltd. Apparatus for bending an insertion section of an endoscope using a shape memory alloy
US4977083A (en) * 1988-04-11 1990-12-11 Eli Lilly And Company Processes for preparing A54145 compounds
DE3832362A1 (de) * 1988-09-23 1990-03-29 Sandoz Ag Neue cyclopeptolide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
MXPA02006030A (es) * 1999-12-15 2004-08-23 Cubist Pharm Inc Lipopeptidos como agentes antibacterianos.
AU784755B2 (en) 1999-12-15 2006-06-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Daptomycin Analogs as antibacterial agents
US6696412B1 (en) 2000-01-20 2004-02-24 Cubist Pharmaceuticals, Inc. High purity lipopeptides, Lipopeptide micelles and processes for preparing same
US20060014674A1 (en) 2000-12-18 2006-01-19 Dennis Keith Methods for preparing purified lipopeptides
RU2512396C2 (ru) 2008-12-22 2014-04-10 Кьюбист Фармасьютикалз, Инк. Новые противобактериальные средства для лечения грамположительных инфекций
PE20151717A1 (es) 2009-11-23 2015-11-19 Cubist Pharm Inc Compuestos lipopeptidos y metodos relacionados
MX2013015434A (es) 2011-06-22 2014-10-14 Vyome Biosciences Pvt Ltd Profarmacos antifungicos y antibacterianos a base de conjugado.
IT201600127655A1 (it) 2016-12-16 2018-06-16 Gnosis Spa Processo per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidici
CN107964557B (zh) * 2018-01-17 2020-11-20 自然资源部第三海洋研究所 一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208403A (en) * 1978-10-16 1980-06-17 Eli Lilly And Company A-21978 Antibiotics and process for their production
IL68700A0 (en) * 1982-05-21 1983-09-30 Lilly Co Eli Improvements relating to a-21978c cyclic peptide derivatives and their production

Also Published As

Publication number Publication date
CS819286A3 (en) 1992-03-18
PT81265A (en) 1985-11-01
ES8700862A1 (es) 1986-11-16
CN85107552A (zh) 1987-05-20
CS719885A3 (en) 1992-03-18
FI853910A0 (fi) 1985-10-08
DK457585A (da) 1986-04-10
DK165757B (da) 1993-01-11
PH21217A (en) 1987-08-21
GR852432B (cs) 1986-02-10
IL76608A0 (en) 1986-02-28
AU5375290A (en) 1990-11-01
SG3292G (en) 1992-03-20
EP0178152B1 (en) 1991-09-25
PL152359B1 (en) 1990-12-31
JPS6192588A (ja) 1986-05-10
AU634766B2 (en) 1993-03-04
EP0178152A2 (en) 1986-04-16
BG47040A3 (en) 1990-04-16
ES8800362A1 (es) 1987-11-01
HUT39782A (en) 1986-10-29
PT81265B (pt) 1988-02-17
DK165416C (da) 1993-04-05
FI82075B (fi) 1990-09-28
ES553603A0 (es) 1987-11-01
FI82075C (fi) 1991-01-10
FI853910L (fi) 1986-04-10
ES547689A0 (es) 1986-11-16
DE3584218D1 (de) 1991-10-31
DK165416B (da) 1992-11-23
HU196845B (en) 1989-01-30
AU4837785A (en) 1986-04-17
EG17619A (en) 1991-03-30
HK24292A (en) 1992-04-10
CN1051200A (zh) 1991-05-08
IE58655B1 (en) 1993-11-03
IE852466L (en) 1986-04-09
JPH0787796B2 (ja) 1995-09-27
DK457585D0 (da) 1985-10-08
DK148791D0 (da) 1991-08-21
KR890000800B1 (ko) 1989-04-07
ATE67788T1 (de) 1991-10-15
IL76608A (en) 1991-03-10
KR860003335A (ko) 1986-05-23
NZ213731A (en) 1988-04-29
EP0178152A3 (en) 1988-11-02
DD247023A5 (de) 1987-06-24
DD238068A5 (de) 1986-08-06
CS276983B6 (en) 1992-11-18
SU1452484A3 (ru) 1989-01-15
CY1633A (en) 1992-11-06
DK165757C (da) 1993-06-07
PL255683A1 (en) 1986-07-29
ZA857759B (en) 1987-05-27
CN1013120B (zh) 1991-07-10
DK148791A (da) 1991-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU624458B2 (en) Macrolide compounds
FI90993B (fi) Menetelmä glykopeptidiantibioottien valmistamiseksi ja niitä tuottavia mikro-organismiviljelmiä
CS276978B6 (en) Process for preparing a-21978c antibiotic derivative
USRE32333E (en) A-21978 Antibiotics and process for their production
JPH0123479B2 (cs)
US4800157A (en) Process for producing the A-21978C antibiotics
US5028590A (en) Derivatives of A54145 cyclic peptides
KR960012063B1 (ko) 글리콜펩티드 항생물질 pa-45052 및 그의 제조방법
HUT57832A (en) Process for producing macrolide compound and parasiticidal composition comprising same as active ingredient
JPH0820596A (ja) 新規抗生物質
PT86364B (pt) Processo para a producao do complexo antibiotico a10255 e seus factores
EP1285928A1 (en) Antibiotics tripropeptins and process for producing the same
CA1337758C (en) Peptide antibiotics
KR840001258B1 (ko) 신항생물질 mf 266 물질의 제조방법
US4550159A (en) Anthracycline compounds
KR920001366B1 (ko) 새로운 항암 항생복합체 bbm-1675의 제조방법
KR870000248B1 (ko) 항생물질 a39079 인자 s-1의 제조방법
KR870000235B1 (ko) 클리코펩타이드 항생물질 cuc/csv의 제조방법
CA1090728A (en) Antibiotic a-7413 mixture comprising factors a,b,c and d and a process for producing it
US4463092A (en) Process for production antibiotic A53868
US4482488A (en) Antibiotic A53868 and process for production thereof
EP0211490A2 (en) Antibiotics of the vancomycin-class
PL152518B1 (pl) Sposób wytwarzania kompleksu antybiotycznego A-21978C i jego czynników
US5350764A (en) Anticoccidial and growth promoting polycyclic ether antibiotic
US4797280A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20051008