JPS63500660A - テトラサイクリン系抗生物質、その製造、それを含有する抗生物質組成物、及びその製造に有用な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 テトラサイタリン系抗生物質、その製造、それを含有する抗生物質組成物、及び その製造に有用な微生物 ３９４９９から単離され、かつこれらの新規微生物の生物学的純粋培養物を用い る調節された条件下での発酵により製造した、新規テトラサイクリン系抗生物質 、７−りロワー８−メトキシテトラサイクリン並びにその４ａ−ヒドロキシ及び ２′　−Ｎ−メチル誘導体に関する。

本発明は、種々の微生物、特にＡＴＣＣ３９２１Ｂの同定特性物の変異株の生物 学的純培養物に関する。上記各培養物は同化性窒素及び炭素源を含有する水性培 地中で好気的条件下での発酵において回収可能な品質で特性的抗生物質又は抗生 物質複合体（ａｎｔｌｂｌｏｔｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を産生ずることができる 。これらの各抗生物質又は抗生物質複合体が本発明の更なる特徴である。

上記の同定した微生物菌株は以下のように抗生物質又は抗生物質複合体を産生ず る。

Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１Ｂは新規抗生物質７−クロロ−８−メ トキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含有する抗生物質複合体８１−４ ７を産生ずる；Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉＭｏｔｌｃａ　ｖａ ｒ、　ｎｏｖ、ＡＴＣＣ５３１０ｇは上記の新規抗生物質７−クロロー８−メト キシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリン及びさらに新規抗生物質７−クロロ− ８−メトキシテトラサイクリン（実質的に純粋に単離可能）を含有する抗生物質 複合体ＥＳ−１１９を産生ずる；Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａｖａｒ、ａｎｔｌｂｉｏ ｔｌｃａｖａｒ、ｎｏｖ、ＡＴＣＣ５３１８０は実質的に７−クロロ−８−メト キシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含有しない新規抗生物質７−クロロ −８−メトキシテトラサイクリンを含有する抗生物質複合体Ｔｅｔ、７を産生す る； Ｄ、　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９は新規抗生物質７−クロロ−４ａ−ヒ ドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンを含有する新規抗生物質７２７３複合 体を産生ずる。

すべてのこれらのテトラサイクリン誘導体は一緒に一般式〔式中、Ｒは水素原子 又はヒドロキシ基であり、Ｒ１は水素原子又はメチル基である、但し、Ｒ及びＲ １の少なくとも一方は水素原子である〕 により表わすことができる。本発明はまた式１のテトラサイクリンの薬剤上許容 できる塩を含有する。

上記の簡易名は本明細書を通じて用いるけれども、完全を期すために、これらの テトラサイクリンの系統名をここで与える。

７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン（Ｒ−Ｒ１−Ｈ）ニア−クロロ−４ −ジメチルアミノ−８−メトキシ−１，４゜４ａ、５，５ａ＋　６，１１１２ａ −オクタヒト０−３．　６．１０゜１２、１２ａ−ペンタヒドロキシ−６−メチ ル−１，１１−ジオキソ−２−ナフタセン−カルボキサミド；７−クロロ−４ａ −ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン（Ｒ−ＯＨ，Ｒ’−Ｈ）ニ ツークロロ−４−ジメチルアミノ−８−メトキシ−１，４゜４ａ、５，５ａｌ　 ６１１１１１２８−オクタヒドロ−３＊　４ａ、６゜１０、１２．１２ａ−ヘキ サヒドロキシ−６−メチル−１，１１−ジオキソ−２−ナフタセン−カルボキサ ミド；７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリン（Ｒ−Ｈ ，Ｒ−ＣＲ２）ニ ア−クロロ−４−ジメチルアミノ−８−メトキシ−１，４゜４　ａ、５．　５　 ａ＊　６＋　１１．１２ａ−オクタヒドロ−３＋　６＋　１（Ｌ１２、１２ａ− ペンタヒドロキシ−６−メチル−１，１１−ジオキソ−２−（２’−Ｎ−メチル ナフタセン）−カルボキサミド。

本発明の抗生物質及び抗生物質複合体は、同化性窒素及び炭素源を含有するｐＨ 及び温度調節した水性栄養培地中で好気的条件下で上記微生物菌種を、実質的な 抗生物質活性を有しかつ本発明の抗生物質又は複合物が産生ずるまで、培養する ことにより産生される。

本発明はまた抗生物質作用上有効な量の上記式Ｉのテトラサイクリン又は薬剤上 許容できるその塩及び薬剤上許容できる担体又は希釈剤を含有する薬剤組成物を 提供する。

本発明は更に感染症にかかった宿主、例えば桶乳類に抗生物質作用を誘導するに おいて、上記宿主に抗生物質作用上有効な量の上記式１のテトラサイクリンもし くは薬剤上許容できるその塩、又は上記の薬剤組成物を投与することから成る方 法を提第１図は７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンの赤外線スペクトル である。

第２図は７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンのｔＨ−ＮＭＲスペクトル である。

第３図は７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンのＫＢ ｒでの赤外線スペクトルである。

第４図はアセトン−ｄ６及びメタノール−ｄ４の混合物中での７−クロロ−８− メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンのＬＨ−ＮＭＲスペクトルである 。

第５図は７−クロロ−４８−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンのＫＢ ｒでの赤外線スペクトルである。

第６図はジメチルスルホキシド−ｄ６中での７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８ −メトキシテトラサイクリンのＩＨ−ＮＭＲスペクトルである。

第７図はジメチルスルホキシド−ｄ６中での７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８ −メトキシテトラサイクリンの完全にデカップリングしたプロトン１３Ｃ−ＮＭ Ｒである。

第８図は７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンの化学 的イオン化質量スペクトルである。

その調製に有用な抗生物質及び微生物を順に記載する。

同定特性をもつ菌株を適切な栄養培地中で育成するときに製造される。

この抗生物質複合体は、以下の手順を用いて、発酵ブイヨンから溶媒抽出及び濾 過により単離することができる。

（ａ）全ブイヨンのｐｕを２に調整し、ン濾過する、（ｂ）炉液のｐｌを８．５ に調整する、（Ｃ）ブイヨンの各容量に対してその都度２容量の有機溶媒（例え ば酢酸エチル）を用いて炉液を抽出する、（ｄ）有機溶媒抽出液を合わせてスト リッピングにより有機溶媒を除去して固体残留物を生成する、 （ｅ）残留物をアセトンに溶かし、不溶物を炉別する、（ｆ）沈澱が生成するま でエチルエーテル：ヘキサンの１＝４（ｖ　／　ｖ　）混合物を炉液に加える、 （ｇ）沈澱を集める。

上記の手順を用いて、１００１ｇの抗生物質複合体が３．５ｇの発酵ブイヨンか ら得られた。この抗生物質複合体は少なくとも２種の異なる成分からできている ため、該複合体に対して適切な物理化学的データを測定することができない。

Ａ２．抗生物質複合体の分離 この抗生物質複合体は少なくとも２種の活性成分がらできており、そのうちの１ 種は単離され、新規の８−置換テトラサイクリン、７−クロロ−８−メトキシ− ２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンであると性状決定された。

７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含有する活性 な抗生物質は、この抗生物質複合体がら（ＨＣｌ３塩として）クロマトグラフィ ー例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５ゲルカラムを用いて 単離することができる。

カラムからの溶出液（希ＨＣρ水）はＳ、　ａｕｒｅｕｓ及びＥ、　ｃｏｌｉに 対する各フラクションの活性を測ることにより監視した。所望の活性フラクショ ンを合わせ、凍結乾燥して、淡黄色粉末が得られ、これを塩化メチレン：ヘキサ ンから結晶化させて新規７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサ イクリンが得られた。

Ａ３．７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンについて の物理的及び分光学的データを以下の第１表に示す。

第　１　表 ７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンについての物理 化学データ （ａ）ＥＩ−ＭＳはＭ＋ピークを５２２．１４１４に生じた。これは正確な質量 ５２２．１４０５にあたる式Ｃ２４Ｈ２７０９Ｎ２Ｃｆｌに相当する。

（ｂ）メタノール中での紫外線吸収極大は２３４（ε１７．４００）、２５０　 （ｅ　１５．７００）及び３７４ｎｍ　（ｅ　１９，５００）である。酸を加え ると紫外線吸収極大は２３２（ε１５．８００）、２５８（ε１７，６００）及 び３６９ｎｍ　（ε１８．３００）にシフトする。

塩基を加えると該極大は２４０（ε２０．４００）及び２８１ｎｍ（ε１４．６ ００）及び３８５正（ε１ｇ、９００）にシフトする。

（ｃ）ＫＢｒでの赤外線スペクトルは第３図に示す。特性吸収バンドは次のもの である：　３４２０　（ｂｒ）　、１８８０．１６０ｇ、　１５７４゜１４３２ 、１４１４．１３８０．１２４０及び１２１０（Ｊ−’。

（ｄ）アセトン−ｄ６及びメタノール−ｄ６の混合物中での’Ｈ−ＮＭＲは第４ 図に示す。

７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイＣ−２９６，５ ＣＯＮＨＣＨ３１６９，９ Ｃ−３１８６，３ Ｃ−４６８，０ Ｎ（ＣＨ３）２４１．５ａ Ｃ−４ａ　３４．８ Ｃ−５２８，９ Ｃ−５ａ　４２．３ａ Ｃ−６８１４８，５ Ｃ−９１００，０ ｃ　−ｉｏ　ｔｅｉ、ｓ Ｃ−１０ａ　１ｇｇ、６ 第　ＩＡ　表　（つづき） ７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイＣ−１１１９０，６ Ｃ−１１ａ　１０５．４ Ｃ−１２１７４，１ Ｃ−１２ａ　７３．６ ０−　ＣＨ３５６，９ Ｎ−ＣＨ３（２’　−Ｎ）　２６．５ ａ−ＤＭＳＯビーク下に隠れるがＤ２０／ジオキサン中でス°ベクトルを実施し たときに観測されるピークを示す。

ｂ−７−タロロチトラサイクリンの１３Ｃ−ＮＭＲでのＣ−８炭素の共鳴は１４ ０ｐｐｍに現われる。７−クロロ−８−メトキシ−２′　−Ｎ−メチルテトラサ イクリンにおけるＣ−８炭素の１６３．２へのシフトは新規なメトキシ置換基の 存在を示す。

上記データに基づけば、この化合物の構造（立体化学は特定せず）は以下の通り である。

Ａ４．抗生物質複合体及び７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラ サイクリンの生物学的性質７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラ サイクリンを包含する、少なくとも２成分を含有するこの抗生物質複合体は、生 体外（インビトロ）で試験したとき種々のダラム陽性菌及びグラム陰性菌に対し て活性である。

７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリン及びテトラサイ クリンを用いてミュラー・ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｌｎｔｏｎ）ブイヨン 中で従来のミクロ規定濃度（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）希釈法を経て行なった生体 外での抗菌活性比較試験では、７−クロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテ トラサイクリンは０．３６の幾何平均最小発育阻止濃度（ＧＭＭ。

ｍｃｇ　／ｍｌ）で９１のグラム陽性テトラサイクリン感受性菌に対して活性を 示し、これはテトラサイクリンのＧＭＭ　（０，４６）よりも良好である。２３ のグラム陰性テトラサイクリン感受性菌に対してテトラサイクリンの２．３のＧ ＭＭに比べて７−クロロ−８−メトキシ−２′　−Ｎ−メチルテトラサイクリン は３３のＧＭＭを有する。２３のグラム陰性菌には９種の菌株の大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）　、８種のクレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）　、４種のエンテ ロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及び２種のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌ　Ｉａ）が含まれる。７−クロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテトラ サイクリンは９種のメチシリン耐性のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ ｏｃｃｉ）に対して０．８６のＧＭＭ。

５４種のメチシリン感受性菌に対して０．４８のＧＭＭ、２５種のスト含む）に 対しての０．１５のＧＭＭ、及び１０菌種のバクテロイデス　フラジリス（Ｂａ ｃｔｅｒｏｊｄｅｓ　ｆｒａ　１ｌｌｓ）に対して０，４１のＧＭＭ（５％羊血 を用いたミュラー・ヒントン寒天培地で試験）を有した。

７−クロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンは以下のＢ項で 記載の如く抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９から及び抗生物質Ｔｅｔ、７から（少量で ）単離することができる。

Ｂ１．抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９の単離及び精製抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９は、 ＡＴＣＣ５３１０８の同定特性を有する同化性微生物、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒ ａ　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｌｏｔｉｃａ　ｖａｒ。

ｎｏｖ、を適当な培地中で生長させたときに産生ずる。

抗生物質ＥＳ−１１９は以下の手順を用いて発酵ブイヨンから単離することがで きる。

（ａ）全ブイヨンのｐＨを２に調整し、抗生物質ＥＳ−１１９及び生物学的に不 活性な有機化合物を含有する溶液から菌糸体を分離する； （ｂ）上記溶液を抗生物質ＥＳ−１１９を含有する溶液と生物学的に不活性な有 機物質を含有する液に分離する；及び（Ｃ）抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９を含有す る溶液から溶媒を除去して抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９を固体残留物として産生ず る。

小規模では、段階（ｂ）での分離は通常上記溶液１容量ずつにつきその都度１容 量の有機溶媒（例えば水で飽和したｎ−ブタノール）を用いて上記溶液を溶媒抽 出することにより達成される。より大きな製造規模では、水性アルコール混合物 （例えば２５％、５０％メタノール水及び１００％メタノール）及び希鉱酸水゛ を含有するアルコール（例えばメタノール：　０．０２　ＮＨＣｇ）を用いて溶 出させて中性樹脂（例えば、ＸＡＤ−２、−４又は−ｔｅ、ローム及びハス（Ｒ ｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ）、から入手できる中性ポリスチレン樹脂、フィラデ ルフィア、ＰＡ）の上でのカラムクロマトグラフィーを通常用いて生物学的不活 性有機物を除去し、抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９を含有する溶出液を産生ずる。

Ｂ２．抗生物質Ｔｅｔ、７の単離及び精製抗生物質Ｔｅｔ、７は、ＡＴＣＣ５３ １８０の同定特性を有する同化性微生物、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎ ｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ｖａｒ、ｎｏｖ。

を適当な培地中で生長させると産生される。

・抗生物質Ｔｅｔ、７は抗生物質ＥＳ−１１９に関して上記した手順を用いて発 酵ブイヨンから単離することができる。

Ｂ３．抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９及びＴｅｔ、７の精製及び７−クロロ−８−メ トキシテトラサイクリンの単離 抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９は少なくとも２つの活性（テトラサイクリン）成分（ 約６０７４０比）からできており、抗生物質ＥＳ−１１９について適切な物理化 学データを得ることができない。

抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９から単離された主（６０％）成分は、上記の、７−ク ロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンと同定され、他方の単 離された活性成分は新規の７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンとして特 徴づけられた。

７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンを含有する該活性抗生物質は、例え ば０１８カラム例えばμｍボンダバック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　Ｃｔ８について の高性能逆相液体クロマトグラフィー又はセファデックスＧ−２５ゲルカラムク ロマトグラフイーを用いてクロマトグラフィーにより抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９ から分離することができる。大規模な調製のためには、セファデックスＧ−２５ ゲルカラムクロ！トゲラフイーを用いることが好ましい。クロマトグラフィーカ ラムからの溶出液はＢ、　５ｕｂｔｉ１１ｓ、　ＡＴＣＣ６６３３及びＥ、　ｃ ｏｌｔ、　ＯＬＡ　２９０Ｒ５に対する各フラクションの活性をディスク試験す ることにより監視した。所望の活性フラクションをプールし、凍結乾燥すると７ −クロロ−８−メトキシテトラサイクリン及び７−クロロ−８−メトキシ−２’ −Ｎ−メチルテトラサイクリンが得られた。

抗生物質Ｔｅｔ、７は実質的に７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテ トラサイクリンを含まず（即ち約１％未満）はとんど７−クロロ−８−メトキシ テトラサイクリンのみを含有する。Ｔｅｔ、７の精製及び７−クロロ−８−メト キシテトラサイクリンの単離は抗生物質ＥＳ−１１９に関して上記した手順を用 いて行なう。

本明細書で記載する及び第１Ｘ−ＸＩＩ表に関してより詳細に及び５３１８０） は、種Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａの別個の亜種の代表例である 。

Ｂ４．７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンについての物理的及び分光学 的データを下記の第■表に表わす。

第■表 ７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンについての物理化学的データ （ａ）グリセロール中での高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）は５０ ９．１２８４にＭ十Ｈピークを生じた。これは正確な質量５０９．１３２７にあ たる式Ｃ２３Ｈ２６Ｎ２０９Ｃｆｌに相当する。

（ｂ）メタノール中での紫外線吸収極大は２３５（６１５，４００）、２４９（ ε１４．３００）及び８７４ｎｍ　（ε１７．０００）である。酸を加えると紫 外線吸収極大２３３（８１６，５００）、２５８（ε１６．１００）及び３７０ 止（ε１６．２００）にシフトする。該極大は塩基を加えると２４１（ε１７， ９００）　２８０（ε１２．８００）及び３８５正（ε１６．６００）にシフト する。

（ｃ）ＫＢｒでの赤外線スペクトルは第１図に示す。特性吸収バンドは以下の通 りである：　３５３０　（ｂｒ）　、１Ｂ５０．１６１０．１５８０゜１３８０ 、及び１２４０ｃｍ−’。

（ｄ）アセトン−ｄ　及びメタノール−ｄ４の混合物中での１Ｈ−ＮＭＲは第２ 図に示す。

（ｅ）７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン、７−クロロ−８−メトキシ −２′−Ｎ−メチルテトラサイクリン及び７−クロロテトラサイクリンについて の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータは第１ＩＡ表に表わす。

第　ｍＡ　表 ７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン（化合物Ａ）、７−クロロ−８−メ トキシ−２′　−Ｎ−メチルテトラサイクリン（化合物Ｂ）及び７−クロロテト ラサイクリン（化合物Ｃ）共鳴（ｐｐｍ） 炭　素　化合物Ａ　化合物Ｂ　化合物ＣＣ−１１９４，０１９３，１１９Ｌ４ Ｃ−２９５４９６，５９５，６ ＣＯＮＨＲ１７１，９（Ｒ＝Ｈ）　１６９．９　（Ｒ−ＣＨ２）　１７２．１（ Ｒ＝Ｈ）Ｃ−３１８７，３１８６，３１８７，３Ｎ（ＣＨ３”）　２４１．５　 ４１．５ａ４１．０ａＣ−４ａ　３４．４　３４．８　８４．９Ｃ−５２７，０ ２６，９２７，１ Ｃ−５ａ　４２．４ａ４２Ｊａ４２．０′ＬＣ−６７３，４７３Ｊ　７０．４ Ｃ−６−ＣＨ３２０，５２０，４２５，０Ｃ−６ａ　１４８．５　１４８．５　 １４３．６Ｃ−７１１１，６１１１，８１２１，２第　ＩＩＡ　表　（つづき） Ｃ−８１６３４（ＯＣＨ３）　ｂ１６３．２（ＯＣＨ３）　ｂ１３９．７　（Ｈ ）ｂＣ−９１００，１１００，０１１８，９Ｃ−１０１Ｂｉ、９　１８１．８　 １６０．７Ｃ−１０ａ　１１１．６　１０８．６　１１７．０Ｃ−１１１９０， ５１９０，６１９３，４Ｃ−ＩＬａ　ＬＱ５．６　１０５．４　１０６．１Ｃ− １２１７４Ｊ　１７４．１　１７５．７Ｃ−１２ａ　７３．９　７３．６　７３ ．２Ｏ−ＣＨ３５７，０５Ｂ、９　− Ｎ−ＣＨ３（２°−Ｎ）　−２６，５−ａ−ＤＭＳＯピーク下に隠れるがＤ２０ ／ジオキシサン中でスペクトルを実施したときに観測されるピークを示す。

ｂ−７−クロロテトラサイクリン、化合物Ｃ１での１３９．７ｐＩ）Ｉから７− クロロ−８−メトキシテトラサイクリン、化合物Ａ１での１６３ｐｐｏ＋へのＣ −８炭素のシフトはＯ−Ｃ１３基の存在を示す。

上記物理化学的データに基づけば、７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン の構造（立体化学は特定せず）は以下のもＢ５．抗生物質ＥＳ−１１９抗生物質 Ｔｅｔ、７及び７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンの生物学的性質抗生 物質Ｅ　Ｓ　−１１９及び抗生物質Ｔｅｔ、７及びそれぞれの共通成分７−クロ ロ−８−メトキシテトラサイクリンを生体外で試験し、種々のグラム陰性菌及び グラム陰性菌に対する活性を見出した。

ミュラー・ヒントンブイヨン中での従来のミクロ規定濃度希釈法を経て行なった 生体外での抗菌活性比較試験では、７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン が０．１２の幾何平均最小発育阻止濃度（ＧＭＭ、　ｍｃｇ　／ｍｌ）で９１の グラム陰性のテトラサイクリン感受性菌に対して活性であることを示し、これは テトラサイクリンについてのＧＭＭ　（０，４６）及び７−クロロ−８−メトキ シ−２′　−Ｎ−メチルテトラサイクリンについてのＧＭＭ　（０，３６）より も良好である。７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンは、２３のグラム陰 性のテトラサイクリン感受性菌に対して、テトラサイクリンについての２，３の ＧＭＭ及び７−クロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンにつ いての３３．０に比較して４．２のＧＭＭを有する。２３のグラム陰性菌には９ 種の菌株のＥ、　ｃｏｌｔ、８種のＫｌｅｂｉｅｌ　Ｉａ、　４種のＥｎｔ、ｅ ｒｏｂａｃｔｅｒ及び２種のＳａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａが含まれる。７−クロロ− ８−メトキシテトラサイクリンは９のメチシリン抵抗性の５ｔａｐｈｙ１ｏｃｏ ｃｃｉに対して０．２１のＧＭＭ、５４のメチシリン感受性の５ｔａｐｈｙ　１ ｏｃｏｃｅｉ菌に対して０．１４のＧＭＭ、２５の５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｌ　 （群Ａ、　Ｂ、Ｃ，Ｇ　；　Ｓ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、　Ｓ、ｖｉｒｉｄａ ｎｓ、　Ｓ、　ｆａｅｃｌｕｍ及びＳ、　ｆａｅｃａｌｉｓを含む）に対して０ ．０６のＧＭＭ、及び１０種のＢａｃｔｅｒｏｌｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｌｓに対 して０．１６のＧＭＭ　（５％羊血を用いてミュラー・ヒントン寒天培地で試験 ）を示した。

Ｃ０抗生物質７２７３複合体の単離及び精製Ｃ１，抗生物質７２７３複合体は、 新種Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｖｅｓｃｕｍの同化性生体、特にＡＴ ＣＣ３９４９９の同定特性を有する菌種、を適当な栄養培地中で生長させると産 生される。

抗生物質７２７３複合体は発酵ブイヨンから溶媒抽出及びン濾過により並びに以 下の手順を用いることにより単離することができる。

（ａ）全ブイヨンのｐＨを４に調整する；（ｂ）ブイヨン各１容量につきその都 度２容世の有機溶媒（例えば酢酸エチル）を用いて全ブイヨンを抽出する；（Ｃ ）有機溶媒抽出液をあわせて、ストリッピングにより有機溶媒を除去して固体残 留物を生じさせる；（ｄ）残留物をアセトンに溶かし、不溶物を炉別する；（ｅ ）　１　：　４　（ｖ／ｖ）の酢酸エチル：ヘキサンの混合物を沈澱が生成する まで滑液に加える；及び （ｆ）沈澱物を集める。

上記手順を用いて１２．５ｇの抗生物質７２７３複合体が８０ｇの発酵ブイヨン から得られた。抗生物質７２７３複合体は少なくとも２つの異なる成分からでき ているので、該複合体について適切な物理化学データは測定できない。

Ｃ２，抗生物質７２７３複合体の分離 抗生物質７２７３複合体は少なくとも２種の活性成分からできており、一方は単 離され本発明の新規な４ａ−１８−置換クロロテトラサイクリン、７−クロロ− ４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン、として特徴づけられた。

７−クロロ−４８−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンを含有する、該 活性抗生物質は、例えばセファデックスＧ−２５ゲルカラムを用いて、クロマト グラフィーにより抗生物質７２７３複合体から（ＨＣ４塩として）単離すること ができる。

関しした。所望の活性フラクションを合わせ、凍結乾燥すると、７−クロロ−４ ８−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンが薄黄色粉末として得られた。

Ｃ３，７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンについて の物理的及び分光学的データを以下の第■表に表わす。

第■表 ７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンについての物理 化学的データ （ａ）高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）は５２５．１２７３にＭ＋ ピークを生じた。これは正確な質量５２５．１２７６にあたる式Ｃ２３Ｈ２５Ｎ ２０□。ＣＩ＋Ｈに相当する。

（ｂ）メタノール中での紫外線吸収極大は２３４（ε１６．７５０）、２５８（ ε１５，５００）及び３７２ｎｍ　（ε１８，０００）である。紫外線吸収極大 は酸を加えると２３３（ε１５．５００）、２５８（ｅ　１６，８００）及び３ ６８ｎｍ　（ｅ　１７，２００）にシフトする。紫外線極大は塩基を加えると２ ４０（ε１８，８００）　２８０（ε１６，４００）及び３８１ｎｍ　（ε１７ ．７００）にシフトする。

（ｃ）ＫＢｒでの赤外線スペクトルは第５図に示す。特性吸収バンドは以下のも のである：　３４０　（ｂｒ）　、ｆｅｌｌ、　１５７０．１５５８゜１４Ｂ１ ．１４３３．１４１４．１３８０．１３０９．１２４０及び１２０９ｃｍ’。

（ｄ）デュテリウム置換したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ　）中でのＩ Ｈ−及び完全にデカップルしたプロトン１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ第 ６及び７図に示す。

（ｆＥｌ）化学イオン化質量スペクトルを第８図に示す。

（ｆ）７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン（化合物Ａ）７−クロロ−４ ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン（化合物Ｂ）及び７−クロロテ トラサイクリンについての完全にデカップルした１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル９デ ータを以下の第■表に表わす。

第　ＨＡ　表 ７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン（化合物Ａ）、７−クロロ−４ａ− ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン（化合物Ｂ）及び７−クロロテトラ サイクリン（化合物Ｃ）共鳴（ｐｐｍ） 炭　素　化合物Ａ　化合物Ｄ　化合物ＣＣ−Ｉ　Ｌ９４．０　１９３．１　１９ ３．４Ｃ−２９５，３９８，２９５，６ ＣＯＮＨ２１７１，９１７２，７１７２，１Ｃ−３１８７４１８８，４１８７， ３ Ｃ−４６８４７０，０６８，１ Ｎ　（ＣＨ３”）　２４１．５ａ４０．７ａ４１．０ａＣ−４ａ　−Ｒ３４，４ ７８，９３４，９（Ｒ−Ｈ）　（Ｒ−ＯＨ）ａ（Ｒ−Ｈ）Ｃ−５２７，０３１， ４２７，１ Ｃ−６７３，４７３，０７０，４ ＣＨ−Ｃ−６２０，５２０，１２５，０Ｃ−６ａ　１４８．５　１４８．８　１ ４３．８Ｃ−７１１１，６１１１，６１２１，２共鳴（ｐｐｍ＞ Ｃ−８１８３Ｊ　１Ｂ３．１　１３９．７（ＯＣＨ３）　０（ＯＣＨ３）　０（ Ｈ）　’Ｃ−９１００，１１００，０１１８，９Ｃ−１０１６１，９１６１，８ １８０，７Ｃ−１０ａ　ｌ１１．６　ＬＯ８，６１１７，０Ｃ−１１１９０，５ １８９，７１９３，４Ｃ−１１ａ　１０５．６　１０４．３　１０８．１Ｃ−１ ２１７４Ｊ　１７３．６　１７５．７Ｃ−１２ａ　７３．９　７３．５　７３． ２Ｏ−ＣＨ３５７，０５６，９− ａ−７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン及び７−クロロテトラサイクリ ンの１３Ｃ−ＮＭＲでのＣ−４ａの共鳴は約３４〜３５ｐｐｍに現われる。７− クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン（化合物Ｂ）におけ るＣ−４ａの７６．９ｐｐｍ　ヘのシフトは新規な４ａ−ヒドロキシ置換基を示 す。

ｂ−ＤＭＳＯピーク下に隠されるがＤ２ｏ／ジオキサン中でのスペクトルで測定 される。

ｃ−７−クロロテトラサイクリンの１３Ｃ−ＮＭＲでのＣ−８炭素の共鳴は１４ ０ｐｐｍに現われる。７−りロワー４ａ−ヒドロキシー８−メトキシテトラサイ クリンにおけるＣ−百炭素のｉｅｓ、ｉへのシフトは新規なメトキシ置換基を示 す。

上記のデータに基づけば、７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラ サイクリンの構造（立体化学の特定せず）は以下のものである。

ＯＨＯＯＨＯ Ｃ４，抗生物質７２７３複合体及び７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキ シテトラサイクリンの生物学的性質７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキ シテトラサイクリンを包含する、少なくとも２種の生物学的活性成分を含有する 抗生物質７２７３複合体は、生体外で試験したとき種々のグラム陰性菌及びグラ ム陰性菌に対して活性である。

７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン及びテトラサイ クリンを用いてミュラー争ヒントンブイヨン中での従来のミクロ規定濃度希釈法 を経て行なった生体外での抗菌活性比較試験では、７−クロロ−４ａ−ヒドロキ シ−８−メトキシテトラサイクリンは、９１のダラム陽性テトラサイタリン感受 性菌に対して１．７７の幾何平均最小発育阻止濃度（ＧＭＭ、、ｗｃｇ／ｍｌ） で活性を示し、これはテトラサイクリンについてのＧＭＭ　（０，４Ｅｉ）と同 様である。２３のグラム陰性テトラサイクリン感受性菌に対して、テトラサイク リンについては２．３のＧＭＭに比べて７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メ トキシテトラサイクリンは７．８のＧＭＭを有する。この２３のグミ−ヒドロキ シ−８−メトキシテトラサイクリンは、９のメチシリン抵抗性　３ｔＨｐ１１ｙ ｌｏｃｏｃｃｉに対して２．８３のＧＭＭ。

５４のメチシリン感受性菌に対して２．８３のＧＭＭ、２５の０．５７のＧＭＭ （５％羊血を用いてミュラー・ヒントン寒天培地で試験）を有した。

７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリン及びクロロテト ラサイクリンを用いて、ミュラー・ヒントン寒天培地中で従来の希釈法を経て行 なった他の一連の生体外での抗菌活性比較試験では、７−クロロ−４ａ−ヒドロ キシ−８−メトキシテトラサイクリンは２０のグラム陽性クロロテトラ対して活 性を示した。２４時間試験では、クロロテトラサイクリンについては０．１７５ のＧＭＭに比べて、７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイク リンは１．３のＧＭＭを有した。７の５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ及び１の５ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを包含する８のクロロテトラサイクリン抵抗性（ＭＩ Ｃ≧８）菌株に対して、クロロテトラサイクリンについては２０．７のＧＭＭに 比べて、７−クロロ−４８−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンは５８ ．７のＧＭＭを有した。８のＥ、　ｃｏｌｔ、２のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ。

９のＫｌｅｂｓｉｅｌ　Ｉａ、各々１のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、　５ｅｒｒａｔ ｉａ及びＳｂｉｇｅｌ　Ｉａを包含する２２のクロロテトラサイクリン感受性菌 株に対して、クロロテトラサイクリンについては３．３のＧＭＭに比べて、７− クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンは３．０のＧＭＭを 有した。７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンはタロ ロチトラサイクリン感受性のグラム陰性菌株に対してクロロテトラサイクリンと ほぼ同じ有効性を有するが、クロロテトラサイクリン感受性のグラム陰性菌株に 対してはクロロテトラサイクリンよりも約８倍少ない有効性を有した。

新規な７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンの上記活性に加えて、特に好 ましい活性を下表に例示する。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ１に対する７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン のＭＩＣ値 幾何平均Ｍ　Ｉ　Ｃ（ｍｃｇ／　ｍｌ、２４時間、ＭＨＢ＋５％ウマ血清、ミク ロ規定濃度）ｆＪ　株番員Ａ　Ｂ　Ｄ　ＴＣＤＯＸＭＩＮＳ、ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ　５　０．０４　０．０７　０．１２　０．１４　０．１２　２．Ｏ８，ｖ ｉｒｉｄａｎｓ　２　０．１２　０．２５　０．７１　０．７１　０．５０　４ ．０群Ａ　５　０．０５　０．１４　０．２９０．２９０．２５１．３群Ｂ　１ 　０．１２０．２５１．０１．００．５０２．０群Ｃ３０，０４０，１２０，２ ５０，３２０，２５２，０群Ｇ　３　０．０ｇ　０．１２０．４００．５００． ２０２．５Ｓ、ｆａｅｃａｌｉｓ　２　０．１２　０Ｊ５　５．７　０．７１　 ０．５０　１．４Ｓ、ｆａｅｃｉｕｍ４０．０Ｂ　０．２５　１．２　０．５０ 　０．３０　２．０全５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　２５　０．０Ｂ　０．１５　 ０．４５　０Ｊ６　０．２５　１．９Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅに対する７−クロロ−８＝幾何平均Ｍ　Ｉ　Ｃ（ｍｃｇ／ｍｌ、　２４時間 チョコレート寒天培地＋１％イソビタレックス（Ｉｓｏ　Ｖｉｔａｌｅｘ）ＭＨ Ｂ：ミュラー争ヒントンブイヨン、Ａ、Ｂ、　Ｄ：第１Ｉａ及びＨＡ表で同定し た通りである；ＴＣ：テトラサイクリン；ＤＯＸニドキシサイクリン；ＭＩＮ： ミノサイクリン。

本新規テトラサイクリン抗生物質は、治療薬用量にて実質的に無毒である。実際 にその低い毒性は、下表（ここで化合物は第ｎＡ及びＨＡで同定したものである ）に示す通り、７−クロロテトラサイクリンと同様である。

マウスにおけるＬ　Ｄ　５０．静脈内注射、　ｍｇ／ｋｇ：化合物　ＡＢＤＣ ＬＤ５０８５　９０　１１０　１１０ 本発明はまた宿主、例えば感受性細菌感染を有する人間の如き温血哺乳類に抗菌 効果を誘導するにおいて、上記宿主に抗菌的有効量の７−クロロ−８−メトキシ テトラサイクリン、７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイク リン又は７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリン、又は その薬剤上許容できる塩を投与することから成る方法に関する。「誘導する（ｅ ｌｌｃｉｔｉｎｇ）Ｊは感受性細菌感染を処置又は予防することを意味する。

本発明の方法は、薬剤上許容できる担体及び薬剤上有効量の７−クロロ−８−メ トキシテトラサイクリン、７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラ サイクリンもしくは７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイク リン又はその薬剤上許容できる塩を含有することがら成る薬剤組成物を用いるこ とにより達成され、これは本発明の特徴でもある。

好ましい薬剤上許容できる塩は酸付加塩である。７−クロロ−８−メトキシテト ラサイクリン、７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテ）・ラサイクリ ン又は７−クロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンの薬剤上 許容できる酸付加塩は、薬剤上許容できるアニオンを含有する強酸から生成され るもの、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸水素塩及びトリクロロ酢酸塩である 。酸付加塩は、２〜１８個の炭素を有する、ジカルボン酸を含むカルボン酸、例 えば脂肪族、脂環式、芳香族及び複素環式カルボン酸を用いて生成することもで きる。かかる酸の典型的な例は、酢酸、プロピオン酸、ステアリン酸、酒石酸、 マレイン酸、シクロプロピルカルボン酸、シクロペンチルカルボン酸、アダマン トン（ａｄａｍａｎｔｏｉｃ）酸、フランカルボン酸、ニコチン酸、テノン（ｔ ｈｅｎｏｉｃ）酸、ピコリン酸、安息香酸、フェニル酢酸等である。

本発明の抗生物質はあらゆる適切な薬剤担体と組合わせることができ、種々の配 合剤で経口的、非経口的、又は外用的に投与できる。経口投与においては、本発 明の抗生物質は錠剤、カプセル剤、エリキシール剤等の形態であり得る。錠剤及 びカプセル剤は澱粉又は乳糖の如き左側を含有でき、液体経口形態は着色剤又は 香味料を含有することができる。外用調製物はクリーム、疎水性及び親水性の軟 膏、又は水性、非水性又は乳化型・ローションの形態であり得る。かかる配合剤 の典型的な担体は、水−オイル、グリース、ポリエステル及びポリオールである 。非経口的配合剤例えば注射可能な投与形態は通常溶液又は懸濁液の如き液体で あり、典型的な担体は蒸留水及び生理的食塩水である。

本発明の抗生物質の経口投与が好ましい。

あらゆる特定投与形態において投与されるべき薬用量は、種々の要因、例えば処 置される動物種の年令及び状況、抗生物質に対する感染菌の感受性及び感染の段 階及び重症度、を考慮の上治療する臨床家により決められよう。

一般に、経口投与薬用量は一日当り一回又は分割薬用量で、体重１キログラム当 り約１．０　ｍｇ〜約２５ｍｇ、好ましくは約５ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである 。

一般に人間への非経口投与薬用量は一回又は分割薬用量で一日当り約１１００ｆ ｉ１〜約２０００ｍｇ、好ましくは約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇである。

ある患者を本発明の化合物で処置するにおいて、他の薬剤上の活性成分を同じ投 与単位中に含ませることができる。

微生物 各微生物を順に記載する。

Ａｃｔｉｎｏｗａｄｕｒｅ　ｂｒ’ｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１Ｂ７−クロロ −８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含有する抗生物質複合体 の産生に用いる微生物は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａ　（ＡＴ ＣＣ３９２１８）の生物的純培養物である。

Ａｃｔｌｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａは新種として分類される。

この微生物の培養物はノーザン・ユティリゼーション・アンド・リサーチφディ ビジョン、アグリ力ルチャー・リサーチ・サービス、ユーエスデパートメント・ オブ・アグリカルチャー・イン・ベオリア・イリノイズ（ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅ ｒｎＵｔｉｌｉｚａｔｌｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、 　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ、　Ｕ、　Ｓ、　 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｐｅｏｒｊａ。

１１１１ｎｏｉｓ）に寄託し、ここで寄託番号Ｎ　ＲＲＬ　１５２１６を得た。

Ａｃｔｊｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａの二次培養物は前述の政府機関がら 制限なく一般に入手できる。この微生物の培養物はメリーランド州。

ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のコ レクションの一部をなし、ここで受託番号Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１６を得た。Ａｃ ｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａＡ　Ｔ　ＣＣ３９２１６の二次培養物は 制限なし一般に入手できる。

該微生物はホエエックス（Ｐｈｏｅｎｊｘ）、アリシナ近辺で集めた土壌試料か ら単離した。該微生物の性状決定を行い、これは性を有することが見出された。

産生菌株の説明 第■〜Ｘ■表に用いた分類法は、Ｒ，Ｅ、　Ｃｏｒｄｏｎ及びＶ、　Ｂｌａｎｃ ｈａｒｄ、”Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｍａｄｕｒａの承認基準（ｓｏｍｅ　ｃｒｉｔ ｅｒｉａｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　 ｍａｄｕｒａ）　’　、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。１４５．第３５５〜３６４頁（１９６６）により；　Ｌｕ ｅｄｅｍａｎｎ及びＢｒｏｄｓｋｙ、”Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｃａｒ ｂｏｎａｃｅａ　ｓｐ、　ｎｏｖ、エベルニノミシン（ｅｖｅｒｎｆｎｏ［１Ｉ ｉｅｉｎ）産生生体”抗菌剤化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａｇｅｎｔｓ　 Ｃｈｅｍｓ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第４７〜５２頁、　１９６４により；　Ｈｏｒ ａｎ及びＢｒｏｄｓｋｙ　”新規抗生物質産生Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ。

ＡｃｔｉｎｏＩＩＩａｄｕｒａ　ｋｉｊａｎｉａｔａ　ｓｐ、　ｎｏｖ、’Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＪｏｕｒｎａｌＳｙｓｔ、　Ｂｅａｃｔｅｒｉａｌ、 、第３２巻第１９５ｃ　〜２００頁、１９８２により；Ｂｅｋｅｒら１種々の属 の“好気的放線菌の菌種からの細胞壁調製物への化学組成物（Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ１ｐｏｓ１ｔ１ｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　ＷａｌｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ 　ｆｒｏｍ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｖａｒｌｏｕｓ　Ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ａ ｅｒｏｂｌｃＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）’　、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｅｒ ｏｂｌｏｌｏｇｙ、第１３巻、第２３６〜２４３頁、　１９６Ｂにより；　Ｌｅ ｃｈｅｖａｌ　ｉｅｒ及びＬｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ、“好気的放線菌の分類にお ける基準としての化学組成物（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｏｓｉｔｌｏｎ　ａｓ 　ａ　Ｃｒ１ｔｅｒｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ａｅｒｏｂｉｃ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）　”　。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉａ ｌ、第２０巻、第４８７〜４９３頁、　１９７０により；　Ｓｈｌｒｌｉｎｇ及 びＧｏｔｔｌｆｅｂ、”ストレプトミセス種の特定方法（Ｍｅｔｈｏｃｆｓ　ｆ ｏｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｌｏｎ　ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　５ ｐｅｃｉｅｓ）　”　、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｌｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　５ｙ ｓｔ。

＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、、　Ｂａ１ｔｉａ＋ｏｒｅ、　Ｍｄ、、　１９６１ ）により引用されるもの第　■　表 最も豊富な有機培地上で　豊富な、長い、分岐した気３０℃にて１４〜２１日後 に良　中菌糸体（直径０．５〜０，８好な生長が起き、黄茶乃　ミクロン）が３ ０℃にて１０〜至茶色の拡散性色素が生　１４日後に水寒天培地上に生成する。

白乃至薄いピン　成する。気中菌糸体は２０以りの気中菌糸体が酵母抽　上の楕 円形胞子の長い直線出物−麦芽抽出物Ｃｌ５Ｐ−乃至屈曲性の鎖、（直径２）、 チロシン（ＩＳＰ−７）及　０．８〜１．２ミクロン、長さびトマトペースト− オー　１．０〜２．０ミクロン）に分トミール寒天培地上で生　解する。

成される。弱い生長はグ リセロールーアスパラギ ン寒天培地で起こる。植 物性菌糸体色素は通常黄 褐色〜こげ茶色の範囲で 第　■　表　（続き） ある。グリセロールルア スパラギンでは植物性菌 糸体はばら色である。

種々の標準的培地上での微生物Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａＮ　 ＲＲＬ　１５２１Ｂ、Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１Ｂ　＜７）培養特性を第７表に示す 。

第７表での微生物の生長特性の説明では、２つの色呼称を用いる。第１はコンテ ナ・コーポレーション・オブφアメリカ（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）　、米国により刊行された（１９５０）　Ｔ ａｙ！ｏｒ、　Ｋｎｏｃｈｅ及びＧｒａｎｖｌ　］　Ｉｓによる“記述的色名辞 典（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ　Ｃｏ１ｏｒ　Ｎａｍｅ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ） ”からとった色名であり、色名に対応するカラーチップ数をもち、該チップ数は コンテナ・コーポレーション・オブ・アメリカにより刊行された“色の調和マニ ュアル（Ｔｈｅ　Ｃｏ１ｏｒ　Ｈａｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｕａｌ）　”第４版、　 １９５８．からとる。第２の呼称は、米国標準局、サーキュラ５５３、１１月１ 日、　１９８５　（米国）で見出された同義語及び近似語に関する色名及び数か ら成る。このコメントは第Ｘ及びＸＩＶ表にもあてはまる。

種々の炭素化合物上での微生物、　Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａ ＮＲＲＬ１５２１８　、　ＡＴＣＣ３９２１６の生長は第■表に示す。

微生物Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａＮ　ＲＲＬ　１５２１６　、 　Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１６の生理特性は第■表に示す。

Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａＮＲＲＬ１５２１Ｂ　、ＡＴ　ＣＣ ３９２１６と他種のＡｃｔｉｎｏＩＩｌａｄｕｒａの特性の比較は第１表に挙げ る。

微生物Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａＮ　ＲＲＬ　１５２１Ｂ　、 　Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１Ｂの全細胞分析により、ジアミノピメリン酸および微量 のり、Ｌ異性体が特有な細胞壁アミノ酸であり、マデュロース（ｍａｄｕｒｏｓ ｅ）　（３−ｏ−メチル−Ｄ−グラクトース）が特有の全細胞糖であると見出さ れた。

抗微生物の生長は酵母−デキストロース寒天培地上で２７°〜４０℃で起こる。

乏しい生長は４５℃で起こり、２７″〜３５℃にて最適生長である。

第　ｖ　表 Ｓ：　水平、端で突起（ｒａｉｓｅｄ）ＡＭ：　存在、中位、白色 ＤＦＰ：　存在、薄茶色 Ｃ：　ｇ３１１、ピーバー色 ツアペック（Ｃｚａｐｅｋ）ショ糖寒天培地　Ｇ：＋、中位Ｓ：　わずかに突起 八Ｍ：　存在する；まずまず、白色 ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ５ｇｃ、もも色様黄褐色 グルコース争アスパラギンφ寒天培地　Ｇニー１＋）、良好Ｓ；　突起、ヒダ（ ｆｏｌｄｅｄ） ＡＭ：　存在せず ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ４１ｅ、メープル色 第　Ｖ　表　（つづき） 培　地　生長特性 グリセロール・アスパラギン寒天培地　Ｇ：＋、まずまず（ＩＳＰ　＃５）　Ｓ ；水平、平滑 ＡＭ：　存在する；まばら、白色 ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ６ｉａ、明るいさんご様ローズ色滋養寒天培地　Ｇ：丑、中位 Ｓ：　水平乃至突起 ＡＭ：　存在する；まばら、白色 ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ３１ｇ、アドービれんが様茶色ペプトン・グルコース寒天培地　Ｇ：＋ １＋、良好Ｓ：　突起、ヒダ 八Ｍ：　存在せず ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ４ｉｃ、小麦色 ポテト・デキストロース寒天培地　Ｇ：捕、良好Ｓ：　突起、ヒダ ＡＭ：　存在せず ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ５ｇｃ、もも色がかった黄褐色第　ｖ　表　（つづき） Ｓ：　突起、ヒダ ＡＭ：　存在；まばら、白色 ＤＦＰ：　存在；茶色 Ｃ：　ｇ４１ｇ、トースト様黄褐色 Ｎ−Ｚ−アミンψグルコース寒天培地　Ｇ：ｆ、良好Ｓ：　突起、隆起（ｒｉｄ ｇｅｄ） ＡＭ；　存在せず ＤＦＰ：　存在；黄茶色 Ｃ：　ｇ３１ｇ、アドービれんが様茶色酵母抽出物・グルコース寒天培地　Ｇニ ー１＋）、良好Ｓ：　突起、ヒダ ＡＭ：　存在；まばら、白色 ＤＦＰ：　存在；茶色 Ｃ：　ｇ５ｎｉココア様茶色 トマトペースト・オートミール 寒天培地　Ｇ：＋１＋、良好 Ｓ：　突起、ヒダ 八Ｍ：　存在；豊富、白色 ＤＦＰ：　存在；灰色 Ｃ：　ｇ３ｎｌ、暗茶色 第　Ｖ　表　（つづき） 培地Ｃｌ５Ｐ＃２）　５：突起、ヒダ ＡＭ：　存在；豊富、白色 ＤＦＰ：　存在：茶色 Ｃ：　ｇ５ｎｉ、ココア様茶色 オートミール寒天培地（ＩＳＰ＃３）　Ｇ：＋、まずまずＳ：　水平、滑らか ＡＭ：　存在；中位、淡いピンク色 ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ４ｇｃ、肌色様黄褐色 無機塩・澱粉寒天培地（ＩＳＰ＃４）　Ｇ：＋、中位Ｓ：　水平、平滑 ＡＭ：　存在；中位、白色 ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ５１ｅ、さび色様黄褐色 澱粉寒天培地（Ｗａｋｓｍａｎ　＃２１）　Ｇ　：廿、中位Ｓ：　水平、平滑 ＡＭ：　存在；まばら、白色 ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ５ｉｅ、銅色様黄褐色 第　Ｖ　表　（つづき） （Ｗａｋｓｍａｎ　＃７）　Ｓ　：わずかに突起、ヒダＡＭ：　存在せず ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ５ｉｃ、明るいカキ色 ペプトン鉄寒天培地　Ｇｅｌ、餅 Ｓ：　突起、ヒダ 八Ｍ：　存在せず ＤＦＰ：　存在せず Ｃ：　ｇ３１ｅ、ラクダ色 チロシン寒天培地（ＩＳＰ＃７）　Ｇ：＊、良好Ｓ：　突起、ヒダ 八Ｍ：　存在；豊富、白色乃至淡いピンク色ＤＦＰ：　存在；明るい茶色 Ｃ：　ｇ４１ｇ、）−スト様茶色 澱粉酵母寒天培地　Ｇ：＋、中位 Ｓ：　突起、ヒダ ＡＭ：　存在；豊富、白色 ＤＦＰ：　存在；黄茶色 Ｃ：　ｇ４０１、暗茶色 ａ）３０℃ｌこで１４〜２１日後の観察ｂ）Ｇ＝生長；Ｓ−表面特性、ＡＭ−気 中菌糸体；ＤＦＰ＝拡散性色素；及びＣ−色 第　■　表 ＡＣＴＩＮＯＭＡＤＵＲＡ　ＢＲＬＩＮＮＥＡ　ＡＴＣＣ３９２１Ｂ　ノ炭水化 物利用１）アドニトール　丑、良　好 り−アラビノース　廿、中　位 し−アラビノース　台、良　好 セリビオース　丹、良　好 デキストリン　丹、良　好 ズルシトール　−、不　良 エリスリトール　−、不　良 フルクトース　−、不　良 し−フルクトース　丹、良　好　・ ガラクトース　−、不　良 グルコース　丹、良好 α−メチル−〇−グルコシド　−、不　良β−メチルーＤ−グルコシド　−、不 　良グリセロール　丹、良　好 イノシトール　丑、中　位 マルトース　丹、良好 マンニトール　−、不　良 第　■　表 リ　ボ　−　ス　雅、良　好 サッカロース　丹、良　好 トレハロース　丹、良　好 Ｄ−キシロース　−、不　良 １）リューデマン（Ｌｕｅｄｅｌ［１ａｎｎ）及びプロトスキー（Ｂｒｏｄｓｋ ｙ）の培地（ＡｎｔｉＩｌｌｉｃｒｏｂ、　Ａｇ、　Ｃｈｅｍｏｔｈ、　１９６ ５）第　■　表 酢　酸　塩　十 安息香酸塩　− 酪　酸　塩　十 クエン酸塩　十 ギ　酸　塩　十 グルクロン酸塩　− グルタミン酸塩　十 乳　酸　塩　− プロピオン酸塩　や コハク酸塩　十 ピルビン酸塩　＋ ５０ａ＋ｃｇ　／ｍｌの存在下での生長ストレオマイシン　十 ロサラマイシン　− エリスロマイシン　＋ 第　■　表　（つづき） ＡＣＴＩＮＯＭＡＤＵＲＡ　Ｂｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１９の生理学的特性 テトラサイクリン　＋ ヒポキサンチン　＋ 馬尿酸塩　− エ　ス　タ　リ　ン　＋ 第　■　表　（つづき） ２７℃　丑、中　位 ３５℃　升、良　好 ４０℃　丑、中　位 ４５℃　±、不　良 化　存 ５０℃７８時間　十 Ｎａ　ＣＪＩ）存在下での生長 ＮａＣΩ　１％　柑、良　好 ２％　丑、中　位 ３％　升、中　位 ４％　±、不　良 メラニン　− 第　■　表　（つづき） ＡＣＴＩＮＯＭＡＤＵＲＡ　Ｂｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１９の生理学的特性 レフレル血清　− ドルセットの卵（Ｉ）ｏｒｓｅｔ’ｓ　Ｅｇｇ）　−第■及び１表に示した細胞 壁分析及び形態特性に基けば本発明の微生物は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｎｒａ属の 種の範鴫に属する。第１表に挙げたこの属の命名寄託した菌株のうち本発明の微 生物は、種Ａ、　ｈｅｌｖａｔａ、　Ａ　ｆｌａｖａ及びＡ、　１Ｉｌｅｌｌｆ ａｕｒａとともに植物性菌糸体着色をもつ。

本発明の微生物Ａｃｔ１ｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１ ６（以後Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａ）は上に挙げたＡｃｔｉｎｏｒｖａｄｕｒａ種と 第１表に挙げた特性の比較により区別することができる。

Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａはＡ、ｈｅｌｖａｔａと以下の点において異なる。（１） 胞子形成菌糸体の形態：　Ａ、　ｈｅｌｖａｔａは気中菌糸体に沿って側分岐と して短かいコイル状胞子鎖を形成する；Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａは２０以上の楕円 形胞子の長い直線乃至屈曲性鎖に分解する豊富な長い分岐状気中菌糸体を生成す る；（２）マンニトールの利用：Ａ、　ｈｅｌｖａｔａはマンニトールを利用す るがＡ、　ｂｒｕｎｎｅａは利用しない；（３）抗生物質産生：　Ａ、　ｂｒｕ ｎｎｅａは新規なテトラサイクリン抗生物質７−クロロ−８−メトキシ−２′− Ｎはテメチルテトラサイクルを産生ずるが、Ａ、　ｈｅｌｖａｔａは何ら抗生物 質を示さない、　Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａはＡ、　ｆｌａｒｖａと、以下点におい て異なる。

（１）気相菌糸体の生成：　Ａ、　ｆｌａｖａ、はＡ、　ｂｒｕｎｎｅａと比較 すると気相菌糸体をほとんど生成しない；（２）マンニトールの利用：Ａ、　ｆ ｌａｖａはマンニトールを利用するがＡ、　ｂｒｕｎｎｅａは利用しない。

Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａはＡ、ｍｅｌ　１ｉａｕｒａと以下の点において異なる。

（１）形態：　ｍｅｔ　ｌ１ａｕｒａ短〜長い胞子鎖を生成し、直線状胞子鎖を 生成する２つの胞子嚢に分岐する；（２）メチル−β−Ｄ−グルクシド及びマン ニトールの利用；　Ａ、　Ｉｏｅｔ　ｌ１ａｕｒａは利用するが、Ａ、　ｂｒｕ ｎｎｅａは利用しない；（３）抗生物質産生の型：Ａ、　ｍｅｌｌｉａｕｒａは 縮合インドールアミノグリコキシドを産生し、Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａは新規テト ラサイクリン抗生物質７−クロロ−８−メトキシ−２′　−Ｎ−メチルテトラサ イクリンを産生ずる。

これらの形態学的、生理学的及び培養特性並びに新規７−クロロ−８−メトキシ −２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンの生産に基づき、本微生物はＡｃｔｉｎｏ ｍａｄｕｒａ属の独特な新種であると考えられる。

該微生物をＡｃｔｌｎｏＩＩｌａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａ、　Ｈｏｒａｎ及び 　Ｂｒｏｄｓｋｙｓｐ、　ｎｏｖと称することを提案する。上記種名は生成され る茶色の植物性菌糸体色素による。これはバクテリアの命名法（Ｓ、　Ｐ、　Ｌ ａｐａｇｅら、Ｅｄ、　１９７５．　Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｎａｌ　Ｃｏｄｅ　ｏ ｆＮｏｍｅｎｃｈａｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｌａ、　１９７６改訂）の規 則に従うと理解される。Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａはタイプ菌株（ｔｙｐｅ　５ｔｒ ａｉｎ）であり、他の菌株が見出されるべきであり、該タイプ菌株はまたタイプ 亜種（ｔｙｐｅ　５ｕｂｓｐｅｃ１ｅｓ）であろう。

微生物の醗酵 本発明の抗生物質複合体は、同化性（ｅｌａｂｏｒａｔｉｎｇ）微生物Ａｃｔ１ ｎｏｍａｄｕｒａ　Ｂｒｕｎｎｅａを、約２７℃〜４０℃、好ましくは２７℃〜 ３５℃の温度にて約６．５〜８．０のｐＨで水中好気的条件下に水性栄養培地中 で攪拌しつつ実質的な抗生物質が培地に与えられるまで成長させることにより産 生ずる。温度研究はこの菌が３０’Ｃにて急速に生長することを示す。従って、 発酵は好ましくは最初の２４時間並びに２４〜９６時間の間３０℃の単一の温度 パターンを用いて行なう。発酵は一般に３〜７日、好ましくは４日間行なう。

高の抗生物質産生に到達したときを決めるために、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓＡ　Ｔ　 ＣＣ２０９Ｐ（ｐＨ７，０）及びＥ、ｃｏｌｌ、ＡＴＣＣ１０５３６（ｐＨ８， ０）に対する全ブイヨンの生物検定により２４時間ごとに培地試料の抗生物質産 生を分析することができる。菌体の生長（圧縮した細胞容積）　、ｐ）ｌ及び溶 解した酸素レベルを継続的に又は連続的に測定することができる。

炭素源、例えば同化できる炭化水素、及び窒素源、例えば同化できる窒素または 蛋白質材料、を包含するあらゆる適当な滋養培地を用いることができる。

発酵に用いる培地は例えば主な酵素及び炭素源としてＮＺ−アミンＡ（カゼイン の酵素的加水分解産物）及び可溶性澱粉を含有することができる。これらの条件 で該微生物は、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ及びＥ、　ｃｏｌｉに対する２　：　２　： 　１　（ｖ／ｖ／ｖ）クロｏホルム：メタノール：　ｐＨ３，５酢酸塩緩衝液で の薄層クロマトグラフィープレートの展開後のバイオオートグラフィーにより決 められる少なくとも２成分を含有する本発明の抗生物質複合体を産生ずる 前述の培地は、本発明の抗生物質複合体を産生ずるＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　 ｂｒｕｎｎｅａにより利用される滋養物の典型例である。

しかしながら、多数の供給者から得られる広範な滋養物が前述のものに置き換え られ得、前述のものと機能上向等の滋養物で一般に良好な生長及び抗生物質産生 が得られることは発酵技術分野における技術者には明らかである。

発酵は一般に接種物を加える前に発酵培地の初期滅菌を行な発酵培地のｐＨは一 般に８．５〜８．０に維持され、６．５〜７．５のｐｈが好ましい。滅菌前は培 地のｐＨは通常６．７に調整し、接種前はｐ）］は通常７．５に調整する。

発酵はブイヨンに接種物を加えることにより始まる。一般に接種物８曾は総ブイ ヨン量の５％である。接種物は凍結した全ブイヨンの試料を適当な培地に加える ことにより調製する。特に好ましい培地はウシ肉抽出物、０．３％；トリプトン 、０．５％：デキストロース、０．１％；じゃがいも澱粉、２．４％；酵母抽出 物、０．５％及び炭酸カルシウム０．２％を包含することから成る。

接種物培地のｐＨは滅菌前に７．５に調整する。発酵の接種工程は通常２４〜１ ２０時間、好ましくは１〜２日必要とし、一般に約３０℃で行なわれる。

Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｌ ｃａ　ｖａｒ、　ｎｏｖ、抗生物質ＥＳ−１１９の産生に用いる微生物はＡｃｔ ｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ｖ ａｒ、　ｎｏｖ、の生物学的純粋培養物である。

この微生物の培養物は、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のコレクションの一部をなし、ここで受託番 号ＡＴＣＣ５３１０ｇを得た。

Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｌｂｉｏｔｉｃ ａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ５３１０８の二次培養物は制限なく一般に人手され得る。

抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９の産生に使用した微生物は、Ａｃｔｉｎｏ［ｌ１ａｄ ｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１６の培養物の自然突然変異株をＮ− メチル−Ｎ−ニトロソ−２′　−ニトロ−グアニジンのような突然変異誘発剤に さらすことによって製造した。

Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａの突然変異集団の代表物を平板に まき生長させた。澱粉寒天平板培地のような寒天平板を２枚用意し、単一コロニ ーが観察されるまで突然変異集団を生長させた。通常、約４日後に単一コロニー が観察され、次いで上記２枚の平板のうち１枚を適当なグラム陰性指示微生物（ 例えばＥ、　ｃｏｌｉＯＬＡ　２９０Ｒ５）を含む寒天で直接覆う。覆われた平 板上のグラム陰性指示株に対して示す阻害の清澄領域と比較することにより、目 的とするＡｃｔｆｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂ ｉｏｔｉｃａｖａｒ、　ｎｏｖ、ＡＴＣＣ５３１０８の変異コロニーを識別し、 覆っていない方の平板から回収した。Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔ ｉｂｉｏｔｆｃａＡ　Ｔ　ＣＣ５３１０８から産生される抗生物質ＥＳ−１１９ は７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンと７−クロロ −８−メトキシテトラサイクリンの約６０　：　４０の混合物からなり、Ａ、　 ｂｒｕｎｎｅａ　ＡＴＣＣ３９２１Ｂの自然突然変異株は上記２種の化合物の約 ８０　：　２０の混合物を産生じた。

抗生物質はＴｅｔ、７の産生に用いられる微生物は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ 　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ｖａｒ、　ｎｏｖ、の 生物学的純粋培養物である。

この微生物の培養物はメリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カル ジャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のコレ二次培養物は制限なく一般に入手しう る。

抗生物質Ｔｅｔ、７の産生に使用した微生物は、Ａｃｔｆｎｏｍａｄｕｒａｂｒ ｕｎｎｅａ　ＡＴ　ＣＣ３９２１Ｂの培養物から単離した高レベルストレプトマ イシン耐性変異株をＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ’　−グアニジンのような突 然変異誘発剤にさらすことによって製造酵母寒天培地のような寒天平板６００枚 以上で直径３〜４ｍｍの単一コロニーが生長するまで生育させた。従って、６０ ０枚の平板縁てを適当なグラム陰性指示微生物（例えばＥ、　ｃｏｌｔ　０ＬＡ ２９０Ｒ５）を含む寒天で直接覆った。グラム陰性指示株が生育できない清澄領 域によってＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａ　ｖａｒ。

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ｖａｒ、　ｎｏｖ、の目的とする変異コニ−を識別し た。

自然性テトラサイクリン耐性誘導体を選択し、その抗生物質産物をＴｅｔ、７と 命名した。抗生物質Ｔｅｔ、７は約１％以下の７−クロロ−８−メトキシ−２′ −Ｎ−メチルテトラサイクリンを含む７−クロロ−８−メトキシ−メチルテトラ サイクリンからなる。

生菌株の説明： 第　■　表 最も豊富な有機培地上で３０　最も豊富な有機培地上で３０℃にて１４〜２１日 後に良好な　℃にて１４〜２１日後に良好な生長が起き、茶色の拡散性　生育が 起き、茶色の拡散性色素が生成する。白〜灰色　色素が生成する。数種の培（Ｉ ＳＰ−２）および澱粉　る。植物性菌糸体色素は黄酵母寒天培地上で生成され　 褐色ビンクル茶色である。

る。植物性混合物偵糸体色 素は通常黄褐色〜暗茶色で ある。

′　ミクロン、長さ１．０〜２．０ミクロン）に分解する。

種々の標準的培地上で微生物Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａ　ｖ ａｒ。

ａｎｔｉｂｉｏｔｌｃａ　ＡＴＣＣ５３１０８およびＡＴＣＣ５３１８０の培養 特性を第Ｘ表に示す。第Ｘ表における微生物の生長特性の記載においては、上記 第■表について述べたのと同様の２つの色称呼を用いる。

微生物Ａｃｔｉｎｃｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉ ｏｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５３１０８およびＡＴＣＣ５３１８０およびＡｃｔｉｎｏ ｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅｒＡＴＣＣ３９２１Ｂの生理特性を第Ｘ■に示す。

Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｒｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉ ｃａ　ＡＴ　ＣＣ５３１０８およびＡ　Ｔ　ＣＣ５３１８０の全細胞分析により 、メソ−ジアミノピメリン酸および微全のり、Ｌ−異性体が特有な細胞壁アミノ 酸であり、マデュロース（３−０−メチル−Ｄ−ガラクトース）が特有の全細胞 糖であると見出された。

微生物Ａｅｔ１ｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏ ｔｉｃａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ５３１０ｇおよびＡＴＣＣ５３１８０の生長は酵母−デ キストロース−寒天培地上で２７″〜４５℃で起こる。５０℃ではわずかに生長 し、菌株は８時間生存する。１０℃では全く生長しない。最適生長は３５℃で観 察される。

第　Ｘ　表 種々の標準培地上でのＡｃｔｊｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ。

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５３１０８およびＡｃｔ４ｎｏｍａｄｕｒｅ ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｊｂｌｏｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５３１８０の生 長特性ベネットの寒天培地　Ｇ＝十、まずまず　＋、まずまずＳ：水平、顆粒状 　わずかに突起 ＡＭ：存在；わずか、存在せず 灰白色 ＤＦＰ　：存在せず　存在せず Ｃ：ｇ２ｉｇ、　ｇ２１ｇ。

スレート様黄褐色　からし様黄褐色 ツアペック・　Ｇ：＋、中位　十、まずまずショ糖寒天培地　Ｓ：水平、顆粒状 　水平Ａ）！：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在　存在せず 渋茶色 Ｃ：ｇ　４１ｇ、　ｇ　５ｇｃ。

明るくやや茶色　もも色がかかった 黄褐色 第　Ｘ　表　（つづき） へＭ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　；存在せず　存在せず Ｃ：　ｇ　３ｉｅ、　ｇ　５ｇａ。

黄褐色　サーモンピンク （ＩＳＰ＃５）　ＡＭ：存在；わずか、存在、ピンク色もち白色　白色 ＤＦＰ　：存在　存在せず 渋茶色 Ｃ：　ｇ　４ｉｅ、　ｇ　６ｇａ。

コルク様黄褐色　明るいサンゴ色 滋養寒天培地　Ｇ：＋、中位　廿、中位Ｓ；水平〜わずか　突起、ヒダ に突起 へＭ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在せず　薄縁茶色 Ｃ：ｇ　２１ｇ、　ｇ　２１ｇ。

からし様黄褐色　からし様黄褐色 第　Ｘ　表　（つづき） ＡＭ＝存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在せず　存在せず Ｃ：ｇ　２ｉｅ、　ｇ　２ｉｅ。

明るいからし様　からし様黄褐色 黄褐色 ヒダ へＭ；存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在せず　黄茶色 Ｃ：　ｇ　２ｉｅ、　ｇ　４ｉｃ。

からし様黄褐色　小麦色 ＡＭ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在、渋茶色　明るい茶色 Ｃ：　ｇ　３ｎｌ、　ｇ　４１ｅ。

暗茶色　メープル色 第　Ｘ　表　（つづき） Ｎ−Ｚ−アミンΦグ　Ｇ　：　Ｊ良好　丑、良好ルコース寒天培地　Ｓ：突起、 硬い、　突起、ヒダヒダ ＡＭ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在、渋茶色　茶色 Ｃ：ｇ　２１ｇ、　ｇ　３ｉｅ。

からし様黄褐色　ラクダ色 酵母抽出物・グル　Ｇ：Ｊ良好　升、良好コース寒天培地　Ｓ：突起、硬い、　 突起、ヒダヒダ へＨ；存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在、茶色　茶色 Ｃ：　ｇ　２ｐｎ、　ｇ　３ｎｉ。

暗茶色　丁子様茶色 トマトペースト・　Ｇ　：　＋ｌ＋、良好升、中位オートミル　Ｓ：突起〜水平 、　突起、ヒダ寒天培地　リボン様 へＭ：存在せず　存在せず；白色 ＤＦＰ　：存在、灰茶色　存在せず Ｃ；　ｇ　３ｎｌ、　ｇ　４ｉｇ。

暗茶色　淡黄茶色 第　Ｘ　表　（つづき） 酵母抽出物・麦芽　Ｇニーｔｆｆｌ、良好　丹、良好抽出物寒天培地　Ｓ：突起 、顆粒状　突起、ヒダＡＭ：存在；中位、　存在；ピンク白色灰白色 ＤＦＰ　：存在　茶色 淡茶色 Ｃ：　ｇ　４１ｉ、　ｇ　４ｎｌ。

ビーバー色　チョコレート色 オートミル寒天培地　Ｇ：士、まずまず　丑、中位（ＩＳＰ＃３）　Ｓ：水平、 顆粒状　水平、突起ＡＭ：存在せず　存在；ピンク ＤＦＰ　：存在；淡茶色　存在せず Ｃ：　ｇ　５ｉｈ、　ｇ　５ｇｃ。

鉛様灰色　もも仏様黄褐色 無機塩・澱粉寒天培　Ｇ：丑、中位　丑、中位地（ＩＳＰ＃４）　Ｓ　：水平、 顆粒状　水平、顆粒状ＡＭ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在せず　存在せず Ｃ’　ｇ　３１ｇ、　ｇ　３ｉｅ。

ベージュ様茶色　ラクダ色 第　Ｘ　表　（つづき） ＡＭ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在；淡茶色　存在せず Ｃ：　ｇ　４１ｅ、　ｇ　５ｅａ。

コルク様黄褐色　もち仏様ピンク マレイン酸　Ｇ：＋、まずまず　＋、まずまずカルシウム寒天　Ｓ：水平、顆粒 状　突起、ヒダ培地（Ｗａｋｓｍａｎ　ＡＭ　：存在せず　存在せず＃　７　） ＤＦＰ　：存在せず　存在せずＣ：　ｇ　３ｎｇ、　ｇ　４ｇａ。

黄メープル色　アプリコツト色 ペプトン鉄寒天培地　Ｇ　：　＋ｌＩ−、良好　世、良好Ｓ：突起、硬い、　突 起、ヒダ 顆粒状 へＨ：存在せず　存在せず ＤＦＰ　：存在、淡茶色　存在せず Ｃ：　ｇ　３１１．　ｇ　３ｅｃ。

ビーバー色　ビスタ色 第　Ｘ　表　（つづき） （ＩＳＰ＃７）　Ｓ　：水平、顆粒状　水平、顆粒状ＡＭ：存在せず　存在、灰 白色 ＤＦＰ　：存在せず　存在せず Ｃ：ｇ　３ｉｇ、　ｇ　４ｇｅ・ ベージュ様茶色　肌色様黄褐色 澱粉酵母培地　Ｇ　ニー）））、良好　丹、良好Ｓ：突起、ヒダ、　突起、ヒダ ひび割れ ＡＭ＝存在；わずか　存在；灰白色 灰色 ＤＰＰ　：存在、淡茶色　存在、淡茶色Ｃ：ｇ　３ｍｌ、　ｇ　３１ｇ。

ビーバ一様灰色　アドービ様茶色 ａ）３０℃にて１４〜２１日後の観察 ｂ）Ｇ−生長；Ｓ−表面特性；ＡＭ−気中菌糸体。

ＤＰＰ　＝拡散性色素；およびＣ−色 第　Ｘｌ　表 炭水化物利用１） アドニトール　」＋、中位　捕、良好 Ｄ−アラビノース　廿、中　位　廿、中　位し−アラビノース　丑、中　位　甘 、良　好セリビオース　甘、良　好　世、良　好デキストリン　廿、中　位　世 、良　好ズルシトール　−、不　良　−１不　良エリスリトール　−、不良　− ９不良 フルクトース　−、不　良　−１不　良し−フコース　卦、良好　捕、良好 ガラクトース　−、不　良　−１不　良グルコース　丹、良　好　併、良　好 α−メチルーＤ− グルコシド　−、不　良　−１不　良 第　Ｍ　表　（つづき） 炭水化物利用１） グルコシド　−、不　良　−０不　良 グルセロール　丹、良　好　丹、良　好イノシトール　廿、中　位　妊、中　位 イヌリン　−、不良　−１不良 ラクトース　−、不　良　−１不　良 マルトース　”　升、良　好　舟、良好マンニードル　−、不良　−１不良 マンノース　丹、良　好　升、良　好 メリビオース　−、不　良　−１不　良メリジトース　−、不良　−１不良 ラフイノース　−、不　良　−１不　良ラムノース　丑、中　位　丑、中　位 第　χＩ　表 Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５３１０ ８およびＡ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｆｃａ　ＡＴＣＣ ５３１８０およびＡ、　ｂｒｕｎｎｅａＡＴＣＣ３９２Ｌ６Ａ、　ｂｒｕｎｎｅ ａＡＴｃｃ　３９２１Ｂの炭水化物利用１） リボース　帯、良好　舟、良好 サッカロース　料、良好　址、良好 トレハロース　丑、中　位　捕、良　好り−キシロース　−、不　良　−１不良 １）リューデマン及びブロードスキーの培地（Ａｎｔｌｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇ、 　Ｃｈｅｍｏｔｈ、　１９８５）第　Ｘ■　表 酢　酸　塩　士　十 安息香酸塩　− 酪　酸　塩　士　士 クエン酸塩　＋　十 ギ　酸　塩　＋　＋ グルクロン酸塩　−− グルタミン酸塩　＋　＋ 乳　酸　塩　−− プロピオン酸塩　十　＋ コハク酸塩　十　＋ ピルビン酸塩　＋　＋ 第　Ｍ　表　（つづき） ストレプトマイシン　土　十 ロサラマイシン　士　士 エリスロマイシン　＋　± テトラサイクリン　＋　＋ エベルニノマイシン　＋　十 ＡＴＣＣ５３１０８ＡＴＣＣ５３１８０リフアマイシン　−　＋　＋ 第　ＸＩ　表　（つづき） ヒポキサンチン　＋　＋ でんぷん　＋　＋ 馬尿酸塩　−− 第　ＸＩ　表　（つづき） １０℃　−１生長せず　−、生長せず ２７℃　丑、中　位　丑、中　位 ３５℃　冊、良　好　捕、良　、好 ４０℃　升、良　好　丑、中　位 ４５℃　＋、まずまず〜中位　十、まずまず５０℃　±、わずか　士、わずか 生　存 ５０℃／８時間　＋　＋ Ｎａ　Ｃ！Ｉ存在下での生長 Ｎａ　ＣＤ　１％升、良　好　捕、良　好２％丑、中　位　廿、中　位 ３％　＋、まずまず　丑、中　位 ４％±、不　良　士、不　良 メラニン　−− ！　ＸＩ−一一嚢　（つづき） レフレル血清　−− ドルセットの卵　− Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａ　ＡＴＣＣ５３１０８（ただＡＴＣＣ８９２１６とリファマイシンに対する感 受性の点（ＡＴＣＣ５３１０ｇはこの抗生物質に対して著しく感受性であるが、 親菌株Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１６およびＡ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔ ｉｂｉｏｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５３１８０は感受性でない）、植物性菌糸体色素お よび数種の培地上における生長程度並びに抗生物質７−クロロ−８−メトキシテ トラサイクリンの産生という点において異る。突然変異株（ＡＴＣＣ５３１０８ およびＡ　Ｔ　ＣＣ５３１８０）および親機生物（Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１６）は ７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを産生ずる。

上記の形態的、生理学的および培養特性、並びに新規７−クロロ−８−メトキシ −テトラサイクリンの産生に基けば、これらの微生物はＡ　Ｔ　ＣＣ５３１０ｇ およびＡ　Ｔ　ＣＣ５３１８０の同定特性を有し、Ａ、　ｂｒｕｎｎｅａ　ＡＴ ＣＣ３９２１Ｂの誘導突然変異体テアル。従ってこれらの微生物、Ａ　Ｔ　ＣＣ ５３１０８およびＡ　Ｔ　ＣＣ５３１８０はであり、該タイプ菌株はまたタイプ 亜種であろう。

微生物の発酵 抗生物質ＥＳ−１１９および抗生物質Ｔｅｔ、　７は各々同化性徴２７°〜４５ ℃、好ましくは２７°〜３５℃の温度にて約６．５〜８．０のｐＨで水中好気的 条件下に水性栄養培地中で撹拌しつつ実質的な抗生物質活性が培地中に与えられ るまで生長させることにより産生される。温度研究はこの菌が３０℃よりも３５ ℃でより迅速に生長することを示す。しかしながら、３５℃における指数増殖期 の終わりに温度を３０℃に下げた場合には抗生物質の産生はより大きくなる。従 って、発酵は３５℃で最初の２４時間を、そして更に３０℃で２４〜９６時間培 養する２温度パターンにより実施することもできる。しかしながら、より簡便に は最初の２４時間も次の２４〜９６時間も３０℃の単一の温度パターンで実施す ることができる。発酵は一般に３〜７日、好ましくは４日間実施する。最高の抗 生物質産生に到達したときを決めるために、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ２０９ Ｐ　（ｐＨ８，０）およびＥ、　Ｃｏ１ｔ　ＯＬＡ　２９０Ｒ５（ｐＨ８，０） に対する全ブイヨンの生物検定によ″す、２４時間ごとに（１８時間目に第１回 目を行う）培地試料の抗生物質含量を分析することができる。菌体の生長（圧縮 した細胞容積）　、ｐＨおよび溶解した酸素レベルを継続的にまたは連続的に測 定することができる。

炭素源、例えば同化できる炭化水素、及び窒素源、例えば同化できる窒素又は蛋 白質材料、を含有する適当な滋養培地を用いることができる。

接種段階に用いる培地は主要窒素および炭素源として例えばウシ肉および酵母抽 出物、セレローズおよび可溶性澱粉を含むことができる。ウシ肉・酵母抽出物を ＮＺ−アミンＡ（カゼインの酵素的加水分解産物）で置き換え、セレローズと可 溶性澱粉の貴を調節し、且つ塩化コバルトを添加することにより特に大規模な発 酵用の発酵段階に好適な培地が製造される。これらの条件下で微生物Ａ　Ｔ　Ｃ Ｃ５３１０ｇは７−クロロ−８−メトキシ−２′　−Ｎ−メチルテトラサイクリ ンと７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンの６０　：　４０混合物を産生 じ、ＡＴＣＣ５３１８０は７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラ サイクリンを実質的に含まない７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンを含 有する抗生物質Ｔｅｔ、　７を産生した。これらの産生は、例えばクロロホルム ：メタノール：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，５）　（２：　２　： 　１．　ｖ／ｖ／ｖ　、下層）中で薄層クロマトグラフィーを展開した後に行う 、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ２０９ＰおよびＥ、　Ｃｏ１ｔ　ＯＬＡ　２９ ０Ｒ５に対する抗生物質のバイオオートグラフィーにより決定しうる。

前述の培地は抗生物質Ｅ　Ｓ　−１１９および抗生物質Ｔｅｔ、　７を産生ずる ために各々Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒｅ　ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉＭ ｏｔｉｃａＡＴＣＣ５３１０８およびＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅ ａ　ｖａｒ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａＡＴＣＣ５３１８０によって利用される 滋養物の典型例である。しかしながら、多数の供給者から得られる広範な滋養物 が前述のものに置き換えられ得、前述のものと機能上向等の滋養物が一般に良好 な生長及び抗生物質産生が得られることは発酵技術分野における技術者には明ら かである。

発酵は一般に接種物を加える前に発酵培地の初期滅菌を行なう。

発酵培地のｐｌは一般に６．５〜８．０に維持され、６．５〜７．５のｐＨが好 ましい。滅菌前は培地のＩ）Ｈは通常６．７に調整する。

発酵はブイヨンに接種物を加えることにより始まる。一般に接種物容量は総ブイ ヨン量の５％である。接種物は凍結した全ブイヨンの試料を適当な培地に加える ことにより調整する。抗生物質ＥＳ−１１９および抗生物質Ｔｅｔ、　７の第１ および第２接種段階のために特に好適な培地は、ウシ肉抽出物３ｇ、トリプトン ５ｇ、酵母抽出物５ｇ、セレローズトｇ１じゃがいも澱粉２４ｇ１炭酸カルシウ ム２ｇおよび所望により消泡剤ＡＦ　−１１ｍｌ　（Ｍ　Ｉ　４８６４１　、　 ミツドランドのダウ・コーニング社より入手可能なＡｎｔｉｆｏａｍ　Ｂ）を含 む。発酵は接種物（通常第２段階の接種物）の一部分（一般には約５容量％）を 適当な培地中に加えることにより実施される。特に好適な培地は１Ω当り：酵母 抽出物５ｇ、ＮＺ−アミンＡ　５ｇ、可溶性澱粉２０ｇ１セレローズｌｏｇ、　 Ｏ，ＱＯＩ　Ｍ塩化コバルト（ＩＩ）　１ｍｌ、炭酸カルシウム０．４ｇおよび 所望により界面活性剤（例えば消泡剤ＡＰ　−１）１ｍｌを含む。接種培地のｐ Ｈは滅菌前に７．５に調整する。発酵の接種段階は通常２４〜１２０時間、好ま しくは１〜２日必要とし、しくは９０時間必要とし、一般には３０℃で、撹拌（ 例えば３００〜３５０ｒｐｍ）　Ｌながら例えば３．５１）　／分の通気流速下 に実施する。

Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９抗生 物質７２７３複合体新種として分類される。

この微生物の培養物はメリーランド州、ロックビルのアメリカンやタイプ拳カル チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のコレクションの一部をなし、受託番号Ａ　 Ｔ　ＣＣ３９４９９を得た。

この微生物はザンビアのカシェ　バレー（Ｋａｓｉｅ　Ｖａｔ　Ｉｅｙ）で採集 した土の試料から単離された。該微生物は性状決定され、ＤａｅｔｙＩＯＳｐＯ ｒａｎｇｉｕｍ属の巨視的および微視的特性並びに全細胞加水分解特性を有する ことが見出された。

産生菌株の説明： Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ｓｐ、　ｎｏｖ、　ＡＴ ＣＣ３９４９９第　Ｘ１ｌｌ　表 Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｎ＋　ＡＴＣＣ３９４９９の エマージンの寒天培地、酵　豊富な、長い胞子嚢床母抽出物・グルコース寒天　 （ｓｐｏｒａｎｇｉｏｌｅｓ）　（直径約培地、酵母抽出物・麦芽抽　２．０　 ミクロン）が３０℃に出物寒天培地およびベブト　て約５日後に水寒天培地上ン 鉄寒天培地上で３０℃にて　で、細がい（ｏ、５〜ｏ、ｅ　ミグ１媒〜２１日後 に良好が生長を　ロン）植物性菌糸体に沿っ示す。その他のほとんどの　で形成 される。胞子置床培地上ではまずまずの生長　は単独でまたは胞子体が観察され る。トマトペー　（ｓｐｏｒｏｎｐｈｏｒｅ）上で生成スト働オートミール寒天 培　し、ブイヨン中にはほとん地上で初期的気中菌糸体が　ど生成しない。指状 の胞子生成し、ベネットの寒天培　！（直径り、Ｏ−１，２ミクロ地上で明るい 黄色の拡散性　ン、長さ４．０〜８．０ミクロ色素を産生ずる。植物性　ン）が 房となって時折り第　Ｘｌ［表 Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９の巨 視的および微視的特性 巨　視　的　微　視　的 菌糸体色素は通常黄褐色〜　３０℃にて水寒天培地上に形黄色〜オレンジ色であ る。　成される。各胞子嚢は３〜４個の胞子を含む。胞子嚢 を湿らせると口を開いて可 動性の胞子を放出する。゛ 各種標準的培地上での微生物Ｄａｅｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕ ｍＡＴＣＣ３９４９９の培養特性を第ＸＩＶ表に示す。第ＸＩＶ表における微生 物の生長特性の説明では、第７表の項で記載した２つの色呼称を用いる。

各種炭素化合物上での微生物Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕ ｍＡＴＣＣ３９４９９（７）生長は第Ｘｖ表ニ示ス。

微生物Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍの生理特性は第ＸＶ Ｉ表に示す。

Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｌ属の他の種とＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａ ｎｇｉｕａ＋　ｖｅｓｃｕｍＡＴＣＣ３９４９９との比較を第Ｘ■表に示す。

Ｄａｅｔ）ｌＩＯｓｐｏｒａｎｇＩＬＩＩｎ属の他の種とＤａｃｔｙｌｏｓｐｏ ｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍＡＴＣＣ３９４９９との比較を第Ｘ■表に示す。

微生物Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｌｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９ ９の全細胞分析により、ヒドロキシジアミノピメル酸が特有な細胞壁アミノ酸で あり、アラビノースおよびキシロースが特有の全細胞糖であると見出された。

該微生物の生長は酵母−デキストロース寒天培地上で２７°〜４０℃で起こる。

乏しい生長は約４０℃以上で起こり、２７°〜３５℃にて最適生長である。

第　ＸＩＶ　表 種々ｃｖｇＮ培地上でのＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｎ＋ 八Ｍ　：存在へず ＤＦＰ：存在；黄茶色 Ｃ：ｇ２１ｅ、明るいからし様 黄褐色 ＡＭ　Ｃ存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ３１ａ、明るいメロン様 黄色 グルコース・アスパラギン寒天培地　Ｇ　：まずまず（ＩＳＰ＃５）　Ｓ　：水 平 へＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ３ｉａ、明るいメロン イエロー 第　ＸＩＶ　表　（つづき） ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４］ｃ、＜すんだ ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ３１ｅ、シナモン色 Ｓ　：突起、顆粒状 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４ｎｃＳ あずき様オレンジ色 第　ＸＩＶ　表　（つづき） Ｓ　；突起、ヒダ ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４ｎｇ、明るい茶色 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：　ｇ４１ｃ、　＜すんだ Ｓ　：突起、顆粒状 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４０Ｃ１あずき様 オレンジ色 第　ＸｒＶ　表　（つづき） 寒天培地　Ｓ　：突起、ヒダ ＡＭ　二開花、白色 ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４１ｃ、くすんだ 培地（ＩＳＰ＃２）　Ｓ　：突起、ヒダＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ３ｉｅ、明るいコハク色 （ｌｓＰ＃３）　Ｓ　：水平 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ３ｇａ、メロン様黄色 無機塩・澱粉寒天培地　Ｇ　：中　位 （ＩＳＰ＃４）　Ｓ　：突起、ヒダ 八Ｍ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４ｎａ、明るい オレンジ色 第　Ｘ■　表　（つづき） ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：　ｇ３１ｃ　、コハク色 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：　ｇ４１ａ　、オレンジ色 クエン酸カルシウム寒天培地　Ｇ　：まずまずＳ　：水平〜突起 八Ｍ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４１ａ、オレンジ色 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４ｎｅ、行李様黄褐色 第　ＸＩＶ　表　（つづき） Ｓ　：突起 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ：存在せず Ｃ：ｇ４ｐｅ、オレンジ様 ＡＭ　：存在せず ＤＦＰ；存在せず Ｃ：ｇ４ｐｓ、 オレンジ様さび色 ａ）３０℃にて１４〜２１日後の観察 ｂ）Ｇ−生長；Ｓ＝表表面外性ＡＭ＝気中菌糸体；ＤＦＰ＝拡散性色素；及びＣ ＝色 第　Ｘｖ　表 Ｐａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｆｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９の炭 水化物利用１）アドニトール　−、不　良 り−アラビノース　＋、　まずまず し−アラビノース　廿、　中　位 セリビオース　丑、中　位 デキストリン　廿、中　位 ズルシトール　−、不　良 エリスリトール　−、　不　良 フルクトース　廿、中　位 ガラクトース　丑、中　位 グルコース　丹、良　好 α−メチル−Ｄ−グルコシド　−、　不　良グリセロール　丑、中　位 イノシトール　−、不　良 イ　ヌ　リ　ン　＋、　ま　ず　ま　ずラ　り　ト　−　ス　廿、　中　位 マルトース　料、良　好 マンニトール　料、良　好 マ　ン　ノ　−　ス゛　丹、　良　好 メリビオース　＋、まずまず メ　リ　ジ　ト　−ス　−、　不　良 第　Ｘｖ　表 ラ　ム　ノ　−　ス　丑、　中　位 す　ボ　−　ス　−、　不　良 サッカロース　丹、良　好 トレハロース　丹、良　好 Ｄ−キシロース　丑、中　位 １）リューデマン及びプロトスキーの培地（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇ、　 Ｃｈｅｍｏｔｈ、　１９６５）第　ＸＶＩ　表 Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９の生 理学的特性状　験　結　果 ５０ｍｃｇ　／ｍｌの存在下での生長 ロサラマイシン　＋ テトラサイクリン　＋ エベルニリマイシン　− ノボビオシン　− スペクチノマイシン　− 第　ｘｖｉ　表　（つづき） Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９の生 理学的特性馬尿酸塩　十 エスクリン　＋ 第　ＸＶＩ　表　（つづき） レフレル血清　− ドルセットの卵　− ２７℃　丑、中　位 ３５℃　世、良　好 ４０℃　丑、中　位 り０℃／８時間　士 Ｎａ　Ｃ（ｌ存在下での生長 ＮａＣ，Ｑ１％　升、良　好 ２％　丑、中　位 ３％　丑、中　位 第Ｘ■表および第ＸＩＶ表の結果は＋（陽性）および−（陰性）で表す第　■　 表 Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ種の比較特性Ｄａｃｔｙｌｏｓ殿ｒａｎｇ ｉｕｍ　黄褐色〜黄色〜オレンジ色　豊　富ｖｅｓｃｕｍ　ＡＴＣＣ３９４９９ Ｄ、ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ　透明〜オレンジ色　存　在ＡＴＣＣ２３４９１ Ｄ、Ｉｏａｔｓｕｚａｋｌｅｎｓｅ　オ　し　ン　ジ色　観察されずＡＴＣＣ３ １５７０ Ｄ、ｒｏｓｅｕｍ　Ｉ囮！４３５２　オレンジ色〜バラ様赤色　観察されずり、 ｓａｌｍｏｎｅｕｍ　クリーム色〜サーモン色　存　在ＡＴＣＣ３１２２２ ＡＴＣＣ２３４９０ Ｄ、ｖａｒｌｅｓｐｏｒｕｍ　オレンジ色〜明るい赤茶色　存　在ＡＴＣＣ３１ ２０３ Ｄ、ｖｉａｎｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ３５２０７ワイン色〜黒たん様茶色　存　在第 　Ｘ■　表 微生物　拡散性色素　グリセ　ラ　ム　３％Ｎａ　Ｃ（１０−ル　ノース　上で の生長 り、ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ　な　し　−十　十ＡＴＣＣ２３４９１ Ｄ、ｍａｔｓｕｚａｋｉｅｎｓｅ　明るい茶色が　−　十　−ＡＴＣＣ３１５７ ０かったピンク色 り、ｒｏｓｅｕｍ　な　し　−−十 ＩＰＯ１４３５２ Ｄ、ｓａｌｍｏｎｅｕｍ　な　し　＋　十　−ＡＴＣＣ３１２２２ Ｄ、ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｅ　明るいオレンジ　−　十　−ＡＴＣＣ２３４９ ０色〜明るい茶色 り、ｖａｒｉｅｓｐｏｒｕｍ　赤がかったオレ　＋　−−ＡＴＣＣ３１２０３ン ジ色 り、ｖｉａｎｃｅｕ［Ｉｌ　ワイン色〜−＋十ＡＴＣＣ３５２０７深赤色 １列に２〜４個の可動性胞子を各々含む指状の胞子量の生成、寒天およびブイヨ ン上での豊富な胞子置床の生成、細胞壁におけるヒドロキシジアミノピメリン酸 の存在および加水分解全細胞におけるキシロースとアラビノースの存在に基づけ ば、この微生物はＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｊｕｍ属のものであると同定さ れる。

既に報告されているｏｏｃｔｙ＋ｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍの種がらり、　ｖｅｓ ｕｍＡＴＣＣ３９４９９を区別する生理学的特性を第Ｘ■表に示す。

Ｄ、　ｖｅｓｃｕｍは、黄褐色〜黄色の植物性菌糸体、豊富で迅速な胞子置床の 生成、黄色の拡散性色素の生成、グリセロールおよびラムノースの利用、３％Ｎ ａ　ＣＯ存在下での生長能および新規７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メト キシテトラサイクリンの産生という組合せの点において他のいずれのＤａｃｔｙ ｌｏｓｐｏｒａｎｇｊｕｍ属の種とも異なる。

従ってＡ　Ｔ　ＣＣ３９４９９菌株はり、　ｖｅｓｃｕｍ　（Ｔｈｅｉｍａｎｎ 、　ＰａｇａｎｉおよびＢｅｒｅｔｔａ）　ＨｏｒａｎおよびＢｒ０ｄＳｋｙＳ ｌ）、　ｎＯＶ、と命名されるＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇ１ｕｎ＋の新種で あると考えられ、この菌株は新種のタイプ菌株である。

バクテリアの命名法（前出）の規則に従うと、Ｄ、　ｖｅｓｃｕｍはタイプ菌株 であり、その他の株が見出される筈であり、該タイプ菌株はまたタイプ亜種であ ろう。

微生物の発酵 抗生物質７２７３複合体は同化性微生物Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｖ ｅｓｃｕｍを約２７″〜４０℃、好ましくは２７″〜３５℃の温度にて約６．５ 〜８．０のｐｌで水中好気的条件下に水性栄養培地中で撹拌しつつ実質的な抗生 物質活性が培地中に与えられるまで生長させることにより産生される。温度研究 はこの菌が３０℃で迅速に生長することを示す。従って発酵は好ま１−＜は最初 の２４時間も次の２４〜９６時間も３０℃の単一の温度パターンで実施される。

発酵は一般に６５〜９６時間、好ましくは６６時間実施する。最高のイヨンの生 物検定により、２４時間ごとに（４８時間目に第１回目を行う）培地試料の抗生 物質含Ωを分析することができる。菌体の生長（圧縮した細胞容積）　、ｐＨお よび溶解した酸素レベルを継続的にまたは連続的に測定することができる。

炭素源、例えば同化できる炭化水素、及び窒素源、例えば同化できる窒素又は蛋 白質材料、を含有するあらゆる適当な滋養培地を用いることができる。

発酵に用いる培地は例えば主な窒素及び炭素源としてＮＺ−アミンＡ（カゼイン の酵素的加水分解産物）及び可溶性澱粉を含有することができる。これらの条件 下で該微生物は、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ及びＥ、　Ｃｏ１１に対する２　：　２　 ：　１　（ｖ／ｖ／ｖ）りｏｐホルム：メタノール：　ｐＨ３，５酢酸塩緩衝液 での薄層クロマトグラフィープレートの展開後のバイオオートグラフィーにより 決められる少なくとも２種の生物活性化合物を含有する抗生物質７２７３複合体 を産生ずる。

前述の培地は、抗生物質７２７３複合体を産生ずるＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎ ｇｊｕｍ　ｖｅｓｃｕｍにより利用される滋養物の典型向である。しかしながら 、多数の供給者から得られる広範な滋養物が前述のものに置き換えられ得、前述 のものと機能上間等のの滋養物が一般に良好な生長及び抗生物質産生が得られる ことは発酵技術分野における技術者には明らかである。

発酵は一般に接種物を加える前に発酵培地の初期滅菌を行なう。

発酵培地のｐｌは一般に６．５〜８．０に維持され、６．５〜７．５のｐＨが好 ましい。滅菌前は培地のＩ）Ｈは通常６．７に調整し、接種前はｐｌは通常７． ０に調整する。

発酵はブイヨンに接種物を加えることにより始まる。一般に接種物容量は総ブイ ヨン量の２．５％である。接種物は凍結した全ブイヨンの試料を適当な培地に加 えることにより調製する。

特に好ましい培地はウシ肉抽出物、０．３％；トリプトン、０．５％；セレロー ズ、０．１％；じゃがいも澱粉、２．４％；酵母抽出物、０．５％及び炭酸カル シウム０．２％を含有することから成る。

接種物培地のｐＨは滅菌前に７．５に調整する。発酵の接種工程は通常２４〜１ ２０時間、好ましくは１〜２日必要とし、一般に約３０℃で行なわれる撹拌およ び強制的通気（一般に約３．５　Ｎ　／分）を発酵中に行う。

実施例　１　抗生物質複合体８１−４７ｃ７）製ａＡ、接種物の調製 １）初期段階 １０個の２５０ｍ１エルレンマイヤーフラスコに次の発芽培地５０ｍ１を用意す る。： ウシ肉エキス　３ｇ ト　リ　プ　ト　ン　５　ｇ 酵母エキス　５ｇ デキストロース　１ｇ ジャガイモ澱粉　２４ｇ 水　道　水　１０００ｍ１ 発芽培地のｐｌを７．５に調整する。この培地を滅菌し、冷却後Ａ、ｂｒｕｎｎ ｅａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ３９２１６の予備調製接種物からの凍結した全培地試料２． ５ｍｌを培地に加える。３００ｒｐｍで絶えず振とうしながら３０℃で４８時間 インキュベーションする。

２）第２段階 前もってｐ＋ｉｙ、５に調整して滅菌した同じ発芽培地５００ｍ１を含む２０個 の２ｇエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに、第１段階の発芽培地２５ｍ１を 移す。３００ｒｐｍで絶えず振とうしながら３０℃で４８時間インキュベーショ ンする。

８９発　酵 １４Ｎの発酵槽に次の培地１０ｉ）を加える：酵母エキス　５ｇ カゼイン加水分解物　５ｇ セレローズ　１０ｇ 可溶性澱粉　２０ｇ 炭酸カルシウム　４ｇ 塩化コハル）　（ＩＩ）　２．４Ｘ１０−’ｇ水道水　１０１００Ｏ 培地のｐｎを６．７に調整し、その後培地を滅菌する。滅菌後、無菌アルカリ性 溶液で培地のｐＨを７．０に調整する。この発酵培地に５容量％の工程Ａの第２ 段階接種調製物を接種する。この発酵混合物を０．３５　ＶＶＭの空気および３ ５０ｒｐｍの振とうにより３０℃で約９６時間インキュベーションする。

Ｃ８単　離 工程Ｂの全発酵培地のｐＨを２に調整し、不溶分を消去する。

消液のｐＨを８．５に調整する。ン戸液３．５ｇを酢酸エチル３．５ｇで２回抽 出する。酢酸エチル溶液を合わせ、それらを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒 をストリッピングにより除去して残留物を得る。乾いた残留物をアセトン３５ｍ １に溶解し、次いで沈殿物が生じるまでエチルエーテル／ヘキサンの１　：　４ 　（Ｖ／Ｖ）混合物３５０ｍ１を加える。この沈殿物を済取し、真空乾燥させて 粗製の抗生物質複合体２７９＋ｎｇを得る。

実施例　２　抗生物質複合体の分離−７−クロロ−実施例ＩＣの粗製抗生物質複 合体１００ｍｇを０．０２Ｎ　Ｈ（Ｊ）１０ｍｌに溶解する。得られた溶液を、 セファデックスａ　−２５を濾過ゲル（メディアム；乾燥粒径５０〜１５０　ｍ ｍ）を含む２．５４　ｃｍＸ６３．５ｃｍゲルカラムに吸着させる。（セファデ ックスＧ−２５はニューシャーシー州　ビス力タウエーのフデーマシア・ファイ ン・ケミカルズ社から市販されている架橋デキストランである。）このカラムを 約３．０ｍｌ／分の流速で０．０２Ｎ　ＨＣｇを用いて溶離する。各画分の活性 はディスク拡散検定を用いてＳ、ａｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ２０９Ｐ　（１）ｔ（ ７，０）およびＥ、ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ１０５３Ｂ　（ｐＨ８，０）に対して調 べる。活性画分を薄槽クロマトグラフィープレート上にのせ、クロロホルム／メ タノール／ｐＨ３，５酢酸緩衝液の２　：　２　：　１　（Ｖ／Ｖ／Ｖ）混合溶 剤で展開する。抗生物質成分をＳ、ａｕｒｅｕｓおよびＥ、ｃｏｌｉの両方に対 してバイオオートグラフィー（微生物学的定量法）で定量する。

所望画分（例えば２６〜３２）を合わせることにより新規な７−クロロ−８−メ トキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリンを得る。プールした画分を凍結乾燥 して淡黄色粉末を得る。その淡黄色粉末を塩化メチレン／ヘキサンの３０　：　 ７０　（ｖ／ｖ）混合物を用いて結晶化させて、表工に要約する物理化学的デー タをもつ表題化合物を黄色の粉末として得る。

実施例　３　抗生物質ＥＳ−１１９の製造２５ｍｍ試験管に次の発芽培地１０ｍ １を用意する：ウシ肉エキス　３ｇ トリプトン　５ｇ 酵母エキス　５ｇ セレローズ　１ｇ 可溶性澱粉　２４ｇ 炭酸カルシウム　２ｇ ＡＰ−１消泡剤１１ｍ１ 水道水　１０００ｍｌ １００Ｏ消泡剤はダウ・コーニング・コーポレーションから市販されているダウ ・コーニング消泡剤Ｂ　（Ｄｏｗ　ＣｏｒｎｉｎｇＡｎｔｉｆｏａｍ　Ｂ）であ る。

発芽培地のｐＨを７．５に調整する。培地を滅菌し、冷却した後Ａ、ｂｒｕｎｎ ｅａ　ｖａｒ　ａｎｔｉｂｌｏｔｉｃａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ５３１０８またはＡ、　 ｂｒｕｎｎｅａ　ｖａｒ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５３１８０の予備 調製接種物からの凍結した全培地試料０．５ｍｌを培地１０ｍ１に加える。３０ ０ｒｐｍで絶えず振とうしながら３０℃において４８時間インキュベーショあら かじめｐＨを調整°して滅菌した初期段階の発芽培地５００ｍ１を含む２Ｑエル レンマイヤーフラスコのそれぞれに、第１段階の発芽培地２５ｍ１を移す。３０ ０ｒｐ［Ｉｌで絶えず振とうしながら３０℃で４８時間インキュベーションする 。

８９発　酵 ４個の２ｇエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに次の培地５００ｍ１を加える ： 酵母エキス　５ｇ カゼイン加水分解物 （ＮＺ−アミンＡ）　５ｇ セレローズ　Ｌｏｇ 可溶性澱粉　２０ｇ 炭酸カルシウム　４ｇ 塩化コバルト（ｎ）　２．４ＸＩＯ’ｇ（０，００１Ｍ溶液１ｍ１） ＡＦ−１消泡剤 （必要に応じて）　１ｍｌ 水道水　１０１００Ｏ 培地のｐｌを６．７に調製し、次いで培地を滅菌する。滅菌後、無菌アルカリ性 溶液を用いて培地のｐＨを７．０に調整する。この発酵培地に工程Ａの第一段階 （または任意に第２段階）の接種調製物２５ｍ１を接種する。この発酵混合物を ＯＪ５　ＶＶＭの空気および３００ｒｐｍの振とうにより３０℃で約９６時間イ ンキュベーション程Ｂの全発酵培地のｐＨを硫酸で２に調整し、遠心により不溶 性菌糸体を除く。ｐｔ（２の上清２ｇを水−飽和ｎ−ブタノール２ｇで２回抽出 する。ｎ−ブタノール溶液を合わせ、４０℃で真空ストリッピングを行うことに より溶媒を除いて残留物を得る。

この残留物を水１８ｍ１に溶解し、そして抗生物質ＥＳ−１１９の水溶液を０． ２２ミクロンフィルターに通す。

Ｄ、単　１１ｉＩ（大規模） 工程Ｂの全培地のｐＨを２に調整して、不溶分を消去する一戸液のｐＨを７に調 整し、ＸＡＤ−１６樹脂（ペンシルバニア州フィラデルフィアのローム＆）１− ス社から市販されている中性ポリスチレン樹脂）　４５０ｍ１を含む７．６２ｃ ＋ｎ　（内径）　Ｘ４５．７２　ｃｒｎ（高さ）のクロマトグラフィーカラムに かける。それぞれ３床容量（１３５０ｍｌ）の次の溶剤：メタノール／水の１： ２０．１：３．１：１．３　：　１　（Ｖ／Ｖ）混合溶剤、次に純粋なメタノー ル、その後メタノール１０．０２ＮＨＣΩの５００：　１　（Ｖハ）混合溶剤を 用いて順次溶離する。

当な画分を合わせ、溶剤を真空除去して粗製の抗生物質ＥＳ−１１９を得る。

実施例３（Ｃ）からのか液を、マイクロボンダバックＣ−１８（μＢｏｎｄａｐ ａｋ　Ｃ−１８；　０１７０１　７サチユーセツツ州　フラミンガムのウォータ ーズ・アソシエーツ社から市販されているシリカ指示体に結合された１８炭素鎖 ）を含む０．７８　Ｘ３０ｃｍＨＰＬＣカラムに入れる。１００％緩衝液Ａ（メ タノール／水１０．２Ｍリン酸塩−リン酸緩衝液ｐＨ２，５の３０　：　６０　 ：　１０（ｖ／ｖ／ｖ）混合溶剤）から１００％緩衝液Ｂ〔メタノール／アセト ニトリル／水／　０．２Ｍリン酸塩−リン酸緩衝液ｐＨ２，５（７）５０　：　 ２０　：　２０　：　１０（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）混合溶剤〕までの１５分にわたる 直線状勾配から成る移動層を３．５０１１１／分の流速で使用する。実施例３（ Ｃ）からの滑液を処理するのに１３回のＨＰＬＣ法を必要とし、該ＨＰＬＣ法に おいて２０秒毎に画分をグラム陰性菌（例えばＥ、ｅｏｌｉ）およびグラム陽性 菌（例えばＢ、５ｕｂｔｉ　１ｉｓ）に対してディスク試験を行うことにより調 べる。Ｅ、ｃｏｌｌｌ：対して活性を示す両分をプールし、溶剤蒸発させて固体 球音物を得る。ＨＰＬＣ法を繰り返して、表■に示す物理化学的データをもつ純 粋な７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンをＸＡＤ−１８樹脂カラムから 得られたメタノール／　０，０２　ＮＨＣρの５００　：　１　（Ｖ／Ｖ）溶出 液３５０ｍｇを０．０２Ｎ　ＨＣｆＩｌｏｏｍｌに溶解して濾過する。０．０２ Ｎ　ＨＣ，Ｑ中にスラリー化したセファデックスＧ　−２５５００ｇを含む７． ６２　ｃｍ　（内径）　Ｘ７Ｂ、２ｃ＋ｎ（高さ）のガラス製クロマトグラフィ ーカラムに滑液を入れる。

このカラムを０．０２Ｎ　ＨＣＮで溶離する。溶出液の抗生物質活性は、グラム 陰性菌に対するディスク試験により調べる。グラム陰性菌に対して活性を示す画 分を合わせ、それらを凍結乾燥して表■に示す物理化学的データをもつ７−タロ ロー８−メトキシテトラサイクリンを固体として得る。

実施例　５　抗生物質ＥＳ−１１９および抗生物質Ｔｅｔ、７の抗生物質ＥＳ− １１９および抗生物質Ｔｅｔ、７の大規模精製のために以下の方法を使用する。

３００ｍ１エルレンマイヤー振とうフラスコ中の実施例３（Ａ）（１）の滅菌済 み発芽培地（ｐＨ７，５）　７０ｍ１に、を５容量％加える。３００ｒｐｍで絶 えず振とうしながら３０℃で４８時間インキュベーションする。

２）第２段階 本実施例の第１段階で使用した滅菌済み発芽培地５００ｍ１を含む２ｇエルレン マイヤー振とうフラスコに、第１段階の接種物２５ｍ１を加える。第１段階にお いて示した条件下でインキュベー１４ｆｆ発光槽中の実施例３（Ｂ）の滅菌済み 発酵培地（ｐＨ７，０）に第２段階の接種物を５容量％加える。この発酵混合物 を３５Ｏｒｐｍの振とうおよび３．５Ｎ　／分の空気流量（溶存酸素を監視する ）で３０℃において９０時間インキユーベーションする。インキュベーションの 前および後、発酵および収穫の間にサンプルをぬき取る。ｐＨ１増殖゛（細胞の 充填容ｆｆ１）　、純度および炭水化物利用性についてサンプルを検査する。

Ｓ、ａｕｒｅｓ　ＡＴ　ＣＣ２０９Ｐ（ｐＨ８，０）およびＥ、　ｃｏｌｔ　０ ＬＡ２９０Ｒ５（ｐＨ８，０）を播種した寒天平板上のベーパーディスク（浜紙 円板）を用いて全培地を検定することにより、発酵状況を調べる。また、ＴＬＣ プレートによるクロマトグラフィー後にバイオオートグラフィーでサンプルを検 査する。全培地分析に基づくと、抗生物質ＥＳ−１１９および抗生物質Ｔｅｔ、 ７は両方とも９０時間の発酵で最大に達する比較可能な活性を有する。抗生物質 ＥＳ−１１９は約１０口ｇ／ｆｌの７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン および１５ｍｇ／Ωの７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイ クリンを含む。抗生物質Ｔｅｔ、７は抗生物質ＥＳ−１１９に含まれる全よりも やや少ない７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンを含む。有意量の７−ク ロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンは抗生物質Ｔｅｔ。

７の既知サンプルに対するＴ４．Ｃによって検出されなかった（例えば約１％未 満）。

Ｄ、単　離 本実施例の工程Ｃからの全培地（６０ｇ）のｐＨを４．５に調整して濾過する。

ＸＡＤ−４樹脂６Ωを含む１２１．９２ｃｍ　（高さ）Ｘ１２．７ｃｍ　（内径 ）のクロマトグラフィーに滑液を通す。メタノール／水の１　：　３　（ｖ／ｖ ）および１　：　１　（ｖ／ｖ）混合溶剤、およびべろ。生物学的活性をもつ画 分を合わせ、蒸発させて固体残留物を得る。その残留物を蒸留水に再溶解し、凍 結乾燥させて固体を得る。

この固体を水中においてＥＤＴＡで処理し、水相をｐＨ６，５で塩化メチレンに より抽出する。有機溶剤を蒸発させて固体を得る。その固体をセファデックスＧ −２５カラムに吸着させ、０．０２Ｎ　ＨＣｆｉで溶離する。活性画分を合わせ る。

３００　ｍｌエルレンマイヤーフラスコに次の発芽培地７０ｍ１を用意する。： ウシ肉エキス　３ｇ トリプトン　５ｇ 酵母エキス　５ｇ セレローズ　１ｇ ジャガイモ澱粉　２４ｇ 炭酸カルシウム　２ｇ 水　道　水　１０００＋ｎＩ ＡＦ−１消泡剤　１ｍ１ 発芽培地のｐＨを７．５に調製する。培地を滅菌し、冷却した後各フラスコ培地 に予備調製接種物からの微生物り、　ｖｅｓｃｕｍＡ　Ｔ　Ｔ　Ｃ３９４９９の 凍結全培地試料３．５　ｍｌを加える。　３００　ｒｐｍで絶えず振とうしなが ら３０℃で４８時間インキュベーションする。

２）第２段階 あらかじめｐＨｎ製して滅菌した同一の発芽培地５００ｍ１を含む２０個の２ｇ エルレンマイヤーフラスコのそれぞれに、第１段階の発芽培地２５ｍ１を移す。

３００ｒｐｍで絶えず振とうしながら３０℃で４８時間インキュベーションする 。

８１発　酵 １４ｇ発酵槽に次の培地１１ｇを加える：酵母エキス　５ｇ カゼイン加水分解物　５ｇ セレローズ　１０ｇ： 可溶性澱粉　２０ｇ 炭酸カルシウム　４ｇ 塩化コバルト（ＩＩ）　（１０’Ｍ） ｍ１ ＡＰ−１消泡剤　１ｍ１ ＭｇＣｆ１２”　６Ｈ２００，５ｇ 水　道　水　１０１００Ｏ 培地のｐｌを６６７に調整し、次いで培地を滅菌する。滅菌後培地のｐＨを無菌 アルカリ性水溶液で７．０に調整する。この発酵培地に５容世％の工程Ａの第２ 段階接種調製物を接種する。この発酵混合物をＯＪ５ＶＶＭ　（３，５Ｎ　／分 ）の空気流量および３５０ｒｐＨの振とうにより３０℃で約６６時間インキュベ ージジンする。

Ｃ１単　離 工程Ｂの全発酵培地のｐｌを６ＮＨ２Ｓ０４で４に調製する。

全培地８ＯＮを等容量の酢酸エチルで４回抽出する。酢酸エチル溶液を合わせ、 それらを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をストリッピングにより除いて残留 物を得る。この残留物をアセトン５００ｍ１に溶解し、沈殿物が生じるまでエチ ルエーテル／ヘキサンの１　：　４　（ｖ／ｖ）混合物５６ｇを加える。沈殿物 を消散し、真空乾燥させて抗生物質７２７３複合体を得る。

実施例７　抗生物質７２７３複合体の分離−０７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ− ８−メトキシテトラサイクリンの単離 Ｈ２０１００ｍｌに実施例６Ｃからの粗製抗生物質７２７３複合体１２．５ｇを 懸濁し、そのｐｌ［を５％ＨＣｇで１．５に調整して濾過する。濾液にエチレン ジアミン四酢酸１０ｇ−を加え、滑液のｐＨを濃水酸化アンモニウムで６．０に 調整する。得られた水相を等容量の塩化メチレンで４回抽出する。有機相を分離 し、合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥する。塩化メチレンを除いて精製された 抗生物質７２７３複合体３．９ｇを得る。セファデックスｃ　−２５２濾過ゲル （メディアム；乾燥粒径５０〜１５０μｍ）　３００　ｍｌを含む７゜８２ｃｍ 　（内径）　＋１０１．Ｅｔ　ｃｍ　（高さ）のクロマトグラフィーカラムに、 ０．’０２Ｎ　Ｈ（Ｊ）　３０ｍ１中の精製複合体３．９ｇの溶液を吸着させる 。０．０２Ｎ　ＭＣＩを用いて約１ｍｌ／分の流速でカラムを溶離する。ディス ク拡散検定を使ってｓ、　ａｕｒｅｕｓ　ＡＴ　ＣＣ２０９Ｐ（ｐＨ８，０）お よびＥ、　ｃｏｌｔ　ＡＴＣＣ１０５３Ｂ（ｐＨ８，０）に対する各画分（１０ ｍｌ）の活性を調べる。活性画分を薄層クロマトグラフィープレート上にのせ、 クロロホルム／メタノール／酢酸緩衝液ｐＩ（３，５の２　：　２　：　１　（ ｖ／ｖ／ｖ）混合溶剤で展開する。抗生物質成分はＳ、　ａｕｒｅｕｓおよびＥ 、　ｃｏｌｌに対するバイオオートグラフィーで検出する。

所望画分を合わせて凍結乾燥するとにより、表■に示す物理化学的データをもつ 新規な７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンが黄色の 粉末として得られる。

バイアル当たり：無菌粉末としての７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン 、７−クロロ−４ａ−ヒドロキシ−８−メトキシテトラサイクリンまたは７−ク ロロ−８−メトキシ−２’−Ｎ−メチルテトラサイクリン（以後“薬物”と称す ）。

単位用量は１００　ｍｇ、　２００　＋ａｇ、　５００　ｌｌ１ｇ、　１　ｇお よび２ｇでありうる。用時調製のために注射用滅菌水（ＵＰＳ）または注射用静 菌水（ＵＰＳ）を加える。

１　薬物　１００　２００ ２　乳糖　１２２　２４４ ３　トウモロコシ澱粉（乾燥）　２５．５　５１２５０ｍｇ　５００　ｍｇ 方　法 成分１．２および３を適当なミキサーで１０〜１５分混合する。

成分４を加えて１〜３分混合する。この混合物を適当な大きさの上下２つめ部分 から成る硬質ゼラチンカプセルに充填する。

実施例　１０ １　薬物　１２５　２５０ ２　乳糖　９３．２５　１８７．５ ３　トウモロコシ澱粉　５１０ （１０％ペーストとして） ４　トウモロコシ澱粉（乾燥）２５５０２５０ｍｇ　５００　ｍｇ 方　法 成分１および２および成分４の一部を適当なミキサーで１０〜１５分混合する。

この混合物を成分３で顆粒状にする。必要に応じて湿った顆粒を目の荒い篩（例 えば０．６〜０．６５　ｃｍ、または１／４インチ）にかけ、湿った顆粒を乾か す。乾いた顆粒を適当な微粉砕機を使って粉砕する。適当なブレングー中の乾燥 顆粒に成分５および成分４の残りを加える。５〜１０分混合する。

この混合物を回転打錠機で所望の形状および大きさの錠剤に圧縮する。錠剤は標 準コーティング法を用いて被包してもよい。

実施例　１１ 局所製剤 ！−号えｌ　玉乙呈 １　薬物　２５ ２　エチルアルコール　４００ ３　ヒドロキシプロピルセルロース　１５４　ポリエチレングリコール　５６０ 万−一抹 成分１．２および４を適当なミキサーで混合する。激しく攪拌しながら成分３を 加える。均一になるまで撹拌を続ける。

実施例　１２ 用時調製用の経口粉末剤（Ｉ） バートＡ（粉末剤） 番号　成分　頚７１− １　薬物　４６．３ ２　風味剤　４００ ３　着色剤　十分量 ４　防腐剤　十分量 ５　緩衝剤　十分量 ６　砂　糖　十分量 全量　１．０ｇ 成分１．２．３．４および５を完全に混合する。成分６を加パートＢ（用時調製 ） 上記粉末剤５４ｇを適当な容器に入れ、水を加えて１００　ｍｌとする。水の添 加後十分にかきまぜる。そのとき各５ｍ１（茶さじ１杯）は１２５　ｍｇに等し い薬物を含むようになるだろう。

１　薬　物　４１６．７ ２　風味剤　十分量 ３　着色剤　十分量 ４　防腐剤　十分量 ５　緩衝剤　２８．３ ６　サッカリン　十分量 成分１．　２．　３．４．　５．　６および７を均一になるまで十分に混合する 。

パー）Ｂ（用時調製） 上記粉末剤６．０ｇを適当な容器に入れ、水を加えて１００　ｍｌとする。均一 になるまで十分にかきまぜる。そのとき各５ｍｌは１２５　ｍｇに等しい薬物を 含むようになるだろう。

実施例　１４ １　薬　物　２５．０ ２　甘味料　十分量 ３　風　味　剤　十分量 ４　着　色　剤　十分量 ５　植物油　十分量 全量　１．Ｏｇ 適当な容器に必要とされる成分５の９０９６を入れる。成分１゜２．３および４ を加えて十分混合する。成分５の残りを加えて最終容量とする。

１　薬物　１２５．０ ２　ウイテブゾル（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）　Ｈ−１５１８６８成分２を溶融し、成 分１と均一になるまで混合する。型の中に注入して冷蔵庫内で固まらせる。圧側 を型から取り出す。

透過厚（％） 国際調査報告 国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒは水素原子またはヒドロキシ基であり、Ｒ１は水素原子またはメチル 基である、但しＲおよびＲ１の少なくとも一方は水素原子である〕で表される化 合物、およびその薬学的に受容される塩。
2. ２．７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリン、７−クロロ−４ａ−ヒドロキ シ−８−メトキシテトラサイクリン、および７−クロロ−８−メトキシ−２′− Ｎ−メチルテトラサイクリン。
3. ３．抗生物質作用上有効な量の請求の範囲第１項または第２項記載の化合物また はその塩、および薬学的に受容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物。
4. ４．非経口または局所投与に適する請求の範囲第３項記載の医薬組成物。
5. ５．経口投与に適する請求の範囲第３項記載の医薬組成物。
6. ６．抗生物質作用上有効な量の請求の範囲第１項または第２項記載の化合物また はその塩もしくはその医薬組成物を感染症にかかった宿主に投与することから成 る、宿主内で抗生物質作用を誘起する方法。
7. ７．同化可能な窒素源および炭素源を含む水性培地中で好気的条件下に発酵させ たとき、回収可能な量で７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサ イクリンを含む抗生物質複合体８１−４７を産生することができるアクチノマデ ュラブルネア（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａ）種の微生物の生物 学的に純粋な培養物。
8. ８．アクチノマデュラ　ブルネア種の微生物を同化可能な窒素源および炭素源を 含むｐＨおよび温度を制御した水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な抗生 物質活性をもつ物質が産生されるまで培養することにより製造された、７−クロ ロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含む抗生物質複合体８ １−４７。
9. ９．同化可能な窒素源および炭素源を含む水性培地中で好気的条件下に発酵させ たとき、回収可能な量で７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンおよびその ２′−Ｎ−メチル誘導体から成る抗生物質ＥＳ−１１９を産生することができる ＡＴＣＣ５３１０８の同定特性をもつ微生物アクチノマデュラブルネアバルアン チバイオティカバルノブ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｕｒｕｎｎｅａ　ｖａ ｒ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ　ｖａｒ　ｎｏｖ．）の生物学的に純粋な培養物。
10. １０．ＡＴＣＣ５３１０８の同定特性をもつアクチノマデュラブルネアバルアン チバイオティカバルノブの菌株を同化可能な窒素源および炭素源を含むｐＨ−お よび温度−制御水性−栄養培地中で好気的条件下に、実質的な抗生物質活性をも つ物質が産生されるまで培養することにより製造された抗生物質ＥＳ−１１９。
11. １１．同化可能な窒素源および炭素源を含む水性培地中で好気的条件下に発酵さ せたとき、回収可能な量で７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンを含むが 実質的に７−クロロ−８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含ま ない抗生物質Ｔｅｔ．７を産生することができるＡＴＣＣ５３１８０の同定特性 をもつ微生物アクチノマデュラブルネアバルアンチバイオティカバルノブ（Ａｃ ｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｂｒｕｎｎｅａｖａｒ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉａ　ｖａｒ 　ｎｏｖ．）の生物学的に純粋な培養物。
12. １２．ＡＴＣＣ５３１８０の同定特定をもつアクチノマデュラブル不アバルアン チバイオティカバルノブの菌株を同化可能な窒素源および炭素源を含むｐＨ−お よび温度−制御水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な抗生物質活性をもち 且つ７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンを含むが実質的に７−クロロ− ８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含まない物質が産生される まで培養することにより製造された抗生物質Ｔｅｔ．７。
13. １３．同化可能な窒素源および炭素源を含む水性培地中で好気的条件下に発酵さ せたとき、回収可能な量で抗生物質７２７３複合体を産生することができるダク チロスポランギウムベスクム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｇｉｕｍ　ｖｅｓｃｕ ｍ）種の微生物の生物学的に純粋な培養物。
14. １４．ダクチロスポランギウムベスクム種の微生物を同化可能な窒素源および炭 素源を含むｐＨ−および温度−制御水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な 抗生物質活性をもつ物質が産生されるまで培養することにより製造された抗生物 質７２７３複合体。
15. １５．アクチノマデュラプルネア種の微生物を同化可能な窒素源および炭素源を 含むｐＨ−および温度−制御水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な抗生物 質活性をもつ物質が産生されるまで培養することから成る抗生物質複合体８１− ４７の製法。
16. １６．ＡＴＣＣ５３１０８の同定特性をもつアクチノマデュラブル不アバルアン チバイオティカバルノブの菌株を同化可能な窒素源および炭素源を含むｐＨ−お よび温度−制御水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な抗生物質活性をもつ 物質が産生されるまで培養することから成る抗生物質ＥＳ−１１９の製法。
17. １７．ＡＴＣＣ５３１８０の同定特性をもつアクチノマデュラブルネアバルアン チパイオティカバルノブの菌株を同化可能な窒素源および炭素源を含むｐＨ−お よび温度−制御水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な抗生物質活性をもち 且つ７−クロロ−８−メトキシテトラサイクリンを含むが実質的に７−クロロ− ８−メトキシ−２′−Ｎ−メチルテトラサイクリンを含まない物質が産生される まで培養することから成る抗生物質Ｔｅｔ．７の製法。
18. １８．ダクチロスポランギウムベスクム種の微生物を同化可能な窒素源および炭 素源を含むｐＨ−および温度−制御水性栄養培地中で好気的条件下に、実質的な 抗生物質活性をもつ物質が産生されるまで培養することから成る抗生物質７２７ ３複合体の製造方法。