DK166024B

DK166024B - Antibiotikum a42125, fremgangsmaade til fremstilling deraf, nocardia aerocolonigenes stamme nrrl 18049 til brug ved fremgangsmaaden samt foderpraeparat indeholdende antibiotiket

Info

Publication number: DK166024B
Application number: DK178387A
Authority: DK
Inventors: Robert L Hamill; Ralph Emil Kastner
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-04-08
Publication date: 1993-03-01
Also published as: PT84628A; US4870021A; ATA257387A; US4764510A; AT389893B; IE59699B1; DE3779946D1; KR920003666B1; DK178387D0; IE870942L; IL82119A0; EP0241285B1; CA1265462A; EG18187A; DK166024C; DE3779946T2; HU197941B; PH24808A; PT84628B; CN87102770A

Description

i

DK 166024 B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotikum A 42125 samt alkalimetal-, jordalkalimetal-, amin- og syreadditionssalte deraf, og en hidtil ukendt stamme af Nocardia aerocolonigenes, NRRL 18049, til brug 5 ved fremstillingen af dette antibiotikum. A 42125 er et antibakterielt middel, der har særlig interessant virkning over for mikroorganismer, der producerer methan. Da A 42125 formindsker methanproduktionen ved forsøg, der efterligner vom-betingelserne hos drøvtyggere, kan A 10 42125 forøge foderudnyttelsen og derfor forøge væksten hos drøvtyggere.

Herudover tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af A 42125, hvilken fremgangsmåde er ejen-15 dommelig ved det i krav 3's kendetegnende del angivne. A 42125 ekstraheres efter dyrkningen fra forgæringsbouillonen ved at absorbere denne på en harpiks og eluere harpiksen med et polært organisk opløsningsmiddel. A 42125 fraskilles og renses yderligere ved velkendte metoder, 20 som f.eks. ionbytterkromatografi.

Fordi Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 er en hidtil ukendt stamme, angår opfindelsen yderligere en biologisk ren kultur af denne mikroorganisme til brug ved frem-25 gangsmåden ifølge opfindelsen.

Tegningen viser det infrarøde absorptionsspektrum af A 42 125 i KBr.

30 Der er et stadigt behov for at forbedre antibiotika inden for det veterinære område. Forøgelse af tilvæksten hos dyr er et mål for disse antibiotika. Tilvæksten opnås ved at reducere sygdomme og ved at forøge foderudnyttelsen. Tilvækstforøgelse hos drøvtyggere som får og kvæg er af 35 speciel kommerciel interesse.

DK 166024 B

2

Hos drøvtyggere nedbryder mikroorganismer i vommen hos dyret kulhydraterne til frembringelse af forbindelser, der kan metaboliseres, som f.eks. propionater.

5 Visse mikroorganismer har imidlertid en uheldig indvirkning på dette systems effektivitet. F.eks. reducerer me-thanogene eller methanproducerende mikroorganismer foderudnyttelsesgraden hos drøvtyggere. En særlig fordel ved A42125 er, at forbindelsen hæmmer methanfrembringende mi-10 kroorganismer og derfor kan anvendes til at fremme tilvæksten hos drøvtyggere.

Skønt de er uønskede i drøvtyggernes fordøjelsessystem, er methandannende mikroorganismer (archaebakterier) vig-15 tige deltagere i miljøet, fordi de katalyserer sluttrin-nene, hvor spildbiomassen dekomponerer til methan. Yderligere kan methan være værdifuldt som brændstof, hvorved det hjælper til at løse energiproblemer. Således er me-thanogener og metoder til at forøge methanfrembringelse 20 vigtig.

En måde at forøge methanproduktionen på er at frembringe genetiske udvekslingssystemer i methanogener. For at opnå dette er selekterbare træk, som f.eks. antibiotikaresi-25 stens af væsentlig betydning. Disse særegne træk findes sædvanligvis ved at selektere mutanter, der er resistente over for et antibiotikum, der normalt vil dræbe mikroorganismen. Methanogener er uheldigvis naturligt resistente over for de fleste antibiotika. Den kendsgerning, at 30 A42125 hæmmer methanogener, vil gøre forbindelsen af vær di til at lokalisere et selekterbart kendetegn til at lette genetisk udveksling i methanogener.

Antibiotikum A42125 ifølge opfindelsen er i ikke-saltform 35 ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

3

DK 166024B

Særlige egenskaber ved A32125

Antibiotikum A42125 har følgende fysisk-kemiske egenskaber: 5

Tilstand : Hvide krystaller (fra vand)

Smeltepunkt: 149-150 °C UV : Ingen absorption IR (Kbr) : Se tegning; 10 viser absorption ved følgende frekvenser (cm-1): bred top, der omfatter 3423, 3413, 3409, 3403, 3398 og 3386; 2937, 1720, 1602, 1453, 1408, 1379, 1290, 1192, 1120, 1090, 1064, 971, 870, 830 og 802.

15

Titrering (80 % vandig dimethylformamid): pKa-værdier på 5,2, 8,7 og 10,5

Molekylvægt: 2032 (feltdesorptionsmassespektrometri).

20

Empirisk formel: cioiH184N2°38 Elementaranalyse: 25 Grundstof Fundet %

Carbon 59,51

Hydrogen 9,05

Nitrogen 1,44

Oxygen 30,08 30

Aminosyrer: Ingen fundet.

Opløselighed: Opløselig i vand.

35 Bioautografi: Under anvendelse af Whatman nr. 1 papir imprægneret med 0,95N Na2S0£ og 0,05 NaHS0^,H20, et opløsningsmiddelsystem bestående af 80 % vandig ethanol inde

DK 166024 B

4 holdende 1,5 % NaCl og påvisning med Micrococcus luteus havde A42125 en Rf-værdi på omtrent 0,46.

Baseret på forbindelsens titreringsegenskaber, viser det 5 sig, at A42125 kan have en carboxylgruppe, en aminofunk-tion og en phenolgruppe, der kan danne salte.

Disse salte kan anvendes til at adskille, rense og frembringe det antibiotiske stof. A42125 er af den grund en 10 del af den foreliggende opfindelse. Specielt er farmaceutisk acceptable salte værdifulde. Saltene kan være alkalimetal-, jordalkalimetal-, amin- og syreadditionssalte.

Eksempler på velegnede alkalimetal- og jordalkalimetal-15 salte omfatter natrium, kalium, lithium, cæsium, rubidium, barium, calcium og magnesiumsalte. Velegnede amin-salte omfatter ammonium og primære, sekundære og tertiære C^-C^-alkylammonium og hydroxy-C2-C^-alkylammoniumsalte. Eksempler på aminsalte omfatter de, der dannes ved omsæt-20 ning af A42125 med ammoniumhydroxid, methylamin, sek.-bu-tylamin, isopropylamin, diethylamin, di-isopropylamin, ethanolamin, triethylamin og 3-amino-l-propanol.

Eksempler på syreadditionssalte omfatter salte dannet 25 under standardbetingelserne med både organiske og uorganiske syrer som f.eks. svovlsyre, saltsyre, phosphorsyre, eddikesyre, ravsyre, citronsyre, mælkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, cholsyre, pamsyre, slimsyre, D-glutaminsyre, d-kamfersyre, glutarsyre, glycolsyre, 30 phthalsyre, vinsyre, myresyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, methansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbin-syre, picrinsyre, benzoesyre eller kanelsyre.

Inden for det veterinær-farmaceutiske område er formen 35 for et antibiotikum sædvanligvis ikke af større betydning, når dyret skal behandles med dette antibiotikum. I de fleste tilfælde forandrer miljøet i selve dyret læge- 5

DK 166024B

midlet til en anden form end den, den er administreret.

Den saltform, i hvilken antibiotikumet kan administreres, er derfor sædvanligvis ikke af større betydning. En saltform kan imidlertid udvælges af økonomiske grunde, af be-5 kvemmelighedsgrunde eller af hensyn til toxiciteten.

Den omhandlede Nocardia aerocolonigenes-stamme, der kan anvendes til fremstillingen af antibiotikum A42125, iso-leredes fra en jordprøve fra Brasilien. Stammen er i 10 overensstemmelse med Budapesttraktaten d. 19. februar 1986 deponeret i Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, USA og er her registreret som Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049. Af bekvemmeligheds-hensyn er den omhandlede N. aerocolonigenes-stamme i det 15 følgende omtalt som "A42125-kulturen”.

Taxonomiske undersøgelser af denne organisme udførtes af Frederick P. Mertz fra Lilly Research Laboratories. Baseret på disse undersøgelser klassificeredes organismen som 20 en ikke tidligere beskrevet stamme af Nocardia aerocolonigenes (Shinobu og Kawato) Pridham and "New Combinations in the Order Actinomycetales Buchanan 1917," USDA Tech.

Bull. nr. 1424:32, Agricultural Research Service, USDA, Washington, D.C., 1970). Denne klassificering er baseret 25 på samtidige laboratoriesammenligninger såvel som undersøgelse af publicerede beskrivelser af lignende species [M. Goodfellow og K.P. Shcaal, "Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus," i F.A. Skinner og D.W. Lovelock, Udg. "Identification Methods 30 for Microbiologists," 2. udgave. Society for Applied Bacteriology Technical Series nr. 14, Academic Press Inc., New York, 1979, side 261; R.E. Gordon, S.K. Mishra og D.A. Barnett, "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. Carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N.

35 orientalis og N. aerocolonigenes," J. Gen. Microbiol.

109, 69-78 (1978); S. J. Mishra, R.E. Gordon og D.A. Barnett, "Identification of Nocardiae and Streptomycetes

DK 166024 B

6 of Medical Importance," J. Clin. Microbiol- 11(6), 728-736 (1980)? H. Mordarska og M. Mordarski, "Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria," J. Gen. Microbiology 71; 77-86 (1972); R.C.

5 Pittenger og R.B. Brigham, "Streptomyces orientalis, n.sp.', the Source of Vancomycin," Antibiotics and Chemotherapy VI(11); 642-647 (1956); og S.A. Waksman, "The Actinomycetes, Vol. II", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961].

10

Metoder anbefalet af the International Streptomyces Project (ISP) til karakteriseringen af Streptomyces species [E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst.

15 Bacteriol. 16(3), 313-340 (1966)] er fulgt sammen med visse yderligere undersøgelser (D.J. Blazevic og G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975).

20

Metoder anbefalet til karakterisering af Nocardia species af Gordon et al. [R.E. Gordon, D.A. Barnett, J.E. Handerhan og C.H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica og the Nocardin Strain," Int. J. Systs.

25 Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974)] anvendtes.

Resistens over for rifampin og lysozym måltes således som beskrevet af Gordon og Barnett [R.E. Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a 30 Taxonomic Tool," Int. J. Syst. Bacteriol. 27(3), 176-178 (1977)].

ICSS-NBS centroide farvekort, standardprøve nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of 35 Commerce, Washington, D.C.) og Color Harmony Manual (4. udgave, Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) anvendtes til farve-

DK 166024 B

7 betegnelserne.

Morfologien undersøgtes under anvendelse af et optisk lysmikroskop. Et scanning-elektron-mikroskop (SEM) an-5 vendtes til at undersøge sporeoverfladeudseendet.

Melanoidpigmentproduktion (chromogenicitet) bestemtes ved hjælp af ISP nr. 1 (trypton-gærekstraktbouillon), ISP nr.

6 (pepton-gærekstrakt-jernagar), ISP nr. 7 (tyrosinagar) 10 og modificeret ISP nr. 7, hvor tyrosin var fjernet.

De isomere af diaminopimelinsyre (DAP) og kulhydraterne i hydrolysater af hele celler blev fastlagt ved hjælp af kromatografiske metoder beskrevet af Becker et al. [B.

15 Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon og H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] og af Lechevalier [M.P. Lechevalier, "Identification of Aerobic 20 Actinomycetes of Clinical Importance," J. Lab. Clin. Med.

71, 934-944 (1968)].

Mycolsyrer bestemtes ved hjælp af en metode baseret på teknikken beskrevet af Minnikin [D.E. Minnikin, I.G.

25 Hutchinson og A.B. Caldicott, "Thin-layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-containing Bacteria," J. Chromatography 188, 221-233 (1980)].

Stivelseshydrolyse bestemtes ved undersøgelse for tilste-30 deværelsen af stivelse med iod på ISP nr. 4 (uorganiske salte-stivelsesagar) plader (se Blazevic og Ederer, supra).

NaCl-tolerance måltes ved at tilsætte NaCl til ISP nr. 2 35 agar svarende til den ønskede koncentration og inkubere pladerne ved 30 ‘C i 14 dage.

8

DK 166024B

Resistens over for antibiotika måltes ved hjælp af anti-biotikafølsomhedsskiver anbragt på overfladen af tilsåede ISP nr. 2 agarplader.

. 5 Phosphatase og urease bestemtes ved metoder beskrevet af Blazevic og Ederer, supra. Gelatinesmeltning anvendtes til at bestemme proteinaseaktivitet.

Væksten af A42125-kulturen var sædvanligvis udmærket på 10 både komplekse og definerede agarsubstrater. Luftmycelier produceredes på alle, på nær gær-dextroseagar. Sporemas-sefarven var i den grå til hvide farverække. De nærmeste tilsvarende farvestave i Tresner og Bachus systemet var d lysegrå og b østersgul. Bagsidens farve var gulligbrun 15 til gullighvid. Et lysebrunt opløseligt pigment blev pro duceret i ISP nr. 2 og gær-dextroseagar. Tabel 1 opsummerer dyrkningsegenskaberne af A42125-kulturen sammenlignet med en blanding af 14 kendte Nocardia aerocolonigenes stammer og en blanding af 21 kendte Nocardia orientalis-20 stammer.

Den i forbindelse med tabel II anvendte sammenligningsstamme Nocardia brasiliensis er en blanding af 72 stammer.

25

De anvendte sammenligningsstammer har oprindelse fra Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University, New Brunswick, New Jersey USA og er bl.a. omtalt i R.E. Gordon, S.K. Mishra og D.A. Barnett, "Some 30 Bits and Pieces of Genus Nocardia: N. Carnea, N.

vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis og N. aerocolonigenes." Journal of General Microbiology (1978) 109, 69-78.

35

DK 166024 B

9 φ I Φ

Cfi rrj ! T3 H fQ Λ Ή H 1-1 (C U-J Ή

4J Cfl t, P

C Φ φ gj O) G > >

-Η Φ j o O

p tp

o -H +J -P

C ffl ® . O ! M ~

iz r-j I C <D C

σ1 u * ρ c _ n O Oc»>hw 3 >i tr "" P H O H >h · _ "P ϊ* . . ^-,-,

CO Φ h · G C G · C G >i G G Ή · G G · K

φ G m h qj CU φ Oj Φ 0) tr· Φ Φ Jlfl 5) Φ Ό Φ Φ G tr· · tn & tP · tr tr Ό · tP CP tr · tn J ^ · O' tr

Cl) · h CN G G O er G G O O C G -HCOCJ G O oo G c

Dl 12 CJM-I H 2 CO Η H 0 CT Η Η DC 00 H H 0 CO H H

Ή c o rH (0 , , O -H (0 G! Φ i

Uh Λ >· Λί 1»Æ 0 (ti CN Ό ·ΰ I O cn O cn |

P +J rH -H · d J

φ r> 3 > ·· H ·· G Η ·· G

co φ tr >·< tr tr- .g tr >·< tr »g tr ·η tr tr tr ·η tr tr »i i ,-j .j η ·η bn jQ I W ·Η Ο ·Η Μ *H -Η ·Η ·Η ·Η ·Η

I · Li ri I H -|j fi · P G H · r-I tP G Η p H -P G Η P H -P G

J i S o Φ cn Φ tr Φ £ ·· Φ Φ ΦτίΦΦΦ Φ X! Φ tr Φ ΦΛ Φ

Si tn * Cr· cC tr T) P &1 tr · tr tn tr tr · tr ti tr· *? * *? PS1 rQ i - . h CO -H > G ocnotnt H OJ -H >1 C -H r~~ -H > G Tj ^ d ^

c 13 PiuoKCOH O CD U S. H Pi Γ~- PS XI H pi ID Pi CD H Pi CO Pi CD H

£-5 φ p G Pi φ Xi!

-P G IJH

I—I -P ·· D i-η in O) Ό Λ *0 . *0

G T3 ·Η ·Η Pi -H

1 -¾ P ·· G G C!> P _G " > in I tr« trCQ G m =o tPCQ tnxl · _.·£

CN in -Η >ι·γΗ P P » H tn >1X11 P -H >1-H CQ >iÆ'W

H CN H · rH · X) · G P G · Ijlfi ri ·Η II i! · S-Jr.

CN H Jlti J) >iJ) Ρ-,ΦΦΦ g·· ΦΦ <1>εΦΦΦ ε··ΦΦ nd* CN er · tP tP to ·φ · tP -P tT Ό · Ό to 1τ> tP · tT -P tT *ti) · Ό 4-> &l C n< Η oo -H · >i OO O 10 Cl o r- O >i G •jd^'d03^ <; ρ^ι^-ΚρΗ^ o co 2 iG1. h ur^UJH edr^K)?. h Or^-utG. h

MH

cti

Pi rti Φ Λ -Q (ti (ti _V< ...... ·· .. ·· ·· ·· ...... · ·· ·· ·· ·· ·· ·· · ·· M co U&E ft ΟΛΕ Q, 0 en g ft OiCE CuOPSg O, en t te co «Jen C w <C w <qcn (ti φ Φ &> tP w Φ en cp .

c -P i H (0 „ g C Li Dj Dj (¾ ft h ^ 4J COCN CDCD CD'd' CD LO -Η·Ρ

Pen H H H H 99 >c Λ Πι-< Γυ ίϋ W υ ε

DK 166024B

ίο *ø ø d d 0 ø Η Η ή m ø s. η øø ø

s > > 4J

ø o o a ty 0) -1 +> -ø s c cd c ø ty

o x ø X4 H

--1 5-1 G 0 C ft O CQ >j Λ d >i o >, ø i η μ -μ o ty ^ η > ϊτ·- >η — ty Μ -Η Λ μ >i ty ixj ·ΗΟ -Η 0 Η >ι S ty ·0 0Η0 0Η·0 0 Η (0 0 d 0 (D 'dø 0 Η >ι 0 0 0 d 0 0 0 ty · ty ø d · ty ty ø · ty ty ty · ty ty 0 • -Hins >i O oo S S °ø ni S S -H m ø c ·©.

S Pi r^· H P! ø co H H D η η H Pi Η Η H

— ft

• O

ø

•Pø II

μ -η d ø i OH IHJ31 Λ ft in ø d O <N| ød na| co

— -P -Η · H d »QI-H H

S > H ·· 0 S °ø > -0 ø ,0 tyn ty ty ø ø ·· x! ty>i ty ty ··« Η -Η >)Λ'0 ·Η -Η -Η ri 0 t' 0 -Η O Ή g 0 · 00 H 0 Η -P S 0 -HØØ Η · H -P S 0

PI O O·· 00 0 XI O t? 0 0 >iH 00 ØØØtnØ H

H d · d -P ft ty · ty ø ty ty · ø -P ty ty · ty ø ty h PQ · o <y O ø fl H > H > 0 ø fi -H co -Η > 0 0 IS ØCOØTStH pj ID Pi CO Η 2 CTl Q® H Pi ID Pi CO H 0 1 0 g 0 0 X2i -pr». -p

0 0 0 0 IH

-P Λ ·· X4 d ø

H 0 Ød 0 0 H

ø ø d! dd-H >iH

X4 0 >1 -H 0 > øømø II

1 CQ 00 rl -00 >ØPJ tnPQ'-'ØØ m >id|ø i1 ty ø MHø -H >i ø ø g cm · ty-P · -h ty S øøøH»ø>d < H g - 0 0 ft H 00 >1000 ødøoø <n d · d 0 ty d · ø 0 ty d · ty-P ty ty · ty 0 ΟΓ^Ο>10 O 0 oid > β OMOØØ -H 00 0 >1 C øn-OPS ØOOQPIH ØØSSH Pi r- H PI 0 d

•H

0 ø ty P2 ø

ø -Q

^ ·· ·· II ·· ·· ·· ·· II ·· II ·· ·· ·· ·· «· ··

0 0 Pi g ft O PS S ftØPSg ft 0 Pi g ft II

0 rfj CO rfjco f=q CQ 1¾ CO

0 PS

ty

Η I

I 10 —

cn 0 0 -P

ty ø d O 0 -Pø I -H ø ø X4

ø -H 0 ty 0 -P RJ

0X40 00 > X > -P 0 0 00 0 0 øfti-ftø dø -Pø dø 11 d 0 h 0 0 ft 00 00

ø n ft ty Hø Oty g ty O

couoø Øø ft d Ød 0 11

DK 166024B

A42125-kulturen gav en kraftig vækst og frembragte et forholdsvis godt luftmycelium. Når man undersøgte i et lysmikroskop, havde lufthyferne et spindelvævsagtigt udseende. Denne morfologi klassificeres i ikke-streptomyce-5 tes-afdelingen beskrevet i Bergey's Manual (R.E. Buchanan og N.E. Gibbons Eds., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology," 8. udgave, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974).

10 Conidier observeredes, dersom lufthyfer fra ISP nr. 4 agarsubstrat undersøgtes ved hjælp af skanningelektronmikroskopi .

Sporer var af uensartet og irregulær form. Sporeoverfla-15 den var glat [(T.G. Pridham, C.W. Hesseltine og R.C.

Benedict, "A Guide for the Classification of Streptomyces According to Selected Groups," Appl. Microbiol. 6, 52-79 (1957)].

20 Sporeformen var aflangt til cylindrisk og dannede kæder på mere end 50 i antal. Sporestørrelsen lå fra 1,2 - 0,9 x 0,5 - 0,4 um og var i gennemsnit 1,1 x 0,5 μΐη.

Når der dyrkedes under neddykkede betingelser under om-25 rystning, gik hyferne i stykker.

A42125-kulturen dekomponerer kasein, elastin, guanin, hy-poxanthin og tyrosin; hydrolyserer calciummalat, DNA, es-culin og stivelse; danner syre ud fra arabinose, cello-30 biose, fructose, galactose, a-methyl-D-glycosid, glucose, glycerol, inositol, lactose, maltose, mannitol, mannose, melibiose, raffinose, rhamnose, trehalose og xylose; forbruger acetat, benzoat, citrat, malat, oxalat, propionat, pyruvat, succinat og tartrat.

A42125-kulturen frembringer catalase, phosphatase, proteinase, urease og melanoide pigmenter; er ikke resistent 35 12

DK 166024 B

over for rifampin, men resistent over for lysozym, cepha-lothin, gentamicin, lincomycin, penicillin og tobramycin.

A42125-kulturen kan tåle indtil 6 % NaCl og vokser ved en 5 temperatur mellem 15 og 37 °C. Den er ikke i stand til at overleve ved 50 °C i 8 timer, hydrolysere skummetmælk eller reducere nitrater til nitriter. Disse fysiologiske egenskaber er angivet i tabel il og ill.

10 15 20 25 30 35

TABEL II

13

DK 166024B

Visse morfologiske og fysiologiske egenskaber ved A42125-kulturen og beslægtede Nocardia-stammera 5 A42125-

Egenskab kultur N-aerocolonigenes N-orientalis N-brasiliensis

Lufthyfer + + 10 Conidier + +

Syrefasthed - -

Mycolsyre i cellevæg - +

Urease + + + + 15 Dekomponerer:

Adenin - -

Casein + + + +

Elastin + - +

Hypoxanthin + + + + 20 Tyrosin + + + + t

Xanthin -

Resistent over for:

Lysozym + + +

Rifampin - + + 25 Hydrolyserer:

Calciummalat + + + nd

Esculin + + + +

Hippurat - +

Stivelse + + + + 30 Bruger:

Benzoat +

Citrat + + + +

Mucat - -

Succinat + + + + 35 Tartrat + -

Reducerer nitrat - + + TABEL II (fortsat) 14

DK 166024B

A42125-

Egenskab kultur N-aerocolonigenes N-orientalis N-brasiliensis 5 -

Overlever ved 50 °C i 8 timer - - + -

Danner syre ud fra: 10 Adonitol - + - l-(+)-Ara- binose + + +

Cellobiose- + + + + i-Erythritol - - + 15 Glucose + + + +

Glycerol + + + +

Inositol + + + + α-Lactose + + +

Maltose + + + - 20 D-Mannitol + + + + D-Mannose + + + +

Melezitose - - -

Melibiose + + -

Danner syre ud fra: 25 a-methyl- glucosid + +

Raffinose + + -

Rhamnose + + +

Sorbitol - - - 30 Trehalose + + + +

Xylose ++ + +

Vokser ved 10° + + + 45° - - - 3 5 50° a + = viser egenskaben; - = udviser ikke egenskaber.

TABEL III

15

DK 166024B

Yderligere egenskaber af A42125-kulturen

Q

5 Egenskab Bedømmelse

Phosphatase +

Hydrolyserer skummetmælk

Melanoid pigmentproduktion + 10 Gelatinesmeltning +

NaCl tolerance % 6

Katalase +

Dekomponerer: 15 Chitin DNA +

Guanin +

Keratin Testosteron 20 Bruger:

Acetat +

Malat +

Oxalat +

Propionat + 25 Pyruvat +

Danner syre ud fra:

Dulcitol

Ethanol

Fructose + 30 d-(+)-galactose +

Inulin

Salicin

Saccharose

Temperaturområde for vækst 15-37 "C

35 -:- o + » stamme har egenskaben; - = stamme har ikke egenskaben . 16

DK 166024B

Hydrolyserede hele celler indeholdt meso-isomeren af di-aminopimelinsyre. Tilstedeværende sukkerarter i hele cel-lehydrolysater var arabinose, galactose, mannose og ribose. Cellevægstypen var ifølge Becker, supra, type IV, og .5 sukkermønstret var type A (Lechevalier, supra). Mycolsyre (LCN-A) produceredes ikke af A42125-kulturen. Cellerne var gram-positive ved farving, men ikke syrefaste.

A42125-kulturen har en type IV cellevæg, et type A hel-10 celle-sukkermønster og indeholder ikke mycolsyre (LCN-A).

Denne chemotaxonomiske information og de almindelige dyrkningsegenskaber er i overensstemmelse med fastlæggelse af A42125-kulturen som .tilhørende slægten Nocardia Trevisan 1889 [V.B.D. Skerman, V. McGowan og P.H.A.

15 Sneath, Eds., "Approved Lists of Bacterial Names," Int.

J. Syst. Bacteriol. 30; 225-420 (1980)].

Sammenligninger af egenskaberne ved A42125-kulturen med offentliggjorte beskrivelser af Nocardia-arter viste 20 overensstemmelse med følgende arter: a h

Nocardia aerocolonigenes ' a

Nocardia brasiliensis '

Nocardia orientalisa'b'c 25 a

Goodfellow og Schaalo, supra u °Gordon, Mishra og Barnett, supra

C

Pittenger og Brigham, supra.

30 Disse kulturer dyrkedes samtidig med A42125-kulturen. Offentliggjorte resultater og forsøgsresultater blev slået sammen, og resultaterne bedømt.

Lighedskoefficienter blev beregnet som anført af 35 Kurylowicz et al., (W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski og T. Szulga, "Nummerical Taxonomy of Streptomycetes," Polish Medical Publishers, 17

DK 166024 B

Warsaw, 1975, p. 37), idet man anvendte følgende ligning:

Ns+ + Ns o _ ---x 100

Ns + Ns" + Nd 5 + hvor Ns er antallet af positive ligheder, Ns er antallet af negative ligheder, og Nd er antallet af uligheder (forskelle).

Egenskaberne, der blev anvendt til at beregne SCM, var XO bn fysiologiske og ikke dyrkningsmæssige eller morfologiske.

Det totale antal egenskaber var lig med 44.

Lighedskoefficienter er angivet nedenfor: 15

Kultur S01UI

SM

A42125 100 N. aerocolonigenes 88 2q N. orientalis 70 N. brasiliensis 65

Fordi N. brasiliensis havde lille lighed dyrkningsmæssigt med A42125-kulturen og en lav SgM~værdi, blev den ladt ude af betragtning.

25 N. orientalis havde dyrkningsmæssige egenskaber svarende til egenskaberne ved A42125-kulturen. Denne lighed gælder specielt på iSP-substrat nr. 3 og 4. Den blev imidlertid ladt ude af betragtning, fordi de fysiologiske egenskaber ikke var ens, hvilket sås af den lave S-.„.

SM

N. aerocolonigenes har ikke lufthyfer. Derfor kan en dyrkningsmæssig sammenligning med A42125-kulturen kun foretages på basis af væksten, farven af bagsiden og oplø-35 selige pigmenter. Da N. aerocolonigenes først blev be-

DK 166024 B

18 skrevet [E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces 111," Int.

J. Syst. Bacteriol. 18(4); 279-392 (1968)], blev det angivet, at den havde hvide lufthyfer på ISP nr. 5. Denne 5 iagttagelse er i overensstemmelse med observationerne fra de foretagne samtidige sammenligningsforsøg (se tabel I, ISP nr. 5). Væksten og farven af bagsiden af A42125-kul-turen og N. aerocolonigenes passer pænt sammen. Begge sammenfald demonstreres specielt godt på Czapek's opløs-10 ningsagar og glucoseasparagin-agar.

Gordon, supra, klassificerede stammer som N. aerocolonigenes under anvendelse af træk, der ikke var lufthyfer.

De fysiologiske og chemotaxonomiske ligheder mellem 15 A42125-kulturen og N. aerocolonigenes var langt større end forskellen på grund af manglende lufthyfer. Tre hovedegenskaber var opgivet af Gordon for at skelne N. orientalis fra N. aerocolonigenes. En sammenligning af disse egenskaber med egenskaberne af A42125-kutluren er 20 angivet i tabel IV:

TABEL IV

Sammenligning af egenskaber, der adskiller A42125-kultu-25 ren, N. orientalis og N. aerocolonigenes g

Egenskab N. orientalis N. aerocolonigenes A42125-kultur

Erythritol + - - 30 α-methylglucosid + -

Resistens over for lysozym - + + 35 a+ = stamme har egenskaben - = stamme har ikke egenskaben.

DK 166024 B

19

Undersøgelse af disse egenskaber viser,, at A42125-kultu-ren er nærmest beslægtet med N. aerocolonigenes.

A42125-kulturen og N. aerocolonigenes er forskellige med 5 hensyn til carbonudnyttelse (målt som vækst og syreproduktion) kun med hensyn til en enkelt kulhydratkilde.

Under anvendelse af nøglen udviklet af Mishra, supra, til foreløbig identifikation af arter af Nocardiae anbragtes 10 A42125-kulturen direkte hørende under N. aerocolonigenes.

Disse sammenligninger tyder på, at A42125-kulturen har en begrænset dyrkningsmæssig lighed og god fysiologisk lighed med N. aerocolonigenes. Den betydeligste forskel er tilstedeværelsen af lufthyfer hos A42125-kulturen. Da N.

15 aerocolonigenes er kendt for at frembringe lufthyfer, antages denne forskel ikke for at være tilstrækkelig til at udelukke A42125-kulturen fra denne taxonomiske gruppe.

Derfor klassificeres A42125-kulturen som en stamme af Nocardia aerocolonigenes (Shinobu og Kawato) Pridham og 20 Lyons 1970. Fordi N. aerocolonigenes ikke er i den vedtagne liste over bakterienavne, supra, er den ikke en gyldig offentliggjort art.

Som det er tilfældet med andre organismer, kan egenska-25 berne hos den A42125-producerende kultur Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 undergå variationer. Rekombinanter, mutanter eller varianter af stammen kan opnås ved fremgangsmåder, der er velkendte af fagmanden. F.eks. kan mutanter opnås ved behandling med forskellige fysiske og 30 kemiske mutagener, som f.eks. ultraviolet lys, røntgenstråler, gamma-stråler og kemikalier som N-methyl-N*-ni-tro-N-nitrosoguanidin.

Dyrkningssubstratet anvendt til at dyrke Nocardia aeroco-35 lonigenes NRRL 18049 kan være et hvilket som helst af en hel række substrater. Af hensyn til økonomien ved produktionen, optimalt udbytte og for at få en så let produk-

DK 166024 B

20 tion som muligt, foretrækkes imidlertid visse dyrkningssubstrater. Til N. aerocolonigenes er de foretrukne kulhydratkilder ved forgæring i stor målestok f.eks. glucose og dextriner, skønt andre sukkerarter og sukkerpolymere 5 og lignende også kan anvendes.

Foretrukne nitrogenkilder for N. aerocolonigenes er sojabønneskrå og majsstøbevæske, skønt andre nitrogenkilder som f.eks. "distillers solubles", gærekstrakt, kødeks-10 trakt og lignende også kan anvendes. Blandt de uorganiske næringssalte, der med fordel kan inkorporeres i dyrkningssubstratet, er almindelige opløselige salte, der giver zink, natrium, magnesium, calcium, ammonium, chlorid, carbonat, sulfat, nitrat og lignende ioner.

15

Essentielle sporstoffer, der er nødvendige for væksten og udviklingen af organismen, bør også forefindes i dyrkningssubstratet. Disse sporstoffer forekommer sædvanligvis som urenheder i andre bestanddele af substratet i 20 tilstrækkelig mængde til at opfylde behovet for vækst for organismen. Opskumning er sædvanligvis ikke et problem, men små mængder (dvs. 0,2 ml/liter) af et skumdæmpende middel, som f.eks. polypropylenglycol, kan eventuelt tilsættes forgæringssunstratet, når der dyrkes i 25 stor målestok.

Til frembringelse af væsentlige mængder antibiotikum A42125 foretrækkes neddykket aerob forgæring i tanken.

Små mængder A42125 kan fås ved rystekulturer. På grund af 30 den nødvendige tid for at opnå antibiotika-produktion, der sædvanligvis opnås ved inokulering af store tanke med sporeformen af den pågældende organisme, foretrækkes det at anvende et vegetativt inolulum. Det vegetative inoku-lum fremstilles ved at inokulere en lille mængde dyrk-35 ningssubstrat med sporeformen eller brudstykker af orga nismens mycelium til opnåelse af en frisk, aktivt groende kultur af organismen. Herefter overføres det vegetative 21

DK 166024B

inokulum til en større tank. Det vegetative inokulum-sub-strat kan være det samme som det, der anvendes til forgæring i fuld målestok, men andre substrater er også velegnede.

5 A42125 produceres af Nocardia aerocolonigenes NRRL18049, når der dyrkes ved temperaturer mellem ca. 25 og ca.‘ 37 °C. En god temperatur for A42125-produktionen synes at være omkring 30 °C.

10

Som det er sædvanligt ved anvendelsen af neddykkede aerobe dyrkningsprocesser, blæses steril luft ind i beholderen fra bunden, medens substratet omrøres med almindelige turbineskovle. Under de hidtil anvendte betingelser over-15 skrider den maksimale oxygenoptagelse ved forgæringen ikke ca. 0,2 ml/liter/minut. I en fuldstændig omrørt 135 liters forgæringsbeholder indeholdende ca. 115 liter bouillon, er en gennemluftningshastighed på 0,125 rum-fang/rumfang/min med en omrøringshastighed på 200-250 om-20 drejninger pr. minut tilstrækkelig til at holde niveauet af opløst oxygen på eller over 30 % af luftmætning.

Produktionen af antibiotikum A42125 kan følges under forgæringen ved at undersøge prøver af bouillonen for anti-25 biotisk aktivitet over for organismer, der er kendt for at være følsomme over for antibiotiket. En forsøgsorganisme, der er af værdi ved undersøgelsen for tilstedeværelse af A42125, er Micrococcus luteus. Bioforsøget udføres bekvemt ved agar-brøndplade-metoden.

30

Efter produktionen af A42125 under neddykkede aerobe forgæringsbetingelser kan antibiotiket udvindes af forgæringssubstratet under anvendelse af metoder, der anvendes inden for forgæring generelt. Den frembragte antibiotiske 35 aktivitet under forgæringen af den A42125 producerende organisme forekommer hovedsagelig i bouillonen. Maksimal udvindelse af A42125 opnås derfor ved først at filtrere

DK 166024 B

22 substratet for at skille bouillonen fra myceliemassen.

Den filtrerede bouillon kan herefter renses for at fraskille A42125. En hel række metoder kan anvendes til denne rensning.

5

En foretrukken metode til adskillelse af A42125 fra den filtrerede bouillon indebærer justering af bouillonen til en pH-værdi på ca. 7 og tilsætning af et passende adsor-berende middel, som f.eks. "Dianion HP-20" harpiks. Har-10 piksen fraskilles ved filtrering og ekstraheres med et passende opløsningsmiddel, som f.eks. acetonitril:vand (1:1). Herefter kan ekstraktionsopløsningsmidlet afdampes under vakuum til opnåelse af A42125.

15 Det på denne måde udvundne A42125 kan yderligere renses ved velkendte metoder. En foretrukken metode indebærer ionbytningskromatografi.

Adskillelse af antibiotikum A42125 kan følges ved hjælp 20 af tyndtlagskromatografi (TLC). Et bekvemt silicagel TLC-opløsningsmiddelsystem er acetonitril:methanol:vand:ammoniumhydroxid (4:2:2:1). I dette system har A42125 en Rf-værdi på omtrent 0,43. Den antibiotiske forbindelse kan afsløres ved bioautografi under f.eks. anvendelse af 25 Micrococcus luteus eller ved andre metoder, som f.eks. vanilin-svovlsyre påsprøj tningsreagens.

Alternativt kan de faste materialer fra dyrkningen, herunder substratbestanddele og mycelium, anvendes uden eks-30 traktion eller adskillelse, men fortrinsvis efter fjernelse af vand som en kilde .for A42125. F.eks. kan hele forgæringsbouillonen tørres ved lyofilisering, tromletørres eller destilleres azeotropt og tørres efter produktion af A42125. Den tørrede bouillon blandes herefter di-35 rekte i et foderpræmix.

23

DK 166024 B

A42125 haammer væksten af bakterier, der er pathogene over for dyr og planter. Tabel V opsummerer de minimum-hæmmende koncentrationer (MlC-værdier), ved hvilke A42125 hæmmer forskellige bakterier målt ved den almindelige agar-5 fortyndingsmetode.

TABEL V

Antibakteriel virkning af A42125 10

Forsøgsorganisme MIC (mcg/ml)

Staphylococcus aureus VI.1 1 15 Staphylococcus aureus V41 1

Staphylococcus aureus X400 1

Staphylococcus aureus S13E 1

Staphylococcus epidermidis Epi 1 1

Staphylococcus epidermidis 222 0,5 20 Streptococcus pyrogenes C203 2

Streptococcus sp. gruppe D X66 1

Streptococcus sp. gruppe D 2041 4

Haemophilus influenzae 76 8 25

Et specielt afgørende træk ved den antimikrobielle virkning af A42125 er dets virkning over for anaerobe bakterier. MIC-værdier, ved hvilke A42125 hæmmer forskellige anaerobe bakterier bestemt ved standard-agar-fortyndings-30 forsøget, er angivet i tabel VI. Resultater blev aflæst efter 24 timers inkubation.

35 24

DK 166024B

TABEL VI

Følsomhed af anaerobe bakterieisolater over for A42125 5 ---

Anaerobe bakterier MIC (mcg/ml)

Clostridium difficile 2994 4

Clostridium perfringens 81 4 10 Clostridium septicum 1128 4

Eubacterium aerofaciens 1235. 4

Peptococcus asaccharolyticus 1302 64

Peptococcus prevoti 1281 4

Peptostreptococcus anaerobius 1428 8 15 Peptostreptococcus intermedius 1624 4

Propionibacterium acnes 79 8

Bacteroides fragilis 111 >128

Bacteroides fragilis 1877 >128

Bacteroides fragilis 1936B >128 20 Bacteroides thetaiotaomicron 128

Bacteroides melaninogenicus 1856/28 64

Bacteroides vulgatis 1211 128

Bacteroides corrodens 1874 >128

Fusobacterium symbiosum 1470 >128 25 Fusobacterium necrophorum 6054A ^0,5

En anden vigtig egenskab ved den antimikrobielle virkning af A42125 er antibiotikets evne til at hæmme methanfrem-30 bringende bakterier. F.eks. hæmmer A42125 Methanococcus vannielli i koncentrationer så lave som 0,1 mcg/ml i et forsøg, ved hvilket én krystal A42125 blev anbragt på et 24 timers substrat (minimal substrat), og hæmningen blev målt i 3 dage.

En anden vigtig egenskab ved A42125 er forbindelsens evne til at forbedre foderudnyttelsen hos dyr. F.eks. forbed- 35 25

DK 166024B

rer A42125 foderudnyttelsen hos drøvtyggere, der har en udviklet vom-funktion.

Effektiviteten af foderudnyttelsen kan kontrolleres ved 5 at observere produktionen og koncentrationen af propio-natforbindelser i vommen. Vomvæsken blev opnået fra en tyr, der havde en kirurgisk installeret fistelåbning i vommen. Tyren blev holdt på et kornrigt foder, hvis sammensætning var følgende: 10

Grovformalet majs ................ 69,95 %

Formalede majskobler ............. 10,0 %

Sojabønnemel (50% protein) ....... 8,0 %

Lucernmel ........................ 5,0 % 15 Melasse.......................... 5,0 %

Urinstof......................... 0,6 %

Dicalciumphosphat ................ 0,5 %

Calciumcarbonat .................. 0,5 %

Salt ............................. 0,3 % 20 Vitamin A og D2 præmix ........... 0,07 %

Vitamin E præmix ................. 0,05 %

Spormineral præmix ............... 0,03 %

En prøve af vomvæsken sigtedes gennem fire lag osteklæde, 25 og filtratet opsamledes i en vakuumkolbe. Findelt materiale tilbageholdt af osteklæde blev genopslæmmet i nok fysiologisk puffer til at bringe rumfanget tilbage til det oprindelige rumfang af vomvæsken, og suspensionen sigte-des atter gennem osteklædet. Den anvendte puffer er be-30 skrevet nedenfor: 0,316 g/liter Na2HP04 0,152 g/liter KH2P04 2,260 g/liter NaHCOg 35 0,375 g/liter KC1 0,375 g/liter NaCl 0,112 g/liter MgS04 26

DK 166024B

0,038 g/liter CaCl2 0,008 g/liter FeS04*7H20 0,004 g/liter MnSO^ 0,004 g/liter ZnS04’7H20 5 0,002 g/liter CuS04*5H20 0,001 g/liter CoCl2

Cheng et al., J. Dairy Sci. 38, 1225 (1955).

10 De to filtrater blev slået sammen i en skilletragt og henstod, indtil findelt materiale steg op på toppen. Herefter fraskiltes det klare lag og fortyndedes 1:1 med den samme puffer og indstilledes til pH 7,0.

15 10 ml af den fortyndede vomvæske anbragtes i en 25 ml kolbe med 40 mg af samme foder som angivet ovenfor. 5 ml sojabønneprotein tilsattes også pr. kolbe. Forbindelsen, der skulle behandles, blev afvejet i hver forsøgskolbe.

Der blev anvendt fire ens kolber pr. behandling. To sæt 20 bestående af fire kontrolkolber anvendtes også. En kontrol til tiden nul anvendes og også en inkuberet 16 timers kontrol. Alle forsøgskolberne inkuberedes 16 timer ved 38 °C. Efter inkubationens afslutning måltes pH, og 2 ml 25 % methaphosphosyre sattes til hver kolbe. Prøverne 25 henstod for at bundfælde. Den supernatante del analyseredes ved hjælp af gaskromatografiske metoder for flygtige fede syrer.

Der udførtes analyser for acetat, propionat og butyrat-30 forbindelser. Resultaterne sammenlignedes statistisk med resultaterne af analyser af kontrolkolberne. Behandlinger med propionatproduktion, der signifikant var højere end kontroller, blev betragtet som aktive behandlinger. Tabel VII viser forholdene mellem flygtige fede syrer- (VFA) 35 koncentrationer i A42125 behandlede kolber i forhold til kontrolkolber ved disse forsøg.

DK 166024 B

27

TABEL VII

9

Virkning af A42125 på drøvtyggeres foderudnyttelse 5 -

Total VFA/

Dosis Molær % Molær % Molær % Kontrol VFA

mcg/ml propionat acetat butyrat mm/1 10 20 1,283 0,914 0,608 0,921 5 1,237 0,877 1,019 0,988 5 0,959 0,992 1,075 0,921 15 1 1,122 1,015 0,795 1,237 5 1,118 0,915 0,867 1,041 1 1,105 0,881 1,111 0,997 20 5 1,778 0,896 0,654 0,921 1 1,458 0,915 0,823 0,858 aFem forsøg.

25 Methanhæmningen skyldtes også en mere effektiv foderudnyttelse hos drøvtyggere ved at føre til acetat som anvendelig energi i stedet for methan, der udskilles. Denne virkning kan måles, idet man anvender in vitro forsøg, der efterligner vomvirkningen. Dette forsøg udførtes i 30 kontinuerte forgæringskolber, der efterligner vommens virkning gennem en længere tidsperiode. Hver kolbe var en gastæt beholder med væsketilledningsåbninger, åbninger for tilledning af faste stoffer, udtagningsåbninger og gasfraledningsrør, der førte til en gummibold, der opsam-35 ledes gassen frembragt ved forgæringen. Væskerumfanget i hver kolbe kontrolleredes ved 500 ml ved hjælp af en ledning, der førte til en væskeopsamlingsbeholder. Tempera-

DK 166024 B

28 turen af kolberne holdtes ved 38-40 °C. Hver kolbe blev forsigtigt omrørt med en magnetisk omrører.

Hvert forsøg startede ved til en kolbe at sætte 500 ml 5 siet vomvæske opnået fra en tyr med dræn, der var fodret med samme diæt som anvendt i forsøget. Fralednings-opsam-lingskolben var forud tilsat 50 ml fortyndet methaphos-phorsyre for at stoppe forgæringen i den væske, der løb over fra kolben. Kolben forsegledes, og gasopsamlingsbol-10 den blev fastgjort.

Væske sattes kontinuert til hver kolbe ved at tildryppe den en liter pr. dag af pH 6,8-7,0 puffer med følgende sammensætning: 15

Natriumhydrogenphosphat 2,2 g/liter

Magnesiumchlorid 0,036

Natriumbicarbonat 5,9

Kaliumchlorid 0,34 20 Natriumchlorid 0,28

Urinstof 1,0

Calciumchlorid 0,024

En 10 g portion af det pågældende foder tilsattes to gan-25 ge dagligt gennem tilførselsåbningen til hver kolbe. Efter hver fodring aflukkedes gasfraledningsåbningen, og kolben blev gennemskyllet med kuldioxid.

Hver dag opsamledes den overskydende væske og analysere-30 ' des, og den gas, der forlod kolben, opsamledes og analy seredes .

Sædvanlig praksis var at behandle hver kolbe i fire dage uden nogen behandlings forbindelse sat til fodret. Efter 35 fire dages ligevægtsperiode påbegyndtes analyse af frastrømmende væske og gas, og kolben behandledes uden nogen form for tilsætningsforbindelse, indtil de analytiske re-

DK 166024 B

29 sultater var forholdsvis konstante. Tilsætning af behandlet foder til kolben påbegyndtes på dette tidspunkt, og kolben behandledes med det behandlede foder i minimum 7 dage.

5

Forbindelsen sattes til fodret i mængder, der var passende til at give den koncentration af forbindelsen i 500 ml væske i kolben, som angivet i tabel VIII nedenfor. I de fleste forsøg anvendtes to kolber for hvert behandlings-10 niveau af forbindelsen, og resultaterne for begge kolber for alle behandlingsdagene blev slået sammen og gennemsnittet beregnet. Tabel VIII opsummerer den methanhæmmen-de virkning af A42125.

15 TABEL VIII

Virkning af A42125 på drøvtyggeres methanproduktion3 20 Dosis Methan mcg/ml mm/dag 23,0 5 2,3 25 - 4,1 5 1,8 1 2,3 30 - 7,2 5 0,3 1 0,8 aTre forsøg.

Beregnet LDgQ efter enkeltdosis-administrering af A42125 til mus er: 35

DK 166024 B

30 LDgQ (intraperitonealt) = > 9,375 mg/kg LD5q (peroralt). = > 89 mg/kg A42125 er typisk i stand til at forøge propionatmængden 5 og som følge hveraf effektiviteten af foderudnyttelsen, dersom forbindelsen administreres peroralt til drøvtyggere i mængder på fra 0,05 mg/kg/dag til 6,75 mg/kg/dag. Foretrukne administreringsmængder er fra 0,2 mg/kg/dag til 3,5 mg/kg/dag.

10

En foretrukken metode til administrering ér at blande forbindelsen med dyrenes foder; imidlertid kan den administreres på andre måder som f.eks. tabletter, store doser, boluser eller kapsler. Formuleringen af de forskel-15 lige dosisformer udføres ved velkendte metoder inden for det veterinære-farmaceutiske fagområde. Hver enkelt dosisenhed kan indeholde en mængde af den omhandlede forbindelse direkte relateret til den korrekte daglige dosis for det dyr, der skal behandles.

20

Opfindelsen angår yderligere foderpræparater til at forøge foderudnyttelsen hos drøvtyggere, der er ejendommelige ved det i krav 5’s kendetegnende del angivne.

25 A42125 kan administreres til dyrene peroralt eller paren- teralt. Den mest praktiske vej er at administrere A42125 som et fodertilskud. En hel række fodermidler, herunder almindeligt tørfoder, væskeformigt foder og pelleteret foder kan anvendes. Skønt den foretrukne metode for admi-30 nistreringen er at blande forbindelsen med dyrets foder, kan det også gøres på anden måde, f.eks. som tabletter, store doser, boluser eller kapsler. Den enkelte enhedsdosis skal indeholde en sådan mængde A42125, at den direkte er relateret med den korrekte daglige dosis til det dyr, 35 der skal behandles.

31

DK 166024B

Metoder til at formulere lægemidler i dyrefoder er velkendte. En foretrukken metode er at fremstille en koncentreret lægemiddel-præmix, der for sit vedkommende anvendes til at fremstille det medikamenterede foder. Typiske 5 præmixer kan indeholde fra ca. 1 til ca. 200 g lægemiddel pr. ca. 500 g præmix. Præmixen kan enten være fast eller flydende.

Den endelige formulering af fodret til dyrene afhænger af 10 den mængde lægemiddel, der skal administreres. Den almindelige metode er at blande og pelletere foderet, idet denne metode kan anvendes til at fremstille foder indeholdende A42125.

15 A42125 kan formuleres til parenteral administrering ved hjælp af metoder, der er velkendte inden for det veterinære farmaceutiske fagområde. Effektive injicerbare præparater indeholdende A42125 kan foreligge i enten suspensions- eller opløsningsform. Som opløsning opløses A42125 20 i et fysiologisk acceptabelt bærestof. Disse bærestoffer omfatter et passende opløsningsmiddel, konserveringsmidler som benzylalkohol og eventuelt puffere. Anvendelige opløsningsmidler er f.eks. vand, alkoholer, glyceroler eller inerte olier som f.eks. vegetabilske olier eller 25 højraffinerede mineralolier.

Injicerbare suspensionspræparater fremstilles under anvendelse af et ikke-opløsningsmiddel for forbindelsen sammen med adjuvanser som bærestof. Ikke-opløsningsmidlet 30 kan f.eks. være vand eller en glycol som polyethylengly- col.

Passende fysiologisk acceptable adjuvanser er nødvendige for at holde forbindelsen opslæmmet i suspensionsform.

35 Adjuvanser kan vælges blandt fortykkelsesmidler som carb-oxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatine og al-ginater. Mange overfladeaktive midler er også anvendelige

DK 166024 B

32 til at opslæmme forbindelserne. Lecithin, alkylphenolpo-lyethylenoxid-additionsprodukter, naphthalensulfonater, alkylbenzensulfonater og polyoxyethylensorbitanestere er værdifulde opslæmningsmidler i flydende ikke-opløsnings-5 midler.

Mange forbindelser, der påvirker hydrofiliciteten, vægtfylden og overfladespændingen af det flydende ikke-opløs-ningsmiddel kan hjælpe til at fremstille injicerbare sus-10 pensioner i de enkelte tilfælde. F.eks. kan siliconeanti- skummidler, glycoler, sorbitol og sukkerarter være af værdi som suspensionsmidler.

Opfindelsen illustreres nærmere i følgende eksempler.

15 EKSEMPEL 1

Fremstilling af antibiotikum A42125 20 A. Rystekulturforgæring

Kulturen Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 enten i form af en lyofiliseret pellet eller som en suspension anbragt i flydende nitrogen anvendtes til at inokulere et skrå- 25 agarsubstrat med følgende sammensætning:

Skråagarsubstrat

Bestanddel Mængde (g/1) 30 Kartoffeldextrin 10 Gærekstrakt 1 *

Enzym-hydrolyseret kasein 2 Kødekstrakt 1

CoC12'6H20 0,01 35 Agar 20

Afioniseret vand q.s. 1 liter 33

DK 166024B

* N-Z Amine A, Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst NJ. pH er indstillet fra “6,2 til 7,0 med NaOH.

Den inokulerede skråagar inkuberes ved 30 °C i ca. 7 da-5 ge. Den udvoksede skråagarkultur afskrabes med et sterilt værktøj for at løsne sporerne og fjerne og sønderdele myceliemåtten. Ca. en fjerdedel af de løsnede sporer og selve kulturen anvendes til at inokulere 50 ml af et vegetativt substrat med følgende sammensætning: 10

Vegetativt substrat

Bestanddel Mængde (g/1)

Glucose 15 * 15 Tapioca dextrin 20

Sojabønneskrå 15

Maj sstøbevæske 10 Gærekstrakt 1

CaCOg 2 20 Postevand q.s. 1 liter *

Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur IL. pH indstillet fra “5,5 til 6,5 med NaOH.

25 Det inokulerede vegetative substrat dyrkes i en 150 ml Erlenmeyer-kolbe ved 30 °C i ca. 72 timer på en rysteanordning, der drejede i en 5,08 cm cirkel med 250 omdrejninger pr. minut.

30 Det inkuberede vegetative substrat (1,25 ml) anvendes til at inokulere 50 ml af et produktionssubstrat med følgende sammensætning: 35

DK 166024 B

34

Bestanddel Mængde (g/l)

Glucose 25

Majsstivelse 10 *

Opløseligt kødpepton 10 5 Enzym-hydrolyseret kasein 4

Sirupmelasse 5

MgS04*7H20 0,5

CaCOo 2,0

Czapek's Mineral-stamopløsning 2 ml 10 Afioniseret vand q.s. 1 liter * O.M. Peptone, Amber Laboratories, Juneau WI.

&& N-Z Amine A.

Czapek's mineral-stamopløsning havde følgende sammen-15 sætning: 100 g KC1 100 g MgS04‘7H20 2 g FeS04*7H20 20 indtil 1 liter med afioniseret vand.

Det inokulerede produktionssubstrat inkuberes i en 250 ml vidhalset Erlenmeyer-kolbe ved 30 °C i 3 til 5 dage på en rysteanordning, der rystede i en 5,0 cm cirkel ved 250 25 omdrejninger pr. minut.

B. Tank forgæring

For at opnå et stort rumfang af inokulum anvendes 10 ml 30 af det inkuberede vegetative substrat fremstillet som beskrevet under afsnit A til at inokulere 250 ml af et andet-trins vækstsubstrat med samme sammensætning som det vegetative substrat. Dette andet trins-substrat inkuberes i en 2-liter vidhalset Erlenmeyer-kolbe i ca. 70 timer 35 ved 30 0C på en rysteanordning, der cirkulerer i en ca.

5,08 cm cirkel med 250 omdrejninger pr. minut. Det således fremstillede inkuberede andet-trins substrat (400 ml)

DK 166024 B

35 anvendes til at inokulere 100 liter sterilt produktionssubstrat fremstillet som beskrevet under afsnit A. Det inokulerede produktionssubstrat forgærer i en 165 liters omrørt forgæringstank i tre til fem dage ved en tempera-5 tur på 30 °C. Luftgennemstrømning (0,12-0,25 rumfang/rum-fang/minut) og moderat omrystning (200-250 omdrejninger pr. minut) i den omrørte beholder opretholder et opløst oxygenniveau på 30 % af luftmængden.

10 EKSEMPEL 2

Isolering af A42125

Hele forgæringsbouillonen (92 liter) indeholdende 3 % 15 "Hyflo Supercel" filtreredes gennem en filterpresse.

Bouillonfiltratet (74 liter) indstilledes til pH 7 med NaOH. "Dianion HP-20" harpiks (9,4 liter) tilsattes. Blandingen omrørtes i 45 minutter og filtreredes. Filtratet bortkastedes, og harpiksen vaskedes tre gange med 20 vand (10 liter pr. gang) og tre gange med acetoni- tril:vand (3:17, 10 liter pr. gang) ved at genopslæmme, omrøre og filtrere. Vaskeopløsningen bortkastedes. A42125 elueredes ved at opslæmme harpiksen i acetonitrilrvand (1:1, 10 liter) og omrøre og filtrere. Man udførte fire 25 efter hinanden følgende elueringer, og hver eluatfraktion undersøgtes, idet man anvendte en Micrococcus luteus ski-ve-plade-metode. De første to eluanter blev slået sammen, koncentreret i vakuum for at fjerne acetonitrilen og frysetørret til opnåelse af 94,9 g urenset A42125. Den tre-30 die eluant gav 20,8 g urenset A42125.

EKSEMPEL 3

Rensning og udkrystallisation af A42125 35

De urensede A42125-præparater fremstillet i eksempel 2 blev slået sammen (115,2 g) og opløst i vand (3 liter).

DK 166024 B

36

Opløsningen filtreredes for at fjerne et bundfald, og filtratet påførtes en søjle indeholdnde 3 liter "Dowex" 50 x 2 (NH^), 100-200 mesh harpiks. Søjlen vaskedes først med 5 rumfang vand og derefter med 0,1N NH^OH. Fraktio-5 nerne fra den 2N NH^OH foretagne eluering indeholdende de største mængder A42125 blev slået sammen og koncentreret til et rumfang på ca. 3 liter. A42125 udfældedes og fra-filtreredes. Bundfaldet opløstes i methanol (300 ml), og denne opløsning sattes til ether (6 liter) for at udfælde 10 A42125. Bundfaldet frafiltreredes og tørredes, hvorved der opnåedes 16,6 g A42125 som et amorft pulver. Et andet bundfald opnåedes ved yderligere at koncentrere den vandige opløsning og behandle denne på samme måde, hvorved der opnåedes 20,7 g mindre rent A42125.

15

Det først opnåede A42125 (16,6 g) opløstes i varmt vand (800 ml). Denne opløsning henstod natten over ved stuetemperatur, og A42125 udkrystalliserede. De udskilte krystaller frafiltreredes og tørredes i vakuum, hvorved der 20 opnåedes 10,6 g og 2,3 g (anden udfældning) krystallinsk A42125 med smeltepunkt 149-150 °C.

EKSEMPEL 4 25 A42125-beriget kvægfoder

En afbalanceret høj-kornholdig foderblanding tilpasset til færdigfodring af kvæg blev fremstillet med følgende sammensætning: 30 ·

Bestanddel Procent kg/ton

Gul majs 50,25 502,5

Maj skolber 34,927 349,27

Dehydratiseret lucernemel, 17% 4,00 40,0 35 Sojabønnemel, opløsningsmiddel- ekstraheret 4,00 40,0

Urinstof, fodergrad 0,35 3,5

DK 166024B

37

Melasse, sukkerrør 5,00 50,0

Dicalciumphosphat 0,65 6,5

Salt 0,35 3,5

Calciumcarbonat 0,30 3,0 5 Spormineral præmix1 0,03 0,3 2

Vitamin A + D« præmix 0,07 0,7 d 3

Vitamin E præmix 0,07 0,7 A42125 0,003 0,03 100,00 1000 kg 10 - - ^Spormineral præmix indeholder: 2,50 % mangan som manganoxid 15 0,07 % iod som kaliumdioxid 0,30 % kobolt som cobaltcarbonat 0,50 % kobber som kobberoxid 20,00 % zink som zinksulfat.

2 20 Hver 0,45 kg Vitamin A og D3 præmix indeholder: 2.000.000 USP enheder Vitamin A og 225.750 USP enheder Vitamin D^.

3 25 Hver 0,45 kg Vitamin E præmix indeholder: 20.000 internationale enheder Vitamin E.

30 35

Claims

1. Antibiotikum A42125 samt alkalimetal-, jordalkalime-5 tal-, amin- og syreadditionssalte deraf, kendetegnet ved, at det i ikke-saltform har følgende egenskaber: Tilstand: Hvide krystaller (fra vand); 10 Smeltepunkt: 149-150 °C; UV: Ingen absorption;

15 IR (KBr): Absorptionsspektrum som angivet på tegningen. Titrering (80 % vandig dimethylformamid): pKa-værdier 5,2, 8,7 og 10,5; Molekylvægt; 2032 (feltdesorptionsmassespektrometri). 20 Empirisk formel: ciqihi84N2°38; Aminosyrer: Ingen fundet;

25 Opløselighed: Opløseligt i vand.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er et farmaceutisk acceptabelt salt af A42125.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum A42125 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 eller en mutant heraf med væsentlig samme egenskaber i et dyrkningssubstrat indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og 35 uorganiske salte under neddykkede aerobe forgæringsbetingelser. DK 166024B

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at dannet A42125 adskilles fra dyrkningssubstratet.

5. Foderpræparat til forøgelse af foderudnyttelsen hos 5 drøvtyggere, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af en forbindelse ifølge krav 2.

6. Biologisk ren kultur af mikroorganismen Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 til brug ved fremgangsmåden 10 ifølge krav 3. 15 20 25 30 35