CN87102770A

CN87102770A - 抗菌素a42125及其生产方法

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Publication number: CN87102770A
Application number: CN198787102770A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·L·哈米尔; 拉尔夫·埃米尔·卡斯特纳
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-04-11
Publication date: 1987-12-16
Also published as: NZ219902A; DE3779946D1; EG18187A; IL82119A0; DK166024B; HUT46073A; US4870021A; DK178387A; HU197941B; PH24808A; AU7136887A; US4764510A; SU1547710A3; EP0241285A2; IE870942L; DK166024C; JPS62281889A; DK178387D0; DE3779946T2; IE59699B1

Abstract

由新菌株产气群诺卡氏菌NRRL 18049(Nocardia aerocolonigenes，NRRL 18049)产生的抗菌素A42125可用作革兰氏阳性和产生甲烷的微生物的抑制剂。A42125也可提高反刍动物对饲料利用效率。本发明提供了一种产气群诺卡氏菌NRRL 18049的生物纯培养菌和通过该菌种发酵生产A42125的方法。

Description

本发明涉及新的抗菌素A42125和产生这种抗菌素的新菌株产气群诺卡氏菌（Nocardia aerocolonigenes）NRRL。18049。A42125是一种对产生甲烷的微生物具有特殊意义的抗菌活性的抗菌剂。由于在模拟瘤胃条件的实验中，A42125使甲烷的产量减至最低程度，所以A42125可以提高饲料效率，同时又促进反刍动物的生长。

本发明的另一个方面就是深层有氧发酵条件下培养新菌株产气群诺卡氏菌NRRL 18049直至基本上产生抗菌素，以生产A42125的方法。A42125是通过将其吸附在树脂上并用极性有机溶剂洗脱，从发酵肉汤中提取得到的。采用公认技术，如离子交换色谱法，对A42125进行分离和进一步纯化。

因为产气群诺卡氏菌NRRL 18049是最新发现的菌株，所以本发明进一步涉及该种微生物的生物纯化培养。

附图表示A42125在KBr中的红外吸收光谱。

在兽医领域里仍有需要继续改进抗菌素。促进动物生长是这些抗菌素的一个目的，促进生长可以通过减少疾病和提高饲料的利用效率来实现。促进诸如牛、羊这一类的反刍动物的生长在商业上有着特殊的兴趣。

在反刍动物的瘤胃中，微生物使碳水化合物降解以产生能够进行代谢的化合物，例如丙酸盐。但是，有些微生物对该系统的效率具有不利的影响。例如，甲烷微生物或产生甲烷的微生物可以降低反刍动物对饲料的利用效率。A42125的一个特殊优点就是抑制产生甲烷的微生物，从而能够用以促进反刍动物的生长。

尽管产生甲烷的微生物（原始细菌）在反刍动物的消化系统中是不需要的，但是他们对世界的环境而言却有重要的贡献，因为他们在把废的生物物质分解为甲烷的最终阶段中起着催化作用。此外，甲烷可以用作燃料，借此有助于解决能源问题。因此甲烷微生物和增产甲烷的方法是重要的。

增加甲烷生产的一种途径是发展甲烷微生物中的遗传交换系统，为了完成此项研究，可选择的特征如选择有抗菌素抗性的特征是重要的。这些特征通常是通过对能正常杀死微生物的抗菌素具有抗性的突变体的选择而发现的。可惜甲烷微生物对大多数抗菌素具有天然的抗性。因此，A42125抑制甲烷微生物的这一事实可用于找出一种可选择的特征以利于在甲烷微生物中的遗传交换。

A42125的特征

抗菌素A42125具有下述生理化学特征：

状态：白色结晶（由水中结晶）

熔点：149-150℃

紫外光：不吸收

红外光：（Kbr）：见附图;

吸收频率（厘米^-1）：宽峰，包括：3423，3413，3409，3403，3398和3386;2937，1720，1602，1453，1408，1379，1290，1192，1120，1090，1064，971，830和802。

滴定（80%二甲基甲酰胺水溶液）：pKa：5.2，8.7和10.5。

分子量：2023（场致解吸质谱分析）

实验式：C₁₀₁H₁₈₄N₂O₃₈

元素分析：

元素实测值%

碳 59.51

氢 9.05

氮 1.44

氧 30.08

氨基酸：未找到

溶解度：溶于水

生物自显影测定：华特曼一号滤纸用0.95N Na₂SO₄和0.05N NaHSO₄.H₂O浸渍，一个含有1.5%NaCl的80%乙醇水溶液的溶剂系统，用藤黄细球菌（Micrococcus luteus）检测，A42125的Rf值约为0.46。

根据其滴定特征，似乎A42125可以具有生成盐类的羧基、胺类官能团和酚基。

这类盐可用于分离、纯化和释放出抗菌素，因此，42125盐类是本发明的一部分。可作药物用的盐类尤其有用，例如可用的盐类有碱金属，碱土金属胺和酸加成盐。

具有代表性的可用碱金属和碱土金属盐包括;钠、钾、锂、铯、铷、钡、钙和镁盐。可用的胺盐包括：铵及伯、仲和叔C₁-C₄烷基铵以及羟基-C₂-C₄烷基铵盐。所述的胺盐包括由A42125与氢氧化铵、甲胺、仲丁胺、异丙胺、二乙胺、二异丙胺、乙醇胺、三乙胺、3-氨基-1-丙醇等反应生成的那些盐。

有代表性的酸加成盐包括由与有机酸和无机酸的标准反应生成的那些盐，有机酸和无机酸例如有硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、双羟萘酸、粘酸、D-谷氨酸、d-樟脑酸、戊二酸、羟基乙酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等。

在兽用药物方面，用抗菌素治疗动物时，抗菌素的形式通常并无重要意义。在大多数情况下，动物体内的条件使药物转换成不同于用药时的形式。因此可以使用的盐的形式的重要性并不很大，然而选用盐的形式是出于经济、设备和毒性的考虑。

生产抗菌素A42125是通过在深层有氧条件下，在适合的培养基中培养产生A42125的产气群诺卡氏菌株至基本产生抗菌活性。A42125可以通过已知的方法采用分离和纯化方法回收。

用于制备抗菌素A42125的新的产氧群诺卡氏菌株是从巴西土壤采样中分离得到的。为了便于描述产氧群诺卡氏菌株，将该菌株称为A42125培养菌。

利利研究室的Frederick P.Mertz对该菌株进行了分类学研究。根据这些研究，该菌株在1970年Pridham和Lyons（T.G.Pridham，“布坎南放线菌目中的新名称和新的组合，1917年”，美国农业部技术公报第1424：32期，哥伦比亚特区，华盛顿，美国农业部农业研究服务处，1970年）的分类中是一个产气群诺卡氏菌的新菌株（Shinobu和Kawato）。这个分类是以同时做出的实验室相比较以及对相似菌种的公开描述的分析为基础的[M.Googfellow和K.P.Schaal，“诺卡氏菌属、放线菌分支菌属（actionmadura）和红球菌属的鉴定方法”，（F.A.Skinner和D.W.Lovelock编辑，“供微生物学家用的鉴定方法”，第二版，第261页，应用细菌学技术学会丛书第14期，学术出版公司，纽约，1979年）;R.E.Gordon，S.K.Mishra和D.A.Barnett，“诺卡氏菌属的若干菌株，N.carnea，N.vaccinii，非洲诺卡氏菌，东方诺卡氏菌和产气群诺卡氏菌”（“普通微生物学杂志”，109卷，69-78页，1978年）;S.J.Mishra R.E.Gordon和D.A.Barnett”，“诺卡氏菌属和链霉菌属医学意义上的鉴定”（“临床微生物学杂志”，第11卷，第6期，第728-736页1980年）;H.Mordarska和M.Mordarski，”“若干诺卡氏菌的化学分类特征和分类”（“普通微生物杂志”，第71卷，第77-86页，1972年）;R.C.Pittenger和R.B.Brigham，“东方链霉菌（新种）-产生万古霉素的菌种”（“抗菌素和化学治疗，第6卷，第11期，第642-647页，1956年）;S.A.Waksman，”放线菌，第2卷”（巴尔的摩，威廉和威尔金公司，1961年）。

应用的方法

继国际链霉菌属研究机构（ISP）建议的鉴定链霉菌菌种特征的方法[E.B.Shirling和D.Gottlieb，“鉴定链霉菌菌种特征的方法”，Int.J.Syst.BACTERIOL.16（3），313-340（1966）]某些补充试验（D.J Blazevic和G.M.Ederer”，诊断微生物学中生物化学试验的原理”，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1975），已被采用。

由Gordon等建议的诺卡氏菌种特性鉴定的方法，[R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan和C.H.Pang，“产腔诺卡氏菌、自营诺卡氏菌（N.Autotrophica）和诺卡氏菌株”，Int.J.Syst.Bacteriol.24（1），54-63（1974）]已被采纳。

采用Gordon和Barnett[R.E.Gordon and D.A.Barnett，“若干分支干菌属和诺卡氏菌属的菌种的利福平和溶菌霉抗性作为分类的工具”Int.J.Syst.Bacteriol 27（3），176-178（1977）建议的方法测定利福平和溶菌霉抗性。

ICSS-NBS质心色图、标准样品2106（国家标准局，1958年，哥伦比亚特区华盛顿美国商业部）和色调手册（第四版，伊利诺斯洲芝加哥，美国集装箱公司彩色标准部，1958年）都被用于确定色名。

形态学研究用的是光学显微镜，扫描电子显微镜（SEM）用于研究孢子表面的形状。

测定类黑素的产生（产色率）是用ISP1号（胰胨-酵母提取液肉汤）、ISP6号（蛋白胨-酵母提取液铁琼脂）、ISP7号（酪氨酸琼脂）和改进ISP7号（去除酪氨酸）。

二氨基庚二酸（DAP）的异构体和全细胞水解产物中的碳水化合物都用Becker等和Lechevalier的色谱法测定（B.Becker，M.P.Lechevalier.R.E.Gordon和H.A.Lechevalier，“用全细胞水解产物纸色谱法快速区分诺卡氏菌属和放线菌属之间的差异”应用微生物学（Appl.Microbiol.）12，421-423（1964）]和[M.P.Lechevalier，“临床意义的需氧放线菌的鉴定”，J.LAB.clin.Med.71，934-944（1968）]。

霉菌酸的测定采用的Minnikin所介绍的技术为基础的方法[D.E.Minnikini，I.G.Hutchinson and A.B.Caldicott，“含霉菌酸细菌甲醇分解产物的薄层色谱”，色谱分析杂志（J.Chromatography），188，221-233（1980）]。

测定淀粉水解用碘在ISP4号（无机盐淀粉琼脂）板上（参阅上文，Blazevic and Ederer，）检查有无淀粉存在。

NaCl耐量的测定：将NaCl加到ISP2号琼脂，使之与所需浓度相等，在30℃将琼脂板保温14天后进行测定。

对抗菌素抗性的测定：将抗菌素敏感盘置于接种过的ISP2号琼脂板上进行测定。

磷酸酶和脲酶用上文中Blazevic和Ederer所介绍的方法测定，明胶的液化用于测定蛋白酶活性。

培养特征

A42125在复合和限定琼脂培养基上一般都生长良好。除了在酵母-葡萄糖琼脂之外，都能产生需氧菌丝体。孢子质量的颜色为灰白相色。Tresner和Bachus系统中的最近配色表为d淡灰色和b牡蛎白色。背面为淡黄棕色趋向淡黄白色。在ISP2号和酵母-葡萄糖琼脂中产生淡棕色可溶色素。表1归纳给出了这些培养特征。

表1 A42125、产气诺卡氏菌属和

东方诺卡氏菌属的培养特征

东方诺卡氏产气诺卡氏

培养基特征＊ A42125 菌属菌属

G：大量大量大量

R： 78.d.yBr 68.s.OY 72.d.OY

ISP2 Am：大量：5fe 大量：2ba 无（表面多

1.gy.rBn 线黄色皱）

Sp：淡棕色无无

G：良好良好较差

R： 89.pY 89.pY 89.p.Y

ISP3 Am：较差：b 良好：b 无

牡蛎白色牡蛎白色

Sp：无无无

G：良好大量良好

R： 77.myBr 72.d.OY 90.gy.Y

ISP4 Am：良好：d 大量：d 无：

淡灰色淡灰色

Sp：无无无

G：大量大量大量

R： 77.m.yBr 67.brill.OY 88.dY

ISP5 Am：大量：b 大量：2ba 无（表面多

牡蛎白色浅黄色皱）

Sp：无无无

表Ⅰ（续）

东方诺卡氏产气诺卡氏

培养基特征＊ A42125 菌属菌属

G：良好大量良好

R： 77.m.yBr 67.brill.OY 88.d.Y

苹果酸钙Am：良好：b 大量：2ba 无

牡蛎白色线黄色

Sp：无无

G：良好良好大量

R： 77.myBr 89.pY 75.deep yBr

Czapek

溶液琼脂Am：良好：d 良好：b 无（表面多

淡灰色牡蛎白色皱）

Sp：极淡棕色无淡黄棕色

G：良好大量良好

R： 89.p.Y 67.brill.OY 88.d.Y

葡萄糖-

天冬酰胺Am：差：d 大量：2ba 无

淡灰色浅黄色

Sp：无无无

表Ⅰ（续）

东方诺卡氏产气诺卡氏

培养基特征＊ A42125 菌属菌属

G：良好较差差

R： 92.黄白色 93.黄灰色 92.黄白色

自来水

琼脂Am：较差：b 差：b 无

牡蛎白色牡蛎白色

Sp：无无无

G：大量大量大量

R： 78.d黄棕色 68.s.OY 72.d乳黄色

酵母-葡

萄糖琼脂Am：无（表面多大量：2ba 无：（表面多

皱）浅黄色皱）

Sp：淡棕色无无

＊G：生长

R：背面

Am：需氧菌丝体

Sp：可溶色素

形态特征

培养物A42125产生一种的底物，需氧菌丝体生长得不太好，用光学显微镜观察时，需氧菌丝体具有网状外形，这种形态在《贝氏手册》（R.E.Buchanan，and N.E.Gibbons编辑：《贝氏测量微生物学手册》“Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology”，第8版，威廉和威尔金公司，巴的摩尔，1974年）中被描述分类为无链霉菌。

用扫描电子显微镜检查ISP4号琼脂培养基中的需氧菌丝体时，观察到分生孢子。

孢子很少且形状不规则，孢子表面形状光滑[T.G.Pridham，C.W.Hesseltine，and R.C.Benedict，《根据选择群链霉菌的分类指南》，应用微生物学第6卷，第52-79页，1957年]。

孢子形状由椭圆形趋向圆柱形，形成的链数目在50以上，孢子大小为1.2-0.9×0.5-0.4微米，平均为1.1×0.5微米。

在深层振荡条件下生长时，菌丝体分离成片段。

生理特征

培养菌A42125分解酪蛋白、弹性蛋白、鸟嘌呤、次黄嘌呤、酪氨酸;水解苹果酸钙、DNA、七叶苷和淀粉;由阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、α-甲基-D-糖苷、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、蜜三糖、鼠李糖、海藻糖、木糖所生成的酸;能利用乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、草酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐。

培养菌A42125产生过氧化氢酶、磷酸酶、蛋白酶、脲酶和类黑素;对利福平没有抗性，但对溶菌酶、噻孢霉素、庆大霉素、林可霉素、青霉素和妥布霉素有抗药性。

培养物A42125的NaCl耐量高至6%，在15-37℃温度条件下生长，在50℃时经受不住8小时，水解脱脂乳或将硝酸盐还原为亚硝酸盐。这些生理特性列于表Ⅱ和表Ⅲ。

表Ⅱ A42125和有关诺卡氏菌株的若干形态和生理特性＊

特性 A42125 产气东方巴西

群诺卡氏菌诺卡氏菌诺卡氏菌

需氧菌丝体 + - + -

分生孢子 + - + -

耐酸性 - - - -

细胞壁中的霉菌酸 - - - +

尿素酶 + + + +

分解：

腺嘌呤 - - - -

酪蛋白 + + + +

弹性蛋白 + - - +

次黄嘌呤 + + + +

酪氨酸 + + + +

黄嘌呤 - - - -

抗药性：

对于溶菌酶 + + - +

对于利福平 - - + +

表Ⅱ（续）

特性 A42125 产气东方巴西

群诺卡氏菌诺卡氏菌诺卡氏菌

水解：

苹果酸钙 + + + 未发现

七叶苷 + + + +

马尿酸盐 - - + -

淀粉 + + + +

利用：

苯甲酸盐 + - - -

柠檬酸盐 + + + +

粘酸盐 - - - -

琥珀酸盐 + + + +

酒石酸盐 + - - -

还原硝酸盐 - - + +

在50℃，经8小时

的存活菌： - - + -

从下列物质形成的酸：

阿东糖醇 - - + -

1-（+）-阿戊糖 + + + -

纤维二糖 + + + +

异赤鲜醇 - - + -

葡萄糖 + + + +

表Ⅱ（续）

特性 A42125 产气东方巴西

群诺卡氏菌诺卡氏菌诺卡氏菌

从下列物质形成的酸：

甘油 + + + +

肌醇 + + + +

α乳糖 + + + -

麦芽糖 + + + -

D-甘露醇 + + + +

D-甘露糖 + + + +

松三糖 - - - -

蜜二糖 + + - -

α- 甲基葡糖苷 + - + -

棉子糖 + + - -

鼠李糖 + + + -

山梨醇 - - - -

海藻糖 + + + +

木糖 + + + -

在下列温度生长：

10℃ - + + +

45℃ - - - -

50℃ - - - -

＊：+表示有此特性;-表示无此特性。

表Ⅲ A42125的其他特性

特性表现特征＊

磷酸酶 +

水解脱脂奶 -

类黑素的产生 +

明胶液化 +

NaCl耐量% 6

过氧化氢酶 +

分解：

聚乙酰氨基葡糖 -

DNA +

鸟嘌呤 +

角蛋白 -

睾酮 -

表Ⅲ A42125的附加特性（续）

特性表现特征＊

利用：

乙酸盐 +

苹果酸盐 +

草酸盐 +

丙酸盐 +

丙酮酸盐 +

从下列物质形成的酸：

甜醇 -

乙醇 -

果醇 +

d-（+）-半乳糖 +

旋复花粉 -

水杨苷 -

蔗糖 -

生长的温度范围 15-37℃

＊：+表示有此特性;-表示无此特性。

细胞壁分析

水解整细胞含有二氨基庚二酸的内消旋异构体。存在于整细胞水解产物中的糖有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和核糖。根据BECKER（上文），细胞壁属Ⅳ型，糖为A型（Lechevalier，上文）。A42125不产生霉菌酸（LCN-A）。细胞染色呈革兰氏阳性，但并不耐酸。

A42125菌株的鉴定

A42125菌株具有Ⅳ型细胞壁，A型整细胞糖型，不含霉菌酸（LCN-A）。此化学分类的资料和一般的培养特征与将A42125菌株确定为诺卡氏菌层Trevisan 1889[V.B.D.Skerman，V.McGowan，和P.H.A.Sneath编：“审定的细菌名称表”，Int.J.Syst.Bacteriol 30卷，第225-420页，1980年]相一致。

A42125菌株与已经公开的关于诺卡氏菌属的菌种的描述进行比较，与下列菌种相似：

产气诺卡氏菌^a，b

巴西诺卡氏菌^a，b（Nbrasiliensis）

东方诺卡氏菌^a，b，c

a：Goodfellow and Schaal，上文

b：Gordon，Miskra and Barnett，上文

c：Pittenger and Brigham，上文

将这些培养菌与A42125菌株同时生长，把已发表的资料与实验资料结合起来计算结果。

以，Kurylowicz等人（W.Kurylowicz，A.Parzkiewicz，W.Woznicka，W.kurzatkowski和T.Szulga，“链霉菌的数字分类学”，华沙，波兰医学出版社，第37页，1975年）所讨论的方法，用下式计算相似系数：

S_SM＝ (Ns⁺+Ns^-)/(Ns⁺+Ns^-+Nd) ×100

式中，Ns⁺是正相似性数，Ns^-是负相似性数，Nd是不相似性数（差分）。

用于计算S_SM的是生理方面的特性，而不是培养或形态方面的特性。特征的总数为44。

相似系数如下：

培养菌 S_SM

A42125 100

产气群诺卡氏菌 88

东方诺卡氏菌 70

巴西诺卡氏菌 65

因为巴西诺卡氏菌与A42125在培养上几乎没有相似之处，而且S_SM值很低，所以不予考虑。

东方诺卡氏菌与A42125在培养特征上具有相似性，尤其是在ISP第3号和第4号的培养基上更加相似。但是，由于他们的生理特征不相似，表现出低的S_SM值，所以也不考虑。

产气群诺卡氏菌不具有需氧菌丝体，因此与A42125在培养上的比较只能在生长、背面颜色和可溶色素的基础上比较。在最初描述产气群诺卡氏菌时[E.B.Shirling，and &.D.Gottlieb，“综合描述链霉菌111的类型培养”，Int.J.Syst Bacteriol 18卷，4期，279-392页，1968年]，报导了该种菌在ISP5号培养基上具有白色需氧菌丝体。该报告与目前的同期比较研究的观察一致（见表Ⅰ，ISP5号）。A42125与产气群诺卡氏菌在生长和背面颜色相适应是可以为人们接受的，这种相适应在Czapek溶液琼脂和葡萄糖一天冬酰胺琼脂的培养基上更为明显。

除了需氧菌丝体外的其他特性而言，Gordon，（上文）把A42125菌株分类为产气群诺卡氏菌。然而A42125与产气群诺卡氏菌在生理和化学分类上的相似性，远远超过了不存在需氧菌丝体这个差别。对于辨别东方诺卡氏菌与产气群卡氏菌，Gordon提出了三个主要特性，这些特性与A42125的那些特性的比较列于表Ⅳ。

表Ⅳ A42125、东方诺卡氏菌和

产气群诺卡氏菌辨别特性的比较

特性东方产气 A42125

诺卡氏菌诺卡氏菌

赤藓醇 + - -

α-甲基葡糖苷 + - +

对溶菌酶有抗药性 - + +

a：+＝菌株具有该种特性

-＝菌株不具有该种特性

检查这些指示特性，说明A42125非常接近于产气群诺卡氏菌。

A42125与产气群诺卡氏菌的区别仅仅在于以一种碳水化合物作为可利用的碳源（通过生长和产生酸来测定）。

采用上文的Mishra所设计的初步鉴别产气群诺卡氏菌种的方法，培养物A42125可直接为鉴别产气群诺卡氏菌提供线索。这些比较说明了A42125对产气群诺卡氏菌虽然在培养上相似性有限，但生理上的相似性却很多，而最显著的差别却在A42125具有需氧菌丝体。由于已知产气群诺卡氏菌会产生需氧菌丝体，这个差别就不能被认为足以把A42125排除在这一类诺卡氏菌以外。因此，1970年Pridham和Lyons把培养菌A42125分类为产气群诺卡氏菌属（Shinobu和Kawato）的一个菌株。因为产气群诺卡氏菌并未被列在上文所审定的细菌名录中，所以没有充分的根据认为它是一个已发表过的菌种。

与另一个菌种一样，产生A42125的培养菌，即产气群诺卡氏菌NRRL18049的特征也是一种变异。菌株的重组体、突变体或变种可以用已知的方法得到。例如，突变体可以通过用各种已知物理的和化学的诱变剂，如紫外光、X射线、y射线，以及化学药剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理获得。保留了A42125产生的特征的所有产气群诺卡氏菌的天然的和诱发的变种、突变体和重组体都是本发明的一部分。

用于产气群诺卡氏菌NRRL 18049生长的培养基可以是任一类的培养基。但是，为了在生产上能经济实惠，获得最佳得率和易于分离产物，选用一定的培养基较为理想。例如，大规模用于产气群诺卡氏菌发酵的碳水化合物源，虽然也可以使用其他糖或糖聚合体等，但理想的是葡萄糖和糊精。

用于培养产气群诺卡氏菌的氮源，虽然也可以用其他氮源，如可溶蒸馏物、酵母浸提液、牛肉浸提液等，但理想的是大豆粗粉和谷物浸提液。

在加到培养基中的营养无机盐中较为有利的是能够产生锌、钠、镁、钙、铵、氯、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐等离子的普通可溶盐。

细菌生长发育所必需的基本微量元素也应包含在培养基内。这类微微量元素通常在培养基的其他取代物中作为杂质形式存在，其量足以满足细菌生长的需要。起泡通常不是什么问题，但是如果需要，在大量发酵培养基中也可加入少量（即0.2毫升/升）的抗泡剂，如聚丙二醇。

在发酵罐内进行深层有氧发酵对于大量生产抗菌素A42125最为理想，小量生产A42125可用摇瓶培养。因为抗菌素生产的时间迟延，一般都与装有细菌孢子的大发酵罐进行接种相结合。最好采用营养接种物。其制备的方法是通过将细菌菌丝体片段或孢子形式接种到小体积培养基上，以获得新鲜的、有生长活性的细菌培养物，然后将营养接种物移到大发酵罐。营养接种物的培养基可以采用与大量发酵用的相同培养基，但也可采用其他合适的培养基。

用产气群诺卡氏菌生产A42125，其生长温度范围约为25°-37℃，生产A42125的较佳温度似乎在30℃左右。

与常规的深层有氧培养方法一样，无菌空气由底部送入罐内，而培养基则用通常的叶轮机叶搅动。在迄今所用的条件下，发酵最大的氧气摄入量不能超过0.2毫克分子/升/分钟左右。在装有足够档板的165升发酵罐内大约含有115升肉汤，搅拌速度为200-250rpm，通气速率为0.125V/V/m，足以保持在饱和空气中溶解氧达到30%或高于30%的水平。

抗菌素A42125的生产，在发酵过程中可以通过测试肉汤样品抗已知对于此种抗菌素敏感的细菌的抗菌活性，可用于测试是否含有A42125的一种测定用的细菌是藤黄细球菌。生物测定通常可用琼脂-槽平板测试法。

按照在深层有氧发酵条件下A42125的生产，可以通过发酵工艺中所用的方法，从发酵培养基中回收A42125。在产生A42125细菌的发酵过程中所产生的抗菌活性主要是在肉汤中，因此要获得A42125的最大回收率需要先过滤培养基，把肉汤与菌丝体分离，然后纯化过滤过的肉汤，分离出A42125。在纯化工作中，各种技术都可使用。

将A42125与过滤过的肉汤进行分离的较佳技术包括：将肉汤的pH调至7左右，加适宜的吸附剂，如Diaion HP-20树脂。树脂用适当溶剂如乙腈∶水（1∶1），通过过滤和萃取进行分离。然后真空蒸发萃取溶剂，可以得到A42125。

用这种方法得到的A42125可用公认的方法进一步纯化，较佳的方法包括离子交换色谱法。

然后可用薄层色谱法分离抗菌素A42125，一种常用的硅胶薄层色谱溶剂系统是乙腈∶甲醇∶水∶氢氧化铵（4∶2∶2∶1）。在该系统中，A42125的Rf值约为0.43。抗菌素可用藤黄细球菌的生物自显影方法或其他方法，如香草醛-硫酸喷湿剂，进行检测。

换言之，固体的培养物，包括培养基成份和菌丝体，无需萃取或分离，但最好是去水后，可以作为A42125源。例如，产生A42125后，整个发酵肉汤可用低压冷冻干燥法，转鼓式干燥或共沸蒸馏和干燥等方法进行干燥，然后将干燥的肉汤直接混入饲料的预混合料中。

A42125抑制使动植物体致病的细菌生长。表Ⅴ概括了用常规琼脂稀释法测定出的A42125抑制各种细菌的最小抑制浓度（MIC′S）。

表Ⅴ：A42125的抗菌活性

试验细菌最小抑制浓度（微克/毫升）

金黄色酿脓葡萄球菌V1.1 1

金黄色酿脓葡萄球菌V41 1

金黄色酿脓葡萄球菌X400 1

金黄色酿脓葡萄球菌S13E 1

表皮葡萄球菌EPi 1 1

表皮葡萄球菌222 0.5

酿脓葡萄球菌C203 2

葡萄球菌属sp.group D X66 1

葡萄球菌属sp.group D 2041 4

流感嗜血杆菌76 8

A42125抗菌活性的一个重要方面就是它的抗厌氧菌活性，按标准琼脂稀释测定法测定，A42125抑制各种厌氧菌的最低抑制浓度列于表Ⅵ。最后几点是经24小时保温培养后的读数。

表Ⅵ厌氧菌分离物对A42125的敏感性

厌氧菌最低抑制浓度（微克/毫升）

Clostridium difficile 2994 4

产气荚膜梭状芽胞杆菌 81 4

败血状芽胞杆菌 1128 4

Eubacterium aerofaciens 1235 4

Peptococcus asaccharolyticus 1302 64

Peptococcus prevoti 1281 4

Peptostreptococcus anaerobius 1428 8

Peptostreptococcus intermedius 1624 4

痤疮丙酸菌 79 8

（Propionibacterium acnes）

脆弱拟杆菌 111 ＞128

脆弱拟杆菌 1877 ＞128

脆弱拟杆菌 1936B ＞128

Bacteroides thetaiotaomicron 1438 128

黑色素拟杆菌 1856/28 64

黑色素拟杆菌 2736 128

Bacteroides vulgatis 1211 128

Bacteroides corrodens 1874 ＞128

Fusobacterium symbiosum 1470 ＞128

Fusobacterium necrophorum 6054A ＞0.5

A42125抗菌活性的另一个重要方面是抑制产生甲烷的细菌，例如在试验浓度低至0.1微克/毫升，A42125抑制Methanococcus vannielli，在该试验中将一个A42125结晶置于24小时菌苔上（最小培养基），3天时测量抑制情况。

A42125的另一个重要性质是能够提高动物对饲料的利用率，例如A42125能够提高瘤胃功能发达的反动物对饲料的利用率。

饲料的利用率可以通过观察瘤胃中各种丙酸盐化合物的产生和浓度进行监测。胃液是从一头通过外科手术将胃管插在瘤胃中的公牛取得的，该头公牛一直保持饲以高谷物饲料，其成份如下：

69.95% 粗谷物碎

10% 玉米芯碎

8% 大豆粗粉（50%蛋白质）

5% 紫花首蓿粗粉

5% 糖蜜

0.6% 尿素

0.5% 磷酸二钙

0.5% 碳酸钙

0.3% 盐

0.07% 维生素A和D预混合料

0.05% 维生表E预混合料

0.03% 痕量无机物预混合料

瘤胃胃液样品用4层干骆包布过滤，将滤液收集在真空瓶中。保留在干骆包布上的颗粒物质再悬浮在足够的生理缓冲液中，使其恢复到瘤胃胃液的原来体积，再用干骆包布过滤悬浮液。所用缓冲液配方如下：

0.316克/升 Na₂HPO₄

0.152克/升 KH₂PO₄

2.260克/升 NaHCO₃

0.375克/升 KCl

0.375克/升 NaCl

0.112克/升 MgSO₄

0.038克/升 CaCl₂

0.008克/升 FeSO₄·7H₂O

0.004克/升 MnSO₄

0.004克/升 ZnSO₄·7H₂O

0.002克/升 CuSO₄·5H₂O

0.001克/升 CoCl₂

Cheng等，（J.Dairy Sci.）38卷，1225页，1955年。

将2份滤液汇集在一个分液漏斗内，静置直到颗粒物质上升到顶层，然后将清液层分离开用相同的缓冲液稀释为1∶1，将pH调至7.0。

取10毫升稀释瘤胃胃液置于装有上述相同饲料40毫克的25毫升烧瓶中，每个烧瓶加入5毫克的大豆蛋白，再将待处理的化合物称入每个烧瓶。每个处理用4个相同样品的烧瓶，并应用每4个对照烧瓶为2组。用一个零点时间对照，并应用一个保温16小时对照;所有试验烧瓶都在38℃保温16小时。保温结束时，测量pH值，并对每个烧瓶加入2毫升25%的偏磷酸，使样品沉淀。用挥发性脂肪酸的气相色谱法分析上清液。

分析乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的化合物，将分析结果与对照烧瓶的分析结果进行统计比较。明显高于对照的产生丙酸盐的处理则可认为是有效的处理。表Ⅶ给出了在这些试验中A42125处理过的烧瓶中的挥发性脂肪酸（VFA）浓度与在对照烧瓶中浓度的比。

表Ⅶ A42125 对反动物的饲料利用效率的影响＊

摩尔% 摩尔% 摩尔% 总VFA/对

用量丙酸盐乙酸盐丁酸盐照VFA

（微克/毫升）（毫摩尔/升）

20 1.283 0.914 0.608 0.921

5 1.237 0.877 1.019 0.988

5 0.959 0.992 1.075 0.921

1 1.122 1.015 0.795 1.237

5 1.118 0.915 0.867 1.041

1 1.105 0.881 1.111 0.997

5 1.778 0.896 0.654 0.921

1 1.458 0.915 0.823 0.858

＊5个试验

甲烷抑制也使反动物更有效地利用饲料，它是通过将乙酸盐转变为可利用的能量，而不是转变为被排出的甲烷。这种活性可以通过用模拟瘤胃作用的试管内的试验来测量。这个试验可以在模拟瘤胃长时间作用方式的连续发酵烧瓶内进行。每个烧瓶都是一个气体密封容器，它具有液体入口、固体入口、采样口和与收取发酵产生的气体的橡胶球相接的排气管。每个烧瓶的液体体积通过与液体收集罐相连的立管控制在500毫升。烧瓶的温度控制在38°～40℃。每个烧瓶都用磁铁搅拌机徐徐搅拌。

每个试验一开始就将500毫升由经胃管插入手术的公牛中取得的过滤过的瘤胃胃液加到烧瓶中，该公牛在取胃液之前已喂过与本试验所用的相同饲料。排液收集瓶预先加入50毫升稀偏磷酸，以阻止发酵液体从烧瓶中溢出。然后密封烧瓶，并将各气体收集球相互连接。

向每个烧瓶每天连续滴加1升pH6.8～7.0缓冲溶液，其组分如下：

磷酸氢二钠 2.2克/升

氯化镁 0.036克/升

碳酸氢钠 5.9克/升

氯化钾 0.34克/升

氯化钠 0.28克/升

尿素 1.0克/升

氯化钙 0.024克/升

每天2次将合适的饲料10克经饲料孔加入各个烧瓶中，每次加入饲料后，关闭排气口，并用二氧化碳冲洗烧瓶。

每天都收集和分析流出液，收集和分析烧瓶中排出的气体。

在没有任何处理化合物加入饲料的的情况下，通常的做法是每个烧瓶都进行4天。在4天的平衡时间后，开始分析流出液和排出的气体，而烧瓶中发酵试验在不加入任何处理化合物的情况下一直进行到分析数据相对恒定，在此时开始加入经处理过的饲料在加入处理过的饲料的情况下，烧瓶试验的操作至少要持续7天。

加入饲料中的化合物的适宜总量列于表Ⅷ，它给出了在500毫升液体容积的烧瓶中的化合物的浓度。在大多数试验中，每个化合物的每个处理都用2个烧瓶，然后将每天处理2个烧瓶的整个处理期间的所有数据汇集平均。表Ⅷ综合了A42125抑制甲烷的活性。

表Ⅷ A42125对反动物产生甲烷的影响＊

用量（微克/毫升）甲烷（毫摩尔/日）

- 23.0

5 2.3

- 4.1

5 1.8

1 2.3

- 7.2

5 0.3

1 0.8

＊3个试验

给小鼠投用单剂量A42125后，测定LD₅₀为：

LD₅₀（腹膜内投药）＝＜9.375毫克/公斤

LD₅₀（口服）＝89毫克/公斤

当反动物口服A42125时，其典型的作用是增加丙酸盐的产生。从而提高了饲料的利用效率，反动物的口服量约为0.05～6.75毫克/公斤/日，较佳口服量约为0.2～3.5毫克/公斤/日。

理想的投药方法是将化合物与动物饲料混合，但是也可以用其他方式投药，例如片剂、兽用顿服剂、大丸剂或胶囊剂。这些不同的剂量形式的配方可用已知的兽用药物的配制技术配制。各个剂量单位应含有直接与被处理的动物的适宜的日剂量有类的一定量的本发明的化合物。

本发明还涉及适合于增进饲料利用率的饲料组合物，包括定量的饲料及每吨含6～60克A42125化合物。

动物对A42125可以口服，也可以用肠胃道外给药。A42125给药的最常用方法是按照处方加到饲料中。各种饲料，包括普通的干饲料、液体饲料和小丸饲料，都可使用。虽然较好的给药方法是将其与动物饲料混合，但也可以用其他方法给药，例如用片剂、兽用顿服剂、大丸剂或胶囊剂。各个剂量单位应含有直接与被处理的动物的适宜日剂量有关的一定量的A42125。

将药物配制在动物饲料中的方法已为人们所熟知，较好的方法是制成浓缩的药物预混物，它又可用于制备药用饲料。典型的预混物可以是每磅预混合物约含有1～200克药物，预混物可以是液体制剂，也可以是固体制剂。

动物饲料的最终配方将决定于用药量。配制饲料、混制饲料和制成小丸饲料等一般方法都可用来制备含有A42125的饲料。

A42125可以按照兽用药物制药技术领域所公认的方法配制成可供肠胃道外投药应用。含有A42125有效的注射用的组合物可以是悬浮液，也可以是溶液。配制成溶液形式时，可将A42125溶于生理上可以接受的载体。这种载体包括一种合适的溶剂、防腐剂为苄醇，如果需要，还可含有缓冲剂。可用的溶剂，可以包括例如水、醇类、二元醇类或惰性油如植物油或高精制的矿物油。

制备注射用的悬浮液组合物可以应用该化合物及佐药的一种非溶剂作为载体，举例来说，非溶剂可以是水或一种二元醇，为聚乙二醇。

生理上可以接受的适合用的佐药必须使该化合物保持悬浮在悬浮液组合物中。佐药可从增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐中选出。许多表面活性剂也可用于使该化合物悬浮，卵磷脂、烷基酚-聚环氧乙烷加合物、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，都可用作液体非溶剂中的悬浮剂。

在各种个别情况下，影响液体非溶剂的亲水性、密度和表面张力的许多物质都有助于配制注射用的悬浮液。例如聚硅氧烷抗泡剂、二元醇、山梨糖醇和糖类，都可用作悬浮剂。

为了更充分地说明本发明的作用，提供如下实施例。

实施例一：抗菌素A42125的制备

A.摇瓶发酵

将培养菌产气群诺卡氏菌NRRL 18049（既可以是冰冻干燥的丸状物，也可以是保存在液氮中的悬浮液）接种在具有下列成份的斜面培养基上：

斜面培养基

成份含量（克/升）

土豆糊精 10

酵母提取液 1

酶水解骆蛋白＊ 2

牛肉提取液 1

CoCl₂·6H₂O 0.01

琼脂 20

去离子水加至 1升

＊N-Z胺A.Humko Sheffield Chemical Co.，Lyndhurst NJ

用NaOH将pH值调至～6.2～7.0。

接种斜面在30℃下保温大约7天以上，然后用无菌器具刮削成熟的斜面培养菌，以便将孢子松开，除去并浸软菌丝体丛。将所得疏松孢子和培养生长物的1/4左右接种到具有下列成份的50毫升营养培养基上。

营养培养基

成份含量（克/升）

葡萄糖 15

木薯淀粉糊精＊ 20

大豆粗粉 15

谷物浸渍液 10

酵母提取液 1

CaCO₃2

自来水加至1 升

＊Stadex 11，A.E.Staley Co.，Decatur IL

用NaOH将pH值调至～5.5～6.5。

接种过的营养培养基放在250毫升锥形烧瓶中，在环绕2英寸（5.08厘米）圆周以250rpm转速作圆周运动的摇床上，在30℃下保温培养约72小时。

将这个保温培养的营养培养基（1.25毫升）接种到具有下列成份的50毫升生产培养基上。

成份含量（克/升）

葡萄糖 25

谷物淀粉 10

可溶肉蛋白胨＊ 10

酶水解酪蛋白＊＊ 4

废糖蜜 5

MgSO₄·7H₂O 0.5

CaCO₃2.0

查贝克氏无机原液＊＊＊ 2毫升

去离子水加至 1升

＊O.M.蛋白胨，Amber Laboratories，Juneau WI

＊＊N-Z胺A

＊＊＊查贝克氏无机原液的组分：100克KCl;100克MgSO₄·7H₂O;2克FeSO₄·7H₂O;加去离子水至1升。

接种过的生产培养基放入250毫升广口锥形烧瓶，该烧瓶置于环绕2英寸圆周以250rpm转速作圆周运动的摇床上，在30℃下保温培养3～5天。

B.发酵罐发酵

为了提供大体积接种，如A节所述的制备方法，将10毫升保温培养的营养培养基接种到具有与营养培养基的成份相同的第2阶段生长培养基250毫升上。该第二阶段培养基置于2升广口锥形烧瓶中，烧瓶在环绕2英寸圆周的250rpm转速作圆周运动的摇床上，在30℃下保温培养约70小时。

将制备好的第2阶段培养基（400毫升）接种到100升在用A节所介绍的方法制备的无菌生产培养基上。使接种过的生产培养基在165升搅拌发酵罐内，在30℃下发酵3～5天。在搅拌发酵罐内低空气流量（0.12～0.25v/v/m）和中等转速（200～250rpm）保持饱和空气中约30%的溶解氧水平。

实施例二 A42125的分离

含有3%硅藻土的完全发酵肉汤（92升）经压滤器过滤，用NaOH将肉汤滤液（74升）的pH值调至7，加Diaion HP-20树脂（9.4升），混合物经搅拌45分钟后过滤，除去滤液，用水洗涤树脂3次（每次用10升）并用乙腈∶水（3∶17，每次用10升）再悬浮、搅拌和过滤3次，弃去洗液。A42125经将树脂悬浮在乙腈∶水（1∶1，10升）中进行洗脱，同时进行搅拌和过滤。连续进行洗脱四次，对每次洗脱后得到的每份洗脱液用藤黄细球菌圆盘平板测定法进行测定。将前两份洗脱液混合在一起，经真空浓缩，除去乙腈，冰冻干燥后得到A42125粗制品94.9克，第三份洗脱液得到A42125粗制品20.8克。

实施例三 A42125的纯化和结晶

将实施例二得到的A42125粗制品混合（115.2克），溶于水（3升）。过滤溶液，除去沉淀。将滤液置于含有3升Dowex 50×2（NH⁺ ₄），100～200筛孔的树脂的色谱柱中，用5倍色谱柱容积的水和0.1N NH OH洗涤色谱柱。将经2N NH₄OH洗脱后含有最大量A42125的洗脱液混合，浓缩成大约3升体积。A42125经沉淀和过滤分离，沉淀物溶于甲醇（300毫升），然后将该溶液加到乙醚（6升）中，使A42125沉淀。该沉淀物经过滤干燥，得到16.6克A42125非晶形粉末。经进一步浓缩水溶液后得到第二次沉淀物，用同样方法处理，得到20.7克纯度较差的A42125。

将第一次得到的A42125（16.6克）溶于温水（800毫升），该溶液可在室温下静置过夜，结晶出A42125。晶体经过滤分离，真空干燥后，得到10.6克和2.3克（第二次产物）A42125晶体（熔点149～150℃）。

实施例四 A42125-增强的定量饲料

适宜于肥育牲口的平衡高谷物定量饲料按如下配方制备：

成份百分比吨/磅

谷物（黄色） 50.25 1005.0

玉米芯 34.927 698.54

脱水紫花苜蓿粗粉，17% 4.00 80.0

大豆油粗粉，（溶剂提取过的） 4.00 80.0

尿素（饲料级） 0.35 7.0

甘蔗糖浆 5.00 100.0

磷酸二钙 0.65 13.0

盐 0.35 7.0

碳酸钙 0.30 6.0

少量无机物预混物¹0.03 0.6

维生素A+D3预混物²0.07 1.4

维生素E预混物³0.07 1.4

A42125 0.003 0.06

100.00 2000.0

1.少量无机物预混物含有：2.5%锰（一氧化锰），0.07%碘（碘化钾），0.30%钴（碳酸钴），0.50%铜（氧化铜），20.00%锌（硫酸锌）

2.每磅维生素A和D3预混物含有2，000，000美国药典单位维生素A和225，750美国药典单位维生素D3

3.每磅维生素E预混物含有20，000国际单位维生素E

Claims

1、一种生产具有下列特征的抗菌素A42125或其盐的方法：

状态：白色结晶(由水中结晶)

熔点：149～150℃

紫外光：不吸收

红外光(Kbr)：见附图

滴定(80%二甲基甲酰胺水溶液)：pKa∶5.2，8.7和10.5

分子量：2032(场致解吸质谱分析)

实验式：C₁₀₁H₁₈₄N₂O₃₈

氨基酸：未找到

溶解度：溶于水包括培养产气群诺卡氏菌NRRL 18049或其产生A42125的变体、突变体或重组体，在含有可同化的碳、氮和无机盐源的培养基中，在深层有氧发酵条件下，直至产生抗菌素A42125，以及任选的盐化产品。

2、根据权利要求3的方法，包括从培养基中分离A42125的附加方法。

3、根据权利要求4的方法，其中所用的菌株是产气群诺卡氏菌NRRL 18049（N.aerocolonigenes NRRL 18049）。

4、一种微生物产气群诺卡氏菌NRRL 18049的生物纯培养菌或其产生A42125的变体、突变体或重组体。

5、一种发展甲烷微生物的遗传交换系统的方法，包括选择对权利要求1的抗菌素A42125具有抗性的突变体和将该突变体应用于遗传重组体试验中。