CN1065277C

CN1065277C - 阿凡曼菌素的制备方法

Info

Publication number: CN1065277C
Application number: CN88100373A
Authority: CN
Inventors: 埃蒙德·威廉·哈夫纳; 凯尔温·施科特·霍尔邓姆; 李士仁
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 2001-05-02
Anticipated expiration: 2003-01-22
Also published as: IL85119A; KR900007937B1; FI90087C; IE62467B1; NZ223270A; JPH0817694B2; PT86582B; JPS6419093A; YU47877B; CN88100373A; NO172447C; EP0284176A2; DK175724B1; YU99090A; YU10988A; PT86582A; AU7111391A; BG48572A3; NO880261D0; FI880279A0

Abstract

本发明涉及缺失分支氨基酸转氨酶活性和/或分支2氧代酸脱氢酶活性的阿凡曼链霉菌及其制备方法，以及产生用作杀虫剂的天然和非天然的阿凡曼菌素。

Description

阿凡曼菌素的制备方法

本发明涉及缺失分支氨基酸转氨酶活性和／或分支2氧代酸脱氢酶活性的阿凡曼链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株及产生该菌的方法和将该菌用于产生天然和非天然的阿凡曼菌素。

美国专利4310519和4429042介绍了阿凡曼菌素-一种有关具有抗寄生虫有效活性的多种药剂的复合物以及通过阿凡曼链霉菌菌株即S．avermitlis ATTC31267、31271和31272的有氧发酵产生阿凡曼菌素的方法。后两株菌株分别系由S．avermitilis ATCC31267经紫外线照射得到的冰冻试管培养菌和冰冻干燥试管培养菌。

1986年7月16日提交的美国专利申请886867副本并于1987年3月18日发表的欧洲专利EP214731公开了许多与天然的或已知的但在25位上具有新取代基的阿凡曼菌素有关的化合物(本文称为非天然阿凡曼菌素)或它们的衍生物或前体，以及在某些特定的羧酸存在下通过产生阿凡曼菌素的有机体的发酵制备这些化合物的方法。用于产生所述新的C-25取代的阿凡曼菌素的S．avermitilis菌株是S．avermitilis ATCC31267、31271、31272和NCIB12121。后者在欧洲专利214731中已作了介绍，它是由S．avermitilis ATCC31271衍生得到。当其培养于半固定培养基时，提高了新的C-25取代阿凡曼菌素的产量。通过改变已知或天然阿凡曼菌素的量，其中25取代基是异丙基或(S)仲丁基(1-甲苯基)，则ATCC31267、31271、31272和NCIB12121各菌株还都可以产生新的C-25取代衍生物。

阿凡曼菌素(见下式(I)所示)的碳架由乙酸酯、丙酸酯和从L异亮氨酸(R=(S)仲丁基)或L缬氨酸(R=异丙基)中得到的天然阿凡曼菌素的C-25取代基衍生获得的(Fisher和Mrozik，《大环内酯抗菌素》，学术出版社(1984年)，第14章)。

“已知”或“天然”阿凡曼菌素系指由25位取代基或是异丙基或是(S)仲丁基(1-甲丙基)的S．avermitilis ATCC31267、ATCC31271和ATCC31272产生的那些阿凡曼菌素。凡属25位取代基但不为异丙基或仲丁基(S型)的阿凡曼菌素，本文均作为新的或非天然的阿凡曼菌素。

在上述美国专利中的S．avermitilis菌株所产生的一类物质，本文中一般以C-076予以介绍。这些物质包括8种性质截然不同但均与所介绍的C-076密切相关的化合物，它们是A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a和B2b。“a”系化合物是指25位取代基为(S)仲丁基的天然阿凡曼菌素，“b”系化合物是指25位取代基为异丙基的天然阿凡曼菌素。符号“A”和“B”系指5位取代基分别为甲氧基或羟基的阿凡曼菌素。数字“1”系指22-23位为双键的阿凡曼菌素，数字“2”系指22位为氢和23位为羟基的阿凡曼菌素。

关于非天然阿凡曼菌素的25位取代基，本申请文件中并未使用这类符号。符号A1，A2，B1和B2用以表示与上述天然阿凡曼菌素具有相应结构特征的非天然阿凡曼菌素。

Willecke和Pardee(J．Biol．Chem．246，5264-72，1971)以及Mart in等(J．Bacteriology，115，198-204，l973)先后分别报导了枯草杆菌(Bacillus subtilis)和putida假单胞菌(Pseudomonas putida)产生缺失分支α酮酸脱氢酶活性的突变体，但是并未报导过链霉菌产生这类突变体。

Schulman等(J．Antibiot．38(11)，1494-1498，1985)报导了实际上仅仅产生阿凡曼菌素糖苷配基A1a和A2a的突变菌株-S．avermitilisAgly-1。还报导了在西尼霉素(sinefungin)存在下，S．avermitilisAgly-1的发酵可以增加阿凡曼菌素糖苷配基B组分的产生。同样，阿凡曼菌素的高产菌株S．avermitilis 08在作为O-甲基转移酶的抑制剂西尼霉素存在下进行发酵时，产生的阿凡曼菌素在C-5糖苷配基和齐墩果糖的二糖部分不含O-甲基。

美国专利4378353介绍了有关C-076的化合物以及通过培养MA-5218制备这类化合物的方法，MA-5218系由S．avermitilisATCC31272经紫外线照射得到的突变菌株，被鉴别为ATCC31780。由所述突变体产生的与C-076有关的化合物不含有C-076呋喃环。此外，在所报导的某些化合物中，有一部分或两部分的齐墩果糖被分裂，而在其他部分则5位上的基团氧化为酮基。

产生不含O-甲基的阿凡曼菌素的三种S．avermitilis O-甲基转移酶突变体已分别由Ruby等于1985年8月26～30日在匈牙利德布列森举行的“放线菌生物学”第六届国际学术讨论会上和Schulman等(Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31，744～7，1987)作过报导。第一种由于不能使大环内酯环的C-5羟基甲基化，所以主要产生β阿凡曼菌素。第二种产生被称为去甲阿凡曼菌素的3′-0，3″-0-双去甲阿凡曼菌素(在两个齐墩果糖单糖残基的3位上不含O-甲基取代基的阿凡曼菌素)。第三种则系在任何位置上都不能甲基化的突变体。

Schulman等(Fed．Proc．44，931，1985)公开了在诸如西尼霉素、S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷高半胱氨酸一类物质的存在下，通过S．avermitilis的发酵，以增加阿凡曼菌素的产生，所述西尼霉素等一类物质是通过阿凡曼菌素B-O-甲基转移酶抑制糖苷配基部分C-5羟基的甲基化。不含O-甲基转移酶活性并产生高产量阿凡曼菌素B组分的阿凡曼链霉菌也已由Schulman等(在Antimicrobial Agents andChemotherapy 29，620～624，1986中)予以公开，可供参考。

阿凡曼链霉菌的诱变产生缺失分支2氧代酸脱氢酶活性或缺失分支氨基酸转氨酶活性的突变体。由此产生单区段突变体的诱变产生的突变体，既缺失分支2氧代酸脱氢酶活性，也缺失分支氨基酸转氨酶活性。在发酵过程中不另加R为异丙基或(S)仲丁基的化合物RCOOH或可转化为RCOOH的化合物的情况下，突变体不再具有产生大量天然阿凡曼菌素的能力。但是，令人惊奇并且出乎意料地发现，在加有R为异丙基或(S)-仲丁基或本文所公开的基他基团的化合物或所述RCOOH的前体情况下进行发酵时，突变体能够产生天然的和非天然的阿凡曼菌素。更为令人惊奇的是，本文所述仅仅缺失分支2氧代酸脱氢酶活性并且不能降解L-异亮氨酸或L-缬氨酸的突变体，能够使阿凡曼菌素生物合成途径中的各种化合物相似于产生不含天然阿凡曼菌素的非天然阿凡曼菌素。

至少还令人惊奇地发现，本文所述的分支氨基酸转氨酶不完全突变体，不能降解L-异亮氨酸、L-亮氨酸或L-缬氨酸，而为了生长则需要这三种氨基酸，这类突变体也能使其他化合物类似于产生不含天然阿凡曼菌素的非天然阿凡曼菌素。

必须指出：产生的天然阿凡曼菌素是8种截然不同但与R为异丙基和(S)-仲丁基的式(I)化合物密切相关的复合混合物。而要将它们回收成基本纯的形式时(参阅美国专利U．S．4429042)，只不过是方法繁复而已。根据欧洲专利EP214731所述方法，由于用于生产非天然的阿凡曼菌素的微生物阿凡曼链霉菌的细胞中存在分支2氧代酸脱氢酶和L-缬氨酸和L-异亮氨酸两种氨基酸，所以非天然阿凡曼菌素也可以产生若干不同量的天然阿凡曼菌素。

选择或者产生天然阿凡曼菌素或非天然阿凡曼菌素，使所得产物的数量和复杂性减至最低程度，从而提高所选择的阿凡曼菌素的纯度并借以简化分离程序，这种方法则符合所需目的。

通过对产生阿凡曼菌素的阿凡曼链霉菌的突变，优其对阿凡曼链霉菌S．avermitilis ATCC31267，ATCC31271，ATCC31272或NCIB12121的突变，可以产生缺失分支2氧代酸脱氢酶活性或分支氨基酸转氨酶活性的阿凡曼链霉菌菌株。将所述不完全菌株之一进一步突变，就能产生不含两种活性的菌株。除了将脂肪酸或其含有异丙基或仲丁基(S型)的前体加入发酵突变体的培养基之外，突变体不能合成天然阿凡曼菌素。在发酵过程中，在有氧的含水条件和含有适宜的伯酸或能转化为伯酸的化合物的营养培养中进行发酵时，突变体就能产生天然的和非天然的阿凡曼菌素。

以缺失分支2氧代酸脱氢酶活性为特征的那些突变体是根据¹⁴CO₂测定法由突变菌落中分离得到的。在该方法中，通透菌落没有从底物(¹⁴C-1)-2-氧异己酸或(¹⁴C-1)-2-氧-3-甲基戊酸或(¹⁴C-1)-2氧-3-甲基丁酸中释放出¹⁴CO₂，则表明不存在分支2-氧代酸脱氢酶活性。

以不含氨基酸转氨酶活性为特征的那些突变体，选自在不含L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的培养基上不能生长的突变菌落。事实上，是将在以M9盐萄萄糖为基础的补充以在酪蛋白水解物中得到的所有氨基酸的琼脂培养基上生长的各个菌落都可转移到不含L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的类似培养基上。本文所述突变体，仅仅不含分支氨基酸转移酶活性，均能采用2-氧代酸作为产生阿凡曼菌素的前体。

令人惊奇并且出乎意料的是本文所述缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性和／或分支氨基酸转氨酶活性的突变体，仍然能够产生阿凡曼菌素，尤其是非天然阿凡曼菌素。如果膜的完整性决定于天然脂酰辅酶A衍生物，或如果由先前的突变体积累了2-氧代酸而导致细胞毒性，则当培养在常规培养基上时不能产生该衍生物的突变体即为致死突变。此外，对这两种突变体都不要期望能够从L-异亮氨酸和L-缬氨酸降解代谢中合成乙酰辅酶A和丙酰辅酶A，因为这需要酶的活性，而这两种突变体均已失去酶的活性。上述为阿凡曼菌素生物合成对这些酰基辅酶A衍生物的需要，可望导致在非天然阿凡曼菌素生产中会严重损害突变体，令人惊奇地是事实并非如此。

本文所述突变体中缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性、结果抑制了L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的降解中合成分支脂酰辅酶A，从而抑制了天然阿凡曼菌素的合成。与此相似的还有阿凡曼菌素的分支氨基酸转氨酶负突变体也具有这种缺失分支脂酰辅酶A合成的特征，因此也不能产生天然阿凡曼菌素。这种缺失脂酰辅酶A是由两种原因造成的。第一，这种转氨酶负突变体不能通过正常的转氨途径由培养基供给的异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸合成分支2-氧代酸。第二，在这些转氨酶突变体中，由细胞分支氨基酸生物合成途径产生分支2-氧代酸被发酵培养中需含有这些氨基酸时抑制。这些氨基酸的存在由于众所周知的酶阻遏和由于合成途径的这些氨基酸末端产物产生的反馈抑制的机制，抑制了该生物含成途径的进行(和中间体2-氧代酸的产生)。得不到作为活性分支2-氧代酸脱氢酶的作用物的这些2-氧代酸有效地抑制了分支脂酰辅酶A的合成。因此，本发明包括这种2-氧代酸)脱氢酶负突变体和转氨酶负突变体的应用和分支转氨酶负突变和2-氧代酸脱氢酶负突变二者相结合的突变体的应用。

本发明还包任何有机体，不管其形态或生理表现如何，凡是用核酸或本文所述各种等同物，通过转化、转导、遗传重组或其他遗传方法，可以生长从而获得本文所述突变体特征的有机体均包括在内。

本文所用“阿凡曼菌素”(“avermectin”或avermectins”)一词系指含有下列式(I)的化合物，但其中25位取代基(R)是在该位置上可被本发明的阿凡曼链霉菌同化的任何基团。

本文所述突变体颇适用于通过本文所公开的例举的方法生产非天然阿凡曼菌素，尤其适用于生产最佳阿凡曼菌素即其C-25取代基为任意由C₁-C₄烷基取代的C₄-C₆环烷基或环链烯基、1-甲硫乙基、或5或6元氧或硫杂环基团、尤其是3-噻吩基或3-呋喃基的化合物。

诱变产生阿凡曼菌素的阿凡曼链霉菌可根据已知方法采用各种诱变手段中的任何一种手段，包括紫外辐射、X射线辐射、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸和氮芥类，如N-甲基双(2-氯乙基)胺，或进行类似的处理。诱变也可以通过对能够产生天然阿凡曼菌素的阿凡曼链霉菌的孢子或营养培养进行，例如采用S．avermitilisATCC31272。

下述方法对本领域的专业人员而言是众所周知的。根据生化测定方法，筛选大量由(¹⁴C-1)-2-氧代酸产生¹⁴CO₂的随机诱变菌落，选出缺失分支2-氧代酸脱氢酶的诱变菌落(Jabor et al．，J．Bact．128，485～486，1976)。

所用方法包括：将诱变菌落培养在微量滴定板井中适宜的培养基上，用甲苯渗透细胞，然后将(¹⁴C-1)-2-氧代酸(如2-氧代异己酸)加至每个井中，检查发酵液上面¹⁴CO₂气体。另外，也可用(¹⁴C-1)-2-氧-3-甲基戊酸或(¹⁴C-1)-2-氧-3-甲基丁酸代替(¹⁴C-1)-2-氧-异己酸。按常规方法，将Ba(OH)₂湿饱和滤纸置于每个井上，以吸收释放的¹⁴CO₂和检测Ba¹⁴CO₃，如有需要，也可采用放射自显影方法，检查产生的¹⁴CO₂。缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性的突变体给出的放射自显影照片接近于空白对照，即没有由突变体产生的Ba¹⁴CO₃。

由此得到的突变体再用上述任何诱变方法进一步进行诱变，根据培养在加有L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸(ILV)的M9／葡萄糖小培养板上缺少情况，挑选缺少分支氨基酸转移酶活性的突变菌落。为了进行培养，三种氨基酸缺一不可。此外，还证明所述转氨酶负突变体都不能在附加有用作转氨酶反应低物的三种酮酸的培养基上生长。因此，一个单一转氨酶催化该3个酮酸(2-氧-甲基戊酸、2-氧-异己酸、2-氧-异戊酸的转氨作用。

缺少分支2-氧代酸脱氢酶和分支氨基酸转氨酶的双区段突变体的活性，由于其回复产生天然阿凡曼菌素的培养菌的概率极低，特别令人感兴趣。在一定条件下，单区段突变体是可以回复到产生天然阿凡曼菌素培养菌的。

除了通过诱变产生给出的微生物菌株所需等位基因外，原生质融合也可以将在一个菌株中产生／相当的所需等位基因引入另一个菌株的染色体中。例如，缺少分支2-氧代酸脱氢酶活性和分支氨基酸转氨酶活性的阿凡曼链霉菌菌株能够通过与具有上述活性的阿凡曼链霉菌菌株的原生质体的融合，产生仅仅缺少分支氨基酸转氨酶活性的阿凡曼链霉菌的菌株。基于本领域的专业人员认为，原生质体融合技术能够将所需的选自的同源株系的等位基因与单个菌株结合，本文所述的缺失分支氨基酸转氨酶菌株阿凡曼链霉菌JC-923(S．avermitilis JC-923，ATCC53669，CCTCC No．M87118)是通过这种技术得到的。

本发明突变体的形态和培养特征一般说来与美国专利4429042中所述相同。本发明突变体的特殊特征在于其缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性和／或缺失分支氨基酸转氨酶活性。这些特征是按本文所述方法测定的。当突变体培养在基本上不含脂肪酸RCOOH(其中R为异丙基或(S)仲丁基)或发酵时可转化为该RCOOH的化合物的特定培养基上时，所述活性的缺少导致产生天然阿凡曼菌素的突变体的缺失。由美国典型菌种保藏委员会(ATCC)所进行的分类学研究，确认通过上述14CO2分析法选出的两种突变菌株I-3(S．avermitilis1-3，ATCC53567，CCTCC No．M87116)和HL-026(S．avermitilisHL-026，ATCC53568，CCTCC No．M87117)的特征与美国专利4429042所述亲本菌株ATCC31272的特征有着密切的关系，但具有某些例外。因此，突变体菌株I-3形成的孢子链显著少于ATCC31272，而突变体菌株HL-026(ATCC53568)实际上没有需氧菌丝体和孢子，但是具有非常少量的孢子，它与ATCC31272的孢子链的特征相似。突变体HL-026在利用棉子糖作为唯一碳源的能力难以确定，而ATCC31272菌株和突变体I-3菌株却能利用棉子糖(在申请人的实验中，棉子糖无助于这些菌株的生长)。突变体菌株HL-026的另一个特征在于其所产生的黑色素少于另两个菌株并且在酪氨酸琼脂上丝毫不存。最后，与美国专利4429042中所描述的ATCC31272相反，我们未能检测到突变体或ATCC31272的蔗糖作为唯一碳源得以生长的情况。突变体I-3和HL-026均仅缺少分支2-氧代酸脱氢酶活性。通过将突变体I-3(ATCC53567)和JC-923(ATCC53669)的原生质体融合得到的并经进一步诱变产生的双缺少突变体PGS-119(S．avermitilis PGS-119，ATCC53670，CCTCC No．M87119)，其分类学关系与突变体菌株I-3一样都相似于ATCC31272。

阿凡曼链霉菌I-3、HL-026、PGS-119和JC-923均按照布达佩斯条约保藏在美国典型菌种保藏委员会(马里兰州洛克维尔)，这是一个能够永久保藏菌种的公认保藏机构，如本申请的专利得到批准，则这些菌种随时可为公众所得到。其登记号分别为阿凡曼链霉菌ATCC53567、ATCC53568、ATCC53670和ATCC53669。它们也已在设在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏日是1987年12月25日，保藏编号依次为CCTCC No．M87116、CCTCCNo．M89117、CCTCC No．M87119和CCTCC No．M87118。在本申请未决时，ATCC保藏菌种由美国专利和商标局专人决定提供使用，其编号为37CFR1．14和35USC 122，并且按照一些国家的外国专利法的规定，提交本申请的有关部分或其原本。对公众利用所保藏微生物的所有限制由于专利的批准最终将会被消除。

阿凡曼链霉菌ATCC31267、ATCC31271、ATCC31272和NCIB12121中，每种都能产生天然阿凡曼菌素即式(I)化合物

式中，22-23位上的虚线代表任意的双键；

R₁仅在没有双键时才存在并且代表羟基；

R₂为下式的4′-(α-L-齐墩果糖酰基)-α-L-齐墩果糖酰氧基

R₃为氢或甲基；

R是异丙基或(S)-仲丁基。美国专利4285963介绍了式(I)的阿凡曼菌素，其中25位由甲基和乙基取代；R¹是羟基，R³是甲基。

在本文所涉及的非天然阿凡曼菌素中，R系除了异丙基或(S)-仲丁基以外的取代基，其定义如下所述。

基本上用于式(I)化合物生物合成的化合物是在阿凡曼链霉菌细胞中进行的。L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸这些化合物被认为是通过转化为2-氧代酸和通过分支2-氧代酸脱氢酶将酸进行脱羧、伴随将产物与辅酶A偶合进入阿凡曼菌素生物合成的。它们的存在是引起式(I)异丙基和(S)仲丁基两种化合物并发产生的原因。当然，由此带来的问题是从S-仲丁基衍生物中分离出异丙基。

当在含有适宜的原始化合物的营养培养基中发酵时，本发明的突变体产生式(I)的化合物，或如较为常见的情况，产生两种或多种式(I)化合物的混合物，其中R相当于所用的原始化合物。可以产生多至4种产物，按美国专利4429042中的用名，通常俗称为R-阿凡曼菌素A1、A2、B₁和B₂。当然，基团“R-”系C-25取代基。例如，当R为环戊基时，四种可能的阿凡曼菌素为：

俗名 R¹ R³

环戊基阿凡曼菌素A1 双键 CH₃

环戊基阿凡曼菌素A₂ 羟基 CH₃

环戊基阿凡曼菌素B1 双键 H

环戊基阿凡曼菌素B₂ 羟基 H

在非天然阿凡曼菌素中，式(I)的C-25取代基“R”系除了异丙基或(S)-仲丁基以外的取代基。

含有双键和不含OH时的式(I)化合物也可以由R¹为OH和不含双键的相应的式(I)化合物通过脱氢反应进行制备。该反应首先在5位和4″位上选择保护羟基，例如象丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰衍生物，然后与取代的硫代羰基囟化物如(4-甲基苯氧基)硫代羰基氯化物反应，继之在高沸点溶剂如三氯苯中加热完成脱氢反应。最后对产物进行脱保护生成不饱和化合物。这些反应步骤连同适宜的试剂和反应条件在美国专利4328335中已作了介绍。

R³为H时的式(I)化合物也可以由R³为CH₃的相应化合物通过脱甲基化反应制取。该反应可通过将5-甲氧基化合物或其适当的被保护衍生物与乙酸汞反应并用稀酸水解生成的3-乙氧基烯醇醚，得到5-酮化合物。然后例如用硼氢化钠还原，生成5-羟基衍生物。这些反应步骤所用适宜试剂和反应条件在美国专利4423209中已作了介绍。

R¹为H和不含双键时的式(I)化合物可以由含双键和不含R的相应化合物通过适宜的催化剂进行选择性催化脱氢制取。例如，可按欧洲专利申请公报No．0001689及其1980年4月22日出版的副本美国专利4199569中所述，采用三(三苯膦)三氯化佬(I)进行还原。

R²为H的式(I)化合物由R²为4′-(α-L-齐墩果糖基)-α-L-齐墩果糖基氧相应化合物通过用酸在含水的有机溶剂中温和水解去除4′-(α-L-齐墩果糖基)-α-L-齐墩果糖基团制取，得到在13位上具有羟基的糖苷配基；然后进行卤化，例如通过与苯磺酰卤化物反应，得到13-脱氧基-13-卤代衍生物，最后例如采用三丁基氢化锡进行选择性还原。为了避免不需要的副反应，例如可用叔丁基二甲基甲硅烷基保护可以存在的任何其他羟基。然后在卤化或还原步骤以后，用含有少量酸的甲醇进行处理，很容易将其去除。所有这些反应步骤与其所需的适宜试剂和反应条件在欧洲专利申请公报No．0002615中已作了介绍。

能被本发明的阿凡曼链霉菌用于生物合成天然或非天然的阿凡曼菌素的化合物是式(II-A)化合物，包括在发酵过程中可以转化为式(II-A)的化合物，式(II-A)为：

R-COOH (II-A)所述化合物在本文中用作“起始化合物”。式(II-A)中，R为α-支链基，其与-COOH基团连接的碳原子还与除了氢以外的至少两个其他原子或基团相连接。当然，这个定义还包含饱和及不饱和的无环基和环基，包括作为无环链或环的一节的那些任意带有硫或氧杂原子的基团。

更准确地说，作为C-25取代基的R可以是α-支链C₃-C₈烷基、链烯基、炔基、烷氧基烷基或烷硫基烷基；C₅-C₈环烷基烷基，其中烷基为α-支链C₂-C₅烷基；C₃-C₈环烷基或C₅-C₈环链烯基，其中每一个都可以任意被亚甲基或1个或多个C₁-C₄烷基或卤原子(氟、氯、碘或溴)取代；或含有氧或硫的3～6元的杂环，该杂环可以是饱和的或完全或部分不饱和，也可以任意被1个或多个C₁-C₄烷基或卤原子取代。

在发酵过程中化合物可以转化为RCOOH即产物母体是式(II-B)的化合物：

R-(CH₂)_n-Z (II-B)式中，R的定义如上，n是0，2，4或6，Z分别是-CH₂OH，-CHO，-CH₂NH₂，-COOR⁵或CONHR⁶(其中R⁵是H或(C_1-6)烷基，R⁶是氢，(C_1-4)烷基，或氨基酸残基，尤指天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸的残基，如-CH(COOH)CH₂COOH，-CH(COOH)(CH₂)₂COOH和-CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃。

在阿凡曼链霉菌菌株仅仅缺少分支氨基酸转氨酶的情况下，2-氧代酸也可用作产物母体。对该类菌株而言，式(II-C)的酸解被阿凡曼链霉菌用于阿凡曼菌素的生物合成。式(II-C)为：

R-CO-Z (II-C)式中R或Z的定义如上。

在发酵过程中可以转化的式(II-A)化合物和该化合物的异构体形式以及将它们应用于本文所述方法中而在C-25位生成异构体阿凡曼菌素，均属于本发明的范围。

实施本发明的方法可以使用缺失分支2-氧化酸脱氢酶活性和／或分支氨基酸转氨酶活性的阿凡曼链霉菌菌株在含水营养培养基中进行需氧发酵，该培养基含有可同化的氮、碳源、无机盐和式RCOOH的化合物或在发酵过程中可以转化为该化合物的化合物(即产物母体)。将酸或可以转化为该酸的化合物在接种时或发酵期间加入发酵液中。当使用转氨酶负突变体时，为了能使突变体进行生长，培养基必须含有L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸。控制阿凡曼产物的生产可以通过发酵液的采样、有机溶剂萃取、通过色谱如高效液相色谱跟踪产物的出现情况。采用连续培养，直至产物的得率达到最大限度，一般一个周期为4～15天。

每次加起始化合物(羧酸或可转化为羧酸的化合物)的最佳量为0．05～3．0克／升。起始化合物可以采用连续、间歇或一齐加入的方式加到发酵液中。加入的酸(RCOOH)可以是这种酸本身或作为盐的形式，如钠盐、锂盐或铵盐，或作为如上定义的可转化为酸的化合物的形式。酸如果是固体的，最好溶于适当的溶剂中，如水或(C_1-4)醇。

用于发酵的培养基，特别是当C-25取代基是异丙基或(S)仲丁基时，是含有可同化的碳、氮和微量元素源的常规培养基。当C-25取代基是非天然基团即非黑丙基或(S)仲丁基时，发酵培养基是一种经过选择缺失若干成份的培养基，或仅含最小量的R为异丙基或(S)仲丁基的起始化合物。

在最佳温度范围为24～33℃下发酵若干天后，离心或过滤发酵液，最好用丙酮或甲醇萃取菌丝饼。溶剂萃取液经浓缩后，将所需产物萃取到与水不混溶的有机溶剂中，例如二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丁醇或甲基·异丁基·酮。溶剂萃取液经浓缩后，粗产物需要采用层析方法，例如用制备逆相高效液相层析法进一步提纯。

得到的产物通常为式(I)化合物的混合物，式中的R²是4′-(α-L-齐墩果糖基)-α-L-齐墩果糖基氧基，R¹是OH并且不含双键或无R¹但含双键，R³是H或CH₃，然而产物的比例可随具体的突变体和所用起始化合物和条件而变化。

R基的来源，不管其是否直接来自R-COOH或由上述产物母体之一或任何产物母体产生的，对阿凡曼菌素的生产非属重要。本发明方法对阿凡曼菌素生产的严格要求在于所需R基在发酵过程中可为本发明的菌株阿凡曼链霉菌所利用。

适宜的化合物包括如下：

2，3-二甲基丁酸

2-甲基己酸

2-甲基戊-4-烯酸

2-环丙基丙酸

4，4-二氟环己烷羧酸锂盐

4-亚甲基环己烷羧酸

3-甲基环己烷羧酸(顺式／反式)

1-环戊烯羧酸

1-环己烯羧酸

四氢吡喃-4-羧酸

噻吩-2-羧酸

3-糠酸

2-氯噻吩-4-羧酸

环丁烷羧酸

环戊烷羧酸

环己烷羧酸

环庚烷羧酸

2-甲基环丙烷羧酸

3-环己烯-1-羧酸

2-甲硫基丙酸

2-甲基-4-甲氧基丁酸

噻吩-3-羧酸

羟甲基环戊烷

3-噻吩羧醛

3-环己基丙酸

3-环戊基丙酸

羟甲基环丁烷

四氢噻吩-3- 羧酸

3-环戊基-1- 丙醇

3-甲基环丁烷羧酸锂盐

3-氟环丁烷羧酸

3-亚甲基环丁烷羧酸锂盐

2-甲基-4- 甲硫基丁酸

四氢噻喃-4- 羧酸

环丁基甲胺

环丁烷羧酸乙酯

4-羟甲基环戊烯

2-(3-噻吩羰基)丙酸乙酯

(S)-2-甲基戊酸

(R)-2-甲基戊酸

O-甲基转够酶突变体可由本文所述的分支2-氧代酸脱氢酶负突变体和／或分支氨基酸转氨酶负突变体得到。与1种或2种O-甲基转移酶诱变相结合而诱变为正分支2-氧代酸脱氢酶活性和／或分支氨基酸转酶活性的突变体得到的阿凡曼链霉菌菌株，在发酵过程中加入RCOOH化合物或可转化为RCOOH的化合物，主要产生阿凡曼菌素B、脱甲基阿凡曼菌素或脱甲基阿凡曼菌素B化合物。所述突变体是通过对本文所述的缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性和／或分支氨基酸转氨酶活性的突变体进行紫外光照射和／或化学诱变剂处理诱变得到的，这些诱变剂例如有N-甲基-N-亚硝基尿烷、亚硝基胍、甲磺酸乙酯或如上所述的其他试剂。另外，缺失一种或两种O-甲基转移酶的分支2-氧代酸脱氢酶正突变体和／或分支氨基酸转氨酶正突变体可通过紫外光或诱变剂处理进行诱变，产生分支2-氧代酸脱氢酶负突变体和／或分支氨基酸转氨酶负突变体。

由这类突变体产生的非天然阿凡曼菌素，其特征在于在糖苷配基部分的C-5位上和／或齐墩果糖部分的C-3′和／或C-3″位上均有羟基。

根据Schulman等人介绍的方法(Antimicrobial Agents andChemotherapy，29，620～624，1986)，上述突变体已被认为是相同的。它们可用于相同目的，而且可与已知阿凡曼菌素的相同方法进行使用。

此外，包括在齐墩果糖双糖部份上缺失甲基在内的阿凡曼菌素B，其所增加的量是由本发明缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性和／或分支氨基酸转氨酶活性的突变体在存在诸如西尼霉素(Sinefungin)、S-腺苷基乙硫氨酸或具有O-甲基转移酶活性的S-腺苷基高半胱氨酸一类物质下进行发酵产生的。

本发明化合物是一类高活性的抗寄生虫剂，特别适用于驱肠虫药、皮肤寄生虫药、杀虫剂和杀疥虫剂。

因此，本发明化合物可有效地治疗由外寄生物引起的各种疾病尤其包括蠕虫病，这种病经常是由线虫纲动物一类的寄生虫引起的并且能造成猪、羊、马、牛饲养方面的严重经济损失以及损害家畜家禽。本发明化合物还能有效地防治损害各种动物的其他线虫纲动物，例如包括伤害狗的恶丝虫和能够传染给人的各种寄生虫，包括胃肠寄生虫，例如钩虫、板口线虫、蛔虫、类圆线虫、毛线虫、毛细线虫、鞭虫、蛲虫和在血液和其他组织器官中所发现的寄生虫，例如丝虫和肠外期的类圆线虫和毛线虫。

本发明化合物的价值还在于能治疗外寄生虫传染病，尤指动物和鸟类的节肢动物的皮肤寄生虫，例如扁虱、螨、虱、蚤、丽蝇、腐蚀性昆虫和能伤害牛马迁徙双翅目幼虫。

本发明化合物还是家庭害虫的杀虫剂，例如_蠊、袋衣蛾、红绿皮囊、家蝇，还可用来杀死对贮藏谷物和农作物有害的昆虫，例如叶螨、蚜虫、、以及迁徙直翅目昆虫，如蝗虫。

式(I)化合物可以作为配方给药，适用于特殊需要和有待治疗的特种宿主动物，包括寄生虫或昆虫。用作驱蠕虫药时，该化合物可以胶囊、大丸剂、片剂或液体兽用顿服药形式给予口服，或者可以注射或插入给药。这类配方可根据标准的习用方法用常规手段制备。因此，胶囊、大丸剂或片剂可以通过将有效成份与附加的适宜粉状稀释剂或载体混合制备。稀释剂或载体包括崩解剂和／或粘合剂，例如淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁等。灌服制剂可以通过将有效成份先分散在水溶液，然后与分散剂或湿润剂等一起进行制备。注射剂可制备成含有其他物质的无菌溶液，其所含物质例如盐或葡萄糖，含量足以配制成血液等渗溶液。这些配方中有效化合物的重量依据待治疗宿主动物的种类、感染的程度和类型以及宿主的体重，可以改变。通常口服剂量约为0．001～10毫克／千克动物体重对1～5天序程的单剂量或分剂量来说是可以令人满意的，当然还可以给出高剂量或低剂量的范围，但这也属于本发明的内容。

此外，本发明化合物可与动物饲料一起服用，为此可与普通动物饲料混合，制成浓缩饲料源加物或预混合料。

为了用作杀虫剂和防治农业害虫，本发明化合物可根据常规的农业操作配制成喷雾剂、粉尘剂和乳化剂等。

根据下列步骤，生产缺失分支2-氧代酸脱氢酶的阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)：

步骤1：将阿凡曼链霉菌ATCC31272的汇合菌苔方式，在NPA(NewPatch Agar Medium)培养基上在30℃培养12天。培养基的成份为：

V-8汁 200ml

CaCO₃ 3g

琼脂 15g

H₂O 至1000ml

营养肉汤 1．0g／l

乙酸钠3H₂O 1．4g／l

异戊酸 50mg／l

异丁酸 50mg／l

2-甲基丁酸 50mg／l

异亮氨酸 250mg／l

亮氨酸 250mg／l

缬氨酸 250mg／l

微量元素溶液** 1ml／l

*8种植物汁(蕃茄、故萝卜、芹菜、甜菜、欧芹、莴苣、水田芹和菠菜)加盐、抗坏血酸、柠檬酸和天然料。由Campbell Soup Company，Camden，NJ提供。

**微量元素溶液的成份为：

FeCl₃·6H₂O 2．7g

MnSO₄·H₂O 4．2

CuSO₄·5H₂O 0．5

CaCl₂ 11．0

H₃BO₃ 0．62

CoCl₂·6H₂O 0．24

ZnCl₂ 0．68

Na₂MoO₄ 0．24

将以上成份溶于1升0．1N HCl。

从上述的3个培养板上收集得到的孢子悬浮在20毫升0．05M tris-马来酸缓冲液，pH9．0。

步骤2：将10毫升孢子悬浮液加到装有10mg N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的瓶中，在28℃下振荡培养60分钟，然后用大量1％的NaCl溶液洗涤。

步骤3：将洗涤过的孢子悬浮在1％NaCl溶液中并与等体积的80％乙二醇混合，保存在-20℃，用作筛选突变体的细胞源。萌芽时得到约10⁴菌落／毫升。

将这些孢子原料涂在ypD培养板上，每块板得到约100个菌落(ypD培养基的成份为：10g／l酵母液、10g／l细菌胨*、10g／l葡萄糖和15g／l细菌琼脂*，在高压灭菌前将pH调至6．9)，标有*号的成份由Difco实验室(密执安48238德特洛依特)提供。

步骤4：在28℃培养2-3周后，从培齐板上挑出各个菌落，置于标准96井微滴定板的各个井中。另外，将少量菌落补充到所鲜琼脂培养基上，在鉴定突变体时用作活细胞源。

步骤5：将约75微升的M9液体盐培养基加到每个井中，该培养基含有1％葡萄糖、0．1％酪蛋白氨基酸、和各为0．01％的异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸。在28℃下培养若干天后，测定细胞是否含有分支2-氧代酸脱氢酶。(每升M9盐培养基含有6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，0．5g NaCl和1gNH₄Cl。培养基经高压消毒后，无菌加入消毒过的1ml的1M MgSO₄和1ml的0．1M CaCl₂)。

步骤6：通过超声波处理不混溶混合物，制备5％苯在M9盐培养基中的微悬浮液。向25毫升的悬浮液中，加入1．2毫升的2．5微居里／毫升和10．0微居里／微摩尔〔¹⁴C-1〕-2-氧-异己酸溶液。取此总混合物50微升加到置有待测菌落的微滴定板的各个井中。

步骤7：采用Tabor等人所介绍的方法(J．Bacterio1．128，485～486，1976，题为：《测定多种样品¹⁴CO₂的常规方法在快速筛选突变体中的应用》)，收集和观测各井产生的¹⁴CO₂。缺失活性分支2-氧代酸脱氢酶的突变体除了对点所观察到的之外，并不产生Ba¹⁴CO₃。

为了改进¹⁴CO₂正测定(放射自显影照片上的暗斑点表示Ba¹⁴CO₃的形成)和负测定(无斑点或有甚亮斑点表示没有Ba¹⁴CO₃的形成)之间的对比，一个更精确的改进筛选方法包括下述各点：

从琼脂培养基中挑出培养7～14天后(不挑培养2～3周的并直接按上述步骤6和7测定)的各个菌落(参见上述步骤4)。省略上述方法的步骤5。

就¹⁴CO₂释放而言，更精确的测定方法实质上是定量测定方法，包括：将按上述筛选方法检测到的突变体培关在合适的培养基上。这种培养基是含有1％葡萄糖和0．1％“合成混合物”(“Syncasa-bcaa”)(一种由L-氨基酸与市售酪蛋白氨基酸的近似组合物组成的合成混合物，但不含L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸，参见如下)的M9盐培养基。

在培养至细胞密度达到很高之后，将细胞置于M9盐培养基中洗涤，再悬浮在含有1％甲苯的冷却M9盐培养基中，甲苯先前经过声波处理形成乳白色甲苯分散液。为了渗透细胞，将细胞-缓冲液-甲苯悬浮液在30℃下培养40分钟。经渗透的细胞置于M9盐培养基中洗涤，最后再将其悬浮在原体积1／5的M9培养基缓冲液中。每次测定取用该悬浮液180微升。

在300微升的反应体积中含有：渗透着甲苯的细胞、0．4mM的硫胺焦磷酸素(TPP)、0．11mM的辅酶A(CoA)、0．68mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、2．6mM的二硫苏糖醇(DTT)、4．1mM的MgCl₂、60mM的Tris-HCl(pH7．5)和6000cpm的(¹⁴c-1)-α-酮异己酸(微居里／微摩尔)。计数效率73％。反应是在15ml闪烁管中进行的，闪烁管的螺丝帽内置有2×2cm华特曼4号滤纸，该滤纸含有30微升1M氢氧化胺(1M的氢氧化甲苯钍的甲醇溶液，由Sigma Chemical CO．，St．Louis，MO63178提供)，以吸收反应中释放的¹⁴CO₂。培养2小时后，将滤纸浸在10ml的Beckman Aquasol II(通用液体闪烁计数管，由New England NuclearResearch Products，Beston，MA 02118提供)中，在该溶剂中平衡4小时或更多时间后测量液体闪烁计数管中的放射性。空白对照反应(即无细胞)约为50～300cpm。

突变体I-3等得到的计数值小于或等于空白对照反应，而亲本菌株的计数值高于空白对照值多倍。

分离阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)的HL-026衍生物(ATCC53568，CCTCC No．M87117)的方法是在营养琼脂板上划出阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)，自发变种的出现频率相当高，经30℃培养4天后，其中有些变种没有需氧菌丝体。分离出若干这种变种，将它们置于加有环戊烷羧酸的AP-5培养基中进行发酵时，测定它们产生非天然阿凡曼菌素的能力。分离变种中有许多能产生非天然阿凡曼菌素而不含天然阿凡曼菌素，选出烧瓶试验中产生的阿凡曼菌素滴定度高于其亲本阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)的菌株。鉴定号为HL-026(ATCC53568，CCTCC No．M87117)。

缺少分支2-氧代酸脱氢酶和缺少分支氨基酸转氨酶的阿凡曼链霉菌PGS-119(ATCC53670，CCTCC No．M87119)的产生步骤为：

步骤1：将100mg左右的阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)在新鲜SAMM琼脂板上培养4天，然后接种到装有50ml SCM培养基(pH7．2)的300毫升烧瓶中，烧瓶在200RPM和30℃下摇动24小时(最终pH=8．2)。

步骤2：从摇床上移去烧瓶，将10ml全培养液置于无菌管中，在2000RPM下离心5分钟。将细胞再悬浮在300ml无菌三角烧瓶装有50ml的SCM培养基中，烧瓶在旋转摇床上和30℃下摇动2小时。

步骤3：将10ml悬浮液放入无菌管中。

步骤4：将250微升甲磺酸乙酯加入管中(在通风良好的柜内)，充分混合后倒入300ml无菌烧瓶中，烧瓶在旋转摇床中和30℃下摇动3小时。

步骤5：将新鲜的无菌SCM培养基40ml加入烧瓶中，在30℃下连续摇动70小时。

步骤6：移去烧瓶，在8000RPM和20℃下离心10分钟，通过再悬浮于SCM培养基中洗涤细胞，再离心后悬浮在10mlSCM培养基中。

步骤7：取出细胞，通过影印培养(约150个菌落／培养板)，测定它们在含有或不含L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和任何所述氨基酸的结合的M9／葡萄糖小培养板上的生长能力。令人感兴趣的突变体细胞只在加有L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的培养基上生长。这些缺失分支氨基酸转氨酶活性的阿凡曼链霉菌I-3(ATCC-53567，CCTCC No．M87116)的衍生物在加有作为L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸产物母体的三种2-氧代酸(2-氧代异己酸、2-氧-3-甲戊酸和2-氧代异戊酸)中1种或多种的培养基上也不能生长。这种情况与在这种培养基上生长良好的阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．87116)完全相反。因此，只有一种转氨酶能催化所述2-氧代酸的转氨作用。

SCM培养基

酵母自溶产物 10g／l

牛肉膏 5g／l

酪蛋白酶催水解物 10g／l

1M MgSO₄ 3g／l

1M K₂HPO₄；pH7．0(HCl) 100g／l

SAMM琼脂板

g／l

Na₂HPO₄ 6．0

KH₂PO₄ 3．0

NaCl 0．5

NH₄Cl 1．0

1M MgSO₄ 1．0

0．1M CaCl₂ 1．0

右旋葡萄糖 8．0

酪蛋白氨基酸 20．0

琼脂 20．0

100倍浓缩物的“合成混合物”的组分

克／升

L-丙氨酸 3

L-精氨酸 4

L-天冬氨酸 6

L-胱氨酸 1

L-谷氨酸 20

甘氨酸 1

L-组氨酸 2

L-赖氨酸 7

L-蛋氨酸 3

L-苯丙氨酸 6

L-脯氨酸 10

L-丝氨酸 6

L-苏氨酸 4

L-酪氨酸 4

L-色氨酸 1

将该混合物的pH调至7，进行无菌过滤。1体积的浓缩物加到99体积的培养基中，得到常规使用的浓度。

通过阿凡曼链霉菌ATCC31272的抗放线壮观素菌株和阿凡曼链霉菌PGS119(ATCC53670，CCTCC No．M87119)的原生质体融合，得到阿凡曼链霉菌JC-923(ATCC53669，CCTCC No．M87118)。

抗放线壮观素阿凡曼链霉菌ATCC31272是阿凡曼链霉菌ATCC31272的一个自发突变体。它是从涂在含有50mcg／ml放线壮观素的AS-1琼脂板上的ATCC31272营养菌丝体分离得到的。在浓培养基上萌发的突变体孢子具有抗50mcg／ml放线壮观素的作用，这与在这种条件下不能萌芽的同源亲本菌株的孢子可作一对比。这种明显可选择的标记可成功地用于分离ATCC31272缺少分支氨基酸转氨酶分离体。

AS-1琼脂(用于平皿接种链霉菌浓培养基)

酵母膏 1g

L-丙氨酸 0．2g

L-精氨酸 0．2g

L-天冬酰胺 0．5g

可溶淀粉 5g

NaCl 25g

Na₂SO₄ 10g

琼脂 20g

蒸馏水 1g

pH调至7．5，在121℃下高压消毒15分钟。将30～35ml倒入无菌塑料的陪替氏板中(100×15mm)。

关于产生阿凡曼链霉菌菌株的活原生质体的方法详述如下：

A．孢子接种

1．按常规方法制取孢子制剂，通过在萌发琼脂上的接种稀释测定活孢子数，在-70℃下，在40％丙三醇中等分冰冻。

2．使用前先将贮藏的孢子在1000g下离心10分钟，然后将其悬浮在等体积的0．85％盐水中。

3．将大约10⁷孢子接种到装有30ml含0．5％甘氨酸的酵母膏-麦芽膏改进培养基(YEME)(参见如下)的300毫升隔有3层或4层烧瓶(three or four-baffled flask)中。

B．经冰冻超声处理菌丝体的接种

1．PGS-119菌丝体培养物在胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中生长至在600nm波长处浊度为2～9。培养物用玻璃组织研磨机均匀10次。

2．均匀的菌丝体在TSB中稀释2倍，取其中20ml加到无菌聚丙烯离心管中。将超声探头浸没到液体1～2cm深处，样品在50％强度下超声处理10秒钟。超声处理将菌丝体分散为单个或两个细胞单位，传代培养时迅速按指数生长速率繁殖。

3．经超声处理的菌丝体制剂烯释至最终浓度为40％的丙三醇，然后滴入管中，-70℃冰冻保藏。

4．需用时将等分试样在室温下解冻，并接上述步骤A3接种到YEME培养基中。

C．琼脂培养基上菌落的接种

1．用环将生长在TSA或YPD-2琼脂培养基上的6个成熟的

PGS-119的菌落移入装有200微升无菌水的微量管中。

2．用一次性使用的研杵将菌丝体混合物搅匀。

3．将搅匀的菌落按上述步骤A3所述加到YEME培养基中。

D．生长在甘氨酸中的菌丝体原生质体的制备

1．培养物在振荡水浴(调至8)中于29℃下培养65小时左右。

2．用40X相2放大率的显微镜观察菌丝体并将其采集在聚丙烯离心管中，在约1475g和20℃下离心10分钟。

3．去上清液，将菌丝体小片再悬浮在10ml原生质体(p)缓冲液(参见如下)。用组织研磨机将小片搅匀5～10次，使其分散成小块。

4．在约1000g下将样品离心10分钟，去上清液，将小片缓慢地悬浮在10ml原生质体缓冲液中。

5．重复上述洗涤步骤。

6．将菌丝体小片再悬浮在10ml含有1．0mg／ml新鲜溶菌酶的原生质体缓冲溶液中，该溶液先前用0．22微米滤纸进行无菌过滤。

7．菌丝体混合物在水浴中和37℃下缓缓振荡60分钟。每隔15分钟，将样品悬浮在溶菌酶溶液中，用40X相照度显微镜观察样品中原生质体的存在。

8．用5ml移液管将菌丝体制剂研制3次，使原生质体脱离其细胞壁。

9．制剂通过玻璃棉或不吸收棉花进行过滤。

10．原生质体约在1000g下离心7分钟沉淀，缓慢悬浮在5ml原生质体缓冲液中，用40X相放大率观察。

11．按上述方法沉淀原生质体并将其悬浮在1．0ml原生质体缓冲液中，用原生质体缓冲液和蒸馏水稀释该悬浮液后，将其置于再生培养基上，从用蒸馏水稀释的原生质体制剂得到的菌落被认为是由不完全的或非原生质体的菌丝体单位衍生的。

12．以200～300微升的原生质体等份试样用冰冻于-70℃，18～24小时后从冰上移去。

用聚乙二醇(PEG)1000融合原生质体的方法如下：

1．本文所述的全部试验均用大量的PEG1000(Sigma Chemical CO．，St．Louis，MO 63178)完成的，就我们所知，其所产生的表观毒性很小。

2．将1．0g的PEG等份试样置于玻璃管中，经高压消毒后加入1．0ml原生质体缓冲液，将玻璃管加热至55℃，使PEG溶解或使其不平衡。使用前才将其溶于原生质体缓冲液，进行无菌过滤。PEG溶液可在环境温度下使用。

3．重新制备原生质体或将保藏在-70℃下的原生质体用流水迅速解冻。把大致等量的各个基因型的原生质体缓慢滴入聚碳酸酯离心管。测定新制备的原生质体制剂的浊度并将其融合成若干不同的浓度。用原生质体缓冲液将各离心管内制剂的体积调至5．0ml。

4．在约1000g下将融合混合物离心7分钟。

5．谨慎地去上清液，用原生质体缓冲液将原生质体小片缓慢悬浮，使其最终体积达到200微升。

6．将800微升50％PEG迅速加到融合混合物。将制剂吸入巴斯德吸管，再将其滴出，使制剂混合。融合物在室温下培养2分钟。加入9ml原生质体缓冲液，以稀释PEG。其他的融合物也连续进行，使培养的时间间隔准确无误。

7．接上述步骤4离心融合混合物，谨慎去上清液，将洗涤过的融合原生质体再悬浮在1．0ml的原生质体缓冲液中。

8．融合混合物用原生质体缓冲液连续稀释至10-1和10-2。

9．各个菌株的融合都通过每个实验来完成并且都有对照试验。

10．将各个原生质体制剂(活菌数)的稀释液进行涂覆，测定用于融合处理的各菌株的活再生菌株的数量。

原生质体的再生方法如下：

1．原生质体悬浮液、融合混合物或自融合物均适宜用原生质体缓冲液稀释，并以100微升的等份缓慢涂在再生琼脂培养基上。将融合原生质体涂在软琼脂的涂复层上并不能显著增加它们的再生。

2．采用上述D．11方法进行适当处理。

3．将再生培养板正面向上置于密封塑料袋内，在29～30℃和约95％温度条件下进行培养。

4．为了进行原生质体融合，以抗放线壮观素作为主要选择标记，对再生原生质体在18小时涂以3．5ml含有100mcg／ml放线壮观素的软琼脂(参见如下)，该放线壮观素是在45℃下加入经过高压消毒的软琼脂中的。

5．原生质体培养7～10天。

生长培养基、再生培养基和原生质体缓冲液的配制方法和成分如下：

完全再生培养基〔对Hopwood等(Genetic Manipulation ofStreptmyces：A Laboratory Manual，P．235，1985)配方的改进)：

基本溶液：

蔗糖 205g

K₂SO₄ 0．25g

MgCl₂·6H₂O 10．12g

葡萄糖 10g

Difco酪蛋白氨基酸 0．1g

Difco酵母膏 5．0g

Difco麦片琼脂 3．0g

Difco细菌琼脂 22．0g

蒸馏水至955ml

在121℃下高压消毒25分钟。

高压消毒后，加下列无菌成分：

KH₂PO₄(0．5％) 10ml

CaCl₂·2H₂O 5ml

L-脯氨酸(20％) 15ml

MES缓冲液(1．0M) 10ml

微量元素溶液* 2．0ml

NaOH(1N) 3．0ml

将pH调至6．5，体积加至1升。

*微量元素溶液(每升)的组分为：

ZnCl₂ 40mg

FeCl₃·6H₂O 200mg

CuCl₂·2H₂O 10mg

MnCl₂·4H₂O 10mg

Na₂B₄O₇·10H₂O 10mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 10mg

放线壮观素软琼脂涂层：

如上述完全再生培养基，另外

琼脂 4．10g

按上述方法高压消毒，冷却至55℃，加100mg放线壮观素，将5ml体积的等份样品置于加盖培养管中，冷却。使用前再高压消毒。改进原生质体缓冲液：

基本溶液：

蔗糖 205g

K₂SO₄ 0．25g

MgCl₂·6H₂O 2．02g

蒸馏水至 977ml

在121下高压消毒25分钟。

高压消毒后，加入下列无菌组分：

KH₂PO₄(0．5％) 1ml

微量元素溶液* 2ml

CaCl₂·2H₂O(3．68％) 10ml

MES缓冲液(1．0M) 10ml

将pH调至6．5，体积加至1升。

*微量元素溶液配方同上。

改进酵母膏-麦芽膏(YEME)培养基

基本溶液：

Difco酵母膏 3g

Difco细菌蛋白胨 5g

Difco细菌麦芽萃取液体培养基 3g

葡萄糖 10g

蔗糖 300g

蒸馏水至 973ml

在121℃下高压消毒25分钟。

高压消毒后，加入下列组分：

MgCl₂·6H₂O(2．5M) 3ml

甘氨酸(20％) 25ml

将体积加至1升。

附图说明：

图1：在不含脂肪酸培养基(WPM Syn A40：40)上生长后，由阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567)细胞的溶剂提取液中得到的溶剂分馏的高效液相色谱的紫外光显迹(240nm)与时间(分)曲线。峰值13．12是寡霉素A。

图2：在不含脂肪酸培养基(WPM Syn A40：40)上生长后，由阿凡曼链霉菌MA4848(ATCC31272)细胞的溶剂提取液得到的溶剂分馏的高效液相色谱的紫外光显迹(240nm)。产物是天然阿凡曼链霉菌素。

图3：在含有环戊基羧酸(参见实施例1)的培养基上生长后，由阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567)细胞的溶剂提取液中得到的溶剂分馏的高效液相色谱的紫外光显迹(240nm)。

附图均为所述化合物的高效液相色谱曲线的精确显迹。

下列实施例中使用的培养基的组分如下所示。所有分子量的测定均是采用三甘醇与固体氯化钠的样品基质通过在VC型7070F质谱仪上完成快速原子撞击质谱测量得到的。测得(M+Na)⁺使用VG型7070F质谱仪完成电子碰撞质谱测量提供m／e值1，仅记录了主要部分的值。

AS-7培养基

g／l

稀淀粉^a 20

Ard胺pH^b 5

医用培养基^c 15

CaCO₃ 2

通过由地衣杆菌(Bacillus licheniformis)得到的2-淀粉酶(由Novo Enzymes，Wilton，CT提供并以商标“Termanyl”的制品出售)将淀粉水能为相当于40％±5％的葡萄糖进行制备。

a由Yeast Products，Inc．，Clifton，NJ07012提供。

b由Traders Protein．，Memphis，TN38108提供。

c 用NaOH将pH调至7．2。

AP-5培养基

稀淀粉 g／l

Ard胺pH 5

K₂HPO₄ 1

MgSO₄·7H₂O 1

NaCl 1

CaCO₃ 7

FeSO₄·7H₂O 0．01

MnCl₂·7H₂O 0．001

ZnSO₄·7H₂O 0．001

p-2000(防泡沫) 1ml／l

用25 ％ NaOH调节pH至6．9。

WPM合成A 40∶40

蒸馏水g／l

稀淀粉 40

马铃薯可溶淀粉 40

谷氨酸 1．0

精氨酸 0．168

胱氨酸 0．084

组氨酸 0．069

亮氨酸 0．798

赖氨酸 0．297

蛋氨酸 0．108

苯丙氨酸 0．168

苏氨酸 0．174

色氨酸 0．048

酪氨酸 0．192

K₂HPO₄ 1．0

MgSO₄·7H₂O 1．0

NaCl 1．0

CaCO₃ 3．5

FeSO₄·7H₂O 0．01

MnCl₂·4H₂O 0．001

ZnSO₄·7H₂O 0．001

pH值调节至6．8～7．0，在121℃搅拌30分钟。

WPM合成B 40∶40

蒸馏水g／l

马铃薯可溶淀粉 40

稀淀粉 40

谷氨酸 0．390

精氨酸 0．168

胱氨酸 0．084

组氨酸 0．069

赖氨酸HCl 0．297

蛋氨酸 0．108

苯丙氨酸 0．168

苏氨酸 0．174

色氨酸 0．048

酪氨酸 0．192

K₂HPO₄ 1

MgSO₄·7H₂O 1

NaCl 1

CaCO₃ 3．5

FeSO₄·7H₂O 0．01

MnCl₂·4H₂O 0．001

ZnSO₄·7H₂O 0．001

pH值调节至6．8～7．0，在121℃搅拌30分钟。

采用一般的高效液相色谱方法，其具体内容为：

流动相：

150ml水

70ml乙腈

用甲醇加至1升

层析柱：

超球形柱ODS 25cm(Beckman Instruments，Fullerton，CA 92634-3100)

流量：0．75 ml／min。检测：紫外光，240nm

衰减：～6

样品稀释剂(D)：

35ml乙腈+390ml甲醇

标准物：

1．将0．5mg阿凡曼菌素A2A置入10ml瓶内，用甲醇加至所需体积

2．将0．5mg试样置入10ml瓶内，用甲醇加至所需体积

1和2均是标准原料溶液，使用该标准溶液进行展开时还必须：

取1和2各100微升置入管内加800微升流动相

样品：

1．取1ml经过充分振摇的培养液，待自旋停止

2．将上清液尽可能除去，但不要被坏小片

3．将100微升高效液相色谱水加到小片中，转动混合使其分散

4．加入2ml稀释剂(D)，充分混匀

5．过滤并用高效液相色谱法展开。

天然阿凡曼菌素经这种高效液相色谱法处理并通过保留时间将各个阿凡曼菌素峰值分开的保留时间可以观察到寡霉素A的存在，而寡霉素A可以用作所给出的高效液相色谱测定的内标物。作为阿凡曼链霉菌发酵的副产物寡霉素A通过高效液相色谱处理几乎总能被观察到，当将它们培养在不含酸RCOOH的培养基或不含可转化为RCOOH酸(RCOOH中R的定义均同上)的化合物的培养基中时，是由本文所述的突变体产生的在高效液相色谱仪上得到的唯一产物。一般说来，寡霉素A的保留时间为12．5～14分钟。保留时间(RT)的比可以成为比较阿凡曼菌素产物同一体和产率的较为有意义的基础。阿凡曼菌素产物在高效液相色谱仪上出现的一般顺序为B2、A2、B1和A1(图2)。

天然阿凡曼菌素 RT／RT(寡霉素A)

B2b 0．70

B2a 0．84

A2b 0．90

A2a 1．09

B1b 1．40

B1a 1．83

A1b 1．83

A1a 2．42

作天然阿凡曼菌素 RT／RT(寡霉素A)

环戊基B2 0．94

环戊基A2 1．23

环戊基B1 1．99

环戊基A1 2．62

从图2的天然阿凡曼菌素(注意：B1a和A1b均不溶解)和图3的非天然阿凡曼菌素测出保留时间的比值。不同天数的保留时间，其变动范围为1～2分钟，寡霉素A的出现时间一般在12．5～14分钟左右。

下列实施例中的阿凡曼菌素是通过上述高效液相色谱方法测定的。

实施例1：环戊基阿凡曼菌素A2

阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)在28～30℃下和AS-7培养基中振荡培养24小时。取其5ml接种到含有100ml AS-7培养基的500ml烧瓶中，在同样条件下培养24小时。取1ml该培养菌接种到AP-5培养基(40ml，置于300ml烧瓶)中，24小时后加入0．4g／l环戊烷羧酸(钠盐)。装有产物的烧瓶在28～30℃下连续振荡。240小时后，产生35mg／l环戊基阿凡曼菌素A2，而相应的天然A2a的滴定率为0。还产生其他环戊基阿凡曼菌素。

实施例2：环戊基阿凡曼菌素A2

将冰冻瓶中的阿凡曼链霉菌HL-026(ATCC53568，CCTCC No．M87117)接种到含有100ml AS-7培养基的500ml烧瓶中，在28～30℃下振荡培养24小时。然后取1ml等份试样分别接种到另2个含有100ml AS-7培养基的500ml烧瓶中，后2个烧瓶中的菌种在培养18小时后再接种到10升AP-5(不含NaCl)培养基中。在28℃下培养24小时后，将0．4g／l环戊烷羧酸加到培养基中。搅拌使溶解氧保持在20％以上的饱和水平。在120、168、216、264和312小时时的环戊基A2的滴定度分别为16、40、65、88和110gm／l。与此相反，在这些样品中，相应的天然阿凡曼菌素A2a的滴定度为0(即未检测到)。

实施例3：环戊基阿凡曼菌素A2

在这个实施例中，浓缩生产的培养基并且成倍地加入环戊烷甲酸，以增加环戊基阿凡曼菌素的滴定度。菌种生长和发酵的条件除与实施例2所述相同之外，还有：另将5g／l Ardamine pH(总量为10g／l)加在AP-5培养基中，再分别在30、172和220小时时加环戊烷甲酸0．4、0．2和0．2g／l。在120、168、216、264和312小时时，环戊基阿凡曼菌素A2的滴定度分别为1．2、11、78、137和214g／l。

实施例4：环戊基阿凡曼菌素

将一冰冻瓶的阿凡曼链霉菌HL-026(ATCC53568，CCTCC No．M87117)接种到含有100ml AS-7培养基的500ml baffled烧瓶中，在28～30℃下培养24～28小时。然后取1ml该培养菌接种到含有40ml AP-5(不含NaCl，但加有0．6g／l谷氨酸)培养基的300ml烧瓶中，在28～30℃下振荡培养96小时后，加入0．4 g／l的环戊烷羧酸(钠盐)。样品经2l6小时的高效液相色谱证明有环戊基阿凡曼菌素B2、A2、Bl和Al的存在，保留时间分别为l2．32、l5．86、25．28和32．96分钟。

实施例5：环戊基阿凡曼菌素A2

在这个实施例中，阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)和阿凡曼链霉菌HL-026(ATCC53568，CCTCC No．M87117)生长在相同条件下。使用三种培养基(AP-5，WPM Syn A 40∶40和WPM SynB 40∶40)。将各个冰冻培养菌接种到含有l0ml AS-7培养基的500mlbafflec)烧瓶中，在28～30℃下连续培养24～26小时。然后，取每种培养菌1ml接种到300ml烧瓶中，每瓶含有一种培养基40ml，均有重复。在28℃下，振荡培养24小时后，每瓶加0．4g／l环戊基羧酸(钠盐)，在培养l92小时后，测定主要产物环戊基阿凡曼菌素A2的滴定度(表I)。

表I培养基阿凡曼链霉菌株环戊基阿凡曼菌素A2(mg／l)AP-5 ATCC53567 29

(CCTCC No．M87116)

ATCC53568 67

(CCTCC No．M87117)WPM Syn A 40:40 ATCC53567 35

(CCTCC No．M87116)

ATCC53568 115

(CCTCC No．M87117)WPM Syn B 40:40 ATCC53567 38

(CCTCC No．M87116)

ATCC53568 36

(CCTCC No．M87117)实施例6：环己垂阿凡曼西乘

在这个实施例中，在96小时时加0．29／l环己烷羧酸而不加环戊烷羧酸。所有其他条件均与实施例4所述相同。在240小时样品的高效液相色谱图上鉴定有4种环己烷羧酸。环己基阿凡曼菌素B2、A2、Bl和Al的保留时间分别为14．84、l9．26、31．46和41．14分钟。

实施例7：3-环已烯基阿凡曼菌素

在这个实施例中，在96小时时加0．29／l 3-环己烯羧酸而不加环戊烷羧酸。所有其他条件均与实施例4所述相同。在312小时样品的高效液相色谱图上鉴定有若干种环己烯阿凡曼菌素，其保留时间分别为12．88(B2)、16．39(A2)、27．37／28．36(Bl异构体)和35．80／37．13(Al异构体)分钟。

实施例8：3-噻吩基阿凡曼菌素

在这个实施例中。在96小时时加0．059／l噻吩-3-羧酸而不加环戊烷羧酸。其他所有条件均与实施例4所述相同。在312小时样品的高效液相色谱图上鉴定有4种3一噻吩基阿凡曼菌素。3-噻吩基阿凡曼菌素B2、A2、B1和Al的保留时间分别为6．96、8．76、13．8和23．5分钟。

实施例9：1-甲硫基乙基阿凡曼菌素

在这个实施例中，在24和96小时分别加0．4和0．29／l 2-甲硫基丙酸而不加环戊烷羧酸，其他所有条件均与实施例4所述相同。在240小时样品的高效液相色谱图上鉴定有2种1-甲硫基乙基阿凡曼菌素。3-噻吩基阿凡曼菌素A2和B1的保留时间分别为9．30和13．06分钟。出现在7．55分钟的前肩峰估计约7．2分钟保留时间的峰值被认为是B2化合物，而A1化合物被认为在17．22分钟峰值以下。

实施例10：2-戊基阿凡曼菌素

在这个实施例中，在96小时时加0．2g／l 2-甲戊酸而不加环戊烷羧酸，其他所有条件均与实施例4所述相同。在312小时样品的高效液相色谱图上鉴定有4种2-戊基阿凡曼菌素。2-戊基阿凡曼菌素B2、A2、B1和A1的保留时间分别为12．88、16．58、31．90和41．92分钟。

实施例11：1-甲基-3-丁烯基阿凡曼菌素

在这个实施例中，在96小时时加0．2g／l 2-甲基-4-戊烯酸而不加环戊烷羧酸，其他所有条件均与实施例4所述相同。在312小时样品的高效液相色谱图上鉴定有4种1-甲基-3-丁烯基阿凡曼菌素。1-甲基-3-丁烯基阿凡曼菌素B2、A2、B1和A1的保留时间分别为11．13、14．78、22．10和28．92分钟。

实施例12：1-甲基-1-丁烯基阿凡曼菌素

在这个实施例中，在96小时时加0．2g／l 2-甲基-2-戊烯酸而不加环戊烷羧酸，其它所有条件均与实施例4所述相同。在312小时样品的高效液相色谱图上鉴定有4种1-甲基-1-丁烯基阿凡曼菌素。1-甲基-1-丁烯基阿凡曼菌素B2、A2、B1和A1的保留时间分别为11．59、14．93、25．39和33．18分钟。

实施例13

在这个实施例中，证明所用突变体是制备由L-缬氨酸衍生得到的天然阿凡曼菌素而不含由L-异亮氨酸衍生的阿凡曼菌素。将含有阿凡曼链霉菌I-3(ATCC53567，CCTCC No．M87116)的冰冻瓶内的培养物转移到含有100ml AS-7培养基的500ml baffled瓶内。在28～30℃下振荡(约200rpm)培养大约1天后，取1ml培养菌接种到置有40ml WPM SynA 40∶40 培养基的300ml烧瓶中，在28～30℃下连续振荡培养24小时。此时加4ml异丁酸(用NaOH中和到pH6～7(4mg／ml)无菌过滤液，按上述方法连续培养8天。高效液相色谱分析显示有4个主峰(寡霉素除外)(类似于用2-甲基丁酸代替异丁酸的试验)，可以看到由L-异亮氨酸衍生的4个阿凡曼菌素的附加峰。

实施例14

重复实施例1的方法，但用下列起始化合物取代环戊烷羧酸。由所给发酵条件鉴定为阿凡曼菌素为式(I)化合物，其中R²为齐墩果糖的双糖部分，R、R¹和R³如所示)列表如下。化合物起始产物：RT／RT(寡霉素A)编号化合物 R B₂ A₂ B₁ A₁1 2-甲基戊-2-基 1 1．287 2．478 3．255

戊酸2 2-甲基戊 4-戊烯-2 0．853 1．090 1．694 2．217

-4-烯酸 -基 0．904 1．133 1．784 2．3463 1-环己烯环己烯-1 0．785 1．021 1．665 2．1 79

羧酸 -基4 噻吩-2- 噻吩-2- 0．694 1．143 1．499

羧酸基5 3-糠酸 3-呋喃基 0．705 1．0956 丁烷环丁基 0．728 0．933 1．546 2．027

羧酸7 环戊烷环戊基 0．960 1．236 1．970 2．568

羧酸8 环己烷环己基 1．206 1．565 2．556 3．343

羧酸9 环庚烷环庚基 1．465 1．923

羧酸10 3-环己烯环己基-3 1 1．273 2．125 2．780

-1-羧酸 -烯基11 2-甲硫基 1-甲硫基 0．565 0．730 1．025 1．351

丙酸乙基12 噻吩-3- 噻吩-3- 0．539 0．639 1．069 1．338

羧酸基13 羟甲基环戊基与7相同

环戊烷14 3-噻吩噻吩-3- 与12相同

羧醛基15 3-环己基环己基与8相同

丙酸16 3-环戊基环戊基与7相同

丙酸17 羟甲基环丁基与6相同

环丁烷18 3-环戊基环戊基与7相同

-1-丙醇19 环丁基环丁基与6相同

甲胺20 环丁烷羧环丁基与6相同

酸乙酯21 2-(环丁环丁基与6相同

基羰基)-

丙酸22 2-(3-噻噻吩-3- 与12相同

吩羰基) 基

丙酸乙酯23 1-甲基环 1-甲基环 1．236

丙烷羧酸丙基24 2-甲基戊 2-戊烯-2 0．812 1．091 1．923 2．523

-2-烯酸 -基 0．882 1．13525 2-糠酸呋喃基 0．709 1．14626 5-甲基噻吩 5-甲基噻 0．533 1．514

-2-羧酸吩-2-基27 1-甲基环 1-甲基环 1．236

丙烷羧酸丙基28 环丙烷环丙基 0．802 1．048 2．236

羧酸若干上述化合物的其他理化数据如下：化合物理化数据6(A2) 白色粉末；熔点135-140℃；

分子量为925；m／e 596，454，321，303，275，237，219，

209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。6(A1) 白色粉末；熔点120-124℃；

分子量=907；m／e 578，303，275，257，219，191，167，

145，127，113，111，95和87。6(B2) 白色粉末；熔点110-112℃；

分子量=911；m／e 321，303，261，257，237，219，209，

191，179，167，145，127，113，111，95和87。6(B1) 白色粉末；熔点135-138℃；

分子量=893；m／e 303，261，257，219，191，167，145，

127，113，111，95和87。8(A2) 白色粉末；熔点112-117℃；

分子量为953；m／e 624，482，349，349，331，275，265，

247，237，219，207，195，179，145，127，113，111，95和8710(A2) 白色粉末；熔点131-135℃；

分子量为951；m／e 624，480，347，329，275，263，245，

235，217，205，193，179，145，127，113，111，95和87。12(A2) 白色粉末；熔点167℃；

分子量=953；m／e 349，331，275，265，257，247，237，

219，195，145，127，113，95和87。

实施例15：环戊基阿凡曼菌素A2的回收

本实施例演示回收由环戊烷羧酸母体产物生成的阿凡曼菌素A2类的方法。过滤全部培养液(由与实施例2相同方法发酵得到)，用丙酮(3体积)两次萃取菌丝体细胞，将丙酮萃取液浓缩到含水油，再用二氯甲烷萃取油，将二氯甲烷溶液浓缩到深棕色油，再溶于甲醇／水(4∶1)，得到的溶液用己烷萃取，除去脂肪酸／类脂类。蒸馏甲醇／水，使轻棕色油含有大约10％(重量／重量)环戊基阿凡曼菌素A2。粗制品阿凡曼菌素油用三氯甲烷稀释(每克油含3毫升CHCl₃)，加入活性炭(0．35g／g油)和硅胶(1g／g油)，混合物搅拌1小时后过滤。浓缩滤液，生成的油用异丙基醚(1ml IPE／g油)稀释。将生成的溶液渐渐滴入大量的己烷(25ml己烷／g油)中，接着白色的粗制品阿凡曼菌素粉末沉淀。通过过滤，分离得到第一次收获物，然后将滤液冷却至5℃左右，沉淀出第二次收获物。

粗物品经制备高效液相色谱进一步处理，得到纯化产物。将粗制品溶于(每克粗制品粉末用4．1毫升(溶剂)IPE(250、CH₃CN(25)、乙酸乙酯(25)、己烷(50)和乙酸(0．125)。将样品注在41．4mm×25cm硅制备柱上，用上述溶剂以每分钟30毫升的速率洗脱，收集含产物的峰值。将收集到的馏分进行浓缩，然后用MeOH／HO(86／14)稀释。使1ml含有50mg左右的产物。再将样品注在C-18的制备柱(与硅柱相同大小)上，用MeOH／H₂O(275ml水，MeOH加至2升)以18～20ml／分钟速率洗脱。再次浓缩馏分和通过C-18制备柱。蒸干含有产物的馏分，得到纯的标题产物。

按上述高效液相色谱分析步骤收集适宜的馏分，回收到相应的环戊基阿凡曼菌素B2、A1和B1。

实施例16

将由YPD-2琼脂培养基得到的阿凡曼链霉菌JC 923(ATCC53669)菌丝体体接种到含有50ml AS-7培养基的300ml bafled瓶中，在30℃下振荡(220rpm)24小时。然后将1ml培养菌接种到2个300ml烧瓶(非baffle瓶)，每个烧瓶含有50ml AP-5培养基，其中一个烧瓶还含有2-甲基丁酸(0．1％)，另一个则不含2-甲基丁酸。在30℃下振荡发酵11天。每个烧瓶的培养菌均按相同方法操作。用4倍体积的过量乙腈∶甲醇(810∶75)提取整个培养基。在强裂振荡促进由细胞中提取抗菌素之后，用高效液相色谱分析澄清的上清液中所含的阿凡曼菌素。当不加脂肪酸前体时，没有检测到阿凡曼菌素(“a”型)(灵敏度≤0．20mg／l)。分别在0．5、1．3、1．4和1．1mg／l处测到有2-甲基丁酸阿凡曼菌素B2a、A2a、B1a、A1a。

实施例17

在本实施例中，按实施例16的方法，由AS-7培养菌种制备阿凡曼链霉菌JC923 (ATCC53669，CCTCC No．M87118)的AP-5生产发酵。在0．05％浓缩时存在起始化合物2-甲基丁酸。在这种情况下，未补充的对照发酵(无脂肪酸前体)分别得到的阿凡曼菌素B2a、A2a、B1a和A1a为0．3、0．9、＜0．2和＜0．2 mg／l，而补充脂肪酸的发酵则分别为2．8、5．0、4．5和2．3 mg／l。

实施例18

在本实施例中，按实施例17的方法，由AS-7菌种制备阿凡曼链霉菌JC923(ATCC53669，CCTCC No．M87118)的AP-5生产发酵液。在这个实施例的过量萃取溶剂萃取。此浓缩步骤能使阿凡曼菌素滴定测量时的灵敏度中，接种AP-5生产发酵液。在这个实施例中，接种AP-5培养基后48小时，加0．05％浓度的2-甲基丁酸，过滤收集细胞，称重(湿)，用4倍重量超过上述直接萃取全部培养基。在本实施例中，补充有2-甲基丁酸的发酵液中，测得的B2a、A2a、B1a、A1a为2．5、8．5、4．5和3．5mg／l，与之相比，未补充的对照则为0．3、0．3、0．3和0．1。后者含量较低，可能是由于在粗制AP-5生产培养基中内生脂肪酸化合物量较低的结果。

实施例19

按实施例18进行发酵，只是补充0．045％浓度的环戊烷羧酸代替2-甲基丁酸。测定环戊基阿凡曼菌素A2的浓度为4mg／l。

实施例20

阿凡曼链霉菌PGS-119(ATCC53670，CCTCC No．M87119)的发酵(16)是在30℃下培养的置于300ml烧瓶(非baffle瓶)中的50ml AP-5培养基中进行的。将1ml培养在AS-7培养基中的菌株(在置有50ml培养基的300ml baffled瓶中和30℃条件下进行培养接种到上述培养基中。在AP-5培养基中培养66小时后，将浓度为0．1％的异丁酸加到8个瓶中。采用实施例16的印迹法，这些具有补充培养基的瓶中产生的B2b、A2b、B1b和A1b分别为(2个试验的平均值)5．6、45、45和68mg／l。未加补充培养基得到的值则分别为0．5、4．0、4．5和≤8．5mg／l。别外，对于后者的发酵，未测到1．1和1．1，其相应的B2a、A2a、B1a和A1a阿凡曼菌素则为＜0．2mg／l。

实施例21

在本实施例中，在置有2ml培养菌的塑料管(15ml)中进行了阿凡曼链霉菌PGS-119(ATCC53670，CCTCC No．M87119)的4个AP-5发酵。按实施例20所述方法，在AS-7培养基和30℃条件下，在30℃斜面培养基的试管中振荡培养菌种。在将AP-5接种到2支试管后的96小时时，加入浓度为0．045％的脂肪酸前体环己烷羧酸(CHC)。在AP-5接种400小时后，将0．05ml AS-7培养菌和8ml提取溶剂(乙腈∶甲醇=810∶75)加到各个试管，用本文所述的高效液相色谱法测定上清液中的阿凡曼菌素滴定度。阿凡曼菌素CHC-B2、CHC-A2、CHC-B1、CHC-A1、A2b、B1b、A1b、A2b和A1a的浓度分别(2个试管的平均值)、为3．5、6．2、3．0、1．4、0．2、0．2、0．4、0．2、＜0．2mg／l。没有前体酸的2个发酵试管的相应值分别为＜0．2、＜0．2、＜0．2、＜0．2、4．2、2．9、9．3、1．2、0．3 mg／l。其他所有天然阿凡曼菌素基本上没有测到。

Claims

1．一种制备下式的阿凡曼菌素的方法，式中22-23位上的虚线代表有或无另一个键；R¹代表羟基，它仅在没有双键时才存在；R²为下式的4′-(α-L-齐墩果糖酰基)-α-L-齐墩果糖酰氧基，R³为氢或甲基；以及R是

环丁基，

环戊基，

环己基，

环庚基，

3-环己烯基，

1-环己烯基，

4，4-二氟环己基，

异丙基，

仲丁基，

2-噻吩基，

3-噻吩基，

4-四氢吡喃基，

3-呋喃基，

3-四氢噻吩基，

4-四氢噻喃基，

4-甲氧基-2-丁基，

1-甲硫基乙基，

2-戊基，

1-甲基-3-丁烯基，

1-甲基-1-丁烯基，

4-戊烯-2-基，

环己烯-1-基，

1-甲基环丙基，

2-戊烯-2-基，

2-呋喃基，

5-甲基噻吩-2-基，

环丙基，

3-硫杂环丁烷基，

4-外亚甲基环己烷基，或

2-四氢呋喃基；

所述方法包括：使用缺失分支2-氧代酸脱氢酶活性和分支氨基酸转氨酶活性之一或两者的并且能够在异丁酸或2-甲基丁酸存在下通过发酵产生天然阿凡曼菌素的阿凡曼链霉菌菌株在含水营养培养基中进行需氧发酵，以及分离所述阿凡曼菌素；其中所述的培养基含有可同化的氮源、碳源、无机盐和其中R如上定义的式RCOOH化合物或可被阿凡曼链霉菌转化成所述化合物的下述化合物：式R-CH₂OH化合物，式中R为环丁基或环戊基；式R-CHO化合物，式中R为噻吩-3-基；式R-(CH₂)₂COOH化合物，式中R为环戊基或环己基；式R-(CH₂)₂CH₂OH化合物，式中R为环戊基；式R-CH₂NH₂化合物，式中R为环丁基；或式R-COOCH₂CH₃化合物，式中R是环丁基。

2．根据权利要求1的方法，其中阿凡曼菌为阿凡曼菌ATCC53567(CCTCC No．M87116)、ATCC53568(CCTCCNo．M87117)、ATCC53669(CCTCC No．M87118)或ATCC53670(CCTCC No．M87119)。

3．根据权利要求1的方法，其中R是环戊基、环己基或噻吩基。

4．根据权利要求1的方法，其中当R是α-支链C₃-C₈烷基时，它不是异丙基或(S)-仲丁基。

5．根据权利要求1的方法，其中R是环己基。