NO172446B - Fremgangsmaate for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin Download PDFInfo
- Publication number
- NO172446B NO172446B NO880261A NO880261A NO172446B NO 172446 B NO172446 B NO 172446B NO 880261 A NO880261 A NO 880261A NO 880261 A NO880261 A NO 880261A NO 172446 B NO172446 B NO 172446B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- atcc
- acid
- avermectins
- avermitilis
- branched
- Prior art date
Links
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 title claims abstract description 125
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 title claims description 21
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 claims abstract description 73
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 42
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 72
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 33
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 21
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 20
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 claims description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 claims description 3
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000006552 (C3-C8) cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000081 (C5-C8) cycloalkenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006350 alkyl thio alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000000590 parasiticidal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002297 parasiticide Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 69
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- JBDSSBMEKXHSJF-UHFFFAOYSA-N cyclopentanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCC1 JBDSSBMEKXHSJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 33
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 29
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- -1 (S)-sec-butyl ( 1-methylpropyl) Chemical group 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 18
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 18
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 17
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 16
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 11
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 10
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical class CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- UAXOELSVPTZZQG-UHFFFAOYSA-N tiglic acid Natural products CC(C)=C(C)C(O)=O UAXOELSVPTZZQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 description 6
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N oligomycin A Natural products CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- LMXOHSDXUQEUSF-YECHIGJVSA-N sinefungin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[C@H](CC[C@H](N)C(O)=O)N)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LMXOHSDXUQEUSF-YECHIGJVSA-N 0.000 description 6
- MNULEGDCPYONBU-UIXCWHRQSA-N (1R,4E,5'S,6S,6'S,7R,8S,10R,11R,12S,14R,15S,16R,18Z,20Z,22R,25S,27R,28S,29R)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-[(2R)-2-hydroxypropyl]-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C\[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C/C=C\1)[C@@H]2C MNULEGDCPYONBU-UIXCWHRQSA-N 0.000 description 5
- MNULEGDCPYONBU-CBLVMMTCSA-N (1R,4Z,5'S,6S,6'S,7R,8S,10R,11R,12S,14R,15S,16R,18Z,20Z,22R,25S,27R,28S,29R)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-[(2R)-2-hydroxypropyl]-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C/C=C\1)[C@@H]2C MNULEGDCPYONBU-CBLVMMTCSA-N 0.000 description 5
- MNULEGDCPYONBU-WABYXMGOSA-N (1S,4E,5'R,6R,6'R,7S,8R,10S,11S,12R,14S,15R,16S,18E,22S,25R,27S,28R,29S)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC[C@H]1CC[C@H]2O[C@@]3(CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O3)[C@H](C)[C@@H](OC(=O)\C=C\[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@](C)(O)[C@H](O)[C@@H](C)C\C=C\C=C1)[C@H]2C MNULEGDCPYONBU-WABYXMGOSA-N 0.000 description 5
- MNULEGDCPYONBU-QECWTJOCSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-QECWTJOCSA-N 0.000 description 5
- MNULEGDCPYONBU-BOXGPLBDSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11s,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-BOXGPLBDSA-N 0.000 description 5
- MNULEGDCPYONBU-YOKYSHDFSA-N (5'R,10S,11R,12S,14S,15R,16R,18R,19S,20R,26R,29S)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2S)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C=CC(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)C=CC=CC(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YOKYSHDFSA-N 0.000 description 5
- MNULEGDCPYONBU-MQLHLVDXSA-N CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C\[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C\C=C\1)C2C Polymers CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C\[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C\C=C\1)C2C MNULEGDCPYONBU-MQLHLVDXSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- DBDJCJKVEBFXHG-UHFFFAOYSA-N L-Oleandrose Natural products COC1CC(O)OC(C)C1O DBDJCJKVEBFXHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- VZFUCHSFHOYXIS-UHFFFAOYSA-N cycloheptane carboxylic acid Natural products OC(=O)C1CCCCCC1 VZFUCHSFHOYXIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 4
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBDJCJKVEBFXHG-BNHYGAARSA-N Oleandrose Natural products O(C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](C)O[C@H](O)C1 DBDJCJKVEBFXHG-BNHYGAARSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 4
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 4
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 101710116650 FAD-dependent monooxygenase Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101710128228 O-methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 3
- 229950008974 sinefungin Drugs 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 3
- FFAADXOKPZHULO-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropanethioic s-acid Chemical compound CC(C)C(S)=O FFAADXOKPZHULO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVBFMEVBMNZIBR-UHFFFAOYSA-N 2-methylvaleric acid Chemical compound CCCC(C)C(O)=O OVBFMEVBMNZIBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHCCAYCGZOLTEU-UHFFFAOYSA-N 3-furoic acid Chemical compound OC(=O)C=1C=COC=1 IHCCAYCGZOLTEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CCC(C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IBSREHMXUMOFBB-JFUDTMANSA-N 5u8924t11h Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O3)C=C[C@H](C)[C@@H](C(C)C)O4)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 IBSREHMXUMOFBB-JFUDTMANSA-N 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- JVGWUGTWQIAGHJ-DFAYUBCLSA-N Avermectin A2a Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](C(C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](OC)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 JVGWUGTWQIAGHJ-DFAYUBCLSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- JVGWUGTWQIAGHJ-UHFFFAOYSA-N avermectin A2a Natural products C1C(O)C(C)C(C(C)CC)OC11OC(CC=C(C)C(OC2OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C2)C(C)C=CC=C2C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(OC)C3OC2)O)CC4C1 JVGWUGTWQIAGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVGWUGTWQIAGHJ-DRBFDSOZSA-N avermectin a2 Chemical compound C1C(O)[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](OC2OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](OC)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 JVGWUGTWQIAGHJ-DRBFDSOZSA-N 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 150000002185 fatty acyl-CoAs Chemical class 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 2
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNVOMSDITJMNET-UHFFFAOYSA-N thiophene-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C=1C=CSC=1 YNVOMSDITJMNET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N (1s,4r,5z,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,18r,19r,20s,21e,26r,27s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@H]1CC[C@H](\C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)C(C)C(=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]2C)C1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N 0.000 description 1
- UBQZUBPODLPCFG-PIBDHAAFSA-N (2S)-2-amino-4-[[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl-ethylsulfonio]butanoate Chemical compound CC[S+](CC[C@@H](C([O-])=O)N)C[C@H]([C@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 UBQZUBPODLPCFG-PIBDHAAFSA-N 0.000 description 1
- OVBFMEVBMNZIBR-RXMQYKEDSA-N (2r)-2-methylpentanoic acid Chemical compound CCC[C@@H](C)C(O)=O OVBFMEVBMNZIBR-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N (4Z,18Z,20Z)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)\C=C/C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)C\C=C/C=C\C(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N 0.000 description 1
- 239000001373 (E)-2-methylpent-2-enoic acid Substances 0.000 description 1
- RELMFMZEBKVZJC-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-trichlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1Cl RELMFMZEBKVZJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLUXAKJPHJEFKL-UHFFFAOYSA-N 1-ethylcyclobutane-1-carboxylic acid Chemical compound CCC1(C(O)=O)CCC1 XLUXAKJPHJEFKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006025 1-methyl-1-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- XFOASZQZPWEJAA-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutyric acid Chemical compound CC(C)C(C)C(O)=O XFOASZQZPWEJAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJYWRQLLQAKNAD-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-2-pentenoic acid Natural products CCC=C(C)C(O)=O JJYWRQLLQAKNAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVRZYSHVZOELOH-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-4-pentenoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)CC=C HVRZYSHVZOELOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJYWRQLLQAKNAD-PLNGDYQASA-N 2-methyl-2-pentenoic acid Chemical compound CC\C=C(\C)C(O)=O JJYWRQLLQAKNAD-PLNGDYQASA-N 0.000 description 1
- AYEGPMGNMOIHDL-UHFFFAOYSA-N 2-methylcyclopropane-1-carboxylic acid Chemical compound CC1CC1C(O)=O AYEGPMGNMOIHDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVKMFSAVYPAZTQ-UHFFFAOYSA-N 2-methylhexanoic acid Chemical compound CCCCC(C)C(O)=O CVKMFSAVYPAZTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046716 3-Methyl-2-Oxobutanoate Dehydrogenase (Lipoamide) Proteins 0.000 description 1
- IBMXMCXCSPGCDQ-UHFFFAOYSA-N 3-cyclopentylpropan-1-ol Chemical compound OCCCC1CCCC1 IBMXMCXCSPGCDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRPLANDPDWYOMZ-UHFFFAOYSA-N 3-cyclopentylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1CCCC1 ZRPLANDPDWYOMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBIGKSZIQCTIJF-UHFFFAOYSA-N 3-formylthiophene Chemical compound O=CC=1C=CSC=1 RBIGKSZIQCTIJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003682 3-furyl group Chemical group O1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- CIFSKZDQGRCLBN-UHFFFAOYSA-N 3-methylcyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound CC1CCCC(C(O)=O)C1 CIFSKZDQGRCLBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001541 3-thienyl group Chemical group S1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- WSSSPWUEQFSQQG-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-1-pentene Chemical compound CC(C)CC=C WSSSPWUEQFSQQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000254032 Acrididae Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001147657 Ancylostoma Species 0.000 description 1
- 241000258993 Anthrenus museorum Species 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000257161 Calliphoridae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000253350 Capillaria Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- GOYBREOSJSERKM-UHFFFAOYSA-N D-oleandrose Natural products O=CCC(OC)C(O)C(C)O GOYBREOSJSERKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000243990 Dirofilaria Species 0.000 description 1
- 241000510032 Ellipsaria lineolata Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000498256 Enterobius Species 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000257226 Muscidae Species 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000017879 Nasturtium officinale Nutrition 0.000 description 1
- 240000005407 Nasturtium officinale Species 0.000 description 1
- 241000498271 Necator Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 240000009164 Petroselinum crispum Species 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241000244174 Strongyloides Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000130767 Tineidae Species 0.000 description 1
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 description 1
- 241001489151 Trichuris Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000895 acaricidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000642 acaricide Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000000921 anthelmintic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124339 anthelmintic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125687 antiparasitic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- AFSHKCWTGFDXJR-HLFFGZBOSA-N avermectin a1 Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](OC2OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](OC)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 AFSHKCWTGFDXJR-HLFFGZBOSA-N 0.000 description 1
- ZPAKHHSWIYDSBJ-QDXJZMFISA-N avermectin b2 Chemical compound O1C(C)C(O)C(OC)CC1OC1C(OC)CC(O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)C(O)C4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)OC1C ZPAKHHSWIYDSBJ-QDXJZMFISA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- MJAMCTLGWXIKOT-UHFFFAOYSA-M benzyl-dimethyl-[2-[2-[2-methyl-4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethyl]azanium;hydroxide Chemical compound [OH-].CC1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 MJAMCTLGWXIKOT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- TXWOGHSRPAYOML-UHFFFAOYSA-N cyclobutanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCC1 TXWOGHSRPAYOML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPOPOPFNZYPKAV-UHFFFAOYSA-N cyclobutylmethanol Chemical compound OCC1CCC1 WPOPOPFNZYPKAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJZLEGIHUQOJBA-UHFFFAOYSA-N cyclohexane propionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1CCCCC1 HJZLEGIHUQOJBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADLKZHGHNJBOOC-UHFFFAOYSA-N cyclopent-3-en-1-ylmethanol Chemical compound OCC1CC=CC1 ADLKZHGHNJBOOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYRZPBDTPRQYKG-UHFFFAOYSA-N cyclopentene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CCCC1 PYRZPBDTPRQYKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISQVBYGGNVVVHB-UHFFFAOYSA-N cyclopentylmethanol Chemical compound OCC1CCCC1 ISQVBYGGNVVVHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 239000013057 ectoparasiticide Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000079386 endoparasite Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 244000000050 gastrointestinal parasite Species 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000926 not very toxic Toxicity 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- UNCAXIZUVRKBMN-UHFFFAOYSA-N o-(4-methylphenyl) chloromethanethioate Chemical compound CC1=CC=C(OC(Cl)=S)C=C1 UNCAXIZUVRKBMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOYBREOSJSERKM-ACZMJKKPSA-N oleandrose Chemical compound O=CC[C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O GOYBREOSJSERKM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 229930191479 oligomycin Natural products 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- AVPKHOTUOHDTLW-UHFFFAOYSA-N oxane-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCOCC1 AVPKHOTUOHDTLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014837 parasitic helminthiasis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 235000011197 perejil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- JSSXHAMIXJGYCS-UHFFFAOYSA-N piperazin-4-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1CNCCN1 JSSXHAMIXJGYCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- QBERHIJABFXGRZ-UHFFFAOYSA-M rhodium;triphenylphosphane;chloride Chemical compound [Cl-].[Rh].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QBERHIJABFXGRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010075550 termamyl Proteins 0.000 description 1
- BTYQWISIPUWRJR-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 3-(2-methoxy-2-oxoethyl)piperidine-1-carboxylate Chemical compound COC(=O)CC1CCCN(C(=O)OC(C)(C)C)C1 BTYQWISIPUWRJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- BSNQHVPRAPQLSW-UHFFFAOYSA-N thiolane-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCSC1 BSNQHVPRAPQLSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QERYCTSHXKAMIS-UHFFFAOYSA-N thiophene-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CS1 QERYCTSHXKAMIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- DBGVGMSCBYYSLD-UHFFFAOYSA-N tributylstannane Chemical compound CCCC[SnH](CCCC)CCCC DBGVGMSCBYYSLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XREXPQGDOPQPAH-QKUPJAQQSA-K trisodium;[(z)-18-[1,3-bis[[(z)-12-sulfonatooxyoctadec-9-enoyl]oxy]propan-2-yloxy]-18-oxooctadec-9-en-7-yl] sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCC(OS([O-])(=O)=O)C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(CCCCCC)OS([O-])(=O)=O)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(CCCCCC)OS([O-])(=O)=O XREXPQGDOPQPAH-QKUPJAQQSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015192 vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/10—Anthelmintics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Det beskrives Streptomyces avermitilis som mangler transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer og/eller dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og fremgangsmåter for fremstilling av stammen og dens anvendelse til fremstilling av naturlige og ikke-naturlige avermectiner egnet som parasitticider.
Description
Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av ikke-naturlige avermectiner med stammer av Streptomyces avermitilis som mangler transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer og/eller dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer som beskrevet i krav 1.
US-patent 4.310.519 og 4.429.042 beskriver avermectinene, som utgjør et kompleks av beslektede midler med betydelig antiparasittisk aktivitet, og deres fremstilling ved aerob fermentering av stammer av Streptomyces avermitilis; nemlig S. avermitilis ATCC nr. 31267, 31271 og 31272. De to siste av de angitte stammer utgjør henholdsvis en dypfryst ampulle og et lyofilisert rør av en kultur oppnådd ved ultrafiolett bestråling av S. avermitilis ATCC 312 67.
EP 214.731 av 18. mars, 1987, beskriver en rekke forbindelser (her omtalt som ikke-naturlige avermectiner) som er beslektet med de naturlige eller kjente avermectiner, men som har en ny substituentgruppe i 25-stillingen, samt en fremgangsmåte for fremstilling av disse ved fermentering av en avermectin-dannende organisme i nærvær av visse nærmere angitte karboksylsyrer, eller derivater eller forløpere derav (precursors). S. avermitilis-orqanismer benyttet til fremstilling av de nevnte nye C-25-substituerte avermectiner er S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121. Sistnevnte organisme, beskrevet i EP 214.731, oppnås fra S. avermitilis ATCC 31271. Denne gir forbedret utbytte av de nye C-25-substituerte avermectiner når den dyrkes i et "semi-defined" medium. Både ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121 kan i tillegg til de nye C-2 5-substituerte derivater, også produsere varierende mengder av de kjente eller naturlige avermectiner, hvor 25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl (1-metylpropyl).
Karbonskjelettet av avermectinene (vist nedenfor i formel (I)) skriver seg fra acetater og propionater og C-25-substituenten av naturlige avermectiner fra L-isoleucin (R=(S)-sek-butyl) eller L-valin (R=isopropyl) [Fisher & Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) Ch. 14] .
Ved "kjente" eller "naturlige" avermectiner menes de avemectiner som produseres av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 og ATCC 31272, hvor substituenten i 25-stillingen enten er isopropyl eller (S)-sek-butyl (1-metylpropyl). Avermectiner hvor substituenten i 25-stillingen er forskjellig fra isopropyl eller sek-butyl (S-form) omtales her som nye eller ikke-naturlige avermectiner.
Stammene av S. avermitilis angitt i ovennevnte US-patenter danner en klasse av substanser som der generisk er beskrevet som C-076. Klassen omfatter åtte distinkte, men nært beslektede forbindelser beskrevet som C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. "a"-serien av forbindelser refererer til de naturlige avermectiner hvor 25-substituenten er (S)-sek-butyl, og "b"-serien til de hvor 25-substituenten er isopropyl. Betegnelsene "A" og "B" refererer til avermectiner hvor 5-substituenten er henholdsvis metoksy eller hydroksy. Endelig, viser tallet "l" til avermectiner som i 22-23-stillingen har en dobbeltbinding; og tallet "2" til avermectiner som har et hydrogen i 22-stilling og hydroksy i 23-stilling.
I denne søknad benyttes ingen slike kjennemerker for 25-substituenten i ikke-naturlige avermectiner. Kjennemerkene Al, A2, Bl og B2 er bibeholdt for å angi ikke-naturlige avermectiner som har strukturelle trekk som korresponderer med det som ovenfor er angitt for naturlige avermectiner.
Frembringelse av mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede a-ketosyrer er beskrevet for Bacillus subtilis, Willecke & Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72
(1971) og Pseudomonas putida. Martin et al., J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973), men ikke for Streptomyces.
S. avermitilis Agly-1, en mutant stamme som praktisk talt bare produserer avermectin aglykon Ala og A2a, er rapportert av Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 (1985). Fermentering av S. avermitilis Agly-1 i nærvær av sinefungin, som forårsaket øket produksjon av avermectin aglykon B-komponenter, er også rapportert. Likeledes resulterte S. avermitilis 08, en høytytende stamme for avermectiner, ved fermentering i nærvær av sinefungin som hemmer av O-metyl-transferaser, i produksjon av avermectiner som manglet 0-metylgrupper på aglykonet ved C-5 og i oleandrose-disakkarid-delen.
US-patent 4.378.353 beskriver C-076-relaterte forbindelser og deres fremstilling ved dyrking av MA-5218, en mutant av S. avermitilis ATCC 31272 som oppnås fra denne ved ultrafiolett bestråling. Mutanten er betegnet ATCC 31780. De C-076-relaterte forbindelsene som fremstilles av mutanten, mangler C-076-furanringen. I enkelte av de omtalte forbindelsene er én eller begge oleandrosesukker-delene dessuten avspaltet mens gruppen i 5-stilling hos andre er oksydert til en ketogruppe.
Tre klasser av O-metyltransferase-mutanter av S. avermitilis som danner avermectiner med manglende 0-metylgrupper, er beskrevet av Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Ungarn, august 26-30 (1985) og Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987). Den første klassen produserer primært B-avermectiner fordi de mangler evne til metylering av C-5 hydroksylgruppen i den makrocykliske laktonring. Den andre klassen danner 3'-0, 3"-0-bis-demetylavermectiner (avermectiner som mangler O-metylsubstituenten i 3-stillingen i begge oleandrose-monosakkarid-restene), og refereres til som demetylavermectiner. Den tredje klassen er ute av stand til å metylere i noen som helst posisjon.
Schulman et al., Fed. Proe. 44, 931 (1985) beskriver øket produksjon av B-avermectiner ved fermentering av S. avermitilis i nærvær av substanser som sinefungin, S-adenosyl-etionin og S-adenosylhpmocystein som hemmer avermectin-B-O-metyltransferaseenzymet i å metylere C-5 hydroksgruppen i aglykon-delen. Streptomyces avermitilis-mutanter som mangler O-metyltransferaseaktivitet og produserer økede mengder avermectin-B-komponenter, er også beskrevet av Schulman et al., i Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29., 620-624
(1986).
Mutagenese av S. avermitilis fører til mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer eller transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer. Mutagenese av de således frembragte enkeltblokkerte mutanter fører til mutanter som mangler både dehydrogenaseaktivitet for 2-oksosyrer og transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer. Mutantene har ikke lenger evnen til å danne vesentlige mengder av de naturlige avermectiner når det under fermenteringsprosessen mangler tilsatt RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller en forbindelse som kan omdannes til RCOOH. Det er nå høyst overraskende funnet at mutantene danner avermectiner, naturlige og ikke-naturlige, ved fermentering i nærvær av en tilsatt forbindelse R-COOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl eller en annen nærmere angitt gruppe, eller i nærvær av en forløper til den nevnte RCOOH. Enda mer overraskende er det at de her beskrevne mutanter, som kun mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, og som er ute av stand til å nedbryte L-isoleucin eller L-valin, kan assimilere et bredt utvalg av forbindelser via avermectin-biosyntesen under produksjon av ikke-naturlige avermectiner som er fri for naturlige avermectiner.
Minst like overraskende er det funn at de her beskrevne mutanter som mangler transaminase for forgrenede aminosyrer og som ikke kan nedbryte L-isoleucin, L-leucin eller L-valin og for sin vekst trenger disse tre aminosyrer, også er i stand til å assimilere andre forbindelser slik at det dannes ikke-naturlige avermectiner som er fri for naturlige avermectiner.
De naturlige avermectiner fremstilles som en kompleks blanding av åtte distinkte, men nær beslektede forbindelser; formel (I), R=isopropyl og (S)-sek-butyl. Selv om.de har kunnet isoleres i tilnærmet ren form (se US-patent 4.429.042) er metodikken, i beste fall, omstendelig. Fremstillingen av ikke-naturlige avermectiner i henhold til fremgangsmåten beskrevet i EP 214.731 kan også danne noen av de naturlige avermectiner i varierende mengder som følge av forekomsten av dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer, og av aminosyrene L-valin og L-isoleucin i cellene av de S. avermitilis mikroorganismer som benyttes for deres fremstilling.
Muligheten for å velge å fremstille enten naturlige eller ikke-naturlige avermectiner slik at antallet og kompleksisi-teten av produktene reduseres og renheten av det valgte avermectin således kan økes, og separasjonsteknikken dermed kan forenkles, har vært et ønskelig mål.
S. avermitilis-stammer som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer eller transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, produseres ved mutasjon av avermectin-produserende stammer av S. avermitilis og spesielt ved mutasjon av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 eller NCIB 12121. Videre mutasjon av den ene av de nevnte minus-stammer fører til stammer som mangler begge aktiviteter. Mutantene kan ikke syntetisere naturlige avermectiner uten at fettsyren, eller en forløper til denne, som har isopropyl-eller sek-butyl- (S-form) gruppen, tilsettes til fermenteringsmediet for mutantene. De er i stand til produksjon av naturlige og ikke-naturlige avermectiner ved fermentering under vandige aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder en passende "primer"-syre eller en forbindelse som kan omdannes til en sådan under fermenteringsprosessen.
Mutanter som er karakterisert ved deres manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, isoleres fra de muterte koloniene på basis av en <1A>C02-bestemmelse. Ved denne teknikk indikerer manglende <1*>C02-utvikling i en permeabilisert koloni fra et substrat av [14C-1] -2-okso-isokapronsyre eller [<14>C-1]-2-okso-3-metyl-valeriansyre eller av [UC-1]-2-okso-3-metyl-smørsyre at dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer mangler.
Mutanter som karakteriseres ved deres manglende aminosyre-transaminaseaktivitet, selekteres fra de muterte koloniene på basis av deres manglende evne til å vokse i et medium som mangler L-isoleucin, L-leucin og L-valin. I praksis overføres enkeltkolonier som vokser på et M9-salt/glukose-basert agarmedium supplert med samtlige individuelle aminosyrer som finnes i casaminosyre, til et tilsvarende medium uten L-isoleucin, L-leucin og L-valin. De her beskrevne mutanter som kun mangler transferaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, er i stand til å benytte 2-oksosyrer som forløpere for dannelse av avermectiner.
Det var overraskende og uventet at de her beskrevne mutanter som manglet dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og/eller transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, bibeholdt evnen til å produsere avermectiner, spesielt ikke-naturlige avermectiner. Mutantenes manglende evne til å fremstille naturlige fett-acyl koenzym A-derivater ved vekst på et konvensjonelt medium, kunne ha vært en letal mutasjon dersom membranintegriteten hadde vært avhengig av de nevnte derivater, eller dersom 2-oksosyre-akkumulering av førstnevnte mutant hadde ført til cytotoksisitet. Det var dessuten ikke forventet at noen av mutantene skulle være i stand til å syntetisere acetyl-CoA og propionyl-CoA ved nedbrytende metabolisme av L-isoleucin og L-valin, idet dette fordrer de enzymaktiviter som mutantene mangler. Behovet for disse ovennevnte acyl-CoA-derivater for avermectin-biosyntese har ført til den antagelse at mutantene ved produksjon av ikke-naturlig avermectin, kunne være alvorlig svekket, noe som altså ikke var tilfellet.
Den manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer i de her beskrevne mutanter, resulterer i at syntese av forgrenet-fett-acyl-CoA fra nedbrytning av L-isoleucin, L-leucin og L-valin, og derved, syntesen av naturlige avermectiner, forhindres. Tilsvarende, har også de forgrenet-aminosyre-transaminase-negative mutanter av S. avermitilis denne karakteristiske mangel på forgrenet-fett-acyl-CoA-syntese. De mangler derved evnen til å fremstille naturlige avermectiner. Denne mangel på fett-acyl-CoA har to grunner. For det første er slike transaminase-negative mutanter ikke i stand til å syntetisere forgrenede 2-oksosyrer fra medie-tilført isoleucin, leucin og valin via den normale transamineringsvei. For det annet hindres produksjonen av forgrenede 2-oksosyrer via den cellulære biosyntesevei for forgrenede aminosyrer, i disse transaminasemutanter av det nødvendige nærvær av disse aminosyrene i vekstmediet. Forekomsten av disse aminosyrene stenger denne biosyntesevei (og produksjon av de intermediære 2-oksosyrene) som følge av velkjente mekanismer for enzymrepresjon og feedback-hemming via aminosyre-sluttproduktene. Ved at disse 2-oksosyrene, som er substrater for det aktive dehydrogenaseenzym for forgrenede 2-oksosyrer, ikke er tilgjengelige, forhindres syntesen av forgrenet-fett-acyl-CoA effektivt. Foreliggende oppfinnelse omfatter således bruk av slike 2-oksosyre-dehydrogenase-negative og transaminase-negative mutanter, samt mutanter hvor både de forgrenet-transaminase-negative og 2-oksosyre-dehydrogenase-negative mutasjoner er kombinert.
Aktuelle mutanter kan utvikles ved hjelp av transformasjon, transduksjon, genetisk rekombinasjon eller annen genetisk teknikk, ved å benytte en nukleinsyre eller ekvivalent materiale fra de her beskrevne arter som har oppnådd de karakteristiske sider ved de her beskrevne mutanter.
Uttrykket "avermectin" eller "avermectiner" refererer til forbindelser som har den senere angitte formel (I), men hvor 25-substituenten (R) kan være en hvilken som helst gruppe i denne posisjon som kan assimileres av S. avermitilis i henhold til oppfinnelsen.
De her beskrevne mutanter er meget verdifulle for fremstilling av ikke-naturlige avermectiner etter de fremgangsmåter som det her vil bli gitt eksempler på. De er spesielt verdifulle for fremstilling av foretrukne avermectiner, dvs. forbindelser hvor C-25-substituenten er C<,-C6-cykloalkyl eller cykloalkenyl, eventuelt substituert med Cj-C<,-alkylgrupper; 1-metyltioetyl, eller en fem- eller seks-leddet oksygen- eller svovel-heterocyklisk gruppe, spesielt 3-tienyl eller 3-furyl.
Mutering av en avermectin-produserende stamme av Streptomyces avermitilis oppnås ved kjente teknikker som benytter én av flere mutasjonsforårsakende midler, innbefattet ultrafiolett bestråling, røntgenbestråling, N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin, etylmetansulfonat, salpetersyrling og nitrogen-sennepsgasser, f.eks. N-metylbis(2-kloretyl)amin, eller lignende. Mutagenesen kan foretas på sporer eller på en vegetativ kultur av S. avermitilis som er i stand til å produsere naturlige avermectiner, f.eks. S. avermitilis ATCC 31272.
Ved å følge fremgangsmåter som er velkjente på dette fagområdet, selekteres mutageniserte kolonier på manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, på basis av en biokjemisk metode som gjør det mulig å gjennomsøke et stort antall vilkårlig mutageniserte bakteriekolonier ved <14>C02-produksjon fra [<1>AC-1]-2-oksosyrer (Tabor et al., J. Bact. 128, 485-486, 1976).
Metodikken består i å dyrke mutantkoloniene i brønner i en mikrotiter-plate på et egnet næringsmedium, permeabilisere cellene med toluen og deretter tilsette [<14>C-1]-2-oksosyren (f.eks. 2-oksoisokapronsyre) til hver brønn og kontrollere den overstående atmosfære på 14C02. Alternativt kan [14C-1]-2-okso-3-metylvaleriansyre eller [<14>C-1]-2-okso-3-metylsmørsyre benyttes i stedet for [<1>AC-1]-2-okso-isokapronsyre. Utviklingen av <1*>C02 kontrolleres hensiktsmessig ved å anbringe fuktet Ba (OH) 2-mettet filtrerpapir over de enkelte brønner for å fange opp eventuelt frigjort 14C02 og påvise eventuelt dannet Ba14C03 ved autoradiografi. Mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, gir autoradiogrammer som ligger nær opp til de ubehandlede kontrollene; dvs. Ba<14>C03 produseres ikke av mutantene.
De således oppnådde mutanter utsettes deretter for videre mutagense ved å benytte et av de ovennevnte
mutasjonsforårsakende midler. Mutageniserte kolonier selekteres med henblikk på manglende transferaseaktivitet for forgrenede aminosyrer på basis av deres manglende evne til å vokse på M9/glukose minimalplater unntatt når disse inneholder L-isoleucin, L-leucin og L-valin (ILV). Samtlige tre aminosyrer må være tilstede for at det skal inntre vekst. Det har dessuten vært vist at disse transaminase-negative mutanter ikke vokser på medier supplert med alle tre av de ketosyrene som tjener som substrater for transaminase-reaksjonene. Et
enkelt transaminaseenzym katalyserer således transamineringen av hver av de tre ketosyrene (2-okso-3-metylvaleriansyre, 2-okso-isokapronsyre, 2-okso-isovaleriansyre).
De dobbeltblokkerte mutantene, de som mangler både dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, er av spesiell interesse da sannsynligheten for at de skal revertere til kulturer som danner de naturlige avermectiner, er ytterst liten. De enkeltblokkerte mutantene kan under visse omstendigheter revertere til kulturer som kan danne naturlige avermectiner.
I tillegg til dannelse av ønskede alleler av en gitt mikroorganismestamme ved mutagenese, muliggjør protoplastsammensmelting at ønskede alleler, produsert/identifisert i en stamme, overføres til kromosomet av en annen stamme. For eksempel kan én stamme av S. avermitilis som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, ved protoplastsammensmelting med en S. avermitilis-stamme som har de nevnte aktiviteter, frembringe en stamme av S. avermitilis som kun mangler transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer. Som fagmannen vil innse muliggjør teknikken som tillater sammensmelting av protoplaster, kombinasjon av ønskelige alleler fra divergente seleksjonslinjer i en enkelt stamme. Den her beskrevne S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669), en stamme som mangler transaminase for forgrenede aminosyrer, ble frembragt ved hjelp av denne teknologi.
De morfologiske og dyrkningsmessige karakteristika for mutantene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, er generelt som beskrevet i US-patent 4.429.042. Særtrekkene ved mutantene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, utgjøres av deres mangel på dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, og/eller på transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, og disse karakteristika bestemmes som her beskrevet. Disse aktivitetsmangler resulterer i svikt når det gjelder mutantens evne til å produsere naturlige avermectiner ved dyrking i et definert medium som i det vesentlige er fritt for fettsyrer RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller forbindelser som kan omdannes til nevnte RCOOH under fermentering. En taksonomisk undersøkelse foretatt ved American Type Culture Collection har bekreftet at de karakteristiske trekk for to mutante stammer 1-3 og HL-026, selektert ved den ovenfor angitte <14>C02-bestemmelse, er nær beslektet med opphavsstammen av ATCC 31272 beskrevet i US-patent 4.429.042, dog med visse unntak. Mutantstammen 1-3 (ATCC 53567) danner således færre sporekjeder enn ATCC 31272, og mutantstammen HL-026 (ATCC 53568) er praktisk talt uten luftmycel og sporer, men de meget få sporekjeder den danner, er av en tilsvarende karakter som hos ATCC 31272. Mutanten HL-026 oppviser dessuten en usikker evne til å utnytte raffinose som eneste karbonkilde, mens ATCC 31272-stammen og mutant 1-3-stammen kan benytte raffinose. (I forsøk utført av søkerne, syntes raffinose ikke å opprettholde veksten av noen av disse stammer). Et ytterligere karakteristikum ved den mutante stamme HL-026 var at den dannet mindre melaninpigment enn de andre to stammene og ikke noe i det hele tatt på tyrosinagar. I motsetning til hva som er angitt i beskrivelsen av ATCC 31272 i US-patent 4.429.042 har vi dessuten ikke kunnet påvise vekst av mutantene eller av ATCC 31272 med sukrose som eneste karbonkilde. Mutantene 1-3 og HL-026 er negative kun med hensyn til dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer. Den dobbelt negative mutant PGS-119 (ATCC 53670), produsert ved videre mutagenese av mutant 1-3 (ATCC 53567 og JC-923 (ATCC 53 669), oppnådd ved protoplastsammensmelting, har en lignende taksonomisk relasjon til ATCC 31272 som den mutante stamme 1-3.
Streptomyces avermitilis 1-3, HL-026 PGS-119 og JC-923 er deponert i henhold til Budapest-traktaten i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, et anerkjent depositorium som gir permanent oppbevaring og vil gi lett offentlig tilgjengelighet om denne patentsøknad innvilges. De har fått betegnelsen henholdsvis Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53670 og ATCC 53669.
Sålenge søknaden verserer er det deponerte materialet tilgjengelig etter tillatelse fra Commissioner of the United States Patent and Trademark Office i henhold til 37 CFR 1.14 og 35 USC 122, og i overensstemmelse med patentlovgivningen i andre land hvor søknaden er innlevert. Samtlige begrensninger i den offentlige tilgjengelighet til de deponerte mikroorganismer vil bli permanent fjernet ved patentets innvilgning.
Hver enkelt stamme av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 og NCIB 12121 danner de naturlige avermectinene med formel (I)
hvor den stiplede linje i 22-23-stilling utgjør en eventuell dobbeltbinding;
R<1> er hydroksy og forekommer kun når dobbeltbindingen mangler;
R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy med formel
R<3> er hydrogen eller metyl; og
R er isopropyl eller (S)-sek-butyl.
US-patent 4.285.963 beskriver et avermectin med formel (I) hvor 25-stillingen er substituert med en metyl- og en etyl-gruppe;
R<1> er hydroksy og R<3> er metyl.
I de nevnte ikke-naturlige avermectiner er R-substituenten forskjellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl og som ovenfor definert.
De essensielle forbindelser som benyttes ved biosyntese av forbindelser med formel (I) forekommer i S. avermitilis-cellen. Disse forbindelsene, L-valin, L-leucin og L-isoleucin, antas å inngå i biosyntesen av avermectiner via en omdannelse til 2-oksosyre og dekarboksylering av syren med forgrenet-2-oksosyre-dehydrogenase under samtidig kobling av produktet med koenzym A. Deres nærvær er ansvarlig for den samtidige dannelsen av både isopropyl- og (S)-sek-butylforbindelsene (I). Dette kompliserer selvsagt separeringen av isopropylderivatene fra (S)-sek-butyl-derivatene.
Ved fermentering i et næringsmedium som inneholder de passende primer-forbindelsene, danner mutantene i henhold til oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) eller, oftest, en blanding av to eller flere forbindelser med formel (I), hvor R tilsvarer den anvendte primer-forbindelse. Inntil fire produkter, hensiktsmessig betegnet R-avermectin Al, A2, Bl og B2, i henhold til betegnelsene benyttet i US-patent 4.429.042, kan dannes. "R-11-gruppen viser selvsagt til C-25-substituenten. Når R er cyklopentyl er for eksempel de fire mulige avermectinene:
I de ikke-naturlige avermectiner er C-25-substituenten "R" med formel (I) forskjellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl .
Forbindelser med formel (I) hvor dobbeltbindingen forekommer og OH mangler, kan alternativt fremstilles fra den korresponderende forbindelse (I), hvor R<1> er OH og dobbeltbindingen mangler, ved en dehydreringsreaksjon. Reaksjonen utføres ved først selektivt å beskytte hydroksygruppene i 5-og 4"-stillingene, f.eks. som t-butyl-dimetylsilyloksyacetyl-derivatet, hvorpå de omsettes med et substituert tiokarbonyl-halogenid, så som (4-metylfenoksy)tiokarbonylklorid, med påfølgende oppvarming i et høytkokende oppløsningsmiddel, f.eks. triklorbenzen, for å bevirke dehydreringen. Produktet befris tilslutt for beskyttelsesgruppen for å gi den umettede forbindelse. Disse trinn sammen med de passende reagenser og reaksjonsbetingelser, er beskrevet i US-patent 4.328.335.
Formel (I)-forbindelser hvor R<3> er H kan også fremstilles fra de korresponderende forbindelser hvor R3 er CH3, ved demetylering. Reaksjonen foretas ved å behandle 5-metoksy-forbindelsen, eller et passende beskyttet derivat derav, med kvikksølv(II)acetat og hydrolysere den resulterende 3-acetoksy-enol-eter med fortynnet syre for å oppnå 5-ketofor-bindelsen. Denne reduseres for eksempel med natriumborhydrid til 5-hydroksyderivatet. Passende reagenser og reaksjonsbetingelser for disse trinn er beskrevet i US-patent 4.423.209.
Forbindelser med formel (I) hvor R<1> er H og dobbeltbindingen mangler, kan fremstilles fra den korresponderende forbindelse hvor dobbeltbindingen forekommer og R<1> mangler, ved selektiv katalytisk hydrogenering under anvendelse av en passende katalysator. For eksempel kan reduksjonen oppnås ved å benytte tris(trifenylfosfin)rhodium(I)klorid som beskrevet i Europeisk patentpublikasjon nr. 0001689 (US-patent 4.199.569 av 22. april, 1980).
Forbindelsene med formel (I) hvor R2 er H, fremstilles fra korresponderende forbindelser hvor R2 er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy, ved å fjerne 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosegruppen ved mild hydrolyse med en syre i et vandig organisk oppløsningsmiddel for å oppnå aglykonet som har en hydroksygruppe i 13-stillingen, og som så halogeneres, for eksempel ved omsetning med et benzensulfonylhalogenid, for å gi 13-deoksy-13-halogenderivatet som tilslutt selektivt reduseres, for eksempel med tributyltinnhydrid. For å unngå uønskede bireaksjoner, er det ønskelig å beskytte eventuelle andre forekommende hydroksygrupper, for eksempel ved å benytte en tert-butyldimetylsilylgruppe. Denne fjernes deretter lett ved halogenerings- eller reduksjonstrinnet ved behandling med metanol som inneholder spor av en syre. Alle disse trinn og de passende reagenser og reaksjonsbetingelser er beskrevet i Europeisk patentpublikasjon nr. 0002615.
De forbindelser som i henhold til oppfinnelsen kan utnyttes av S. avermitilis for biosyntese av ikke-naturlige avermectiner, er forbindelser med formel (II-A)
innbefattet forbindelser som kan omdannes til (II-A) under
fermenteringsprosessen. Disse forbindelsene omtales her som "primer-forbindelser". I formel (II-A) er R en alfa-forgrenet gruppe bortsett fra isopropyl eller (S)-sek-butyl, og karbonatomet i denne som -COOH-gruppen er tilknyttet, er også bundet til minst to andre atomer eller grupper som er forskjellige fra hydrogen. Denne definisjonen omfatter selvsagt mettede og umettede acykliske og cykliske grupper, innbefattet grupper som eventuelt har et svovel- eller oksygen-heteroatom i den acykliske kjede eller cykliske ring.
Mer spesifikt, kan R, som blir C-25-substituenten, være en alfa-forgrenet C3-C8-alkyl, alkenyl-, eller
alkyltioalkylgruppe; en C3-C8-cykloalkyl- eller C5-C8-cykloalkenylgruppe, som hver eventuelt kan være substituert med én eller flere Ci-C^-alkylgrupper; eller en 3-6-leddet oksygen- eller svovelholdig heterocyklisk ring som kan være mettet eller helt eller delvis umettet, og som eventuelt kan være substituert med én eller flere Ci-C^-alkylgrupper eller halogenatomer, med det forbehold at R ikke er isopropyl eller (S)-sek-butyl.
Forbindelser som kan omdannes til RCOOH under fermenteringsprosessen, dvs. forløpere, er forbindelser med formel (II-B), hvor R er som ovenfor definert:
n er 0, 2, 4 eller 6; og Z er -CH20H, -CHO, -CH2NH2, -C00R<5 >eller -CONHR<6>, hvor R<5> er H eller (Cx_6) alkyl; R<6> er hydrogen, (C^J alkyl eller en rest av en aminosyre, spesielt asparagin-syre, glutaminsyre og metionin, f.eks. henholdsvis -CH(COOH) CH2COOH, -CH(COOH) (CH2) 2COOH og -CH(COOH) (CH2) 2SCH3. For S. avermitilis-stammer som kun mangler transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, tjener også 2-oksosyrer som forløpere. For disse stammer kan syrer med formel (II-C)
hvor R og Z er som ovenfor definert, utnyttes av de nevnte S.
avermitilis for biosyntese av avermectiner.
Innenfor rammen av denne oppfinnelse faller også de isomere former av formel-(II-A)-forbindelser og forbindelser som kan omdannes til slike under fermenteringsprosessen, samt de isomere avermectiner ved C-25 som resulterer fra anvendelse av disse i den her beskrevne fremgangsmåte.
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utføres ved aerob fermentering med en stamme av S. avermitilis som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og/eller transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, i et vandig næringsmedium som består av en assimilerbar kilde av nitrogen, karbon, uorganiske salter og en forbindelse med formel RCOOH, eller en forbindelse som kan omdannes til denne forbindelse (dvs. en forløper) under fermenteringen. Syren eller forbindelsen som kan omdannes til denne, tilsettes ved inokuleringen eller til forskjellige tider under fermenteringen. Når det benyttes en transaminase-negativ mutant, må mediet inneholde L-isoleucin, L-leucin og L-valin for å oppnå vekst av mutanten. Dannelsen av avermectin-produktene kan følges ved uttak av prøver fra fermentoren, ekstrahere dem med et organisk oppløsningsmiddel og vurdere produktet ved kromatografi, for eksempel høytrykks-væskekromatografi (HPLC). Inkuberingen fortsettes inntil maksimalt produktutbytte oppnås, i alminnelighet fra 4 til 15 dager.
En foretrukket tilsetningsmengde av primer-forbindelsene
(karboksylsyre eller forbindelse som kan omdannes dertil)
utgjør mellom 0,05 og 3,0 g per liter. Primer-forbindelsen kan tilsettes kontinuerlig, periodevis eller på én gang. Syren (RCOOH) tilsettes som sådan eller som et salt, f.eks. som natrium-, litium- eller ammoniumsaltet eller som en forbindelse som kan omdannes til syren. Utgjør syren et faststoff, oppløses det fortrinnsvis i et hensiktsmessig oppløsningsmiddel, for eksempel vann eller (C^) alkoholer.
De anvendte fermenteringsmedier kan, spesielt når C-25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl, være konvensjonelle medier som inneholder assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og sporelementer. Når C-25-substituenten skal være en ikke-naturlig gruppe; dvs. ikke er isopropyl eller (S)-sek-butyl, utgjøres dyrkningsmediet av et medium som mangler de valgte ingredienser eller som bare inneholder minimale mengder primer-forbindelser hvor R-delen er isopropyl eller (S)-sek-butyl.
Etter flere dagers fermentering ved en temperatur som fortrinnsvis ligger i området 24-33°C, sentrifugeres eller filtreres gjæringsvæsken, hvorpå mycelie-kaken ekstraheres med aceton eller metanol. Ekstraktet konsentreres, hvoretter det ønskede produkt ekstraheres over i et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, så som metylenklorid, etylacetat, kloroform, butanol eller metylisobutylketon. Ekstraktet konsentreres og råproduktet renses om nødvendig ved kromatografi, for eksempel ved preparativ, omvendt-fase HPLC.
Produktet oppnås i alminnelighet som en blanding av forbindelsene (I), hvor R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy, R<1> er OH og dobbeltbindingen mangler, eller R<1 >mangler og dobbeltbindingen forekommer, og hvor R3 er H eller CH3. Blandingsforholdet kan imidlertid variere med den spesielle mutant og primer-forbindelse som er benyttet, og med de anvendte betingelser.
Kilden for R-gruppen; dvs. hvorvidt den kommer direkte fra R-COOH eller dannes fra en av de nevnte forløpere, eller fra en hvilken som helst forløper, er uvesentlig for produksjonen av avermectinene. Avgjørende for deres fremstilling i henhold til oppfinnelsen, er at den ønskede R-gruppe under fermenteringsprosessen gjøres tilgjengelig for S. avermitilis-stammene i henhold til oppfinnelsen.
Egnede forbindelser innbefatter:
2,3-dimetylsmørsyre
2-metylheksansyre
2- metylpent-4-en-syre
3- metylcykloheksan-karboksylsyre (cis/trans) 1-cyklopenten-karboksylsyre
1- cykloheksen-karboksylsyre
tetrahydropyran-4-karboksylsyre
tiofen-2-karboksylsyre
3-furan-karboksy1syre
cyklobutan-karboksylsyre
cyklopentan-karboksylsyre
cykloheksan-karboksy1syre
cykloheptan-karboksy1syre
2- metylcyklopropan-karboksylsyre
3- cykloheksen-l-karboksylsyre
2- mety1tiopropionsyre
tiofen-3-karboksylsyre
hydroksymetylcyklopentan
3- tiofen-karboksaldehyd
3-cykloheksylpropionsyre
3-cyklopentylpropionsyre
hydroksymety1cyklobutan
tetrahydrot io fen-3-karboksylsyre
3-cyklopentyl-l-propanol
3- metylcyklobutan-karboksylsyre-litiumsalt 2-metyl-4-metyltiosmørsyre
tetrahydrotiopyran-4-karboksylsyre cyklobutylmetylamin
etyl-cyklobutankarboksylat
4- hydroksymety1cyklopenten
2-(3-tiofenkarbonyl)propionsyre-etylester (S)-2-metylpentansyre
(R)-2-metylpentansyre
Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen er meget aktive antiparasittiske midler med spesiell anvendelse som anthelmintika, ektoparasitticider, insekticider og akaricider.
Forbindelsene er således effektive ved behandling av en rekke tilstander forårsaket av endoparasitter, spesielt helminthiasis som oftest forårsakes av en gruppe parasittære ormer betegnet nematoder, og som kan forårsake alvorlige økonomiske tap av svin, sau, hest, kyr og andre husdyr, inklusivt fjærkre. Forbindelsene er også virksomme mot andre nematoder som angriper dyr, for eksempel Dirofilaria i hunder, og forskjellige parasitter som kan infisere mennesker, herunder gastrointestinale parasitter, så som Ancylostoma. Necator, Ascaris, Stronqyloides. Trinchinella. Capillaria. Trichuris, Enterobius og parasitter som forekommer i blod, vev og organer, så som filarier og ekstraintestinale stadier av Stron<q>yloides og Trichinella.
Forbindelsene har også betydning ved behandling av ektoparasittære infeksjoner, og særlig mot ektoparasittære artropoder, på dyr og fugl, så som blodmidd, midd, lus,
lopper, spyfluer, bitende insekter og migrerende to-vingelarver, som kan angripe kveg og hester.
Forbindelsene er også insekticider med virkning overfor husholdnings-skadedyr som kakerlakker, klesmøll, museumsbiller og husfluer og mot skadeinsekter på lagret korn eller på kulturplanter, så som edderkopparter, bladlus og sommerfugl-larver, samt mot migrerende rettvinger, så som gresshopper.
Forbindelsene med formel (I) gis som et preparat egnet for den spesielt tiltenkte anvendelse, den spesielle art av vertsdyr som skal behandles og angjeldende parasitt eller insekt. For bruk som anthelmintikum kan forbindelsene gis peroralt i form av en kapsel, bolus, tablett eller flytende dose, eller alternativt, gis ved injeksjon eller som et implantat. Slike preparater fremstilles på konvensjonell måte i overensstemmelse med vanlig veterinærmedisinsk praksis. Kapsler, bolus-preparater eller tabletter kan således fremstilles ved å blande virkestoffet med et passende findelt fortynnings- eller bæremiddel som dessuten inneholder et sprengmiddel og/eller bindemiddel, så som stivelse, laktose, talk, magnesiumstearat etc. Et flytende preparat kan fremstilles ved å dispergere virkestoffet i en vandig oppløsning sammen med dispergerings- eller fuktemidler, og injiserbare preparater kan fremstilles i form av en steril oppløsning som kan inneholde andre substanser, for eksempel tilstrekkelige mengder av salter eller glukose til å gjøre oppløsningen isotonisk med blodet. Disse preparatene vil variere med hensyn til vekt av virkestoff, avhengig av arten av vertsdyr, grad og type av infeksjon og pasientens vekt. For peroral administrasjon gis i alminnelighet en dose på 0,001-10 mg per kg. legemsvekt som en enkeltdose eller som avdelte doser i 1-5 dager. Det vil imidlertid selvsagt være situasjoner hvor høyere eller lavere doseområder er indikert.
Som et alternativ, kan forbindelsene gis med dyrefo^ret, og i så fall kan en konsentrert fo^rtilsetning eller forblanding for tilblanding til det vanlige fo<A>r, fremstilles.
For bruk som insekticid og for behandling av skadegjørere i landbruket kan forbindelsene påføres som sprøytemiddel, dustepulver, emulsjoner og lignende, etter vanlig landbruks-praksis.
Fremstilling av S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) med manglende dehydrogenase for forgrenede 2- oksosvrer
En blanding av 8 grønnsaksafter (tomat, gulrot, selleri, bete, persille, salat, brønnkarse og spinat) pluss salt, askorbinsyre og sitronsyre og naturlige smaksstoffer. Selges av Campbell Soup Company, Camden, NJ. U.S.A.
<**>Sammensetning av sporelementoppløsningen:
De angitte forbindelser oppløses i 1 liter 0,1N HC1.
Sporer ble høstet fra tre slike plater og suspendert i
20 ml 0,05M tris-maleinsyre-buffer, pH 9,0.
Trinn 2. 10 ml av sporesuspensjonen ble tilsatt til et glass som inneholdt 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Glasset ble inkubert og ristet ved 28°C i 60 minutter, hvorpå sporene ble vasket grundig med 1% NaCl-oppløsning.
Trinn 3. De vaskede sporene ble suspendert i 1% NaCl og blandet med et like stort volum 80% etylenglykol. Suspensjonen ble oppbevart ved -20°C og benyttet som cellekilde for gjennom-søkning med henblikk på mutanter. Den ga ca. 10<4> kolonier/ml ved spiring.
Dette sporeforrådet ble utspredd på YPD-plater for å gi ca. 100 kolonier per plate (YPD-mediet besto av 10 g/liter av hver av gjærekstraktene, Bacto peptone<*> og dekstrose; og 15 g/liter Bacto agar<*>, justert til pH 6,9 før autoklavering) ingredienser merket med stjerne leveres av Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238, U.S.A.
Trinn 4♦ Enkeltkolonier ble overført fra plater etter 2-3 ukers vekst ved 28°C og anbragt i individuelle brønner i en standard 96-brønns mikrotiter-plate. Litt av kolonien ble også overført til et friskt agarmedium for å tjene som kilde av levedyktige celler ved mutant-identifiseringen.
Trinn 5. Til hver brønn ble det tilsatt ca. 75 -liter av et flytende M9-saltmedium inneholdende 1% glykose, 0,1% casaminosyre og 0,01% hver av isovalerian- og isosmør- og 2-metylsmør-syrer. Etter inkubasjon ved 28°C i flere dager, ble cellene undersøkt på nærvær av dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer. (Hver liter M9-saltmedium inneholdt 6 g Na2HPOA, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl og 1 g NH4C1. Mediet ble autoklavert, hvoretter 1 ml porsjon sterilisert IM MgSOA og 0,1M CaCl2 ble tilsatt aseptisk). Trinn 6. En mikrosuspensjon av 5% toluen i M9-saltmedium ble fremstillet ved kort ultralyd-behandling av den ikke-blandbare blanding. Til 25 ml av suspensjonen ble det tilsatt 1,2 ml av en oppløsning inneholdende [<14>C-l]-2-oksoisokapronsyre, 2,5 mikrocurie/ml og 10,0 mikrocurie/mikromol. 50 mikroliter av denne totalblanding ble tilsatt til hver brønn i mikrotiter-platen som inneholdt de kolonier som skulle måles.
Trinn 7. <14>C02 dannet i hver brønn ble fanget opp og registrert visuelt etter fremgangsmåten beskrevet av Tabor et al., J. Bacteriol. 128, 485-486 (1976) under tittelen "Convenient Method for Detecting <14>C02 in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants". Mutanter som manglet aktiv forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase dannet intet Ba<14>C03 utover hva som ble observert for kontrollene.
En mer raffinert metode som forbedrer kontrasten mellom en positiv <14>C02-registrering, tilkjennegitt ved en mørk flekk på autoradiogrammet som resultat av Ba<14>C03-dannelse, og et negativt resultat angitt ved manglende flekk eller en meget svak flekk, består i følgende modifiserte utsilingsmetode.
Enkeltkolonier (se Trinn 4 ovenfor) ble overført fra agarmediet etter 7-14 dagers vekst (i stedet for etter 2-3 uker, og bestemt direkte ifølge de ovenfor angitte Trinn 6 og 7). Trinn 5 av den ovenfor angitte metode ble utelatt.
En ytterligere forbedret bestemmelsesmetode som er kvantitativ med henblikk på <u>C02-frigjøring, består i å dyrke mutantene påvist ved de ovenfor angitte utsilingsmetoder, på et egnet medium som består av et M9-saltmedium med 1% glukose, og 0,1% "Syncasa-bcaa", (en syntetisk blanding av L-aminosyrer med tilnærmet samme sammensetning som kommersielle casaminosyrer, men uten L-valin, L-isoleucin og L-leucin; se nedenfor).
Etter vekst til høy celletetthet, ble cellene vasket i M9-saltmedium og resuspendert i et kaldt M9-saltmedium inneholdende 1% toluen og som var ultralydbehandlet for å gi en melkehvit toluendispersjon. Celle/buffer/toluensuspensjonen ble inkubert i 4 0 minutter ved 30°C for å permeabilisere cellene. De permeabiliserte cellene ble deretter vasket i M9-saltmedium og tilslutt resuspendert i 1/5 av det opprinnelige volum M9-mediumbuf f er. 180 juliter av denne suspensjon ble benyttet per bestemmelse.
Et reaksj onsvolum på 300 juliter inneholdt de tolueniserte cellene, tiaminpyrofosfat (TPP), 0,4 mmol; koenzym A (CoA), 0,11 mmol; nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD), 0,68 mmol; ditiotreitol (DTT), 2,6 mmol; MgCl2, 4,1 mmol; tris-HCl, 60 mmol; pH 7,5; og [<14>C-l]-alfa-ketoisokaproat, 6000 cpm., mikrocurie per mikromol. Telleeffektiviteten var 73%. Reaksjonen ble utført i 15 ml scintillasjonsglass som inneholdt et 2 x 2 cm Whatman #4 papirkvadrat presset inn i glassets skrulokk. Papiret inneholdt 30 /uliter IM Hyamine Hydroxide (IM oppløsning av metylbenzetoniumhydroksyd i metanol; fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, U.S.A.) som fanger opp <U>C02 utviklet under reaksjonen. Etter inkubering i 2 timer, ble papirene lagt i 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC (liguid scintillation counter) fra New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118 U.S.A.) og radioaktiviteten målt i en væske-scintallasjons-teller etter stabilisering i oppløsningsmidlet i minst 4 timer. En blindprøve (dvs. - uten celler) ga ca. 50-300 cpm.
Mutant 1-3 og tilsvarende ga tall som var mindre enn eller lik blindprøven, mens opphavs stammen ga tall som var flere ganger høyere enn blindverdien.
Isolering av HL-026-derivat (ATCC 53568)
av S. avermitilis 1- 3 ( ATCC 53567)
S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) ble strøket ut på næringsagar-plater. En relativt høy frekvens spontane varianter forekom, hvorav noen manglet luft-mycel etter 4 dagers inkubering ved 3 0°C. Noen av disse variantene ble isolert og testet på evnen til å produsere ikke-naturlige avermectiner ved dyrkning i et AP-5 medium som var tilsatt cyklopentan-karboksylsyre. Fra isolatene, hvorav mange dannet ikke-naturlige avermectiner som var fri for naturlige avermectiner, ble en stamme som ga høyere avermectin-utbytte i kolbeforsøk enn dens opphav S. avermitilis 1-3 (ATCC 53 567) gitt identifikasjonsnummer HL-026 (ATCC 53568) .
Fremstilling av forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase-negativ og forgrenet-kjede aminosyre-transaminase-negativ
S. avermitilis PGS- 119 ( ATCC 53670)
Trinn 1. Ca. 100 mg S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) dyrket på en frisk SAMM agarplate i 4 dager, ble inokulert i en 300 ml kolbe inneholdende 50 ml SCM-medium (pH 7,2). Kolben ble deretter ristet i 24 timer ved 200 rpm og 30°C (endelig pH=8,2).
Trinn 2. Kolben ble fjernet fra risteapparatet og 10 ml av hele mediet sentrifugert i et sterilt rør i 5 minutter ved 2000 rpm. Cellene ble deretter resuspendert i 50 ml SCM-medium i sterile 300 ml Erlenmeyer-kolber og kolbene ristet på et roterende risteapparat i 2 timer ved 30°C.
Trinn 3. 10 ml av suspensjonen ble anbragt i et sterilt rør. Trinn 4. Etylmetansulfonat (250 /iliter) ble tilsatt til røret (i et godt ventilert avtrekk), innholdet grundig blandet og deretter helt over i en steril 300 ml kolbe, hvorpå kolben ble ristet i et roterende risteapparat i 3 timer ved 30°C.
Trinn 5. Kolben ble tilsatt friskt sterilt SCM-medium (40 ml) og ristingen fortsatt i tilsammen 70 timer ved 3 0°C.
Trinn 6. Kolben ble tatt ut, innholdet sentrifugert ved
8000 rpm i 10 minutter ved 20°C. Cellene ble vasket ved resuspendering i SCM-medium, sentrifugert ned igjen og resuspendert i 10 ml SCM-medium.
Trinn 7. Cellene ble fjernet og bestemt via replika-dyrking, ca. 150 kolonier/skål, med henblikk på deres evne til å vokse på M9/glukose minimalskåler med eller uten L-leucin, L-isoleucin, L-valin og kombinasjoner av hver av disse aminosyrene. Mutantceller av interesse vokste kun på medier som var gitt et supplement av L-leucin, L-isoleucin og L-valin. Disse derivatene av S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), som manglet transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, var også ute av stand til å vokse på medier forsynt med én eller flere av de tre 2-oksosyrene (2-okso-isokapronsyre; 2-okso-3-metylvaleriansyre og 2-oksoisovaleriansyre) som tjener som forløper for L-leucin, L-isoleucin og L-valin. Dette er den helt omvendte oppførsel av S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) som vokser godt på slike medier. Et enkelt transaminaseenzym må således katalysere transamineringen av de nevnte 2-oksosyrene.
Blandingen ble justert til pH 7 og sterilfiltrert. En volumdel konsentrat ble tilsatt til 99 volumdeler medium for å oppnå standard brukskonsentrasjoner.
S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669) ved protoplastsammensmelting av en spectinomycin-resistent stamme av S. avermitilis ATCC 31272 og S. avermitilis PGS 119 (ATCC 53670)
Spectinomycin-resistent S. avermitilis ATCC 31272 er en spontan mutant av S. avermitilis ATCC 31272. Den ble isolert fra populasjoner av vegetativt mycel av ATCC 31272 utspredd på AS-1 agarskåler som inneholdt 50 /xg/ml speetinomycin. Sporer av mutanten som spirte på rikt medium, var resistent overfor 50 /x/ml spectinomycin i motsetning til sporer av den isogene opphavsstamme som ikke spirte under disse betingelsene. Denne lett synlige selekterbare markør ble med hell benyttet for å isolere forgrenet-kjede aminosyretransaminase-negative isolater av ATCC 31272.
Juster til pH 7,5. Autoklaver i 15 minutter ved 121°C. Hell 30-35 ml over i sterile Petri plastskåler (100 x 15 mm).
FREMGANGSMÅTER FOR FREMSTILLING AV LEVEDYKTIGE
PROTOPLASTER AV STREPTOMYCES AVERMITILIS- STAMMER
A. Sporer som inokulum
1. Sporepreparater ble fremstillet ved
standardprosedyrer (antallet levedyktige sporer bestemt ved dyrking av fortynninger på spireagar) og alikvoter dypfryst til -70°C i 40% glycerol. 2. Før bruk ble spore-forrådene sentrifugert ved 1000 g i 10 minutter og resuspendert i et tilsvarende volum 0,85% saltoppløsning. 3. Ca. 10<7> sporer ble inokulert i 30 ml modifisert gjærekstrakt-maltekstrakt-buljong (YEME) medium inneholdende 0,5% glycin (se nedenfor) i en 300 ml kolbe med tre eller fire skovler.
B. Dypfryst ultralydbehandlet mycel som inokulum
1. Myceliekulturer av PGS-119 ble dyrket i Trypticase Soy Brooth (TSB) til en turbiditet på 2-9 ved 600 nm. Kulturen ble homogenisert 10 ganger med en vevshomogenisator av glass. 2. Det homogeniserte mycel ble fortynnet 2 x i TSB og 20 ml tilsatt til et sterilt polypropylen sentrifugerør. En prøve ble dyppet 1 til 2 cm ned i væsken av et ultralydbad og prøven ultralydbehandlet ved 50% intensitet i 10 sekunder. Ultralydbehandlingen dispergerte myceliemassen i enkle eller doble celleenheter som forårsaket hurtig eksponensiell vekst ved dyrking som subkulturer. 3. Ultralydbehandlede myceliepreparater ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 40% glycerol, pipettert over i glass og dypfryst ved -70°C. 4. Alikvoter ble opptint ved romtemperatur etter behov for inokulering i YEME-medium som angitt ovenfor under Trinn A.3.
C. Kolonier på aqarmedium som inokulum
1. Seks utviklede kolonier av PGS-119 dyrket på TSA eller YPD-2 agar ble med en øse overført til 200 /uliter sterilt vann i et mikrosentrifugerør. 2. Mycelieblandingen ble homogenisert med en engangs-pistill. 3. De homogeniserte koloniene ble tilsatt til YEME-
mediet som angitt ovenfor under Trinn A.3.
D. Fremstillin<g> av protoplaster fra mycel dyrket i <g>lycin
1. Kulturer ble inkubert i et ristebad ved 29°C i ca. 65 timer ved innstilling 8. 2. Myceliet ble iakttatt mikroskopisk under 40x fasekontrast-2-forstørrelse og oppsamlet i et polypropylen sentri-fugerer ved ca. 1475 g i 10 minutter ved 20°C. 3. Den overstående væske ble kassert og myceliepelleten ble resuspendert i 10 ml protoplast (P) buffer (se nedenfor). Pelleten ble homogenisert 5-10 ganger med en vevshomogenisator for å dispergere klumper. 4. Prøven ble sentrifugert ved ca. 1000 g i 10 minutter. Den overstående væske ble kassert og pelleten forsiktig resuspendert i 10 ml P-buffer.
5. Vasketrinnet ovenfor ble gjentatt.
6. Myceliepelleten ble resuspendert i 10 ml av en
1,0 mg/ml frisk lysozym-oppløsning i P-buffer som var sterilisert ved filtrering gjennom et 0,22 ju filter. 7. Mycelieblandingen ble inkubert i et vannbad ved 37°C under svak risting i 60 minutter. Prøvene ble resuspendert i lysozym-oppløsningen hvert 15. minutt. Prøver ble iakttatt mikroskopisk under 40x fasekontrast-belysning for registrering av protoplaster.
8. Myceliepreparater ble triturert tre ganger med en
5 ml pipette for å frigjøre protoplastene fra deres cellevegger. 9. Preparatene ble filtrert gjennom glassull eller ikke-adsorberende bomull. 10. Protoplaster ble sedimentert ved sentrifugering ved ca. 1000 g i 7 minutter, forsiktig resuspendert i 5 ml P-buffer og iakttatt under 40x fase-forstørrelse. 11. Protoplastene ble sedimentert som ovenfor og resuspendert i 1,0 ml P-buffer. Fortynninger av denne suspensjon ble foretatt i P-buffer og destillert vann og utsådd på et regenerasjonsmedium. Kolonier som oppsto fra protoplastpreparater fortynnet i destillert vann, ble antatt å skrive seg fra ufullstendige eller ikke-protoplastiserte mycelie-enheter. 12. Protoplaster ble dypfryst på is i 200-300 /xliter alikvoter ved -70°C. De ble fjernet fra isen 18-24 timer senere.
SAMMENSMELTING AV PROTOPLASTER MED POLYETYLENGLYKOL fPEG) 1000
1. Samtlige her beskrevne forsøk er foretatt med samme lot av PEG 1000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, U.S.A.) som i våre forsøk var tilsynelatende lite toksisk. 2. 1,0 g alikvoter av PEG ble autoklavert i prøveglass, tilsatt 1,0 ml P-buffer og PEG enten oppløst ved oppvarming av glasset til 55°C eller veiet, oppløst i P-buffer og sterilfiltrert like før bruk. PEG-oppløsningene ble benyttet ved romtemperatur. 3. Protoplaster ble nyfremstillet eller opptint hurtig fra et forråd holdt ved -70°C, under rennende vann. Tilnærmet likt antall protoplaster av hver genotype ble forsiktig pipettert over i et polykarbonat sentrifugerør. For nylig fremstillede protoplastpreparater ble turbiditetene målt og flere forskjellige konsentrasjoner fusjonert. Volumet i hvert rør ble justert til 5,0 ml med P-buffer. 4. Fusjonsblandingen ble sentrifugert ved ca. 1000 g i
7 minutter.
5. Den overstående væske ble forsiktig avdekantert. Protoplast-pelleten ble forsiktig resuspendert til et sluttvolum på 2 00 -liter med P-buffer. 6. 800 /uliter 50% PEG ble hurtig tilsatt til fusjonsblandingen. Preparatet ble blandet ved å trekkes opp i en Pasteur-pipette og slippes ut igjen. Fusjonatet ble inkubert i 2 minutter ved romtemperatur. 9 ml P-buffer ble tilsatt for å fortynne PEG. Ytterligere fusjoner ble foretatt serielt med nøyaktige inkuberingsintervaller. 7. Fusjonsblandingene ble sentrifugert som ovenfor i Trinn 4, den overstående oppløsning omhyggelig avdekantert og de sammensmeltede, vaskede protoplastene resuspendert i 1,0 ml P-buffer. 8. Fusjonsblahdingen ble fortynnet IO"<1> og IO"<2> i P-buffer. 9. I hvert forsøk ble det foretatt fusjoner av hver stamme for seg, som kontroller. 10. Fortynninger av hvert protoplastpreparat (levedyktig antall) ble dyrket på skåler for å bestemme antallet av levedyktige regeneranter av hver av stammene benyttet i sammen-smeltningsforsøkene.
REGENERERING AV PROTOPLASTER
1. Protoplastsuspensjoner, fusjonsblandinger eller spontane sammensmeltinger ble passende fortynnet i P-buffer og 100 Mliter alikvoter avsatt på regenerasjonsagar ved bruk av "gentle spread"- teknikk. Spredning av sammensmeltede protoplaster i mykagar-topplag forbedret ikke regenereringen vesentlig. 2. Hvor det var aktuelt, ble fremgangsmåten beskrevet ovenfor under D.ll benyttet. 3. Regenerasjonsplater ble inkubert med rettsiden opp i forseglede plastposer ved 29-30°C under ca. 95% luftfuktighet. 4. For protoplastsammensmeltinger hvor spectinomycin-resistens ble benyttet som lett synlig selekterbart kjennetegn, ble regenererte protoplaster etter 18 timer overskiktet med 3,5 ml av 100 /ug/ml spectinomycin i mykagar (se nedenfor), autoklavert og tilsatt ved <45°C. 5. Protoplaster ble inkubert i 7-10 dager.
VEKSTMEDIER. REGENERASJONSMEDIER OG PROTOPLASTBUFFER
KOMPLETT REGENERASJONSMEDIUM
(Modifisert fra Hopwood et al., 1985. Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, s. 23 5) Basisoppløsning:
Autoklavér i 25 minutter ved 121°C.
Etter autoklavering tilsett sterile forråd av:
Justér pH til 6,5 og volumet til 1 liter.
Sporelementoppløsning (per liter):
Spectinomycin mykaqar- topplaq
Komplett regenerasjonsmedium som ovenfor, bortsett fra: Agar 4,10 g
Autoklavér som ovenfor. Avkjøl til 55°C. Tilsett 100 mg spectinomycin. Alikvoter i 5 ml volumer i proppede kultur-rør. Dypfrys, autoklavér igjen like før bruk.
Modifisert protoplast ( P) buffer
Basisoppløsning:
Autoklavér i 25 minutter ved 121°C.
Etter autoklavering tilsett suksessivt til sterile forrådsoppløsninger av:
Justér pH til 6,5 og volumet til 1 liter.
Sporelementoppløsningen er som angitt ovenfor.
Modifisert giærekstrakt- maltekstrakt fYEME) medium Basisoppløsning:
Justér volumet til 1 liter.
OMTALE AV TEGNINGENE
Figur 1: HPLC-kromatogram med UV-deteksjon (24 0 nm) av oppløsningsmiddelfraksjon fra ekstraksjon av S. avermitilis I-3 (ATCC 53567) celler etter vekst på fettsyrefritt medium (WPM SynA 40:40). Toppen ved 13,12 er oligomycin A. Figur 2: HPLC-kromatogram med UV-deteksjon (240 nm) av oppløsningsmiddelfraksjon fra ekstraksjon av S. avermitilis MA4848 (ATCC 31272) celler etter vekst på fettsyrefritt medium (WPM SynA 40:40). Produktene er naturlige avermectiner. Figur 3: HPLC-kromatogram med UV-deteksjon (24 0 nm) av oppløsningsmiddelfraksjon fra ekstrakt av S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) celler etter vekst på medium inneholdende cyklopentylkarboksylsyre (se Eksempel l).
De vedlagte figurer er nøyaktige opptak av HPLC-kurvene av de angitte forbindelser.
Sammensetningen av medier benyttet i de følgende eksempler er angitt nedenfor. Samtlige
molekylvektsbestemmelser ble foretatt ved FAB (fast atom bombardment) massespektrometri foretatt med et massespektrometer, VG modell 707OE ved å benytte en prøvematriks av trietylenglykol med fast natriumklorid. (M + Na)<+> ble bestemt. Elektronstøt-massespektrometri ble utført med et VG massespektrometer, Model 707OF, for å gi m/e-verdier. Bare verdier for hovedfragmentene er angitt.
a Fremstillet ved hydrolyse av stivelse ved alfa-amylase fra Bacillus licheniformis (fra Novo Enzymes, Wilton, CT, U.S.A. under handelsnavnet "Termamyl") til en dekstrose-ekvivalent på 40% ± 5%.
b Fra Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012 U.S.A.
<0> Fra Traders Protein, Memphis, TN 38108 U.S.A.
Justér pH til 7,2 med NaOH.
Justér pH til 6,8-7,0 og omrør i 30 minutter ved 121°C.
Justér pH til 6,8-7,0 og omrør i 3 0 minutter ved 121°C.
Generelle høytrykks- væskekromatoarafi ( HPLC) metoder Mobilfase:
150 ml vann
70 ml acetonitril
bringes til 1 liter med metanol
Kolonne:
Ultrasphere ODS 2 5 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100)
væskestrøm: 0,75 ml/minutt
deteksjon: UV ved 240 nm
attenuering: nær 6
Prøve-fortynningsmiddel (D):
35 ml acetonitril pluss 390 ml metanol
Standarder:
1. Innvei 0,5 mg avermectin A2A i en 10 ml målekolbe og tilsett metanol til volum-merket. 2. Innvei 0,5 mg testprodukt i en 10 ml målekolbe og tilsett metanol til volum-merket. 1 og 2 er standard-forrådsoppløsninger; for
standardoppløsninger for kromatografi:
tilsett 100 /uliter (1) og 100 /xliter (2) til prøveglass og tilsett 800 /iliter mobilfase.
Prøver:
1. Ta ut 1 ml grundig ristet buljong; sentrifugér.
2. Fjern mest mulig av supernatanten uten å forstyrre pelleten. 3. Tilsett 100 /uliter HPLC-vann til pelleten og dispergér den ved hjelp av vibrasjonsmikser. 4. Tilsett 2 ml fortynningsmiddel (D) og bland grundig.
5. Filtrér og foreta HPLC.
De naturlige avermectinene ble undersøkt kromatografisk ved HPLC etter denne metode og retensjonstiden for de enkelte avermectin-topper dividert med retensjonstiden for det forekommende oligomycin A, som tjener som indre standard ved en gitt HPLC-bestemmelse. Oligomycin A ses nesten bestandig ved HPLC som biprodukt av S. avermitilis-fermenterin<q>er. og er eneste produkt som ses på kromatogrammet oppnådd ved undersøkelse av de her beskrevne mutanter når de dyrkes i et medium uten syrene RCOOH, hvor R er som definert ovenfor, eller i et medium uten forbindelser som kan omdannes til syrer med formel RCOOH, hvor R er som tidligere angitt. En typisk oligomycin A retensjonstid er 12,5-14 minutter. Forholdet mellom retensjonstider (RT) gir et mer sikkert grunnlag for sammenligning av identiteten og utbyttene av avermectin-produktene. Den generelle rekkefølge for forekomsten av avermectin-produktet på kromatogrammet er B2, A2, Bl og Al (Figur 2).
Forholdene ble bestemt fra Figur 2 for de naturlige avermectiner (bemerk at Bla og Alb ikke er separert) og fra
Figur 3 for ikke-naturlige avermectiner. Retensjonstidene varierer 1-2 minutter fra dag til dag, og oligomycin A viser seg i alminnelighet nær 12,5-14 minutter.
I de følgende eksempler ble avermectinene bestemt ved hjelp av den ovenfor beskrevne HPLC-metode.
Eksempel 1
Cvklopentvl- avermectin A2
S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) ble dyrket ved 28-30°C i AS-7 medium under risting i 24 timer. En 5 ml porsjon ble benyttet for inokulering av en 500 ml kolbe inneholdende 100 ml AS-7 medium, og inkuberingen ble utført under de samme betingelsene i 24 timer. Av denne kultur ble 1 ml benyttet for inokulering av AP-5 medium (40 ml i 3 00 ml kolber). 24 timer senere ble tilsatt 0,4 g/liter cyklopentankarboksylsyre (natriumsalt). Produktkolbene ble behandlet som ristekulturer ved 28-30°C. Etter 240 timer var det produsert 35 mg/liter cyklopentyl-avermectin A2, mens den korresponderende naturlige A2a titer var 0. Andre cyklopentyl-avermectiner ble også
dannet.
Eksempel 2
Cyklopentyl- avermectin A2
Et dypfryst glass inneholdende S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) ble benyttet for inokulering av 100 ml AS-7 medium i en 500 ml kolbe. Vekst inntrådte ved inkubering ved 28-30°C under risting i 24 timer. En 1 ml alikvot ble benyttet for inokulering av ytterligere to 500 ml kolber inneholdende 100 ml AS-7 medium, og de sistnevnte kolbene ble etter 18 timers inkubering, benyttet for inokulering av 10 liter AP-5 (uten NaCl) medium. Etter 24 timers inkubering ved 28°C ble 0,4 g/liter cyklopentankarboksylsyre tilsatt til mediet. Omrøringen ble foretatt slik at oppløst oksygen ble holdt 20% over metningspunktet. Cyklopentyl A2 innholdet etter 120, 168, 216, 264 og 312 timer var henholdsvis 16, 40, 65, 88 og 110 mg/liter. Til sammenligning, var innholdet av det korresponderende naturlige avermectin A2a lik 0 (dvs., ikke påvisbar) i disse prøvene.
Eksempel 3
Cyklopentyl- avermectin A2
I dette forsøk ble produksjonsmediet beriket, og det ble foretatt flere tilsetninger av cyklopentankarboksylsyre for å øke cyklopentyl-avermectininnholdet. Betingelsen for inokulasjon og fermentering var som beskrevet i Eksempel 2 bortsett fra følgende: ytterligere 5 g/liter Ardamine pH (totalt 10 g/liter) ble benyttet i AP-5 mediet og 0,4, 0,2 og 0,2 g/liter cyklopentankarboksylsyre ble tilsatt henholdsvis etter 30, 172 og 220 timer. Cyklopentyl-avermectin A2 innholdet var 1,2, 11, 78, 137 og 214 mg/liter etter henholdsvis 120, 168, 216, 264 og 312 timer.
Eksempel 4
Cyklopentyl- avermectiner
Et dypfryst glass inneholdende S. avermitilis HL-02 6 (ATCC 53568) ble benyttet for inokulering av 100 ml AS-7 medium i en 500 ml skovle-kolbe som ble inkubert i 24-28 timer ved 28-30°C. 1 ml av denne kultur ble deretter benyttet for inokulering av en 300 ml kolbe inneholdende 40 ml AP-5 (uten NaCl, men tilsatt 0,6 g/liter glutaminsyre) medium. Etter 96 timers inkubering ved 28-30°C under risting, ble 0,4 g/liter cyklopentankarboksylsyre (natriumsalt) tilsatt. HPLC-kromatografi av en prøve etter 216 timer, viste forekomst av cyklopentyl- avermectinene B2, A2, Bl og Al med retensjonstider på henholdsvis 12,32, 15,86, 25,28 og 32,96 minutter.
Eksempel 5
Cyklopentyl- avermectin A2
I dette eksempel ble S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) og S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) dyrket under identiske betingelser. Tre medier (AP-5, WPM Syn A 40:40 og WPM Syn B 40:40) ble benyttet. En dypfryst kultur av hver organisme ble benyttet for inokulering av 100 ml AS-7 medium i 500 ml skovle-kolber som deretter ble inkubert i 24-26 timer ved 28-30°C. Deretter ble 1 ml av hver kultur benyttet for inokulering av 300 ml kolber som hver inneholdt 40 ml av et av de tre mediene. Det ble benyttet duplikater av hver kolbe. Etter 24 timers inkubering ved 28°C under risting, ble hver kolbe tilsatt 0,4 g/liter cyklopentylkarboksylsyre (natriumsalt) og etter i alt 192 timers inkubering, ble innholdet av hoved-produktet, cyklopentyl-avermectin A2, bestemt (Tabell I).
Eksempel 6
Cykloheksyl- avermectiner
I dette eksempel ble det etter 96 timer tilsatt
0,2 g/liter cyklopheksankarboksylsyre i stedet for cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. Fire cykloheksyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet av en prøve uttatt etter 240 timer. Retensjonstidene for cykloheksyl-avermectin B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 14,84, 19,26, 31,46 og 41,14 minutter.
Eksempel 7
3- cykloheksenvl- avermect iner
I dette eksempel ble det etter 96 timer tilsatt
0,2 g/liter 3-cykloheksankarboksylsyre i stedet for cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. Flere cyklopheksenyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet av en prøve uttatt etter 312 timer. Retensjonstiden for disse var 12,88 (B2), 16,39 (A2), 27,37/28,36 (Bl-isomerer) og 35,80/37,13 (Al-isomerer) minutter.
Eksempel 8
3- tienvl- avermectiner
I dette eksempel ble det etter 96 timer tilsatt
0,05 g/liter tiofen-3-karboksylsyre i stedet for cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. Fire 3-tienyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet av en prøve uttatt etter 312 timer. Retensjonstidene for 3-tienyl-avermectinene B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 6,96, 8,76, 13,8 og 23,5 minutter.
Eksempel 9
1- metvltioetyl- avermectiner
I dette eksempel ble det etter 24 og etter 96 timer tilsatt henholdsvis 0,4 og 0,2 g/liter 2-metyltiopropionsyre i stedet for cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. To 1-metyltioetyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet av en prøve uttatt etter 240 timer. Retensjonstidene for 3-tienyl-avermectinene A2 og Bl var henholdsvis 9,30 og 13,06 minutter. Toppen med en anslått retensjonstid på ca. 7,2 minutter som kom tilsyne på frontskulderen av 7,557 minutt-toppen, antas å være B2-forbindelsen, og Al-forbindelsen antas å ligge under 17,22 minutt-toppen.
Eksempel 10
2- pentvl- avermectiner
I dette eksempel ble det etter 96 timer tilsatt
0,2 g/liter 2-metylvaleriansyre i stedet for
cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. Fire 2-pentyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet
av en prøve uttatt etter 312 timer. Retensjonstidene for 2-pentyl-avermectinene B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 12,88, 16,58, 31,90 og 41,92 minutter.
Eksempel 11
l- metvl- 3- butenyl- avermectiner
I dette eksempel ble det etter 96 timer tilsatt
0,2 g/liter 2-metyl-4-pentensyre i stedet for
cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. Fire l-metyl-3-butenyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet av en prøve uttatt etter 312 timer. Retensjonstidene for l-metyl-3-butenyl-avermectinene B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 11,13, 14,78, 22,10 og 28,92 minutter.
Eksempel 12
1- metyl- l- butenyl- avermectiner
I dette eksempel ble det etter 96 timer tilsatt
0,2 g/liter 2-metyl-2-pentensyre i stedet for
cyklopentankarboksylsyre, mens alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 4. Fire 1-metyl-l-butenyl-avermectiner ble identifisert på HPLC-kromatogrammet av en prøve uttatt etter 312 timer. Retensjonstidene for 1-metyl-l-butenyl-avermectinene B2, A2, Bl og Al var henholdsvis 11,59, 14,93, 25,29 og 33,18 minutter.
Eksempel 13
I dette eksempel demonstreres bruk av mutanten for å fremstille naturlige avermectiner oppnådd fra L-valin uten nærvær av avermectinene oppnådd fra L-isoleucin. Innholdet av et dypfryst prøveglass inneholdende S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) ble overført til en 500 ml skovle-kolbe som inneholdt 100 ml AS-7 medium. Etter risting (ca. 200 rpm) i ca. 1 dag ved 28-30°C, ble 1 ml av kulturen benyttet for inokulering av 40 ml WPM Syn A 40:40 medium i en 300 ml kolbe som deretter ble inkubert ved 28-30°C i 24 timer under risting. På dette tidspunkt ble 4 ml sterilfiltrert oppløsning av isosmørsyre (nøytralisert til pH 6-7 med NaOH), 4 mg/ml, tilsatt, og inkuberingen fortsatt som ovenfor i tilsammen 8 dager. HPLC-analysen oppviste 4 hovedtopper (utenom oligomycin). (I tilsvarende forsøk med 2-metylsmørsyre i stedet for isosmørsyre, ble de korresponderende 4 topper av avermectiner oppnådd fra L-isoleucin registrert).
Eksempel 14
Fremgangsmåten fra Eksempel 1 ble gjentatt, men med de nedenfor angitte primer-forbindelser i stedet for cyklopentan-karboksylsyre. Avermectinene (formel I-forbindelser hvor R<2> er oleandrose-disakkarid-delen og R, R<1> og R<3> er som vist) identifisert ved den respektive dyrking, er også angitt.
Andre fysikalsk-kjemiske data for enkelte av forbindelsene ovenfor, er angitt i det følgende:
Eksempel 15
Cyklopentyl- avermectin A2 isolering
Dette eksempel gis for å vise en isoleringsmetode for A2-lignende avermectiner dannet fra cyklopentankarboksylsyre-forløperen. Hele buljongen (fra en tilsvarende fermentering som i Eksempel 2) ble filtrert og myceliecellene ekstrahert to ganger med aceton (3 volumer). Acetonekstraktet ble konsentrer t til en vandig olje som så ble ekstrahert med metylenklorid, hvorpå metylenkloridoppløsningen ble konsentrert til en mørkebrun olje. Denne oljen ble deretter oppløst i metanol/vann (4:1) og den resulterende oppløsning ekstrahert med heksan for å fjerne fettsyrer/lipider. Inndampning av metanol/vann-fasen førte til en lysebrun olje inneholdende ca. 10% cyklopentyl-avermectin A2 vekt/vekt. Den rå avermectin-olje ble deretter fortynnet med kloroform (3 ml CHC13 per g olje) og tilsatt aktivkull (0,35 g/g olje) og silikagel (1 g/g olje), hvorpå blandingen ble omrørt i 1 time og deretter filtr ert. Filtratet ble konsentrert og den resulterende olje fortynnet med isopropyleter (1 ml IPE per g olje). Den resulterende oppløsning ble deretter litt etter litt dryppet inn i et større volum heksan (25 ml heksan/g olje), hvorpå et hvitt, rått avermectin-pulver utfeltes. Den første fraksjon ble isolert ved filtrering, og filtratet ble deretter avkjølt til ca. 5°C for utfelling av en ytterligere fraksjon. Råfraksjonene ble deretter underkastet preparativ HPLC for å oppnå det rensede produkt. Herunder ble råfraksjonene oppløst (4,1 ml oppløsningsmiddel per g råpulver) i 25/25/25/50/0,125 IPE/CH3CN/etylacetat/heksan/eddiksyre. Prøvene ble injisert på en 41,4 mm x 25 cm preparativ silikakolonne og eluert med 30 ml/minutt av det ovenfor angitte oppløsningsmiddel og produ ktholdige fraksjoner samlet opp. De oppsamlede fraksjoner ble konsentrert og fortynnet med MeOH/H20 (86/14) slik at 1 ml inneholdt ca. 50 mg produkt. Prøver ble deretter injisert på en C-18 preparativ kolonne (samme dimensjoner som silikakolonnen) og eluert med 18-20 ml/minutt MeOH/H20 (275 ml H20 oppfylt til 2 liter med MeOH). Fraksjonene ble igjen konsentrert og sendt gjennom den preparative C-18 kolonnen nok en gang. Inndampning av produkthoIdige fraksjoner til tørrhet førte til det rene tittelprodukt.
De korresponderende cyklopentyl-avermectinene B2, Al og Bl ble oppnådd ved å samle passende fraksjoner fra de ovenfor beskrevne HPLC-trinn.
Eksempel 16
S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) mycel fra YPD-2 agarmedium ble benyttet for inokulering av 50 ml AS-7 medium i en 300 ml skovle-kolbe, som ble holdt under risting (220 rpm) i 24 timer ved 30°C. To 3 00 ml kolber (uten skovler) som begge inneholdt 50 ml AP-5 medium, ble inokulert med 1 ml av kulturen. Den ene kolben inneholdt 2-metylsmørsyre (0,1%) og den andre inneholdt ikke 2-metylsmørsyre. Fermenteringen ble utført ved 30°C i 11 dager under risting. Innholdet fra hver kolbe ble opparbeidet på samme måte. Hele buljongen ble ekstrahert med et firfoldig volumoverskudd av acetonitril:metanol (810:75). Etter kraftig risting for å bedre antibiotika-ekstraksjonen fra cellene, ble den klarnede overstående væske analysert for avermectiner ved HPLC. Uten tilsetning av fettsyre-forløper, ble det ikke funnet påvisbare (følsomhet <0,20 mg/liter) avermectiner av ("a" type). I nærvæ r av 2-metylsmørsyre ble avermectinene B2a, A2a, Bla, Ala bestemt til henholdsvis 0,5, 1,3, 1,4 og 1,1 mg/liter.
Eksempel 17
I dette eksempel ble AP-5 produksjonsfermenteringer av S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) fremstillet fra AS-7 dyrkede inokula, som i Eksempel 16. Primer-forbindelsen 2-metylsmørsyre forekom i 0,05% konsentrasjon. I dette tilfelle ga usupplert kontrollfermentering (ingen fettsyre-primer) verdier på 0,3, 0,9, <0,2 og <0,2 mg/liter henholdsvis for avermectinene B2a, A2a, Bla og Ala, mens resultatene fra fetts yre-tilsatte fermenteringer henholdsvis var 2,8, 5,0, 4,5 og 2,3 mg/liter.
Eksempel 18
I dette eksempel ble AP-5 produksjonsfermenteringer av S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) fremstillet fra AS-7 inokula, som i Eksempel 17. I dette eksempel ble 2-metylsmørsyre tilsatt i en konsentrasjon på 0,05% 48 timer etter inokulering av AP-5 mediet, og cellene ble frafiltrert, veiet (våtvekt) og ekstrahert med et firfoldig vektoverskudd av ektraksjonsmiddel. Dette konsentrasjonstrinn muliggjorde høyer e følsomhet ved avermectin-bestemmelsen i forhold til tidligere bestemmelser, hvor hele buljongen ble ekstrahert direkte. I foreliggende eksempel ble nivåene av B2a, A2a, Bla og Ala bestemt til 2,5, 8,5, 4,5 og 3,5 mg/liter for den 2-metylsmørsyre-supplerte fermentering, mens verdiene 0,3, 0,3, 0,3 og 0,1 ble oppnådd for ikke-supplerte kontroller. De sistn evnte lave nivåer kan antagelig skyldes lave nivåer av endogene fettsyreforbindelser i det rå AP-5 produksjonsmedium.
Eksempel 19
Fermenteringen ble utført som i Eksempel 18, bortsett fra at det som supplement ble benyttet cyklopentankarboksylsyre i 0,045% konsentrasjon i stedet for 2-metylsmørsyre. Cyklopentyl-avermectin A2 ble påvist i 4 mg/liter konsentrasj on.
Eksempel 20
Fermenteringene (16) av S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) ble foretatt i 50 ml AP-5 medium i 300 ml kolber (uten skovler) inkubert ved 30°C. Mediet ble inokulert med 1 ml av en 24 timers kultur av stammen i AS-7 medium, 3 0°C inkubering,
50 ml medium i 3 00 skovle-kolber. Etter 66 timers vekst i AP-5 mediet ble isosmørsyre tilsatt til 8 av kolbene i en-konsentrasjon på 0,1%. Ved å benytte samme opparbeidning som i Eksempel 16, ga disse supplerte kolbene B2b, A2b, Blb og Alb konsentrasjoner (gjennomsnitt av to forsøk) på henholdsvis 5,6, 45, 45 og 68 mg/liter. Usupplerte kulturer ga verdier på henholdsvis 0,5, 4,0, 4,5 og <8,5 mg/liter. Under sistnevnte fermentering ble dessuten verdiene 1,1, 1,1 ubestemt, og <0,2 mg/liter for de korresponderende B2a, A2a, Bla og Ala avermectiner funnet.
Eksempel 21
I dette eksempel ble fire AP-5 fermenteringer av S. averm itilis PGS-119 (ATCC 53670) foretatt på 2 ml kulturer i plastrør (15 ml). Inokula ble fremstillet som beskrevet i Eksempel 20 i AS-7 medium i 30°/kultur under risting av rørene som ble holdt i 30° skråstilling. Fettsyre-forløperne, cykloheksankarboksylsyre (CHC) i 0,045% konsentrasjon ble tilsatt til to av rørene 96 timer etter AP-5 inokuleringen. 400 timer etter AP-5 inokulering med 0,05 ml av AS-7 kulturen, ble 8 ml ekstraksjonsmiddel (acetonitril:metanol (810:75)) tilsatt til hvert rør og avermectin-innholdet bestemt i supernatantene ved HPLC-analyse som angitt i beskrivelsen. For avermectinene CHC-B2, CHC-A2, CHC-B1, CHC-A1, A2b, Blb, Alb, A2b og Ala utgjorde konsentrasjonene (gjennomsnitt av to rør) henholdsvis 3,5,
6,2, 3,0, 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 0,2, <0,2 mg/liter. De korresponderende verdier for de to rørene som ikke fikk noen syretilsetning var henholdsvis <0,2, <0,2, <0,2, <0,2, 4,2, 2,9, 9,3, 1,2, 0,3 mg/liter. Alle øvrige naturlige avermectiner var i det vesentlige upåvisbare.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin med formelen
hvor den stiplede linje i 22-23-stilling utgjør en eventuell dobbeltbinding;
R<1> er hydroksy og forekommer kun når dobbeltbindingen mangler;
R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy med
formel
R<3> er hydrogen eller metyl; og
R er en alfa-forgrenet C3-C8-alkyl-, alkenyl- eller alkyltioalkylgruppe; en C3-C8-cykloalkyl- eller C5-C8-cykloalkenylgruppe, som hver eventuelt kan være substituert med én eller flere Ci-C^-alkylgruppe; eller en 3-6-leddet oksygen- eller svovelholdig heterocyklisk ring som kan være mettet eller helt eller delvis umettet, og som eventuelt kan være substituert med én eller flere Ci-C^-alkylgrupper, med det forbehold at R ikke er isopropyl eller (S)-sek-butyl, karakterisert ved aerob fermentering ved 28-30°C ved hjelp av en mutant av Streptomyces avermitilis som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og/eller transaminaseaktivitet for forgrenede aminosyrer, og som er avledet fra utgangs-stammen Streptomyces avermitilis ATCC 31272, har i alt vesentlig de samme morfologiske egenskaper som utgangs-stammen og har evnen til å produsere de ovennevnte avermectiner i et medium inneholdende R-COOH eller en forbindelse som kan omdannes dertil ved fermentering, hvor R er som angitt ovenfor, eller Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53569 eller ATCC 53670, av et vandig næringsmedium som består av en assimilerbar kilde for nitrogen, karbon og uorganiske salter og en syre med formelen
R-COOH
eller en forbindelse som kan omdannes til denne syre under fermenteringen, hvor R er som angitt ovenfor.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at R er
cyklopentyl, cykloheksyl eller tienyl.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at S. avermitilis-stammen er S. avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 eller ATCC 53670.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US651287A | 1987-01-23 | 1987-01-23 | |
US10782587A | 1987-10-13 | 1987-10-13 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO880261D0 NO880261D0 (no) | 1988-01-22 |
NO880261L NO880261L (no) | 1988-07-25 |
NO172446B true NO172446B (no) | 1993-04-13 |
NO172446C NO172446C (no) | 1993-07-21 |
Family
ID=26675723
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO880261A NO172446C (no) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Fremgangsmaate for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin |
NO880262A NO172447C (no) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO880262A NO172447C (no) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0284176B1 (no) |
JP (1) | JPH0817694B2 (no) |
KR (1) | KR900007937B1 (no) |
CN (1) | CN1065277C (no) |
AP (1) | AP53A (no) |
AR (1) | AR244344A1 (no) |
AU (1) | AU636709B2 (no) |
BG (1) | BG48572A3 (no) |
CA (1) | CA1338141C (no) |
CZ (1) | CZ290312B6 (no) |
DE (1) | DE3883408T2 (no) |
DK (1) | DK175724B1 (no) |
EG (1) | EG18796A (no) |
ES (1) | ES2058244T3 (no) |
FI (1) | FI90087C (no) |
HU (1) | HU203130B (no) |
IE (1) | IE62467B1 (no) |
IL (1) | IL85119A (no) |
MA (1) | MA21161A1 (no) |
MX (1) | MX169293B (no) |
MY (1) | MY102581A (no) |
NO (2) | NO172446C (no) |
NZ (1) | NZ223270A (no) |
PT (1) | PT86582B (no) |
RU (1) | RU2096462C1 (no) |
YU (2) | YU47877B (no) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2054822T3 (es) * | 1987-10-23 | 1994-08-16 | Pfizer | Procedimiento para la produccion de agliconas de avermectinas y sus cultivos. |
GB8807280D0 (en) * | 1988-03-26 | 1988-04-27 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
GB8809232D0 (en) * | 1988-04-19 | 1988-05-25 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
GB8811036D0 (en) * | 1988-05-10 | 1988-06-15 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
US5030622A (en) * | 1989-06-02 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
US5057499A (en) * | 1989-06-02 | 1991-10-15 | Merck & Co. Inc. | Avermectin derivatives |
NZ238521A (en) * | 1990-06-22 | 1992-12-23 | Merck & Co Inc | Process for the conversion of avermectin glycone to avermectin mono- and disaccharides by fermentation with streptomyces avermitilis ma6078 |
NZ240128A (en) * | 1990-10-15 | 1994-01-26 | Merck & Co Inc | Production of 13-beta and 5-beta ivermectin monoglucopyranosides from |
US5250422A (en) * | 1990-10-15 | 1993-10-05 | Merck & Co., Inc. | Biotransformation process for the production of invermectin derivatives |
US6103504A (en) * | 1992-03-25 | 2000-08-15 | Pfizer Inc. | Process for production of avermectins and cultures therefor |
US5292647A (en) * | 1992-11-30 | 1994-03-08 | Eli Lilly And Company | Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith |
CN1038330C (zh) * | 1993-07-05 | 1998-05-13 | 塞泰克斯公司 | 阿弗麦菌素的生产与分离 |
DE69433112T2 (de) * | 1993-07-30 | 2004-04-01 | Pfizer Inc. | Gene, die verzweigte-alpha-ketosäure-dehydrogenasekomplexe von streptomyces avermitius kodieren |
US5466102A (en) | 1993-12-16 | 1995-11-14 | Kennametal Inc. | System for coupling machine tools |
GB9716567D0 (en) * | 1997-08-05 | 1997-10-08 | Pfizer | Process |
GB9825402D0 (en) * | 1998-11-19 | 1999-01-13 | Pfizer Ltd | Antiparasitic formulations |
KR20040045440A (ko) | 2001-09-17 | 2004-06-01 | 일라이 릴리 앤드 캄파니 | 농약 배합물 |
CN101560535B (zh) * | 2009-05-26 | 2012-05-23 | 浙江升华拜克生物股份有限公司 | 一种基于代谢参数our补糖发酵生产阿维菌素工艺 |
US20120196821A1 (en) | 2009-10-19 | 2012-08-02 | Roger Mervyn Sargent | Method and formulation for the control of parasites |
RU2454420C1 (ru) * | 2011-03-31 | 2012-06-27 | Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" | Цитотоксические полусинтетические производные макролидного антибиотика олигомицина а и способ их получения |
CN104877925B (zh) * | 2014-02-28 | 2018-05-25 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种异壁放线菌和三种新的抗真菌maclafungins类化合物及其制备和应用 |
CN116602242B (zh) * | 2023-05-08 | 2024-01-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种提高反季鱼苗成活率的方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE434277B (sv) | 1976-04-19 | 1984-07-16 | Merck & Co Inc | Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis |
US4429042A (en) | 1978-09-08 | 1984-01-31 | Merck & Co., Inc. | Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds |
NZ204074A (en) * | 1982-05-10 | 1986-05-09 | Merck & Co Inc | Synergistic compositions containing avermectins |
NZ207655A (en) * | 1983-04-07 | 1986-09-10 | Merck & Co Inc | Synergistic veterinary compositions containing an avermectin compound and clorsulon |
NZ210505A (en) * | 1983-12-22 | 1988-06-30 | Merck & Co Inc | Parasiticidal compositions containing avermectin or milbemycin derivatives |
US4579864A (en) * | 1984-06-11 | 1986-04-01 | Merck & Co., Inc. | Avermectin and milbemycin 13-keto, 13-imino and 13-amino derivatives |
ES8800986A1 (es) * | 1985-07-27 | 1987-12-01 | Pfizer | Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina |
GB8606120D0 (en) * | 1986-03-12 | 1986-04-16 | Glaxo Group Ltd | Process |
EP0240274A3 (en) * | 1986-04-03 | 1990-03-14 | Merck & Co. Inc. | Avermectins as growth promotant agents |
-
1988
- 1988-01-18 EP EP88300353A patent/EP0284176B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 IL IL85119A patent/IL85119A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-01-18 DE DE88300353T patent/DE3883408T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 BG BG82655A patent/BG48572A3/xx unknown
- 1988-01-18 ES ES88300353T patent/ES2058244T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-19 MA MA21398A patent/MA21161A1/fr unknown
- 1988-01-21 PT PT86582A patent/PT86582B/pt unknown
- 1988-01-21 CZ CS1988408A patent/CZ290312B6/cs unknown
- 1988-01-21 YU YU10988A patent/YU47877B/sh unknown
- 1988-01-21 CA CA000556996A patent/CA1338141C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-22 DK DK198800286A patent/DK175724B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 KR KR1019880000469A patent/KR900007937B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 JP JP63012461A patent/JPH0817694B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 CN CN88100373A patent/CN1065277C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 NO NO880261A patent/NO172446C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 AR AR88309889A patent/AR244344A1/es active
- 1988-01-22 HU HU88259A patent/HU203130B/hu unknown
- 1988-01-22 IE IE15988A patent/IE62467B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 NO NO880262A patent/NO172447C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 NZ NZ223270A patent/NZ223270A/en unknown
- 1988-01-22 RU SU884355097A patent/RU2096462C1/ru active
- 1988-01-22 AP APAP/P/1988/000077A patent/AP53A/en active
- 1988-01-22 MX MX026651A patent/MX169293B/es unknown
- 1988-01-22 FI FI880279A patent/FI90087C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-01-25 MY MYPI88000058A patent/MY102581A/en unknown
- 1988-02-21 EG EG3488A patent/EG18796A/xx active
-
1990
- 1990-05-21 YU YU99090A patent/YU47886B/sh unknown
-
1991
- 1991-02-15 AU AU71113/91A patent/AU636709B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU595673B2 (en) | Non natural demethylavermectins and process therefor | |
US5077278A (en) | Non-natural demethylavermectins compositions and method of use | |
NO172446B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin | |
US5238848A (en) | Cultures for production of avermectins | |
US5234831A (en) | Cultures for production of B avermectins | |
EP0313297B1 (en) | Process for production of avermectin aglycones and cultures therefor | |
US5240850A (en) | Cultures for production of avermectin aglycones | |
US5387509A (en) | Ethylated avermectins | |
US5525506A (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor | |
EP0640142B1 (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor | |
AP64A (en) | "Process for production of B avermectins and cultures therefor". |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |