DE69433112T2 - Gene, die verzweigte-alpha-ketosäure-dehydrogenasekomplexe von streptomyces avermitius kodieren - Google Patents

Gene, die verzweigte-alpha-ketosäure-dehydrogenasekomplexe von streptomyces avermitius kodieren Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, die den verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplex eines Organismus, der zur Gattung Streptomyces gehört, codieren, und neue Polypeptide, die durch Expression solcher Sequenzen erzeugt werden. Sie betrifft auch neue Methoden zur Verbesserung der Produktion von natürlichem Avermectin und zur Erzeugung neuer Avermectine mit Fermentation.
  • Zahlreiche pharmazeutische Produkte werden durch Mikroorganismen hergestellt. Von diesen Mikroorganismen wurden Mitgliedern der Gattung Streptomyces – einer Gruppe Gram-positiver Erdbakterien – eine große Beachtung geschenkt, die mehr als 90% der therapeutisch nützlichen Antibiotika lieferten. Streptomycetes sind im Focus intensiver Untersuchungen unter Anwendung rekombinanter DNA-Klonierungstechniken, um antibiotische biosynthetische Gene zu isolieren, neue Derivate oder Hybridverbindungen zu erzeugen, regulatorische Gene zu isolieren und die regulatorischen Mechanismen zu untersuchen, die sowohl am primären als auch sekundären Metabolismus beteiligt sind.
  • S. avermitilis erzeugt acht verschiedene aber eng verwandte antiparasitische Polyketidverbindungen, die als Avermectine benannt werden. Der Avermectinkomplex, der von S. avermitilis erzeugt wird, hat vier Hauptkomponenten, A1a, A2a, B1a und B2a und vier Komponenten in geringerer Menge, A1b, A1b, B1b und B2b. Die Struktur der verschiedenen Komponenten ist unten dargestellt.
  • Figure 00020001
  • Die Avermectinpolyketidstruktur ist aus 7 Acetat-, 5 Propionatmolekülen und einem verzweigtkettigen Fettsäuremolekül abgeleitet, das entweder S(+)-2-Methylbuttersäure oder Isobuttersäure ist. Die Bezeichnungen "A" und "B" beziehen sich auf Avermectine, bei denen der 5-Substituent Methoxy bzw. Hydroxy ist. Die Zahl "1" bezieht sich auf Avermectine, die eine Doppelbindung an Position 22–23 haben und die Zahl "2" bezieht sich auf Avermectine mit einem Wasserstoff an Position 22 und einem Hydroxyrest an Position 23. Schließlich hat C-25 zwei mögliche Substituenten: der sec.-Butylsubstituent (abgeleitet von L-Isoleucin) ist in der Reihe der Avermectine "a" vorhanden, und der Isopropylsubstituent (abgeleitet von L-Valin) ist in der Reihe der Avermectine "b" vorhanden (bezüglich einer Übersicht siehe M. H. Fischer und H. Mrozik, 1984, "Macrolide Antibiotics", Academic Press, Kapitel 14).
  • Unter "natürlichen" Avermectinen werden solche Avermectine verstanden, die durch S. avermitilis erzeugt werden, wobei der Substituenten in Position 25, wie oben erwähnt, entweder Isopropyl oder sec-Butyl ist. Aver mectine, bei denen die Gruppe an Position 25 etwas anderes als Isopropyl oder sec-Butyl ist, werden hier als neue oder nicht natürliche Avermectine bezeichnet.
  • Ein metabolischer Weg zu diesen α-verzweigtkettigen Fettsäuren in ihrer CoA-Form erfolgt über eine verzweigtkettige Aminosäure-Transaminasereaktion gefolgt von einer verzweigtkettigen α-Ketosäure-Dehydrogenasereaktion. (Alteinativ können verzweigtkettige Fettacyl-CoA-Derivate aus verzweigtkettigen α-Ketosäuren entstehen, die durch de-novo-Synthese erzeugt wurden). Diese metabolischen Stoffwechselwege sind unten dargestellt.
  • Figure 00030001
  • Eine Mutante von S. avermitilis ohne nachweisbare verzweigtkettige α-Ketosäuredehydrogenase-(BCKDH)-Aktivität bei dem zuletzt erwähnten Enzym wurde kürzlich isoliert (Hafner et al., 1988, Europäische Patentanmeldung #88300353.5, Publikation #0284176). Die Mutante wurde isoliert mit einer chemischen Standardmutagenese von S. avermitilis Stamm ATCC 31272 bei einem Screening, bei dem nach Abwesenheit der 14CO2-Pruduktion aus einem mit 14C-1 markierten 2-Oxoisocapronsäuresubstrat (Leucinanalogon) gesucht wurde. Die Mutante kann natürliche Avermectine nicht synthetisieren, außer wenn die α-verzweigtkettige Fettsäure oder ein Vorläufer, der die Isopropyl- oder sec-Butyl-(S-Form)-Gruppe trägt, dem Medium zugegeben wird, indem die Mutanten fermentiert werden. Die Mutante kann auch neue oder nicht natürliche Avermectine erzeugen, wenn sie unter wässrigen aeroben Bedingungen in einem Nährmedium fermentiert wird, das eine geeignete alternative Carbonsäure enthält, wie Cyclohexancarbonsäure (CHC) oder einen Vorläufer davon.
  • S. avermitilis BCKDH zu klonieren, ist äußerst wünschenswert. Die Manipulation dieser Gene durch rekombinante DNA-Techniken sollte die Herstellung von natürlichen und neuen Avermectinen erleichtern. Bei bestimmten Stämmen würde man einen erhöhten Titer natürlicher Avermectine erwarten, wenn die Kopienzahl der BCKDH-Gene erhöht wird. Außerdem würde die Erzeugung eines irreversibel blockierten bkd-Stamms, bei dem die BCKDH-Aktivität permanent deletiert oder durch Genersatz modifiziert ist, eine verbesserte Alternative zu der derzeitigen bkd-Mutante sein, die, wie oben erwähnt, durch chemische Mutagenese erhalten wurde.
  • Die α-Ketosäuredehydrogenase-Multienzym-Komplexe – der verzweigtkettige α-Ketosäuredehydrogenase-(BCKDH)-Komplex, der Pyruvatdehydrogenase-(PDH)-Komplex und der α-Ketoglutaratdehydrogenase(KGDH)-Komplex katalysieren die oxidativen Decarboxylierungen von verzweigtkettigen α-Ketosäuren, Pyruvat bzw. α-Ketoglutarat, unter Freisetzung von CO2 und Erzeugung des entsprechenden Acyl-COAs und von NADH (R. N. Perham, 1991, Biochemistry, 30: 8501–8512). Jeder Komplex besteht aus drei verschiedenen katalytischen Enzymen: Decarboxylase (E1), Dihydrolipoamidacyltransferasetransacylase (E2) und Dihydrolipoamiddehydrogenase (E3).
  • Verzweigtkettige α-Ketosäuredehydrogenase (BCKDH) ist ein Multienzymkomplex, der aus drei funktionellen Komponenten aufgebaut ist: E1, der Decarboxylase, E2, der Transacylase und E3, der Lipoamiddehydrogenase. Die gereinigten Komplexe aus Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa und Bacillus subtilis sind aus vier Polypeptiden aufgebaut. Die gereinigten Säugetierkomplexe bestehen auch aus vier Polypeptiden, E1α, E1β, E2 und E3. Es wurde aus Bacillus subtilis ein α-Ketosäuredehydrogenasekomplex isoliert, der sowohl Pyruvat- als auch verzweigtketige α-Ketosäuredehydrogenaseaktivitäten entwickelt. Dieser Komplex mit Doppelfunktion oxidiert Pyruvat und liefert verzweigtkettige Fettsäuren für Membranphospholipide.
  • Die Klonierung von prokaryotischen verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasegenen wurde für Pseudomonas und Bacillus berichtet, nicht aber für Streptomyces. Es wurde gefunden, dass in diesen Systemen die Gene, die BCKDH codieren, in einem Operon geclustert waren. Die Gene des BCKDH-Komplexes von Pseudomonas putida wurden kloniert und die Nucleotidsequenz dieser Region bestimmt (Sykes et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 1619–1625, und Burns et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165–169 und 176: 311–317). Das Molekulargewicht von E1α ist 45289, von E1β 37138, von E2 45134 und von E3 48164. Die vier Gene sind in der Reihenfolge geclustert: E1α, E1β, E2 und E3. Eine Northern-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression dieser vier Gene aus einer einzigen mRNA erfolgt und dass diese Gene ein Operon bilden. Es gibt einen typischen prokaryotischen Konsensuspromotor, der direkt dem Start der E1α-codierenden Region vorangeht, der die konstitutive Expression der Pseudomonas-bkd-Gene zulässt. Das Startcodon für die E1β-codierende Region ist nur 40 Nucleotide stromabwärts von dem Ende des offenen Leserahmens (ORF) von E1α angeordnet. Im Gegensatz dazu gibt es keinen Intergenabstand zwischen den ORFs für E1β und E2, da das Stoppcodon für den E1β-ORF das Triplett ist, das direkt dem Startcodon des E2-ORFs vorhergeht. Der Intergenabstand zwischen den ORFs für E2 und E3 ist auf nur zwei Nucleotide reduziert. Daher sind die Pseudomonas-bkd-Gene eng verbunden. In gleicher Weise wurde das Operon, das den Bacillus-subtilis-BCKDH/PDH-Doppelkomplex codiert, kloniert (Hemila et al., 1990, J. Bacteriol., 172: 5052–5063). Dieses Operon enthält vier ORFs, die vier Proteine mit 42, 36, 48 und 50 Kilodalton (kDa) Größe codieren, von denen gezeigt wurde, dass sie mit den E1α-, E1β-, E2- und E3-Untereinheiten des Pseudomoras-bkd-Clusters äußerst homolog sind. Kürzlich wurden auch die Gene, die die α- und β-Untereinheiten der E1-Komponente des Doppel-BCKDH/PDH-Multienzymkomplexes von Bacillus stearothermophilus codieren, kloniert und sequenziert (geschätzte Molekulargewichte für die α- und β-Untereinheiten ungefähr 41.000 bzw. 35.000) (Hawkins et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337–346).
  • Außerdem wurde die Sequenz einer Anzahl eukaryotischer E1α- und -β-BCKDH-Untereinheiten (Mensch, Rind und Ratte) offenbart. Kürzlich wurde ein Aminosäuresequenzvergleich aller publizierten Sequenzen, die für die E1α- und E1β-Komponenten der PDH- und BCKDH-Komplexe bekannt sind, aus vielen Arten mit Computeranalyse durchgeführt (Wexler et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209–213). Interessanterweise wurden verschiedene Regionen der α- und β-Untereinheiten identifiziert, die stark konserviert sind, nicht nur bei allen PDHs, die bisher beschrieben wurden, sondern auch sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen BCKDH-Komplexen.
  • Es wird die Klonierung von verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasegenen aus Streptomyces avermitilis beschrieben. Die neuen Gene wurden kloniert unter Verwendung einer Kombination von zwei Techniken der Molekulargenetik, der DNA-Polymerasekettenreaktion (PCR) und einer Homologiesondierung. Die Homologiesondierung beinhaltet das Screenen der cDNA oder von genomischen Bibliotheken mit radioaktiv markierten synthetischen Oligonucleotidsonden, die Aminosäuresequenzen des Proteins entsprechen. Unglücklicherweise hat diese Technik bestimmte Beschränkungen, von denen eine die ziemlich starke Beschränkung in Bezug auf die Degeneriertheit des Oligonucleotids, das verwendet werden kann, ist. Außerdem wird eine Screening-Hybridisierung mit niedriger Stringenz durchgeführt, so dass die Zahl der falsch positiven Ergebnisse oft hoch ist. Um einige dieser Beschränkungen der Oligonucleotidhybridisierung zu überwinden, wurde kürzlich eine Variation des Homologiesondierens entwickelt, die die DNA-Polymerasekettenreaktion (PCR) beinhaltet und die Verwendung hochdegenerierter Oligonucleotide als Sonden zulässt. Diese Methode erfordert nur die Kenntnis der Aminosäuresequenz von zwei kurzen Regionen (ungefähr 7 bis 10 Aminosäuren Länge) des codierten Proteins. Zwei Oligonucleotide, die jeder Peptidsequenz entsprechen, werden als Primer in der Reaktion verwendet. Jeder Primer kann als Mischung von vollständig degenerierten Oligonucleotiden, die alle möglichen Codonkombinationen enthalten, die die bekannten Aminosäuresequenzen codieren könnten, verwendet werden. Die Matrize für die Amplifikation kann irgendeine aus verschiedenen DNA-Quellen sein, einschließlich genomischer DNA und supergeknäuelte Formen von Plasmidbibliotheken. Verschiedene Berichte, die kürzlich in der Literatur veröffent licht wurden, haben den Nutzen gezeigt, wenn Polymerasekettenreaktion und Homologiesondierung für die Identifikation eines Gens aus mehreren Arten kombiniert werden.
  • Glossar
  • Technische Ausdrücke, die in dieser Anmeldung verwendet werden, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekulargenetik wohl bekannt. Die Definition dieser Ausdrücke findet sich in vielen Lehrbüchern, die sich dem Gebiet der Molekularbiologie widmen, wie "Genes", 2. Ausg. von Dr. Benjamin Lewin, 1985, John Wiley & Sons, Inc., New York. Ausdrücke, die häufig in diesem Dokument verwendet werden, sind unten definiert: Antibiotikum: Ein chemisches Mittel, das das Wachstum von Bakterienzellen hemmt. Verwendet, um rekombinante Bakterienzellen zu selektieren.
  • Antibiotisches Resistenzgen: DNA-Sequenz, die die Resistenz gegen ein Antibiotikum vermittelt, wenn sie in eine Wirtszelle eingebracht wird, die natürlicherweise für das spezielle Antibiotikum empfindlich ist. Auch bekannt als antibiotischer Marker.
  • Bakteriophagen: Viren, die Bakterien infizieren.
  • cRNA: Einzelsträngige RNA, komplementär zu einer DNA, synthetisiert aus letzterer durch in-vitro-Transkription.
  • Chromosom: Diskrete Einheit des Genoms, die viele Gene trägt.
  • Klon: Große Anzahl von Zellen oder Molekülen, die mit einem einzelnen Vorgänger identisch sind.
  • Klonierungsvektor: Jedes Plasmid, in das eine Fremd-DNA insertiert werden kann, um kloniert zu werden. Es trägt bei Transformation Fremd-DNA in eine Wirtsbakterienzelle.
  • CoA: Coenzym A.
  • Kohäsive Endsequenz Cos): DNA-Sequenz, die aus dem Bakteriophagen λ stammt, die die in-vitro-Verpackung zulässt.
  • Cosmid: Plasmid, in das die cos-Stellen des Bakteriophagen λ insertiert wurden; als Ergebnis kann die Plasmid-DNA (die Fremd-DNA-Inserts trägt) in vitro in die Phagenhülle verpackt werden.
  • Dalton: Masseeinheit, die allgemein im Zusammenhang mit Moleküldimensionen verwendet wird, entsprechend einem Wasserstoffatom.
  • DNA-Ligierun: Die Bildung einer chemischen Bindung, die zwei Fragmente von DNA verbindet.
  • Eukaryotische Zellen: Zellen höherer Organismen, die einen von Membran umgebenen Kern aufweisen.
  • Gencluster: Eine Gruppe von Genen, die physikalisch auf dem Chromosom nahe beieinander sind. Genom: Vollständiger Chromosomensatz. Die Summe aller Gene eines Einzelnen.
  • Hybridisierung, Koloniehybridisierung: Technik, die verwendet wird, um Bakterienkolonien zu identifizieren, die chimäre Vektoren tragen, deren insertierte DNA einer bestimmten Sequenz gleicht.
  • kb: Abkürzung für 1000 Basenpaare DNA oder RNA.
  • NADH: Reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid.
  • Linker: Kurzes synthetisches doppelsträngiges Oligodesoxynucleotid, das die Zielstelle für ein oder mehrere Restriktionsenzyme enthält. Es wird einem Vektor angefügt, um einen neuen Polylinker oder eine Mehrfachklonierungsstelle (MCS) zu erzeugen.
  • Nucleotid: Einen Block von Nucleinsäuren bildend oder monomere. Einheit von Nucleinsäuren.
  • Oligonucleotid: Eine kurze Kette von Nucleotiden.
  • Operon: Eine vollständige Einheit der bakteriellen Genexpression und -regulation, einschließlich der Strukturgene, Regulatorgene und Kontrollelemente in DNA, die von Regulatorgenprodukten erkannt wird.
  • Plasmid: Autonome, sich selbst replizierende, extrachromosomale zirkuläre DNA.
  • Plasmidkopienzahl: Anzahl von Plasmidmolekülen, die in Bakterien aufrechterhalten werden für jedes Wirtschromosom.
  • Primer: Kurze Sequenz von DNA oder RNA, die mit einem Strang DNA gepaart wird und ein freies 3'-OH-Ende liefert, an dem eine DNA-Polymerase die Synthese einer Desoxyribonucleotidkette startet.
  • Prokaryotische Zellen: Kleine, relativ einfache Zellen, die die meisten Mikroorganismen umfassen.
  • Promotor: DNA-Region, die für den Start der Transkription verantwortlich ist.
  • Restriktionsenzym: Enzym, das eine spezifische kurze Sequenz-DNA erkannt und spaltet.
  • Restriktionserkenungssequenz: DNA-Sequenz, die spezifisch von einem speziellen Restriktionsenzym erkannt wird. Auch bekannt als Zielstelle.
  • Shuttle-Vektor: Bifunktioneller Klonierungsvektor, der in einem oder mehreren alternativen Wirten replizieren kann (z. B. E. coli und Streptomyces).
  • Southern Blotting: Verfahren, um denaturierte DNA von einem Agarosegel auf ein Nitrocellulosefilter zu überführen, wo es mit einer komplementären Nucleinsäuresonde hybridisiert werden kann.
  • Subklonierung: Überführung von klonierten Fragmenten von DNA von einer Art Vektor zu einem anderen, z. B. von einem rekombinanten Cosmid zu einem Plasmid. Das neue rekombinante Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, um einen Subklonstamm zu erzeugen.
  • Transkription: Synthese von RNA aus einer DNA-Matrize.
  • Transformation von Bakterienzellen: Beschreibt die Aufnahne neuer genetischer Marker durch Einbau von zugefügter DNA.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Segment, das den verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplex eines Organismus codiert, der zur Gattung Streptomyces gehört, wobei das DNA-Segment die DNA-Sequenz von SEQUENZ ID Nr. 1, SEQUENZ ID Nr. 2, SEQUENZ ID Nr. 3, SEQUENZ ID Nr. 4 oder SEQUENZ ID Nr. 5 oder eine allelische Variation solcher Sequenzen enthält.
  • Bevorzugt codiert das isolierte DNA-Segment den verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplex von Streptomyces avermitilis. Bevorzugter weist das isolierte DNA-Segment weiterhin eine DNA-Region auf, die die Expression des verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplexes reguliert.
  • Bevorzugt weist das isolierte DNA-Segment gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung weiterhin eine DNA-Region auf, die die Expression des verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplexes reguliert. Gemäß einem zweiten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine rekombinante DNA mit einem DNA-Segment, wie oben beschrieben. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Wirtszelle, in die die rekombinante DNA eingebracht wurde. Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Plasmid mit der rekombinanten DNA.
  • Gemäß einem dritten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein DNA-Segment, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 und pCD577, wobei die DNA-Segmente die in 3 gezeigte genomische Restriktionskarte haben. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Wirtszelle, in die ein DNA-Segment gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung eingebracht wurde.
  • Gemäß einem vierten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein DNA-Segment gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, das eine DNA-Region aufweist, die die Transkription oder Translation der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID Nr. 1, SEQUENZ ID Nr. 2, SEQUENZ ID Nr. 3, SEQUENZ ID Nr. 4 oder SEQUENZ ID Nr. 5 oder einer allelischen Variation solcher Sequenzen reguliert.
  • Gemäß einem fünften Aspekt lieferte die vorliegende Erfindung die Gene für den verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplex der in einem DNA-Segment gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung enthalten ist.
  • Gemäß einem sechsten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein DNA-Segment mit einer DNA-Sequenz, die eine Untergruppe der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID Nr. 1, SEQUENZ ID Nr. 2, SEQUENZ ID Nr. 3, SEQUENZ ID Nr. 4 oder SEQUENZ ID Nr. 5 ist und die mit SEQUENZ ID Nr. 1, SEQUENZ ID Nr. 2, SEQUENZ ID Nr. 3, SEQUENZ ID Nr. 4 oder SEQUENZ ID Nr. 5 oder einer allelischen Variation davon hybridisieren kann.
  • Gemäß einem siebten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQUENZ ID Nr. 6, SEQUENZ ID Nr. 7, SEQUENZ ID Nr. 8 oder SEQUENZ ID Nr. 9 enthält.
  • Es wird auch eine Methode offenbart, um ein natürliches Avermectin zu erzeugen, die umfasst, dass S. avermitilis, bei dem die Kopienzahl der Gene, die den verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplex codieren, erhöht wurde, unter Bedingungen und in einem Fermentationsmedium, das zur Erzeugung von natürlichem Avermectin geeignet ist, gezüchtet wird.
  • Offenbart wird auch eine Methode, um natürliches Avermectin zu erzeugen, die umfasst, dass S. avermitilis bei dem die Expression der Gene, die den verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplex codieren, durch Manipulation oder Ersatz der Gene, die für die Regulation einer solchen Expression verantwortlich sind, verbessert wurde unter Bedingungen und in einem Fermentationsmedium, das zur Erzeugung eines solchen natürlichen Avermectins geeignet ist, gezüchtet wird.
  • Offenbart wird auch eine Methode, um ein neues Avermectin zu erzeugen, die umfasst, dass S. avermitilis, bei dem die Expression des verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasekomplexes vermindert oder eliminiert wurde, z. B. durch Manipulation (z. B. Deletion, Inaktivierung oder Ersatz) der Gene, die für die Expression verantwortlich sind, unter Bedingungen und in einem Fermentationsmedium, das zur Erzeugung eines solchen neuen Avermectins geeignet ist, gezüchtet wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Nucleotidsequenz der Polymerasekettenreaktion-(PCR)-Primer, die verwendet werden, um ein Fragment des S. avermitilis-E1α-BCKDH-Gens zu klonieren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die von jedem Oligodesoxynucleotid codiert wird, ist über den entsprechenden DNA-Sequenzen gezeigt. Pfeile zeigen die Richtung der Amplifikation. 1A ist ein rechtsgerichteter Primer und 1B ein linksgerichteter Primer.
  • 2: Vergleich der verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenasesequenz. Die Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für das mit PCR klonierte genomische Fragment CD503 von Streptomyces avermitilis (Sa), für Bacillus stearothermophilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp) und Homo sapiens (Hs). Vertikale Markierungen bezeichnen Aminosäureübereinstimmungen. Die Anordnung der Sequenzen entsprechend der rechtsgerichteten und linksgerichteten PCR-Primer, die für die Klonierung verwendet werden, ist angezeigt (oben rechts bzw. oben links).
  • 3: Genomische Restriktionskarte, Anordnung und Subklone für das Streptomyces avermitilis-bkd-Gencluster. Der schwarze Kasten unter der Karte zeigt die Anordnung und Orientierung des anfänglichen E1α-spezifischen S. avermitilis-CD503-Genomfragments, das unter Verwendung von PCR kloniert wurde. Genomische Subklone (Derivate von pGEM-3Z) sind angezeigt. Die Anordnung und Organisation der bkd-Strukturgene, die E1α (E1a), E1β (E1b) und E2-BCKDH-Untereinheiten codieren, ist auch gezeigt. Die Polarität der identifizierten offenen Leserahmen (durch Kästchen gezeigt) ist von links nach rechts. Abkürzungen: B BamHI; E Eco-RI, K KpnI; Bg BglII und S SphI.
  • 4A, 4B, 4C, 4D, 4E und 4F: Nucleotidsequenz und abgeleitete Translationsprodukte des genomischen DNA-Fragments von S. avermitilis mit 2728 bp, das die offenen Leserahmen für E1α, E1β und E2 (teilweise) von bkd enthält. Der E1α-ORF erstreckt sich von Position 403 bis 1548 der Sequenz, E1β-ORF erstreckt sich von Position 1622 bis 2626 und E2-ORF startet an Position 2626. Die Nucleotide sind oben auf den Sequenzlinien nummeriert. Stoppcodons sind mit einem Stern "*" gezeigt. Mögliche Shine-Dalgarno-Ribosomen-Bindungssequenzen sind unterstrichen. BamHI-Restriktionserkennungssequenzen sind mit einem Kasten versehen.
  • 5: Nucleotidsequenz und abgeleitete Translationsprodukte des genomischen BglII-SphI-DNA-Fragments (pCD539) von S. avermitilis mit 0,8 kb, das einen Teil des E2-bkd-ORFs enthält. 251 by wurden sequenziert ausgehend von der BglII-Stelle (im Kasten). Die Nucleotide sind oben auf der Sequenzlinie nummeriert.
  • 6: Nucleotidsequenz der mutagenen (rechtsgerichteten) und universellen (linksgerichteten) Primer für die Polymierasekettenreaktion (PCR), die verwendet wurden, um p77-Derivate zu konstruieren für die heterologe Expression von S. avermitilis-bkd-Genen in E. coli. PCR-Primer wurden verwendet, um eine NdeI-Restriktionsstelle am Translationsstartcodon der E1α- oder E1β-S. avermitilis-bkd-ORFs einzuführen (Primerpaar 55 : 31 bzw. 56 : 30). Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die von jedem mutagenen Oligodesoxynucleotid codiert wird, ist über den entsprechenden DNA-Sequenzen gezeigt. Die Restriktionserkennungssequenzen sind angegeben. Die Pfeile zeigen die Richtung der Amplifikation. 6A sind rechtsgerichtete mutagene Primer und 6B linksgerichtete mutagene Primer.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die neuen Verfahren zur Klonierung von S. avermitilis-bkd-Genen und die Bestimmung der primären Struktur der Gene, die den S. avermitilis-BCKDH-Multierizymkomplex codieren, werden unten beschrieben.
  • Zuerst wurden zwei PCR-Primer, als "rechtsgerichtet" und "linksgerichtet" (1) bezeichnet, entwickelt über konservierte Regionen, die durch mehrfache Ausrichtung abgeleiteter E1α-BCKDH-Peptidsequenzen aus verschiedenen Arten und solchen, die aus der Literatur verfügbar sind, identifiziert wurden. Ein PCR-Produkt, ungefähr 0,2 kb lang, wurde mit Amplifikation von genomischer S. avermitilis-DNA nachgewiesen unter Verwendung sowohl der rechtsgerichteten als auch der linksgerichteten Primer. Das mit PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde anschließend in den E. coli-Vektor pGEM-3Z kloniert, um das rekombinante Plasmid pCD503 zu erzeugen. Anschließend wurde Plasmid CD503 in E. coli-DH5α-kompetente Zellen transformieirt. Ein Transformant wurde als Stamm CD503 bezeichnet. Die DNA-Sequenzierung des klonierten DNA-Fragments CD503 zeigte die Existenz eines offenen Leserahmens mit einem abgeleiteten Peptid, das äußerst homolog zu einer E1α-BCKDH-Untereinheit war (2). Das klonierte genomische CD503-DNA-Fragment wurde dann als Sonde verwendet, um eine S. avermitilis-Chromosomenbibliothek durch Koloniehybridisierung zu screenen. Vier Cosmidklone wurden identifiziert, nämlich CD518, CD519, CD520 und CD521. Restriktions- und Southern-Blot-Analyse zeigten, dass die vier Klone überlappende genomische Fragmente trugen. Die DNA-Sequenzierung der ineinander gesetzten Deletionen aus subklonierten genomischen DNA-Fragmenten (wie vollständig in Beispiel #8 beschrieben) zeigte, dass Sequenz CD503 Teil eines komplexen bkd-Genclusters war. Klonierte S. avermitilis-bkd-Gene beinhalten eine Region des Chromosoms mir annähernd 15 Kilobasen Länge (3). Die DNA-Sequenzanalyse zeigte die Gegenwart von möglichen Transkriptionspromotorsequenzen und bkd-Strukturgenen, die als Cluster angeordnet sind, das wie folgt organisiert ist: Promotorsequenz, offene Leserahmen von E1α, E1β und E2 (4 und 5).
  • Schließlich wurde das vollstäildige S. avermitilis-bkd-Gencluster stromabwärts des starken Escherichia-coli-T7-Promotors für die Expression in einem E. coli-Wirt kloniert. In gleicher Weise wurden die offenen Leserahmen für E1α und E1β auch entweder getrennt oder zusammen stromabwärts des T7-Promotors kloniert und jede Konstruktion wurde bezüglich der Expression getestet. Neue mutagene PCR-Primer, die verwendet wurden, um eine einzelne NdeI-Restriktionsstelle am ATG-Translationsstart der E1α- und E1β-ORFs einzuführen, sind vollständig in Beispiel #9 beschrieben (siehe auch 6). Die Doppel-Plasmid-T7-Expressionssystemuntersuchung zeigte, dass mindestens zwei offene Leserahmen des von CD503 abgeleiteten S. avermitilis-bkd-Genclusters (E1α und E1β) vollständig translatierbar sind, wenn sie in E. coli exprimiert werden. Außerdem bestätigten enzymatische Assays, die spezifisch die E1-Komponente des BCKDH-Komplexes analysieren sollten, schlüssig, dass zwei der rekombinanten E. coli-Klone – einer, der das gesamte bkd-Gencluster trägt, und ein anderer, der die E1α- und E1β-ORFs trägt, E1-BCKDH-spezifische Enzymaktivität enthielten (Tabelle 1).
  • Es wird die Isolierung der bkd-Gene aus dem Avermectinerzeuger Streptomyces avermitilis beschrieben. Das große Streptomyces-Genom (etwa 104 kb) ist mehr als doppelt so groß als das von Escherichia coli. Das Streptomycetes-Genom ist aus DNA aufgebaut mit einem extrem hohen Anteil an Guanosin plus Cytosin (G + C) (durchschnittlich bis zu 73%, in einigen Regionen > 90%), was nahe an der oberen Grenze ist, die in der Natur beobachtet wird. Diese unterscheidenden Merkmale erfordern die Entwicklung einer Streptomycetes-spezifischen rekombinanten DNA-Technik. Beispiele für diese Anstrengungen finden sich in der US-Patentanmeldung 08/048 719, eingereicht am 16. April 1993 und der US-Patentanmeldung 08/032 925, eingereicht am 18. März 1993.
  • Andere Techniken, die spezifisch für die Zwecke der Erfindung optimiert wurden, wie die PCRgenomische DNA-Amplifikation, Erzeugung von ineinander gesetzten Deletionen, DNA-Sequenzierung und heterologe Expression der S. avermitilis-bkd-Gene in E. coli werden im Detail im Abschnitt der Beispiele beschrieben.
  • Eine vollständige Beschreibung der experimentellen Stufen, die einer Klonierung der S. avermitilis-bkd-Gene beteiligt sind und die erhaltenen Ergebnisse folgt:
  • (a) Identifizierung von konservierten Regionen in der E1α-BCKDH-Peptiduntereinheit, die als Kandidatenstellen für die Bindung von PCR-Primern dienen könnten
  • Vier E1α-BCKDH-Peptidsequenzen von Mensch (Fisher et al., 1989, J. Biol. Chem., 264: 3448–3453), Ratte (Zhang et al., 1987, 1. Biol. Chem., 262: 15220–15224), Pseudomonas putida (Sokatch et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 311–317) und Bacillus stearothermophilus (Perham et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337–346) wurden so ausgerichtet, dass konservierte Regionen identifiziert werden konnten, die als Kandidatensequenzen dienen könnten, um entsprechende PCR-Primer zu entwickeln. Die Computeranalyse, um Regionen der E1α-Untereinheit zu identifizieren, die hochkonserviert sind, sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen BCKDH-Komplexen, erfolgte unter Verwendung der LineUp- und Pretty-Programme der GCG-Sequenzanalyse-Software (Madison, WI). Eine mehrfache Ausrichtung der vier E1α-BCKDH-Peptide zeigte mehrere Regionen mit stärkerer Homologie (siehe I. D. Wexler et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209–213). Das Thiaminpyrophosphatbindungsmotiv (Perham et al., 1989, FEBS Letters, 255: 77–82), das zwischen den menschlichen E1α-Aminosäuren 182–229 angeordnet ist, und eine Region, die die Phosphorylierungsstellen 1 und 2 umfasst und die Aminosäuren 245 bis 289 überspannt, war bemerkenswert konserviert bei allen vier analysierten E1α-BCKDH-Peptiden. Es war auch eine vorher beschriebene Region mit starker Homologie vorhanden, die zwischen den Aminosäuren 291 und 307 angeordnet ist. Diese Region scheint für α-Ketosäuredehydrogenasen einzigartig zu sein, die sowohl α- als auch ββ-Untereinheiten haben, und ist nicht homolog zu irgendeiner Sequenz in E. coli-PDC-E1 oder den E1-Komponenten von E. coli und Hefe-α-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexen, die Dimere sind, die nur aus einem einzigen E1-Polypeptid aufgebaut sind. Aus den oben erwähnten Gründen wurde vorgeschlagen, dass letztere Region mit Homologie eine Rolle bei der Untereinheitswechselwirkung spielt (Patel et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209–213). Konservierte Regionen, die für den PCR-Primeraufbau ausgewählt wurden, codierten die Aminosäurereste 192 bis 200 und 370 bis 376 des menschlichen E1α-BCKDH-Proteins.
  • (b) Aufbau neuer Oligonucleotide, die von diesen konservierten Regionen von E1α-BCKDH abgeleitet sind, die als PCR-Primer verwendet werden sollen
  • Wie vorher diskutiert, wurden zwei konservierte Regionen der E1α-BCKDH-Untereinheit aus der Mehrfachausrichtungsuntersuchung ausgewählt. Der rechtsgerichtete PCR-Primer (1) wurde zugeschnitten auf eine Region, die die Aminosäuren 192 bis 200 der menschlichen E1α-BCKDH-Untereinheit umfasst, die als repräsentatives Modell einer E1α-BCKDH-Untereinheit verwendet wurde. Diese Aminosäuren sind innerhalb des Thiaminpyrophosphatbindungsmotivs angeordnet. Der linksgerichtete PCR-Primer (1) wurde zugeschnitten auf eine Region, die die Aminosäuren 370 bis 376 der E1α-BCKDH-Untereinheit umfasst. Letztere Aminosäuresequenz ist nahe dem C-terminalen Bereich des Peptids angeordnet. Streptomyces-Gencodonzuordnungen wurden verwendet (F. Wright und M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55–65). Am 5'-Ende jeden Primers gibt es eine Restriktionsenzymerkermungssequenz (EcoRI im rechtsgerichteten Primer und XbaI im linksgerichteten Primer), um die Klonierung der PCR-Produkte zu erleichtern. Die vollständige Sequenz des rechtsgerichteten PCR-Primers ist:
    5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3'.
  • Die vollständige Sequenz des linksgerichteten PCR-Primers ist:
    5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'.
  • Sequenzen, die nicht zu den E1α-bkd-Genen homolog sind und in die Primer aus Klonierungszwecken eingearbeitet wurden, sind unterstrichen (siehe auch 1).
  • (c) PCR-Amplifikation der genomischen DNA-Fragmente von S. avermitilis
  • Genomische DNA von S. avermitilis wurde enzymatisch amplifiziert unter Verwendung von Reaktionsbedingungen, die für DNA mit einem hohen GC-Gehalt geeignet sind, die eine effiziente und spezifische Amplifikation von Streptomycetes-DNA zulassen (siehe Beispiel 2). Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der oben beschriebenen Primerkombination (rechtsgerichteter Primer,
    5'-GAATTCGGCGACGGCGGCACCTCCGAGGGCGAC-3' und linksgerichteter Primer
    5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'). Die Amplifikationsprodukte wurden der Größe nach mit Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Unter den oben beschriebenen PCR-Bedingungen wurde eine einzelne DNA-Bande (ungefähr 250 Basenpaare lang) nachgewiesen, wenn diese Primerkombination verwendet wurde.
  • (d) Klonierung des amplifizierten genomischen DNA-Fragments in einem Escherichia-coli-Klonierungsvektor und nachfolgende Transformation in einen E.-coli-Wirt
  • Wie oben erwähnt, wurde eine EcoRI-Restriktionsstelle in den rechtsgerichteten PCR-Primer eingebaut, um die Klonierung zu erleichtern, und eine XbaI-Restriktionsstelle war am 5'-Ende des linksgerichteten Primers vorhanden. Versuche, das 0,25-kb-PCR-Fragment unter Verwendung eines Ligierungsverfahrens zu klonieren, bei dem sowohl Insert als auch Klonierungsvektor mir EcoRI und XbaI verdaut wurden, waren jedoch nicht erfolgreich. Daher wurde ein alternativer Ansatz zur Klonierung des 0,25-kb-PCR-Fragments, der die Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I zur Erzeugung glatter Enden in dem PCR-Fragment beinhaltete, untersucht. Ein einzelner rekombinanter Klon wurde gewonnen nach Insertieren des Fragments mit geglätteten Enden in einen mit SmaI linearisierten E. coli-Vektor mit geglätteten Enden (pGEM-3Z[f+]), um das rekombinante Plasmid pCD503 zu erzeugen. Anschließend wurde pCD503 in E. coli-DH5αα-kompetente Zellen durch Transformation eingeführt. Der selektierte Transformant wurde als Stamm CD503 bezeichnet. Eine bestätigende Restriktionsanalyse zeigte, dass Plasmid pCD503 – isoliert aus E. coli Stamm CD503 – tatsächlich das 0,25 kb S. avermitilis-Insert enthielt.
  • (e) Subklonierung des mit PCR amplifizierten 0,25-kb-DNA-Inserts in dem Bakteriophagen M13, Sequenzierung der DNA des klonierten Fragments und Identifikation der bkd-spezifischen Sequenzen
  • Das in Plasmid pCD503 vorhandene 0,25 kb-Insert wurde in dem Bakteriophagen M13 subkloniert. Um dies zu erreichen, wurde zuerst das Insert aus dem E. coli-Vektor freigesetzt, indem pCD503 mit EcoRI und PstI, zwei Restriktionsenzymen, deren Erkennungssequenzen in der Mehrfachklonierungsstelle des pGEM-Vektors vorhanden waren, an beiden Seiten des klonierten Inserts, verdaut wurde. Das spezifische Fragment wurde dann in sowohl mit EcoRI als auch PstI-behandelte M13mp18- und mp19-Vektoren kloniert. Die Klonierung in beiden Vektoren stellt die Möglichkeit sicher, einzelsträngige DNA beider Sträge der Insert-DNA zu erzeugen für die Sequenzierung. Ein Klon, der das spezifische Insert enthält, ausgewählt aus dem mp18-Transfektionsversuch, wurde als Stamm CD505 benannt. Ein weiterer Klon, der auch das spezifische Insert enthielt, aber aus dem mp19-Transfektionsexperiment ausgewählt wurde, wurde als CD506 bezeichnet. Die DNA-Sequenzierung wurde mit der Didesoxynucleotid-Kettenabbruchmethode durchgeführt mir einer einzelsträngigen Matrize und dem TaqTrack-Kit (Promega). In allen Fällen wurden beide Stränge der DNA – einer von Klon CD505 abgeleitet, der komplementäre Strang von Klon CD506 abgeleitet – sequenziert. Die Codonpräferenzanalyse (GCG-Sequenzanalyse-Software, Madison, WI) der aus den Klonen CD505 und CD506 erhaltenen DNA-Sequenzierungsdaten zeigte die Existenz eines offenen Leserahmens mit der richtigen Codonverwendung für ein Streptomycetesgen.
  • Als nächstes wurde der mögliche offene Leserahmen in eine Aminosäuresequenz übersetzt unter Verwendung der Seq- und Translate-Programme der IntelliGenetics Suite Software (IntelliGenetics Inc., Mountain View, Kalifornien). Schließlich wurde eine Datenbankähnlichkeitssuche mit der Fragepeptidsequenz unter Verwendung des FASTDB-Programms der IntelliGenetics Software durchgeführt. Alle Datenbankrecherchen, die entweder in DNA-Datenbanken (GenBank und EMBI) oder Proteindatenbanken (PIR und Swiss-Prot) recherchierten, zeigten eindeutig, dass die aus Klon CD503 abgeleitete Sequenz stark homolog, aber neu und unterschiedlich zu allen anderen in den Datenbanken aufgeführten E1α-BCKDH-Peptiden, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Ursprungs war. Eine mehrfache Ausrichtung der E1α-BCKDH-Peptidsequenzen aus Mensch, Ratte, Pseudomonas putida und Bacillus stearothermophilus und einschließlich der neuen Streptomyces avermitilis-E1α-BCKDH-CD503-Peptidsequenz ist in 2 gezeigt. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass das in E. coli-Stamm CD503 klonierte 250-bp-S. avermitilis-Genom-PCR-Produkt tatsächlich ein neues E1α-bkd-Genfragment darstellt.
  • (f) Klonierung des vollständigen S. avermitilis-bkd-Genclusters, Restriktions- und Southern-Blot-Analyse und Konstruktion der Chromosomenkarte
  • Ein ungefähr 0,25 kb langes BamHI/EcoRI-DNA-Fragment aus pCD503, das die E1α-bkd-spezifizische S. avermitilis-DNA-Sequenz trug, wurde als radioaktiv markierte Sonde verwendet, um eine genomische S. avermitilis-DNA-Cosmidbibliothek zu screenen durch Koloniehybridisierung. Vier Klone (CD518, CD519, CD520 und CD521) wurden identifiziert und gewonnen. Restriktions- und Southern-Blot-Hybridisierungsanalysen zeigten, dass die vier Klone überlappende Sequenzen enthielten, die aus dem gleichen Chromosomenbereich stammten. Die gleiche Sonde wurde mit hoher Stringenz gegen Southern Blots von verdauter chromosomaler DNA aus S. avermitilis ATCC 31272 verwendet. Die letztere Analyse bestätigte die Identität der Klone, die aus der Genombibliothek gewonnen wurden. Eine Restriktionskarte der genomischen Region, die die S. avermitilis-CD503-Sequenz enthält, ist in 3 gezeigt.
  • (g) Subklonierung von genomischen DNA-Fragmenten, abgeleitet aus den Klonen CD518 und CD521, und DNA-Sequenzierung der Chromosomenregion von S. avermitilis, die den bkd-Gencluster trägt
  • Genomische Fragmente (1 bis 2 kb lang), die die gesamte CD503-bkd-Region des S. avermitilis-Chromosoms abdecken, wurden aus DNA-Bibliotheksklonen CD521 und CD518 in E. coli-Vektor pGEM-3Z subkloniert. Eine Liste der während dieser Arbeit konstruierten Subklone einschließlich einer kurzen Beschreibung jeden Plasmids folgt: 1. Plasmid pCD528 enthält ein 7 kb BamHI-Fragment, subkloniert aus pCD518; 2. Plasmid pCD545 enthält ein 2,3 kb SphI-Fragment, subkloniert aus pCD528; 3. Plasmid pCD550 enthält ein 6 kb SphI-Fragment, subkloniert aus pCD521; 4. Plasmid pCD559 enthält ein 7 kb BamHI-Fragment subkloniert aus pCD521; 5. Plasmid pCD574 enthält ein 4,2 kb kB SphI/BglII-Fragment subkloniert aus pCD550 und 6. Plasmid pCD577 enthält ein ungefähr 10,4 kb-Insert. Dieses Insert enthält zwei benachbarte genomische Fragmente, die wieder zusammengesetzt wurden: Ein 4,2 kb SphI/BglII-Fragment, subkloniert aus pCD550, und ein 6,2 kb BglII/BamHI-Fragment, subkloniert aus pCD559. Plasmidrestriktionskartierung, Southern-Hybridisierung und PCR-Analyse bestätigten die Identität jeden Subklons. Die Sanger-Kettenabbruchmethode wurde zur Bestimmung der Nucleotidsequenz verwendet. Für diesen Zweck wurden genomische Fragmente von S. avermitilis anschließend in M 13mp18 und M 13mp19-Bakteriophagen subkloniert, um die Sequenz beider DNA-Stränge zu bestimmen. Verschiedene DNA-Restriktionsfragmente wurden aus den von pGEM abgeleiteten Klonen, die oben erwähnt wurden, isoliert und in M13mp18 und M13mp19 ligiert und die folgenden rekombinanten Phagen entstanden:
  • CD535: 0,4 kb S. avermitilis-DNA-Fragment kloniert durch PCR unter Verwendung einer pCD528 DNA als Matrize, spezifische Primer 29-PCR-EX
    (5'-AAGAATTCTCGAGCTGGCCGACAAGGCCGTCGGCTAC-3')
    und universeller Primer 31-PCR-BP (siehe Beispiel #9 und 6). Amplifiziertes Fragment wurde mit EcoRI und PstI geschnitten und in mit EcoRI/PstI linearisierte M13mp18-DNA kloniert.
  • CD536: Gleiches DNA-Fragment, wie oben beschrieben, kloniert in M13mp19DNA.
  • CD537: 1,15 kb SalI-DNA-Fragment mit der Sequenz CD503, subkloniert von pCD528 in M13mp18.
  • CD538: 1,15 kb SalI-pCD528-DNA-Fragment (stromaufwärts des 1,15 kb SalI-Fragments angeordnet, das oben beschrieben wurde), kloniert in M13mp18.
  • CD539: 1,5 kb BamHI/BglII-DNA-Fragment, subkloniert aus pCD550 in M13mp18.
  • CD540: Gleiches DNA-Fragment, wie oben beschrieben, kloniert in entgegengesetzter Orientierung in M13mp18.
  • CD541: 0,35 kb SalI/BamHI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD528 in M13mp18.
  • CD542: 0,35 kb SalI/BamHI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD528 in M13mp19.
  • CD553: 0,8 kb BamHI/BglII-DNA-Fragment subkloniert aus pCD550 in M13mp18.
  • CD554: 1,1 kb BamHI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD550 in M13mp18.
  • CD555: Gleiches DNA-Fragment, wie oben beschrieben, kloniert in entgegengesetzter Orientierung in M13mp18.
  • CD558: 0,8 kb BamHI/HindlII-DNA-Fragment subkloniert aus pCD553 in M13mp19.
  • CD561: 1,15 kb SalI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD537 in M13mp18 (entgegengesetzte Orientierung zu der in Konstrukt CD537).
  • CD565: 1,15 kb SalI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD537 in M13mp19.
  • CD566: 1,15 kb SalI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD537 in M13mp19 (entgegengesetzte Orientierung zu der in Konstrukt CD565).
  • CD567: 1,15 kb SalI-DNA-Fragment subkloniert aus pCD538 in M13mp19.
  • CD582: 0,8 kb BamHI/BglII-DNA-Fragment subkloniert aus pCD550 in M13mp18 (entgegengesetzte Orientierung zu der in CD553).
  • Die genomischen Inserts aus S. avermitilis, die diese Klone tragen, wurden anschließend gekürzt durch Behandlung mit Exonuclease III, um eine Reihe von Subklonen zu schaffen ("ineinander gesetzte Deletionen"), siehe Beispiel #8).
  • (h) Computeranalyse der DNA-Sequenzierungsdaten, die aus klonierten DNA-Fragmenten erhalten wurden, und Identifikation der offenen Leserahmen von E1α, E1β und E2-bkd von S. avermitilis
  • Die Nucleotidsequenz der 2,7 kb genomischen Region von S. avermitilis, die die bkd-Gene enthält, ist in 4 gezeigt. Eine gleitende Basenzusammensetzungsanalyse der 2,7 kb genomischen Region, die die offenen Leserahmen für E1α, E1β und E2 (teilweise) von bkd aus S. avermitilis enthält, wurde durchgeführt unter Verwendung der "DNA-Inspector"-Software. Diese Analyse lieferte ein Profil des laufenden Durchschnitts des G + C-Gehalts unter Verwendung einer Streckenlänge von 30 Basen und eines Versatzwertes von 20. Der Gesamt-G + C-Gehalt, der dieser Region von S. avermitilis-Chromosom entsprach, war 72%. Ein niedriger G + C-Wert (G + C-Gehalt etwa 50%) – Hinweis auf eine Promotorregion – war direkt stromaufwärts der offenen Leserahmen für bkd angeordnet.
  • Der G + C-Gehalt als Funktion der Codonposition wurde auch analysiert. Offene Leserahmen wurden nachgewiesen unter Verwendung des Programms "CodonPreference" (Genetics Computer Group, Madison, WI) mit einer Streptomyces-Codonverwendungstabelle für 64 Gene (F. Wright und M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65). Das CodonPreference-Programm ist ein rahmenspezifischer Genfinder, der versucht, Protein codierende Sequenzen zu erkennen durch die Ähnlichkeit einer Codonhäufigkeitstabelle oder durch Bevorzugung ihrer Zusammensetzung (gewöhnlich GC) an dritter Position jeden Codons. ORFs wurden als Kästen neben dem Schema für die jeweiligen Leserahmen gezeigt. Alle Start-(ATG) und Stoppcodons wurden auch nachgewiesen (vertikale Linien). Seltene Codons, die in jedem Leserahmen gefunden wurden, wurden unter jedem ORF-Schema markiert. Der G + C-Gehalt wurde berechnet unter Verwendung eines Gleitfensters von 25 Codons, so dass ein Vorlauf von etwa 25 Codons erwartet wurde, bevor der volle Hinweis auf eine Protein codierende Region beobachtet wurde. Drei Profile wurden erhalten wie folgt: 1. Erste Position im Triplett; 2. Zweite Position im Triplett; 3. Dritte Posi tion im Triplett. Als Ergebnis dieser Analyse wurden drei bkd-ORFs lokalisiert, die den folgenden BCKDH-Untereinheiten entsprechen: E1α, E1β, E2 (4 und 5).
  • (i) Aufbau neuer Oligonucleotide, die als Primer für auf PCR basierende ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden
  • Eine auf Linker basierende oder PCR basierende ortsgerichtete Mutagenese wurde verwendet, um eine NdeI-Restriktionsstelle an der ATG-Translationsstartstelle der E1α- und E1β-ORFs einzuführen. Die folgenden neuen Oligonucleotide wurden entwickelt (siehe auch Beispiel #9 und 6):
  • Linksgerichtete universelle (Vektor) Primer:
    Figure 00160001
  • Rechtsgerichtete mutagene Primer:
    Figure 00160002
  • (j) Ortsgerichtete Mutagenese von S. avermitilis-bkd-Genen, um neue NdeI-Restriktionsstellen stromaufwärts eines offenen Leserahmens zu erzeugen
  • Expressionsplasmide waren Derivate von Plasmid pT7-7 (siehe S. Tabor, 1990. In Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 16.2.1–16.2.11, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York), die die E1α-, E1β-, E1α- plus E1β-ORFs oder das vollständige S. avermitilis-bkd-Gencluster tragen. NdeI-Restriktionsstellen wurden erzeugt durch auf PCR basierende ortsgerichtete Mutagenese. Fünf Expressionsplasmide wurden für diese Untersuchung konstruiert wie folgt:
  • Plasmid pCD670: Derivat von pT7-7, das den offenen Leserahmen für das E1α-bkd von S. avermitilis trägt (ORF1). Eine NdeI-Restriktionsstelle, die das ATG-Startcodon überspannt, wurde in das S. avermitilis-E1α-bkd-Gen eingeführt durch Amplifikation und gleichzeitige Mutagenese unter Verwendung des mutagenen PCR-Primers 55-PCR (siehe Beispiel #9 und 6).
  • Plasmid pCD666: Derivat von pT7-7, das den offenen Leserahmen für S. avermitilis-E1β-bkd trägt (ORF2). Eine NdeI-Restriktionsstelle, die das ATG-Startcodon überspannt, wurde in das S. avermitilis-E1β-bkd-Gen eingeführt durch Amplifikation und gleichzeitige Mutagenese unter Verwendung des mutagenen PCR-Primers 56-PCR (siehe Beispiel #9 und 6). Um eine optimale Expression dieses Leserahmens zu erreichen, wurde die dritte Position von Codon 7 von C zu G verändert, um ein Codonsynonym zu erzeugen, das der E. coli-Codonverwendung ähnelt. Die E1β-Peptidsequenz wurde durch diese Veränderung nicht beeinflusst.
  • Plasmid pCD736: Derivat von pT7-7, das sowohl E1α- (ORF1) als auch E1β- (ORF2)-ORFs unter der Kontrolle des T7-Promotors trägt.
  • Plasmid pCD705: Wie pCD736, bei dem aber die 3'-Hälfte des E1β-ORFs in der falschen Orientierung angeordnet ist. Dieses Konstrukt wurde als negative Kontrolle in Expressionsversuchen verwendet.
  • Plasmid pCD685: Derivat von pT7-7, das das vollständige S. avermitilis-bkd-Gencluster trägt.
  • (k) Expression der offenen Leserahmen von S. avermitilis-bkd in E. coli unter Verwendung des T7-Doppelplasmidexpressionssystems
  • Die Expression der S. avermitilis-bkd-Gene in E. coli wurde erreicht unter Verwendung des T7-RNA-Polymerase/Promotor-Doppelplasmidsystems, im Wesentlichen wie von S. Tabor beschrieben (1990 in Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 16.2.1–16.2.11. Greene Publishing and Wiley Interscience, New York). Derivate von E. coli C600 (pGP-1), die verschiedene pT7-7-Konstruktionen enthielten, wurden analysiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde verwendet, um die Expression von S. avermitilis-ORFs in dem E. coli-Wirt nach Hitzeinduktion zu überwachen. Die SDS-PAGE-Analyse des Proteinprofils bei Induktion zeigte eine Überexpression der induzierten Peptide mit einer Größe gleich dem vorhergesagten Wert (wie aus der entsprechenden DNA-Sequenz abgeleitet) für die E1α- und E1β-ORFs wie folgt:
  • Figure 00170001
  • (l) Detektion von E1-S. avermitilis-BCKDH-Aktivität durch spezifischen Assay im Rohextrakt von rekombinantem E. coli-Klon
  • Tabelle 1 unten (Beispiel 11) fasst diese Ergebnisse zusammen. E1-spezifische BCKDH-Assays, die an Rohextrakten von E. coli-Zellen durchgeführt wurden, die pCD736 trugen, zeigten eine signifikante E1-Aktivität bei Induktion des T7-Promotors. Eine gleiche Kultur, die ein Konstrukt mit einem Teil des Inserts, angeordnet in der falschen Orientierung, trug (pCD705) zeigte den Hintergrundanteil an Aktivität.
  • Außerdem deuteten enzymatische Assays an, dass rohe Extrakte aus dem E. coli-Stamm, der das Plasmid pCD685 enthält, auch eine signifikante E1-BCKDH-Aktivität haben (> dem zehnfachen Hintergrundanteil). Eine nicht induzierte Kultur dieses Klons wurde auch analysiert und zeigte einen Grundaktivitätspegel vom zweifachen über Hintergrund. Letzteres Ergebnis wird erwartet, da bekannt ist, dass das T7-System einen geringen Anteil an konstitutiver Expression der klonierten Gene sogar unter nicht induzierten Bedingungen zulässt.
  • Das klonierte Streptomyces avermitilis-bkd-Gencluster ist nützlich, um die natürliche Avermectinproduktion zu verbessern, indem die Kopienzahl dieser Gene erhöht wird oder durch Optimierung der Expression in Produktionsstämmen. Ein möglicher Ansatz, um eine effiziente Expression der klonierten bkd-Gene zu erreichen, beinhaltet die Insertion dieser Gene in einen Multicopy-E. coli/Streptomycetes-Shuttlevektor (z. B. Plasmid pCD262, C. D. Denoya, 1993, "Novel Bacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli", U.S.-Patentanmeldung 08/032 925, eingereicht am 18. März 1993), so dass die Gene von einem starken Promotor transkribiert werden. Dieses Verfahren sichert eine effiziente Transkription der Gene. Zusätzlich können bestimmte Strategien erarbeitet werden, um eine effiziente Expression zu garantieren. Diese schließen (a) Promotorstärke; (b) Stabilität der mRNA; (c) Gegenwart oder Abwesenheit von regulierenden Faktoren; (d) Induzierbarkeit und (e) ortsgerichtete Mutagenese, und die Ribosomenerkennung und Translationsstartsignale zu verbessern, ein. Die Expression der bkd-Gene sollte auch optimiert werden, indem der Wildtyppromotor und regulatorische Regionen durch verschiedene Promotoren mit Genersatztechniken ersetzt werden. Es gibt viele Beispiele in der Literatur für nützliche Promotoren, die angewendet werden könnten, um die Expression der neuen S. avermitilis-bkd-Gene, die hier offenbart werden, zu optimieren, z. B. den starken ermE-Promotor (Hopwood et al., 1985, "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, GB) und der Thiostrepton-induzierbare tipA-Promotor (Murakami et al., 1989, J. Bacteriol., 171, 1459-1466). Zusätzlich werden durch die Inaktivierung der bkd-Gene und die gleichzeitige Abwesenheit der BCKDH-Aktivität, durch Deletion oder ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von Genersatztechniken verbesserte Streptomyces avermitilis-Stämme mit irreversibel blockiertem bkd entwickelt, die zur Produktion neuer Avermectine nützlich sind.
  • Beispiele
  • Im Folgenden sind detaillierte Beispiele der Versuchsverfahren angegeben, die verwendet wurden, um die bkd-Gene aus S. avermitilis zu klonieren und zu analysieren, die auch in den beigefügten Figuren erläuert sind.
  • Zusätzliche Details von Standardtechniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohl bekannt sind und die Bezeichnung der jeweils verwendeten Enzyme werden z. B. in dem Laborhandbuch "Molecular Cloning" von Maniatis et al. (Cold Spring Harbor laboratory, 1989) beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von genomischer S. avermitilis-DNA
  • S. avermitilis ATCC 31272-Mycel wurde als zusammenfließender Rasen auf YPD-2-Agarmedium 7 Tage bei 29°C gezüchtet. Das Medium enthielt:
    Difco Hefeextrakt 10 Gramm
    Difco Bactopepton 10 Gramm
    Dextrose 5 Gramm
    Difco Bactoagar 20 Gramm
    Natriumacetat 2 Gramm
    MOPS 10 Gramm
    pH eingestellt auf 7,0
    Endvolumen: 1 l
    Autoklav 25 Minuten bei 121°C.
  • Das gewachsene Mycel wurde dann verwendet, um 30 ml AS-7-Medium zu beimpfen (siehe Hafner et al., 1988, Europäische Patentanmeldung #88 300 353.5, Veröffentlichungsnummer #0 284 176) in einem unterteilten 300-ml-Kolben, das 24 Stunden lang unter Schütteln (230 U/min) auf 29°C gehalten wurde. Das Medium enthielt:
    Verdünnte Stärke1 20 Gramm
    Ardamin pH2 5 Gramm
    Pharmamedia3 15 Gramm
    Calciumcarbonat (CaCO3) 2 Gramm
    pH eingestellt auf 7,2 mit Natriumhydroxid (NaOH)
    Endvolumen: 1 l
    Autoklav 25 Minuten bei 121°C
  • Ungefähr 0,3 ml der obigen Kultur wurden verwendet, um einen weiteren unterteilten 300-ml-Kolben zu impfen, der 30 ml modifiziertes flüssiges Hefeextrakt-Malzextrakt-(YEME)-Medium (M. J. Bibb, R. F. Freeman und D. A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155–166) enthielt. Modifiziertes YEME-Medium enthielt pro Liter:
    Difco Hefeextrakt 3 Gramm
    Difco Bactopepton 5 Gramm
    Oxoid Malzextrakt 3 Gramm
    Saccharose 300 Gramm
    Glucose 10 Gramm
    Autoklaviert 40 Minuten bei 121°C.
  • 2 ml 2,5 M Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2·6 H2O) wurden nach dem Autoklavieren zugegeben. Endvolumen eingestellt auf 1 l.
  • Die Kulturen wurden bei 29°C 48 bis 72 Stunden lang gezüchtet. Das Mycel wurde durch Zentrifugation gewonnen und genomische DNA wurde gemäß dem Protokoll "Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Procedure 2" präpariert, wie im Lehrbuch "Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985, von Dr. D. A. Hopwood et al. als Autor, angegeben. Die DNA-Pellets wurden in 3 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert.
  • Beispiel 2
  • Amplifikation der genomischen DNA von S. avermitilis mit Polymerasekettenreaktion
  • Genomische DNA von S. avermitilis wurde enzymatisch amplifiziert unter Verwendung einer Perkin-Elmer Cetus-Temperaturwechselvorrichtung. Die PCR-Reaktion wurde mit Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) und dem Puffer, der vom Hersteller geliefert wurde, in Gegenwart von 200 μM dNTP, 15% Glycerin, 0,5 μM jedes Primers, 50 ng Matrizen-DNA (in diesem Fall genomische DNA von S. avermitilis) und 2,5 Einheiten Enzym in einem Endvolumen von 100 μl 30 Zyklen lang durchgeführt. Das Temperaturprofil des ersten Zyklus war wie folgt: 95°C 3 Minuten (Denaturierungsstufe), 55°C 2 Minuten lang (Annealingstufe) und 72°C 2 Minuten lang (Verlängerungsstufe). Die nachfolgenden 29 Zyklen hatten dasselbe Temperaturprofil, außer dass die Denaturierungsstufe auf 1,5 Minuten gekürzt wurde. Die DNA-Primer wurden von Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) geliefert. Der rechtsgerichtete Primer (1) war 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' und der linksgerichtete Primer (1) war 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'. Die Amplifikationsprodukte wurden der Größe nach mit Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Die PCR-Probe wurde elektrophoresiert in einem horizontalen 1,5%-Agarosegel in 1 × TBE-Puffer (90 mM Tris-HCl, pH 8,5, 90 mM Borsäure, 2,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1,5 Stunden lang bei 100 V, wie von Maniatis et al. beschrieben. Die getrennten PCR-DNA-Produkte wurden in dem Gel lokalisiert durch Anfärben mir Ethidiumbromid und Sichtbarmachen fluoreszierender Banden mit 365 nm Ultraviolettlicht. Unter den oben beschriebenen PCR-Bedingungen wurde eine einzelne DNA-Bande (ungefähr 250 Basenpaare lang) nachgewiesen unter Verwendung dieser Primerkombination.
  • Beispiel 3
  • Klonierung eines durch PCR amplifizierten genomischen DNA-Fragments von S. avermitilis mit 0 25 kb in einen E. coli-Vektor und nachfolgende Transformation in einem E. coli-Wirt
  • A. Gewinnung des 0,25-kb-PCR-Produkts
  • Wie oben erwähnt, wurde ein 0,25-kb-DNA-Fragment mit PCR amplifiziert unter Verwendung von genomischer DNA von S. avermitilis als Matrize und der Kombination aus rechtsgerichtetem und linksgerichtetem Primer. Wie in 1 gezeigt, hatte der rechtsgerichtete Primer eine EcoRI-Erkennungsstelle, die am 5'-Ende angeordnet war, und der linksgerichtete Primer hatte eine XbaI-Erkennungsstelle am 5'-Ende. Versuche, das 0,25-kb-PCR-Fragment zu klonieren durch Verwendung eines Ligierungsverfahrens, bei dem sowohl Insert als auch Klonierungsvektor mit EcoRI und XbaI verdaut wurden, waren jedoch nicht erfolgreich. Daher wurde ein alternativer Ansatz zur Klonierung des 0,25-kb-PCR-Fragments untersucht unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I, um glatte Enden an dem PCR-Fragment zu erzeugen. Nach der Amplifikation (wie in Beispiel 2 beschrieben) wurden ungefähr 80 μl PCR-Reaktion zweimal mit Phenol-Chloroform extrahiert, zweimal mit Ether extrahiert und dann das PCR-DNA-Produkt mit Ethanol ausgefällt, wie vorher beschrieben. Die DNA wurde wieder in 18,5 μl H2O suspendiert. Dann wurden 2,5 μl 10 × Nick-Translationspuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M Magnesiumsulfat (MgSO4,), 1 mM Dithiothreitol, 500 μg/ml Rinderserumalbumin) (Maniatis et al., 1989) und 20 Einheiten des Klenow-Fragments von E. coli-DNA-Polymerase I (Boehringer Mannheim Biochemicals) zugegeben und die Mischung 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden 1 μl 2 mM dNTP (jeweils 2 mM der 4 dNTPs) zugegeben und der Ansatz weiterhin bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Die Paarbildungsreaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 1 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0, und der Gesamtgehalt der Reaktionsmischung wurde auf 1,5% Agarosegel geladen und elektrophoretisch aufgetrennt. Das 0,25-kb-DNA-Fragment wurde sichtbar gemacht, wie vorher beschrieben, und durch Elektroelution wie folgt gewonnen: Die 0,25-kb-DNA-Bande wurde mit einer Rasierklinge entfernt und die DNA aus dein Agarosegel durch Elektroelution 35 Minuten lang bei 80 Volt in einem V-förmigen Napf, der mit 10 M Ammoniumacetat gefüllt war, unter Verwendung eines in eine Richtung gerichteten Elektroelutionsgeräts (International Biotechnology Inc., New Haven, CT) gewonnen. Die DNA wurde dann mit Ethanol ausgefällt, pelletisiert und schließlich wieder in 20 μl DNA-Puffer (10 mM Tris-HCl, 4 mM Natriumchlorid (NaCl), 0,1 mM EDTA; pH 7,5) aufgelöst.
  • B. SmaI-Verdau und Dephosphorylierung von Plasmidvektor pGEM-3Z
  • Ungefähr 1 μg des Plasmids pGEM-3Zf(+) (Promega Corp., Madison, WI) und 2 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (alle Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals erworben) wurden in dem Testpuffer, der vom Lieferanten angegeben war, bei 25°C 3,5 Stunden lang inkubiert in einem Gesamtreaktionsvolumen von 40 μl, um lineare Moleküle mit glatten Enden zu erzeugen. Dann wurde der mit SmaI linearisierte Vektor dephosphoryliert unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) (erworben von Promega Corp., Madison, WI) nach den Anleitungen, die vom Lieferanten erhalten wurden. Die Reaktionsmischung wurde 35 Minuten lang bei 37°C inkubiert und DNA wurde dann zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform, zweimal mit einem gleichen Volumen Ether extrahiert und schließlich die DNA ausgefällt durch Zugabe von zwei Volumina absolutem Ethanol. Die ausgefällte DNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation mit 10.000 × G 10 Minuten lang gewonnen und im Vakuum getrocknet. Das fertige Pellet wurde wieder in 20 μl DNA-Puffer aufgelöst.
  • C. Ligierung, um pCD503 zu erzeugen
  • Etwa 9 μl des Klenow behandelten 0,25-kb-PCR-DNA-Produkts und etwa 1 μl des mit SmaI linearisierten, mit CIAP dephosphorylierten pGEM-3Zf(+) mit glatten Enden wurden über Nacht mit einer Einheit Ligase (New England BioLabs, IC, Beverly, MA) unter den vom Lieferanten spezifisch angegebenen Bedingungen bei 14°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl über Nacht inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt, indem das Testmikroröhrchen auf Eis gebracht wurde und 15 μl der Reaktionsmischung wurden dann verwendet, um kompetente E. coli-JM109-Zellen zu transformieren gemäß Standardverfahren, wie von Maniatis et al., 1989, beschrieben. Viele ampicillinresistente Transformanten wurden gewonnen. Der Plasmidvektor pGEM-3Zf(+) enthält ein DNA-Segment, das von dem lac-Operon von Escherichia coli stammt, das das aminoterminale Fragment von β-Galactosidase codiert (C. Yanisch-Perron, J. Vieira und J. Messing, 1985, Gene, 33, 103). Dieses Fragment, dessen Synthese durch Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) induziert werden kann, ist fähig zu einer intraallelischen (a) Komplementierung mit einer defekten Form von β-Galactosidase, die von dem Wirt codiert wird. E. coli-Zellen, die dem Induktor IPTG ausgesetzt sind, synthetisieren beide Fragmente des Enzyms und bilden blaue Kolonien, wenn sie auf Medien plattiert werden, die das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlorindolyl-β-D-galactosid (X-gal) enthalten. Die Insertion von Fremd-DNA in die Polyklonierungsstelle des Plasmids inaktiviert das aminoterminale Fragment der β-Galactosidase und stört die α-Komplementierung. Daher erzeugen Bakterien, die rekombinante Plasmide tragen, weiße Kolonien. Zahlreiche weiße Kolonien wurden aus diesem Transformationsversuch gewonnen. Diese Kolonien sollten das Plasmid pCD503 enthalten. Dies wurde bestätigt, indem eine Kolonie ausgewählt wurde, als Stamm CD503 bezeichnet wurde und weiter analysiert wurde. Eine einzelne Bakterienkolonie von E. coli-Stamm CD503 wurde in Luria-Bertani-(LB)-Flüssigmedium geimpft, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gemäß mikrobiologischen Standardverfahren. Das LB-Medium enthielt:
    Bactotrypton 10 Gramm
    Bacto-Hefeextrakt 5 Gramm
    NaCl 10 Gramm
    pH eingestellt auf 7,0 mit 5 n Natriumhydroxid (NaOH)
    Fertiges Volumen der Lösung eingestellt auf 1 l
    Sterilisiert durch Autoklavieren 20 Minuten bei 121°C.
  • Die Kultur wurde über Nacht bei 35°C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation mit 10.000 U/min 5 Minuten lang bei 4°C geerntet. Der Plasmidvektor wurde aus frisch geernteten Escherichia coli-CD503-Zellen isoliert unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1513), wie von Denoya et al., 1985, Microbios Lett., 29: 87, beschrieben. Die isolierte Plasmid-DNA wurde schließlich in DNA-Puffer (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5) gelöst, um eine Konzentration von ungefähr 1 μg pCD503 pro 10 μl Puffer zu erzeugen. Eine bestätigende Restriktionsanalyse unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und PstI zeigte, dass wie erwartet, pCD503 das 0.25-kb-DNA-Insert trug.
  • Beispiel
  • Herstellung von radioaktiv markierten DNA- und RNA-Sonden
  • A. Herstellung von gleichmäßig markierten doppelsträngigen DNA-Sonden
  • Doppelsträngige DNA-Sonden wurden hergestellt durch Nick-Translation (siehe Maniatis et al., 1989, für eine allgemeine Beschreibung dieser Technik). Als erstes wurde ein spezifisches DNA-Fragment, das die Zielsequenz trug, hergestellt durch geeigneten Restriktionsverdau und durch Reinigung mit Elektroelution, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Ungefähr 1 μg DNA wurde in jedem Fall markiert unter Verwendung von [α-32P]dCTP (Desoxycytidin-5'-triphosphattetra(triethylammonium)salz, [α-32P]-) erworben von NEN-Dupont, und des BRL-Nick-Translationssystems, das von BRL Life Technologies Inc. erworben wurde, gemäß den Anleitungen, die vom Hersteller erhalten wurden. Eine typische Reaktion wurde in einem Volumen von 50 μl durchgeführt. Nach Zugabe von 5 μl Stopppuffer (wie in dem von BRL empfohlenen Verfahren beschrieben) wurde die markierte DNA von nicht eingebauten Nucleotiden abgetrennt unter Verwendung der Stratagene Push-Säule nach dem Anleitungshandbuch, das vom Hersteller erhalten wurde. 32P-markierte DNA mit einer spezifischen Aktivität von gut mehr als 108 cpm/μg wurde routinemäßig mit diesem Verfahren erhalten.
  • B. Herstellung von markierten einzelsträngigen RNA-Sonden
  • 32P-markierte wurden hergestellt durch in-vitro-Transkription unter Verwendung des Riboprobe Gemini Transkriptionssystems (Promega). Ein gereinigtes Fragment der Ziel-DNA wurde in den Transkriptionsvektor pGEM-3Z kloniert unter Verwendung von Standardverfahren. Die Herstellung von Matrizenplasmid-DNA für die in-vitro-Transkriptionsreaktionen wurde durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben, wies aber eine Polyethylenglycol-(PEG)-Ausfällstufe auf, um selektiv kleine Nucleotide zu entfernen, die diese Präparate kontaminieren könnten, wie folgt: Nach der Ethanolausfällungsstufe wurde das Pellet wieder in 520 μl Nasser suspendiert. Dann wurden 100 μl 5 M NaCl und 620 μl 13% PEG (MW 6.000 bis 8.000) zugegeben. Nach dem Vermischen wurde das Röhrchen 1 Stunde auf Eis inkubiert und die DNA bei 4°C mit 10.000 × G 15 Minuten lang pelletisiert. Das Pellet wurde einmal mit 500 μl 80% kaltem Ethanol gewaschen und wieder wie gewöhnlich suspendiert. Ungefähr 1μg Matrizenplasmid-DNA wurden linearisiert unter Verwendung entweder des SacI- oder HindIII-Restriktionsenzyms und anschließend in vitro transkribiert unter Verwendung von SP6-oder T7-Bakteriophagen-DNA-abhängiger RNA-Polymerase. Cytidin-5'-triphosphattetra(triethylammonium)salz, [α-32P] (CTP), erhalten von NEN-Dupont wurde in dieser Reaktion verwendet. Die Reaktionsbedingungen waren wie vom Hersteller empfohlen. Nach der Inkubation wurde die Reaktionsmischung mit einer Einheit RQ1-DNase (Promega) versetzt, um die DNA-Matrize abzubauen, zweimal mit Phenol-Chloroform extrahiert und dann mit Erhanol ausgefällt unter Verwendung von Standardverfahren. Das Pellet wurde getrocknet und wieder in 20 μl RNase-freiem Wasser (Promega) resuspendiert. Ein kleines Aliquot des markierten RNA-Transkripts wurde mit Polyacrylamidagarosegel-Elektrophorese analysiert, wie von Denoya et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 3857–3860, beschrieben. Unter den hier beschriebenen Bedingungen wurden markierte Transkripte mit voller Länge routinemäßig erhalten.
  • Beispiel 5
  • Analyse von genomischer DNA von S. avermitilis mit Southern-Hybridisierung
  • Ungefähr 10 μg von gereinigter genomischer DNA von S. avermitilis wurden mit 2 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI bei 37°C mindestens 2 Stunden lang verdaut. Am Ende des Verdaus wurden die DNA-Fragmente durch Elektrophorese aufgetrennt auf einem 1%-Agarosegel (siehe Beispiel 1A) und wurden über Nacht auf eine Nylonmembran (Porengröße 0,45 μm) (Schleicher und Schüll Nytranmembranen) unter Verwendung der Kapillartransfermethode (E. M. Southern, 1975, J. Mol. Biol., 98: 503) transferiert. Am nächsten Tag wurden die Nylonmembranen in Plastikfolie eingewickelt und die DNA-Seite jeder Membran wurde einer Quelle für Ultraviolettstrahlung (302 nm) ausgesetzt, um die DNA an der Membran zu fixieren. Die Hybridisierung von radioaktiv markierten RNA- oder DNA-Sonden mit DNA, die auf Nylonmembranen immobilisiert war, wurde durchgeführt gemäß dem bei Maniatis et al. (1989) beschriebenen Protokoll. Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 42°C durchgeführt. Die Hybridisierungslösung enthielt: 6 × SSC (1x: 0,15 M Natriumchlorid (NaCl), 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 10 × Denhardt's Reagenz [1x: 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin], 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 100 μg/ml denaturierte fragmentierte Lachssperm-DNA, 100 μg/ml E. coli tRNA und 50% Formamid (Fluka). Nach über-Nacht-Hybridisierung wurden die Membranen wie folgt gewaschen: zweimal Waschen mit 1 × SSC, 0,1% SDS, 15 Minuten bei Raumtemperatur und zweimal mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 15 Minuten bei 42°C. Bei einigen Versuchen wurde die Hybridisierung bei 65°C ohne Formamid durchgeführt und SSPE (1x: 0,18 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat (NaPO4), pH 7,7, 1 mM EDTA) anstelle von SSC verwendet. Schließlich wurden die Membranen einem Röntgenfilm ausgesetzt, um ein autoradiografisches Bild zu erhalten.
  • Beispiel 6
  • Klonierung des genomischen CD503-Fragments von S. avermitilis mit 0.25 kb in dem Bakteriophagen M13 und DNA-Sequenzierung
  • Das DNA-Fragment CD503 von S. avermitilis mit 0,25 kb wurde in die Bakteriophagen M13mp18 und M13mp19 kloniert zur Herstellung von einzelsträngiger rekombinanter DNA, die als Matrizen bei der Didesoxysequenzierungsmethode von Sauger verwendet werden sollte (Sauger et al., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74: 5463–5467). Etwa 2 μg des Plasmids pCD503, hergestellt mit einem Miniprep-Verfahren, wie oben beschrieben, wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut, um das genomische Insert von S. avermitilis mit 0,25 kb freizusetzen. Vorher zeigte eine Restriktionsanalyse, dass allein mit EcoRI oder PstI verdautes pCD503 linear war. Diese Analyse zeigte, dass das 0,25-kb-Insert weder eine EcoRI- noch eine PstI-Erkennungsstelle enthielt. Die Verdaumischung wurde in einem 1,2%-Agarosegel elektrophonetisch behandelt und das 0,25-kb-Fragment wurde elektroeluiert und ausgefällt, wie vorher beschrieben. Außerdem wurden et al μg jeder gereinigten doppelsträngigen replikativen Form (RF) von M13mp18- und M13mp19-DNA doppelt mit EcoRI und PstI verdaut, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) (erworben von Promega Corp., Madison, WI) dephosphoryliert und schließlich mit dem 0,25-kb-DNA-Fragment ligiert, wie vorher beschrieben. Gereinigte RF-M13-Klonierungsvektoren wurden von New England Biolabs erworben. Ligierungsmischungen wurden verwendet, um kompetente E. coli-JM109-Zellen zu transfizieren. Ein einziger weißer Plaque von der mp18-Transfektion und ein einziger von der mp19-Transfektion wurden ausgewählt, Phagen gezüchtet und einzelsträngige DNA hergestellt, wie beschrieben (Maniatis et al., 1989). Die DNA-Sequenzierung jeder einzelsträngigen DNA-Matrize wurde durchgeführt unter Verwendung der M13-spezifischen -40-Sequenzierungsprimer (New England Biolabs, Katalog #1212), Desoxyadenosin-5'-[α-thio]triphosphat, [35S] (NEN-Dupont) und des TaqTrack-Sequenzierkits (Promega) gemäß den Instruktionen, die vom Hersteller geliefert wurden (Promega). Die DNA-Sequenzierungsdaten des genomischen Fragments von S. avermitilis, pCD503, sind in 4 gezeigt.
  • Beispiel 7
  • Klonierung des vollständigen bkd-Genclusters von S avermitilis und Konstruktion einer Chromosomenkarte
  • Etwa 5 μg gereinigtes pCD503 wurden doppelt verdaut unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI. DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese in einem 1,2% Agarosegel getrennt, ein ungefähr 0,25 kb langes DNA-Fragment, das eine Sequenz, die spezifisch für das S. avermitilis-bkd-E1α-Gen war, wurde durch Elektroelution gewonnen und durch Nick-Translation markiert, im Wesentlichen wie vorher beschrieben. Das [32P]-markierte DNA-Fragment wurde dann als Sonde verwendet, um eine genomische Cosmidbibliothek von S. avermitilis zu screenen. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von genomischen Bibliotheken allgemein findet sich in Molecular Cloning A Laboratory Manual von Maniatis et al. (1989). Eine vollständige Beschreibung der Herstellung einer Streptomycetes-Chromosomenbibliothek wird in Genetic Manipulation of Streptomyces – A Laboratory Manual von Hopwood et al. (1985) gezeigt. Eine Beschreibung des Cosmidvektors findet sich in "Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning" von C. D. Denoya, US-Patentanmeldung 08/048 719, eingereicht am 16. April 1993. Vier Klone wurden nach dem Screenen von mehr als 2200 rekombinanten Bibliotheksklonen identifiziert. Die vier hybridisierenden Klone (als E. coli-Klone CD518, CD519, CD520 und CD521 bezeichnet) wurden in LB-Medium unter Ampicillinselektionsdruck gezüchtet. Das Plasmid wurde aus jeder Kultur präpariert, wie oben beschrieben. Restriktions- und Southern-Blot-Hybridisierungsanalysen zeigten, dass die vier Klone verwandt waren mit überlappenden chromosomalen Regionen. Eine genomische Restriktionskarte für S. avermitilis, die den gesamten Chromosomenbereich einschließlich der Sequenz CD503 abdeckte, wurde erhalten gemäß Standardverfahren und ist in 3 gezeigt.
  • Beispiel 8
  • Erzeugung von ineinander gesetzten Sätzen von Deletionsmutanten für gerichtete DNA-Sequenzierung des Chromosomenbereichs von S. avemitilis, der das bkd-Gencluster trägt
  • Ineinander gesetzte Sätze von Deletionsmutanten, denen zunehmend mehr Nucleotide von einem Ende oder dem anderen der S. avermitilis-bkd-Ziel-DNAs fehlten, wurden erzeugt unter Verwendung von Exonuclease III gemäß Verfahren, die im Wesentlichen denen entsprachen, die von S. Henikoff (1987, Methods Enzymol., 115: 156) beschrieben wurden. Um gerichtete Deletionsmutanten zu erzeugen, wurde die doppelsträngige DNA jeder replikativen Form der DNA des rekombinanten Bakteriophagen M13 mit zwei Restriktionsenzymen verdaut, die beide Spaltungsstellen zwischen einem Ende der Ziel-DNA und der Primerbindungsstelle hatten. Das Restriktionsenzym, das näher an den Zielsequenzen spaltete, erzeugte ein glattes Ende oder einen zurückgesetzten 3'-Terminus; das andere Enzym erzeugte ein hervortretendes 3'-Ende. Exonuclease III katalysiert die stufenweise Entfernung von 5'-Mononucleotiden von einem zurückgesetzten oder glatten 3'-Hydroxylende von doppelsträngiger DNA. Hervorspringende 3'-Enden sind jedoch völlig resistent gegenüber der Aktivität des Enzyms. Daher war nur ein Ende der entstehenden linearen DNA für Exonuclease III empfänglich und der Verdau erfolgte in einer Richtung weg von der Spaltstelle in die Ziel-DNA-Sequenzen.
  • Als ein Beispiel folgt die Beschreibung der Herstellung von ineinander gesetzten Deletionen bei pCD565. Plasmid pCD565 ist ein M13mp19-RF-Derivat, das ein 1,15-kb-SalI-Fragment trägt, das einen Teil des offenen Leserahmens von E1α-S. avermitilis-bkd enthält. Das Plasmid pCD565 wurde durch Gleichgewichtszentrifugation in Cäsiumchlorid und Ethidiumbromidgradienten gereinigt, wie Maniatis et al. (1989) beschrieben. Exonuclease III kann den Verdau von einzelsträngigen Brüchen starten, daher ist es wichtig, ein Präparat zu verwenden, das weniger als 10% entspannte zirkuläre Moleküle enthält. Etwa 10 μg des Plasmids pCD565 (siehe Abschnitt "Detaillierte Beschreibung der Erfindung") wurden 4 Stunden lang bei 37°C doppelt verdaut mit den Restriktionsenzymen SacI und XbaI, dann mit Phenol-Chloroform und Ether extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, wie vorher beschrieben. Das Pellet wurde wieder in 60 μl Exonuclease-III-Reaktionspuffer (10 × Exonuclease-III-Puffer: 0,66 M Tris-HCl, pH 6,0, 66 mM Magnesiumchlorid (MgCl2)) suspendiert. Die DNA-Lösung wurde dann bei 37°C in Gegenwart von 300 Einheiten Exonuclease III (Ambion Inc.) inkubiert und 2,5-μl-Aliquots wurden in Intervallen von 30 Sekunden entnommen. Die Proben wurden dann mit Nuclease S1 inkubiert und Aliquots von jeder der Proben wurden mit Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Proben, die DNA-Fragmente der gewünschten Größe enthielten, wurden zusammengefasst, die DNA wurde repariert unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase 1, über Nacht ligiert und in kompetente E. coli-JM109-Zellen transfiziert. Die Insertgröße in gewonnenen Klonen wurde mit EcoRI/HindIII-Restriktion und Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Fünf Klone wurden für die Sequenzierung ausgewählt: 565-D19 (1,1 kb), 565-D7 (0,88 kb), 5,65-d24 (0,77 kb), 565-D1 (0,51 kb) und 565-D16 (0,36 kb). Einzelsträngige DNA wurde aus jedem dieser Klone hergestellt und wie oben beschrieben sequenziert.
  • Beispiel 9
  • Konstruktion der Plasmide pCD670 pCD666 pCD736 und pCD685 die für die Expression der S avermitilis-bkd-Gene in E. coli verwendet werden
  • Die Expression der S. avermitilis-bkd-Gene in E. coli wurde erreicht unter Verwendung des T7-RNA-Polymerase/Promotor-Doppelplasmidsystems, im Wesentlichen wie von S. Tabor beschrieben (1990 in Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 16.2.1–16.2.11, Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York).
  • A. Konstruktion von pCD670, der den S. avermitilis-E1α-bkd-ORF trägt
  • Eine NdeI-Restriktionsstelle, die das ATG-Startcodon überspannt, wurde in das S. avermitilis-bkd-E1α-Gen eingeführt unter Verwendung eines auf PCR basierenden Verfahrens. Die Matrize für die PCR war Plasmid pCD528, ein pGEM-3Z-Derivat, das ein genomisches S. avermitilis-Insert mit 7 kb trägt, das die aminoterminale Hälfte des E1α-ORF enthält. Zwei Oligonucleotide wurden als Primer in der PCR-Reaktion verwendet (siehe 6):
  • 1. Linksgerichteter universeller (Vektor) Primer 3l-PCR-PB
  • (5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTAGACCATGATTACGCCA-3'), der stromabwärts die HindIII-Stelle von pGEM-3Z-MCS (Position 91–114) kartiert. Am 5'-Ende dieses Primers gibt es zwei As und zwei Restriktionsstellen (BamHI und PstI), um die Klonierung der PCR-Produkte zu erleichtern.
  • 2. Mutagener Primer 55-PCR
  • (5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3'.). Am 5'-Ende dieses Primers gab es zwei As, ein G, und zwei Restriktionsstellen (BglII und NdeI). Die NdeI-Stelle überlappt das ATG-Startcodon des offenen Leserahmens von E1α.
  • Die Polymerasekettenreaktion wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Reaktionsprodukte wurden mit Elektrophorese auf einem 0,8%-Agarosegel analysiert. Ein mit PCR amplifiziertes DNA-Fragment der richtigen Größe (etwa 1,1 kb lang) wurde elektroeluiert, mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI verdaut und in mit NdeI/BamHI linearisiertes Plasmid pT7-7 subkloniert, was Plasmid pCD663 bei Ligierung und Transformation in E. coli-DH5-α-Zellen ergab. Etwa 1 μg Plasmid pCD663 (hergestellt aus E. coli-Stamm CD663 unter Verwendung eines Plasmid-Miniprep-Verfahrens) wurde mit BamHI linearisiert, dephosphoryliert und schließlich in Gegenwart von etwa 0,5 μg elektroeluiertem gereinigten 1,1-kb-BamHI-Fragment, das aus einem BamHI-Verdau von Plasmid pCD550 isoliert worden war, ligiert, was Plasmid pCD670 ergab. Die richtige Orientierung des 1,1-kb-BamHI-Fragments in letzterem Konstrukt wurde bestimmt durch Kartierung der SalI-Stellen, die in dem Insert vorhanden waren. Schließlich wurde Plasmid pCD670 in E. coli-Stamm C600 eingebracht, der Plasmid pGPI-2 trägt (das Plasmid, das das T7-RNA-Polymerasegen enthält) (siehe Tabor, 1990). Ein Transformant wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und als Stamm CD676 bezeichnet.
  • B. Konstruktion von pCD666, das S. avermitilis-E1β-bkd-ORF trägt:
  • Eine NdeI-Restriktionsstelle, die das ATG-Startcodon überspannt, wurde in das S. avermitilis-bkd-E1β-Gen eingeführt unter Verwendung eines auf PCR basierenden Verfahrens. Die Matrize für PCR war Plasmid pCD574, ein pGEM-3Z-Derivat, das ein genomisches Insert von S. avermitilis mit 4,5 kb trägt, das den E1β-ORF enthält. Zwei Oligonucleotide wurden als Primer in der PCR-Reaktion verwendet (siehe auch 6):
  • 1. Linksgerichteter universeller (Vektor) Primer 30-PCR-PB
  • (5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3') hat stromaufwärts die EcoRI-Stelle von pGEM-3Z-MCS (Position 2689–2712). Am 5'-Ende dieses Primers gibt es zwei As und zwei Restriktionsstellen (BamHI und PstI), um die Klonierung der PCR-Produkte zu erleichtern.
  • 2. Rechtsgerichteter mutagener Primer 56-PCR:
  • 5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3').
  • Am 5'-Ende dieses Primers gab es zwei As, ein G, und zwei Restriktionsstellen (BgIII und NdeI). Die NdeI-Stelle überlappt das ATG-Startcodon des offenen Leserahmens von E1β.
  • Die Polymerasekettenreaktion wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Reaktionsprodukte wurden mit Elektrophorese auf einem 0,8%-Agarosegel analysiert. Ein mit PCR amplifiziertes DNA-Fragment mit richtiger Größe (etwa 1,9 kb lang) wurde elektroeluiert, mit den Restriktionsenzymen NdeI und EcoRI verdaut und in mit NdeI/EcoRI linearisiertes Plasmid pT7-7 subkloniert, was Plasmid pCD666 bei Ligierung und Transformation in E. coli-DHS-α-Zellen ergab. Schließlich wurde Plasmid pCD666 in E. coli-Stamm C600 eingebracht, der Plasmid PGP1-2 trägt (das Plasmid, das das T7-RNA-Polymerasegen enthält) (siehe Tabor, 1990). Ein Transformant wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und als Stamm CD673 bezeichnet.
  • C. Konstruktion von pCD736, das S. avermitilis-E1α- und E1β-bkd-ORFs trägt
  • Etwa 2 μg von Plasmid pCD670 wurden durch Teil-BamHI-Verdau linearisiert. Um die lineare Form des Plasmids pCD670 zu erhalten, wurden Aliquots der BamHI-Verdaumischung zu folgenden Zeitpunkten entnommen: 1, 3, 5, 10 und 20 Minuten. Aliquots wurden durch ein 0,8%-Agarosegel laufen gelassen. Die lineare Form (etwa 4,3 kb lang) wurde durch Elektroelution gewonnen und unter Verwendung von CIAP dephosphoryliert (wie vorher beschrieben). Dann wurde die Hälfte der dephosphorylierten linearen Form von Plasmid pCD670 mit einem 0,8-kb-BamHI/BglII-Fragment, das aus Plasmid pCD577 isoliert worden war, ligiert. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli-DH5-α-Zellen zu transformieren. Zehn Klone wurden gewonnen und durch Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA analysiert, die mit dem Miniprep-Verfahren hergestellt worden war. Ein Klon, bezeichnet als Stamm CD736, enthielt das korrekt zusammengesetzte Plasmid pCD736). Schließlich wurde Plasmid pCD736 in E. coli-Stamm C600, der Plasmid pGP1-2 trägt, eingebracht. Ein Transformant wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und als Stamm CD737 bezeichnet. Ein weiterer Klon, als Stamm CD705 bezeichnet, enthielt Plasmid pCD705, das das 0,8-kb-BamHI/BglII-Fragment in der falschen Orientierung trägt. Das Konstrukt pCD705 wurde als negative Kontrolle in Expressionsversuchen verwendet.
  • D. Konstruktion von pCD685, das das S. avermitilis-bkd-Gencluster trägt
  • Die verbleibende Hälfte der dephosphorylierten linearen Form von Plasmid pCD670, die, wie oben beschrieben, durch einen Teilverdau mir dem Restriktionsenzym BamHI erhalten worden war, wurde in ein 7-kb-BamHI-Fragment ligiert, das aus Plasmid CD577 isoliert wurde. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli-DH5-α-Zellen zu transformieren. Viele Klone wurden gewonnen und 16 davon für die weite re Analyse ausgewählt. Plasmid-DNA wurde extrahiert und mit Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon, als Stamm CD685 bezeichnet, enthielt das korrekt zusammengesetzte Plasmid (pCD685). Schließlich wurde Plasmid pCD685 in E. coli-Stamm C600 eingebracht, der Plasmid pGP1-2 trug. Ein Transformant wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und als Stamm CD687 bezeichnet.
  • Beispiel 10
  • Expression von S. avermitilis-bkd-Genen in Escherichia coli unter Verwendung des T7-Doppelplasmidsystems
  • Derivate von E. coli C600 (pGP-1), die verschiedene pT7-7-Konstruktionen enthielten (Stämme CD676, CD673, CD737 und CD687) wurden in 5 ml LB-Medium, das sowohl Kanamycin (60 μg/ml) als auch Ampicillin (60 μg/ml) enthielt, über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die über-Nacht-Kulturen wurden dann 1 : 40 (0,25 : 10,00 ml) in eine Röhrchenkultur (25 × 150 nun) verdünnt, die frisches LB/Ampicillin/Kanamycin-Medium enthielt, und mit Schüttelbelüftung bei 30°C bis zu einer gemessenen optischen Dichte (OD590) von etwa 0,4 gezüchtet. Das Gen für die T7-RNA-Polymerase wurde induziert, indem die Temperatur 30 Minuten lang auf 42°C erhöht wurde, was wiederum das Gen/die Gene unter der Kontrolle des T7-Promotors induzierte (wie von S. Tabor 1990 beschrieben). Schließlich wurde die Temperatur auf 37°C gesenkt und die Zellen wurden weitere 90 Minuten lang unter Schütteln gezüchtet. Nicht induzierte Kontrollkulturen wurden immer auf 30°C gehalten. Die Proteine wurden mit Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, wie von C. D. Denoya et al., 1986, J. Bacteriol., 168: 1133–1141 beschrieben. Die enzymatische Aktivität wurde analysiert, wie in Beispiel 11 beschrieben.
  • Beispiel 11
  • Bestimmung der E1-S. avermitilis-BCKDH-Aktivität in Rohextrakten von rekombinanten E. coli-Stämmen
  • A. Zelllysatherstellung
  • Zellen (abgeleitet aus 8-ml-Kulturen) wurden durch Zentrifugation (5 Minuten bei 5.000 U/min – 3.000 × G – unter Verwendung eines Sorvall SS-34-Rotors, gekühlt auf 4°C) gesammelt und wieder in 5 ml "Brechungspuffer" (0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, der 3% Triton X-100, 15% Glycerin, 3 mM Dithiothreitol, 1 mg/ml Puteneiweißtrypsininhibitor, 5 mM EDTA und 0,04 mM TPP [Thiaminpyrophosphat] enthält) suspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in eine French-Presse überführt und die Zellen wurden durch einen Durchgang mit 5.000 × psi aufgerissen. Ein 1,5-ml-Aliquot des aus der French-Presse erhaltenen Materials wurden dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und durch 30-sekündige Zentrifugation bei 14.000 U/min geklärt. Jeweils 100-μl-Aliquots des Überstands wurden für den Enzymtest verwendet. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt unter Verwendung des Bio-Rad-Proteinassays (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien), der auf dem Bradford-Farbstoffbindungsverfahren beruht (M. Bradford, Anal. Biochem., 72: 248, 1976).
  • B. Test für die E1-Komponente des S. avermitilis-verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenase-(BCKDH)-Komplexes
  • Die BCKDH-E1-Aktivität wurde bestimmt durch eine modifizierte Version des radiochemischen Assays, der schon beschrieben wurde (D. T. Chuang, 1988, Methods Enzymol., 166: 146–154 und E. W. Hafner et al., 1991, J. Antibiotics, 44: 349). Auf den Boden eines 15-ml-Glasszintillationsgläschens wurden gegeben: 0,148 ml 0,25 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5; 0,002 ml 0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Dinatriumsalz); 0,004 ml 0,1 M MgCl2; 0,02 ml 3,7 mM Thiaminpyrophosphat (TPP); 0,02 ml 37 mM NaAsO2; 0,01 ml 37 mM 2,6-Dichlorphenolindophenol (Natriumsalz, Sigma D-1878); 0,008 ml α-[1-14C]-Ketoisocaproat-Vorratslösung (hergestellt wie später beschrieben); 0,058 ml Wasser und 0,1 ml geklärter zellfreier Extrakt. Die Öffnung des Gläschens wurde sofort mit Whatman 4CHR-Papier (Whatman Katalog Nr. 3004614) bedeckt, das mit Solvable (ein Gewebe- und Gelsolubilisator, erworben von NEN-Dupont) imprägniert war. Eine Plastikkappe wurde dann fest auf das Gläschen gebracht, sowohl die Kappe als auch die obere Hälfte des Gläschens wurden mit Parafilm überzogen und bei sanftem Schütteln 2 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurde das Filterpapier in ein 7-ml-Glasszintillationsgläschen überführt, das 4 ml "Ready Safe" (Beckman) Flüssigszintillationscocktail enthielt, um die Radioaktivität zu bestimmten. Die α-[1-14C]-Ke0toisocaproat-Vorratslösung wurde hergestellt, indem 5,6 μl 20 mM α-Ketoisocaproat (Natriumsalz, Sigma K-0629), 50 μl α-[1-14C]-Ketoisocaproat (55 mCi/mmol, 50 μCi/ml, Amersham) und genug Wasser für ein Endvolumen von 1 ml vermischt wurden. Die spezifische Aktivität der E1-Komponente der verzweigtkettigen α-Ketosäuredehydrogenase wird angegeben in Picomol Kohlendioxid entwickelt pro Minute pro mg Protein, wie in Tabelle I unten gezeigt.
  • Tabelle I E1-Streptomyces avermitilis verzweigtkettige α-Ketosäuredehydrofenaseaktivität in rohen Extrakten von rekombinanten E. coli-Zellen
    Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Beschreibung der Seguenz-IDs
  • SEQUENZ ID Nr. 1 zeigt die DNA-Sequenz, die die E1α-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH codiert. Diese Sequenz ist auch in 4 als Basen 403–1548 dargestellt.
  • SEQUENZ ID Nr. 2 zeigt die DNA-Sequenz, die die E1β-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH codiert. Diese Sequenz ist auch in 4 als Basen 1622–2626 dargestellt.
  • SEQUENZ ID Nr. 3 zeigt die DNA-Sequenz, die den offenen Leserahmen beginnt, der den aminoterminalen Bereich der E2-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH codiert. Diese Sequenz ist auch in 4 als Basen 2626–2727 dargestellt.
  • SEQUENZ ID Nr. 4 ist eine DNA-Sequenz, die die Basen 3–251 von pCD539 zeigt. Dies ist ein Teil der inneren Sequenz des Gens, das die E2-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH codiert. Diese Sequenz ist auch in 5 gezeigt.
  • SEQUENZ ID Nr. 5 zeigt die 2728 Basenpaare des genomischen S. avermitilis-DNA-Fragments, das in 4 dargestellt ist und die offenen Leserahmen der E1α-, E1β- und E2-(teilweise)-Untereinheiten von S. avermitilis BCKDH enthält.
  • SEQUENZ ID Nr. 6 zeigt die Aminosäuresequenz der E1α-Untereinheit von S. avermtilis BCKDH. Diese Aminosäuresequenz wird von der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID Nr. 1 codiert.
  • SEQUENZ ID Nr. 7 zeigt die Aminosäuresequenz der E1β-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH. Diese Aminosäuresequenz wird von der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID Nr. 2 codiert.
  • SEQUENZ ID Nr. 8 zeigt die Aminosäuresequenz des aminoterminalen Teils der E2-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH. Diese Aminosäuresequenz wird von der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID Nr. 3 codiert. SEQUENZ ID Nr. 9 zeigt die Aminosäuresequenz, die von der DNA-Sequenz codiert wird, die durch die Basen 3 bis 251 von pCD539 dargestellt wird (SEQUENZ ID Nr. 4). Diese Aminosäuresequenz zeigt ein inneres Peptidfragment der E2-Untereinheit von S. avermitilis BCKDH.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001

Claims (13)

  1. Isoliertes DNA-Segment, das den verzweigtkettigen Alpha-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplex eines Organismus codiert, der zur Gattung Streptomyces gehört, wobei das DNA-Segment die DNA-Sequenz von SEQUENZ ID NO. 1, SEQUENZ ID NO. 2, SEQUENZ ID NO. 3, SEQUENZ ID NO. 4 oder SEQUENZ ID NO. 5 oder eine allelische Variation solcher Sequenzen aufweist.
  2. Isoliertes DNA-Segment nach Anspruch 1, das den verzweigtkettigen Alpha-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplex von Streptomyces avermitilis codiert.
  3. Isoliertes DNA-Segment nach Anspruch 1, das weiterhin eine DNA-Region aufweist, die die Expression des verzweigtkettigen Alpha-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexes reguliert.
  4. Isoliertes DNA-Segment nach Anspruch 2, das weiterhin eine DNA-Region aufweist, die die Expression des verzweigtkettigen Alpha-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexes reguliert.
  5. Rekombinante DNA mit einem DNA-Segment nach Anspruch 1.
  6. Wirtszelle, in die eine rekombinante DNA gemäß Anspruch 5 eingebracht wurde.
  7. Plasmid mit einer rekombinanten DNA gemäß Anspruch 5.
  8. DNA-Segment, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 und pCD577, wobei die DNA-Segmente die genomische Restriktionskarte haben, die in 3 gezeigt ist.
  9. Wirtszelle, in die ein DNA-Segment nach Anspruch 8 eingebracht wurde.
  10. DNA-Segment nach Anspruch 1, das eine DNA-Region aufweist, die die Transkiption oder Translation der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID NO. 1, SEQUENZ ID NO. 2, SEQUENZ ID NO. 3, SEQUENZ ID NO. 4 oder SEQUENZ ID NO. 5 oder einer allelischen Variation solcher Sequenzen reguliert.
  11. Gene für den verzweigtkettigen Alpha-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplex, die in einem DNA-Segment gemäß Anspruch 8 enthalten sind.
  12. DNA-Segment mit einer DNA-Sequenz, die eine Untereinheit der DNA-Sequenz von SEQUENZ ID NO. 1, SEQUENZ ID NO. 2, SEQUENZ ID NO. 3, SEQUENZ ID NO. 4 oder SEQUENZ ID NO. 5 ist und das mit SEQUENZ ID NO. 1, SEQUENZ ID NO. 2, SEQUENZ ID NO. 3, SEQUENZ ID NO. 4 bzw. SEQUENZ ID NO. 5 oder einer allelischen Variation davon hybridisieren kann.
  13. Im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid enthaltend die Aminosäuresequenz von SEQUENZ ID NO. 6, SEQUENZ ID NO. 7, SEQUENZ ID NO. 8 oder SEQUENZ ID NO. 9.
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