PL181916B1 - Method of obtaining natural avermectin - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny na drodze fermentacji Streptomyces avermitilis w warunkach i w pozywce fermentacyjnej odpowiedniej do wytwarzania takiej naturalnej awermektyny przez zwiekszenie ekspresji genów kodujacych kompleks dehydro- genazy alfa-ketonokwasów, znamienny tym, ze stosuje sie mikroorganizm, w którym DNA zostalo zmodyfikowane przez wprowadzenie genów kodujacych kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgalezionym lancuchu, zawierajacych segment DNA kodujacy kom- pleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgalezionym lancuchu i/lub równowazna mu czynnosciowa czesc tego segmentu DNA obejmujaca sekwencje DNA oznaczona jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiane alleliczna takiej sekwencji, na drodze znanych manipulacji genetycznych w drobnoustroju Streptomyces avermitilis, poddaje sie fermentacji ten mikroorganizm, w warunkach i w pozywce fermentacyjnej odpowiedniej dla wytwarzania takiej naturalnej awermektyny Streptomyces avermitilis. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnej awermektyny na drodze fermentacji Streptomyces avermitilis. Naturalna awermektyna jest wytwarzana poprzez ekspresję segmentu DNA o sekwencji dla kompleksu dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu mikroorganizmie rodzaju Streptomyces i jest uzyskiwana na drodze fermentacji tego mikroorganizmu. Sposób według wynalazku pozwala na zwiększenie wytwarzania naturalnej awermektyny na drodze fermentacji drobnoustroju Streptomyces avermitilis przez zwiększenie ekspresji genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów.

Wiele produktów farmaceutycznych wytwarzanych jest przez drobnoustroje. Wśród tych drobnoustrojów na szczególną uwagę zasługują organizmy należące do rodzaju Streptomyces grupy Gram-dodatnich bakterii obecnych w glebie; wytwarzają one ponad 90% antybiotyków nadających się do zastosowania w lecznictwie.

Drobnoustroje z rodzaju Streptomycetes są przedmiotem intensywnych badań, w których stosuje się techniki klonowania rekombinacyjnego DNA w celu wyizolowania genów biosyntezy antybiotyków, wytwarzania nowych związków, stanowiących pochodne lub hybrydy,

181 916 wyizolowania genów regulatorowych i zbadania mechanizmów regulacyjnych zarówno pierwotnego, jak i wtórnego metabolizmu.

S. avermitilis wytwarza osiem różnych, lecz blisko spokrewnionych związków poliketydowych o działaniu przeciwpasożytniczym, zwanych awermektynami.

Kompleks awermektynowy, wytwarzany przez S. avermitilis, utworzony jest z czterech składowych głównych, A1a, A2a, B1a i B2a, oraz czterech składowych pobocznych, A1b, A2b, B1b i B2b. Strukturę tych składowych przedstawiono poniżej

Awermektyna	R1	R2	Χ-Υ
Ala	sec-butylowa	Me	CH=CH
Alb	izopropylowa	Me	CH=CH
A2a	sec-butylowa	Me	CH2-CH(OH)
A2b	izopropylowa	Me	CH2-CH(OH)
B1a	sec-butylowa	H	CIACH
B1b	izopropylowa	H	CH=CH
B2a	sec-butylowa	H	CH2-CH(OH)
B2b	izopropylowa	H	CH2- CH(OH)

Poliketydowa struktura awermektyny pochodzi od siedmiu cząsteczek octanu, pięciu cząsteczek propionianu i jednej cząsteczki kwasu tłuszczowego o łańcuchu rozgałęzionym w pozycji alfa, który stanowi kwas S(+)-2-metylomasłowy lub kwas izomasłowy. Oznaczenia „A” i „B” odnoszą się do awermektyn, w których podstawnik w pozycji 5 stanowi, odpowiednio, grupa metoksylowa lub hydroksylowa. Cyfra „1” odnosi się do awermektyn, posiadających podwójne wiązanie w pozycjach 22-23, a cyfra „2” - do awermektyn, posiadających wodór w pozycji 22 i grupę hydroksylową w pozycji 23. Wreszcie, C-25 może mieć jeden z dwóch podstawników: podstawnik sec-butylowy (pochodny L-izoleucyny) obecny jest w awermektynie serii „a”, a podstawnik izopropylowy (pochodny L-waliny) jest obecny w awermektynie serii „b” (por. Fisher M.H. i Mrozik H., 1984, „Macrolide Antibiotice”, Academic Press, rozdział 14).

Awermektynami „naturalnymi” w niniejszym opisie zwane są awermektyny wytwarzane przez S. avermitilis, w których podstawnik w pozycji 25 stanowi, jak to wspomniano powyżej, grupa izopropylowa lub sec-butylowa. Awermektyny, w których w pozycji 25 znajduje się grupa

181 916 inna, niż izopropylowa lub sec-butylowa, zwane są w dalszym ciągu niniejszego opisu „nowymi” lub „nienaturalnymi” awermektynami.

Jednym ze szlaków metabolicznych dla wytworzenia kwasów tłuszczowych o łańcuchach rozgałęzionych w pozycji alfa, w postaci CoA, jest szlak poprzez reakcję transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i następnie reakcję dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (zamiast tego, pochodne tłuszczowych acylo-CoA o rozgałęzionym łańcuchu można uzyskać z alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, wytwarzanych poprzez syntezę de novo). Szlaki metaboliczne przedstawiono poniżej.

CH,CHCH(NH-)COOH ³ I 2

CH,

CH,CH,CHCH(NH,)COOH J i. | Z

CH,

Walina

Iz oleucyna

Transaminaza aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu

CH,CHCOCOOH 3 i CH,

Kwas

2-oksoizo -Walerianowy

Synteza de novo'

Transaminaza

CH-CH-CHCOCOOH ^{3 2} 1

CH,

Kwas

2-okso-3-metylo-walerianowy

Kompleks dehydrogenazy Alfa-Ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu

Synteza de novo

CH,CHCO.SCoA ³ I

CH,

CH,CH-CHCO.SCoA ^{3 2}I

CH

Izobutyrylo-CoA

2-Metylobutyrylo-CoA

Szlak degradacji (Propionylo-CoA, Metyloamalonylo-CoA)

Szlak degradacji (Acetylo-CoA, Propionylo-CoA Metylomalonylo-CoA)

Biosynteza

Awermektyny

R

R

R

R __ CHCO. SCoA ²' t ‘'^CHCOOH

Egzogenny kwas tłuszczowy o rozgałęzionym łańcuchu

181 916

Uprzednio izolowano mutant S. avermitilis, nie wykazujący wykrywalnej aktywności dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) w ostatnim z wymienionych enzymów (Hafner i wsp., 1988, Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 88300353.5, publikacja nr 0284176). Mutant ten wyizolowano w wyniku standardowej mutagenezy chemicznej szczepu S. avermitilis ATCC 3I272, w ekranie, pozwalającym wykryć brak wytwarzania ¹⁴C0₂, substratu, który stanowił kwas 2-oksoizokapronowy (analog leucyny), znakowany ^l4C-1. Mutant tenjest zdolny do wytwarzania naturalnych awermektyn tylko pod warunkiem, że do pożywki, w której mutant fermentuje, doda się kwas tłuszczowy o łańcuchu rozgałęzionym w pozycji alfa lub prekursor, zawierający grupę izopropylową lub sec-butylową (S-form). Mutant zdolny jest również do wytwarzania nowych, czyli nienaturalnych, awermektyn, jeżeli poddaje się go fermentacji w środowisku wodnym w warunkach tlenowych w pożywce zawierającej odpowiedni inny kwas karboksylowy, jak np. kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC), lub jego prekursor.

Klonowanie BCKDH S. avermitilis byłoby bardzo korzystne. Manipulacja tymi genami z zastosowaniem rekombinacyjnych technik DNA ułatwiłaby wytwarzanie naturalnych i nowych awermektyn. U niektórych gatunków można by oczekiwać zwiększenia miana naturalnych awermektyn poprzez zwiększanie liczby kopii genów BCKDH. Ponadto, wytworzenie nieodwracalnie zablokowanego szczepu bkd, w którym aktywność BCKDH byłaby trwale zniesiona lub zmodyfikowana poprzez podstawienie genowe, byłoby korzystniej sze, niż dostępny obecnie mutant bkd, uzyskiwany, jak to opisano powyżej, poprzez mutagenezę chemiczną.

Wieloenzymatyczne kompleksy dehydrogenazy alfa-ketonokwasów - kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH), kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) i kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu (KGDH) katalizujądekarboksylację oksydatywną, odpowiednio, alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, pirogronianu i alfa-ketoglutaranu, uwalniając CO₂ i wytwarzając odpowiednie acylo-CoA i NADH (Perham, R.N., 1991, Biochemistry, 30:8501 -8512). Każdy z kompleksów składa się z trzech różnych enzymów katalitycznych: dekarboksylazy (E1), acylotransferazy (transacylazy) kwasu dihydroliponowego (E2) i dehydrogenazy kwasu dihydroliponowego (E3).

Dehydrogenaza alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BGKDH) stanowi wieloenzymatyczny kompleks, złożony z trzech składowych funkcjonalnych, E1, dekarboksylazy, E2, transacylazy i E3, dehydrogenazy kwasu dihydroliponowego. Oczyszczone kompleksy, pochodzące z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus subtilis, składają się z czterech polipeptydów. Oczyszczone kompleksy, pochodzące od ssaków, również składają się z czterech polipeptydów, E1-alfa, E1-beta, E2 i E3. Z Bacillus subtilis wyizolowano kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów, wykazujący aktywność zarówno dehydrogenazy pirogronianowej, jak i dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Ten spełniający podwójną funkcję kompleks utlenia pirogronian i dostarcza kwasów tłuszczowych o rozgałęzionym łańcuchu do wytwarzania fosfolipidów błonowych.

Klonowanie prokariotycznych genów dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu opisywano dla Pseudomonas i Bacillus, lecz nie opisywano ich dla Streptomyces. W systemach tych stwierdzono, że geny kodujące BCKDH są zgrupowane w operonie. Dokonano klonowania genów kompleksu BCKDH Pseudomonas putida i określono sekwencję nukleotydową tego regionu (Sykes i wsp., 1987, J. Bacteriol. 169: 1619-1625, i Burns i wsp., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165-169 i 176: 311-317). Masa cząsteczkowa E1-alfa wynosi 45289, E1-beta - 37138, E2 - 45134, a E3 - 48164. W sekwencji zgrupowane są cztery geny: E1-alfa, E1-beta, E2 i E3. Analiza sposobem Northern blot wskazuje, że ekspresja tych czterech genów zachodzi za pośrednictwem jednego mRNA, oraz że geny te tworzą operon. Stwierdza się obecność typowego prokariotycznego jednolitego promotora, bezpośrednio poprzedzającego początek regionu kodującego E1-alfa, który umożliwia konstytutywną ekspresję genów bkd Pseudomonas. Kodon inicjujący regionu kodującego E1-beta znajduje się zaledwie 40 nukleotydów za końcem otwartej ramki odczytu (ORF) E1-alfa. W przeciwieństwie do tego, między oRf E1-beta a E2 nie ma odstępu międzygenowego, jako że kodon „stop” ORF E1-beta

181 916 stanowi trójkę nukleotydów bezpośrednio poprzedzającą kodon inicjujący ORF E2. Odstęp międzygenowy między ORF E2 a E3 jest ograniczona zaledwie do dwóch nukleotydów. Tak więc geny bkd Pseudomonas są ściśle sprzężone. Podobnie, dokonano klonowania operonu kodującego podwójny kompleks BCKDH/PDH Bacillus subtilis (Hemila i wsp., 1990, J. Bacteriol. 172: 5052-5063). Operon ten zawiera cztery ORF, kodujące cztery białka o ciężarze 42,36,48 i 50 kilodaltonów (kDa); wykazano, że są one w dużym stopniu homologiczne z podjednostkami E1-alfa, E1-beta, E2 i E3 grupy genów bkd Pseudomonas. Ostatnio dokonano klonowania i sekwencjonowania genów kodujących podjednostki alfa i beta składowej E1 podwójnego kompleksu enzymatycznego BCKDH/PDH, pochodzącego z Bacillus stearothermophilus (szacunkowa masa cząsteczkowa podjednostek alfa i beta wynosi, odpowiednio, 41000 i 35000) (Hawkins i wsp., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346).

Ponadto opisywano sekwencję kilku eukariotycznych podjednostek BCKDH E1 -alfa i beta (ludzkich, bydlęcych i szczurzych). Ostatnio dokonano porównania sekwencji aminokwasowej wszystkich opublikowanych sekwencji, zawierających zarówno składowąE1-alfa, jak i E1-beta, kompleksów PDH i BCKDH pochodzących od różnych gatunków, poprzez analizę komputerową (Wexler i wsp., 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Co ciekawe, zidentyfikowano kilka regionów podjednostek alfa i beta, które sąjednakowe nie tylko we wszystkich dotychczas opisanych PDH, ale również w kompleksach BCKDH, pochodzących zarówno od organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych.

Opisujemy klonowanie genów dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, pochodzących z drobnoustroju Streptomyces avermitilis. Klonowania nowych genów dokonano stosując kombinację dwóch technik genetyki molekularnej, polimerazowej reakcji łańcuchowej DNA (PCR) i sondowania homologicznego. Sondowanie homologiczne polega na przeglądaniu biblioteki cDNA lub biblioteki genomowej za pomocą znakowanych radioaktywnie syntetycznych sond oligonukleotydowych, odpowiadających sekwencjom aminokwasowym białka. Niestety, technika ta wykazuje pewne ograniczenia: jednym z nich jest dość ostre ograniczenie zależne od degeneracji stosowanego oligonukleotydu. Ponadto, hybrydyzacja, stosowana przy przeglądaniu biblioteki, dokonywana jest z niewielką swoistością, tak więc dosyć wysoki jest odsetek wyników fałszywie dodatnich. Dla uniknięcia niektórych spośród ograniczeń hybrydyzacji oligonukleotydowej opracowano ostatnio odmianę sondowania homologicznego, której jednym z etapów jest polimerazowa reakcja łańcuchowa DNA (PCR), w której możliwe jest zastosowanie jako sond wysoce zdegenerowanych oligonukleotydów. Sposób ten wymaga jedynie znajomości sekwencji aminokwasowej dwóch krótkich regionów (o długości około 7-10 aminokwasów) kodowanego białka.

Jako primery tej reakcji stosuje się dwa Oligonukleotydy, odpowiadające obu sekwencjom peptydowym. Każdy z primerów można stosować w postaci mieszaniny w pełni zdegenerowanych oligonukleotydów, zawierających wszelkie możliwe kombinacje kodonów, kodujące znane sekwencje aminokwasowe. Matryca do amplifikacji może pochodzić z dowolnego źródła DNA, np. bibliotek DNA genomowego i podwójnie zwiniętych postaci plazmidów.

W kilku opublikowanych ostatnio doniesieniach dowiedziono użyteczności łączenia polimerazowej reakcji łańcuchowej z sondowaniem homologicznym dla identyfikacji genu pochodzącego od różnych gatunków.

Terminy techniczne, stosowane w niniejszym opisie, są znane specjalistom w zakresie genetyki molekularnej. Definicje tych terminów można znaleźć w licznych podręcznikach poświęconych biologii molekularnej, jak np. w „Genes”, wydanie II, autorstwa dr. Benjamina Lewin, 1985, John Wiley & Sons, Inc., New York. Poniżej zdefiniowano terminy często stosowane w niniejszym opisie:

Antybiotyk: środek chemiczny, hamujący wzrost komórek bakteryjnych. Stosowany do selekcji rekombinacyjnych komórek bakteryjnych.

Gen odporności na antybiotyk: sekwencja DNA, nadająca odporność na antybiotyk po wprowadzeniu jej do komórki - gospodarza, który jest naturalnie wrażliwy na ten konkretny antybiotyk. Znany również jako marker antybiotykowy.

181 916

Bakteriofagi: wirusy zakażające bakterie.

cRNA: RNA o pojedynczej spirali, komplementarny do DNA, wytwarzany z tego ostatniego poprzez transkrypcję in vitro.

Chromosom: oddzielna jednostka genomu, zawierająca wiele genów·'.

Klon: duża liczba komórek lub cząsteczek, identyczna, jak ich jeden wspólny przodek.

Wektor klonujący: dowolny plazmid, do którego można wprowadzić obce DNA w celu klonowania tego DNA. Przenosi on obce DNA do komórki bakteryjnej - gospodarza w procesie transformacji.

CoA: koenzym A.

Sekwencja o lepkim końcu (cos) - sekwencja DNA pochodząca z bakteriofaga lambda, umożliwiająca upakowywanie in vitro.

Kosmid: plazmid, do którego włączono sekwencje cos, pochodzące z bakteriofaga lambda; w wyniku tego, DNA plazmidu (w którym znajdują się fragmenty obcego DNA) można upakować in vitro do otoczki faga.

Dalton: powszechnie używana jednostka masy, związana z rozmiarami cząsteczkowymi odpowiadającymi jednemu atomowi wodoru.

Ligacja DNA: tworzenie wiązania chemicznego łączącego dwa fragmenty DNA.

Komórki eukariotyczne: komórki organizmów wyższych, zawierającejądro otoczone błoną.

Grupa genów: geny znajdujące się fizycznie blisko siebie na chromosomie.

Genom: pełny zestaw chromosomów. Całość wszystkich genów osobnika.

Hybrydjyzcją hybrydyzacja kolonii: technika stosowana do identyfikacji kolonii bakteryjnych, zawierających wektory chimeryczne, których włączone DNAjest podobne do danej sekwencji.

kb: skrót na oznaczenie 1000 par zasad DNA lub RNA.

NADH: zredukowany dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy.

Linker: krótki syntetyczny dwuniciowy oligodezoksyńukleotyd, zawierający miejsce docelowe dla jednego lub więcej enzymów restrykcyjnych. Dodaje się go do wektora dla wytworzenia nowego linkera wielokrotnego, czyli wielokrotnego miejsca klonującego (MCS).

Nukleotyd: „klocek”, czyli jednostka monomeryczna kwasów nukleinowych.

Oligonukleotyd: krótki łańcuch nukleotydów.

Operon: pełnajednostka ekspresji i regulacji genów bakteryjnych, zawierająca genu struktury, geny regulatorowe i elementy kontrolne DNA, rozpoznawane przez produkt/produkty genów regulatorowych.

Plazmid: autonomiczne, samoreplikujące się, pozachromosomowe koliste DNA.

Liczba kopii plazmidu: liczba cząsteczek plazmidu, utrzymywana w bakterii na każdy chromosom gospodarza.

Primer: krótka sekwencja DNA lub RNA, komplementarna z jedną nicią DNA, posiadająca wolny koniec 3'-OH, od którego polimeraza DNA rozpoczyna syntezę łańcucha dezoksyrybonukleotydowego.

Komórki prokariotyczne: małe, względnie proste komórki większości drobnoustrojów.

Promotor: region DNA odpowiedzialny za zapoczątkowanie transkrypcji.

Enzym restrykcyjny: enzym rozpoznający swoistąkrótką sekwencję DNA i przecmającyją.

Sekwencja rozpoznawcza restrykcji: sekwencja DNA, swoiście rozpoznawana przez konkretny enzym restrykcyjny, znana również jako miejsce docelowe.

Wektor wahadłowy: pełniący podwójną rolę wektor klonujący, zdolny do replikacji w jednym lub więcej alternatywnych organizmów - gospodarzy (np. E. coli i Streptomyces).

Southern blotting: sposób przenoszenia zdenaturowanego DNA z żelu agarozowego na filtr nitrocelulozowy, gdzie można dokonać jego hybrydyzacji z komplementarną sondą kwasu nukleinowego.

Subklonowanie: przenoszenie klonowanych fragmentów DNA z wektora jednego typu na inny, np. z kosmidu rekombinacyjnego na plazmid. Nowy plazmid rekombinacyjny transformuje się następnie do odpowiedniej komórki - gospodarza dla wytworzenia szczepu - subklonu.

181 916

Transkrypcja: synteza RNA z matrycy DNA.

Transformacja komórek bakteryjnych: nabycie nowych markerów genetycznych poprzez włączenie dodanego DNA.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnej awermektyny na drodze fermentacji Streptomyces avermitilis w warunkach i na pożywce fermentacyjnej odpowiedniej do wytworzenia takiej naturalnej awermektyny przez zwiększenie ekspresji genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów, polegający na tym, że stosuje się mikroorganizm, w którym DNA zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, zawierających segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub równoważną mu czynnościową część tego segmentu DNA obejmującą sekwencję DNA oznaczonąjako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę allelicznątakiej sekwencji, na drodze manipulacji lub zastąpienia genów odpowiedzialnych za regulację takiej ekspresji w drobnoustroju Streptomyces avermitilis, poddaje się fermentacji ten mikroorganizm, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiedniej dla wytwarzania takiej naturalnej awermektyny Streptomyces avermitilis.

Korzystnie, stosuje się segment DNA, który obejmuje ponadto region DNA, regulujący ekspresję tego kompleksu dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

Jeszcze bardziej korzystnie, stosuje się segment DNA stanowiący DNA rekombinacyjne.

W sposobie według wynalazku korzystnie, stosuje się segment DNA dobrany z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadają genomową mapę restrykcyjną taką, jak przedstawiono na fig. 3.

Korzystnymi segmentami DNA są segmenty, zawierające region DNA regulujący transkrypcję lub translację sekwencji DNA oznaczonej jako SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEq. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji.

Można także stosować, w sposobie według wynalazku, część sekwencji DNA zgodnej z SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, która to sekwencja jest zdolna do hybrydyzacji, z odpowiednio, SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako sondę, lub do amplifikacji całości lub części takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako primer polimerazowej reakcji łańcuchowej.

Geny kodujące kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu znajdująsię w segmencie DNA dobranym z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD577, przy czym te segmenty DNA posiadają genomową mapę restrykcyjną taką jak przedstawiono na fig. 3.

Segment DNA wprowadza się do organizmu gospodarza jako plazmid. Plazmid ten zatem zawiera DNA rekombinacyjne obejmujące segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu drobnoustroju Streptomyces avermitilis i/lub równoważną mu czynnościową część tego segmentu DNA obejmującą sekwencję DNA oznaczonąjako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SeQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji.

Stwiedzono także, że w oparciu o powyżej zdefiniowane sekwencje genetyczne, na drodze innych manipulacji genetycznych można także wytwarzać naturalnąawermektynę. W metodach tych poddaje się fermentacji, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiednich do wytworzenia takiej naturalnej awermektyny S. Avermitilis, w którym zwiększono liczbę kopii genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym kolejne figury ilustrują:

Figura 1: sekwencję nukleotydowąprimerów polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), stosowanych do klonowania fragmentu genu E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Wywiedzione sekwencje aminokwasowe, kodowane przez poszczególne oligodezoksynukleotydy, przedstawiono nad odpowiednimi sekwencjami dNa. Strzałki wskazują kierunek amplifikacji. Fig. 1A przedstawia primer prawy, a fig. 1B przedstawia primer lewy.

181 916

Figura 2: porównanie sekwencji dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. „Wyprostowanie” wywiedzionych sekwencji aminokwasowych dla fragmentu genomowego CD503, klonowanego z zastosowaniem PCR, Streptomyces avermitilis (Sa), Bacillus stearothermophilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp) i Homo sapiens (Hs). Pionowe kreski wskazują aminokwasy identyczne. Wskazano umiejscowienie sekwencji odpowiadających prawemu i lewemu primerowi PCR, zastosowanych do klonowania (odpowiednio, u góry po stronie lewej i prawej).

Figura 3 - genomowąmapę restrykcyjną umiejscowienie i subklony dla skupienia genów bkd Streptomyces avermitilis. Czarny prostokąt pod mapą wskazuje umiejscowienie i orientację początkowego El-alfa-swoistego fragmentu genomowego CD503 S. avermitilis, klonowanego z zastosowaniem PCR. Wskazano subklony genomowe (pochodne pGEM-3Z). Przedstawiono również umiejscowienie i organizację genów strukturalnych bkd, kodujących podjednostki Elalfa (Ela), El-beta (Elb) i E2 BCKDH. Polarność zidentyfikowanych otwartych ramek odczytu (oznaczonych prostokątami) ma zwrot od strony lewej do prawej. Skróty: B, BamHI; E, EcoRI; K, KpnI; Bg, BgIII; S, SphI.

Figury 4A, 4B, 4C, 4D, 4E i 4F: sekwencja nukleotydową i wywiedzione produkty translacji 2728-bp fragmentu genomowego DNA S. avermitilis, zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) El-alfa, El-beta i E2 (częściowo) bkd. ORF El-alfa rozciąga się od pozycji 403 do 1548 sekwencji, ORF E1 -beta rozciąga się od pozycji 1622 do 2626 sekwencji, a ORF E2 rozpoczyna się w pozycji 2626. Nukleotydy ponumerowano powyżej linii sekwencji. Kodony „stop” oznaczono gwiazdką (*). Podkreślono prawdopodobne rybosomowe sekwencje wiążące ShineDalgamo. Sekwencje rozpoznawcze restrykcji BamHI ujęto w prostokąt.

Figura 5: sekwencję nukleotydową i wywiedzione produkty translacji 0,8-kb fragmentu genomowego DNA BgIII-SphI S. avermitilis, (pCD539), zawierającego część ORF E2 bkd. 251 bp sekwencjonowano poczynając od miejsca BgIII (ujęte w prostokąt). Nukleotydy ponumerowano powyżej linii sekwencji.

Figura 6: sekwencję nukleotydową primerów mutagennego (po prawej) i uniwersalnego (po lewej) polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), zastosowanych do wytworzenia pochodnych pT7 dla heterologicznej ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli. Primery PCR zastosowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego Ndel do kodonu „start” translacji ORF El-alfa lubEl-beta bkd S. avermitilis (odpowiednio, para primerów 55:31 i 56:30). Wywiedzione sekwencje aminokwasowe, kodowane przez poszczególne oligodezoksynukleotydy mutagenne, przedstawiono powyżej odpowiednich sekwencji DNA. Wskazano sekwencje rozpoznawcze restrykcji. Strzałki wskazują kierunek amplifikacji. Fig. 6A przedstawia prawe primery mutagenne, a fig. 6B przedstawia lewe primery mutagenne.

Poniżej opisano nowe sposoby klonowania genów bkd S. avermitilis i określania pierwszorzędowej struktury genów kodujących wieloenzymatyczny kompleks BCKDH S. avermitilis. Najpierw, opierając się na regionach zachowawczych zidentyfikowanych poprzez wielokrotne wyprostowanie wywiedzionych sekwencji peptydów BCKDH El-alfa, pochodzących od różnych gatunków zwierząt i opisanych w literaturze, wytworzono dwa primery PCR, zwane „prawym” i „lewym” (fig. 1). Stosując oba primery, prawy i lewy, poprzez amplifikację genomowego DNA S. avermitilis wytworzono produkt PCR, o długości około 0,2 kb. Ten amplifikowany zapomocąPCR fragment DNA klonowano następnie do wektora E. coli pGEM-3Z w celu wytworzenia rekombinacyjnego plazmidu pCD503, po czym plazmid pCD503 transformowano do komórek kompetentnych DH5-alfa E. coli. Jeden z transformantów oznaczono jako szczep CD503. Sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu CD503 pozwoliło stwierdzić istnienie otwartej ramki odczytu o wywiedzionej sekwencji peptydów wysoce homologicznej z jednostką El-alfa BCRDH (fig. 2). Klonowany fragment genomowego DNA CD503 zastosowano następnie jako sondę do przeglądania biblioteki chromosomowej S. avermitilis poprzez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano cztery kosmidy, a mianowicie CD518, CD519, CD520 i CD521. Analiza metodą restrykcji i metodą Southern blot wykazała, że cztery klony zawierały identyczne fragmenty genomowe. Sekwencjonowanie DNA ciągów delecji

181 916 subklonowanych fragmentów genomowego DNA (jak to szczegółowo opisano w przykładzie VIII) wykazało, że sekwencja CD503 stanowiła fragment pełnego skupienia genów bkd. Klonowane geny bkd S. avermitilis obejmują region chromosomu o długości około 15 kb (fig. 3). Analiza sekwencji DNA wykazała obecność próbnych sekwencji promotorowych transkrypcji i genów strukturalnych bkd, tworzących skupienie genów o następującej organizacji: sekwencja promotorowa, otwarte ramki odczytu E1-alfa, E1-beta i E2 (fig. 4 i 5).

Na koniec klonowano całe skupienie genów bkd S. avermitilis, położone w kierunku końca 3' silnego promotora T7 Escherichia coli w celu uzyskania ekspresji w gospodarzu - E. coli. Podobnie, otwarte ramki odczytu (ORF) E1-alfa i E1-beta klonowano również, oddzielnie lub razem, w kierunku końca 3' promotora T7 i poszczególne produkty testowano co do ekspresji. Nowe primery mutagenne PCR, zastosowane do włączenia unikalnego miejsca restrykcyjnego NdeI w miejscu translacji ATG ORF E1-alfa i E1-beta, opisano szczegółowo w przykładzie IX (por. również fig. 6). Badanie podwójnego systemu ekspresji plazmidu T7 wykazało, że co najmniej dwie otwarte raki odczytu skupienia genów bkd S. avermitilis, pochodzącego z CD503 (E1 -alfa i E1 -beta), mogąulegać w całości translacji przy ekspresji w E. coli. Ponadto, testy enzymatyczne, w których analizowano swoiście składową E1 kompleksu BCKDH, ostatecznie potwierdziły, że dwa rekombinacyjne klony E. coli - jeden zawierający całe skupienie genów bkd i drugi, zawierający zarówno ORF E1-alfa, jak i ORF E1-beta, wykazywały aktywność enzymu E1-BCKDH-swoistego (Tabela I). Opisujemy izolowanie genu bkd z produkującego awermektynę Streptomyces avermitilis. Obszerny genom Streptomyces (około 104 kb) jest ponad dwukrotnie większy od genomu Escherichia coli. Genom Streptomycetes utworzony jest z DNA o skrajnie wysokiej zawartości guanozyny z cytozyną (G + C) (średnio do 73%, a w niektórych regionach >90%), blisko górnej granicy obserwowanej w przyrodzie. Ta szczególna charakterystyka wymaga opracowania swoistych dla Streptomycetes technik rekombinacyjnych DNA. Przykłady takich prób można znaleźć w Zgłoszeniu Patentowym Stanów Zjednoczonych 08/048719, złożonym 16 kwietnia 1993, i w Zgłoszeniu Patentowym Stanów Zjednoczonych 08/032925, złożonym 18 marca 1993. Zgłoszenia te włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie.

W części „Przykłady” szczegółowo opisano inne techniki, swoiście ulepszone dla osiągnięcia tego celu wynalazku, jak np. amplifikacja DNA genomowego z użyciem PCR, wytwarzanie ciągów delecji, sekwencjonowania DNA i heterologiczna ekspresja genów bkd S. avermitilis w E. coli.

Poniżej przedstawiono szczegółowy opis etapów eksperymentalnych klonowania genów bkd S. avermitilis i otrzymane wyniki:

(a) Identyfikacja w podjednostce E1-alfa peptydu BCKDH regionów zachowawczych, które mogłyby służyć jako ewentualne miejsca przyłączenia primerów PCR.

W celu identyfikacji regionów zachowawczych, mogących ewentualnie służyć jako sekwencje do wytworzenia odpowiednich primerów PCR, wyprostowano cztery sekwencje peptydów E1-alfa BCKDH, uzyskane od człowieka (Fisher i wsp., 1989, J. Biol. Chem. 264: 3448-3453), szczura (Zhang i wsp., 1987, J. Biol. Chem. 262:15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch i wsp., 1988, Eur. J. Biochem. 176:311-317), i Bacill-u^ sterothe]imophiius (Perham i wsp., 1990, Eur. J. Biochem. 191; 337-346). Analizę komputerowąw celu identyfikacji regionów podjednostki E1-alfa, które są w wysokim stopniu identyczne zarówno w prokariotycznych, jak i w eukariotycznych kompleksach BCKDH, przeprowadzono z użyciem oprogramowania LineUp i Pretty z pakietu programowego do analizy sekwencji GCG (Madison), stan WI, Stany Zjednoczone). Wielokrotne wyprostowanie czterech peptydów BCKDH E1-alfa wykazało istnienie kilku regionów o zwiększonej homologii (por. Wexler I. D. i wsp., 1991, FEBS Letters 282: 209-213). Motyw wiążący pirofosforan tiaminy (Perham i wsp., 1989, FEBS Letters 255: 77-82), umiejscowiony pomiędzy ludzkimi aminokwasami E1-alfa 182-229, i region, zawierający miejsca fosforylacji 1 i 2, obejmujący aminokwasy 245-289, były szczególnie zachowawcze we wszystkich czterech analizowanych peptydach E1 -alfa BCKDH. Obecny był również uprzednio opisywany region o wysokiej homologii, umiejscowiony pomiędzy aminokwasami 291 a 307. Region ten

181 916 wydaje się występować wyłącznie w dehydrogenazach alfa-ketonokwasów, zawierających zarówno podjednostkę alfa, jak i beta, i nie jest on homologiczny z żadną sekwencją PDC E1 E. coli ani ze składowymi El kompleksów dehydrogenazy alfa-ketoglutaranów E. coli i drożdży, które stano w iądi mery złożone z tylko pojedynczych polipeptydów E1. Z wyżej wymienionych przyczyn sugerowano, że ten ostatni region homologii odgrywa rolę w interakcji podjednostek (Patel i wsp., 1991, FEBS Letters 282: 209-213). Regiony zachowawcze, dobrane do wytworzenia primerów PCR, kodująreszty aminokwasowe 192-200, i 370-376 ludzkiego białka E1-alfa BCKDH.

(b) Wytworzenie nowych oligonukleotydów, pochodzących z regionów zachowawczych E1-alfa BCKDH, do zastosowania jako primery PCR.

Jak to omówiono powyżej, w wyniku badań z wielokrotnym wyprostowaniem struktury DNA, dobrano dwa regiony zachowawcze podjednostki E1-alfa BCKDH. Z regionu obejmującego aminokwasy 192-200 ludzkiej podjednostki E1-alfa BCKDH, którą zastosowano jako reprezentatywny model podjednostki E1-alfa BCKDH, wytworzono prawy primer PCR (fig. 1). Aminokwasy te znajdują się wewnątrz motywu wiążącego pirofosforan tiaminy. Z regionu obejmującego aminokwasy 370-376 podjednostki E1-alfa BCKDH, wytworzono lewy primer PCR (fig. 1). Ta ostatnia sekwencja aminokwasów znajduje się w pobliżu C-końcowego regionu peptydu. Zastosowano oznaczenia kodonów genu Streptomyces (F. Wrigth i M.J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65). Na końcu 5' każdego z primerów znajduje się sekwencja rozpoznawcza enzymu restrykcyjnego (EcoRI w primerze prawym i XbaI w primerze lewym), dla ułatwienia klonowania produktów PCR. Pełna sekwencja prawego primera PCR jest następująca:

5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACC'fCCGAGGGCGAC-3'

Pełna sekwencja lewego primera PCR jest następująca:

5'-TCTAGACCXiCAGGT(iKiTCCGGCATCTC-3'

Podkreślono sekwencje niehomologiczne z genami E1-alfa bkd, włączone do primerów w celu klonowania (por. również fig. 1).

(c) Amplifikacja metodą PCR fragmentów genomowego DNA S. avermitilis.

Dokonano enzymatycznej amplifikacji genomowego DNA S. avermitilis, stosując warunki reakcji odpowiednie dla DNA o wysokiej zawartości GC tak, aby umożliwić skuteczną i swoistą amplifikację DNA Streptomycetes (por. przykład II). PCR przeprowadzono z zastosowaniem powyżej opisanej kombinacji primerów (primer prawy 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' i primer lewy 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'). Dokonano rozdzielenia produktów amplifikacji poprzez elektroforezę na żelu agarozowym. W wyżej opisanych warunkach PCR, stosując tę kombinację primerów, wykryto pojedynczy prążek DnA (o długości około 250 par zasad).

(d) Klonowanie amplifikowanego fragmentu genomowego DNA do wektora klonującego Escherichia coli i następcza transformacja do gospodarza - E. coli.

Jak wspomniano uprzednio, miejsce restrykcyjne EcoRI włączono do prawego primera PCR, dla ułatwienia klonowania, a na końcu 5' primera lewego znaj dowało się miej sce restrykcyjne XbaI. Jednakże nie udało się dokonać klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb z zastosowaniem ligacji, przy której zarówno wstawiony fragment, jak i wektor klonujący ulegają trawieniu przez EcoRI i XbaI. Zastosowano zatem inny sposób klonowania fragmentu o długości PCR 0,25 kb, przy czym użyto fragmentu Klenow polimerazy I DNA dla wytworzenia tępych końców we fragmencie PCR. Po włączeniu fragmentu o tępych końcach do SmaIlinearyzowanego wektora E. coli (pGEM-3Z[f+]) o tępych końcach dokonano regeneracji pojedynczego klonu rekombinacyjnego dla wytworzenia rekombinacyjnego plazmidu pCD503. Następnie pCD wprowadzono poprzez transformację do komórek kompetentnych DH5-alfa E. coli. Dobrany transformant oznaczonojako szczep CD503. Analiza restrykcyjna potwierdziła, że plazmid pCD503, wyizolowany ze szczepu CD503 E. coli, istotnie zawierał wstawkę S. avermitilis o długości 0,25 kb.

181 916 (e) Subklonowanie wstawki DNA o długości 0,25 kb, amplifikowanej zapomocąPCR, do bakteriofaga M13, sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu i identyfikacja sekwencji bkd-swoistych.

Wstawkę o długości 0,25 kb, znajdującąsię w plazmidzie pCD503, subklonowano do bakteriofaga M13. W tym celu najpierw uwolniono wstawkę z wektora E. coli poprzez trawienie pCD503 za pomocą EcoRi i PstI, dwa enzymy restrykcyjne, których sekwencje rozpoznawcze znajdują się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora pGEM po obu stronach klonowanej wstawki. Następnie fragment swoisty klonowano zarówno do wektora mp18, jak i mp19 M13, poddanego obróbce EcoRI PstI. Klonowanie do obu wektorów zapewnia możliwość wytworzenia jednoniciowego DNA obu nici wstawki DNA w celu jej sekwencjonowania. Jeden klon, zawierający swoistą wstawkę, dobrany z eksperymentu transfekcji mp18, nazwano szczepem CD505. Klon drugi, również zawierający swoistą wstawkę, ale dobrany z eksperymentu transfekcji mp19, nazwano szczepem CD506. Sekwencjonowania DNA dokonano stosując metodę terminacji łańcucha dwudezoksynukleotydowego, z użyciem jako matrycy jednoniciowego DNA i zestawu TaqTrack (Promega). We wszystkich przypadkach dokonano sekwencjonowania obu nici DNA - jednej pochodzącej z klonu CD505 i drugiej komplementarnej, pochodzącej z klonu CD506. Analiza preferencji kodonów (pakiet programów do analizy sekwencji GCG, Madison, stan WI) danych z sekwencjonowania DNA otrzymanych klonów CD505 i CD506 wykazała istnienie otwartej ramki odczytu, zawierającej prawy kodon właściwy dla genu Streptomycetes. Następnie dokonano translacji próbnej otwartej ramki odczytu do sekwencji aminokwasowej, stosując programy Seq i Translate oprogramowania IntelliGenetics Suite (InterlliGenetics Inc., Mountain View, stan Kalifornia), po czym przeprowadzono poszukiwanie podobieństwa w banku danych, stosując próbną sekwencję peptydową i program FASTDB z pakietu programów IntelliGenetics. Przeglądanie wszystkich banków danych, zarówno banków danych DNA (GenBank i EMBL), jak i banków danych białek (PIR i Swiss-Prot) wykazało jednoznacznie, że sekwencja pochodząca z klonu CD503 była wysoce homologiczna, lecz nowa i różna od wszystkich innych peptydów El -alfa BCKDH, zarówno pochodzenia prokariotycznego, jak i eukariotycznego, notowanych w bankach danych. Wynik wielokrotnego wyprostowania sekwencji peptydowych E1-alfa BCKDH, pochodzących od człowieka, szczura, Pseudomonas putida i Bacillus stearothermophilus, jak również nową sekwencję peptydową CD503 E1-alfa BCKDH Streptomyces avermitilis, przedstawiono na fig. 2. Z danych tych można wyciągnąć wniosek, że produkt PCR, o długości 250 par zasad, genomu S. avermitilis, klonowany w szczepie CD503 E. coli, stanowi istotnie nowy fragment genowy E1-alfa bkd.

(f) Klonowanie całego skupienia genów bkd S. avermitilis, analiza metodą restrykcji i metodą Southern blot i tworzenie mapy chromosomowej.

Fragment DNA BamHI/EcoRI o długości 0,25 kb, pochodzący z pCD503, zawierający E1-alfa-bkd-swoistą sekwencję DNA S. avermitilis, zastosowano jako znakowaną radioaktywnie sondę do przeglądania biblioteki kosmidów genomowego DNA S. avermitilis poprzez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano i regenerowano cztery klony (CD518, CD519, CD520, CD521). Analiza metodą restrykcji i hybrydyzacji metodą Southern blot wykazała, że te cztery klony zawierały identyczne sekwencje, pochodzące z tego samego regionu chromosomu. Ta sama sonda została następnie inkubowana z wysoką dokładnością, z produktami Southern blot strawionego DNA chromosomalnego, pochodzącego z S. avermitilis ATCC 31272. Ta ostatnia analiza potwierdziła tożsamość klonów regenerowanych z biblioteki genomowej. Mapę restrykcyjną fragmentu genomowego, zawierającego sekwencję CD503 S. avermitilis, przedstawiono na fig. 3.

(g) Subklonowanie fragmentu genomowego DNA, pochodzącego z klonów CD518 i CD521, i sekwencjonowanie DNA regionu chromosomalnego S. avermitilis, zawierającego skupienie genów bkd.

Fragmenty genomowe (o długości 1 -2 kb), zawierające całość regionu bkd CD503 chromosomu S. avermitilis, subklonowano z klonów CD521 i CD518 biblioteki DNA do wektora E. coli pGEM-3Z. Poniżej przedstawiono listę subklonów wytworzonych w wyniku tej operacji

181 916 wraz z krótkim opisem poszczególnych plazmidów: 1. plazmid pCD528 zawiera fragment BamHI o długości 7 kb, subklonowany z pCD518; 2. plazmid pCD545 zawiera fragment SphI o długości 2,3 kb, subklonowany z pCD528; 3. plazmid pCD550 zawiera fragment SphI o długości 6 kb, subklonowany z pCD521; 4. plazmid pCD559 zawiera fragment BamHI o długości 7 kb, subklonowany z pCD521; 5. plazmid pCD574 zawiera fragment SphI-BgIII o długości 4,2 kb, subklonowany z pCD550, a 6. plazmid pCD579 zawiera wstawkę o długości około 10,4 kb. Wstawka ta zawiera dwa przylegające fragmenty genomowe, które na powrót połączono: i ragment SphI/BgIII o długości 4,2 kb, subklonowany z pCD550, i fragment BgIII/BamHI o długości 6,2 kb, subklonowany z pCD559. Mapowanie restrykcyjne plazmidu, hybrydyzacja metodą Southern i analiza PCR potwierdziły tożsamość poszczególnych subklonów. Da oznaczenia sekwencji nukleotydowej zastosowano metodę terminacji łańcuchów Sanger. W tym celu fragmenty genomowe S. avermitilis subklonowano następnie do bakteriofagów M13 mp 18 i M13 mp 19 dla określenia sekwencji obu nici DNA. Z wyżej wymienionych klonów, pochodzących z pGEM, wyizolowano kilka fragmentów restrykcyjnych DNA i dokonano ich ligacji do M13 mp18 i M13 mp19, uzyskując w wyniku następujące fagi rekombinacyjne:

CD535: fragment DNA S. avermitilis o długości 0,4 kb, klonowany metodąPCR z zastosowaniem DNA pCD528 jako matrycy, primera swoistego 29-PCR-EX (.S^/AAGAAniZCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCiGGCnAC-S') i primera uniwersalnego 31-PCR-BP (por. przykład IX i fig. 6). Dokonano restrykcji amplifikowanego fragmentu, stosując EcoRI i PstI, po czym wklonowano go do DNA M13 mp18, lineryzowanego za pomocą EcoRI/PstI.

CD536: fragment DNA, podobny do opisanego powyżej, klonowany do DNA M13 mp19.

CD537: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, zawierający sekwencję CD503, subklonowany z pCD528 do M13 mpl8.

CD538: fragment DNA SaII pCD528 o długości 1,15 kb, (zlokalizowany w kierunku końca 5' od opisanego powyżej fragmentu SaII o długości 1,15 kb), klonowany do M13 mp 18.

CD539: fragment DNA BamHI/BgIII, o długości 1,5 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18.

CD541: fragment DNA SaII/BamHI o długości 0,35 kb, subklonowany z pCD528 do M13 mp18.

CD542: fragment DNA Sall/BamHI o długości 0,35 kb, subklonowany z pCD528 do M13 mp19.

CD553: fragment DNA BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18.

CD554: fragment DNA BamHI o długości 1,1 kb, subklonowanyzpCD550doM13mp18.

CD555: fragment DNA, podobny do opisanego powyżej, klonowany w przeciwnej orientacji do M13 mp18.

CD558: fragment DNA BamHI/HindIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD553 do M13 mp19.

CD561: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mp18 (orientacja przeciwna niż w CD537).

CD565: fragment DNA Sali o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mp 19.

CD566: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD537 do M13 mp19 (orientacja przeciwna niż w CD565).

CD567: fragment DNA SaII o długości 1,15 kb, subklonowany z pCD538 do M13 mp19.

CD582: fragment DNA BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, subklonowany z pCD550 do M13 mp18 (orientacja przeciwna niż w CD553).

Wstawki genomowe S. avermitilis, zawarte w tych klonach, skrócono następnie poprzez traktowanie Egzonukleazą III w celu wytworzenia serii subklonów („ciągi delecji”, por. przykład VIII).

(h) Analiza komputerowa danych z sekwencjonowania DNA, uzyskanych z klonowanych fragmentów DNA, i identyfikacja ramek odczytu bkd Eł-alfa, E1-beta i E2 S. avermitilis.

181 916

Sekwencję nukleotydową regionu genomowego S. avermitilis, o długości 2,7 kb, zawierającego geny bkd, przedstawiono na fig. 4. Przesuwnej anali'zy składu zasad regionu genomowego, o długości 27 kb, zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) bkd E1-alfa, E1-beta i E2 (częściowo) S. avermitilis, dokonano z użyciem oprogramowania „DNA Inspector”. W analizie tej określa się profil bieżącej średniej zawartości G + C, stosując rozstaw wynoszący 30 zasad i przesunięcie wynoszące 20. Całkowita zawartość G + C, odpowiadająca temu regionowi chromosomu S. avermitilis, wynosiła 72%. Bezpośrednio powyżej otwartych ramek odczytu bkd zlokalizowano miejsce o niskiej zawartości G + C (zawartość G + C wynosząca około 50%) - co jest wskaźnikiem regionu promotorowego.

Analizowano również zawartość G + C w funkcji pozycji kodonu. Z zastosowaniem tabeli kodonów Streptomyces dla 64 genów (F. Wright i M.J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65) i oprogramowania „CodonPreference” (Genetics Computer Group, Madison, stan WI) wykryto otwarte ramki odczytu. Oprogramowanie „CodonPreference” jest swoistym względem ramek programem służącym do wyszukiwania genów, który rozpoznaje sekwencje kodujące białka poprzez ich podobieństwo do tabeli częstości kodonów lub poprzez odchylenie w ich składzie (zwykle GC) w pozycji trzeciej poszczególnych kodonów. ORF przedsatwiono w postaci prostokątów poniżej wykresu dla ich odpowiednich ramek odczytu. Wykryto również wszystkie kodony „start” (ATG) i „stop” (linie pionowe). Poniżej każdego wykresu ORF zaznaczono rzadkie kodony wykryte w poszczególnych ramkach odczytu. Zawartość G + C obliczono, stosując przesuwne „okno”, utworzone z 25 kodonów, tak więc oczekiwano opóźnienia wynoszącego około 25 kodonów przed ujawnieniem się pełnego wpływu regionu kodującego białko. Uzyskano następujące trzy profile: 1. pierwsza pozycja w trójce 2. druga pozycja w trójce 3. trzecia pozycja w trójce. W wyniku tej analizy zlokalizowano trzy ORF bkd, odpowiadające następującym podjednostkom BCKDH: E1-alfa, E1-beta, E2 (fig. 4 i 5).

(i) Skład nowych oligonukleotydów, które można stosować jako primery w opartej na PCR mutagenezie ukierunkowanej.

Dla wprowadzenia miejsca restrykcyjnego NdeI do miejsca ATG początku translacji ORF E1-alfa i E1-beta zastosowano mutagenezę ukierunkowaną opartą na linkerach lub reakcji PCR. Wytworzono następujące nowe Ollgonukleotydy (por. również przykład IX i fig. 6):

Lewe primery uniwersalne (wektorowe):

30- PCR-BP: 5'-AAGCATCGTGCAGGCGAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3'

31- PRC-BP: 5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3'

Prawe primery mutagenne:

55- PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3'

56- PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3' (j) Mutegeneza ukierunkowana genów bkd S. avermitilis w celu wytworzenia nowego miejsca restrykcyjnego NdeI powyżej otwartej ramki odczytu.

Plazmidy ekspresyjne stanowiły pochodne plazmidu pT7-7 (por. S. Tabor, 1990, w: Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York), zawierające ORF E1-alfa, E1-beta, E1-alfa + E1-beta, lub pełne skupienie genów bkd S. ayermitilis. Miejsce restrykcyjne NdeI wytworzono poprzez opartą na PCR mutagenezę ukierunkowaną. Do tych badań wytworzono następujących pięć plazmidów ekspresyjnych:

Plazmid pCD670: pochodna pT7-7, zawierająca otwartą ramkę odczytu (ORF 1) bkd E1- alfa S. ayermitilis. Do genu bkd E1-alfa S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne NdeI, obejmujące kodon „start” ATG, poprzez amplifikację i jednoczesną mutagenezę z zastosowaniem primera mutagennego PCR 55-PCR (por. przykład IX i fig. 6).

Plazmid pCD666: pochodna pT7-7, zawierająca otwartą ramkę odczytu (ORF 2) bkd E1-beta S. αvermitilia. Do genu bkd E1-beta S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne NdeI, obejmujące kodon „start” ATG, poprzez amplifikację i jednoczesną mutagenezę z zastosowaniem primera mutagennego PCR 56-PCR (por. przykład IX i fig. 6). Dla osiągnięcia optymalnej ekspresji tego ORF pozycję trzecią kodonu 7 zmieniono z C na G dla wytworzenia

181 916 kodonu synonimowego, przypominającego kodon E. coli. Sekwencja peptydowa E1-beta nie zmieniła się wskutek tego podstawienia.

Plazmid pCD736: pochodna pT7-7, zawierająca zarówno ORF E1 -alfa (ORF 1), jak i ORF E1-beta (ORF 2) pod kontrolą promotora T7.

Plazmid pCD705: podobny do pCD736, ale zawierający połowę 3' ORF E1-beta, ustawioną w niewłaściwej orientacji. Plazmid ten stosowano jako kontrolę ujemną w eksperymentach dotyczących ekspresji.

Plazmid pCD685: pochodna pT7-7, zawierająca całość skupienia genów bkd S. avermitilis.

(k) Ekspersja otwartych ramek odczytu genów bkd S. avermitilis w E. coli z zastosowaniem podwójnego plazmidowego systemu ekspresji T7.

Dokonano ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli, stosując podwójny plazmidowy system ekspresji T7 polimerazy RNA/promotora, w zasadzie w sposób opisany przez S. Tabor (1990, w Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York). Analizowano pochodne E. coli C600 (pGP-1), zawierające różne produkty pT7-7. Do monitorowania ekspresji ORF S. avermitilis po indukcji cieplnej w gospodarzu - E. coli stosowano elektroforezę na żelu poliakrylamidowym z zastosowaniem soli sodowej siarczanu dodecylowego (SDS-PAGE). Analiza SDS-PAGE profilu białek w czasie indukcji wykazała nadmierną ekspresję indukowanych peptydów o rozmiarach podobnych do wartości przewidywanej (wywiedzionej z odpowiedniej sekwencji DNA), dla ORF E1-alfa i E1-beta, jak to przedstawiono poniżej:

Wielkość przewidywana Wielkość rzeczywista (Da) (Da)

ORF1 (E1-alfa) 41000 41000

ORF2 (E1-beta) 35000 34000 (l) Wykrywanie aktywności BCKDH E1 S. avermitilis z zastosowaniem testu swoistego w nieoczyszczonym wyciągu rekombinacyjnego klonu E. coli.

Wyniki te podsumowuje poniższa tabela 1 (przykład XI). Testy na wykrywanie BCKDH swoistego względem E1, przeprowadzone w nieoczyszczonym wyciągu z komórek E. coli, zawierających pCD736, wykazały istnienie znaczącej aktywności El po indukcji promotora T7. Hodowla w podobnych warunkach komórek, w 'których część wstawki była ustawiona w niewłaściwej orientacji (pCD705), wykazała poziom aktywności równy poziomowi tła.

W testach enzymatycznych stwierdzono ponadto, że nieoczyszczony wyciąg ze szczepu E. coli, zawierającego plazmid pCD685, również wykazywał znaczącą aktywność BCKDH E1 (>10-krotną wartość tła). Analizowano również nieindukowaną hodowlę tego klonu i stwierdzono podstawowy poziom aktywności dwukrotnie przewyższający tło. Ten ostatni wynik był do przewidzenia, jak że wiadomo, że system T7 umożliwia niski poziom ekspresji konstytutywnej klonowanych genów, nawet w warunkach braku indukcji.

Klonowane skupienie genów bkd Streptomyces avermitilis jest korzystne w ulepszaniu wytwarzania naturalnej awermektyny poprzez zwiększanie liczby kopii tych genów lub poprzez optymalizację ich ekspresji w wytwarzających szczepach. Jedno z możliwych rozwiązań dla uzyskania skutecznej ekspresji klonowanych genów bkd polega na insercji tych genów do zawierającego liczne kopie genów wektora wahadłowego E. coli/Streptomycetes (np. plazmid pCD262, Denoya C.D., 1993, „Novel Bacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli”, Zgłoszenie Patentowe Stanów Zjednoczonych 08/032925, złożone 18 marca 1993), przy czym geny ulegajjątranskrypcji z silnego promotora. Sposób ten zapewnia skuteczną transkrypcję genów·'. Istnieje kilka innych sposobów osiągnięcia skutecznej ekspresji. Należy do nich zapewnienie (a) siły promotora (b) stabilności mRNA (c) obecności lub nieobecności czynników regulacyjnych (d) indukowalności i (e) mutageneza ukierunkowana w celu poprawy rozpoznawania rybosomu i sygnałów początku translacji. Ekspresję genów bkd można również ulepszyć, zastępując promotor i regiony regulacyjne typu dzikiego różnymi innymi promotorami poprzez techniki zastąpienia genów. W literaturze opisano liczne przykłady korzystnych promo16

181 916 torów, które można zastosować dla optymalizacji ekspresji opisywanych w niniejszym zgłoszeniu nowych genów bkd S. avermitilis, np. silny promotor ermE (Hopwood i wsp., 1985, „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Foundation, Norwich, Wielka Brytania) i indukowany tiostreptonem promotor tipA (Murakami i wsp., 1989, J. Bacteriol, 171, 1459-1466). Ponadto, w wyniku inaktywacji genów bkd przy jednoczesnym braku aktywności BCKDH poprzez delecję lub mutagenezę ukierunkowaną z zastosowaniem technik zastąpienia genów można wytworzyć ulepszone, nieodwracalnie zablokowane szczepy bkd Streptomyces avermitilis, korzystne dla wytwarzania nowych awermektyn.

Przykłady

W dalszym ciągu niniejszego opisu przedstawiono szczegółowe przykłady sposobów doświadczalnych, zastosowanych do klonowania i analizowania genów bkd pochodzących z S. avermitilis, które przedstawiono również na załączonych figurach. Dodatkowe szczegóły rutynowych technik, dobrze znane specjalistom w zakresie biologii molekularnej, i oznaczenia poszczególnych zastosowanych enzymów, przedstawiono np. w podręczniku laboratoryjnym „Molecular Cloning”, autor: Maniatis i wsp. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Przykład I. Wytwarzanie DNA genomowego S. avermitilis

Grzybnię S. avermitilis ATCC 31272 hodowano w postaci zlewającej się murawy na pożywce agarowej YPD-2 przez 7 dni w temperaturze 29°C. Pożywka zawierała:

Wyciąg z drożdży Difco	10g
Bacto-pepton Difco	10g
Dekstrozę	5g
Agar Difco Bacto	20 g
Octan sodowy	2g
MOPS	10g

pH doprowadzono do wartości 7,0.

Objętość końcowa: 1 l.

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 25 minut w temperaturze 121°C. Wyhodowaną grzybnię posiano na 30 ml pożywki AS-7 (por. Hafner i wsp., Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 88300-353.5, publikacja nr 0 284 176) w kolbie z przegrodą o pojemności 300 ml, którą utrzymywano, ciągle mieszając, w temperaturze 29°C przez 24 godziny. Pożywka zawierała:

Rozcieńczoną skrobię¹ 20 g

Ardaminę pH² 5 g

Pharmamedia³ 15 g

Węglan wapniowy (CaCO3) 2 g pH doprowadzono do wartości 7,2, stosując wodorotlenek sodowy (NaOH).

Objętość końcowa: 1 l.

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 25 minut w temperaturze 121°C.

¹ - wytworzono przez hydrolizę skrobi alfa-amylazą, pochodzącą z Bacillus licheniformis, do równoważnika dekstrozy wynoszącego około 40%.

- uzyskano z Yeast Products, Inc., Clifton, stan NJ, 07012

- uzyskano z Traders Protein, Memphis, TN, 38108.

Około 0,3 ml powyższej hodowli posiano do kolejnej kolby z przegrodą o pojemności 300 ml, zawierającej 30 ml modyfikowanej płynnej pożywki Yeast Extract Malt Extrack (YEME) (Bibb, M.J., Freeman, R.F., i D.A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154:155-166). Modyfikowana pożywka YEME zawierała (w przeliczeniu na litr pożywki):

Wyciąg Difco Yeast	3g
Pepton Difco Bacto	5g
Wyciąg Oxoid Malt	3g
Sacharozę	300 g
Glukozę	10g

181 916

Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 40 minut w temperaturze 121°C. Po wyjałowieniu dodano 2 ml 2,5 M sześciowodzianu chlorku magnezowego (MgCl₂ · 6 H₂0). Końcową objętość doprowadzono do 11. Hodowle prowadzono przez 48-72 godzin w temperaturze 29°C. Grzybnie regenerowano poprzez odwirowanie, po czym wytworzono DNA genomowe według sposobu opisanego w „Isolation of Streptomyces Total dNa by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Procedure 2”, jak to opisano w podręczniku „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manuał”, The John Innes Foundation, Norwich, Wielka Brytania, 1985, autor: drD.A. Hopwoodiwsp. Grudki DNA zawieszono ponownie w 3 ml bufora TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).

Przykład II. Amplifikacja DNA genomowego S. avermitilis z zastosowaniem pol limerazowej reakcji łańcuchowej.

Genomowe DNA S. avermitilis amplifikowano enzymatycznie, stosując urządzenie do przeprowadzania cyklu obróbki cieplnej typu Perkin-Elmer Cetus. Reakcję PCR przeprowadzono stosując polimerazę Taq (Perkin-Elmer Cetus) i bufor dostarczony przez producenta, w obecności 200 pM dNTP, 15% glicerolu, po 0,5 pM każdego z primerów, 50 ng matrycy DNA (w tym przypadku matrycę stanowiło genomowe DNA S. avermitilis), i 2,5 jednostek enzymu, w końcowej objętości 100 pl, przez 30 cykli. Profil cieplny pierwszego cyklu był następujący: 95°C przez 3 minuty (etap denaturacji), 55°C przez 2 minuty (etap wyżarzania) i 72°C przez 2 minuty (etap wydłużania). Kolejnych 29 cykli miało podobny profil cieplny z tym wyjątkiem, że etap denaturacji skrócono do 1,5 minuty. Primery DNA uzyskano z Genosys Biotechnologies, Inc. (stan Teksas). Sekwencja prawego primera PCR (fig. 1) była następująca: 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3', a sekwencja primera lewego: 5^,-TCTAGACCGCAGGTCiGT^CCXiCiCA^^ITTC?-3'. Produkty amplifikacji rozdzielono za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. Elektroforezy próbki PCR dokonano w poziomym 1,5% żelu agarozowym w buforze 1X TBE (90 mM Tris-HCl, pH 8,5,90 mM kwasu borowego,

2.5 mM kwasu etylenodwuaminoczterooctowego (EDTA) przez 1,5 godziny, przy napięciu wynoszącym 100 V, jak to opisał Maniatis i wsp. Rozdzielone odcinki DNA, stanowiące produkt PCR, zlokalizowano na żelu, stosując barwienie bromkiem etydyny i uwidocznienie prążków fluoryzujących w świetle ultrafioletowym o długości fali 365 nm. W opisanych powyżej warunkach PCR przy stosowaniu tej kombinacj i primerów wykrywano pojedynczy prążek DNA (o długości 250 par zasad).

Przykład III. Klonowanie amplifikowanego przy użyciu PCR fragmentu genomowego DNA o długości 0,25 kb do wektora E. coli i transformacja do gospodarza E. coli.

A. Regeneracja produktu PCR o długości 0,25 kb

Jak to wspomniano powyżej, fragment DNA o długości 0,25 kb amplifikowano w PCR, stosując genomowe DNA S. avermitilis jako matrycę i kombinację primerów lewego i prawego. Jak to przedstawiono na fig. 1, primer prawy posiada miejsce rozpoznawcze EcoRI, umiej scowione na końcu 5', a primer lewy posiada miejsce rozpoznawcze XbaI, umiejscowione na końcu 5'. Jednakże próby klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb z zastosowaniem ligacji, przy których zarówno wstawka, jak i wektor kodujący były trawione przez EcoRI i Xbal, nie powiodły się. Zastosowano więc inne rozwiązanie klonowania fragmentu PCR o długości 0,25 kb, w którym zastosowano fragmenty Klenow polimerazy I DNA dla wytworzenia tępych końców we fragmencie PCR. Po amplifikacji, (jak to opisano w przykładzie II), dokonano dwukrotnej ekstrakcji około 80 pl produktów reakcji PCR, stosując mieszaninę fenolchloroform, następnie dwukrotnie ekstrahowano eterem, po czym fragment DNA, stanowiący produkt PCR, strącono z użyciem etanolu, jak to opisywano uprzednio. DNA ponownie zawieszono w

18.5 pl H₂0; następnie dodano 2,5 pl 10x buforuNick-translation (0,5 m Tris-HCl), pH 7,2,0,1 M siarczanu magnezowego (MgSO4), 1 mM ditiotreitu, 500 pg/ml bydlęcej albuminy osoczowej) (Maniatis i wsp., 1989) i 20 jednostek fragmentu Klenow polimerazy I DNA E. coli (Boehringer Mannheim Biochemicals) i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Następnie dodano 1 pl 2 mM dNTP (po 2 mM każdego z 4 dNTP) i mieszaninę dalej inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Reakcję naprawy DNA zahamowano,

181 916 dodając 1 μΐ 0,5 M EDTA, pH 8,0, i całkowitą zawartość mieszaniny reakcyjnej przeniesiono na 1,5% żel agarozowy i poddano elektroforezie. Fragment DNA o długości 0,25 kb uwidoczniono sposobem opisanym powyżej i regenerowano poprzez elektroelucję, przeprowadzoną w następujący sposób: prążek DNA o długości 0,25 kb usunięto żyletkąi dokonano regeneracji DNA z żelu agarozowego poprzez elektroelucję przez 35 minut przy napięciu 80 V w zagłębieniu o kształcie litery V, napełnionym 10 mM octanu amonowego, stosując urządzenie do elektroelucji jednokierunkowej (International Biotechnology Inc., New Haven, stan CT). Następnie dokonano strącenia DNA z użyciem etanolu, mieszaninę poddano granulacji, a na koniec ponownie rozpuszczono w 20 μΐ buforu DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM chlorku sodowego (NaCl), 0,1 mM EDTA; pH 7,5).

B. Trawienie za pomocą SmaI i defosforylacja wektora plazmidowego pGEM-3Z

Około 1 μg plazmidu pGEM-3Zf(+) (Promega Corp., Madison, stan WI) i 2 jednostki enzymu restrykcyjnego SmaI (wszystkie enzymy restrykcyjne nabyto w firmie Boehringer Mannheim Biochemicals) inkubowano w buforze testowym, wskazanym przez producenta, w temperaturze 25°C przez 3,5 godziny, przy czym całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 40 mikrolitrów (μθ dla wytworzenia linearnych cząsteczek o tępych końcach. Następnie, linearyzowany za pomocą SmaI wektor poddano defosforylacji z zastosowaniem cielęcej jelitowej fosfatazy zasadowej (CIAP) (nabytej w Promega Corp., Madison, stan WI), według zaleceń producenta. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 35 minut w temperaturze 37°C, po czym dokonano dwukrotnej ekstrakcji DNA, stosując równą objętość mieszaniny fenolu i chloroformu, dwukrotnie ekstrahowano równą objętością eteru, a na koniec dokonano strącenia DNA poprzez dodanie dwukrotnej objętości absolutnego etanolu. Strącone DNA regenerowano poprzez odwirowanie (10000 x G) przez 10 minut, i wysuszono pod próżnią. Uzyskaną grudkę rozpuszczono w 20pl buforu DNA.

C. Ligacja dla wytworzenia pCD503

Około 9 μl poddanego obróbce fragmentem Klenow DNA, stanowiącego produkt PCR, o długości 0,25 kb, i około 1 μl linearyzowanego za pomocą SmaI, defosforylowanego z użyciem CIAP pGEM-3Zf(+) o tępych końcach inkubowano przez noc z jedną jednostką ligazy (New England BioLabs, IC, Beverly, stan MA) w warunkach wskazanych przez producenta w temperaturze 14°C, przy czym całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 μ. Reakcję zakończono, umieszczając mikroprobówkę testową na lodzie, po czym 15 μΐ mieszaniny reakcyjnej zastosowano do transformacji kompetentnych komórek JM 109 E. coli według rutynowego sposobu, jak to opisał Maniatis i wsp., 1989. Uzyskano liczne transformanty oporne na ampicylinę. Wektor plazmidowy pGEM-3Zf(+) zawiera fragment DNA pochodzący z operonu lac Escherichia coli, kodującego fragment aminokońcowy beta-galaktozydazy (Yanish-Perron, C., Vieira, J., i J. Messing, 1985, Gene, 33, 103). Fragment ten, którego syntezę można indukować stosując izopropylotiobeta-D-galaktozyd (IPTG) zdolny jest do wewnątrzallelicznej (alfa) komplementacji z ułomną formą beta-galaktozydazy, kodowaną przez gospodarza. Komórki E. coli, wystawione na działanie induktora IPTG, syntetyzują oba fragmenty enzymu, tworząc niebieskie kolonie po wysianiu ich na pożywki zawierające substrat chromogenny 5-bromo-4-chloro-3indolilo-beta-D-galaktozyd (X-gal). Insercja obcego DNA do poliklonującego miejsca plazmidu powoduje inaktywację beta-galaktozydazowego fragmentu aminokońcowego i znosi alfakomplementację. Tak więc, bakterie zawierające plazmidy rekombinacyjne tworzą kolonie białe. W tym doświadczeniu transformacji uzyskano liczne białe kolonie. Kolonie te powinny zawierać plazmid pCD503. Zostało to potwierdzone poprzez dobraniejednej kolonii, oznaczonej jako szczep CD503, i jej dalszą analizę. Pojedynczą kolonię bakteryjną szczepu E. coli CD503 posiano do płynnej pożywki Luria-Bertani (LB), zawierającej 50 μg/ml ampicyliny, według rutynowych sposobów stosowanych w mikrobiologii. Pożywka LB zawierała:

Bacto-trypton 10 g

Wyciąg Bacto z drożdży 5 g

NaCl 10 g

181 916 pH doprowadzono do wartości 7,0, stosując 5 N wodorotlenek sodowy (NaOH). Końcową objętość roztworu doprowadzono do 1l. Wyjaławiano w reaktorze ciśnieniowym przez 20 minut w temperaturze 121°C.

Hodowlę inkubowano przez noc w temperaturze 35°C. Następnego dnia rano komórki bakteryjne zebrano poprzez odwirowywanie z prędkością 10000 obr./min. przez 5 minut w temperaturze 4°C. Wektor plazmidowy wyizolowano ze świeżo zebranych komórek Escherichia coli CD503, stosując modyfikację sposobu opisanego przez Bimboim i Doly (Nucleic Acid Res., 1979,7:1513), jak to opisał Denoya i wsp., 1985, Microbios Lett., 29:87. Wyizolowany plazmid DNA rozpuszczono na koniec w buforze DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5) dla wytworzenia stężenia wynoszącego około 1 pg pCD503 na 10 (l buforu. Potwierdzająca analiza restrykcyjna z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pstl wykazała, jak tego oczekiwano, że pCD503 zawierał wstawkę DNA o długości 0,25 kb.

Przykład IV. Wytwarzanie znakowanych radioaktywnie sond DNA i RNA

A. Wytwarzanie jednolicie znakowanych dwuniciowych sond DNA

Dwuniciowe sondy DNA wytworzono przez translację typu nick (ogólny opis tej techniki por. Maniatis i wsp., 1989). W pierwszym etapie, zawierający sekwencję docelową swoisty fragment DNA wytworzono poprzez odpowiednie trawienie enzymami restrykcyjnymi i oczyszczenie poprzez elektroelucję w zasadzie tak, jak to opisano w przykładzie I. Oznakowano około 1 pg DNA, stosując w każdym przypadku [alfa-³²P] dCTP (znakowaną [alfa-³2P] sól dezoksycytydynową 5'-trójfosforanu cztero(trójetylo)amonowego, którą uzyskano z NEN-Dupont, oraz BRL Nick Translation System, uzyskany z BRL Life Technologies Inc., zgodnie ze wskazówkami producenta. Typową reakcję przeprowadzono w objętości wynoszącej 50 pl. Po dodaniu 5 (l bufora Stop, (jak to opisano we wskazówkach BRL), rozdzielono oznakowane DNA od nukleotydów niewłączonych, stosując kolumnę przyciskową Stratagene według instrukcji obsługi dostarczonej przez producenta. W wyniku zastosowania powyższego sposobu uzyskano DNA znakowane 32p o swoistej aktywności znacznie przekraczającej 10⁸ cpm/pg.

B. Wytwarzanie znakowanych jednoniciowych sond RNA

Sondy RNA, znakowane 3²P, wytworzono poprzez transkrypcję in vitro, stosując system transkrypcyjny Riboprobe Gemini (Promega). Oczyszczony fragment docelowego DNA klonowano do wektora transkrypcyjnego pGEM-3Z, stosując rutynowe sposoby. Wytwarzanie matrycowego DNA plazmidowego do reakcji transkrypcji in vitro przeprowadzono tak, jak to opisano w przykładzie III, jednakże włączając etap strącania glikolem polietylenowym (PEG) w celu wybiórczego usunięcia nukleotydów o małych rozmiarach, które mogłyby zanieczyszczać te preparaty. Etap ten przeprowadzono w następujący sposób: po etapie strącania etanolem grudkę ponownie zawieszono w 520 pl wody, po czym dodano 100 pl MN NaCi 1 i 62 0 pd33% EG G (MW 6000-8000). Po zmieszaniu rurkę inkubowano na lodzie przez 1 godzinę, po czym dokonano granulacji DNA w temperaturze 4°C przy 10000 x G przez 15 minut. Grudkę przepłukano jednokrotnie z użyciem 500 pl 80% zimnego etanolu, po czym w rutynowy sposób ponownie zawieszono. Około 1 pg matrycowego plazmidowego DNA poddano linearyzacji z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych SacI lub HindIII, a następnie dokonano ich transkrypcji in vitro z zastosowaniem DNA-zależnej polimerazy RNA, odpowiednio, bakteriofaga SP6 i T7. W reakcji tej zastosowano [alfa-3²P] sól cytydynową 5'-^t^<ój^?o^foranu cztero(trójetylo)amonowego (CTP), którą uzyskano z NEN-Dupont. Zastosowano warunki reakcji zalecane przez producenta. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną potraktowano 1 jednostką RQ1 -DNazy (Promega) w celu degradacji matrycy DNA, ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenolchloroform, po czym strącono etanolem według rutynowych sposobów. Grudkę wysuszono i zawieszono ponownie w 20 (l wody pozbawionej RNazy (Promega). Dokonano analizy próbki o małej objętości znakowanego transkryptu RNA, stosując elektroforezę na żelu poliakrylamidowo-agarozowym, jak to opisał Denoya i wsp., 1987, J. Bacteriol 169: 3857-3860. W wyżej opisanych warunkach uzyskano rutynowo znakowane transkrypty o pełnej długości.

Przykład V. Analiza DNA genomowego S. avermitilis poprzez hybrydyzację metodą Southern

181 916

Około 10 pg oczyszczonego DNA genomowego S. avermitilis poddawano trawieniu dwoma jednostkami enzymu restrykcyjnego BamHI w temperaturze 37°C przez co najmniej 2 gocteiny. Pod koniec trawienia fragmenty DNA rozdzielono poprzez elektroforezę na 1% żelu agarozowym (por. przykład 1 A), i przeniesiono przez noc na błonę nylonową (średnica porów 0,45 pm) (błony Schleicher i Schuell Nytran), stosując metodę przenoszenia kapilarnego (Southern E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503). Następnego dnia błony nylonowe opakowano w folię plastykowąi stronę zawierajjącąDNA każdej błony wystawiono na działanie promieniowania ultrafioletowego (302 nm) w celu przytwierdzenia DNA do błony. Przeprowadzono hybrydyzację znakowanych radioaktywnie sond RNA lub DNA do DNA unieruchomionego na błonach nylonowych, stosując sposób opisany przez Maniatis i wsp., 1989. Prehybrydyzację i przeprowadzono w 42°C. Roztwór hybryny zawierał: 6 x

SSC [1x: 0,15 M chlorku sodowego (NaCl), 15 mM cytrynianu sodowego, pH 7,0], 10 x odczynnik Denhardta [1x: 0,02% fikolu, 0,02% pcliwinylopirclidonu, 0,02% bydlęcej albuminy osoczowej], 1% SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu), 100 pg/ml zdenaturowanego, rozfragmentcwanegc DNA spermy łososiowej, 100 tRNA E. coli i 50% formamidu (Fluka). Po hybrydyzacji przez noc błony przepłukano w następujacy sposób: dwukrotne płukanie 1x SSC 0,1 % SDS w temperaturze pokojowej przez 15 minut i dwukrotne płukanie 0,1 x SSC 0,1% SDS w temperaturze 42°C przez 15 minut. W niektórych doświadczeniach hybrydyzację przeprowadzano w temperaturze 65°C w nieobecności formamidu, stosując zamiast SSC - SSPE [1x: 0,18 M NaCl, 10 mM fosforanu sodowego (NaPOJ, pH 7,7,1 mM EDTA], Na koniec błony poddano ekspozycj i z klisząRTG, w celu uzyskania obrazu autoradiograficznegc.

Przykład VI. Klonowanie fragmentu genomowego DNA S. avermitilis CD503 o długości 0,25 kb do bakteriofaga M13 i sekwencjoncwanie DNA

Fragment genomowy DNA S. avermitilis CD503 o długości 0,25 kb klonowano do bakteriofagów M13 mp18 i M13 mp 19 w celu wytworzeniaecdnoniciowego rekombinacyjnego DNA, które stosowano następnie jako matryce w metodzie dwudezcksysekwencjonowania, opisanej przez Sangera (Sanger i wsp., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74: 5463-5467). Około 2 pg plazmidu pCD503, wytworzonego skróconym sposobem opisanym powyżej, poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl w celu uwolnienia wstawki genomowej S. avermitilis o długości 0,25 kb. Uprzednia analiza restrykcyjna wykazała, że pCD503, poddane trawieniu tylko EcoRI lub tylko Pstl, miało strukturę liniową. Niniejsza analiza wykazała, że wstawka o długości 0,25 kb nie zawierała miejsc rozpoznawczych EcoRI ani Pstl. Mieszaninę, powstałą po procesie trawienia, poddano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym, po czym dokonano elektroelucji i strącenia fragmentu o długości 0,25 kb, jak to opisano powyżej. Ponadto, po około 1 pg każdej z oczyszczonych dwuniciowych form replikacyjnych (RF) DNA M13 mpl 8 i M13 mp 19 poddano podwój nemu trawieniu EcoRI i Pstl, defosColyljacji cielęcąeeiitową fosfatazą zasadową (CtAP) (uzyskaną z Promega Corp., Madison, stan WI) i na koniec ligacji z fragmentem DNA o długości 0,25 kb, jak to opisano uprzednio. Oczyszczone wektory klonowane RF M13 uzyskano z New England BioLabs. Powstałe po ligacji mieszaniny zastosowano do transfekcji kompetentnych komórek JM 109 E. coli. Dobrano pojedynczą białą łysinkę pochodzącą z transfekcji mp18, i pojedynczą łysinkę pochodzącą z transfekcji mpl 9, a następnie przeprowadzono hodowlę faga z wytworzeniem jednoniciowego DNA, jak to opisano w literaturze (Maniatis i wsp., 1989). Dokonano sekwencjonowania DNA poszczególnych jednoniciowych matryc DNA, stosując M13-swoisty-40 primer sekwencjonujący (New England BioLabs, nr katal. 1212), p⁵S] 5'-[alfa-tic] trójfosforan dezoksyadenozyny NEN-Dupont i zestaw do sekwencjonowania TaqTrack (Promega), stosując się do wskazówek producenta (Promega). Dane z sekwencjoncwania fragmentu genomowego S. avermitilis pCD503 przedstawiono na fig. 4.

Przykład Vtt. Klonowanie całego skupienia genów bkd S. avermitilis i tworzenie mapy chromosomowej

Około 5 pg oczyszczonego pCD503 poddano podwójnej restrykcji, stosując zarówno enzym restrykcyjny BamHI, jak i EcoRI; fragmenty DNA rozdzielono poprzez elektroforezę na

181 916

1,2% żelu agarozowym, po czym fragment DNA o długości około 0,25 kb, zawierający sekwencję swoistą dla genu E1-alfa bkd S. avermiiilis, regenerowano przez elektroelucję i wyznakowano przez translację typu nick w zasadzie tak, jak to opisano powyżej. Fragment DNA oznakowany [³²P] zastosowano następniejako sondę do przeglądania biblioteki kosmidów genomowych S. avermitilis. Szczegółowy opis tworzenia bibliotek genomowych można znaleźć w: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, autor: Maniatis i wsp., 1989. Pełny opis tworzenia biblioteki chromosomowej Streptomycetes przedstawiono w: „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, autor: Hopwood i wsp., 1985. Opis wektora kosmidowego można znaleźć w: „Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning”, autor: Denoya

C.D., Zgłoszenie Patentowe Stanów Zjednoczonych 08/048719, złożone 16 kwietnia 1993. Po przejrzeniu ponad 2200 rekombinacyjnych klonów biblioteki zidentyfikowano cztery klony. Te cztery hybrydyzujące klony (oznaczone jako klony E. coli CD518, CD519, CD520 i CD521) hodowano w pożywce LB, zawierającej ampicylinę jako czynnik selekcjonujący. Z poszczególnych hodowli wytworzono plazmidy, jak to opisano powyżej. Analiza metodą restrykcji i hybrydyzacji metodą Southern blot wykazała, że te cztery klony były spokrewnione, ponieważ zawierały identyczne regiony chromosomowe. Stosując następujące rutynowe sposoby uzyskano genomowąmapę restryk<^|yjn^ S. avermitilis, pokrywającą cały region chromosomowy, w tym sekwencję CD503. Mapę tę przedstawia fig. 3.

Przykład VIII. Wytwarzanie ciągów mutantów delecyjnych w celu ukierunkowanego sekwencjonowania DNA regionu chromosomowego S. avermitilis, zawierającego skupienie genów bkd

Stosując egzonukleazę III wytworzono ciągi mutantów delecyjnych, pozbawionych kolejno coraz większej liczby nukleotydów, poczynając od jednego lub od drugiego końca docelowego DNA bkd S. avermitilis, w zasadzie według sposobu opisanego przez Henikoff S. (1987, Methods Enzymol. 155: 156). W celu wytworzenia jednokierunkowych mutantów delecyjnych dokonano trawienia dwuniciowego DNA replikacyjnych form dNa, pochodzących z poszczególnych rekombinacyjnych bakteriofagów M13, stosując dwa enzymy restrykcyjne, przy czym miejsca cięcia obu tych enzymów restrykcyjnych znajdowały się pomiędzy jednym końcem docelowego DNA a miejscem wiążącym się z primerem. Enzym restrykcyjny, tnący bliżej sekwencji docelowych, wytwarzał koniec tępy, czyli wgłębiony koniec 3'; drugi enzym wytwarzał wystający koniec 3'. Egzonukleaza III katalizuje stopniowe usuwanie 5'-mononukleotydu z wgłębionych, czyli tępych końców 3'-hydroksylowych dwuniciowego DNA. Jednakże, wystające końce 3' są całkowicie oporne na działanie tego enzymu. Tak więc tylko jeden koniec uzyskanego liniowego DNA był podatny na działanie egzonukleazy III, zatem trawienie postępowało w jednym kierunku od miejsca cięcia ku docelowym sekwencjom DNA.

Poniżej tytułem przykładu opisano wytwarzanie ciągu delecji pCD565. Plazmid pCD565 stanowi pochodną RF M13 mp19, zawierającą fragment SaII o długości 1,15 kb, którego część stanowi otwarta ramka odczytu E1-alfa bkd S. avermitilis. Plazmid pCD565 oczyszczono przez odwirowanie równowagowe w gradientach chlorku cezowego i bromku etydyny, jak to opisał Maniatis i wsp., (1989). Egzonukleaza III zdolna jest do inicjacji trawienia z jednoniciowych „wgłębień” - („nicks”), tak więc istotne jest stosowanie mieszanin zawierających poniżej 10% relaksowanych cząsteczek kolistych. Około 10 pg plazmidu pCD565 (por. rozdział „Szczegółowy opis wynalazku”) poddano podwójnemu trawieniu, stosując enzymy restrykcyjne SacI i XbaI w temperaturze 37°C przez 4 godziny, następnie ekstrakcji fenolem-chloroformem i eterem i strąceniu etanolem, jak to opisano powyżej. Grudkę zawieszono ponownie w 60 pl buforu reakcyjnego egzonukleazy III (10 x bufor egzonukleazy III: 0,66 M Tris-HCl, pH 8,0, 66 mM chlorku magnezowego (MgC^). Roztwór DNA inkubowano następnie w temperaturze 37°C w obecności 300jednostek egzonukleazy III (Ambion Inc.) i w odstępach 30-sekundowych pobierano próbki o objętości 2,5 pl. Próbki inkubowano następnie z nukleazą S1, po czym z nich z kolei pobierano próbki, które analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Próbki zawierające fragmenty DNA o pożądanych rozmiarach łączono, dokonywano naprawy DNA, stosując fragmenty Klenow polimerazy I DNA, poddawano przez noc ligacji i transfekowano do kompe22

181 916 tentnych komórek JM 109 E. coli. Wielkość wstawek w regenerowanych klonach analizowano metodą restrykcji EcoRI/HindIII i elektroforezy na żelu agarozowym. Do sekwencjonowania dobrano pięć klonów: 565-D 19(o długości 1,1 kb), 565-D7 (o długości 0,88 kb), 565-D24 (o długości 0,77 kb), 565-D1 (o długości 0,51 kb) i 565-D 16 (o długości 0,36 kb). Z poszczególnych klonów wytworzono jednoniciowe DNA, które poddano sekwencjonowaniu, jak to opisano powyżej.

Przykład IX. Wytwarzanie plazmidów pCD670, pCD666, pCD736 i pCD685 w celu zastosowania do ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli

Dokonano ekspresji genów bkd S. avermitilis w E. coli, stosując podwójny system płazmidowy polimerazy RNA/promotora T7, w zasadzie według opisu S. Tabor (1990), w: Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York).

A. Wytwarzanie pCD670, zawierającego ORF E1-alfa bkd S. avermitilis

Do genu E1-alfa bkd S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne NdeI, zawierające kodon „start” ATG, stosując sposób oparty naPCR. Matrycę dlaPCR stanowił plazmid pCD528, pochodna pGEM-3Z, zawierająca wstawkę genomową S. avermitilis o długości 7 kb, w skład której wchodziła aminokońcowa połowa ORF E1 -alfa. W reakcji PCRjako primery zastosowano dwa ołigonukleotydy (por. fig. 6):

1. Lewy primer uniwersalny (wektorowy) 31-PCR-BP (5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTAACGCCA-3'), umiejscowiony w kierunku końca 3' od miejsca HindIII MCS pGEM-3Z (pozycja 91-114). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i dwa miejsca restrykcyjne (BamHI i PstI), dla ułatwienia klonowania produktów PCR.

2. Primer mutagenny 55-PCR (5'-AAGAGATCTCATAAT(GCGGTCATGGAGCAGCGG-3'). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i jedna cząsteczka guaniny oraz dwa miejsca restrykcyjne (BgIII i NdeI). Miejsce NdeI zachodzi na kodon inicjujący ATG otwartej ramki odczytu E1-alfa. Polimerazową reakcję łańcuchową przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Produkty reakcji analizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Amplifikowany za pomocą PCR fragment DNA o właściwych rozmiarach (o długości około 1,1 kb) poddano elektroelucji, trawieniu enzymami restrykcyjnymi NdeI i BamHI i subklonowaniu do linearyzowanego za pomocą NdeI/BamHI plazmidu pT7-7 dla wytworzenia plazmidu pCD663 w czasie ligacji i transformacji do komórek DH5-alfa E. coli. Około 1 pg plazmidu pCD663 (wytworzonego ze szczepu CD663 E. coli z zastosowaniem skróconego sposobu wytwarzania plazmidów) poddano linearyzacji za pomocąBamHI, defosforylacji i na koniec ligacji w obecności około 0,5 pg elektroeluowanego oczyszczonego fragmentu BamHI o długości 1,1 kb, izolowanego z trawienia za pomocąBamHI plazmidu pCD550, dla wytworzenia plazmidu pCD670. Prawidłową orientację fragmentu BamHI o długości 1,1 kb w tym ostatnim produkcie określono przez mapowanie miejsc SaII obecnych we wstawce. Na koniec dokonano włączenia plazmidu pCD670 do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2 (przy czym plazmid zawierał gen polimerazy RNA T7) (por. Tabor 1990). Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD676.

B. Wytwarzanie pCD666, zawierającego ORF E1-beta bkd S. avermitilis

Do genu E1-beta bkd S. avermitilis wprowadzono miejsce restrykcyjne NdeI, zawierające kodon „start” ATG, stosując sposób oparty na PCR. Matrycę dla PCR stanowił plazmid pCD574, pochodna pGEM-3Z, zawierająca wstawkę genomową S. avermitilis o długości 4,5 kb, w skład której wchodziła ORF E1-beta. W reakcji PCR jako primery zastosowano dwa Olgonukleotydy (por. fig. 6):

1. Lewy primer uniwersalny (wektorowy) 30-PCR-BP (5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGaCgTTGTAAAACGA-3'), umiejscowiony w kierunku końca 5' od miejsca EcoRI MCS pGEM-3Z (pozycja 2689-2712). Na końcu 5' tego primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i dwa miejsca restrykcyjne (BamHI i PstI), dla ułatwienia klonowania produktów PCR.

181 916

2. Primer mutagenny 56-PCR (5AAGAGATCTC ATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-')). Na końcu 5' tego- primera znajdują się dwie cząsteczki adeniny i jedna cząsteczka guaniny oraz dwa miejsca restrykcyjne (BgIII i NdeI). Miej sce NdeI zachodzi na kodon inicjujący ATG otwartej ramki odczytu E1 -beta. Polimerazową reakcję łańcuchową przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Produkty reakcji analizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Amplifikowany za pomocą PCR fragment DNA o właściwych rozmiarach (o długości około 1,9 kb) poddano elektroelucji, trawieniu enzymami restrykcyjnymi NdeI i EcoRI i subklonowaniu do linearyzowanego zapomocąNdeI/EcoRI plazmidu pT7-7 dla wytworzenia plazmidu pCD666 w czasie ligacji i transformacji do komórek DH5-alfa E. coli. Na koniec dokonano włączenia plazmidu pCD666 do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2 (przy czym plazmid zawierał gen polimerazy RNA T7) (por. Tabor 1990). Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD673.

C. Wytwarzanie pCD736, zawierającego ORF bkd E1-alfa i E1-beta S. avermitilis

Około 2 μg plazmidu pCD670 linearyzowano przez częściowe trawienie za pomocą BamHI. W celu uzyskania formy liniowej plazmidu pCD670 próbki mieszaniny poddawanej trawieniu BamHI pobierano w następujących punktach czasowych: po 13,5,10 i 20 minutach. Próbki przepuszczano przez 0,8% żel agarozowy. Formę liniową (o długości około 4,3 kb) regenerowano przez elektroelucję i poddawano defosforylacji z zastosowaniem CIAP (jak to opisano uprzednio). Następnie połowę defosforylowanej formy liniowej plazmidupCD670 poddano ligacji z fragmentem BamHI/BgIII o długości 0,8 kb, wyizolowanym z plazmidu pCD577. Mieszaninę ligacyjnązastosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5-alfa E. coli. Regenerowano dziesięć klonów i plazmidowe DNA, wytworzone sposobem skróconym, poddano analizie restrykcyjnej. Jeden klon, oznaczony jako szczep CD736, zawierał prawidłowo odtworzony plazmid pCD736. Na koniec plazmid pCD736 włączono do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2. Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transfromant, oznaczając go jako szczep CD737. Inny klon, oznaczony jako szczep CD705, zawierał plazmid pCD705, w którym znajdował się fragment BamHL/Bglll o długości 1,8 kb w nieprawidłowej orientacji. pCD705 zastosowano jako kontrolę ujemnąw doświadczeniach dotyczących ekspresji.

D. Wytwarzanie pCD685, zawierającego skupienie genów bkd S. avermitilis

Pozostałą połowę defosforylowanej postaci plazmidu pCD670 uzyskanego, jak to opisano powyżej, przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym BamHI, poddano ligacji z fragmentem BamHI o długości 7 kb, wyizolowanym z plazmidu pCD577. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5-alfa E. coli. Regenerowano wiele klonów; szesnaście z nich dobrano do dalszych analiz. Ekstrahowano plazmidowe DNA i poddanoje analizie restrykcyjnej. Jeden klon, oznaczonyjako szczep CD685, zawierał prawidłowo odtworzony plazmid (pCD685). Na koniec plazmid pCD685 włączono do szczepu C600 E. coli, zawierającego plazmid pGP1-2. Do dalszych doświadczeń dobrano jeden transformant, oznaczając go jako szczep CD687.

Przykład X. Ekspresja genów bkd S. avermitilis w E. coli z zastosowaniem podwójnego systemu plazmidowego T7

Pochodne E. coli C600 (pGP-1), zawierające różne produkty pT7-7 (szczepy CD676, CD673, CD737 i CD687), hodowano w 5 ml pożywki LB, zawierającej zarówno kanamycynę (60 (g/ml), jak i ampicylinę (60 μg/ml), przez noc w temperaturze 30°C. Hodowlę rozcieńczono następnie w stosunku 1 : 40 (0,25 : 10,00 ml) do hodowli (o wymiarach 25 x 150 mm), zawierających świeżą pożywkę LB/ampicylina/kanamycyna i hodowano z napowietrzaniem wstrząsowym w temperaturze 30°C do uzyskania zmierzonej gęstości optycznej (OD₅9₀) wynoszącej około 0,4. Poprzez podniesienie temperatury do 42°C przez 30 minut dokonano indukcji genu kodującego polimerazę RNA T7, co z kolei spowodowało indukcję genów pozostających pod kontrolą promotora T7, jak to opisał S. Tabor (1990). Następnie temperaturę obniżono do 37°C i komórki hodowano, wstrząsając, jeszcze przez 90 minut. Nieindukowane ho24

181 916 dowie kontrolne utrzymywano w temperaturze 30°C. Dokonano analizy białek, stosując elektroforezę na żelu poliakrylamidowym z użyciem soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), jak to opisał C.D.Denoya i wsp., 1986, J. Bacteriol. 168:1133-1141. Aktywność enzymatycznąpoddano analizie, jak to opisano w przykładzie XI.

Przykład XI. Oznaczanie aktywności BCKDH E1 S. avermitilis w nieoczyszczonych wyciągach szczepów E. coli

A. Wytworzenie lizatu komórek

Komórki (pochodzące z 8 ml hodowli) zebrano przez odwirowanie (5 minut przy 5000 obr./min. - 3000 x g - stosując rotor Sorvall SS-34, schłodzony do temperatury 4°C), po czym ponownie zawieszono je w 5 ml buforu „rozrywającego” (0,05 M buforu fosforanu potasowego, pH 7,0, zawierającego 3% Triton Χ-100,15% glicerolu, 3 mM ditiotreitu, 1 mg/ml inhibitora trypsyny z białka jaja indyczego, 5 mM EDTA i 0,04 mM TPP [pirofosforanu tiaminy]). Ponownie zawieszone komórki przenoszono do tłoczni typu French, gdzie komórki ulegały pękaniu po jednym przejściu przy 5000 x psi. Następnie, próbki o objętości po 1,5 ml produktu tłoczenia w tłoczni typu French przenoszono do rurki do mikroodwirowywania i klarowano przez 30-sekundowe odwirowanie przy 14000 obr./min. Do każdego testu enzymatycznego stosowano próbkę o objętości 100 pl z każdego supernatantu. Stężenie białka oznaczano, stosując test białkowy BioRad (BioRad Laboratories, Richmond, stan Kalifornia), oparty na sposobie wiązania barwnika, opisanym przez Bradforda (Bradford M., Anal. Biochem., 72: 248, 1976).

B. Test na kompleks składowej E1 dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) S. avermitilis

Aktywność BCKDH E1 oznaczono stosując zmodyfikowaną wersję uprzednio opisywanego testu radiochemicznego (Chuang, D.T., 1988, Methods Enzymol., 166: 146-154, i Hafher,

E. W. i wsp., 1991, J. Antibiotics 44: 349). Na dno szklanej fioliki scyntylacyjnej o pojemności 15 ml dodano: 0,148 ml 0,25 M bufora fosforanu potasowego o pH 6,5; 0,002 ml 0,1 M kwasu etylenodwuaminoczten^^ctowego (EDTA, sól dwusodowa); 0,004 ml 0,1M MgCl₂; 0,02 ml 3,7 mM pirofosforanu tiaminy (TPP); 0,02 ml 37 mMNaAsO,; 0,01 ml 37 mM 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu (sól sodowa, Sigma D-1878); 0,008 ml roztworu podstawowego alfa-[1-¹⁴C]ketoizokapronianu (wytworzonego jak to opisano poniżej); 0,058 ml wody i 0,1 ml sklarowanego bezkomórkowego wyciągu. Wylot fiolki natychmiast zatkano papierem typu Whatman 4CHR (nr katalogu Whatmana 3004614), który następnie impregnowano z użyciem Solvable (środek zwiększający rozpuszczalność tkanek i żelu, nabyty w firmie NEN-Dupont). Na fiolce umieszczono zatyczkę plastykową; zatyczkę i górną połowę fiolki oblano parafiną i poddano inkubacji, delikatnie wstrząsając, przez 2 godziny w temperaturze 30°C. Po zakończeniu inkubacji papier filtracyjny przeniesiono do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 7 ml, zawierającej 4 ml płynnej mieszaniny scyntylacyjnej „Ready Safe” (Beckman) dla oznaczenia radioaktywności. Roztwór podstawowy alfa-[1-1⁴C]ketoizokapronianu wytworzono, mieszając 5,6 mikrolitra 20 mM alfa-ketoizokapronianu (sól sodowa, Sigma K-0629), 50 mikrolitrów alfa-[1-¹⁴C]ketoizokapronianu (55 mCi/mmol, 50 pCi/ml, Amersham) i dostateczną ilość wody dla uzyskania końcowej objętości 1 ml. Swoistą aktywność składowej E1 dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu wyrażono w pikomolach dwutlenku węgla uwalnianego na minutę na miligram białka, jak to przedstawiono w poniższej Tabeli I.

181 916

Tabela I

Aktywność dehydrogenazy E1 alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu Streptomyces avermitilis w nieoczyszczonych wyciągach rekombinacyjnych komórek E. coli

Produkt	Plazmid	Szczep	Indukcja	Aktywność swoista El BCKDH12
Bez wstawki	pT7-7	CD677	+	0,9
E1-a	pCD670	CD676	+	0,6 0,8
E1-b	pCD666	CD673	+	0,5 0,7
E1-[a + b]	pCD736	CD737	+	2,0 13,7
E1-[a + b]3	pCD705	CD705	+	0,9 0,5
E1-[a + b]-E2-E3	pCD685	CD687	+	2,9 6,0

¹ Swoistąakywność składowej E1 dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu wyrażono w pikomolach dwutlenku węgla uwalnianego na minutę na miligram białka

Wyniki stanowią średnią z dwóch pomiarów

Produkt ten zawiera część C-końcową^twa^ej ramki odczytu EI -beta umiejscowioną w niewłaściwej orientacji i był stosowany jako kontrola ujemna

Opis specyfikacji sekwencji („SEQUENCE ID”)

SEQUENCE ID NR 1 przedstawia sekwencję DNA kodującą podjednostkę E1-alfa BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 403-1548.

SEQUENCE ID NR 2 przedstawia sekwencję DNA kodującą podjednostkę E1-beta BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4jako zasady 1622-2626.

SEQUENCE ID NR 3 przedstawia sekwencję DNA, rozpoczynającą otwartą ramkę odczytu, kodującą region aminokońcowy podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 4 jako zasady 2626-2727.

SEQUENCE ID NR 4 przedstawia sekwencję DNA, odpowiadającą zasadom 3-251 pCD539. Stanowi ona wewnętrzną część sekwencji genu kodującego podjednostkę E2 BCKDH S. avermitilis. Sekwencję tę przedstawiono również na fig. 5.

SEQUENCE ID NR 5 przedstawia 2728 par zasad fragmentu genomowego DNA S. avermitilis, przedstawionego na fig. 4, zawierającego otwarte ramki odczytu podjednostek E1-alfa, E1-beta i E2 (część) BCKDH S. avermitilis.

SEQUENCE ID NR 6 przedstawia sekwencję aminokwasową podjednostki Ei-alfa BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasowa jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 1.

SEQUENCE ID NR 7 przedstawia sekwencję aminokwasową podjednostki E1-beta BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasową jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 2.

SEQUENCE ID NR 8 przedstawia sekwencję aminokwasową części aminokońcowej podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis. Ta sekwencja aminokwasową jest kodowana przez sekwencję DNA przedstawioną w SEQUENCE ID NR 3.

SEQUENCE ID NR 9 przedstawia sekwencję aminokwasową kodowainąprzez sekwencję DNA (.odpowiadającą zasadom 3-251 pCD539 (SEQUENCE ID Nr 4). Ta sekwencja aminokwasową odpowiada wewnętrznemu fragmentowi peptydowemu podjednostki E2 BCKDH S. avermitilis.

181 916

Specyfikacja sekwencji (1) Informacja ogólna (i) ZGŁASZAJĄCY: (wszystkie wskazane kraje z wyjątkiem Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej) (A) NAZWA: Pfizer Inc.

(B) ULICA: 235 East 42nd St., 20th Floor (C) MIASTO: New York (D) STAN: Nowy Jork (E) KRAJ: Stany Zjednoczone A.P.

(F) KOD POCZTOWY: 100017 (ii) ZGŁASZAJĄCY: (wyłącznie dla Stanów Zjednoczonych Amery ki Północnej):

(A) CLAUDIO D. DENOYA (B) ULICA: 80 Spyglass Circle (C) MIASTO: Groton (D) STAN: Connecticut (E) KRAJ:Stany Zjednoczone A. P.

(F) KOD POCZTOWY: 06340 (iii) TYTUŁ WYNALAZKU: “Geny kodujące kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgaęzionym łańcuchu, pochodzące z drobnoustroju Streptomyces avermitilis (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Peter C. Richardson (B) ULICA: Pfizer Inc., 235 East 42nd St., 20th Floor (C) MIASTO: New York (D) STAN: Nowy Jork (E) KRAJ: Stany Zjednoczone A.i*.

(F) KOD POCZTOWY: 10017-5755 (v) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/100518 (B) DATA ZŁOZENIA: 30 lipca 1993 (C) KLASYFIKACJA:

(vi) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/100518 (B) DATA ZŁOZENIA: 30 lipca 1993 (vii) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:

(A) NAZWISKO: Sheyka, Robert F.

(B) NUMER LICENCJI: 31304 (C) NUMER REFERENCYJNY: PC8346 (viii) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (212) 573-1189 (B) TELEFAKS: (212) 573-1939 (C) TELEKS: (-) (ix) LICZBA SEKWENCJI: 9 (x) FORMA KOMPUTEROWA:

(A) TYP MEDIUM: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1,0, wersja 1,25

181 916 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) D-ŁCJGOSC: 1146 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 1

ATGACGGTCA	TGGAGCAGCG	GGGCCCTTAC	CGGCCCACAC	CCCCGCCCGC	CTGGCAGCCC	60
CGCACCGACC	CCCCGCCACT	GCTGCCCGAC	GCGCTGCCCC	ACCGCGTCCT	GGGCACCGAG	120
GCGGCCGCGG	AGGCCGACCC	GCTACTGCTC	CGCCGCCTGT	ACGCGGAGCT	GGTGCGCGGC	130
CGCCGCTACA	ACACGCAGGC	CACGGCTCTC	ACCAAGCAGG	GCCGGCTCGC	CGTCTACCCG	240
TCGAGCACGG	GCCAGGAGGC	CTGCGAGGTC	GCCGCCGCGC	TCGTGCTGGA	GGAGCGCGAC	300
TGGCTCTTCC	CCAGCTACCG	GGACACCCTC	GCCGCCGTCG	CCCGCGGCCT	CGATCCCGTC	360
CAGGCGCTCA	CCCTCCTGCG	CCGCGACTGG	CACACCGGGT	ACGACCCCCG	TGAGCACCGC	420
ATCGCGCCCC	TGTGCACCCC	TCTCGCGACC	CAGCTCCCGC	ACGCCGTCGG	CCTCGCGCAC	430
CCCGCCCGCC	TCAAGGGCGA	CGACGTGGTC	GCGCTCGCCC	TGGTCGGCGA	CGGCGCCACC	540
AGCGAGGGCG	ACTTCCACGA	GGCACTCAAC	TTCGCCGCCG	TCTGGCAGGC	GCCCGTCGTC	600
TTCCTCGTGC	AGAACAACGG	CTTCGCCATC	TCCGTCCCCC	TCGCCAAGCA	GACCGCCGCC	660
CCGTCGCTGG	CCCACAAGGC	CGTCGGCTAC	GGGATGCCGG	GCCGCCTGGT	CGACGGCAAC	720
GACGCGGCGG	CCGTGCACGA	GGTCCTCAGC	GACGCCGTGG	CCCACGCGCG	CGCGGGAGGG	780
GGGCCGACGC	TCGTGGAGGC	GGTGACCTAC	CGCATCGACG	CCCACACCAA	CGCCGACGAC	340
GCGACGCGCT	ACCGGGGGGA	CTCCGAGGTG	GACGCCTGGC	GCGCGCACGA	CCCGATCGCG	900
CTCCTGGAGC	ACGAGTTGAC	CGAACGCGGG	CTGCTCGACG	AGGACGGCAT	CCGGGCCGCC	960
CGCGAGGACG	CCGAGGCGAT	CGCCGCGGAC	CTGCGCGCAC	GCATGAACCA	GGATCCGGCC	1020
CTGGACCCCA	TGGACCTGTT	CGCCCATGTG	TATGCCGAGC	CCACCCCCCA	GCTGCGGGAG	1080
CAGGAACCCC	AGTTGCGGGC	CGAGCTGGCA	GCGGAGGCCG	ACGGGCCCCA	AGGAGTCGGC	1140
CGATGA						1146

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁDGOSC: 1005 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

181 916 (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 2

ATGACCACCG	TTGCCCTCAA	GCCGCCCACC	ATGGCCCAGG	CACTCACACG	CGCGTTGCGT	SO
GACGCCATGG	CCCCCGACCC	CCCCGTCCAC	GTCATGGGCG	AGGACGTCGG	CACGCTCGGC	120
GGGGTCTTCC	CGGTCACCGA	CGCGCTCGCC	AAGGAGTTCG	GCGAGGACCG	CTGCACGGAC	ISO
ACCCCCCTCG	CCGAGGCAGG	CATCCTCGGC	ACGGCCGTCG	GCATGGCGAT	GTACGGGCTG	240
CGGCCGGTCG	TCGAGATGCA	GTTCGACGCG	TTCGCGTACC	CCGCGTTCGA	GCAGCTCATC	300
AGCCATGTCG	CGCGGGATGC	GCAACGCACC	CGCGGGGCGA	TGCCGCTGCC	GATCACCATC	360
CGTGTCCCCT	ACGGCGGCGG	AATCGGCGGA	GTCGAACACC	ACAGCGACTC	CTCCGAGCCG	420
TACTACATGG	CGACTCCGGG	GCTCCATGTC	GTCACGCCCG	CCACGGTCGC	CGACGCGTAC	430
GGGCTGCTGC	GCGCCGCCAT	CGCCTCCGAC	GACCCGGTCG	TCTTCCTGGA	GCCCAAGCGG	5 40
CTGTACTGGT	CGAAGGACTC	CTGGAACCCG	GACGAGCCGG	GGACCGTTGA	ACCGATAGGC	600
CGCGCGGTGG	TGCGGCGCTC	GGGCCGGAGC	GCCACGCTCA	TCACGTACGG	GCCTTCCCTG	660
CCCGTCTGCC	TGGAGGCGGC	CGAGGCGGCC	CGGGCCGAGG	GCTGGGACCT	CGAAGTCGTC	720
GATCTGCGCT	CCCTGGTGCC	CTTCGACGAC	GAGACGGTTG	TGCGCGTCGG	TGCGCGGACC	730
GGACGCGCCG	TCGTCGTGCA	CGAGTCGGGT	GGTTACGGCG	GCCCGGGCGG	GGAGATCGCC	840
GCGGGCATCA	CCGAGCGCTG	CTTCCACCAT	CTGGAGGCCC	CGGTGCTGCG	CGTCGCCGGG	900
TTCGACATCC	CGTATCCGCC	GCCGATGCTG	GAGCGCCATC	ATCTGCCCGG	TGTCGACCGG	960
ATCCTGGACG	CGGTGCGGCG	GCTTCAGTGG	GAGGCGGGGA	. GCTGA		1005

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) D-ŁDGOSO: 102 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 3

ATGGCCCAGG TGCTCGAGTT CAAGCTCCCC GACCTCGGGG AGGGCCTGAC CGAGGCCGAG 60

ATCGTCCGCT GGCTGGTGCA GGTCGGCGAC GTCGTGGCGA TC 102 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁDGOSC: 249 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 4:

181 916

ATCTCCCTCA	TCGCGCTGCT	CGCCACGATC	TGCACCGCCG	CACTGGCCCG	CTTCCCCGAG	60
CTCAACTCCA	CCGTCGACAT	GGACGCCCCC	GAGGTCGTAC	CGCTCCACCA	GGTGCACCTG	120
GGCTTCGCCG	CGCAGACCGA	ACGGGGGCTC	GTCGTCCCGG	TCGTGCGGGA	CGCGCACGCG	130
CGGGACGCCG	AGTCGCTCAG	CGCCGAGTTC	GCGCGGCTGA	CCGAGGCCGC	CCGGACCGGC	240
ACCCTCACA						249

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁDGOSC: 2728 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 5

GTCGACGCGG GCTCCGAAAC CGCGGATCAC GCCGTCGTCG ATGAGCCGGT TGATTCGCGC 60

GTAGGCATTG GCACCCGACA CGTGGGCGCG CTCGGCCACG GACCGTATCG AGGCGCGGCC 120

GTCCGCCTGG AGCATCTGGA GGATGTCCTG ATCGATGGCG TCCAGCGGGC GGGCGGGCGG 130

CAGGGGTACC CCGGGCTCCG CTCCCTCGGC CATTTGTTCA GGTGCCATGT CCTCCGGCCT 240

CCTTACCATG GACGTAGTGC GTTCATTCCA GGCTGTGGAG AACCGTTTGT CCACAGCCTG 300

ACGGTGCCTG TAGCCAAAAT GTGCCGACGA CCGAACAATC GGTAGGTGAG GCGCCTCACA 360

CCCGTGGCGC GCCCAAAGCC GCTCCCACGA GGAGGTGCCG TCATGACGGT CATGGAGCAG 420

CGGGGCGCTT ACCGGCCCAC ACCGCCGCCC GCCTGGCAGC CCCGCACCGA CCCCGCGCCA 430

CTGCTGCCCG ACGCGCTGCC CCACCGCGTC CTGGGCACCG AGGCGGCCGC GGAGGCCGAC 540

CCGCTACTGC TGCGCCGCCT GTACGCGGAG CTGGTGCGCG GCCGCCGCTA CAACACGCAG 600

GCCACGGCTC TCACCAAGCA GGGCCGGCTC GCCGTCTACC CCTCGAGCAC GGGCCAGGAG 660

GCCTGCGAGG TCGCCGCCGC GCTCGTGCTG GAGGAGCGCG ACTGGCTCTT CCCCAGCTAC 720

CGGGACACCC TCGCCGCCGT CGCCCGCGGC CTCGATCCCG TCCAGGCCCT CACCCTCCTG 730

CGCGGCGACT GGCACACCGG GTACGACCCC CGTGAGCACC GCATCGCGCC CCTGTGCACC 340

CCTCTCGCGA CCCAGCTCCC GCACGCCGTC GGCCTCGCGC ACGCCGCCCG CCTCAAGGGC 900

GACGACGTGG TCGCGCTCGC CCTGGTCGGC GACGGCGGCA CCAGCGAGGG CGACTTCCAC 960

GAGGCACTGA ACTTCGCCGC CGTCTGGCAG GCGCCGGTCG TCTTCCTCGT GCAGAACAAC 1020

GGCTTCGCCA TCTCCGTCCC GCTCGCCAAG CAGACCGCCG CCCCGTCGCT GGCCCACAAG 1030

GCCGTCGGCT ACGGGATGCC GGGCCGCCTC GTCGACGGCA ACGACGCGGC GGCCGTGCAC 1140

GAGGTCCTCA CCGACGCCGT GGCCCACGCG CGCGCGGCAG GGGGGCCCAC GCTCGTGGAG 1200

GCGGTGACCT ACCGCATCGA CGCCCACACC AACGCCGACG ACGCGACGCG CTACCGGGGG 1260

181 916

GACTCCGAGG	TGGACGCCTG	GCGCGCGCAC	GACCCGATCG	CCCTCCTGGA	GCACGAGTTC	1320
ACCGAACGCG	GGCTGCTCGA	CGAGGACGGC	ATCCGGGCCG	CCCGCGAGGA	CGCCGAGGCG	1380
ATGGCCCCGG	ACCTGCGCGC	ACGCATGAAC	CACGATCCGG	CCCTGGACCC	CATGGACCTG	1440
TTCGCCCATG	TGTATGCCGA	GCCCACCCCC	CACCTGCGGG	AGCACGAACC	CCAGTTGCGG	1500
GCCGAGCTGG	CAGCGGACGC	CGACCGGCCC	CAAGGAGTCG	GCCGATCAAG	ACAGTTGACC	1560
ATCGGGCCCC	GAGAAGCGGG	CCGATGACCT	CCGTTGCCCT	TTGGCCGGAA	GGAGCCGGGC	1620
CATGACCACC	GTTGCCCTCA	AGCCGGCCAC	CATCGCGCAG	GCACTCACAC	GCGCGTTGCG	1680
TGACGCCATG	GCCGCCGACC	CCGCCGTCCA	CGTGATGGGC	GAGGACGTCG	GCACGCTCGG	1740
CGGGGTCTTC	CGGGTCACCG	ACGGCCTCGC	CAAGGAGTTC	GGCGAGGACC	GCTGCACGGA	1800
CACGCCGCTC	GCCGAGGCAG	GCATCCTCGG	CACGGCCGTC	GGCATGGCGA	TGTACGGGCT	1360
GCGGCCGGTC	GTCGAGATCC	AGTTCCACGC	GTTCGCGTAC	CCGGCGTTCG	AGCAGCTCAT	1920
CAGCCATGTC	GCGCGGGATG	CGCAACGCAC	CCGCGGGGCG	ATGCCGCTGC	CGATCACCAT	1980
CCGTGTCCCC	TACGGCGGCC	GAATCGGCCG	AGTCGAACAC	CACAGCCACT	CCTCCGAGGC	2040
GTACTACATG	GCGACTCCGG	GGCTCCATGT	CGTCACGCCC	GCCACGGTCG	CCGACGCGTA	2100
CGGGCTGCTG	CGCGCCGCCA	TCGCCTCCGA	CGACCCGGTC	GTCTTCCTGG	AGCCCAAGCG	2160
GCTGTACTGG	TCGAAGGACT	CCTGGAACCC	GGACGAGCCG	GGGACCGTTG	AACCCATAGG	2220
CCGCGCGGTG	GTGCGGCGCT	CGGGCCGGAG	CGCCACGCTC	ATCACGTACG	GGCCTTCCCT	2230
GCCCGTCTGC	CTGGAGGCGG	CCGAGGCGGC	CCGGGCCGAG	GGCTGGGACC	TCGAAGTCGT	2340
CGATCTGCGC	TCCCTGGTGC	CCTTCGACGA	CGAGACGGTT	GTGCGCGTCC	GTGCGCGGAC	2400
CGGACGCGCC	GTCGTCGTGC	ACGAGTCGGG	TGGTTACGGC	GGCCCGGGCG	GGGAGATCGC	2460
CGCGGGCATC	ACCGAGCGCT	GCTTCCACCA	TCTGGAGGCG	CCGGTGCTGC	GCGTCGCCGG	2520
GTTCGACATC	CCGTATCCCC	CCCCCATGCT	GGACCGCCAT	CATCTGCCCG	GTGTCGACCG	2580
GATCCTGGAC	GCGGTGGGGC	GGCTTCAGTG	GGAGGCGGGG	AGCTGATGGC	CCAGGTGCTC	2640
GAGTTCAAGC	TCCCCGACCT	CGGGGAGGGC	CTGACCGAGG	CCGAGATCGT	CCGCTGGCTG	2700
GTCCAGGTCG	GCGACGTCGT	GGCGATCG				2728

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 381 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 6:

Ket Thr Val Het Glu Gln Arę Gly Ala 1 5

Tyr Arg Pro Thr Pro Pro 10 15

Pro

181 916

Ala

Trp Gln

Pro 20

Arg

Thr Aso

Pro

Ala 25

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 30

Ala

Leu

Pro

His

Arg

Val

Leu

Gly

Thr

Clu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

A3O

Pro

Leu

3S

40

45

Leu

Leu

Arg

Arg

Leu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Gly

Arg

Arg

Tyr

Asn

SO

SS

60

Thr

GLn

Ala

Thr

Ala

Leu

Thr

Ly3

Gln

Gly

Arg

Leu

Ala

Val

Tyr

Pro

65

70

75

ao

Ser

Ser

Thr

Gly

Gln

Glu

Ala

Cy3

Glu

Val

Ala

Ala

Ala

Leu

Val

Leu

35

90

95

Glu

Giu

Arg

Asp

Tr?

Leu

Phe

Pro

Ser

Tyr

Arg

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

100

105

110

Val

Ala

Arg

Gly

Leu

Α3Ο

Pro

Val

Gln

Ala

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

115

120

125

Asp

Trp

His

Thr

Gly

Tyr

Aso

Pro

Arg

Glu

Hi3

Arg

Ile

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Cys

Thr

Pro

Leu

Ala

Thr

Gln

Leu

Pro

His

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

His

145

150

155

160

Ala

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Asp

Asp

Val

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

val

Gly

165

170

17S

Asp

Gly

Gly

Thr

Ser

Glu

Gly

Asp

Phe

His

Glu

Ala

Leu

Asn

Phe

Ala

iao

13S

190

Ala

Val

Trp

Gln

Ala

Pro

Val

Val

Phe

Leu

Val

Gln

Asn

Asn

Gly

Phe

195

200

205

Ala

Ile

Ser

Val

Pro

Leu

Ala

Lys

Gln

Thr

Ala

Ala

Pro

Ser

Leu

Ala

210

215

220

His

Lys

Ala

Val

Gly

Tvr

Gly

Met

Pro

Gly

Arg

Leu

Val

Asp

Gly

Asn

225

230

235

240

Asp

Ala

Ala

Ala

Val

Hl3

Glu

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Val

Ala

Hls

Ala

245

250

2S5

Arg

Ala

Gly

Gly

Gly

Pro

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Thr

Tyr

Arg

Ile

260

265

270

Asp

Ala

Hi3

Thr

Asn

Ala

Asp

Asp

Ala

Thr

Arg

Tyr

Arg

Gly

Asp

Ser

275

280

285

Glu

Val

Glu

Ala

Trp

Arg

Ala

His

Asp

Pro

Ile

Ala

Leu

£ eu

Glu

His

290

29 S.

300

Glu

Leu

Thr

Glu

Arg

Gly

Leu

Leu

Asp

Glu

Aso

Gly

Ile

Arg

Ala

Ala

305

310

315

320

Arg

Glu

Asp

Ala

Glu

Ala

Mec

Ala

Ala

Aso

Leu

Arg

Ala

Arg

Met

Asn

325

330

335

Gln

Asp

Pro

Ala

Leu

Asp

Pro

Met

Asp

Leu

Phe

Ala

Hls

Vai

Tyr

Ala

340

345

3S0

Glu Pro Thr Pro Gln Leu Arg Glu Gln Glu Ala Gln Leu Arg Ala Glu

181 916

355 360 ³⁶⁵

Leu Ala Ala Glu Ala Asd Gly Pro Gln Gly Val Gly Arg 370 ' 375 380 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) D-ŁUGOSC: 334 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd

(xi)

: OPIS

SEK'

WENCJI:

SEQ ID NO

7:

Het

Thr

Thr

Val

Ala

Leu

Ly3

Pro

Ala

Thr

Met

Ala

Gln

Ala

Leu

Thr

1

5

10

15

Arg

Ala

Leu

Arg

Asp

Ala

Met

Ala

Ala

Asp

Pro

Ala

Val

His

Val

Met

20

25

30

Gly

Glu

Asp

Val

Gly

Thr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Arg

Val

Thr

Asp

Gly

35

40

45

Leu

Ala

Lya

Glu

Phe

Gly

Glu

Asp

Arg

Cys

Thr

Asp

Thr

Pro

Leu

Ala

SO

55

60

Glu

Ala

Gly

Ile

Leu

Gly

Thr

Ala

Val

Gly

Met

Ala

Met

Tyr

Gly

Leu

65

70

75

30

Arg

Pro

Val

Val

Glu

Met

Gln

Phe

Asp

Ala

Phe

Ala

Tyr

Pro

Ala

Phe

85

90

95

Glu

Gln

Leu

Ile

Ser

His

Val

Ala

Arg

Asp

Ala

Gln

Arg

Thr

Arg

Gly

100

105

110

Ala

Met

Pro

Leu

Pro

Ile

Thr

Ile

Arg

Val

Pro

Tyr

Gly

Gly

Gly

Ile

115

120

125

Gly

Gly

Val

Glu

His

Hi3

Ser

Asp

Ser

Ser

Glu

Ala

Tyr

Tyr

Met

Ala

130

135

140

Thr

Pro

Gly

Leu

His

Val

Val

Thr

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Asp

Ala

Tyr

145

150

155

160

Gly

Leu

Leu

Arg

Ala

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

Asp

Pro

Val

Val

Phe

Leu

165

170

175

Glu

Pro

Lys

Arg

Leu

Tyr

Trp

Ser

Ly3

Asp

Ser

Tr?

Α3Π

Pro

Asp

Glu

180

185

190

Pro

Gly

Thr

Val

Glu

Pro

Ile

Gly

Arg

Ala

Vai

Val

Arg

Arg

Ser

Gly

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Thr

Leu

Ile

Thr

Tyr

Gly

Pro

Ser

Leu

Pro

Val

Cys

Leu

210

21S

220

Clu

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Arg

Ala

Glu

Gly

Tro

Asp

Leu

Glu

Val

Val

22S

230

235

240

Asp

Leu

Arg

Ser

Leu

Val

Pro

Phe

Asp

Aso

Glu

Thr

Val

Val

Arg

Val

245

250

255

181 916

Gly

Ala

Arg

Thr

Gly

Arg

Ala

Val

Val

Val

His

Glu

Ser

Gly

ciy

Tyr

260

265

270

Gly

Gly

Pro

Gly

Gly

Glu

Ile

Ala

Ala

Gly

Ile

Thr

Glu

Arg

Cys

Phe

275

2ao

28S

His

His

Leu

Glu

Ala

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Ala

Gly

Phe

Asp

Ile

Pro

290

295

300

Tyr

?ro

Pro

Pro

Het

Leu

Glu

Arg

His

.3

Leu

Pro

Gly

Val

Asp

Arg

305

310

315

320

Ile

Leu

Asp

Ala

Val

Gly

Arg

Leu

Gln

Trp

Glu

Ala

Gly

Ser

325 330 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi): OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 8

Met 1

Ala

Gln

Val

Leu 5

Glu Phe Lys

Leu

Pro Asp Leu Gly Glu Gly

Leu

10

15

Thr

Glu

Ala

Glu

Ile

Val

Arg

Trp

Leu

Val

Gln

Val

Gly

Aso

Val

Val

20

25

30

Ala Ile (2) INFORMACJA O SEQ ID NO 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 83 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) : OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 9

Ile 1

Ser

Leu

Ile

Ala 5

Leu

Leu

Ala

Arg

Ile 10

Cys

Thr

Ala

Ala

Leu 15

Ala

Arg

Phe

Pro

Glu

Leu

Asn

Ser

Thr

Val

Asp

Het

Asp

Ala

Arg

G lu

Val

20

25

30

Val

Arg

Leu

Asp

Gln

Val

His

Leu

Gly

Phe

Ala

Ala

Gin

Thr

G lu

Arg

35

40

45

Gly

Leu

Val

Val

Pro

Val

Val

Arg

Asp

Ala

His

Ala

Arg

Asp

Ala

Glu

50

55

60

Ser

Leu

Ser

Ala

Glu

Phe

Ala

Arg

Leu

Thr

Glu

Ala

Ala

Arg

Thr

Gly

65

70

75

30

Thr Leu Thr

181 916

FIG. 1A

GDGATSEGD O 5 ' -GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCĆGAGGGCGAC - 3 '

EcoRI

FIG. 1B

Ε Μ P D H L R 5'-GAGATGCCGGACCACCTGCGG-3 '

3'-CTCTACGGCCTGGTGGACGCCAGATCT-5' <]

Xbal

181 916

q o cn— cn c, — o. < χ

X I—I-I—I -I-I

V x o — o — o >- < o -> o- < -o — o >->->-Cu

< — <	o	— O
X-	X	cc	— aa
o—	O	o	-5
<—	< —		— <
X—	X	X	ι—i
cn	E1 —	E*	O
Cu	X.	E-	Q
—	<	cn	O
<	>	CU	CC
E- —	E-	O
a—	O-	o	-a
x—	X	<	ω
<	ω	i—<	cn
X	>	<	E-1
Cu-	CL-	a	-X
•		Cu	•

X > e-—e- —h

CN

u.

cn — cn — cn — cn

I-I -I-I-I-I-I-I <-<-<-<

Cłu -	Cl.	3
ο-	(X	O	-O
χ—	Z-	X·	— X
X—	Z-	Z .	— X
o—	σ	5	X
> —	—	z>	O
X		X	Cłu
Cłu -	Cl, -	X	-Cłu
>	M-	(-1	-I-I
>-	< -	>	I-I

Cu — — CL » Cu — Cu

< —	<	— <	o
σ			ω
2	X	>	X
>-	<	->	E-*
<-	O	u.	-<

<—<—<—< X-Cłu-Cłu-X

X —	X-	Ε-	-X
X-	1—1	-X	X
<-	ο-	-<	-ο
X-	χ	ε-	<

ZZ- > -X— X

Cu-Ciu-Ctu <

iQ—Q —Q —Q

ο —	— ο-	cn	-Ο
χ-	ο	-χ.	— X
cn-	-cn-	<	-cn
Ε--	-Ε--	-Ε-1
<-	Ο		— <

o—O — o — o

α—	α —α	X
Π3	U1	α	ω
cn	03	X	u-

181 916

FIG. 3

Chromosom

Β Ε

I_L kb

S Κ Κ Β B Bg S < > S

1_1_1_I_I I_I_L em

Subklony

B

PCD520 l pCD545 pCD574 pCD550 pCD559 pCD577

S B

I_I

S Bg

Β B

I_I

S B

I_I

Ela Elb E2

181 916

FIG. 4A

10	20	30	40	50	60	70
G i. CGACGCCu	GCTCCGAAAC	CGCCGATCAC	GCCGTCC-TCC	ATGAGCCGCT	TGATTCGCCC	GTAGGCATTG
30	90	100	110	120	130	140
C<. AC A c.~.	CCTGGCCCCG	CTCGGCCACG	GACCGTATCG	AGGCGCGGCC	GTCCGCCTGG	AGCATCTGGA
150	160	170	180	190	200	210
GGATGTCCTG	ATCGATGGCG	TCCAGCGGGC	GGGCGGGCGG	CAGGGGTACC	CCGGGCTCCG	CTCCCTCGGC
220	230	240	250	260	270	280
CATTTGTTCA	GGTGCCATGT	CCTCCGGCCT	CCTTACCATG	GACGTAGTGC	GTTCATTCCA	GGCTGTGGAG
290	300	310	320	330	340	350
AACCGTTTGT	CCACAGCCTG	ACGGTGCCTG	TAGCCAAAAT	GTGCCGACGA	CCGAACAATC	GGTAGGTGAG
360	370	380	390	400	411
GCCCCTCACA	CCCGTGGCGC	CCCCAAAGCC	GCTCCCACGA	GGAGGTGCCG	TC ATG ACG Μ T	GTC V
420	i 429 438	447	456	465

ATG CAG CAG CGG

GGC G

GCT A 483

TAC Y

CGG CCC ACA CCG CCG CCC GCC TGG CAG CCC CGC

Q 474

R

R

p 492

T

p

p 501

P

A

W 510

Q

p

R 519

ACC

GAC

CCC

GCG

CCA

CTG

CTG

CCC

GAC

CCG

CTG

CCC

CAC

CGC

GTC

CTG

GGC

ACC

T

D

?

A

0

L

L

0

D

A

L

p

H

R

V

L

C·

T

528

537

546

555

554

573

GAG

GCG

GCC

GCG

GAG GCC

GAC

CCG

CTA

CTG

CTG

CCC

CGC

CTG

TAC

GCG

GAG

CTG

E

A

A

A

E

A

D

0

L

L

L

R

R

r,

Y

A

L

532

591

600

509

618

627

GTG

CCC

GGC

CGC

CCC

TAC

AAC

ACG

CAG

GCC

ACG

GCT

CTC

ACC

AAG

CAG

GGC

CGG

V

3

G

3

R

Y

N

7

<3

λ

T

A

c

T

K

Q

V

a

181 916

FIG. 4B

636

545

554

653

572

631

CTC GCC

CTC

TAC

CCG

TĆG

AGC

ACG

GGC CAG

GAG

GCC

TGC

GAG GTC

GCC

GCC

GĆG

1 λ

V

Y

□

S

S

T

G Q

c

A

C

Ξ V

A

A

A

590

699

703

717

725

735

CTC GTG CTG GAG

GAG

CGC R 753

GAC D

TGG CTC TTC CCC AGC TAC CGG GAC ACC CTC GCC

b

V

b 744

Ł

W

L 762

F

0

s 771

Y

R

D 780

T

L

A 789

GCC

GTC

GCC

CGC

GGC

CTC

GAT

CCC

GTC

CAG

GCG

CTC

ACC

CTC

CTG

CGC

GGC

GAC

A

V

A

R

G

L

0

P

V

Q

A

L

T

L

L

R

G

D

798

807

816

825

834

843

TGG

CAC

ACC

GGG

TAC

GAC

CCC

CGT

GAG

CAC

CGC

ATC

GCG

CCC

CTG

TGC

ACC

CCT

W

H

T

G

Y

D

P

R

E

fi

R

T

A

P

L

C

T

P

852

861

870

879

888

897

CTC

GCG

ACC

CAG

CTC

CCG

CAC

GCC

GTC

GGC

CTC

GCG

CAC

GCC

GCC

CGC

CTC

AAG

L

A

T

Q

P

H

A

G

b

A

H

A

A

R

L

X

GGC GAC

906

915

924

933

942 ACC AGC

951 GAG GGC

GAC D 960

GTG V

GTC V

GTC V

GGC GAC

GGC GGC

GCG A 969

CTC L

GCC A

CTG L 978

G

D

G

D 937

G

G

T 996

s

E

G 1005

GAC

TTC

CAC GAG

GCA

CTG

AAC

TTC

GCC

GCC

GTC

TGG

CAG

GCG

CCG

GTC

GTC

TTC

D

F

H

E

A

L

N

F

A

A

V

W

Q

A

P

V

V

F

1014

1023

1032

1041

1050

1059

CTC

GTG

CAG

AAC

AAC

GGC

TTC

GCC

ATC

TCC

GTC

CCG

CTC

GCC

AAG

CAG

ACC

GCC

b

V

Q

N

N

G

c

A

T

S

V

□

b

A

K

Q

T

A

181 916

FIG. 4C

1068

1077

1085

1095

1104

1113

GCC

CCC TCC

CTC

GCC CAC

AAG

GCC

GTC

GGC

TAC

GGG

ATG

CCG

GGC

CGC

CTG GTC

? 5

L

A 4

K

A

V

G

V

G

M

0

G

R

L V

1122

1131

1140

1149

1158

1167

GAC

AAC

GAC

GCG GCG

GCC

GTG

CAC

GAG

GTC

CTC

AGC

GAC

GCC

GTG

GCC CAC

D

G N

0

A A

A

V

H

£

V

L

S

D

A

V

A H

1176

1185

1194

1203

1212

1221

GCG

CGC GCG

GGA

GGG GGG

CCG

ACG

CTC

GTG

GAG

GCG

GTG

ACC

TAC

CGC

ATC GAC

A

R A

G

G G

P

T

L

V

E

A

V

T

Y

R

i D

1230 1239 1248 1257 1266 1275

GCC CAC ACC AAC GCC GAC GAĆ GCG ACG ĆGĆ TAC ĆĆG GĆG GAĆ TCC GAĆ ĆTG GAĆ

A

Η T

N

A D

0

A T

a

Y R

G

D

S

£

V

Ξ

1284

1293

1302

1311

1320

1329

GCC

TGC CGC

GCG

CAC GAC

CCG

ATC GCC

CTC

CTG GAG

CAC

GAG

TTG

ACC

GAA

CGC

A

A

a D

P

1 A

L

L E

H

E

L

T

E

R

1333

1347

1356

1365

1374

1383

GGG

CTG CTC

GAC

GAG GAC

GGC

ATC CGG

GCC

GCC CGC

GAG

GAC

GCC

GAG

GCG

ATG

G

L L

D

E D

G

I R

A

A R

E

D

A

E

A

M

1392

1401

1410

1419

1428

1437

GCC

GCG GAC

CTG

CGC GCA

CGC

ATG AAC

ca)g

GAT cdG

GCC

CTG

GAC

CCC

ATG

GAC

A

A D

b

R A

R

Μ N

Q

D P

A

L

D

P

M

D

1446

1455

1454

1473

1482

1491

CTG TTC CCC CAT GTG TAT GCC GAG CCC ACC CCC CAG CTG CGG GAG CAG GAA GCC CFAHVYAEPT?QLREQEA

191 916

FIG. 4D

	1500	1509	1518	1527	1536	1545
CAC Q	TTG CGG GCC GAG CTG GCA 2. R A Ξ L A	GCG GAG GCC A E A	GAC GGG 0 G	CCC CAA GGA GTC GGC CGA P Q G V G R
	1558	1568	1578	1588	1598	1608
TGA	AuAGAGTTGA	CCATCGGGCC CCGAGAAGCG GGCCGATGAC	CTCCGTTGGC	CTTTGGCCGG
	1618	1627	1636	1645	1654	1663
AAGGAGCCGG GCG	ATG ACC ACC MTT	GTT GCC CTC V A L	AAG CCG GCC ACC ATG Κ P A T M	GCG CAG GCA A Q A
	1572	1681	1690	1699	1708	1717
CTC L	ACA CGC GCG TTG CGT GAC T R A l a 0	GCC ATG GCC A M A	GCC GAC A D	CCC GCC GTC P A V	CAC GTG ATG Η V M
	1726	1735	1744	1753	1762	1771

GGC GAG GAC GTC GGC ACG CTC GGC GGG GTC TTC CGG GTC ACC GAC GGG .CTC GCC

C· E D V	G T L	G G V	E R V	T D G	L A
1780	1789	1798	1807	1816	1825

AAG GAG TTC GGC

GAG Ł

GAC D 1843

CGC R

TGC ACG GAC ACG CCG CTC GCC GAG GCA GGC ATC

K

E

1834

G

C

T 1852

D

T

P 1861

L

A

E 1870

A

G

I 1879

CTC

GGC

ACG

GCC

GTC

GGC

ATG

GCG

ATG

TAC

GGG

CTG

CGG

CCG

GTC

GTC

GAG

ATG

L

G

T

S

V

G

M

A

M

Y

G

Ł

R

p

V

V

E

M '

1888

1897

1906

1915

1924

1933

CAG

TTC

GAC

GCG

TTC

GCG

TAC

CCG

GCG

TTC

GAG

CAG

CTC

ATC

AGC

CAT GTC

GCG

Q

E

0

A

c

A

Y

p

A

E

<2

L

I

S

H

V

A

181 916

FIG. 4E

1942

19S1

1960

1969

1973

1987

CGG

GAC

' GCG

CAA

CGC ACC

CGC

GGG GCG

ATG

CCG CTG

CCG

ATC ACC

ATC

CGT GTC

R

3

λ

Q

a τ

R

G A

M

? L

0

i T

I

R V

1995

2005

2014

2023

2032

2041

ccc

TAC

: GGC

GGC

GGA ATC

GGC

GGA GTC

GAA

CAC CAC

AGC

GAC TCC

TCC

GAG GCG

?

Y

G

G

G I

G

G V

E

Η H

S

0 S

s

E A

2050

2059

2068

2077

2086

2095

TAC

TAC

ATG

GCG

ACT CCG GGG

CTC CAT

GTC

GTC ACG

CCC

GCC ACG

GTC

GCC GAC

Y

Y

M

A

T P

G

L H

V

ν τ

p

A T

V

A D

2104

2113

2122

2131

2140

2149

GCG

TAC

GGG

CTG

CTG CGC

GCC

GCC ATC

GCC

TCC GAC

GAC

CCG GTC

GTC

TTC CTG

A

Y

G

L

L R

A

A 1

A

S D

D

P V

V

P L

2158

2167

2176

2185

2194

2203

GAG

ccc

AAG

CGG

CTG TAC

TGG

TCG AAG

GAC

TCC TGG

AAC

CCG GAC

GAG

CCG GGG

Ł

□

X

R

L Y

W

S X

D

S W

N

P D

E

? G

2212

2221

2230

2239

2248

2257

ACC

GTT

GAA

CCG

ATA GGC

CGC

GCG GTG

GTG

CGG CGC

TCG

GGC CGG

AGC

GCC ACG

T

V

E

P

I G

R

A V

V

R R

S

G R

S

A T

2255

2275

2284

2293

2302

2311

CTC ATC ACG TAC GGG CCT TCC CTG CCC GTC TGC CTG GAG GCG GCC GAG GCG GCC

L

I T

Y

G

p

S

L

p

V

c

L

E

A

A

E A

A

2320

2329

2338

2347

2356

2365

CGG

GCC GAG

GGC

TGG

CAC

CTC

GAA

GTC

CTC

GAT

CTG

GCG

TCC

CTG

GTG CCC

TTC

□

A Ξ

G

W

D

L

£

V

V

D

£

R

S

L

V ?

181 916

FIG. 4F

2374

2383

2392

2401

2410

2419

GAC

CAC

GAG

ACG

GTT

GTG

CGC

GTC

GGT

GCG

CGG

ACC GGA

CGC

GCC

GTC

GTC

' GTG

0

D

-

y

V

R

V

G

A

R

T

G

R

A

V

V

V

2428

2437

2446

2455

2464

2473

ĆAĆ

GAG

TCG

GGT

GGT

TAC

GGC

GGC

CCG GGC

GGG

GAG

ATC

GCC

GCG

GGC

ATC

' ACC

H

E

S

G

G

Y

G

G

p

G

G

E

I

A

A

G

I

T

2482

2491

2500

2509

2518

2527

GAG

CGC

TGC

TTC

CAC

CAT

CTG

GAG

GCG

CCG

GTG

CTG

CGC

GTC

GCC

GGG

TTC

GAC

E

R

C

F

H

H

L

E

A

P

V

L

R

y

A

G

F

D

2536

2545

2554

2563

2572

2581

ATC

CCG

TAT

CCG

CCG

CCG

ATG

CTG

GAG

CGC

CAT

CAT

CTG

CCC

GGT

GTC

GAC

I

p

Y

P

p

O

«

L

E

R

H

H

L

P

G

V

D

R

2590

2599

2608

2617

2628

a TC OTG

GAC

GCG

GTG

GGG

CGG

CTT

CAG

TGG

GAG

GCG

GGG

AGC

TG ATG GCC

CAG

I

L

D

A

V

G

R

L

0

W

£

A

G

S

' Μ i

Q

2637

2646

2655

2664

2673

2632

GTG

CTC

GAG

TTC

AAG

CTC

CCC

GAC

CTC

GGG

GAG

GGC

CTC

ACC

GAG

GCC

GAG

ATC

V

L

E

F

K

L

P

D

L

G

E

G

L

T

E

A

E

I

2691

2700

2709

2718

2727

GTC

CGC

TGG

CTG

GTG

CAG

GTC

GGC

GAC

GTC

GTG GCG

ATC

G

V

R

W

L

V

Q

V

G

D

V

V

A

I

181 916

FIG. 5

20 29 38 47

AG ATC ICC CTC ATC GCG CTG CTC GCC AGG ATC TCC ACC GCĆ GCA CTG GCC CGC

ISLIALLARICTAALAR

65 74 83 92 101

TTC CCC GAG CTC AAC TCC ACC GTC GAĆ ATC GAC GCC CGC GAG GTC GTA CGG CTC

FPELNSTVDMDAREVVRL

110 119 128 137 146 155

GAC CAG GTG CAC CTC GGC TTC GCC GCG CAG ACC GAA CGG GGG CTC CTC GTC CCG

DQVHLGFAAQTERGLVVP

164 173 182 191 200 209

GTC GTC CGG GAC GCG CAC GCG CGG GAC GCC GAG TCG ĆTC AGC GCC GAG TTC GCG

VVRDAHARDAESLSAEFA

218 227 236 245 ____________>

CGG CTG ACC GAG GCC GCC CGG ACC GGC ACC CTC ACA

RLTEAARTGTLT

181 916

FIG. 6A

Μ Τ V Μ E Q R

S55-PCR [> 5 ' -AAGAGATCTCATATGAĆGGTĆATGGAGCAGCGG-3 ' Balii Ndel

Μ Τ Τ V A L K #56- PCR [> 5 ’ -AAGAGATCTCĄTATGACĆaĆĆGTTGĆĆCTGAAG- 3 ’ Balii Ndel

FIG. 6B # 3 O - Β P - PCR 3’ - AGCAAAATGTTGCAGCACTGACCGACGTCCTAGGAA- 5 ' <]

Pstl BamHI

S31-BP-PCR 3’-ACCGCATTAGTACCAGTATCGACAGACGTCCTAGGAA-5'<]

Pstl BamHI

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny na drodze fermentacji Streptomyces avermitilis w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiedniej do wytwarzania takiej naturalnej awermektyny przez zwiększenie ekspresji genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfaketonokwasów, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm, w którym DNA zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie genów kodujących kompleks dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, zawierających segment DNA kodujący kompleks dehydrogenazy alfaketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub równoważną mu czynnościową część tego segmentu DNA obejmującą sekwencję DNA oznaczonąjako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmianę alleliczną takiej sekwencji, na drodze znanych manipulacji genetycznych w drobnoustroju Streptomyces avermitilis, poddaje się fermentacji ten mikroorganizm, w warunkach i w pożywce fermentacyjnej odpowiedniej dla wytwarzania takiej naturalnej awermektyny Streptomyces avermitilis.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA, który obejmuje ponadto region DNA, regulujący ekspresję tego kompleksu dehydrogenazy alfa-ketonokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA stanowiący DNA rekombinacyjne.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA dobrany z grupy, do której należy pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 i pCD 577, przy czym te segmenty DNA posiadają genomową mapę restrykcyjną taką, jak przedstawiono na fig. 3.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się segment DNA, zawierający region DNA regulujący transkrypcję lub translację sekwencji DNa oznaczonej jako SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się część sekwencji DNA zgodnej z SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, która to sekwencja jest zdolna do hybrydyzacji, z odpowiednio, SEQ. ID NO 1, SEQ. ID NO 2, SEQ. ID NO 3, SEQ. ID NO 4 lub SEQ. ID NO 5, lub odmiany allelicznej takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako sondę, lub do amplifikacji całości lub części takiej sekwencji, kiedy stosuje się go jako primer polimerazowej reakcji łańcuchowej.