CZ26096A3 - Isolated dna segment, recombinant dna, plasmid, host cell, genes and process for preparing natural or novel avermectin - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových sekvencí DNA, které kódují komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy organismu spadajícího do rodu Streptomyces a nových polypeptidů produkovaných expresí těchto sekvencí. Dále se vynález týká nových způsobů zvyšování produkce přírodního avermektinu a způsobu výroby nových avermektinů fermentací.

Dosavadní stav techniky

Mikroorganismy produkují četné farmaceutické produkty. Z těchto mikroorganismů byla podstatná pozornost zaměřena na příslušníky rodu Streptomyces. Tato skupina gram-pozitivních zemních bakterií poskytla až dosud více než 90 % terapeuticky užitečných antibiotik. Streptomycetes jsou v ohnisku intenzivního výzkumu využívajícího technik klonování rekombinantní DNA za účelem izolace antibiotických biosyntetických genů, vytvoření nových derivátů nebo hybridních sloučenin, izolace regulačních genů a zkoumání regulačních mechanismů podílejících se jak na primárním, tak na sekundárním metabolismu.

Streptomyces avermitilis produkuje osm rozdílných, ale příbuzných antiparazitických polyketidových sloučenin, které jsou označovány názvem avermektiny. Avermektinový komplex produkovaný S. avermitilis obsahuje čtyři hlavní složky: Ala, A2a, B2a a B2a a čtyři vedlejší složky: Alb,

A2b, Blb a B2b. Struktura těchto různých složek je znázorněna dále.

CHg'

Avermektin	Bl
Ala	sek-butvl
Álb	isopropy!
A2a	sek-butvl
A2b	Isopropy!
Bia	sek-butvl
B1b	Isopropy!
B2a	sek-butvl
. B2b	isopropy!

B?	X-Y
Me	CH=CH
Me	CH=CH
Me	CH2-CH(OH)
Me	CH2-CH(OH)
H	CH=CH
H	CH=CH
H	CH2-CH(0H)
H	CH2-CH(OH)

Polyketidová struktura avermektinu je odvozena od sedmi acetátových molekul, pěti propionátových molekul a jedné molekuly α-rozvětvené mastné kyseliny, kterou je bud S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo isomáselná kyselina. Označení A se vztahuje k avermektinu, v němž je 5-sub3 stituentem methoxyskupina a označení B se vztahuje k avermektinu, v němž je 5-substituentem hydroxyskupina. Označení 1 se vztahuje k avermektinům, v nichž je dvojná vazba přítomna v poloze 22-23 a označení 2 k avermektinům, obsahujícím v poloze 22 vodík a v poloze 23 hydroxyskupinu. Konečně v poloze C-25 jsou možné dva substituenty: v avermektinech ze série a je přítomna sek.butylskupina (odvozená od L-isoleucinu) a v avermektinech ze série b je přítomna isopropylskupina (odvozená od L-valinu). Přehled viz Fisher Μ. H. a Mrozik Η. , 1984, Macrolide Antibiotics, Academie Press, kapitola 14.

Pod označením přírodní avermektiny se rozumějí avermektiny produkované S. avermitilis, v nichž je substituentem v poloze 25, jak již bylo uvedeno, bud isopropylskupina nebo sek.butylskupina. Avermektiny, které v poloze 25 obsahují jinou skupinu než isopropylskupinu nebo sek.butylskupinu, jsou v tomto popisu označovány názvem nové nebo nepřirozené avermektiny.

Jedna metabolická dráha vedoucí k těmto a-rozvětveným mastným kyselinám ve formě CoA zahrnuje reakci s rozvětvená aminokyselina transaminasou, po níž se provede reakce s rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasou. (Alternativně mohou vzniknout rozvětvený alifatický acyl-CoA-deriváty novou syntézou z rozvětvených α-ketokyselin.) Tyto metabolické dráhy jsou znázorněny dále.

CH₃CHCH(NH₂)COOH) ch₃ valin

CH₃CH₂CHCH (NH₂) cooh I ch₃ isoleucin rozvětvená aminokyselina transaminasa transaminasa

CH₃CHCOCOOH

CH₃CH₂CHCOCOOH ch₃

2-oxoisovalerová kyselina

CH₃

2-oxo-3-methylvalerová kyselina nová syntéza komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy nová syntéza

CH₃CHCO.SCoA I

CH₃ isobutyryl-CoA

CH₃CH₂CHCO.SCoA

I

CH₃

2-methylbutyryl-CoA degradační dráha (propionyl-CoA, methylmalonyl-CoA)

degradační dráha (acetyl-OoA, propionyl-CoA, methylmalonyl-CoA)

Biosyntéza avermektinu \ [

CHCO.SCoA /

R₂ t

Ri \

CHCOOH /

R₂ exogenní rozvětvená mastná kyselina

Nedávno byl izolován mutant S. averraitilis,který nevykazuje žádou detegovatelnou aktivitu rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy (BCKDH) v posledně uvedeném enzymu (Hafner et al, 1988, Evropská patentová přihláška číslo podání 88300353.5 s publikačním číslem 0284176). Tento mutant byl izolován po standardní chemické mutagenesi kmene S. avermitilis ATCC 31 272 za použití screeningu na nepřítomnost produkce ¹⁴CO₂ z ¹⁴C-1 značené 2-oxoisokapronové kyseliny (analog leucinu), jako substrátu. Tento mutant není schopen syntetizovat přírodní avermektiny, pokud se k médiu, v němž je fermentován, nepřidá α-rozvětvená mastná kyselina nebo její prekursor nesoucí isopropylovou nebo sek.butylovou skupinu (v S-formě). Tento mutant je dále schopen produkovat nové či nepřirozené avermektiny při fermentaci za vodných aerobních podmínek v živné půdě obsahující příslušnou alternativní karboxylovou kyselinu, jako cyklohexankarboxylovou kyselinu (CHC) nebo její prekursor.

Klonování BCKDH z S. avermitilis je vysoce žádoucí. Manipulace těchto genů pomocí technik s rekombinantní DNA by měla umožnit produkci přírodních a nových avermektinů. U některých kmenů by bylo možno očekávat zvýšení titru přírodních avermektinů na základě zvýšení počtu kopií genů BCKDH. Kromě toho, vytvoření ireveresibilně blokovaného kmene bkd, vykazujícího permanentně vypuštěnou nebo modifikovanou aktivitu BCKDH prostřednictvím nahrazení genu, by představovalo zlepšenou alternativu k běžnému mutantu bkd, který byl získán, jak je uvedeno výše, chemickou mutagenesi.

Multienzymové komplexy α-ketokyselina dehydrogenasy, tj. komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasa (BCKDH), komplex pyruvát dehydrogenasa (PDH) a komplex aketoglutarát dehydrogenasa (KGDH), katalyzují oxidační dekarboxylace α-ketokyselin s rozvětveným řetězcem, pyruvátu a α-ketoglutarátu, které jsou spojeny s uvolňováním oxidu uhličitého a tvorbou odpovídajících acyl-CoA a NADH (Perham, R. Ν., 1991, Biochemistry 30: 8501 až 8512). Každý z těchto komplexů sestává ze tří různých katalytických enzymů: dekarboxylasy (El), dihydrolipoamid acyltransferasy transacylasy (E2) a dihydrolipoamid dehydrogenasy (E3).

Rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasa (BCKDH) je multienzymovým komplexem, který se skládá ze tří funkčních složek: dekarboxylasy (El), transacylasy (E2) a lipoamid dehydrogenasy (E3). Purifikovaňé komplexy z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa a Bacillus subtilis se skládájí ze čtyř polypeptidů. Také purifikovaňé savčí komplexy se skládají ze čtyř polypeptidů, Ela, Εΐβ, E2 a E3. Komplex α-ketokyselina dehydrogenasy byl izolován z Bacillus subtilis vykazujícího jak pyruvát, tak rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasovou aktivitu. Tento komplex s dvojí funkcí oxiduje pyruvát a poskytuje mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem pro membránové fosfolipidy.

Klonování prokaryontních rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasových genů bylo oznámeno v případě Pseudomonas a Bacillus, ale nikoliv v případě Streptomyces. Zjistilo se, že v těchto systémech vytvářejí geny kódující BCKDH shluk v operonu. Geny komplexu BCKDH Pseudomonas putida byly klonovány a byla stanovena nukleotidová sekvence této oblasti (Sykes et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 1619 až 1625 a Burns et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165 až 169 a 176: 311 až 317). Molekulová hmotnost Ela je 45 289, Εΐβ 37 138, E2 45 134 a E3 48 164. Tyto čtyři geny jsou spojeny do shluku o sekvenci Ela, Εΐβ, E2 a E3. Analýza Northern blot ukazuje, že exprese těchto čtyř genů probíhá z jediné mRNA a že tyto geny tvoří operon. Bezprostředně před počátkem Ela kódující oblasti je zde přítomen typický prokaryontní konvenční (consensus) promotor, který umožňuje konstitutivní expresi genů Pseudomonas bkd. Iniciátorový

Ί kodon pro Εΐβ kódující oblast je umístěn jen 40 nukleotidů za koncem otevřeného čtecího rámce (ORF) Ela. Naproti tomu mezi ORF Εΐβ a ORF E2 neexistuje žádný intergenový prostor, poněvadž stop kodon ORF Εΐβ představuje triplet bezprostředně předcházející iniciátorový kodon ORF E2. Intergenový prostor mezi ORF E2 a ORF E3 je redukován pouze na dva nukleotidy. Geny Pseudomonas bkd jsou tedy těsně spojeny. Podobně byl klonován operon kódující duální komplex Bacillus subtilis BCKDH/PDH (Hemila et al., 1990, J. Bacteriol., 172: 5052 až 5063). Tento operon obsahuje čtyři otevřené čtecí rámce kódující čtyři proteiny o velikosti 42, 36, 48 a 50 kilodalton (kDa), u nichž byla prokázána vysoká homologie s podjednotkami Ela, Εΐβ, E2 a E3 shluku Pseudomonas bkd. Nedávno byly také klonovány a sekvenovány geny kódující α a β podjednotky složky El duálního multienzymového komplexu BCKDH/PDH z Bacillus stearothermophilus (odhadovaná molekulová hmotnost α podjednotky je přibližně 41 000 a β podjednotky přibližně 35 000) (Hawkins et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337 až 346).

Dále byla také publikovány sekvence četných eukaryontních podjenotek Ela a β BCKDH (humánního, hovězího a krysího původu). Nedávno bylo počítačovou analýzou provedeno srovnání všech publikovaných sekvencí známých pro Ela a Εΐβ složky komplexů PDH a BCKDH z několika druhů (Wexler et al. 1991, FEBS Letters, 282: 209 až 213). Zjistila se zajímavá skutečnost, že několik identifikovaných oblastí α a β podjednotek má vysoce konzervovaný charakter nejen ve všech až dosud popsaných PDH, nýbrž i v jak prokaryontních, tak eukaryontních komplexech BCKDH.

V tomto textu se popisuje klonování rozvětvená α ketokyselina dehydrogenasových genů ze Streptomyces avermitilis. Tyto nové geny byly klonovány za použití kombinace dvou technik molekulární genetiky, tj. řetězové reakce ka8 talýzóvané DNA polymerasou (PCR) a zkoušení homologie próbami (zkušebními látkami), tj. próbováním homologie (homology probing). Próbování homologie zahrnuje screening cDNA nebo genomových knihoven pomocí radioaktivně značených syntetických oligonukleotidových prób odpovídajících aminokyselinovým sekvencím proteinu. Tato technika má však svá omezení, z nichž jedním je dost přísné omezení, pokud se týče degenerace oligonukleotidu, kterého lze použít. Screeningová hybridizace se kromě toho provádí za podmínek nízké stringence, takže počet falešných pozitivních výsledků je často vysoký. Pro překonání některých z těchto omezení hybridizace oligonukleotidu bylo nedávno vyvinuto variantní próbování homologie, které zahrnuje řetězovou reakci s DNA polymerasou (PCR) a které umožňuje použít jako prób vysoce degenerovaných nukleotidů. Tato metoda vyžaduje pouze znalost aminokyselinové sekvence dvou krátkých oblastí (přibližně v délce 7 až 10 aminokyselin) v kódovaném proteinu. Jako primerů se při této reakci používá dvou oligonukleotidů odpovídajících těmto peptidovým sekvencím. Každého primeru se může použít ve formě směsi úplně degenerovaných oligonukleotidu obsahující všechny možné kodonové kombinace, které by mohly kódovat známé aminokyselinové sekvence. Jako templátu pro amplifikaci se může použít kteréhokoliv z několika zdrojů DNA, včetně genomové DNA a superhelixových forem plasmidových knihoven. Několik zpráv, které byly nedávno publikovány v literatuře, ukazuje užitečnost kombinace řetězové reakce katalyzované polymerasou s próbováním homologie pro identifikaci genu z několika druhů.

Technické termíny, kterých se používá v tomto popisu, jsou dobře známy odborníkům v oboru molekulární genetiky. Definice těchto termínů je možno nalézt v mnoha učebnicích a příručkách, které se věnují molekulární biologii, jako je Genes, II. vydání, dr. Benjamin Lewin, 1985,

John Wiley & Sons, Inc. New York, USA. Definice termínů, kterých se v tomto popisu často používá, jsou uvedeny dále.

Pod označením antibiotikum se rozumí chemické činidlo inhibující růst bakteriálních buněk. Antibiotik se používá pro selekci rekombinantních bakteriálních buněk.

Pod označením gen resistence vůči antibiotiku se rozumí sekvence DNA, která po zavedení do hostitelské buňky, jež je přirozeně sensitivní vůči určitému antibiotiku, uděluje buňce resistenci vůči tomuto antibiotiku. Tento gen bývá také označován názvem antibiotický markér.

Pod označením bakteriofágy se rozumějí viry infikující bakterie.

Pod označením cRNA se rozumí jednořetězcová RNA, která je komplementární vůči DNA a je z ní syntetizována transkripcí in vitro.

Pod označením chromosom se rozumí oddělená jednotka genomu nesoucí mnoho genů.

Pod označením klon se rozumí velký počet buněk nebo molekul, které jsou identické s jedním předkem.

Pod pojmem klonovací vektor se rozumí jakýkoliv plasmid, do kterého je možno vložit cizí DNA, jež má být klonována. Klonovací vektor vnáší při transformaci cizí DNA do hostitelské bakteriální buňky.

Pod označením CoA se rozumí koenzym A.

Pod označením kohesní (lepivá) koncová sekvence (Cos) se rozumí sekvence DNA pocházející z bakteriofágu lambda a umožňující sbalování in vitro.

Pod označením kosmid se rozumí plasmid, do něhož byla vložena bakteriofágová lambda cos místa. V důsledku toho může dojít ke sbalení plasmidové DNA (nesoucí cizí inserty DNA) in vitro ve fágovém povlaku.

Pod označením Dalton se rozumí jednotka hmotnosti, které se obvykle používá ve spojení s rozměry molekul. Tato jednotka odpovídá hmotnosti jednoho atomu vodíku.

Pod označením ligace DNA” se rozumí tvorba chemické vazby spojující dva fragmenty DNA.

Pod označením eukaryontní buňky” se rozumějí buňky vyšších organismů, které obsahují jádro obklopené membránou.

Pod označením shluk genů (gene cluster) se rozumí skupina genů, které se v chromosomu nacházejí ve fyzické blízkosti.

Pod označením genom se rozumí celý soubor chromosomů, tj. celý soubor všech genů jednotlivce.

Pod označením hybridizace nebo hybridizace kolonií se rozumí technika, které se používá pro identifikaci bakteriálních kolonií nesoucích chimérické vektory, jejichž vložená DNA se podobá určité konkrétní sekvenci.

Pod zkratkou kb se rozumí tisíc bázových párů DNA nebo RNA.

Pod označením NADH se rozumí redukovaný nikotinamid-adeninový dinukleotid.

Pod označením linker se rozumí krátký syntetický duplexní oligodeoxynukleotid obsahující cílové místo pro jeden nebo více restrikčních enzymů. Zavádí se do vektoru pro vytvoření nového polylinkeru nebo několikanásobného klonovacího místa (MCS).

Pod označením nukleotid se rozumí stavební kámen, či monomerní jednotka, nukleových kyselin.

Pod označením oligonukleotid se rozumí krátký řetězec nukleotidů.

Pod označením operon se rozumí úplná jednotka exprese a regulace bakteriálního genu zahrnující strukturní geny, regulátorové geny a kontrolní prvky v DNA rozpoznatelné produktem nebo produkty regulátorového genu.

Pod označením plasmid se rozumí autonomní extrachromosomální kružnicová DNA, která se sama replikuje.

Pod označením počet plasmidových kopií se rozumí počet plasmidových molekul udržovaných v bakterii pro každý hostitelský chromosom.

Pod označením primer se rozumí krátká sekvence DNA nebo RNA, která vytvoří pár s jedním řetězcem DNA a dodá volný 3'-OH konec, na němž může DNA polymerasa zahájit syntézu deoxyribonukleotidového řetězce.

Pod označením prokaryontní buňka se rozumí malá, poměrně jednoduchá buňka. Většina mikroorganismů zahrnuje tyto buňky.

Pod označením promotor se rozumí oblast DNA, která je zodpovědná za iniciaci nebo transkripci.

Pod označením restrikční enzym se rozumí enzym, který je schopen rozpoznat a rozštěpit specifickou krátkou sekvenci DNA.

Pod označením sekvence rozpoznávání a restrikce se rozumí sekvence DNA, která je specificky rozpoznána určitým restrikčním enzymem. Rovněž se označuje názvem cílové místo.

Pod označením vektor shuttle se rozumí bifunkční klonovací vektor, který je schopen se replikovat v jednom nebo více alternativních hostitelích (například E. coli a Streptomyces).

Pod označením Southern Blotting se rozumí postup spočívající v přenesení denaturované DNA z agarosového gelu na nitrocelulosový filtr, kde může být hybridizována s komplementární nukleokyselinovou próbou.

Pod označením subklonování se rozumí přenášení klonovaných fragmentů DNA z jednoho typu vektoru do jiného, například z rekombinantního kosmidu do plasmidú. Nový rekombinantní plasmid se potom tranformuje do vhodné hostitelské buňky za vzniku subklonového kmene.

Pod označením transkripce se rozumí syntéza RNA z templátové DNA.

Pod označením transformace bakteriálních buněk se rozumí získání nových genetických markérů zavedením přídavné DNA.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaný segment DNA kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy z organismu, který náleží do rodu Streptomyces.

Předmětem vynálezu je dále také izolovaný segment DNA popsaný výše, který dále obsahuje oblast DNA regulující expresi komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.

Předmětem vynálezu je dále také izolovaný segment DNA, který kóduje komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy ze Streptomyces avermitilis.

Dále je předmětem vynálezu také segment DNA zahrnující sekvenci DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 (víz dále) nebo allelové obměně takové sekvence. Vynález zahrnuje též segment DNA, který je podmnožinou výše uvedeného segmentu DNA a je mu funkčně ekvivalentní.

Dále je předmětem vynálezu také a) rekombinantní DNA zahrnující sekvenci DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelové variaci této sekvence; b) plamid obsahující takovou rekombinantní DNA a c) hostitelská buňka, do které byla taková rekombinantní DNA zavedena.

Předmětem vynálezu jsou dále geny pro komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy obsažené v segmentu DNA zvoleném ze souboru zahrnujícího pCD528, pCD545, pCD574, pCD550, pCD559 a pCD577 (definice jsou uvedeny dále).

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby přírodního avermektinu, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis se zvýšeným počtem kopií genů kódujících komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby přírodního avermektinu, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla zvýšena exprese genů kódujících komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy manipulací nebo nahrazením genů zodpovědných za regulaci této exprese.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby nového avermektinu, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla snížena nebo odstraněna exprese komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy, například manipulací, jako delecí, inaktivaci nebo nahrazením genů zodpovědných za tuto expresi.

Předmětem vynálezu je dále segment DNA obsahující sekvenci DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelové variaci této sekvence.

Předmětem vynálezu je dále segment DNA obsahující sekvenci DNA která je podmnožinou sekvence DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo

SEQ ID NO: 5 nebo allelové variaci této sekvence a která je schopna se hybridizovat s příslušnou sekvencí SEQ ID NO: 1,

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelovou variací této sekvence, pokud se jí použije jako próby, nebo která je schopna amplifikovat celou tuto sekvenci nebo její část, pokud se jí použije jako primeru při řetězové reakci působením polymerasy.

Předmětem vynálezu je dále v podstatě purifikovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 9.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna nukleotidová sekvence primerů pro řetězovou reakci katalyzovanou polymerasou (PCR) použitých pro klonování fragmentu genu S. avermitilis El-a BCKDH. Dedukovaná aminokyselinová sekvence kódovaná každým oligodeoxynukleotidem je znázorněna nad odpovídající sekvencí DNA. Šipky ukazují směs amplifikace. Na obr. IA je znázorněn pravosměrný primer a na obr. 1B levosměrný primer.

Na obr. 2 je uvedeno porovnání sekvencí rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy. Do vzájemného zákrytu jsou zde vyrovnány dedukované aminokyselinové sekvence PCR-klonovaného genomového fragmentu CD503 pro Streptomyces avermitilis (Sa), Bacillus stearothermophilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp) a Homo sapiens (Hs). Vertikální značky označují totožnost aminokyselin. Umístění sekvencí odpovídajících pravosmérnému a levosměrnému PCR primeru použitému pro klonování je označeno nahoře nalevo a napravo.

Na obr. 3 je znázorněna genomová restrikční mapa, umístění genového shluku Streptomyces avermitilis bkd a subklony pro tento shluk. Černé obdélníčky pod mapou označují umístění a orientaci počátečního ΕΙ-α-specifického genomového fragmentu CD503 z S. avermitilis klonovaného za použití PCR. Jsou zde označeny genomové subklony (deriváty pGEM-3Z). Také je zde uvedeno umístění a organizace stru16 kturních genů bkd kódujících podjednotky El-α (Ela), El-β (Elb) a E2 BCKDH. Polarita identifikovaných otevřených čtecích rámců (označených obdélníčky) je zleva doprava. Používá se těchto zkratek: B = BamHI, E = EcoRI, K = KpnI,

Bg = BglII a S = SphI.

Na obr. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E a 4F jsou uvedeny nukleotidové sekvence a dedukované translační produkty 2 728bp genomového DNA fragmentu z S. avermitilis obsahující otevřené čtecí rámce (ORF) El-a, El-β a E2 (zčásti) bkd. El-α ORF leží od polohy 403 do polohy 1548 této sekvence, El-β ORF leží od polohy 1622 do polohy 2 626 a E2 ORF začíná v poloze 2 626. Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence. Stop kodony jsou označeny hvězdičkou. Pravděpodobné Shine-Dalgarnovy ribosomální vazebné sekvence jsou podtrženy. Sekvence rozpoznávané a štěpené restrikčním enzymem BamHI jsou orámovány.

Na obr. 5 je uvedena nukleotidové sekvence a dedukované translační produkty 0,8kb BglII-Sphl genomového DNA fragmentu z S. avermitilis (pCD539) obsahujícího část E2 bkd ORF. 251 bp bylo podrobeno sekvenaci, počínaje od místa BglII (je orámováno). Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence.

Na obr. 6 je znázorněna nukleotidové sekvence PCR mutagenního (pravosměrného) a universálního (levosměrného) primerů použitého pro konstrukci pT7 derivátů pro heterologní expresi genů z S. avermitilis bkd v E. coli. PCR primerů bylo použito pro zavedení restrikčního místa Ndel v místě translačního start kodonu otevřeného čtecího rámce El-α nebo El-β S. avermitilis bkd (dvojice primerů 55 : 31 a 56 :

30). Dedukovaná aminokyselinová sekvence kódovaná každým mutagenním oligodeoxynukleotidem je uvedena nad odpovídající sekvencí DNA. Jsou zde také uvedeny restrikční a rozpozná17 telné sekvence. Šipkami je znázorněn směr amplifikace. Na obr. 6A jsou znázorněny pravosměrné mutagenní primery a na obr. 6B levosměrné mutagenní primery.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Nové postupy klonování genů S. avermitilis bkd a stanovení primární struktury genů kódujících multienzymový komplex S. avermitilis BCKDH jsou popsány dále.

Nejprve se zkonstruují dva PCR primery označené názvy pravosměrný a levosměrný (viz obr. 1) nad konzervovanými oblastmi identifikovanými ze seřazení několika dedukovaných sekvencí El-α BCKDH peptidu z různých druhů a dostupných z literatury. PCR produkt o délce přibližně 0,2 kb se deteguje amplifikací genomové DNA z S. avermitilis za použití jak pravosměrného, tak levosměrného primeru. PCRamplifikovaný fragment DNA se potom klonuje do E. coli vektoru pGEM-3Z za vzniku rekombinantního plasmidu pCD503. Potom se plasmid pCD503 transformuje do E. coli DH5-a kompetentních buněk. Jeden z transformantů se označí jako kmen CD503. Sekvenování DNA klonovaného fragmentu DNA CD503 ukazuje existenci otevřeného čtecího rámce s dedukovaným peptidem, který je vysoce homologický vzhledem k El-α BCKDH podjednotce (viz obr. 2). Klonovaného fragmentu genomové DNA CD503 se potom použije jako próby pro screening chromosomové knihovny S. avermitilis hybridizací kolonií. Jsou identifikovány čtyři kosmidové klony, totiž CD518, CD519, CD520 a CD 521. Restriční analýza a analýza Southern Blot ukazuje, že tyto čtyři klony nesou překrývající se genomové fragmenty. DNA sekvenování hnízdových delecí ze subklonovaných genomových DNA fragmentů (jak je to podrobně vysvětleno v příkladu 8) ukazují, že sekvence CD503 je součástí úplného shluku genů bkd. Klonované geny S. avermitilis bkd zahrnují oblast chromosomu o délce přibližně 15 kb (viz obr. 3). Analýza sekvence DNA ukazuje přítomnost pravděpodobných transkripčních promotorových sekvencí a strukturních genů BKD uspořádaných do shluku, který je organizován následujícím způsobem: promotorově sekvence, ORF El-α, ORF El-β a ORF E2 (viz obr. 4 a 5).

Konečně se úplný shluk genů S. avermitilis bkd klonuje za silný promotor T7 z Escherichia coli pro expresi v hostiteli E. coli. Podobně se také klonují otevřené čtecí rámce pro El-α a El-β, a to bud odděleně nebo dohromady za promotor T7 a každý ze získaných konstruktů se zkouší na expresi. Nové PCR mutagenní primery použité pro zavedení jediného restrikčního místa Ndel na ATG translačním startu ORF El-α a ORF El-β jsou podrobně popsány v příkladu 9 (viz též obr. 6). Studie s duálním plasmidovým T7 expresním systémem ukazuje, že alespoň dva otevřené čtecí rámce shluku genů (El-α a El-β) z S. avermitilis bkd CD503 jsou plně přeložitelné při expresi v E. coli. Kromě toho enzymatická stanovení zaměřená na specifickou analýzu složky El komplexu BCKDH jednoznačně potvrzují, že dva z rekombinantních klonů E. coli (jeden, který nese celý shluk genů bkd, a druhý, který nese společně otevřený čtecí rámec El-α a El-β) obsahují BCKDH-specifickou enzymatickou aktivitu (viz tabulka I).

V tomto popisu se uvádí izolace genů bkd z producentu avermektinu, kterým je Streptomyces avermitilis. Genom streptomyces je rozměrný (asi 10⁴ kb), což je více než dvojnásobek ve srovnání s genomem Escherichia coli. Genom streptomycetes se skládá z DNA s velmi vysokým celkovém obsahem guanosinu a cytosinu (G + C), který činí v průběhu až 73 % a v některých oblastech více než 90 %, což je hodnota blížící se horní mezi pozorované v přírodě. Tyto výrazné charakteristiky vyžadují vývoj rekombinantní DNA techniky specificky přizpůsobené streptomycetes. Příklady takového úsilí je možno nalézt v patentové přihlášce USA s pořadovým číslem 08/048719, podané 16. dubna 1993 a v patentové přihlášce USA s pořadovým číslem 08/032925 podané 18. března 1993. Uvedené přihlášky jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Jiné techniky, které jsou specificky optimalizovány pro účely tohoto vynálezu, jako je PCR, amplifikace genomové DNA, tvorba hnízdových delecí, sekvenování DNA a heterologická exprese genů S. avermitilis bkd v E. coli, jsou podrobně popsány v příkladové části tohoto popisu.

Úplný popis experimentálních stupňů prováděných při klonování genů S. avermitilis bkd a dosažené výsledky jsou uvedeny dále:

(a) Identifikace konzervovaných oblastí v podjednotce peptidu El-α BCKDH, které by mohly sloužit jako potenciální místa pro navázání PCR primerů

Čtyři peptidové sekvence El-α BCKDH, tj. z člověka (Fisher et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:3448-3453), krysy (Zhang et al., 1987.. J. Biol. Chem. 262: 15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 311-317) a Bacillus stearothermophilus (Perham et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346) se seřadí do zákrytu, aby bylo možno identifikovat konzervované oblasti, které by mohly sloužit jako potenciální sekvence pro konstrukci odpovídajících PCR primerů. Počítačová analýza pro identifikaci oblastí podjednotky El-α, které jsou vysoce konzervovány jak v prokaryontních, tak eukaryontních komplexech BCKDH, se provádí za použití programů LineUp a Pretty z balíku programů pro analýzu GCG sekvence (Madison, WI, USA). Ze seřazení těchto čtyř El-α BCKDH peptidů je zřejmé, že existuje několik oblastí s prodlouženou homologií (Wexler, I. D., et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Thiaminpyrofosfátový vazebný motiv (Perham et al., 1989, FEBS Letters, 255: 77-82) umístěný mezi humánními El-α aminokyselinami 182 až 229 a oblast zahrnující fosforylační místa 1 a 2 v rozmezí aminokyselin 245 až 289 jsou pozoruhodně konzervovány ve všech čtyřech analyzovaných peptidech El-α BCKDH. Také je zde přítomna již dříve popsaná oblast s vysokou homologií, která leží v rozmezí aminoyseliny 291 až 307. Tato oblast se zdá být jedinečnou pro α-ketokyselina dehydrogenasy, které obsahují jak α-, tak β-podjednotky a není homologická s žádnou sekvencí v E. coli PDC El nebo ve složkách El a-ketoglutarát dehydrogenasových komplexů E. coli a kvasinek, což jsou dimery, které se skládají pouze z jediného El polypeptidu. Z výše uvedených důvodů se předpokládá, že posledně uvedená oblast homologie bude hrát roli při interakci podjednotky (Patel et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209 až 213). Konzervované oblasti zvolené pro konstrukci PCR primeru kódují aminokyselinové zbytky 192 až 200 a 370 až 376 humánního El-α BCKDH proteinu.

(b) Konstrukce nových oligonukleotidů vyrobených na konzervovaných oblastech El-α BCKDH, kterých má být použito jako PCR primeru

Jak již bylo uvedeno výše, při studii seřazení čtyř

El-α BCKDH peptidových sekvencí se zvolí dvě konzervované oblasti. Pravosměrný PCR primer (obr. 1) se zkonstruuje na oblasti zahrnující aminokyseliny 192 až 200 z humánní El-a BCKDH podjednotky, které se použije jako reprezentativního modelu El-α BCKDH podjednotky. Tyto aminokyseliny jsou umístěny v thiaminpyrofosfátovém vazebném motivu. Levosměrný PCR primer (obr. 1) se zkonstruuje na oblasti zahrnující aminokyseliny 370 až 376 El-α BCKDH podjednotky. Posledně uvedená aminokyselinová sekvence je umístěna v blízkosti C-terminální oblasti peptidu. Používá se přiřa21 zení kodonu genu Streptomyces (F. Wright a M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55 až 65). U 5' konce každého primeru je umístěna sekvence rozpoznávaná restrikčním enzymem (EcoRI u pravosměrného primeru a Xbal u levosměrného primeru), která usnadňuje klonování PCR produktů. Úplná sekvence pravosměrného PCR primeru je

5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' a úplná sekvence levosměrného PCR primeru je

5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’.

Sekvence, které nejsou homologické vzhledem k El-a bkd genům, zavedené do primerů pro účely klonování jsou podtrženy (viz obr. 1).

(c) PCR amplifikace fragmentu genomové DNA S. avermitilis

Genomová DNA S. avermitilis se eznymaticky amplifikuje za reakčních podmínek vhodných pro DNA s vysokým obsahem GC, které umožňují účinnou a specifickou amplifikaci DNA ze streptomycetes (viz příklad 2). PCR se provádí za použití kombinace primerů popsané výše (pravosměrný primer: 5 '-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3 ' a levosměrný primer: 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'). Amplifikační produkty se frakcionují podle velikosti elektroforézou na agarosovém gelu. Za PCR podmínek popsaných výše a za použití výše uvedené kombinace primerů se deteguje jediný pás DNA (o délce přibližně 250 bázových párů).

(d) Klonování amplifikovaného fragmentu genomové DNA do.klonovacího vektoru Escherichia coli a následující transfor mace do hostitele E. coli

Jak již bylo uvedeno výše, do pravosměrného PCR primeru se pro usnadnění klonování zavede restrikční místo EcoRI, přičemž u 5’ konce levosměrného primeru je přítomno restrikční místo Xbal. Pokusy o klonování 0,25 kb PCR fragmentu za použití ligačního postupu, při němž se jak insert, tak klonovací vektor štěpí EcoRI a Xbal, však nejsou úspěšné. Proto se pro klonování 0,25 kb PCR fragmentu pokusně použije alternativního postupu zahrnujícího použití fragmentu Klenow DNA polymerasy I za účelem vytvoření tupých konců ve fragmentu PCR. Po vložení fragmentu s tupými konci do Smal-linearizovaného E. coli vektoru s tupými konci (pGEM-3Z[f+]) se izoluje jediný rekombinantní klon tvořený rekombinantním plasmidem pCD503. Plasmid pCD503 se potom tranformací zavede do E. coli DH5-a-kompetentních buněk. Zvolený transformant se označí jako kmen CD503. Potvrzující restrikční analýza ukazuje, že plasmid pCD503 izolovaný z E. coli kmene CD503 skutečně obsahuje 0,25kb insert z S. avermitilis.

(e) Subklonování 0,25kb PCR-amplifikovaného DNA insertu do bakteriofágu M13, sekvenování DNA klonovaného fragmentu a identifikace bkd-specifických sekvencí

0,25kb insert přítomný v plasmidú pCD503 se subklonuje do bakteriofágu M13. Při tom se nejprve insert uvolní z E. coli vektoru štěpením pCD503 pomocí EcoRI a Pstl, tj. dvěma restrikčními enzymy, jimiž rozpoznatelné sekvence jsou přítomny v několikanásobném klonovacím místě vektoru pGEM na obou stranách klonovaného insertu. Tento specifický fragment se potom klonuje do EcoRI a Pstl zpracovaných vektorů M13 mpl8 a mpl9. Klonování do obou vektorů zajišťuje možnost produkovat jednořetězcovou DNA obou řetězců insertu DNA pro sekvenování. Jeden klon obsahující specifický insert vybraný z mpl8 transfekčního experimentu se označí jako kmen CD505. Jiný klon, který také obsahuje specifický insert, ale vybra23 ný z mpl9 transfekčního experimentu, se označí jako CD506. Sekvenování DNA se provádí metodou zahrnující terminaci dideoxynukleotidových řetězců. Za použití jednořetězcového DNA templátu a soupravy TaqTrack kit (Promega) ve všech případech se sekvenují oba řetězce DNA, tj. jeden získaný z klonu CD505 a komplementární řetězec získaný z klonu CD506. Kodonová preferenční analýza (balík software programů GCG Sequence Analysis, Madison, WI, USA) sekvenačních dat získá ných z klonů CD505 a CD506 ukazuje přítomnost otevřeného čtecího rámce vykazujícího správné použití v kodonu u genu streptomycetes.

Potom se pravděpodobný otevřený čtecí rámec přeloží do aminokyselinové sekvence za použití programů Seq and Translate, IntelliGenetics Suitě software (IntelliGenetics lne. Mountain View, California, USA). Nakonec se provede zjišťování podobnosti zkoumané peptidové sekvence pomocí databanky a programu FASTDB ze software IntelliGenetics. Všechny rešerše v databance, ať již se prohledávají databanky DNA (GenBank a EMBL) nebo proteinové databanky (PIR a Swiss-Prot) neomylně ukazují, že sekvence získaná z klonu CD503 je vysoké homologická, ale nová a odlišná od všech ostatních El-α BCKDH peptidů uvedených v těchto databankách, ať již se jedná o peptidy prokaryontního nebo eukaryontního původu. Na obr. 2 jsou do vzájemného zákrytu vyrovnány El-α BCKDH peptidové sekvence z člověka, krysy, Pseudomonas putida a Bacillus stearothermophilus, a je zde znázorněna nová peptidové sekvence Streptomyces avermitilis El-α BCKDH CD503. Z výše uvedených dat je možno učinit závěr, že 250 bp genomový PCR produkt z S. avermitilis klonovaný v E. coli kmene CD503 skutečně představuje nový El-α bkd genový fragment.

(f) klonováni úplného genového shluku z S. avermitilis bkd, restrikce a analýza Southern Blot a konstrukce chromosomové mapy *

Přibližně 0,25 kb dlouhý BamHI/EcoRI DNA fragment z pCD503 nesoucí El-α bkd specifickou sekvenci DNA z S. avermitilis se použije jako radioaktivně značené próby pro screening genomové kosmidové knihovny S. avermitilis prostřednictvím hybridizace kolonií. Jsou identifikovány a získány čtyři klony (CD518, CD519, CD520 a CD521). Analýza restrikcí a hybridizací Southern Blot ukazuje, že tyto čtyři klony obsahují překrývající se sekvence pocházející ze stejné chromosomové oblasti. Stejné próby se použije za podmínek vysoké stringence proti Southern blotům štěpené chromosomové DNA z S. avermitilis ATCC 31272. Posledně uvedená analýza potvrzuje totožnost těchto klonů získaných z genomové knihovny. Restrikční mapa genomové oblasti obsahující sekvenci S. avermitilis CD503 je znázorněna na obr. 3.

(g) Subklonování genomových DNA fragmentů získaných z klonů CD518 a CD521 a sekvenování DNA z chromosomální oblasti z S. averraitilis nesoucí bkd genový shluk

Genomové fragmenty (o délce 1 až 2 kb) pokrývající celou oblast CD503 bkd chromosomu S. avermitilis se subklonují z klonů CD521 a CD518 z DNA knihovny do E. coli vektoru pGEM-3Z. Seznam subklonů zkonstruovaných během této práce zahrnuje následující krátký popis každého plasmidu: 1. plasmid pCD528 obsahuje 7kb BamHI fragment subklonovaný z pCD518; 2. plasmid pCD545 obsahuje 2,3kb Sphl fragment subklonovaný z pCD528; plasmid pCD550 obsahuje 6kb Sphl fragment subklonovaný z pCD521; 4. plasmid pCD559 obsahuje 7kb BamHI fragment subklonovaný z pCD521; 5. plasmid pCD574 obsahuje 4,2kb SphI-BglII fragment subklonovaný z pCD550; a plasmid pCD577 obsahuje přibližně 10,4kb insert. Tento insert obsahuje dva znovu spojené sousední genomové fragmenty: 4,2kb SphI/BglII fragment subklonovaný z pCD550 a 6,2kb BglII/BamHi fragment subklonovaný z pCD559. Totožnost každého subklonu se potvrdí pomocí restrikčního mapování, hybridizace Southern a analýzy PCR plasmidu. Pro stanovení nukleotidové sekvence se použije Sangerovy metody terminace řetězců. K tomuto účelu se genomové fragmenty S. avermitilis subklonují do bakteriofágů M13mpl8 a M13mpl9 za účelem stanovení sekvence obou řetězců DNA. Z pGEM-odvozených klonů uvedených výše se izoluje několik DNA restrikčních fragmentů a ty se ligují do M13mpl8 a M13mpl9, za vzniku následujících rekombinantních fágů:

CD535: 0,40kb S.avermitilis DNA fragment klonovaný PCR za použití pCD528 DNA jako templátu, specifického prime ru 29-PCR-EX (5 '-aaGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3 ' ) a universálního primerů 31-PCR-BP (viz příklad 9 a obr. 6). Amplifikovaný fragment se štěpí EcoRI a Pstl a klonuje do EcoRI/Pstl linearizované M13mpl8 DNA.

CD536: podobný DNA fragment, jaký je popsán výše, klonovaný do M13mpl9 DNA.

CD537: l,15kb Sáli DNA fragment nesoucí sekvenci CD503 subklonovanou z pCD528 do M13mpl8.

CD538: l,15kb Sáli pCD528 DNA fragment (umístěný před l,15kb Sáli fragmentem popsaným výše) klonovaný do M13mpl8.

CD539: l,5kb BamHI/BglII DNA fragment subklonovaný Z pCD550 do M13mpl8.

CD540: podobný DNA fragment, jaký je popsán výše, ale klonovaný do M13mpl8 s opačnou orientací.

CD541; Ο,35kbSalΙ/BamHI DNA fragment subklonovaný Z pCD528 do M13mpl8.

CD542: 0,35kb Sall/BamHI DNA fragment subklonovaný z pCD528 do M13mpl9.

CD553: 0,8kb BamHI/BglII DNA fragment subklonovaný z pCD550 do M13mpl8.

CD554: l,lkb BamHI DNA fragment subklonovaný z pCE550 do M13mpl8.

CD555; podobný DNA fragment, jako je fragment popsaný výše, ale klonovaný do M13mpl8 s opačnou orientací.

CD558: 0,8kb BamHI/HindlII DNA fragment subklonovaný z pCD553 do M13mpl9.

CD561: 1,15 kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD537 do M13mpl8 (opačná orientace ve srovnání s orientací přítomnou v konstruktu CD537).

CD565; l,15kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD537 do M13mpl9.

CD566: l,15kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD537 do M13mpl9 (opačná orientace než je přítomna v konstruktu CD565).

CD567; l,l5kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD538 do M13mpl9.

CD582: 0,8kb BamHI/BglII DNA fragment subklonovaný z pCD550 do M13mpl8 (opačná orientace než je přítomna v konstruktu CD553).

- 27 Genomové inserty S. avermitilis nesené těmito klony se potom zkrátí působením enzymu Exonuclease III za vzniku série subklonů (hnízdové delece, viz příklad 8).

(h) Počítačová analýza dat ze sekvenování DNA získaných při analýze klonovaných fragmentů DNA a identifikace otevřených čtecích rámců S. avermitilis El-a, El-β a E2 bkd

Nukleotidová sekvence 2,7kb genomové oblasti S. avermitilis obsahující geny bkd je znázorněna na obr. 4. Klouzavá analýza složení (sliding base composition analysis) 2,7kb genomové oblasti obsahující otevřené čtecí rámce (ORF) S. avermitilis El-a, El-β a E2 (zčásti) bkd se provede na použití software DNA Inspector. Tato analýza poskytuje profil zahrnující běžný průměrný obsah (running average)

G+C za použití protažené délky (stretch length) 30 bází a přesahové hodnoty (offset value) 20. Celkový obsah G+C odpovídající této oblasti chromosomu S. avermitilis je 72 %. Nízká sedlová hodnota valley G+C (obsah G+C asi 50 %) indikativní pro promotorovou oblast leží bezprostředně před otevřenými čtecími rámci bkd.

Také se analyzuje obsah G+C v závislosti na poloze kodonu. Otevřené čtecí rámce se detegují za použití programu CodonPreference (Genetics Computer Group, Madison, WI,

USA) a za použití tabulky Streptomyces codon usage pro 64 genů (F. Wright a M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55 až 65). Program CodonPreference je rámcově specifický hledač genů, který se snaží rozpoznat kódující sekvence proteinu na základě jejich podobnosti s tabulkou kodonových frekvencí nebo na základě kompoziční tendence (obvykle GC) ve 3. poloze každého kodonu. Otevřené čtecí rámce jsou znázorněny jako čtverečky pod grafem příslušných čtecích rámců. Také se detegují všechny start kodony (ATG) a stop kodony (vertikální čárky). Pod každým grafem ORF jsou také označeny vzácné kodony nalezené v každém otevřeném čtecím rámci. Obsah G+C se vypočítá za použití klouzavého okénka (sliding window) 25 kodonů, takže se očekává interval (lag) asi 25 kodonů před kódující oblastí proteinu. Získají se následující tři profily: 1. první poloha v tripletu; 2. druhá poloha v tripletu a 3. třetí poloha v tripletu. Na základě této analýzy se lokalizují tři otevřené čtecí rámce bkd, které odpovídají následujícím podjednotkám BCKDH: El-a, Ε1-β, E2 (obr. 4 a 5).

(i) Konstrukce nových oligonukleotidů pro použití jako primerů při místně orientované mutagenesi na bázi PCR

Pro zavedení restrikčního místa NDE1 v počátečním místě translace (ATG) otevřeného čtecího rámce El-α a Ε1-β se použije místně orientované mutagenese na bázi linkerové nebo PCR techniky. Zkonstruují se následující nové oligonukleotidy (viz příklad 9 a obr. 6):

Levosměrné universální (vektorové) primery:

30- PCR-BP: 5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3'

31- PCR-BP: 5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3'

Pravosměrné mutagenní primery:

55- PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3'

56- PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3' (j) Místně orientovaná mutagenese genů S. avermitilis bkd za účelem vytvoření nového restrikčního místa NDEI před otevřeným čtecím rámcem

Jako expresních plasmidů se použije derivátů plasmidu pt7-7 (viz S. Tábor, 1990, Current Protocols in

Molecular Biology str. 16.2.1 až 16.2.11, Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York) nesoucích otevřené čtecí rámce El-a, El-β nebo El-a + El-β nebo úplný shluk genů S. avermitilis bkd. Restrikční místa Ndel se vytvoří místně orientovanou mutagenesí na bázi PCR. Pro tuto studii se zkonstruuje následujících pět expresních plasmidů:

Plasmid pCD670: derivát pt7-7 nesoucí otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-α bkd (ORF1). Do genu S. avermitilis El-α bkd se zavede restrikční místo Ndel u start kodonu ATG amplifikaci a současnou mutagenesí za použití PCR mutagenního primeru 55-PCR (viz příklad 9 a obr. 6).

Plasmid pCD666: derivát pt7-7 nesoucí otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-β bkd (ORF2). Do genu S. avermitilis El-β bkd se zavede restrikční místo Ndel u start kodonu ATG amplifikaci a současnou mutagenesí za použití PCR mutagenního primeru 56-PCR (viz příklad 9 a obr. 6) pro dosažení optimální exprese tohoto otevřeného čtecího rámce se třetí poloha kodonu 7 změní z C na G za vzniku synonymního kodonu podobajícího se kodonu použitému v E. coli. Sekvence peptidu El-β není touto změnou ovlivněna.

Plasmid pCD736: derivát pt7-7 nesoucí společně jak otevřený čtecí rámec El-α (ORF 1), tak El-β (ORF 2), kteréžto ORF jsou pod kontrolou T7-promotoru.

Plasmid pCD705: tento plasmid se podobá plasmidu pCD736, ale obsahuje 3' polovinu otevřeného čtecího rámce El-β ve špatné orientaci. Tohoto konstruktu se používá jako negativní kontroly při experimentální expresi.

Plasmid pCD785: derivát pt7-7 nesoucí úplný shluk genů S. avermitilis bkd.

(k) Exprese otevřených čtecích rámců S. avermitilis bkd v E. coli za použití duálního plasmidového expresního systému T7

Exprese genů S. avermitilis bkd v E. coli se provede za použití duálního plasmidového systému T7 RNA polymerasa/promotor v podstatě, jak je popsán v S. Tábor, 1990 v Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1 až 16.2.11, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, USA. Analyzují se deriváty E. coli C600 (pGP-1) obsahující odlišné konstrukce pT7-7. Pro monitorování exprese otevřených čtecích rámců z S. avermitilis v hostiteli E. coli po tepelné indukci se použije elektroforézy na polyakrylamidovém gelu za použití natriumdodecylsulfátu (SDS-PAGE).

Analýza metodou SDS-PAGE proteinového profilu po indukci vykazuje nadexpresi indukovaných peptidů, které mají velikost podobnou předvídané hodnotě (na základě dedukce z odpovídající sekvence DNA) pro otevřený čtecí rámec El-α a El-β:

Předvídaná Pozorovaná velikost velikost (Da) (Da)

ORF1 (El-a) 41 000 41 000

ORF2 (El-β) 35 000 34 000 (1) Detekce aktivity El S. avermitilis BCKDH pomocí specifického stanovení v surovém extraktu rekombinantního klonu E. coli

Výsledky (příklad 11) jsou sumarizovány v tabulce

I. El-specifická stanovení BCKDH prováděná na surových extraktech buněk E. coli nesoucích pCD736 vykazují významnou El-aktivitu po indukci promotoru T7. Podobná kultura nesoucí konstrukt, v němž je část insertu umístěna ve špat31 né orientaci (pCD705) vykazuje aktivitu, jejíž úroveň odpovídá pozadí.

Kromě toho enzymatická stanovení ukazují, že surové extrakty z kmene E. coli obsahujícího plasmid pCD685 také vykazují významnou aktivitu El BCKDH (více než desetinásobnou, vzhledem k úrovni pozadí). Analyzuje se také neindukovaná kultura tohoto klonu, a zjistí se, že základní úroveň aktivity je o dvojnásobek hodnoty pozadí vyšší než hodnota pozadí. Tento výsledek je očekáván, poněvadž o systému T7 je známo, že umožňuje nízkou konstitutivní expresi klonovaných genů i za neindukovaných podmínek.

Klonovaný shluk genů Streptomyces avermitilis bkd je užitečný při zlepšování přirozené produkce avermektinu prostřednictvím zvýšení počtu kopií těchto genů nebo optimalizace jejich exprese v produkčních kmenech. Jeden z možných přístupů pro dosažení účinné exprese klonovaných genů bkd zahrnuje vložení těchto genů do mnohakopiového E. coli/ streptomycetes shuttle vektoru (například plasmidu pCD262, Denoya C. D., 1993, Novel Baacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli US patentová přihláška č. 08/032,925, podaná 18. března 1993) tak, že jsou geny transkribovány ze silného promotoru. Tento postup zajišťuje účinnou transkripci genů. Kromě toho lze navrhnout určité strategie zaručující účinnou expresi. Tyto strategie zahrnují následující faktory: a) sílu promotoru, b) stabilitu mRNA, c) přítomnost nebo nepřítomnost regulačních faktorů, d) indukovatelnost a e) místně orientovanou mutagenesi pro zlepšení rozpoznání ribosomu a translace signálů iniciace. Expresi genů bkd by také bylo možno optimalizovat nahrazením promotoru divokého typu a regulačních oblastí odlišnými promotory za použití technik výměny genů.

V literatuře je uvedeno mnoho příkladů užitečných promotorů, kterých by bylo možno použít pro optimalizaci exprese nových genů S. avermitilis bkd popsaných v tomto textu, například silný ermE promotor (Hopwood et al., 1985,

Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Velká Británie) a thiostreptonem indukovatelný tipA promotor (Murakami et al., 1989, J. Bacteriol, 171, 1459-1466). Kromě toho inaktivaci bkd genů s průvodní absencí aktivity BCKDH, které se dosahuje vypuštěním místně orientované mutagenese za použití technik výměny genů, se vyvinou zlepšené nevratně blokované kmeny Streptomyces avermitilis bkd, které jsou užitečné při produkci nových avermektinů.·

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady představují podrobné příklady experimentálních postupů použitých pro klonování a analýzu genů bkd z S. avermitilis, které jsou rovněž ilustro vány v přiložených výkresech. Přídavné podrobnosti standardních technik, které jsou dobře známy odborníkům v oboru molekulární biologie a označování specifických enzymů je například popsáno v latoratorní příručce Molecular Cloning, Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Příklad 1

Příprava genomové DNA z S. avermitilis

Mycelium S. avermitilis ATCC 31272 se napěstuje v podobě konfluentního porostu na agarovém médiu YPD-2 v průběhu 7 dnů při 29’C. Toto médium obsahuje:

kvasinkový extrakt Difco 10 g baktopepton Difco 10 g dextrosu 5 g baktoagar Difco 20 g octan sodný 2 g MOPS 10 g hodnota pH přizpůsobena na 7,0 konečný objem: 1 litr medium zpracováno v autoklávu 25 minut při 121^eC

Narostlého mycélia se potom použije pro inokulaci 30 ml média AS-7 (viz Hafner et al., 1988, evropská patentová přihláška č. 88300353.5, publikační číslo 0 284 176) ve 300ml baňce s narážkami, která se třepe (230 min^-1) při 29’C po dobu 24 hodin. Toto médium obsahuje:

modifikovaný škrob¹ 20 g Ardamin pH² 5 g Pharmamedia³ 15 g uhličitan vápenatý (CaCO₃) 2 g pH nastaveno hydroxidem sodným na 7,2 konečný objem: 1 litr medium zpracováno v autoklávu 25 minut při 121’C ¹ vyrobí se hydrolýzou škrobu působením α-amylasy z Bacillus licheniformis do dextrosového ekvivalentu přibližně 40 % ² od firmy Yeast Products lne., Clifton, NJ 07012, USA ³ od firmy Traders Protein, Memphis, TN 38108, USA.

Přibližně 0,3 ml výše uvedené kultury se použije pro inokulaci další 300ml baňky s narážkami s obsahem 30 ml modifikovaného kapalného média s kvasinkovým a sladovým extraktem (Yeast Extract Malt Extract (YEME) medium) (Bibb,

M. J., Freeman, R. F. a D. A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155-166). Modifikované médium YEME obsahuje v 1 litru kvasinkový extrakt Difco 3 g baktopepton Difco 5 g sladový extrakt Oxoid 3 g sacharosa 300 g glukosa 10 g

Médium se 40 minut zpracovává v autoklávu při 121*C a potom se k němu přidají 2 ml 2,5M roztoku hexahydrátu chloridu hořečnatého a výsledný objem se nastaví na 1 litr.

Kultury se nechají růst 48 až 72 hodin při 29°C. Mycelium se oddělí centrifugací a genomová DNA se připraví podle protokolu Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Proceduře 2 uvedeného v příručce Genetic Manipulation of Streptomyces, A. Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich,

Velká Británie, 1985, autoři Dr. D. A. Hopwood et al. Pelety DNA se resuspendují ve 3 ml pufru TE (lOmM tris-HCl, pH 8,0, lmM EDTA).

Příklad 2

Amplifikace genomové DNA z S. avermitilis řetězovou reakcí za použití polymerasy

Genomová DNA z S. avermitilis se enzymaticky amplifikuje za použití tepelného cyklovače Perkin-Elmer Cetus. Reakce PCR se provádí za použití polymerasy Taq (PerkinElmer Cetus) a pufru dodaného výrobcem za přítomnosti 200 μΜ dNTP, 15% glycerolu, 0,5 μΜ každého z primerů, 50 ng témplátově DNA (v tomto případě genomové DNA z S. avermitilis) a 2,5 jednotky enzymu v konečném objemu 100 μΐ v celkem 30 cyklech. Tepelný profil prvního cyklu je následující: 95’C po dobu 3 minut (denaturační stupeň), 55’C po dobu 2 minut (stupeň tepelné hybridizace) a 72°C po dobu 2 minut (prodlužovací stupeň). Následujících 29 cyklů má podobný tepelný profil, pouze s tím rozdílem, že denaturační stupeň je zkrácen na 1,5 minuty. DNA primery jsou dodány od firmy Genosys Biotechnologies Inc. (Texas, USA). Pravosměrný primer (viz obr. 1) má sekvenci

5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' a úplná sekvence levosměrného PCR primeru (obr. 1) je

5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3 ’ .

Amplifikační produkty se frakcionují podle velikosti elektroforézou na agarosovém gelu. Vzorek PCR se zpracovává elektroforézou na horizonálním 1,5% agarosovém gelu v IX TBE pufru (90mM Tris-HCl, pH 8,5, 90mM kyselina boritá, 2,5mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA)), 1,5 hodiny při 100 V (viz výše uvedená citace Maniatis et al.). Oddělené PCR DNA produkty se na gelu lokalizují barvením ethidiumbromidem a vizualizují jako fluorescentní pásy v ultrafialovém světle 365 nm. Za podmínek PCR uvedených výše a za použití výše uvedené kombinace primerů se deteguje jediný pás DNA (přibližně o délce 250 bp).

Příklad 3

Klonování 0,25kb PCR-amplifikovaného fragmentu genomové DNA z S. avermitilis do vektoru E. coli a následující transformace do hostitele E. coli technology lne. New Haven, CT, USA). Potom se DNA vysráží ethanolem, peletizuje a nakonec znovu rozpustí ve 20 μΐ DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, 0,lmM EDTA, pH 7,5).

B. Štěpení Smál a defosforylace plasmidového vektoru pGEM-3Z

Přibližně 1 μg plasmidu pGEM-3Zf(+) (Promega Corp. Madison, WI, USA) a 2 jednotky restrikčního enzymu Smál (všechny restrikční enzymy byly zakoupeny od firmy Boehringer Mannheim Biochemicals) se inkubují v pufru pro stanovení (specifikovaném dodavatelem) při 25‘C po dobu 3,5 hodiny v celkovém reakčním objemu 40 μΐ. Tak se získají lineární molekuly s tupými konci. Potom se Smal-linearizovaný vektor defosforyluje za použití alkalické fosfatasy z telecího střeva (CIAP) (zakoupena od firmy Promega Corp. Madison, WI, USA) podle instrukcí dodavatele. Reakční směs se 35 minut inkubuje při 37’C a potom se DNA extrahuje dvakrát stejným objemem směsi fenolu a chloroformu, dvakrát stejným objemem etheru a nakonec se DNA vysráží přídavkem dvou objemů absolutního ethanolu. Vysrážená DNA se izoluje lOminutovou centrífugací při 10 000 x g a vysuší se za vakua. Získaná peleta se znovu rozpustí ve 20 μΐ DNA-pufru.

C. Ligace za vzniku pCD503

Přibližně 10 μΐ 0,25kb PCR DNA produktu zpracovaného Klenowovým fragmentem a asi 1 μΐ Smal-linearizovaného CIAP-defosforylovaného pGEM-3Zf(+) s tupými konci se inkubuje přes noc s 1 jednotkou ligasy (New England BioLabs, IC, Beverly, MA, USA) za podmínek specifikovaných dodavatelem při 14’C v celkovém reakčním objemu 20 μΐ. Reakce se ukončí tím, že se mikrozkumavka, ve které se stanovení provádí, vloží do ledu. Získaných 15 μΐ reakční směsi se potom použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli JM109 za

A. Izolace O,25kb PCR produktu

Jak již bylo uvedeno výše, 0,25kb fragment DNA se amplifikuje PCR za použití genomové DNA z S. avermitilis, jako templátu a výše uvedené kombinace pravosměrného a levosměrného primeru. Jak je zřejmé z obr. 1, pravosměrný primer obsahuje místo rozpoznávané restrikčním enzymem EcoRI u 5’ konce a levosměrný primer obsahuje místo rozpoznávané restrikčním enzymem Xbal u 5' konce. Pokusy klonovat 0,25kb PCR fragment za použití ligačního postupu, při němž se jak insert, tak klonovací vektor štěpí EcoRI a Xbal, však nebyly úspěšné. Proto se vyzkouší alternativní pokus klonovat 0,25kb PCR fragment za použití Klenowova fragmentu DNA polymerasy I za vzniku tupých konců v PCR fragmentu. Po amplifikaci, která se provádí způsobem popsaným v příkladu 2 se přibližně 80 μΐ PCR reakční směsi extrahuje dvakrát směsí fenolu a chloroformu, dvakrát etherem a potom se PCR DNA produkt vysráží ethanolem, jak to bylo popsáno výše. DNA se resuspenduje v 18,5 μΐ vody, k suspenzi se přidá 2,5 μΐ lOx translačního pufru nick (0,5M Tris-HCl, pH 7,2, O,1M síran hořečnatý, lmM dithiothreitol, 500 mg/ml hovězí sérový albumin) (Maniatis et al., výše uvedená citace z roku 1989) a 21 jednotek Klenowova fragmentu E. coli DNA polymerasy I (Boehringer Mannheim Biochemicals) a směs se 5 minut inkubuje při 37’C. Potom se přidá 1 μΐ 2μΜ dNTP (2 mM každého ze čtyř dNTP) a reakční směs se dále inkubuje 15 minut při teplotě místnosti. Opravná reakce se zastaví přídavkem 1 μΐ 0,5M kyseliny ethylendiamintetraoctové o pH 8,0 a celá reakční směs se nanese na 1,5% agarosový gel, kde se podrobí elektroforéze. 0,25kb DNA fragment se vizualizuje způsobem popsaným výše a izoluje elektroelucí, která se provádí takto: 0,25kb DNA pás se sejme holicí čepelkou a DNA se izoluje z agarosového gelu 35minutovou elektroelucí při 80 V do jímky tvaru písmene V naplněné 10M octanem amonným za použití jednosměrného elektroelutoru (International Bio38 použití standardního postupu popsaného ve výše uvedené citaci Maniatis et al. z roku 1989. Získá se mnoho ampicilinresistentních transformantů. Plasmidový vektor p-GEM-3Zf(+) obsahuje segment DNA pocházející z lac operonu Escherichia coli, který kóduje aminoterminální fragment β-galaktosidasy (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. a J. Messing, 1985, Gene,

33, 103). Tento fragment, jehož syntézu je možno indukovat isopropylthio-p-D-galaktosidem (IPTG) je schopen intra-allelové (a) komplementace s defektní formou β-galaktosidasy kódovanou hostitelem. Buňky E. coli po expozici indukčnímu IPTG syntetizují oba fragmenty enzymu a na miskách s médiem obsahujícím chromogenní substrát 5-brom-4-chlor-3-indolylβ-D-galaktosid (X-gal) vytvářejí modré kolonie. Vložení cizí DNA do polyklonovacího místa plasmidú inaktivuje aminoterminální fragment β-galaktosidasy a ruší α-komplementaci. Bakterie nesoucí rekombinantní plasmidy proto vytvářejí bílé kolonie. Při tomto transformačním pokuse se izolují četné bílé kolonie. Tyto kolonie by měly obsahovat plasmid pCD503. Tato skutečnost se potvrdí následujícím pokusem. Vybere se jedna kolonie, která se označí jako kmen CD503, a podrobí se další analýze. Jediná bakteriální kolonie E. coli kmene CD503 se inokuluje na kapalné médium Luria-Bertani (LB) s obsahem 50 mg/ml ampicilinu za použití standardních mikrobiologických postupů. Použité LB médium obsahuje:

baktotrypton bakto-kvasinkový extrakt chlorid sodný g

g 10 g hodnota pH nastavena na 7,0 5N roztokem hydroxidu sodného konečný objem roztoku nastaven na 1 litr ’médium sterilizováno v autoklávu 20 minut při 121’C

Kultura se inkubuje přes noc při 35’C. Následujícího rána se bakteriální buňky sklidí 5minutovou centrifu39 gací při frekvenci otáčení 10 000 min“¹ a teplotě 4’C. Plasmidový vektor se izoluje z čerstvě sklizených buněk Escherichia coli CD503 za použití modifikace Birnboimovy a Dolyho metody (Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1513); tato modifikace je popsána v Denoya et al., 1985, Microbios Lett. 29: 87. Izolovaná plasmidová DNA se potom rozpustí v DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, 0,lmM kyselina ethylendiamintetraoctová, pH 7,5) na koncentraci přibližně 1 μg pCD503 v 10 μΐ pufru. Potvrzující restrikční analýza za použití restrikčních enzymů EcoRI a Pstl ukazuje, že podle očekávání pCD503 nese 0,25kb insert DNA.

Příklad 4

Příprava rádioznačených DNA a RNA prób

A. Příprava rovnoměrně značených dvouřetězcových DNA prób

Dvouřetězcové DNA próby se připraví translací nick (obecný postup této techniky je popsán v publikaci Maniatis et al. z roku 1989 citované výše). Nejprve se připraví specifický fragment DNA nesoucí cílovou sekvenci vhodným restrikčním štěpením a tento fragment se purifikuje elektroelucí v podstatě za podmínek uvedených v příkladu 1. Přibližně 1 μg DNA se vždy označí za použití [a-³²P]dCTP ([a-³²P]-značená tetra(triethylamoniová) sůl deoxycytidin5'-trifosfátu) zakoupené od firmy NEN-Dupont, a systému BRL Nick Translation System (výrobek zakoupen od firmy BRL Life Technologies lne.) podle instrukcí získaných od dodavatele. Obvykle se tato reakce provádí v objemu 50 μΐ. Po přidání 5 μΐ Stop pufru (jak je to popsáno v doporučeném postupu od firmy BRL) se značená DNA oddělí od neinkorporoVaných nukleotidů pomocí protlačovacího sloupce Stratagene způsobem uvedeným v instrukčním manuálu dodavatele. Těmito postupy se vždy rutinním způsobem získá ³²P-značená DNA se specifickou aktivitou zaručeně vyšší než 10⁸ cpm/^g.

B. Příprava značených jednořetězcových RNA prób ³²P-značené RNA próby se připraví in vitro transkripcí za použití transkripčního systému Riboprobe Gemini (Promega). Purifikovaný fragment cílové DNA se klonuje do transkripčního vektoru pGEM-3Z za použití standardních postupů. Příprava templátové plasmidové DNA pro in vitro transkripční reakce se provádí způsobem popsaným v příkladu 3, ale zahrnuje srážecí stupeň za použití polyethylenglykolu (PEG) za účelem selektivního odstranění malých nukleotidů, které by mohly kontaminovat tyto přípravky. Posledně uvedený stupeň se provádí takto: Po stupni srážení ethanolem se peleta resuspenduje v 520 μΐ vody. K suspenzi se přidá 100 μΐ 5M roztoku chloridu sodného a 620 μΐ 13% polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 6 000 až 8 000. Po promíchání se zkumavka jednu hodinu inkubuje na ledu a DNA se peletizuje 15minutovým odstředováním při 10 000 x g a teploty 4’C. Získaná peleta se promyje jednou 500 μΐ 80% chladného ethanolu a potom obvyklým způsobem resuspenduje. Přibližně 1 μg templátové plasmidové DNA se linearizuje za použití restrikčního enzymu Sací nebo Hindill a potom se podrobí in vitro transkripci za použití SP6 nebo T7 bakteriofágová DNA-dependentní RNA polymerasy. Při této reakci se použije [a-³²P]-značené tetra(triethylamoniové) soli cytidin-5'-trifosfátu (CTP) zakoupené od firmy NEN-Dupont. Pracuje se za reakčních podmínek doporučených dodavatelem.

Po inkubaci se na reakční směs působí jednou jednotkou RQl-DNasy (Promega), za účelem degradace DNA templátu, reakční směs se extrahuje dvakrát směsí fenolu a chloformu a potom se produkt standardními technikami srazí ethanolem. Peleta se vysuší a resuspenduje ve 20 μΐ vody neobsahující RNasu (RNase-free Water, Promega). Malý alikvot značeného

RNA transkriptu se analyzuje elektroforézou na polyakrylamid-agarosovém gelu způsobem popsaným v Denoya et al., 1987, J. Bacteriol, 169: 3857 až 3860. Za výše uvedených podmínek je rutinním způsobem možno získat značené transkripty s úplnou délkou.

Příklad 5

Analýza genomové DNA z S. avermitilis hybridizaci Southern

Přibližně 10 μg purifikované genomové DNA z S. avermitilis se štěpí 2 jednotkami restrikčního enzymu BamHI při 37’C nejméně po dobu 2 hodin. Na konci štěpení se fragmenty DNA oddělí elektroforézou na 1% agarosovém gelu (viz příklad IA) a přes noc se přenesou na nylonovou membránu o velikosti pórů 0,45 μπι (Schleicherovy a Schuell Nytranovy membrány) za použití kapilární přenosové metody (Southern, E.M. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503). Následujícího dne se nylonové membrány zabalí do plastového obalu a ta strana každé membrány, která obshuje DNA, se exponuje zdroji ultrafialového záření (302 nm), aby se DNA fixovala k membráně. Hybridizace radioznačených RNA a DNA prób k DNA imobilizované na nylonové membráně se provádí podle protokolu popsaného ve výše uvedené publikaci Maniatis et al. z roku 1989. Prehybridizace a hybridizace se provádí při 42’C. Hybridizační roztok obsahuje: 6x SSC (lx: 0,15M chlorid sodný, 15mM citran sodný, pH 7,0), lOx Denhardtovo činidlo (lx: 0,02% ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% hovězí sérový albumin), 1% SDS (natriumdodecylsulfátu), 100 μg/ml denaturovanou fragmentovanou DNA z lososího sperma, 100 μg/ml E. coli tRNA a 50% formamid (Fluka). Hybridizace se provádí přes noc a potom se membrány opláchnou následujícím způsobem: dva oplachy 1 x SSC, 0,1% SDS při teplotě místnosti po dobu 15 minut a 2 oplachy 0,1 x SSC, 0,1% SDS při

42*C po dobu 15 minut. Při některých pokusech se hybridizace provádí při 65’C za nepřítomnosti formamidu a používá se SSPE (lx: 0,18M chlorid sodný, lOmM fosforečnan sodný (NaPO₄), pH 7,7, lmM EDTA) místo SSC. Nakonec se membrány exponují na rentgenografický film, by se získal autoradiograf ický obraz.

Příklad 6

Klonování 0,25kb genomového fragmentu CD503 z S. avermitilis do bakteriofágu M13 a sekvenování DNA

0,25kb fragment DNA CD503 z S. avermitilis se klonuje do bakterifágu M13mpl8 M13mpl9 za účelem přípravy jednořetězcových rekombinantních DNA pro použití jako templátů při Sangerově dideoxy-sekvenační metodě (Sanger et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463 až 5467). Asi 2 μg plasmidu pCD503 vyrobeného minipreparačním postupem popsaným výše se štěpí restrikčními enzymy EcoRI a Pstl za účelem uvolnění 0,25kb genomového insertu S. avermitilis. Restrikční analýza ukazuje, že pCD503 štěpený samotným enzymem EcoRI nebo Pstl je lineární. Tato analýza také ukazuje, že 0,25kb insert neobsahuje specifická místa pro EcoRI nebo Pstl. Po štěpení se směs podrobí elektroforéze na 1,2% agarosovém gelu a 0,25kb fragment se podrobí elektroeluci a vysráží se výše uvedeným způsobem. Kromě toho se asi 1 μg každé purifikované dvouřetězcové replikační formy (RF) DNA z M13mpl8 a M13mpl9 dvojnásobně štěpí EcoRI a Pstl, defosforyluje alkalickou fosfatasou z telecího střeva (CIAP) (enzym zakoupen od firmy Promega Corp., Madison, WI, USA) a nakonec liguje k 0,25kb DNA fragmentu způsobem popsaným výše. Purifikované klonovací vektory RF M13 jsou zakoupeny od firmy New England BioLabs. Ligačních směsí se použije pro transfekci kompetentních buněk E. coli JM109. Z mpl8 a mpl9 transfekce se vždy vybere jeden bílý plak, podrobí se fágo43 vému růstu a jednořetězcová DNA se připraví způsobem popsaným ve výše uvedené citaci Maniatis et al. z roku 1989. Sekvenování DNA každého jednořetězcového DNA templátu se provádí za použití M13-specifického -40 sekvenačního primeru (New England Biolabs, katalogové číslo 1212), deoxyadenosin5'-(α-thio)trifosfátu, [³⁵C](NEN-Dupont) a sekvenační soupravy TaqTrack (Promega) podle instrukcí dodavatele, tj. Promega. DNA sekvenační data pCD503 S.avermitilis genomového fragmenfu jsou uvedena na obr. 4.

Příklad 7

Klonování úplného shluku genů z S. avermitilis bkd a sestrojení chromosomální mapy

Přibližně 5 μg purifikovaného pCD503 se dvakrát štěpí za použití restrikčního enzymu BamHI a EcoRI. Fragmenty DNA se oddělí elektroforézou na 1,2% agarosovém gelu, elektroelucí se získá přibližně 0,25 kb dlouhý DNA fragment nesoucí sekvenci specifickou pro gen Ε-1α z E. avermitilis bkd a ten se značí nick translací v podstatě způsobem popsaným výše. Získaného [³²P]-značeného DNA fragmentu se potom použije jako próby pro screening genomové kosmidové knihovny S.avermitilis. Podrobný obecný popis přípravy genomových knihoven je možno nalézt v příručce Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al., (1989). Úplný popis přípravy chromosomální knihovny streptomycetes je uveden v příručce Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, Hopwood et al. (1985). Popis kosmidového vektoru je možno nalézt v americké patentové přihlášce č. 08/048,719, podané 16. dubna 1993 o názvu Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning původce Denoya C. D. Při screeningu více než 2200 rekombinantních klonů v knihovně jsou identifikovány čtyři klony. Tyto čtyři hybridizující klony (označené jako klony E. coli CD518, CD519,

CD520 a CD521) se nechají růst na LB médiu za ampicilinového selekčního tlaku. Z každé kultury se výše uvedeným způsobem připraví plasmid. Restrikční analýza a hybridizační analýza Southern blot ukazuje, že tyto čtyři klony jsou příbuzné a obsahují překrývající se chromosomové oblasti. Standardními postupy se také získá restrikční mapa genomu S. avermitilis pokrývající celou chromosomovou oblast včetně sekvence CD503 (tato restrikční mapa je znázorněna na obr. 3).

Příklad 8

Vytvoření hnízdových souborů delečních mutantů pro orientované sekvenování DNA oblasti chromosomu nesoucí shluk genů bkd z S. avermitilis

Hnízdové soubory delečních mutantů, kterým chybí postupně stále větší počet nukleotidů na jednom nebo druhém konci cílové DNA z S. avermitilis bkd se vytvoří za použití enzymu Exonuklease III v podstatě za použití postupů, které se podobají postupům popsaným S. Henikoffem (S. Henikoff, 1987, Methods Enzymol, 155:156). Pro vytvoření jednosměrných delečních mutantů se dvouřetězcová DNA každé rekombinantní bakteriofágové M13 replikační formy DNA štěpí dvěma restrikčními enzymy, přičemž obě obsahují místa štěpení mezi jedním koncem cílové DNA a vazebným místem primeru. Restrikční enzym, který štěpí ve větší blízkosti k cílové sekvenci, vytváří tupý konec nebo zahloubený 3' konec. Zbývající enzym vytváří vystupující 3' konec. Enzym Exonuclease III katalyzuje postupné odštěpování 5’ mononukleotidů od zahloubeného nebo tupého 3’ hydroxylového konce dvouřetězcové DNA. Vystupující 3' konce jsou však vůči této enzmatické aktivitě úplné resistentní. Vůči Exonuclease III je tedy susceptibilní pouze jeden konec výsledné lineární

DNA a štěpení probíhá jednosměrně od místa štěpení do cílových DNA sekvencí.

Jako příklad je možno uvést popis přípravy hnízdových delecí pCD565. Plasmid pCD565 je M13mpl9 RF derivát nesoucí l,15kb Sall fragment, který obsahuje část otevřeného čtecího rámci El-α S. avermitilis bkd. Plamis pCD565 se purifikuje rovnovážnou centrifugací v gradientu chloridu česného a ethidiumbromidu způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Maniatis et al. z roku 1989. Enzym Exonuclease III je schopen iniciovat štěpení od jednořetězcových nicků, takže je důležité použít přípravku obsahujícího méně než 10 % relaxovaných kružnicových molekul. Přibližně 10 μg plasmidu pCD565 (viz část zabývající se podrobným popisem tohoto vynálezu) se dvakrát štěpí restrikčními enzymy Sací a Xbal při 37’C po dobu 4 hodin, vzniklá směs se extrahuje směsí fenolu a chloroformu a etherem a potom se výše uvedeným způsobem produkt srazí ethanolem. Vzniklá peleta se resuspenduje v 60 μΐ reakčního pufru s Exonuclease III (lOx reakční pufr s Exonuclease: 0,66M Tris-HCl, pH 8,0, 66mM chlorid horečnatý (MgCl₂))· Roztok DNA se potom při 37°C inkubuje za přítomnosti 300 jednotek Exonuclease III (Ambion Inc.) a ve 30sekundových intervalech se odebírají 2,5μ1 alikvoty. Odebrané vzorky se potom inkubují s nukleasou Sl a alikvot každého vzorku se analyzuje elektroforézou na agarosovém gelu. Vzorky obsahující fragmenty DNA požadované délky se spojí, DNA se opraví za použití Klenowova fragmentu DNA polymerasy I, přes noc se provede ligace a potom následuje transfekce do kompetentních buněk E. coli JM109. Velikost insertu v získaných klonech se analyzuje restrikcí EcoRI/HindlII a elektroforézou na agarosovém gelu. Pro sekvenování se vybere 5 klonů: 565-D19 (1,1 kb), 565-D7 (0,88 kb), 565-d24 (0,77 kb), 565-D1 (0,51 kb) a 565-D16 (0,36 kb). Z každého z těchto klonů se přiraví jednořetězcová DNA, která se výše uvedeným způsobem sekvenuje.

Příklad 9

Sestrojení plasmidů pCD670, pCD666, pCD736 a pCD685 pro použití při expresi genů S. avermitilis bkd v E. coli

Exprese genů S. avermitilis bkd v E. coli se provede za použití duálního plasmidového systému T7 RNA polymerasa/promotor v podstatě, jak je popsán v S. Tábor, 1990 v Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1 až 16.2.11, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, USA.

A. Sestrojení pCD670 nesoucího otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-α bkd

Postupem založeným na PCR se do S. avermitilis bkd El-α genu zavede restrikční místo pro Ndel oddělující ATG start kodon. Templátem pro PCR je plasmid pCD528, pGEM-3Z derivát nesoucí 7kb S. avermitilis genomový insert obsahující aminoterminální polovinu otevřeného čtecího rámci El-α. Jako primerů se při PCR reakci použije dvou oligonukleotidů (viz obr. 6), kterými jsou

1. levosměrný universální (vektorový ) primer 31-PCR-BP: 5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3 ' , který mapuje za místem pro HindlII pGEM-3Z MCS (polohy 91 až 114). Na 5' konci tohoto primeru jsou dva zbytky As a dvě restrikční místa (BamHI a Pstl) pro usnadnění klonování PCR produktů;

2. mutagenní primer

55-PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3', na jehož 5' konci jsou dva zbytky As, jeden G a dvě restrikční místa (BglII a Ndel). Místo Ndel se překrývá s kodonem ATG iniciátoru otevřeného čtecího rámce El-a.

2712). Na 5’ konci tohoto primeru jsou dva zbytky As a dvě restrikční místa (BamHI a Pstl) pro usnadnění klonování PCR produktů;

2. pravosměrný mutagenní primer 5 6-PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3', na jehož 5' konci jsou dva zbytky As, jeden G a dvě restrikční místa (BglII a Ndel). Místo Ndel se překrývá s kodonem ATG iniciátoru otevřeného čtecího rámce El-β.

Řetězová reakce působením polymerasy se provádí výše popsaným způsobem. Reakční produkty se analyzují na elektroforézou na 0,8% agarosovém gelu. PCR-amplifikovaný DNA fragment o správné velikosti (délka asi 1,9 kb) se elektroeluuje, štěpí restrikčními enzymy Ndel a EcoRI a subklonuje do Ndel/EcoRI-linearizovaného plasmidú pT7-7, z něhož se ligací a transformací do buněk E. coli DH-5-α získá plasmid pCD666. Nakonec se plasmid pCD666 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plasmid pGPl-2 (plasmid obsahující gen pro T7 RNA polymerasu) (viz Tábor, výše uvedená citace z roku 1990). Pro další práci se vybere jeden transformant, který se označí jako CD673.

C. Sestrojení pCD736 nesoucího otevřené čtecí rámce S. avermitilis El-α a 41-β bkd

Přibližně 2 ng plasmidú pCD670 se linearizují částečným štěpením BamHI. Pro získání lineární formy plasmidu pCD670 se odebírají alikvotní vzorky směsi štěpené BamHI po jedné, třech, pěti, deseti a dvaceti minutách. Alikvoty se podrobí elektroforéze na 0,8% agarosovém gelu. Lineární forma (o délce asi 4,3 kb) se izoluje elektroelucí a defosforyluje se působením CIAP (viz výše). Potom se polovina defosforylované lineární formy plasmidú pCD670 liguje s 0,8kb BamHI/BglII fragmentem izolovaným z plasmidú pCD577. Ligační směsi se použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5-a. Izoluje se deset klonů, které se analyzují restrikční analýzou plasmidové DNA získané při minipreparačním postupu. Jeden klon označený jako CD736 obsahuje správně uspořádaný plasmid pCD736. Nakonec se plasmid pCD736 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plasmid pGPl-2. Pro další práci se zvolí jeden transformant, který se označí jako kmen CD737. Jiný klon označený jako kmen CE705 obsahuje plasmid pCE705 nesoucí 0,8kb BamHI/BglII fragment v nesprávné orientaci. Konstruktu pCD705 se použije jako negativní kontroly při pokusech o expresi.

D. Sestrojení pCD685 nesoucího shluk genů S. avermitilis bkd

Zbývající polovina defosforylované lineární formy plasmidu pCD670 získaná výše uvedeným způsobem částečným štěpením pomocí restrikčního enzymu BamHI se liguje s 7kb BamHI fragmentem izolovaným z plasmidu pCD577. Ligační směs se použije pro transformaci kopetentních buněk E. coli DH5-a. Získá se mnoho klonů a 16 z nich se zvolí pro další analýzu. Extrahuje se plasmidová DNA, a ta se analýzu je restrikční analýzou. Jeden z klonů označený jako kmen CD685 obsahuje správně uspořádaný plasmid pCD685. Nakonec se plasmid pCD685 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plasmid pCGl-2. Jeden transformant se vybere pro další práci a označí se jak kmen CD687.

Příklad 10

Exprese genů z S. avermitilis bkd v Escherichia coli za použití duálního plasmidového systému T7

Deriváty E. coli C600 (pGP-1) obsahující různé konstrukce pT7-7 (kmeny CD676, CD673, CD737 a CD687) se nechají růst v 5 ml LB média obsahujícího kanamycin (60 μ9/ιη1) a ampicilin (60 μς/ιηΐ) přes noc při 30’C. Noční kultury se zředí v poměru 1 : 40 (0,25 : 10,00 ml) a převedou do kultivační zkumavky (25 x 150 mm) obsahující čerstvé LB médium s ampicilinem a kanamycinem. Kultura se nechá růst za provzdušňování protřepáváním při 30’C až do naměřené optické hustoty (OD_5go) přibližně 0,4. Gen pro T7 RNA polymerásu se indukuje zvýšením teploty na 42'C na dobu 30 minut, čímž dojde k indukci genů, které jsou pod kontrolou T7 promotoru (jak to popisuje S. Tábor ve výše uvedené publikaci z roku 1990). Nakonec se teplota sníží na 37’C a buňky se nechají dalších 90 minut růst za protřepávání. Neindukované kontrolní kultury se vždy udržují při 30’C. Proteiny se analyzují elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s natriumdodecylsulfétem (SDS) způsobem popsaným v C.

D. Denoya et al., 1986, J. Bacteriol. 168: 1133 až 1141. Enzymatická účinnost se analyzuje způsobem popsaným v příkladu 11.

Příklad 11

Stanovení BCKDH aktivity El S.avermitilis v surových extraktech rekombinantních kmenů E. coli

A. Příprava buněčného lysátu

Buňky (získané z 8ml kultur) se oddělí centrifugací (5 minut při 5 000 min“¹, asi 3 000 x g, za použití rotoru Sorvall SS-34 a chlazení na 4°C) a resuspendují v 5 ml rozbijecího pufru (0,05M pufr na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,0 obsahující 3% Tritonu X-100, 15% glycerolu, dithiothreitol (3mM) a trypsinový inhibitor z krůtího vaječného bílku (1 mg/ml), EDTA (5mM) a TPP[thiaminpyrofosfát] (0,04mM)]. Resuspendované buňky se převedou do francouzského lisu a rozbijí se jedním průchodem za tlaku

34,3 MPa. Alikvot o objemu 1,5 ml produktu prošlého lisem se převede do mikrocentrifugační zkumavky a čeří se 30sekundovou centrifugací při frekvenci otáčení 14 000 min^-1.

Alikvotu každého supernatantu (100 μΐ) se použije pro enzymatické stanovení. Koncentrace proteinu se stanoví za použití soupravy pro stanovení proteinu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), která je založena na Bratfordově postupu vazby barviva (Bratford, Μ., Anal. Biochem. 72: 248, 1976).

B. Stanovení El komponenty komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy (BCKDH) z S. avermitilis

Aktivita BCKDH El se stanoví modifikovaným postupem radiochemického stanovení popsaného výše (Chuang D. T., 1988, Methods Enzymol., 166: 146-154 a Hafner E. W. et al., 1995, J. Antibiotics 44: 349). Na dno 15ml skleněné scintilační nádoby se přidá 0,148 ml 0,25M pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 6,5; 0,002 ml 0,ÍM ethylendiamintetraoctové kyseliny (dvojsodné soli EDTA); 0,004 ml 0,lM chloridu draselného (MgCl₂); 0,02 ml 3,7mM thiaminpyrofosfátu (TPP); 0,02 ml 37mM arsenitanu sodného NaAsO₂; 0,01 ml 37mM 2,6-dichlorfenolindofenolu (sodná sůl, Sigma D-1878); 0,008 ml a-[l-¹⁴C]ketoisokaproátového zásobního roztoku (vyrobeného dále popsaným způsobem); 0,058 ml vody; a 0,1 ml vyčeřeného bezbuněčného extraktu. Hrdlo lahvičky se ihned zakryje papírem Whatman 4CHR (Whatman katalogové číslo 3004614), který je napuštěn prostředkem Solvable (tkáňový a gelový solubilizátor zakoupený od firmy NEN-Dupont). Lahvička se potom těsně uzavře plastovým uzávěrem, přičemž jak uzávěr, tak horní polovina lahvičky se obalí parafilmem. Inbubace za mírného protřepávání se provádí 2 hodiny při 30’C. Po skončení inkubace se filtrační papír přenese do 7ml skleněné scintilační kyvety obsahující 4 ml kapalného scin52 tilačního koktejlu Ready Safe (Beckman) za účelem stanovení radioaktivity.

a-[l-¹⁴C]ketoisokaproátový zásobní roztok se vyrobí tak, že se smíchá 5,6 μΐ 20mM α-ketoisokaproátu (sodná sůl, Sigma, K-0629), 50 μΐ α-[l-¹⁴C]ketoisokaproátu (50 mCi/mmol, 50 μΟί/ιηΙ, Amersham) a dostatečným množstvím vody do celkového objemu 1 ml.

Specifická aktivita El složky rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasa se uvádí v pmol oxidu uhličitého uvolěného na minutu na 1 mg proteinu (viz tabulka I).

Tabulka I

Aktivita rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy z El Streptomyces avermitilis v surových extraktech rekombinantních buněk E. coli

Konstrukce	Plasmid	Kmen	Indukce	Specifická aktivita1»2 El BCKDH
žádný insert	pT7-7	CD677	+	0,9
El-a	pCD670	CD676	-	0,6
			+	0,8
El-b	pCD666	CD673	-	0,5
			+	0,7
El-[a+b]	pCD736	CD637	-	2,0
			+	13,7
El-[a+b]3	pCD705	CD705	-	0,9
			+	0,5
El-[a+b]-	pCD685	CD687	-	2,9
E2-E3			+	6,0

¹ Specifická aktivita složky El rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy je vyjádřena v pmol oxidu uhličitého uvolněného za minutu, vztaženo na 1 mg proteinu.

² Výsledky jsou střední hodnoty ze dvou stanovení.

² Tento konstrukt nese C-terminální část El-β otevřeného čtecího rámce ve špatné orientaci a používá se ho jako negativní kontroly.

Popis sekvencí podle čísel

SEQ ID NO: 1 představuje sekvenci DNA kódující El-a podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 4 (báze 403 až 1548).

SEQ ID NO: 2 představuje sekvenci DNA kódující El-β podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 4 (báze 1622 až 2626).

SEQ ID NO: 3 představuje sekvenci DNA, která zahajuje otevřený čtecí rámec kódující aminoterminální oblast E2 podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 4 (báze 2626 až 2727).

SEQ ID NO: 4 představuje sekvenci DNA zahrnující báze 3 až 251 z pCD539. Jedná se o částečnou vnitřní sekvenci genu kódujícího E2 podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 5.

SEQ ID NO: 5 představuje 2728 bp fragmentu genomové DNA S. avermitilis znázorněného na obr. 4 a zahrnuje otevřené čtecí rámce El-a, El-β a E2 (částečně) podjednotek S. avermitilis BCKDH.

SEQ ID NO: 6 představuje aminokyselinovou sekvenci El-α podjednotky S. avermitilis BCKDH. Tato aminokyselinová sekvence je kódována sekvencí DNA SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 7 představuje aminokyselinovou sekvenci El-β podjednotky S. avermitilis BCKDH. Tato aminokyselinová sekvence je kódována sekvencí DNA SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 8 představuje aminokyselinovou sekvenci aminoterminální části E2 podjednotky S. avermitilis BCKDřL Tato aminokyselinová sekvence je kódována sekvencí DNA SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 9 představuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí DNA reprezentovanou bázemi 3 až 251 z pCD539 (SEQ ID NO: 4). Tato aminokyselinová sekvence představuje vnitřní peptidový fragment E2 podjednotky S. avermitilis BCKDH.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL (pro všechny designované státy s výjimkou USA):

(A) JMÉNO: Pfizer Inc.

(B) ULICE: 235 East 42nd Street, 20th Floor (C) MĚSTO: New York (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 10017-5755 (ii) PŘIHLAŠOVATEL (pouze pro USA):

(A) JMÉNO: Claudio D. Denoya (B) ULICE: 80 Spyglass Circle (C) MĚSTO: Groton (D) STÁT: Conecticut (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 06340 (iii) NÁZEV VYNÁLEZU: Geny kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy z Streptomyces avermitilis (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Peter C. Richardson
(B)	ULICE:	Pfizer Inc., 235 East 42nd Street, 20th Floor
(C)	MĚSTO:	New York
(D)	STÁT:	New York
(E)	ZEMĚ:	USA
(F)	PSČ:	10017-5755

(v) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 08/100,518 (B) DATUM PODÁNÍ: 30. července 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/100,518 (B) DATUM PODÁNÍ: 30. července 1993 (vii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Sheyka, Robert F.

(B) ČÍSLO LICENCE: 31,304 (C) SPISOVÁ ZNAČKA: PC8346 (viii) INFORMACE O TELEKOMUNIKAČNÍM SPOJENÍ (A) TELEFON: (212)573-1189 (B) TELEFAX: (212)573-1939 (C) TELEX: N/A (ix) POČET SEKVENCÍ: 9 (x) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (2) INFORMACE O SEQ ID N0:l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 146 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:l:

ATGACGGTCA	TGGAGCAGCG	GGGCGCTTAC	CGGCCCACAC	CGCCGCCCGC	CTGGCAGCCC	60
CGCACCGACC	CCGCGCCACT	GCTGCCCGAC	GCGCTGCCCC	ACCGCGTCCT	GGGCACCGAG	120
GCGGCCGCGG	AGGCCGACCC	GCTACTGCTG	CGCCGCCTGT	ACGCGGAGCT	GGTGCGCGGC	180
CGCCGCTACA	ACACGCAGGC	CACGGCTCTC	ACCAAGCAGG	GCCGGCTCGC	CGTCTACCCG	240
TCGAGCACGG	GCCAGGAGGC	CTGCGAGGTC	GCCGCCGCGC	TCGTGCTGGA	GGAGCGCGAC	300
TGGCTCTTCC	CCAGCTACCG	GGACACCCTC	GCCGCCGTCG	CCCGCGGCCT	CGATCCCGTC	360
CAGGCGCTCA	CCCTCCTGCG	CGGCGACTGG	CACACCGGGT	ACGACCCCCG	TGAGCACCGC	420
ATCGCGCCCC	TGTGCACCCC	TCTCGCGACC	CAGCTCCCGC	ACGCCGTCGG	CCTCGCGCAC	480
GCCGCCCGCC	TCAAGGGCGA	CGACGTGGTC	GCGCTCGCCC	TGGTCGGCGA	CGGCGGCACC	540
AGCGAGGGCG	ACTTCCACGA	GGCACTGAAC	TTCGCCGCCG	TCTGGCAGGC	GCCGGTCGTC	600

TTCCTCGTGC	AGAACAACGG	CTTCGCCATC	TCCGTCCCGC	TCGCCAAGCA	GACCGCCGCC	660
CCGTCGCTGG	CCCACAAGGC	CGTCGGCTAC	GGGATGCCGG	GCCGCCTGGT	CGACGGCAAC	720
GACGCGGCGG	CCGTGCACGA	GGTCCTCAGC	GACGCCGTGG	CCCACGCGCG	CGCGGGAGGG	780
GGGCCGACGC	TCGTGGAGGC	GGTGACCTAC	CGCATCGACG	CCCACACCAA	CGCCGACGAC	840
GCGACGCGCT	ACCGGGGGGA	CTCCGAGGTG	GAGGCCTGGC	GCGCGCACGA	CCCGATCGCG	900
CTCCTGGAGC	ACGAGTTGAC	CGAACGCGGG	CTGCTCGACG	AGGACGGCAT	CCGGGCCGCC	960
CGCGAGGACG	CCGAGGCGAT	GGCCGCGGAC	CTGCGCGCAC	GCATGAACCA	GGATCCGGCC	1020
CTGGACCCCA	TGGACCTGTT	CGCCCATGTG	TATGCCGAGC	CCACCCCCCA	GCTGCGGGAG	1080
CAGGAAGCCC	AGTTGCGGGC	CGAGCTGGCA	GCGGAGGCCG	ACGGGCCCCA	AGGAGTCGGC	1140
CGATGA						1146

(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 005 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

ATGACCACCG TTGCCCTCAA GCCGGCCACC ATGGCGCAGG CACTCACACG CGCGTTGCGT 60

GACGCCATGG CCGCCGACCC CGCCGTCCAC GTGATGGGCG AGGACGTCGG CACGCTCGGC 120

GGGGTCTTCC GGGTCACCGA CGGGCTCGCC AAGGAGTTCG GCGAGGACCG CTGCACGGAC 180

ACGCCGCTCG CCGAGGCAGG CATCCTCGGC ACGGCCGTCG GCATGGCGAT GTACGGGCTG 240

CGGCCGGTCG TCGAGATGCA GTTCGACGCG TTCGCGTACC CGGCGTTCGA GCAGCTCATC 300

AGCCATGTCG CGCGGGATGC GCAACGCACC CGCGGGGCGA TGCCGCTGCC GATCACCATC 360

CGTGTCCCCT ACGGCGGCGG AATCGGCGGA GTCGAACACC ACAGCGACTC CTCCGAGGCG 420

TACTACATGG CGACTCCGGG GCTCCATGTC GTCACGCCCG CCACGGTCGC CGACGCGTAC 480

GGGCTGCTGC GCGCCGCCAT CGCCTCCGAC GACCCGGTCG TCTTCCTGGA GCCCAAGCGG 540

CTGTACTGGT CGAAGGACTC CTGGAACCCG GACGAGCCGG GGACCGTTGA ACCGATAGGC 600

CGCGCGGTGG TGCGGCGCTC GGGCCGGAGC GCCACGCTCA TCACGTACGG GCCTTCCCTG 660

CCCGTCTGCC TGGAGGCGGC CGAGGCGGCC CGGGCCGAGG GCTGGGACCT CGAAGTCGTC GATCTGCGCT CCCTGGTGCC CTTCGACGAC GAGACGGTTG TGCGCGTCGG TGCGCGGACC

GGACGCGCCG TCGTCGTGCA CGAGTCGGGT GGTTACGGCG GCCCGGGCGG GGAGATCGCC

GCGGGCATCA CCGAGCGCTG CTTCCACCAT CTGGAGGCGC CGGTGCTGCG CGTCGCCGGG TTCGACATCC CGTATCCGCC GCCGATGCTG GAGCGCCATC ATCTGCCCGG TGTCGACCGG

ATCCTGGACG CGGTGGGGCG GCTTCAGTGG GAGGCGGGGA GCTGA (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 102 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

ATGGCCCAGG TGCTCGAGTT CAAGCTCCCC GACCTCGGGG AGGGCCTGAC CGAGGCCGAG ATCGTCCGCT GGCTGGTGCA GGTCGGCGAC GTCGTGGCGA TC (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 249 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

ATCTCCCTCA TCGCGCTGCT CGCCAGGATC TGCACCGCCG CACTGGCCCG CTTCCCCGAG

CTCAACTCCA CCGTCGACAT GGACGCCCGC GAGGTCGTAC GGCTCGACCA GGTGCACCTG

GGCTTCGCCG CGCAGACCGA ACGGGGGCTC GTCGTCCCGG TCGTGCGGGA CGCGCACGCG

CGGGACGCCG AGTCGCTCAG CGCCGAGTTC GCGCGGCTGA CCGAGGCCGC CCGGACCGGC

ACCCTCACA

720

780

840

900

960

1005

102

120

180

240

249 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2 728 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GTCGACGCGG	GCTCCGAAAC	CG CGG ATC AC	GCCGTCGTCG	ATGAGCCGGT	TGATTCGCGC	60
GTAGGCATTG	GCACGCGACA	CGTGGGCGCG	CTCGGCCACG	GACCGTATCG	AGGCGCGGCC	120
GTCCGCCTGG	AGCATCTGGA	GGATGTCCTG	ATCGATGGCG	TCCAGCGGGC	GGGCGGGCGG	180
CAGGGGTACC	CCGGGCTCCG	CTCCCTCGGC	CATTTGTTCA GGTGCCATGT	CCTCCGGCCT	240
CCTTACCATG	GACGTAGTGC	GTTCATTCCA	GGCTGTGGAG	AACCGTTTGT	CCACAGCCTG	300
ACGGTGCCTG	TAGCCAAAAT	GTGCCGACGA	CCGAACAATC	GGTAGGTGAG	GCGCCTCACA	360
CCCGTGGCGC	GCCCAAAGCC	GCTCCCACGA	GGAGGTGCCG	TCATGACGGT	CATGGAGCAG	420
CGGGGCGCTT	ACCGGCCCAC	ACCGCCGCCC	GCCTGGCAGC	CCCGCACCGA	CCCCGCGCCA	480
CTGCTGCCCG	ACGCGCTGCC	CCACCGCGTC	CTGGGCACCG	AGGCGGCCGC	GGAGGCCGAC	540
CCGCTACTGC	TGCGCCGCCT	GTACGCGGAG	CTGGTGCGCG	GCCGCCGCTA	CAACACGCAG	600
GCCACGGCTC	TCACCAAGCA	GGGCCGGCTC	GCCGTCTACC	CGTCGAGCAC	GGGCCAGGAG	660
GCCTGCGAGG	TCGCCGCCGC	GCTCGTGCTG	GAGGAGCGCG	ACTGGCTCTT	CCCCAGCTAC	720
CGGGACACCC	TCGCCGCCGT	CGCCCGCGGC	CTCGATCCCG	TCCAGGCGCT	CACCCTCCTG	780
CGCGGCGACT	GGCACACCGG	GTACGACCCC	CGTGAGCACC	GCATCGCGCC	CCTGTGCACC	840
CCTCTCGCGA	CCCAGCTCCC	GCACGCCGTC	GGCCTCGCGC ACGCCGCCCG	CCTCAAGGGC	900
GACGACGTGG	TCGCGCTCGC	CCTGGTCGGC	GACGGCGGCA	CCAGCGAGGG	CGACTTCCAC	960
GAGGCACTGA	ACTTCGCCGC	CGTCTGGCAG	GCGCCGGTCG	TCTTCCTCGT	GCAGAACAAC	1020
GGCTTCGCCA	TCTCCGTCCC	GCTCGCCAAG	CAGACCGCCG	CCCCGTCGCT	GGCCCACAAG	1080
GCCGTCGGCT	ACGGGATGCC	GGGCCGCCTG	GTCGACGGCA	ACGACGCGGC	GGCCGTGCAC	1140
GAGGTCCTCA	GCGACGCCGT	GGCCCACGCG	CGCGCGGCAG	GGGGGCCGAC	GCTCGTGGAG	1200
GCGGTGACCT	ACCGCATCGA	CGCCCACACC	AACGCCGACG	ACGCGACGCG	CTACCGGGGG	1260
GACTCCGAGG	TGGAGGCCTG	GCGCGCGCAC	GACCCGATCG	CGCTCCTGGA	GCACGAGTTG	1320
ACCGAACGCG	GGCTGCTCGA	CGAGGACGGC	ATCCGGGCCG	CCCGCGAGGA	CGCCGAGGCG	1380
ATGGCCGCGG	ACCTGCGCGC	ACGCATGAAC	CAGGATCCGG	CCCTGGACCC	CATGGACCTG	1440
TTCGCCCATG	TGTATGCCGA	GCCCACCCCC	CAGCTGCGGG	AGCAGGAAGC	CCAGTTGCGG	1500
GCCGACCTGG	CAGCGGAGGC	CGACGGGCCC	CAAGGAGTCG	GCCGATGAAG	AGAGTTGACC	1560

ATCGGGCCCC	GAGAAGCGGG CCGATGACCT CCGTTGGCCT TTGGCCGGAA GGAGCCGGGC	1620
GATGACCACC	GTTGCCCTCA AGCCGGCCAC CATGGCGCAG GCACTCACAC GCGCGTTGCG	1680
TGACGCCATG	GCCGCCGACC CCGCCGTCCA CGTGATGGGC GAGGACGTCG GCACGCTCGG	1740
CGGGGTCTTC	CGGGTCACCG ACGGGCTCGCCAAGGAGTTC GGCGAGGACC GCTGCACGGA	1800
CACGCCGCTC	GCCGAGGCAG GCATCCTCGG CACGGCCGTC GGCATGGCGA TGTACGGGCT	1860
GCGGCCGGTC	GTCGAGATGC AGTTCGACGC GTTCGCGTAC CCGGCGTTCG AGCAGCTCAT	1920
CAGCCATGTC GCGCGGGATG CGCAACGCAC CCGCGGGGCG ATGCCGCTGC CGATCACCAT	1980
CCGTGTCCCC	TACGGCGGCG GAATCGGCGG AGTCGAACAC CACAGCGACT CCTCCGAGGC	2040
GTACTACATG	GCGACTCCGG GGCTCCATGT CGTCACGCCC GCCACGGTCG CCGACGCGTA	2100
CGGGCTGCTG	CGCGCCGCCA TCGCCTCCGA CGACCCGGTC GTCTTCCTGG AGCCCAAGCG	2160
GCTGTACTGG	TCGAAGGACT CCTGGAACCC GGACGAGCCG GGGACCGTTG AACCGATAGG	2220
CCGCGCGGTG	GTGCGGCGCT CGGGCCGGAG CGCCACGCTC ATCACGTACG GGCCTTCCCT	2280
GCCCGTCTGC	CTGGAGGCGG CCGAGGCGGC CCGGGCCGAG GGCTGGGACC TCGAAGTCGT	2340
CGATCTGCGC	TCCCTGGTGC CCTTCGACGA CGAGACGGTT GTGCGCGTCG GTGCGCGGAC	2400
CGGACGCGCC	GTCGTCGTGC ACGAGTCGGG TGGTTACGGC GGCCCGGGCG GGGAGATCGC	2460
CGCGGGCATC	ACCGAGCGCT GCTTCCACCA TCTGGAGGCG CCGGTGCTGC GCGTCGCCGG	2520
GTTCGACATC	CCGTATCCGC CGCCGATGCT GGAGCGCCAT CATCTGCCCG GTGTCGACCG	2580
GATCCTGGAC	GCGGTGGGGC GGCTTCAGTG GGAGGCGGGG AGCTGATGGC CCAGGTGCTC	2640
GAGTTCAAGC	TCCCCGACCT CGGGGAGGGC CTGACCGAGG CCGAGATCGT CCGCTGGCTG	2700
GTGCAGGTCG	GCGACGTCGT GGCGATCG	2728

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 381 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Met

Thr Val Met Glu Gin Arg Gly Ala Tyr Arg Pro Thr Pro Pro 5 10 15

Pro

Ala

Trp Gin

Pro Arg 20

Thr Asp Pro

Ala 25

Pro Leu

Leu

Pro

Asp 30

Ala

Leu

Pro

His

Arg

Val

Leu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Asp

Pro

Leu

35

40

45

Leu

Leu

Arg

Arg

Leu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Gly

Arg

Arg

Tyr

Asn

50

55

60

Thr

Gin

Ala

Thr

Ala

Leu

Thr

Lys

Gin

Gly

Arg

Leu

Ala

Val

Tyr

Pro

65

70

75

80

Ser

Ser

Thr

Gly

Gin

Glu

Ala

Cys

Glu

Val

Ala

Ala

Ala

Leu

Val

Leu

85

90

95

Glu

Glu

Arg

Asp

Trp

Leu

Phe

Pro

Ser

Tyr

Arg

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

100

105

110

Val

Ala

Arg

Gly

Leu

Asp

Pro

Val

Gin

Ala

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

115

120

125

Asp

Trp

His

Thr

Gly

Tyr

Asp

Pro

Arg

Glu

His

Arg

Ile

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Cys

Thr

Pro

Leu

Ala

Thr

Gin

Leu

Pro

His

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

His

145

150

155

160

Ala

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Asp

Asp

Val

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Val

Gly

165

170

175

Asp

Gly

Gly

Thr

Ser

Glu

Gly

Asp

Phe

His

Glu

Ala

Leu

Asn

Phe

Ala

180

185

190

Ala

Val

Trp

Gin

Ala

Pro

Val

Val

Phe

Leu

Val

Gin

Asn

Asn

Gly

Phe

195

200

205

Ala

Ile

Ser

Val

Pro

Leu

Ala

Lys

Gin

Thr

Ala

Ala

Pro

Ser

Leu

Ala

210

215

220

His

Lys

Ala

Val

Gly

Tyr

Gly

Met

Pro

Gly

Arg

Leu

Val

Asp

Gly

Asn

225

230

235

240

Asp

Ala

Ala

Ala

Val

His

Glu

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Val

Ala

His

Ala

245

250

255

Arg

Ala

Gly

Gly

Gly

Pro

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Thr

Tyr

Arg

Ile

260

26S

270

Asp

Ala

His

Thr

Asn

Ala

Asp

Asp

Ala

Thr

Arg

Tyr

Arg

Gly

Asp

Ser

275

280

285

Glu

Val

Glu

Ala

Trp

Arg

Ala

His

Asp

Pro

Ile

Ala

Leu

I eu

Glu

His

290

295

300

Glu

Leu

Thr

Glu

Arg

Gly

Leu

Leu

Asp

Glu

Asp

Gly

Ile

Arg

Ala

Ala

305

310

315

320

Arg

Glu

Asp

Ala

Glu

Ala

Met

Ala

Ala

Asp

Leu

Arg

Ala

Arg

Met

Asn

325

330

335

Gin

Asp

Pro

Ala

Leu

Asp

Pro

Met

Asp

Leu

Phe

Ala

His

Val

Tyr

Ala

340

345

350

Glu

Pro

Thr

Pro

Gin

Leu

Arg

Glu

Gin

Glu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ala

Glu

355

360

365

Leu

Ala

Ala

Glu

Ala

Asp

Gly

Pro

Gin

Gly

Val

Gly

Arg

370 375 380 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: T.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 334 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

(xi) POPIS SEKVENCE:

SEQ ID

NO: 7:

Met

Thr

Thr

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Ala

Thr

Met

Ala

Gin

Ala

Leu

Thr

1

5

10

15

Arg

Ala

Leu

Arg

Asp

Ala

Met

Ala

Ala

Asp

Pro

Ala

Val

His

Val

Met

20

25

30

Gly

Glu

Asp

Val

Gly

Thr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Arg

Val

Thr

Asp

Gly

35

40

45

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Gly

Glu

Asp

Arg

Cys

Thr

Asp

Thr

Pro

Leu

Ala

50

55

60

Glu

Ala

Gly

Ile

Leu

Gly

Thr

Ala

Val

Gly

Met

Ala

Met

Tyr

Gly

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Val

Val

Glu

Met

Gin

Phe

Asp

Ala

Phe

Ala

Tyr

Pro

Ala

Phe

85

90

95

Glu

Gin

Leu

Ile

Ser

His

Val

Ala

Arg

Asp

Ala

Gin

Arg

Thr

Arg

Gly

100

105

110

Ala

Met

Pro

Leu

Pro

Ile

Thr

Ile

Arg

Val

Pro

Tyr

Gly

Gly

Gly

Ile

115

120

125

Gly

Gly

Val

Glu

His

His

Ser

Asp

Ser

Ser

Glu

Ala

Tyr

Tyr

Met

Ala

130

135

140

Thr

Pro

Gly

Leu

His

Val

Val

Thr

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Asp

Ala

Tyr

145

150

155

160

Gly

Leu

Leu

Arg

Ala

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

Asp

Pro

Val

Val

Phe

Leu

165

170

175

Glu

Pro

Lys

Arg

Leu

Tyr

Trp

Ser

Lys

Asp

Ser

Trp

Asn

Pro

Asp

Glu

180

185

190

Pro

Gly

Thr

Val

Glu

Pro

Ile

Gly

Arg

Ala

Val

Val

Arg

Arg

Ser

Gly

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Thr

Leu

Ile

Thr

Tyr

Gly

Pro

Ser

Leu

Pro

Val

Cys

Leu

210

215

220

Glu

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Arg

Ala

Glu

Gly

Trp

Asp

Leu

Glu

Val

Val

225

230

235

240

Asp

Leu

Arg

Ser

Leu

Val

Pro

Phe

Asp

Asp

Glu

Thr

Val

Val

Arg

Val

245

250

255

Gly

Ala

Arg

Thr 260

Gly

Arg

Ala

Val

Val 265

Val

His

Glu

Ser

Gly 270

Gly

Tyr

Gly

Gly

Pro 275

Gly

Gly

Glu

Ile

Ala 280

Ala

Gly

Ile

Thr

Glu 285

Arg

Cys

Phe

His

His 290

Leu

Glu

Ala

Pro

Val 295

Leu

Arg

Val

Ala

Gly 300

Phe

Asp

Ile

Pro

Tyr 305

Pro

Pro

Pro

Met

Leu 310

Glu

Arg

His

His

Leu 315

Pro

Gly

Val

Asp

Arg 320

Ile

Leu

Asp

Ala

Val 325

Gly

Arg

Leu

Gin

Trp 330

Glu

Ala

Gly

Ser

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Met Ala Gin Val 1

Leu Glu 5

Phe Lys Leu Pro Asp Leu Gly Glu 10

Gly 15

Leu

Thr

Glu

Ala

Glu

Ile

Val

Arg

Trp

Leu

Val

Gin

Val

Gly

Asp

Val

Val

*

20

25

30

Ala Ile (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 83 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

Ile

Ser

Leu

Ile

Ala

Leu

Leu

Ala

Arg

Ile

Cys

Thr

Ala

Ala

Leu

Ala

1

5

10

15

Arg

Phe

Pro

Glu

Leu

Asn

Ser

Thr

Val

Asp

Met

Asp

Ala

Arg

Glu

Val

20

25

30

•

Val

Arg

Leu

Asp

Gin

Val

His

Leu

Gly

Phe

Ala

Ala

Gin

Thr

Glu

Arg

35

40

45

»

Gly

Leu

Val

Val

Pro

Val

Val

Arg

Asp

Ala

His

Ala

Arg

Asp

Ala

Glu

50

55

60

Ser

Leu

Ser

Ala

Glu

Phe

Ala

Arg

Leu

Thr

Glu

Ala

Ala

Arg

Thr

Gly

65

70

75

80

Thr Leu Thr /Co - <?ζ

Claims (19)

1. Ρ A Τ Ε NTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný segment DNA kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy organismu rodu Streptomyces, kterýžto segment DNA obsahuje sekvenci DNA SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelovou variaci této sekvence.
2. 2. Izolovaný segment DNA podle nároku 1, kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy organismu Streptomyces avermitilis.
3. 3. Izolovaný segment DNA podle nároku 1, který dále obsahuje oblast DNA regulující expresi komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.
4. 4. Izolovaný segment DNA podle nároku 2, který dále obsahuje oblast DNA regulující expresi komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.
5. 5. Segment DNA, který je podmnožinou segmentu DNA podle nároku 1 a je mu funkčně ekvivalentní.
6. 6. Rekombinantní DNA obsahující segment DNA podle nároku 1.
7. 7. Hostitelská buňka se zavedenou rekombinantní DNA podle nároku 6.
8. 8. Plasmid obsahující rekombinantní DNA podle nároku 6.
9. 9. Segment DNA zvolený ze souboru zahrnujícího pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 a pCD577, kteréžto segmenty DNA mají genomovou restrikční mapu znázorněnou na obr. 3.
10. 10. Hostitelská buňka se zavedeným segmentem DNA podle nároku 9.
11. 11. Segment DNA podle nároku 1 obsahující oblast DNA, která reguluje transkripci nebo translaci sekvence DNA DNA SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelovou variaci této sekvence.,
12. 12. Geny pro komplex rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasu obsažené v segmentu DNA podle nároku 9.
13. 13. Způsob výroby přírodního avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byl zvýšen počet kopií genů kódujících komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.
14. 14. Způsob výroby přírodního avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla zvýšena exprese genů kódujících komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy manipulací nebo nahrazením genů zodpovědných za regulaci této exprese.
15. 15. Způsob výroby nového avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla snížena nebo odstraněna exprese komplexu rozvětvená a-keto- 67 kyselina dehydrogenasy delecí, inaktivaci, nahrazením nebo jinou manipulací genů zodpovědných za tuto expresi.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t i m , že geny, které jsou vypuštěny, inaktivovány, nahrazeny nebo jinak manipulovány, jsou geny enhanceru, inhibitoru, aktivátoru nebo represoru.
17. 17. Způsob výroby nového avermektinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byly vypuštěny nebo inaktivovány geny zodpovědné za expresi komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.
18. 18. Segment DNA obsahující sekvenci DNA která je podmnožinou sekvence DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelové variaci této sekvence a která je schopna se hybridizovat s příslušnou sekvencí SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:

    2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo allelovou variací této sekvence, pokud se jí použije jako próby, nebo která je schopna amplifikovat celou tuto sekvenci nebo její část, pokud se jí použije jako primeru při řetězové reakci působením polymerasy.
19. 19. V podstatě purifikovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 9.