KR100221385B1 - 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로 부터의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 유전자 - Google Patents

스트렙토마이세스 아베르미틸리스로 부터의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 유전자 Download PDF

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디. 제이. 우드
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    • C12Y102/04004—3-Methyl-2-oxobutanoate dehydrogenase (2-methylpropanoyl-transferring) (1.2.4.4), i.e. branched-chain-alpha-ketoacid dehydrogenase

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 DNA 서열, 및 이러한 서열의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 발효를 통한 천연 아베르멕틴의 생산을 향상시키는 방법 및 신규한 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
스트렙토마이세스 아베르미틸리스로 부터의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 유전자
[발명의 배경]
본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 미생물의 측쇄 알파-케토산 데이하이드로게나제 복합체를 암호화하는 신규한 DNA 서열, 및 이러한 서열의 발현에 의해 생산되는 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연 아베르멕틴(avermectin)의 생산을 향상시키고 발효를 통해 신규한 아베르멕틴을 생산시키는 신규한 방법에 관한 것이다.
다수의 약품들이 미생물들에 의해 생산된다. 이러한 미생물들중에서, 스트렙토마이에스 속-그람 양성 토양균의 그룹-의 일원들이 치료학적으로 유용한 항생물질의 90%이상을 생산하는 것으로 상당한 주목을 받아왔다. 스트렙토마이세테스(Streptomycetes)는 항생물질 생합성 유전자를 단리하고, 신규한 유도체들 또는 하이브리드 화합물들을 생성시키고, 조절 유전자들을 단리하고 1차 및 2차 대사 모두와 관련된 조절 기작을 조사하기 위하여 제조합 DNA 클로닝 기법을 적용시키는 집중적인 연구의 초점이다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis; 이하, 에스.아베르미틸리스라고 약칭하기도 함)는 8개의 독특하지만 서로 밀접하게 연관된 아베르멕틴이라 칭하는 구충용 폴리케타이드 화합물을 생산한다. 상기 에스.아베르미틸리스에 의해 생산된 아베르멕틴 복합체는 4개의 주요 성분인 A1a, A2a, B1a 및 B2a 와, 4개의 보조 성분인 A1b, A2b, B1b 및 B2b를 갖는다. 상기 다양한 성분들의 구조를 하기에 나타낸다:
상기 아베르멕틴 폴리케타이드 구조는 7개의 아세테이트, 5개의 프로피오네이트 분자, 및 하나의 알파-측쇄 지방산 분자(이것은 S(+)-2-메틸부티르산이거나 이소부티르산이다)로부터 유도된다. 상기 "A" 또는 "B"의 표시는 5번 치환체가 각각 메톡시 또는 하이드록시인 아베르멕틴을 나타낸다. "1"이라는 숫자는 이중 결합이 22-23번 위치에 존재하는 아베르멕틴을 나타내고, "2"라는 숫자는 22번 위치에 수소를 갖고 23번 위치에 하이드록시를 갖는 아베르멕틴를 나타낸다. 마지막으로, C-25는 2개의 가능한 치환체를 갖는다. 즉, 2급-부틸 치환체(L-이소류신으로부터 유도됨)가 아베르멕틴 "a"시리즈에 존재하고, 이소프로필 치환체(L-발린으로부터 유도됨)가 아베르멕틴 "b"시리즈에 존재한다(참조 문헌:[Fisher, M.H. 및 Mrozik, H., 1984, "Macrolide Antibiotics", Academic Press, chapter 14]).
"천연" 아베르멕틴이란 25번 치환체가 상기 언급한 바와 같이 이소프로필 또는 2급-부틸인, 에스.아베르미틸리스에 의해 생산된 아베르멕틴을 의미한다. 25번 기가 이소프로필 또는 2급-부틸이 아닌 아베르멕틴을 본원에서는 신규 또는 비-천연 아베르멕틴이라 칭한다.
CoA 형태의 이들 알파-측쇄 지방산으로의 대사 경로중 하나는 측쇄 아미노산 트랜스아미나제 반응에 이은 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 반응을 통해서이다. (한편으로, 측쇄 지방 아실-CoA 유도체는 새로운 합성에 의해 생산된 측쇄 알파-케토산으로부터 생성될 수 있다). 상기 대사 경로를 하기에 도시한다.
상기 마지막에 언급한 효소에서 측쇄 알파-케톤산 데하이드로게나제(Branched-Chain alpha-Ketoacid Dehydrogenase; BCKDH)활성을 찾을 수 없는 에스.아베르미틸리스의 돌연변이체가 이미 단리되었다(하프너(Hafner)등, 1988, 유럽 특허원 제 883003535, 공개 번호 제 0284176호). 상기 변이체는14C-1 표지된 2-옥소이소카프로산 기질(류신 동족체)로 부터의14CO2생산 부재에 대한 스크린 조사에서 에스.아베르미틸리스 균주 ATCC 31272의 표준 화학 돌연변이에 따라 단리되었다. 상기 변이체는, 이소프로필 또는 2급-부틸(S-형)기를 갖는 알파-측쇄 지방산 또는 전구체를 상기 변이체가 배양되는 배지에 가하는 경우를 젝외하고는 천연 아베르멕틴을 합성할 수 없다. 상기 변이체는 또한 적합한 또다른 카복실산, 예를들어 사이클로헥산 카복실산(CycliHexane Carboxylic acid; CHC) 또는 그의 전구체를 함유하는 영양 배지에서 수성의 통기 조건하에서 배양될 때 신규 또는 비-천연 아베르멕틴을 생산할 수 있다.
에스.아베르미틸리스를 클로닝 하기 위해서는 BCKDH가 매우 바람직하다. 재조한 DNA 기법을 통한 상기 유전자의 조작은 천연 및 신규 아베르멕틴의 생산을 촉진시킬 것이다. 몇몇 균주에 대해서, 천연 아베르멕틴의 증가된 역가는 상기 BCKDH 유전자의 복제수를 증가시킴으로써 기대된다. 또한, BCKDH 활성이 유전자 치환에 의해 영구적으로 소실되거나 또는 변형된 비가역적으로 차단된 bkd 균주의 생산은 이전에 언급한 바와 같이 화학적 돌연변이에 의해 수득된 시중의 bkd 변이체에 대해 개선된 편법일 수 있다.
알파-케토산 데하이드로게나제 다중효소 복합체-측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제(BCKDH) 복합체, 피루베이트 데하이드로게나제(Pyruvate DeHydrogenase; PDH) 복합체, 및 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제(alpha-KetoGlutarate DeHydrogenase; KGDH)복합체는 CO2를 방출하고 상응하는 아실-CoA 및 NADH를 생성시키는 측쇄 알파-케토산, 피루베이트 및 알파-케토글루타레이트 각각의 산화적 데카복실화를 촉진시킨다.(Perham, R.N., 1991, Biochemistry, 30: 8501-8512). 상기 각 복합체들은 3개의 상이한 촉매 효소: 데카복실라제(E1), 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라제 트랜스아실라제(E2) 및 디하이드로리포아미드 데하이드로게나제(E3)로 이루어진다.
측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제(BCKDH)는 3개의 작용성분인, 데카복실라제(E1), 트랜스아실라제(E2) 및 리포아미드 데하이드로게나제(E3)로 구성된 다중효소 복합체이다. 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginisa) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 정제된 복합체들은 4개의 폴리펩티드로 구성된다. 상기 정제된 포유동물의 복합체들은 또한 4개의 폴리펩티드인 E1알파, E1베타, E2 및 E3로 구성된다. 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체는 피루베이트 및 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 활성을 둘다 갖는 바실러스 서브틸리스로부터 단리되었다. 이러한 이중 작용 복합체는 피루베이트를 산화시키고 세포막 인지질에 대해 측쇄 지방산을 제공한다.
원핵성 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 유전자의 클로닝은 슈도모나스 및 바실러스에 대해서 보고되어 있으나, 스트렙토마이세스에 대해서는 보고되어 있지 않다. 상기 시스템들에서, BCKDH를 암호화하는 유전자가 오페론으로 모여있음이 밝혀졌다. 슈도모나스 푸티다의 BCKDH 복합체의 유전자가 클로닝되었으며 상기 영역의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다(Sykes et al., 1987, J. Bacteriol, 169:1619-1625, 및 Burns et al., 1988, Eur. J. Biochem, 176:165-169, 및 176:311-317). E1알파의 분자량은 45289이고, E1베타는 37138이고, E2는 45134이고, E3는 48164이다. 이들 4개의 유전자들은 하기 순서로 모여있다: E1알파, E1베타, E2및 E3. 노던 블럿 분석은 상기 4개 유전자들의 발현이 단일 mRNA 로부터 발생하고 이들 유전자는 오페론을 구성함을 나타내었다. 슈도모나스 bkd 유전자의 구조적인 발현(constitutive expression)을 허용하는 E1알파 암호화 영역의 출발점에 바로 선행하여 전형적인 원핵성 컨센서스(consensus) 프로모터가 존재한다. 상기 E1베타 암호화 영역의 개시 코돈은 E1알파 개방 판독 프레임(Open Reading Frame ; ORF)의 말단으로부터 하향으로 단지 40번재 뉴클레오티드에 위치한다. 대조적으로, E1베타와 E2 ORF간에는 유전자간 간격이 없는데, 그 이유는 상기 E1베타 ORF에 대한 정지 코돈이 E2 ORF의 개시 코돈에 바로 선행하는 코돈이기 때문이다. E2와 E3 ORF간의 유전자간 간격은 단지 2개의 뉴클레오티드로 감소된다. 따라서, 슈도모나스 bkd 유전자는 긴밀하게 연결되어 있다. 유사하게, 바실러스 서브틸리스 BCKDH/PDH 이중 복합체를 암호화하는 오페론이 클로닝되었다(Hemila et al., 1990, J. Bacteriol., 172:5052-5063). 상기 오페론은, 슈도모나스 bkd 군의 E1알파, E1베타, E2 및 E3 소단위와 매우 유사한 것으로 나타난, 크기 42,36, 48 및 50킬로달톤(kDa)의 단백질 4개를 암호화하는 4개의 ORF를 함유한다. 최근에, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로 부터의 상기 이중 BCKDH/PDH 다중효소 복합체의 E1성분의 알파 및 베타 소단위를 암호화하는 유전자가 또한 클로닝되었으며 서열화되었다(상기 알파 및 베타 소단위의 추정상 분자량은 대략적으로 각각 41,000 및 35,000이다)(Hawkins et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191:337-346).
또한, 다수의 친핵성(인간, 소 및 쥐) E1알파 및 베타 BCKDH 소단위들의 서열이 개시되었다. 최근에, 다수의 종들로부터의 PDH 및 BCKDH 복합체의 E1알파 및 E1베타 성분 모두에 대해 공지된 모든 공개된 서열들의 아미노산 서열 비교가 컴퓨터 분석에 의해 수행되었다(Wexler et al., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). 흥미롭게도, 상기 알파 및 베타 소단위의 다수 영역들이 지금까지 개시된 모든 PDH 뿐아니라, 원핵 및 진핵성 BCKDH 복합체에서도 고도로 보존되는 것으로 확인되었다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로 부터의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 유전자의 클로닝을 개시한다. 상기 신규 유전자들을 2개의 분사 유전학 기법, 즉 DNA 폴리머라제 쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 및 유사성 검침(homology probing)의 조합을 사용하여 클로닝하였다. 유사성 검침은 cDNA 또는 게놈라이브버리를 단백질의 아미노산 서열에 상응하는 방사성-표지된 합성올리고뉴클레오티드 탐침(probes)을 사용하여 스크리닝함을 포함한다. 불행하게도, 상기 기법에는 몇가지 제한이 있다. 이들중 하나는 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 변질(degeneracy)에 대한 다소 엄격한 규제이다. 또한, 하이브리드화의 스크리닝은 덜 제한되게 수행되며, 따라서 거짓 양성의 수가 종종 많다. 이러한 올리고뉴클레노티드 하이브리드화에 대한 몇가지 제한을 극복하기 위해서, DNA 폴리머라제 쇄 반응(PCR)과 관련되고 탐침으로서 고도로 변질된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있는 다양한 유사성 검침법이 최근 개발되었다. 상기 방법은 단지 암호화된 단백질의 2개의 짧은 영역(대략 7 내지 10개의 길이의 아미노산)의 아미노산 서열을 알필요가 있을 뿐이다. 각각의 펩티드 서열에 상응하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 상기 반응에 프라이머로서 사용한다. 각각의 프라이머를, 기지의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 모든 가능한 코돈 조합들을 함유하는 충분히 변질된 올리고뉴클레오티드의 혼합물로서 사용할 수 있다. 증폭을 위한 주형은 게놈 DNA 및 플라스미드 라이브러리의 대단히 감긴(supercoiled) 형태를 비롯한 다수의 DNA 공급원들중 임의의 것일 수 있다. 최근 공개된 문헌들중 다수의 보고서들은 상기 폴리머라제 쇄 반응과, 다수 종들이 유전자 동정을 위한 유사성 검침법의 조합의 유용성을 입증하였다.
[용어 풀이]
본원 전체에 걸쳐 사용된 기술 용어들은 분자 유전학 분야의 숙련가들에게 잘 공지되어 있다. 상기 용어들의 정의를 분자 생물한 분야에 기증된 다수의 교과서들, 예를들어 문헌[Dr. Benjamin Lewin, "Genes", Second Edition, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1985]에서 알 수 있다. 상기 문헌에 흔히 사용되는 용어들은 하기와 같이 정의된다;
항생제 : 세균 세포의 증식을 억제하는 화학적 약제. 제조합 세균 세포를 선별하는데 사용된다.
항생제 내성 유전자 : 특정 항생제에 대해 본래부터 민감한 숙주 세포내에 도입시켰을 때 상기 항생제에 대한 내성을 함유하는 DNA 서열. 항생제 마커로서도 알려져 있다.
박테리오파아지 : 세균을 감염시키는 바이러스.
cRNA : DNA에 상보적인 안딜가닥 RNA로, 생체외 전사에 의해 상기 DNA 로부터 합성됨.
염색체 : 다수의 유전자를 운반하는 게놈의 분리된 단위.
클론 : 단일 원종과 동일한 다수의 세포 또는 분자.
클로닝 벡터 : 외래 DNA를 삽입시켜 클로닝할 수 있는 임의의 플라스미드로, 형질전환시, 외래 DNA를 숙주 세균 세포내로 운반한다.
CoA : 조 효소 A.
결합성(Cohesive) 말단 서열(Cos) : 생체의 패키징을 허용하는 박테리오 파아지 람다로부터 유도된 DNA 서열.
코스미드 : 박테리오파아지 람다 cos 부위가 삽입된 플라스미드; 결과적으로, 상기 플라스미드 DNA(외래 DNA 삽입물을 운반함)를 파아지 외피에서 생체외 패키징할 수 있다.
달톤 : 하나의 수소 원자에 상응하는 분자 치수와 관련하여 통상적으로 사용되는 질량의 단 뒤.
DNA 연결(ligation) : 2개의 DNA 단편을 화학적 결합을 형성시켜 연결함.
진핵 세포 : 세포막으로 둘러싸인 핵을 함유하는 고등 유기체 세포.
유전자 군(cluster) : 염색체상에서 물리적으로 가까운 유전자들의 그룹.
게놈 : 전체 염색체 셋트. 개별적인 유전자들 모두의 전체 합.
하이브리드화, 콜로니 하이브리드화 : 삽입된 DNA가 일부 특정 서열과 유사한 키메라 벡터를 운반하는 세균 콜로니들을 동정하는데 사용되는 기법.
kb : DNA 또는 RNA의 1,000개 염기쌍에 대한 약어.
NADH : 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드.
링커 : 하나이상의 제한 효소에 대한 표적 부위를 함유하는 짧은 합성 이중 올리고데옥시뉴클레오티드. 이것을 벡터에 가하여 신규한 폴리링커 또는 다중 클로닝 부위(Multiple Cloning Site ; MCS)를 생성시킨다.
뉴클레오티드 : 헥산의 구성 블록, 또는 단량체성 단위.
올리고뉴클레오티드 : 단쇄의 뉴클레오티드.
오페론 : 구조 유전자, 조절 유전자, 및 조절 유전자 산물(들)에 의해 인식된 DNA의 조절 요소를 비롯한, 세균 유전자 발현 및 조절의 완전한 단위.
플라스미드 : 자율적인 자기-복제성의, 비염색체성 환상 DNA.
플라스미드 복제수 : 모든 숙주 염색체에 대해 세균내에 유지되는 플라스미드 분자의 수.
프라이머 : DNA 의 한가닥에 대해 쌍을 이루고, DNA 폴리머라제가 데옥시리보뉴클레오티드 쇄의 합성을 개시시키는 유리 3'-OH 말단을 제공하는 DNA또는 RNA의 짧은 서열.
원핵 세포 : 대부분의 미생물을 포함한 작은, 비교적 단순한 세포.
프로모터 : 전사의 개시를 책임지고 있는 DNA 영역.
제한 효소 : DNA의 특이적인 짧은 서열을 인식하고 이를 절단하는 효소.
제한 인식 서열 : 특정 제한 효소에 의해 구체적으로 인식되는 DNA 서열. 또한 표적 부위로서도 알려짐.
셔틀 벡터 : 하나이상의 선택적인 숙주[예 : 이. 콜라이(E. coli) 및 스트렙토마이세스)에서 복제가능한 이작용성 클로닝 벡터.
써던 블롯팅 : 변성된(denatured) DNA를 한천겔에서 니트로셀루로즈 필터(여기에서 상기 DNA는 상보적인 핵산 탐침과 하이브리드를 형성할 수 있다)로 옮기는 공정.
서브클로닝 : 클로닝된 DNA 단편을 한 유형의 벡터로부터 또다른 유형의 벡터로, 예를들어 재조합 코스미드에서부터 플라스미드로 옮기는 것. 이어서 새로운 재조합 플라스미드를 적합한 숙주 세포 내로 형질전환시켜 서브클론 균주를 생성시킨다.
전사 : DNA 주형으로부터 RNA를 합성하는 것.
세균 세포의 형질전환 : 첨가된 DNA의 통합(incorporation)에 의해 새로운 유전자 마커가 획득되는 것을 나타냄.
[발명의 개요]
본 발명은 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 단리된 DNA 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기와 같은 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체의 발현을 조절하는 DNA 영역을 추가로 포함하는, 상술한 바와 같은 단리된 DNA 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화 하는 단리된 DNA 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 후술하는 바와 같은 서열 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3, 서열 식별 번호 4 또는 서열 식별 번호 5의 DNA 서열, 또는 이러한 서열의 대립 유전자 변종(alleleic variation)을 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 전술한 DNA 단편의 일부분을 포함하는 부분집합(subset)이며 이와 기능적으로 동등한 DNA 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3, 서열 식별 번호 4 또는 서열 식별 번호 5의 DNA 서열, 또는 이러한 서열의 대립 유전자 변종을 포함하는 재조합 DNA ; (b) 이러한 재조합 DNA를 포함하는 플라스미드; 및 (c) 이러한 재조합 DNA를 포함하고 있는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 정의하는 바와 같은 pCD528, pCD545, pCD574, pCD550, pCD559 및 pCD577로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 단편에 함유된 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체의 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 또는 천연 아베르멕틴의 생산에 적합한 조건 및 발효 배지에서, 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 유전자의 복제수를 증가시킨 에스.아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 천연 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 천연 아베르멕틴의 생산에 적합한 조건 및 발효 배지에서, 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화는 유전자의 발현을 이러한 발현을 조절하는 유전자의 치환(replacement)또는 다른 조작(manipulation)에 의해 향상시킨 에스.아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 천연 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 신규한 아베르멕틴의 생산에 적합한 조건 및 발효 배지에서, 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체의 발현을 예를들어 상기 복합체를 발현하는 유전자의 조작(예 : 결실, 불활성화 또는 치환)에 의해 감소시키거나 또는 배제시킨 에스.아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 신규한 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3, 서열 식별 번호 4 또는 서열 식별 번호 5의 DNA 서열, 또는 상기 서열의 대립 유전자 변종을 포함하는 DNA단편에 관한 것이다.
본 발명은 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3, 서열 식별 번호 4 또는 서열 식별 번호 5의 DNA 서열, 또는 상기 서열의 대립 유전자 변종의 일부분을 포함하는 부분집합이며, 탐침으로 사용시 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3, 서열 식별 번호 4 또는 서열 식별 번호 5의 DNA 서열, 또는 이러한 서열의 대립 유전자 변종 각각과 하이브리드를 형성할 수 있거나, 또는 폴리머라제 쇄 반응 프라이머로서 사용시 상기 서열의 전부 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 식별 번호 6, 서열 식별 번호 7, 서열 식별 번호 8 또는 서열 식별 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 에스.아베르미틸리스 E1-알파 BCKDH 유전자의 단편을 클로닝하는데 사용되는 폴리머라제 쇄 반응(PDH) 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다. 상기 각각의 올리고데옥시뉴클레오티드에 의해 암호화된 추론된 아미노산 서열은 상응하는 DNA 서열위에 나타내었다. 화살표는 증폭의 방향을 가리킨다. 제1(a)도는 우향 프라이머이고, 제1(b)도는 좌향 프라이머이다.
제2도는 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 서열의 비교이다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Sa)PCR-클로닝된 CD503 게놈 단편, 바실러스 스테아로써모필러스(Bs), 슈도모나스 푸티다(Pd) 및 호모사피엔스(Homo sapiens)(Hs)에 대해 추론된 아미노산 서열을 정렬시켜 나타내었다. 수직 표시는 아미노산의 정체를 표시한다. 클로닝에 사용된 우향 및 좌향 PCR 프라이머들에 상응하는 서열들의 위치를 지시한다(각각 좌측 상부 및 우측 상부).
제3도는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 bkd 유전자 군에 대한 게놈 제한 지도, 위치 및 서브클론을 도시한다. 상기 지도아래의 검은 상자는 PCR을 사용하여 클로닝된 초기 E1-알파 특이적인 에스.아베르미틸리스 CD503 게놈 단편의 위치 및 배향을 가리킨다. 게놈 서브클론(pGEM-3Z의 유도체)를 나타낸다. E1-알파(E1a), E1-베타(E1b) 및 E2 BCKDH 소단위를 암호화하는 bkd 구조 유전자의 위치 및 구성을 또한 나타낸다. 동정된 개방 판독 프레임(상자로 표시함)의 극성은 왼쪽에서 오른쪽이다. 약어 : B. BamH1; E, EcoR1; K, Kpn1; Bg, Bg1Ⅱ; 및 S, SphI.
제4(a),4(b),4(c),4(d),4(e) 및 4(f)도는 E1-알파, E1-베타 및 E2(부분) bkd 개방 판독 프레임(ORF)을 함유하는 2,728-bp의 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 단편의 뉴클레노티드 서열 및 추론된 번역 산물을 도시한다. E1-알파 ORF는 상기 서열의 403번에서 1548번 위치로 연장된다. E1-베타 ORF는 1622-2626위치로 연장되고, E2 ORF는 2626위치에서 출발한다. 뉴클레오티드를 상기 서열 라인의 상부에 숫자로 표시한다. 정지 코돈은 별표(*)로 표시한다. 가능한 쉰-달가노(Shine-Dalgarno) 리보조옴 결합 서열은 밑줄을 그어 표시한다. BamHI 제한 인식 서열은 상자로 표시하였다.
제5도는 E2 bkd ORF의 일부를 함유하는 0.8-kb의 Bg1Ⅱ-SphI 에스.아베르미틸리스 게늄 DNA 단편(pCD539)의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 번역 산물을 도시한다. 251bp가 Bg1Ⅱ부위(상자로 표시함)로부터 출발하여 서열화되었다. 뉴클레오티드를 상기 서열라인의 상부에 숫자로 표시하였다.
제6도는 이.콜라이중의 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 이종 발현을 위한 pT7 유도체의 제작에 사용된 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 돌연변이 프라이머(우향) 및 일반 프라이머(좌향)의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. PCR 프라이머들을 사용하여 E1-알파 또는 E1-베타 에스.아베르미틸리스 bkd ORF(프라이머 쌍, 각각 55:31 및 56:30)의 번역 개시 코돈에 NdeI 제한 부위를 도입시켰다. 각 돌연병이성 올리고데옥시뉴클레오티드에 의해 암호화된 추론된 아미노산 서열을 상응하는 DNA 서열위에 나타내었다. 제한 인식 서열을 나타내었다. 화살표는 증폭 방향을 지시한다. 제6(a)도는 우향의 돌연변이성 프라이머이고, 제6(b)도는 좌향의 돌연변이성 프라이머이다.
[발명의 상세한 설명]
에스.아베르미틸리스 bkd 유전자를 클로닝하고, 에스.아베르미틸리스 BCKDH 다중효소 복합체를 암호화하는 유전자의 1차 구조를 결정하기 위한 신규한 방법을 하기에 개시한다.
먼저, "우향" 및 "좌향"이라 칭하는 2개의 PCR 프라이머(제1도)를 다양한 종들의 다수 배열의 추론된 E1-알파 BCKDH 펩티드 서열로부터 동정되고 문헌으로부터 입수할 수 있는 보존된 영역들에 따라 구상하였다. 대략 0.2kb 길이의 PCR 산물을 상기 우향 및 좌향 프라이머들 둘다를 사용하여 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 의 증폭에 의해 검정하였다. 이어서 상기 PCR-증폭된 DNA 단편을 이.콜라이 벡터 pGEM-3Z내로 클로닝시켜 재조합 플라스미드 pCD503을 제작하였다. 후속적으로 플라스미드 pCD503을 이.콜라이 DH5-알파 컴피턴트(competent) 세포내로 형질전환시켰다. 하나의 형질전환체를 CD503 균주로서 표시하였다. 클로닝된 DNA 단편 CD503의 DNA 서열화는 E1-알파 BCKDH 소단위와 매우 유사한 추론된 펩티드를 갖는 개방 판독 프레임의 존재를 나타냈다(제2도). 이어서 클로닝된 CD503 게놈 DNA 단편을 탐침으로서 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 에스.아베르미틸리스 염색체 라이브러리를 스크리닝하였다. 4개의 코스미드클론, 즉, CD518,CD519,CD520 및 CD521을 동정하였다. 제한 및 써던 블롯 분석은 상기 4개의 클론이 중복되는 게놈 단편을 운반함을 보였다. 서브클로닝된 게놈 DNA 단편으로 부터의 네스트(nested) 결실의 DNA 서열화(실시예 8에 충분히 개시되어 있음)는 서열 CD503이 완전한 bkd 유전자 군의 일부임을 입증하였다. 클로닝된 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자는 대략 15kb 길이의 염색체 영역을 포함한다(제3도). DNA 서열 분석은 하기와 같이 구성된 군으로서 배열된 추정적인 전사 프로모터 서열 및 bkd 구조 유전자의 존재를 나타내었다; 프로모터 서열, E1-알파, E1-베타 및 E2 개방 판독 프레임(제4도 및 제5도).
마지막으로, 완전한 에스.아베르틸리스 bkd 유전자 군을 이.콜라이 숙주에서의 발현에 대해 강력한 에스케리키아 콜라이 T7 프로모터의 하향으로 클로닝시켰다. 유사하게, E1-알파 및 E1-베타 개방 판독 프레임(ORF)을 또한 상기 T7 프로모터와 별도로 또는 함께 하향으로 클로닝하고 각각의 구조물을 발현에 대해 시험하였다. 상기 E1-알파 및 E1-베타 ORF의 ATG 번역 개시점에 독특한 NdeI 제한 부위를 도입시키는데 사용된 신규한 PCR 돌연변이 프라이머를 실시예 9에 충분히 개시하였다(또한 제6도 참조). 이중 플라스미드 T7 발현 시스템 연구는 CD503-유도된 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자 군의 적어도 2개의 개방 판독 프레임(E1-알파 및 E1-베타)이 이.콜라이에서 발현시 완전히 번역가능함을 입증하였다. 또한, BCKDH 복합체의 E1 성분을 구체적으로 분석하기 위한 효소 분석으로, 2개의 재조합 이.콜라이 클론-bkd 유전자 군 전체를 운반하는 하나와, E1-알파 및 E1-베타 ORF를 함께 운반하는 다른 하나-이 E1 BCKDH-특이적인 효소 활성을 가짐을 결론적으로 확인하였다(표 1).
본 발명은 아베르멕틴-생산자인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 bkd 유전자를 단리함을 개시한다. 큰 스트렙토마이세스 게놈(약 104kb)은 에스케리키아 콜라이의 게놈보다 2배이상 크다. 스트렙토마이세스 게놈은 사실상 관찰된 상한선에 가까운 대단히 높은 구아노신 + 시토신(G+C) 함량(평균 73% 이하, 일부 영역은 ＞90%)을 갖는 DNA 로 구성된다. 이러한 독특한 특징은 스트렙토마이세스-특이적인 재조합 DNA 기법의 개발에 필수적이다. 이러한 노력의 예들을 1993년 4월 16일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/048,719호 및 1993년 3월 18일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/032,925호에서 찾을 수 있다. 상기 특허원들은 본원에 그 내용 전부가 참고로 인용되어 있다.
본 발명의 상기 목적에 대해 특히 최적인 기타의 기법들, 예를들어 PCR 게놈 DNA 증폭, 네스트 결실의 생산, DNA 서열화 및 이.콜라이에서 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 이종 발현을 실시예 부분에서 충분히 상세하게 개시한다.
에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 클로닝과 관련된 실험 단계들 및 수득된 결과를 하기에 충분히 개시한다;
(a) PCR 프라이머의 결합을 위한 후보 부위로서 작용할 수 있는 E1-알파 BCKDH 펩티드 소단위의 보존된 영역의 동정
인간(Fisher et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:3448-3453), 래트(Zhang et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:15220-15224), 슈도모나스 푸티다(Sokatch et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176:311-317) 및 바실러스 스테아로써모필러스(Perham et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191:337-346)로부터 4개의 E1-알파 BCKDH 펩티드 서열을 정렬시켜 상응하는 PCR 프라이머를 구상하기 위한 후보 서열로서 작용할 수 있는 보존된 영역들을 동정하였다. 원핵 및 진핵 BCKDH 복합체 모두에 고도로 보존된 E1-알파 소단위의 영역들을 동정하기 위한 컴퓨터 분석을 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지(미합중국 위스콘신주 마디슨 소재)로부터 라인업 및 프리티 프로그램(LineUp nad Pretty programs)을 사용하여 수행하였다. 상기 4개의 E1-알파 BCKDH 펩티드들의 다중 정렬은 다수의 연장된 유사 영역들을 나타내었다(문헌[Wexler, I.D. et al., 1991. FEBS Letters, 282:209-213]참조). 인간 E1-알파 아미노산 182-229와, 포스포릴화 부위 1 및 2를 함유하는 아미노산 245-289사이에 걸쳐 있는 영역사이에 위치한 티아민 피로포르페이트 결합 모티프(Perham et al., 1989, FEBS Letters, 255:77-82)가 상기 분석된 4개의 E1-알파 BCKDH 펩티드 모두에서 현저하게 보존되었다. 또한, 아미노산 291-307사이에 위치한 매우 유사한 상술한 영역이 존재하였다. 상기 영역을 알파 및 베타 소단위를 모두 갖는 알파-케토산 데하이드로게나제에 대해 독특한 것으로 보이며, 이.콜라이 PDC E1 또는 이.콜아이 E1 성분, 및 효모 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제 복합체(상기는 단지 하나의 E1 폴리펩티드로만 구성된 이량체이다)중의 어떠한 서열과도 유사하지 않다. 상기 언급한 이유들 때문에, 소단위 상호작용의 역할을 하는 상기 아미노산 291-307사이에 위치한 영역의 유사성이 제시되었다(Patel et al., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). PCR 프라이머에 대해 선택된 보존된 영역들은 인간 E1-알파 BCKDH 단백질의 암호화된 아미노산 잔기 192 내지 200, 및 370 내지 376을 구상한다.
(b) PCR 프라이머로서 사용되는 E1-알파 BCKDH 보존 영역에 따라 유도된 신규 올리고뉴클레오티드의 구상
이미 논의한 바와 같이, E1-알파 BCKDH 소단위의 2개의 보존된 영역들을 다중 배열 연구로부터 선별하였다. 우향 PCR 프라이머(제1도)를 E1-알파 BCKDH 소단위의 대표적인 모델로서 사용된 인간 E1-알파 BCKDH 소단위의 아미노산 192-200을 함유하는 영역에 따라 구상하였다. 상기 아미노산은 티아민 피로포스페이트 결합 모티프 내에 위치한다. 좌향 PCR 프라이머(제1도)를 E1-알파 BCKDH 소단위의 아미노산 370-376을 함유하는 영역에 따라 구상하였다. 상기 아미노산 서열은 상기 펩티드의 C-말단 영역 근처에 위치한다. 스트렙토마이세스 유전자 코돈 지정을 사용하였다(F. Wright 및 M.J.Bibb, 1992: Gene, 113:55-65). 각 프라이머의 5'-말단에 제한 효소 인식 서열(우향 프라이머에서는 EcoRI, 좌향 프라이머에서는 XbaI)이 존재하여 PCR 산물의 클로닝을 용이하게 만든다.
상기 우향 PCR 프라이머의 완전한 서열은 다음과 같다:
상기 좌향 PCR 프라이머의 완전한 서열은 다음과 같다:
E1-알파 bkd 유전자와 유사하지 않고 클로닝 목적의 프라이머내에 포함된 서열을 밑줄로 표시하였다(또한 제1도 참조).
(c) 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 단편의 PCR 증폭
에스.아베르미틸리스 게놈 DNA를 높은 GC 함량을 갖는 DNA에 적합한 반응 조건을 사용하여 효소적으로 증폭시켜 스트렙토마이세테스 DNA를 효율적이고 특이적으로 증폭시켰다(실시예 2참조). PCR을 상술한 프라이머 조합을 사용하여 수행하였다(우향 프라이머, 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3', 및 좌향 프라이머, 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'). 상기 증폭산물을 한천 겔 전기영동법에 의해 크기별로 분별시켰다. 상술한 PCR 조건하에서, 상기 프라이머 조합의 사용시 단일 DNA 밴드(대략 250염기쌍 길이)가 검출되었다.
(d) 에스케리키아 콜라이 클로닝 벡터내로의 증폭된 게놈 DNA 단편의 클로닝 및 후속적인 이.콜라이 숙주내로의 형질전환
이전에 언급한 바와 같이, EcoRI 제한 부위를 클로닝의 편의성을 위해 우향 PCR 프라이머내에 통합시켰고, XbaI 제한 부위는 좌향 프라이머의 5'-말단에 존재하였다. 그러나, 삽입 벡터 및 클로닝 벡터 모두가 EcoRI 및 XbaI로 절단된 연결 공정을 사용함으로써 0.25kb PCR 단편을 클로닝시키려는 시도는 성공적이지 못했다. 따라서, PCR 단편에 블런트 말단을 생성시키는 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편의 사용을 포함한, 상기 0.25kb PCR 단편의 클로닝을 위한 또다른 접근방법을 시험하였다. 상기 블런트 말단화된 단편을 블런트-말단화된, SmaI-선형화된 이.콜라이 벡터(pEGM-3Z[f+])내에 삽입시킨 후에 단일 재조합 클론을 회수하여 재조합 플라스미드 pCD503을 제작하였다. 후속적으로, pCD503을 형질전환에 의해 이.콜라이 DH5-알파 컴피턴트 세포내에 도입시켰다. 선별된 형질전환체는 CD503 균주로 표시하였다. 확인 제한 분석은 이.콜라이 균주 CD503으로부터 단리된 플라스미드 pCD503이 정말로 0.25kb의 에스.아베르미틸리스 삽입물을 함유함을 보였다.
(e) 0.25kb의 PCR-증폭된 DNA 삽입물의 박테리오파아지 M13 내로의 서브클로닝, 클로닝된 단편의 DNA 서열화, 및 bkd-특이적인 서열의 동정
플라스미드 pCD503에 존재하는 0.25kb의 삽입물을 박테리오파아지 M13내로 서브클로닝하였다. 이를 수행하기 위해서, 먼저 pCD503을 EcoRI 및 PstI(이들 2개의 제한 효소의 인식 서열은 상기 클로닝된 삽입물 양쪽의 pGEM 벡터의 다중 클로닝 부위에 존재한다)으로 절단시킴으로써 이.콜라이 벡터로부터 상기 삽입물을 방출시켰다. 이어서 상기 특이적인 단편을 EcoRI-처리되고, PstI-처리된 M13 mp18 및 mp19 벡터내로 클로닝시켰다. 이들 두 벡터내로의 클로닝은 서열화를 위한 상기 삽입 DNA 의 양쪽 가닥의 단일가닥 DNA를 생산할 가능성을 보장한다. mp18 형질감염 실험으로부터 선별된, 특이적인 삽입물을 함유하는 하나의 클론을 균주 CD505라 명명하였다. 또한 상기 특이적인 삽입물은 함유하지만 mp19 형질감염 실험으로부터 선별된 또다른 클론을 CD506이라 명명하였다. DNA 서열화는 단일가닥 DNA 주형 및 TaqTrack 키트(Promega)를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드-쇄 종결 방법에 의해 수행하였다. 모든 경우에, DNA의 양쪽 가닥-하나는 CD505 클론으로부터 유도되고, 상보적인 가닥은 CD506 클론으로부터 유도됨-을 서열화하였다. CD505 및 CD506 클론으로부터 수득된 DNA 서열화 데이터의 코돈 선호 분석(GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 미합중국 위스콘신주 마디슨 소재)은 스트렙토마이세스 유전자에 대해 코돈이 올바르게 사용된 개방 판독 프레임이 존재함을 보였다.
이어서, 추정상의 개방 판독 프레임을 IntelliGenetics Suite 소프트웨어(IntelliGenetics Inc., 미합중국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)의 Seq 및 번역 프로그램을 사용하여 아미노산 서열로 번역하였다. 최종적으로, 의심스러운 펩티드 서열에 대한 데이터 뱅크 유사성 연구를 상기 IntelliGenetics 소프트웨어 FASTDB 프로그램을 사용하여 수행하였다. DNA 데이터 뱅크(GenBank 및 EMBL) 또는 단백질 데이터 뱅크(PIR 및 Swiss-Prot)를 연구하는 모든 데이터 뱅크 연구는 CD503 클론으로부터 유도된 서열이 원핵 및 진핵 기원 모두로부터, 상기 데이터 뱅크에 나열된 모든 다른 E1-알파 BCKDH 펩티드와 매우 유사하지만 신규하고 독특함을 명료하게 나타내었다. 인간, 래트, 슈도모나스 푸티다 및 바실러스 스테아로써모필러스로 부터의 E1-알파 BCKDH 펩티드 서열, 및 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 E1-알파 BCKDH CD503 펩티드 서열의 다중 배열을 제2도에 나타낸다. 상기 데이터로부터, 이.콜라이 균주 CD503에서 클로닝된 250bp의 에스.아베르미틸리스 게놈 PCR 산물이 정말로 신규한 E1-알파 bkd 유전자 단편을 나타낸다고 결론지을 수 있다.
(f) 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자 군 전체의 클로닝, 제한 및 써던 블롯 분석, 및 염색체 지도의 제작
E1-알파 bkd-특이적인 에스.아베르미틸리스 DNA 서열을 운반하는 pCD503으로부터 대략 0.25kb 길이의 BamHI/EcoRI DNA 단편을 방사성 표지된 탐침으로서 사용하여 클로니 하이브리드화에 의해 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 코스미드 라이브버리를 스크리닝하였다. 4개의 클론들(CD518,CD519,CD520 및 CD521)을 동정하고 회수하였다. 제한 및 써던 블롯 하이브리드화 분석은 상기 4개의 클론들이 동일한 염색체 영역으로부터 기원한 중복 서열을 함유함을 보였다. 동일한 탐침을 에스.아베르미틸리스 ATCC 31272로부터 절단된 염색체 DNA의 써던 블롯에 대해 매우 엄중하게 사용하였다. 상기 써던 블롯 분석으로, 상기 게놈 라이브러리로부터 회수된 클론의 정체를 확인하였다. 에스.아베르미틸리스 CD503 서열을 함유하는 게놈 영역의 제한지도를 제3도에 도시하였다.
(g) CD518 및 CD521 클론으로부터 유도된 게놈 DNA 단편의 서브클로닝 및, bkd 유전자 군을 운반하는 에스.아베르미틸리스 염색체 영역의 DNA 서열화
에스.아베르미틸리스 염색체의 전체 CD503 bkd 영역을 포함하는 게놈 단편(1 내지 2kb 길이)을 DNA 라이브러리 클론 CD521 및 CD518로부터 이.콜라이 벡터 pGEM-3Z내로 서브클로닝시켰다. 상기 작업도중 제작된 서브클론들의 목록을 각 플라스미드에 대한 간단한 설명과 함께 하기에 나타낸다: 1. 플라스미드 pCD528은 pCD518로부터 서브클로닝된 7kb의 BamHI 단편을 함유한다; 2. 플라스미드 pCD545는 pCD528로부터 서브클로닝된 2.3kb의 SphI 단편을 함유한다; 3. 플라스미드 pCD 550은 pCD521로부터 서브클로닝된 6kb의 SphI 단편을 함유한다; 4. 플리스미드 pCD559는 pCD521로부터 서브클로닝된 7kb의 BamHI 단편을 함유한다; 5. 플라스미드 pCD574는 pCD550으로부터 서브클로닝된 4.2kb의 SphI-Bg1Ⅱ단편을 함유한다; 6. 플라스미드 pCD577은 대략적으로 10.4kb의 삽입물을 함유한다. 이 삽입물은 pCD550으로부터 서브클로닝된 4.2kb의 SphI/Bg1Ⅱ 단편 및 pCD559로부터 서브클로닝된 6.2kb의 Bg1Ⅱ/BamHI 단편과 함께 조립된 2개의 인접된 게놈 단편을 함유한다. 플라스미드 제한 지도작성, 써던 하이브리드화, 및 PCR 분석으로 각 서브클론의 정체를 확인하였다. 상거(Sanger) 쇄-종결 방법을 뉴클레오티드 서열의 결정에 사용하였다. 이를 위해서, 에스.아베르미틸리스 게놈 단편을 후속적으로 M13mp18 및 M13mp19 박테리오파아지내로 서브클로닝시켜 양쪽 DNA 가닥의 서열을 정하였다. 다수개의 DNA 제한 단편을 상기 언급한 pGEM-유도된 클론으로부터 단리시키고 M13mp18 및 M13mp19내로 연결시켜, 하기의 재조합 파아지가 생성되었다:
CD535 : 주형으로서 pCD528 DNA, 특이적인 프라이머 29-PCR-EX(5'-AAGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3') 및 일반 프라이머 31-PCR-BP(실시예 9 및 제6도 참조)를 사용하여 PCR에 의해 클로닝된 0.4kb의 에스.아베르미틸리스 DNA 단편. 증폭된 단편을 EcoRI 및 PstI로 제한처리하였고 EcoRI/PstI 선형화된 M13mp18 DNA 내로 클로닝시켰다.
CD536 : M13mp19 DNA내로 클로닝된 상술한 바와 유사한 DNA 단편.
CD537 : pCD528로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 서열 CD503을 운반하는 1.15kb Sa1I DNA 단편.
CD538 : M13mp18내로 클로닝된 1.15kb의 Sa1I pCD528 DNA 단편(상술한 1.15kb Sa1I 단편의 상부에 위치함).
CD539 : pCD550으로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 1.5kb의 BamHI/Bg1Ⅱ DNA 단편.
CD540 : M13mp18에서 반대방향으로 클로닝된 상술한 바와 유사한 DNA 단편.
CD541 : pCD528로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 0.35kb의 Sa1I/BamHI DNA 단편.
CD542 : pCD528로부터 M13mp19 내로 서브클로닝된 0.35kb의 Sa1I/BamHI DNA 단편.
CD553 : pCD550으로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 0.8kb의 BamHI/Bg1Ⅱ DNA 단편.
CD554 : pCD550으로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 1.1kb의 BamHI DNA 단편.
CD555 : M13mp18에서 반대방향으로 클로닝된 상술한 바와 유사한 DNA 단편.
CD558 : pCD553으로부터 M13mp19 내로 서브클로닝된 0.8kb의 BamHI/HindⅢ DNA 단편.
CD561 : pCD537로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 1.15kb Sa1I DNA 단편(구조물 CD537에 존재하는 것과 반대 방향).
CD565 : pCD537로부터 M13mp19 내로 서브클로닝된 1.15kb Sa1I DNA 단편.
CD566 : pCD537로부터 M13mp19 내로 서브클로닝된 1.15kb Sa1I DNA 단편(구조물 CD565에 존재하는 것과 반대 방향).
CD567 : pCD538로부터 M13mp19 내로 서브클로닝된 1.15kb Sa1I DNA 단편.
CD582 : pCD550으로부터 M13mp18 내로 서브클로닝된 0.8kb의 BamHI/Bg1Ⅱ DNA 단편(구조물 CD553에 존재하는 것과 반대 방향).
후속적으로 상기 클론들에 의해 운반되는 에스.아베르미틸리스 게놈 삽입물을 엑소뉴클레아제 Ⅲ으로 처리하여 단편화시켜 일련의 서브클론들을 제공하였다("네스트 결실", 실시예 8 참조).
(h) 클로닝된 DNA 단편들로부터 수득된 DNA 서열화 데이터의 컴퓨터 분석 및 에스.아베르미틸리스 E1-알파, E1-베타 및 E2 bkd 개방 판독 프레임의 동정
bkd 유전자를 함유하는 2.7kb 에스.아베르미틸리스 게놈 영역의 뉴클레오티드 서열을 제4도에 도시한다. 에스.아베르미틸리스 E1-알파, E1-베타 및 E2(부분) bkd 개방 판독 프레임(ORF)을 함유하는 2.7kb 게놈 영역의 슬라이딩(Sliding) 염기 조성 분석을 "DNA 조사" 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 상기 분석은 30 염기의 신장 길이 및 20의 상쇄값(offset value)을 사용하여 G+C 함량의 실험 평균 프로파일을 제공하였다. 에스.아베르미틸리스 염색체의 상기 영역에 상응하는 전체 G+C 함량은 72%이었다. 낮은 G+C 밸리(G+C 함량 약 50%)-프로모터 영역의 표시-가 상기 bkd 개방 판독 프레임의 바로 위에 위치하였다.
코돈 위치의 함수로서의 G+C 함량을 또한 분석하였다. 개방 판독 프레임을 64개 유전자에 대한 스트렙토마이세스 코돈 이용표(F. Wright 및 M.J. Bibb, 1992, Gene, 113:55-65)와 함께 "코돈 선호도"(Genetics Computer Group, 미합중국 위스콘신주 마디슨 소재) 프로그램을 사용하여 검출하였다. 상기 코돈 선호도 프로그램은 단백질 암호화 서열의 코돈 빈도표에 대한 유사성 또는 각 코돈의 세 번째 위치에서의 상기 서열의 조성(대개 GC)에 의해 상기 단백질 암호화 서열을 인식하는 프레임-특이적인 유전자 파인더(finder)이다. ORF를 각각의 판독 프레임에 대한 도표 바로아래에 상자로서 나타내었다. 모든 개시(ATG) 및 정지 코돈도 또한 검정하였다(수직선). 각각의 판독 프레임에서 발견되는 희귀한 코돈을 각각의 ORF 도표아래에 표시하였다. G+C 함량을 25 코돈의 슬라이딩 창을 사용하여 계산하였고, 따라서 단백질-암호화 영역의 충분한 밀착이 관찰되기 전에 약 25코돈의 지체가 예상되었다. 3개의 프로파일을 하기와 같이 얻었다: 1, 코돈의 첫 번째 위치; 2, 코돈의 두 번째 위치; 3, 코돈의 세 번째 위치. 상기 분석의 결과로서, 3개의 bkd ORF가 하기 BCKDH 소단위인 E1-알파, E1-베타 및 E2 에 상응하게 위치하였다(제4도 및 5도).
(ⅰ) PCR-기본의 부위-유도된 돌연변이에 대한 프라이머로서 사용되는 신규한 올리고뉴클레오티드의 구상
링커 또는 PCR-기본의 부위-유도된 돌연변이를 사용하여 E1-알파 및 E1-베타 ORF의 ATG 변역 개시 부위에 NdeI 제한 부위를 도입시켰다. 하기의 신규한 올리고뉴클레오티드를 구상하였다(또한 실시예 9 및 제6도를 참조하시오):
좌향의 일반(벡터) 프라이머:
우향의 돌연변이 프라이머:
(j) 개방 판독 프레임 상부의 신규한 NdeI 제한 부위를 생성시키는 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 부위-유도된 돌연변이
발현 플라스미드는 E1-알파, E1-베타, E1-알파+E1-베타 ORF, 또는 완전한 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자 군을 운반하는 플라스미드 pT7-7(문헌[S. Tabor, 1990, In Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York])의 유도체이었다. NdeI 제한 부위를 PCR-기본의 부위-유도된 돌연변이에 의해 생성시켰다. 5개의 발현 플라스미드를 하기와 같이 상기 연구를 위해 제작하였다:
플라스미드 pCD670 : 에스.아베르미틸리스 E1-알파 bkd 개방 판독 프레임(ORF1)을 운반하는 pT7-7의 유도체, ATG 개시 코돈에 걸쳐있는 NdeI 제한 부위를 PCR 돌연변이 프라이머 55-PCR(실시예 9 및 제6도 참조)을 사용하여 증폭 및 동시 돌연변이에 의해 에스.아베르미틸리스 E1-알파 bkd 유전자내에 도입시켰다.
플라스미드 pCD666 : 에스.아베르미틸리스 E1-알파 bkd 개방 판독 프레임(ORF2)을 운반하는 pT7-7의 유도체. ATG 개시 코돈에 걸쳐있는 NdeI 제한 부위를 PCR 돌연변이 프라이머 56-PCR(실시예 9 및 제6도 참조)을 사용하여 증폭 및 동시 돌연변이에 의해 에스.아베르미틸리스 E1-베타 bkd 유전자내에 도입시켰다. 상기 ORF의 최적 발현을 획득하기 위해서, 코돈 7의 세 번째 위치를 C에서 G로 바꾸어 이.콜라이 코돈 용법을 닮은 코돈 동의어를 생성시켰다. 상기 E1-베타 펩티드 서열은 상기 변화에 의해 영향을 받지 않았다.
플라스미드 pCD736 : T7 프로모터의 조절하에 E1-알파(ORF1) 및 E1-베타(ORF2) ORF를 모두 운반하는 pT7-7의 유도체.
플라스미드 pCD705 : pCD736과 유사하나 틀린 배향으로 배치된 E1-베타 ORF의 3'-반을 갖는 플라스미드. 이 구조물을 발현 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다.
플라스미드 pCD685 : 완전한 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자 군을 운반하는 pT7-7의 유도체.
(k) T7 이중 플라스미드 발현 시스템의 사용에 의한 이.콜라이에서의 에스.아베르미틸리스 bkd 개방 판독 프레임의 발현
이.콜라이에 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자를 발현시키는 것은 필수적으로 문헌 [S. Tabor, 1990, In Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에 개시된 바와 같은 T7 RNA 폴리머라제/프로모터 이중 플라스미드 시스템을 사용하여 성취하였다. 상이한 pT7-7 구조물들을 함유하는 이.콜라이 C600(pGP-1)의 유도체를 분석하였다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 열 유도후에 이.콜라이 숙주에서의 에스.아베르미틸리스 ORF의 발현을 감시하였다. 열 유도시 단백질 프로파일의 SDS-PAGE 분석은 하기와 같이 E1-알파 및 E1-베타 ORF에 대한 예상치(상응하는 DNA 서열로부터 추론됨)와 유사한 크기를 갖는 유도된 펩티드의 과잉발현을 나타냈다:
(1) 재조합 이.콜라이 클론의 조 추출물에서의 특이적인 분석에 의한 E1 에스.아베르미틸리스 BCKDH 활성의 검정
하기 표 1(실시예 11)은 상기 결과들을 요약한다. pCD736을 운반하는 이.콜라이 세포의 조 추출물에서 수행된 E1-특이적인 BCKDH 분석은 T7 프로모터 유도시 현저한 E1 활성을 보였다. 틀린 배향으로 배치된 삽입물의 일부를 갖는 구조물을 운반하는 유사 배양물(pCD705)은 백그라운드 수준의 활성을 보였다.
또한, 효소 분석은 플라스미드 pCD685를 함유하는 이.콜라이 균주로 부터의 조 추출물도 또한 현저한 E1 BCKDH 활성(백그라운드 수준의 ＞10배)을 가짐을 가리켰다. 상기 클론의 유도되지 않은 배양물을 또한 분석하였고 이는 백그라운드보다 2 배 이상의 기본 활성 수준을 보였다. 이 결과는 T7 시스템이 유도되지 않은 조건하에서 조차도 클로닝된 유전자의 낮은 수준의 구조적인 발현을 허용하는 것으로 알려져 있기 때문에 예상된 것이다.
클로닝된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 bkd 유전자 군을 상기 유전자의 복제수를 증가시키거나 생산 균주에서 그의 발현을 최적화시킴으로써 천연 아베르멕틴 생산을 개선시키는데 유용하다. 클로닝된 bkd 유전자의 효율적인 발현을 성취하기 위한 한가지 가능한 접근방법으로는 상기 유전자를 다중복제 이.콜라이/스트렙토마이세테스 셔틀벡터(예 : 플라스미드 pCD262, Denoya C. D., 1993, "Novel Bacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomucetes and Escherichia coli", 미합중국 특허원 제 08/032,925, 1993년 3월 18일 출원)내로 삽입시켜 상기 유전자가 강한 프로모터로부터 전사되도록함을 포함한다. 이 방법은 상기 유전자의 효율적인 전사를 보장할 것이다. 또한, 효율적인 발현을 보장하기 위해서 몇가지 사항들이 고안될 수 있다. 여기에는 (a)프로모터 강도; (b) mRNA 의 안정성; (c) 조절 인자의 존재 또는 부재; (d) 유도성; 및 (e) 리보조옴 인식 및 번역 개시 신호를 개선시키기 위한 부위 유도된 돌연변이가 포함된다. bkd 유전자의 발현을 또한 야생형의 프로모터 및 조절 영역들을 유전자 치환 기법에 의해 상이한 프로모터로 치환시킴으로써 최적화시킬 수 있다. 본원에 개시된 신규한 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 발현을 최적화시키기 위해 사용할 수 있는 유용한 프로모터, 예를들어 강한 ermE 프로모터(Hopwood et al., 1985, "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Nurwich, U.K.) 및 티오스트렙톤-유도성 tipA 프로모터(Murakami et al., 1989, J. Bacteriol, 171, 1459-1466)에 대한 문헌에 다수의 예가 존재한다. 또한, 유전자 치환 기법을 사용하는 결실 또는 부위-유도된 돌연변이에 의한 bkd 유전자의 불활성, 및 BCKDH 활성의 동시적인 부재는 신규한 아베르멕틴의 생산에 유용한 개선된, 비가역적으로 보호된 bkd 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 개발시킬 것이다.
[실시예]
하기는 에스.아베르미틸리스로부터 bkd 유전자를 클로닝하고 분석하는데 사용되는 실험 과정의 상세한 실시예이며, 이는 또한 첨부된 도면에도 도시된다. 표준 기법들(이들은 분자 생물학의 숙련가들에게 잘 공지되어 있다)의 세부사항 및 사용된 특정 효소의 명칭은 예를 들어 실험 매뉴얼[Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Habor Laboratory, 1989]에 개시되어 있다.
[실시예 1]
[에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 의 제조]
에스.아베르미틸리스 ATCC 31272 균사를 29℃에서 7일간 YPD-2 한천 배지상에서 유착된 잔디로서 증식시켰다. 배지는 하기와 같이 구성되었다:
이어서 증식된 균사를 사용하여 300-정류조절된 플라스크중의 AS-7 배지[하프너 등의 유럽 특허원 제 88300353.5호(공개 번호 제 0284176 호)(1988) 참조] 30에 접종시키고, 이를 29℃에서 24시간동안 진탕(230rpm)시켰다. 상기 배지는 하기와 같이 구성되었다:
대략 0.3의 상기 배양물을 사용하여 변형된 액체 효모 추출물 맥아 추출물(Yeast Extract Malt Extract; YEME) 배지 30(Bibb, M.J., Freeman, R.F., 및 D.A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154:155-166)을 함유하는 또다른30-정류조절된 플라스크에 접종시켰다. 상기 변형된 YEME 배지는 1ℓ당 하기 물질을 함유한다:
배양물을 29℃에서 48 내지 72시간 동안 증식시켰다. 균사를 원심분리에 의해 회수하고 게놈 DNA를 "세슘 클로라이드 구배 원심분리에 의한 스트렙토마이세스 전체 DNA의 단리: 공정2" 프로토콜(문헌[Dr. D.A. Hopwood et al., "Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985] 참조)에 따라 제조하였다. DNA 펠렛을 3의 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁시켰다.
[실시예 2]
[폴리머라제 쇄 반응 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 증폭]
에스.아베르미틸리스 게놈 DNA를 퍼킨-엘머 씨터스(Perkin-Elmer Cetus) 열 순환기를 사용하여 효소적으로 증폭시켰다. PCR 반응을 20μM dNTP, 15% 글리세롤, 각 프라이머 0.5μM, 주형 DNA(이 경우 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA) 50ng, 및 최종 부피 100중의 효소 2.5단위의 존재하에서 Taq 폴리머라제(퍼킨-엘머 씨터스) 및 제조자에 의해 제공된 완충액을 사용하여 30주기동안 수행하였다. 상기 첫 번째 주기의 열 프로파일은 95℃에서 3분(변성 단계), 55℃에서 2분(어닐링 단계) 및 72℃에서 2분(연장 단계)이었다. 후속적인 29 주기는 상기 변성 단계를 1.5분으로 단축한 것을 제외하고 유사한 열 프로파일을 가졌다. DNA 프라이머들은 제노시스 바이오테크놀로지즈, 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies, Inc., 미합중국 텍사스주 소재)에 의해 공급되었다. 우향 프라이머(제1도)는 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGACCCGCAG-3'이고, 좌향 프라이머(제1도)는 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'이었다. 상기 증폭산물을 한천 겔 전기영동에 의해 크기별로 분류하였다. PCR 샘플을 상기 문헌[Maniatis et al]에 개시한 바와 같이 1X TBE 완충액(90mM 트리스-HCl, pH 8.5, 90mM 붕산, 2.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))중의 수평적인 1.5% 한천 겔에서 1.5시간 동안 100V로 전기영동시켰다. 상기 분리된 PCR DNA 산물은 에티디움 브로마이드로 염색하고 365nm의 자외선 광으로 형광 밴드를 가시화함으로써 상기 겔에 나타났다. 상술한 PCR 조건하에서, 상기 프라이머 조합을 사용할 때 단일의 DNA 밴드(대략 250 염기쌍 길이)가 검출되었다.
[실시예 3]
[0.25kb PCR증폭된 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 단편의 이.콜라이 벡터내로의 클로닝, 및 후속적인 이.콜라이 숙주내로의 형질전환]
[A. 1.25kb PCR 산물의 회수]
이전에 언급한 바와 같이, 0.25kb DNA 단편을 주형으로서 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 및 우향 + 좌향 프라이머 조합을 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다. 제1도에 도시된 바와 같이, 우향 프라이머는 5'-말단에 배치된 EcoRI 인식 부위를 가지며, 좌향 프라이머는 5'-말단에 XbaI 인식 부위를 갖는다. 그러나, 상기 삽입물과 클로닝 벡터 모두를 EcoRI 과 XbaI로 절단시키는 연결 과정을 사용하여 상기 0.25kb PCR 단편을 클로닝하려는 시도는 성공적이지 못했다. 따라서, 상기 0.25kb PCR 단편의 클로닝을 위한 또다른 시도로, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편을 사용하여 PCR 단편내에 블런트 말단을 생성시키는 것이 시험되었다. 증폭에 이어서(실시예 2에 개시된 바와 같이), 대략 80의 PCR 반응물에 페놀-크롤로포름으로 2회, 에테르로 2회 추출하고, 이어서 상기 PCR DNA 산물을 이미 기술한 바와 같이 에탄올로 침전시켰다. DNA를 H2O 18.5에 재현탁시켰다. 이어서, 10배닉(Nick)-번역 완충액(0.5M 트리스-HCl, pH 7.2, 0.1M 황산 마그네슘(MgSO4), 1mM 디티오쓰레이톨, 500/의 소 혈청 알부민(Maniatis et al., 1989) 2.5및 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I (Boehringer Mannheim Biochemicals)의 클레노우 단편 20단위를 가하고, 혼합물을 37℃에서 5분간 배양시켰다. 이어서, 2mM dNTP(4dNTP 각 2mM) 1를 가하고 반응물을 추가로 실온에서 15분간 배양시켰다. 보수(repairing) 반응을 0.5M EDTA(pH 8.0) 1를 가하여 중단시키고 상기 반응 혼합물의 전량을 1.5% 한천 겔상에 적하하고 전기영동시켰다. 0.25kb DNA 단편을 이미 기술한 바와 같이 가시화시키고 하기와 같이 전기용출(electroelution)에 의해 회수하였다: 0.25kb DNA 밴드를 레이저 블레이드로 제거하고 상기 DNA를 80V에서 35분간 단일방향의 전기용출기(International Biotechnology Inc., 미합중국 코넥티컷주 뉴 해븐 소재)를 사용하여 10M 암모늄 아세테이트로 충전된 V-형 웰내로 전기용출에 의해 상기 한천 겔로부터 회수하였다. 이어서 상기 DNA를 에탄올로 침전시키고, 펠렛화하고 최종적으로 DNA 완충액(10mM 트리스-HCl, 4mM 염화 나트륨(NaCl), 0.1mM EDTA;pH 7.5) 20에 재용해시켰다.
[B . 폴라스미드 벡터 pGEM-3Z의 SmaI 절단 및 탈인산화(dephosphorylation)]
대략 1의 폴라스미드 pGEM-3Zf(+)(Promega Corp., 미합중국 위스콘신주 마디슨 소재) 및 2단위 제한 효소 SmaI(모든 제한 효소들은 베링거 만하임 바이오케미칼사(Boehringer Mannheim Biochemicals)로부터 구입하였다)을 공급자에 의해 제시된 분석 완충액 중에서 25℃에서 3.5시간동안 40의 총 반응 부피로 배양시켜 선형의 블런트-말단화된 분자를 제조하였다. 이어서, SmaI-선형화된 벡터를 공급자로부터 입수한 설명서에 따라 송아지 장 알칼리 포스파타제(Calf Interstine Alkaline Phosphatase; CIAP)(Promega Corp., 미합중국 위스콘 신주 마디슨 소재로부터 구입)를 사용하여 탈인산화시켰다. 반응 혼합물을 37℃에서 35분간 배양시키고 이어서 DNA를 동부피의 페놀-클로로포름으로 2회, 동부피의 에테르로 2회 추출하고, 최종적으로 상기 DNA를 무수 에탄올 2부피를 가하여 침전시켰다. 침전된 DNA를 10,000xG에서 10분간 원심분리에 의해 회수하고 진공하에서 건조시켰다. 최종 펠렛을 DNA 완충액 20에서 재용해시켰다.
[C. pCD503의 생산을 위한 연결공정]
클레노우-처리된 0.25kb PCR DNA 산물 약 9및 SmaI -선형화되고, CIAP-탈인산화되고, 블런트-말단화된 pGEM-3Zf(+) 약 1를 14℃에서 총 반응 부피 20로 공급자에 의해 제시된 조건하에서 1단위의 리가제(New Englad BioLabs, IC, 미합중국 매사츄세츠주 베버리소재)와 함께 밤새 배양하였다. 얼음상에 상기 분석물 마이크로튜브를 놓아 상기 반응을 종결시키고 이어서 반응 혼합물 15를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 JM109 세포를 문헌[Maniatis ei al., 1989]에 개시된 바와 같은 표준 공정에 따라 형절전환시켰다. 다수의 암피실린-내성 형진전환체가 회수되었다. 플라스미드 벡터 pGEM-3Zf(+)는 베타-갈락토시다제의 아미도-말단 단편을 암호화하는 에스케리키아 콜라이의 lac 오페론으로부터 유도된 DNA 단편을 함유한다(Yanisch-Perron, C., Vieira J., 및 J. Messing, 1985, Gene, 33, 103). 이소프로필티오-베타-D-갈라토사이드(IPTG)에 의해 합성을 유도할 수 있는 상기 단편은 숙주에 의해 암호화된 결함 형태의 베타-갈락토시다제와 대립 유전자(알파) 상보성일 수 있다. 유발자인 IPTG에 노출된 이.콜라이 세포는 상기 효소의 단편 모두를 합성하며 발색성 기질인 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토사이드(X-gal)를 함유하는 배지상에 놓일 때 청색 콜로니를 형성한다. 외래 DNA를 상기 플라스미드의 다클로닝 부위내에 삽입하면 상기 베타-갈락토시다제의 아미노-말단 단편이 불활성화 되고 알파-상보성이 파괴된다. 따라서, 재조합 플라스미드를 운반하는 세균은 백색 콜로니를 생산한다. 다수의 백색 콜로니들이 상기 형질전환 실험으로부터 회수되었다. 이들 콜로니는 플라스미드 pCD503을 함유할 것이다. 이는 pCD503균주로 표시된 하나의 콜리니를 선별하여 추가로 분석함으로써 확인되었다. 이.콜라이 균주 CD503의 단일 세균 콜로니를 표준 미생물학 공정에 따라 암피실린 50/를 함유하는 루리아-베르타니(Liria-Bertani ; LB) 액체 배지에 접종시켰다. 상기 LB 배지는 하기와 같이 구성되었다;
배양물을 35℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 세균 세포를 10,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리시켜 수확하였다. 플라스미드 벡터를 문헌[Denoya et al., 1985, Microbios Lett., 29:87]에 개시된 바와 같이, 번보임과 돌리(Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res., 1979, 7:1513) 방법의 편법을 사용하여 새로 수확한 에스케리키아 콜라이 CD503 세포로부터 단리시켰다. 단리된 플라스미드 DNA를 최종적으로 DNA 완충액(10mM 트리스-HCl, 4mM NaCl, 0.1mM EDTA; pH 7.5)에 용해시켜 완충액 10당 대략 1의 pCD503 농도를 얻었다. 제한 효소 EcoRI 및 PstI을 사용한 확인 제한 분석은 예상한 바와 같이, pCD503이 0.25kb DNA 삽입물을 함유함을 나타냈다.
[실시예 4]
[방사성 표지된 DNA와 RNA 탐침의 제조]
[A. 균일하게 표지된 이중가닥 DNA 탐침의 제조]
이중가닥 DNA 탐침의 닉(nick) 번역(이 기법에 대한 일반적인 설명에 대해 문헌[Maniatis et al., 1989]을 참조할 수 있다)에 의해 제조하였다. 먼저, 표적 서열을 운반하는 특정 DNA 단편을 적합한 제한 절단에 의해 제조하고 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 전기용출에 의해 정제하였다. 대략 1의 DNA를 각각의 경우에 엔이엔-듀퐁사(NEN-Dupont)로부터 구입한 [알파-32P]dCTP(데옥시시시티딘 5'-트리포스페이트, 테트라(트리에틸암모늄)염 [알파-32P]-)과, 비알엘 라이프 테크놀로지즈, 인코포레이티드(BRL Life Techmologies, Inc.)로부터 구입한 비알엘 닉 번역 시스템을 사용하여 공급자로부터 입수한 설명서에 따라 표지하였다. 전형적인 반응을 50의 부피로 수행하였다. 정지 완충액 5를 가한 후에(BRL 권장 공정에 기술된 바와 같이), 표지된 DNA를 공급자로부터 입수한 설명서에 따라 스트라타유전자(Stratagene) + 컬럼을 사용하여 통합되지 않은 뉴클레오티드로부터 분리시켰다. 108cpm/과잉의 특이적인 활성을 갖는32P-표지된 DNA를 통상적으로 상기 공정에 따라 수득하였다.
[B. 표지된 단일가닥 RNA 탐침의 제조]
32P-표지된 RNA 탐침을 리보프로브 제미니(Riboprobe Gemini)전사 시스템(Promega)을 사용하여 생체외 전사에 의해 제조하였다. 표적 DNA 의 정제된 단편을 표준 공정을 사용하여 전사 벡터 pGEM-3Z 내로 클로닝시켰다. 생체외 전사 반응을 위한 주형 플라스미드 DNA의 제조를 실시예 3에 개시한 바와 같이 수행하나, 단 상기 제제를 오염시킬수도 있는 작은 뉴클레오티드들을 선택적으로 제거하기 위한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전 단계를 하기와 같이 수행한다; 에탄올 침전 단계후에, 펠렛을 물 520에 재현탁시켰다. 이어서 5M NaCl 100및 13% PEG(분자량 6,000-8,000) 620를 가하였다. 혼합후에, 상기 튜브를 빙상에서 1시간동안 배양시키고 DNA를 4℃, 10,000xG에서 15분간 펠렛화시켰다. 펠렛을 80% 냉 에탄올 500로 1회 세척하고 통상적으로 재현탁시켰다. 대략 1의 주형 플라스미드 DNA를 SacI 또는 HindⅢ 제한 효소를 사용하여 선형화시키고, 후속적으로 SP6 또는 T7 박테리오파아지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 각각 사용하여 생체외에서 전사시켰다. 상기 반응에 엔이엔-듀퐁사로부터 구입한 시티딘 5'-트리포스페이트 테트라(트리에틸암모늄)염, [알파-32P](CTP)을 사용하였다. 반응 조건들은 공급자에 의해 권장된 바에 따랐다. 배양 후에, 반응 혼합물을 1단위의 RQ1-DNase(Promega)로 처리하여 DNA 주형을 변성시키고, 페놀-클로로포름으로 2회 추출하고, 이어서 표준 공정에 따라 에탄올로 침전시켰다. 펠렛을 건조시키고 RNase가 없는 물(Promega) 20에 재현탁시켰다. 소 분액의 표지된 RNA 전사물을 문헌[Denoya et al., 1987, J. Bacteriol., 169:3857-3860]에 개시된 바와 같이 폴리아크릴아미드-한천 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 본 실시예에 개시된 조건하에서, 표지된 충분한 길이의 전사물을 통상적으로 수득하였다.
[실시예 5]
[써던 하이브리드화에 의한 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA의 분석]
대략 10의 정제된 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA를 2단위의 제한 효소 BamHI으로 37℃에서 최소한 2시간동안 절단시켰다. 상기 절단의 끝에서, DNA 단편들을 1% 한천 겔을 통한 전기영동(실시예 1a 참조)에 의해 분리시키고 밤새 모세관 전달 방법(Southern, E.M., 1975, J.Mol. Biol., 98:503)을 사용하여 나일론 멤브레인(구멍 크기 0.45㎛(Schleicher 및 Schuell Nytran membranes)으로 옮겼다. 다음날, 상기 나일론 멤브레인을 플라스틱 랩으로 싸고 각 멤브레인의 DNA 면을 자외선 광원(302nm)에 노출시켜 DNA를 상기 멤브레인에 고정시켰다. 방사성 표지된 RNA 또는 DNA 탐침을 문헌[Maniatis ei al., 1989]에 개시된 프로토콜에 따라 나일론 멤브레인상에 고정화된 DNA에 하이브리드 형성시켰다. 예비 하이브리드화 및 하이브리드화를 42℃에서 수행하였다. 하이브리드화 용액은 6x SSC(1x : 0.15M NaCl, 15mM 시트르산 나트륨, pH 7.0), 10x 덴하르트(Denhardt) 시약[1x : 0.02% 피콜, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민], 1% SDS(나트륨 도데실 설페이트), 100/의 변성되고 단편화된 연어 정액 DNA, 100/의 이.콜라이 tRNA 및 50% 포름아미드(Fluka)를 함유하였다. 밤새 하이브리드화 시킨 후에, 멤브레인들을 하기와 같이 세척하였다: 1x SSC, 0.1% SDS로 실온에서 15분간 2회 세척하고 0.1x SSC, 0.1% SDS로 42℃에서 15분간 2회 세척하였다. 몇몇 실험에서, 하이브리드화를 포름아비드의 부재하에서 65℃에서 수행하였고, SSC 대신에 SSPE(1x : 0.18M NaCl, 10mM NaPO4, pH 7.7, 1mM EDTA)를 사용하였다. 최종적으로, 멤브레인을 X-선 필름에 노출시켜 방사선 사진 영상을 수득하였다.
[실시예 6]
[0.25kb CD503 에스.아베르미틸리스 게놈 단편의 박테리오파아지 M13내로의 클로닝 및 DNA 서열화]
0.25kb CD503 에스.아베르미틸리스 DNA 단편을 상거의 디데옥시 서열화 방법(Sanger et al., 1977, Proc. Nat. Acid. Sci. USA, 74:5463-5467)에서 주형으로서 사용되는 단일가닥 재조합 DNA의 제조를 위해 박테리오파아지 M13mp18 및 M13mp19 내로 클로닝시켰다. 이미 개시한 바와 같은 소규모제조 공정에 따라 제조된 약 2의 플라스미스 pCD503을 제한 효소 EcoRI 및 PstI 로 절단시켜 0.25kb 에스.아베르미틸리스 게놈 삽입물을 방출시켰다. 이전에, 제한 분석은 EcoRI 이나, 또는 PstI 단독으로 절단된 pCD503이 선형이었음을 보였다. 이러한 분석은 상기 0.25kb 삽입물이 EcoRI 또는 PstI 인식 부위를 함유하지 않았음을 입증하였다. 상기 절단 혼합물을 1.2% 한천 겔에서 전기영동시키고 0.25kb 단편을 상술한 바와 같이 전기용출시키고 침전시켰다. 또한, 정제된 이중가닥의 복제형(Replicative Form; RF) M13mp18 및 M13mp19 DNA 각각 약 1을 EcoRI 및 PstI 로 이중 절단시키고, 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIAP)(Promega Corp., 미합중국 위스콘신주 마디슨 소재로부터 구입)로 탈인산화시키고, 최종적으로 이미 기술한 바와 같이 상기 025kb DNA 단편에 연결시켰다. 정제된 RF M13 클로닝 벡터를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 구입하였다. 연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 JM109 세포를 형질감염시켰다. mp18 형질감염물로부터 단일의 백색 플라크, 및 mp19 형질감여물로부터 단일의 백색 플라스크를 선별하고, 개시된 바와 같이(Maniatis ei al., 1989) 파아지 증식시켜 단일가닥 DNA를 제조하였다. 각각의 단일가닥 DNA 주형의 DNA 서열화를, M13-특이적인 40 서열화 프라이머(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 제품번호 1212), 데옥시아데노신 5'-[알파-티오]트리포스페이트, [35S](NEW-Dupont), 및 TaqTrack 서열화 키트(Promega)를 공급자(Promega)가 제공하는 설명서에 따라 사용하여 수행하였다. pCD503 에스.아베르미틸리스 게놈 단편의 DNA 서열화 데이터를 제4도에 도시하였다.
[실시예 7]
[전체 bkd 에스.아베르미틸리스 유전자 군의 클로닝 및 염색체 지도의 제작]
정체된 pCD503 약 5을 BamHI 및 EcoRI 제한 효소를 모두 사용하여 이중 제한처리하고, DNA 단편을 1.2% 한천겔에서 전기영동에 의해 분리시키고, 전기용출에 의해 에스.아베르미틸리스 bkd E1-알파 유전자에 대해 특이적인 서열을 운반하는 대략 0.25kb 길이의 DNA 단편을 회수하고, 본질적으로 이미 기술한 바와 같이 닉 번역에 의해 표지화하였다. 이어서 [32P] 표지된 DNA 단편을 탐침으로 사용하여 에스.아베르미틸리스 게놈 코스미드 라이브러리를 스크리닝하였다. 일반적으로 게놈 라이브러리의 제조의 대한 상세함 설명은 문헌[Maniatis ei al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 1989]에서 찾을 수 있다. 스트렙토마이세테스 염색체라이브러리 제조에 대한 충분한 설명한 문헌[Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual, 1985]에 제공되어 있다. 코스미드 벡터에 대한 설명은 1993년 4월 16일자로 출원된 미합중국 특허 제 08/048,719호 (Denoya C.D., "Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning")에 개시되어 있다. 2200개 이상의 재조합 라이브러리 클론을 선별한 후에 4개의 클론을 동정하였다. 이들 4개의 하이브리드화 클론(이.콜라이 클론 CD518,CD519,CD520 및 CD521이라 기록함)을 암피실린 선택성 압력하에서 LB 배지에서 증식시켰다. 플라스미드를 이전에 기술한 바와 같이 각각의 배양물로부터 제조하였다. 제한 및 써던 블롯 하이브리드화 분석은 상기 4개의 클론들이 중복된 염색체 영역을 가져 서로 관련되었음을 밝혔다. CD503 서열을 포함한 전체 염색체 영역을 포함하는 에스.아베르미틸리스 게놈 제한 지도를 표준 공정에 따라 수득하였고, 제3도에 나타내었다.
[실시예 8]
[bkd 유전자군을 운반하는 에스.아베르미틸리스 염색체 영역의 유도된 DNA 서열화를 위한 네스트 셋트의 결실 변이체의 생성]
에스.아베르미틸리스 bkd 표적 DNA의 한쪽 말단 또는 다른쪽 말단으로부터 점진적으로 보다 많은 뉴클레오티드가 부족한 네스트 셋트의 결실 변이체를 필수적으로 문헌[Henikoff, S., Methods Enzymol., 1987, 155:156]에 개시된 바와 유사한 공정에 따라 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 사용하여 생성시켰다. 단일방향의 결실 변이체를 생성시키기 위하여, 각 재조합 박테리오파아지 M13 복제형 DNA의 이중가닥 DNA를 2개의 제한 효소로 절단시키고, 이들 효소는 둘다 상기 표적 DNA의 한쪽 말단과 프라이머-결합 부위사이에 절단 부위를 갖는다. 상기 표적 서열에 보다 가깝게 절단된 제한 효소는 블런터 말단 또는 움푹 들어간 3' 말단을 생성시키며; 다른 효소는 돌출된 3' 말단을 생성시켰다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ는 이중가닥 DNA 의 움푹 들어간 말단 또는 블런트 3'-하이드록실 말단으로부터 5' 모노뉴클레오티드의 단계적 제거를 촉진시킨다. 그러나, 돌출된 3' 말단은 상기 효소의 활성에 대해 완전히 내성이다. 따라서, 생성된 선형 DNA 의 단지 한쪽 말단만이 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 민감히며, 절단은 상기 절단 부위로부터 표적 DNA 서열로 단일 방향으로 진행되었다.
예로서, pCD565 네스트 결실물의 제조에 대한 설명은 하기와 같다. 플라스미드 pCD565는 E1-알파 에스.아베르미틸리스 bkd 개방 판독 프레임의 일부를 함유하는 1.15kb Sa1I 단편을 운반하는 M13mp19 RF 유도체이다. 플라스미드 pCD565를 문헌[Maniatis ei al., 1989]에 개시된 바와 같이 세슘 클로라이드 및 에티디움 브로마이드 구배로 평형 원심분리에 의해 정제하였다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ은 단일가닥 닉으로 부터의 절단을 개시시킬 수 있으며, 따라서 10% 미만의 이완된 환상 분자를 함유하는 제제를 사용하는 것이 중요하다 약 10의 플라스미드 pCD565(본 "발명의 상세한 설명"부 참조)를 37℃에서 4시간동안 제한 효소 SacI 및 XbaI로 이중 절단하고, 이어서 페놀-클로로포름 및 에테르로 추출하고, 이전에 기술한 바와 같이 에탄올로 침전시켰다. 펠렛을 엑소뉴클레아제 Ⅲ 반응 완충액(10x 엑소뉴클레아제 Ⅲ 완충액; 0.66M 트리스-HCl, pH 8.0, 66mM MgCl2)60에 재현탁시켰다. 이어서 상기 DNA 용액을 300 단위의 엑소뉴클레아제 Ⅲ(Ambion Inc.)의 존재하에 37℃에서 배양시키고 2.5분액을 30초 간격으로 회수하였다. 이어서 샘플들을 뉴클레아제 S1과 함께 배양시키고 상기 각 샘플들의 분액을 한천 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 목적하는 크기의 DNA 단편을 함유하는 샘플들을 모으고, DNA를 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편을 사용하여 보수하고, 밤새 연결시키고, 컴피턴트 이.콜라이 JM109 세포내로 형질감염시켰다. 회수된 클론의 삽입 크기를 EcoRI/HindⅢ 제한 및 한천 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 5개의 클론들을 서열화를 위해 선별하였다: 565-D19(1.1kb), 565-D7(0.88kb), 565-d24(0.77kb), 565-D1(0.51kb) 및 565-D16(0.36kb). 단일가닥 DNA를 상기 각각의 클론들로부터 제조하고 이전에 기술한 바와 같이 서열화하였다.
[실시예 9]
[이.콜라이에서의 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 발현에 사용되는 플라스미드 pCD670, pCD666, pCD736 및 pCD685의 제작]
이.콜라이에서의 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 발현을 본질적으로 문헌[S. Tabor, 1990, In Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에 개시된 바와 같이 T7 RNA 폴리머라제/프로모터 이중 플라스미드 시스템을 사용하여 수행하였다.
A. 에스.아베르미틸리스 E1-알파 bkd ORF를 운반하는 pCD670의 제작 ATG 개시 코돈을 포함하는 NdeI 제한 부위를 PCR-기본 공정을 사용하여 에스.아베르미틸리스 bkd E1-알파 유전자내에 도입시켰다. PCR 에 대한 주형은 상기 E1-알파 ORF의 아미노 말단의 1/2을 함유하는 7kb 에스.아베르미틸리스 게놈 삽입물을 운반하는 pGEM-3Z 유도체인 플라스미드 pCD528이었다. 상기 두 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응에 프라이머로서 사용하였다(제6도 참조):
1. pGEM-3Z MCS의 HindⅢ 부위(위치 91-114)의 하부에 유전자를 위치시키는 좌향의 일반적인 (벡터) 프라이머 31-PCR-BP
(5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3').
상기 프라이머의 5'-말단에는 2개의 As, 및 2개의 제한 부위(BamHI 및 PstI)가 존재하여 PCR 산물의 클로닝을 용이하게 한다.
2. 돌연변이성 프라이머 55-PCR
(5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3'). 상기 프라이머의 5'-말단에는 2개의 As, 하나의 G, 및 2개의 제한 부위(Bq1Ⅱ 및 NdeI)가 있다. NdeI 부위는 E1-알파 개방 판독 프레임의 ATG 개시 코돈과 겹쳐있다.
폴리머라제 쇄 반응을 이전에 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응 산물을 0.8% 한천 겔에서 전기영동에 의해 분석하였다. 정확한 크기(약 1.1kb 길이)의 PCR-증폭된 DNA 단편을 전기용출시키고, 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단시키고, NdeI/BamHI 선형화된 플라스미드 pT7-7내로 서브클로닝시켜 연결 및 이.콜라이 DH5-알파 세포내로 형질전환시 플라스미드 pCD663을 수득하였다. 약 1의 플라스미드 pCD663(플라스미드 소규모제조 공정을 사용하여 이.콜라이 균주 CD663으로부터 제조)을 BamHI으로 선형화시키고, 탈인산화시키고, 최종적으로 플라스미드 pCD550의 BamHI 절단으로부터 단리된, 전기용출되어 정제된 1.1kb BamHI 단편 약 0.5의 존재하에서 연결시켜 플라스미드 pCD670을 수득하였다. 상기 구조물중의 1.1kb BamHI 단편의 정확한 배향을 상기 삽입물중에 존재하는 Sa1I 부위의 유전자 지도 작성에 의해 결정하였다. 최종적으로, 플라스미드 pCD670을 플라스미드 pGP1-2(이 플라스미드는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유함)를 운반하는 이.콜라이 균주 C600내로 도입시켰다.(문헌[Tabor, 1990]참조). 하나의 형질전환체를 추가의 연구를 위해 선별하고 균주 CD676으로서 기록하였다.
[B. 에스.아베르미틸리스 E1-베타 bkd ORF를 운반하는 pCD666의 제작]
ATG 개시 코돈을 포함하는 NdeI 제한 부위를 PCR-기본 공정을 사용하여 에스.아베르미틸리스 bkd E1-베타 유전자내로 도입시켰다. PCR에 대한 주형은 E1-베타 ORF를 함유하는 4.5kb 에스.아베르미틸리스 게놈 삽입물을 운반하는 pGEM-3Z 유도체인 플라스미드 pCD574이었다. 2개의 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응에 프라이머로서 사용하였다(제6도 참조):
1. pGEM-3Z MCS의 EcoRI 부위(위치 2689-2712)의 하부에 유전자를 위치시키는 좌향의 일반적인 (벡터) 프라이머 31-PCR-BP
(5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3').
상기 프라이머의 5'-말다에는 2개의 As, 및 2개의 제한 부위(BamHI 및 PstI)가 존재하여 상기 PCR 산물의 클로닝을 용이하게 한다.
2. 우향의 돌연변이성 프라이머 56-PCR
(5'-AAGAGATCTCATATGACCACCTTGCCCTGAAG-3'). 상기 프라이머의 5'-말단에는 2개의 As, 하나의 G, 및 2개의 제한 부위(Bq1Ⅱ 및 NdeI)가 있다. NdeI 부위는 E1-베타 개방 판독 프레임의 ATG 개시 코돈과 겹쳐있다.
폴리머라제 쇄 반응을 이전에 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응 산물을 0.8% 한천 겔에서 전기영동에 의해 분석하였다. 정확한 크기(약 1.1kb 길이)의 PCR-증폭된 DNA 단편을 전기용출시키고, 제한효소 NdeI 및 EcoRI으로 절단시키고, NdeI/EcoRI 선형화된 플라스미드 pT7-7내로 서브클로닝시켜 연결 및 이.콜라이 DH5-알파 세포내로 형질전환시 플라스미드 pCD666을 수득하였다. 최종적으로, 플라스미드 pCD666을 플라스미드 pGP1-2(이 플라스미드는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유함)를 운반하는 이.콜라이 균주 C600내로 도입시켰다.(문헌[Tabor, 1990]참조). 하나의 형질전환체를 추가의 연구를 위해 선별하고 균주 CD673으로서 기록하였다.
[C. 에스.아베르미틸리스 E1-알파 및 E1-베타 bkd ORF를 운반하는 pCD736의 제작]
약 2의 플라스미드 pCD670을 부분 BamHI 절단에 이해 선형화시켰다. 플라스미드 pCD670의 선형화된 형태를 얻기 위해서, BamHI 절단 혼합물의 분액을 하기의 시점에서 취하였다: 1,3,5,10 및 20분. 분액들을 0.8% 한천겔에 통과시켰다. 선형화된 형태(약 4.3kb 길이)를 CIAP를 사용하여 전기용출시키고 탈인산화시켜 회수하였다(상술한 바와 같음). 이어서, 상기 플라스미드 pCD670의 탈인산화된 선형 형태의 1/2을 플라스미드 pCD577로부터 단리된 0.8kb BamHI/Bq1Ⅱ 단편과 연결시켰다. 상기 연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 DH5-알파 세포를 형질전환시켰다. 10개의 클론을 회수하고 소규모 제조 공정에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 분석에 의해 분석하였다. CD736 균주로서 보고된 하나의 클론은 정확하게 조립된 플라스미드 pCD736을 함유하였다. 최종적으로 플라스미드 pCD736을 플라스미드 pGP1-2를 운반하는 이.콜라이 균주 C600내로 도입시켰다. 하나의 형질전환체를 추가의 연구를 위해 선별하고 CD737 균주로서 기록하였다. CD705 균주로 보고된 또다른 클론은 플라스미드 pCD705를 함유하였으며, 상기는 잘못 배향된 0.8kb BamHI/Bq1Ⅱ 단편을 운반하였다. pCD705 구조물을 발현 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다.
[D. 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자 군을 운반하는 pCD685의 제작]
상술한 바와 같이 제한 효소 BamHI을 이용한 부분 절단에 의해 수득된 플라스미드 pCD670의 탈인산화된 선형 형태의 나머니 1/2을 프라스미드 pCD577로부터 단리된 7kb BamHI 단편과 연결시켰다. 상기 연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 DH5-알파 세포를 형질전환시켰다. 다수의 클론들을 회수하고 이들중 16개를 추가의 분석을 위해 선별하였다. 플라스미드 DNA를 추출하고 제한 분석에 의해 분석하였다. CD685 균주로서 보고된 하나의 클론은 정확하게 조립된 플라스미드(pCD685)를 함유하였다. 최종적으로 플라스미드 pCD685를 플라스미드 pGP1-2를 운반하는 이.콜라이 C600내로 도입시켰다. 하나의 형질전환체를 추가의 연구를 위해 선별하고 균주 CD687로 기록하였다.
[실시예 10]
[T7 이중 플라스미드 시스템을 사용하는 에스.아베르미틸리스 bkd 유전자의 에스케리키아 콜라이에서의 발현]
상이한 pT7-7 구조물을 함유하는 이.콜라이 C600(pGP-1)의 유도체들(균주 CD676, CD673, CD737 및 CD687)을 카나마이신(60/) 및 암피실린(60/)을 모두 함유하는 LB 배지 5에서 밤새 30℃에서 증식시켰다. 이어서 상기 밤새 증식시킨 배양물을 새로운 LB/암피실린/카나마이신 배지를 함유하는 튜브 배양물(25x150mm)내로 1:40(0.25:10.00)으로 희석시키고 30℃에서 진탕기로 통기시키면서 약 0.4의 흡광도(OD590)로 증식시켰다. T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자를 42℃로 온도로 30분간 상승시킴으로써 유도하고, 이어서 T7 프로모터의 조절하에서 상기 유전자(들)를 유도하였다(문헌[S. Tabor, 1990] 참조). 최종적으로 온도를 37℃로 감소시키고 세포를 진탕시키면서 추가로 90분간 증식시켰다. 유도되지 않은 대조용 배양물은 항상 30℃에서 유지시켰다. 단백질을 문헌[C.D. Denoya et al., 1986, J. Bacteriol., 168:1133-1141]에 개시된 바와 같이 나트륨 도데실 셀페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 효소 활성은 실시예 11에 개시된 바와 같이 분석하였다.
[실시예 11]
[재조합 이.콜라이 균주의 조 추출물에서의 E1 에스.아베르미틸리스 BCKDH 활성의 측정]
[A. 세포 용균물의 제조]
세포(8-배양물로부터 유도된 것)를 원심분리(5,000rpm-3,000xg에서 5분, 4℃에서 냉장된 Sorvall SS-34 회전기 사용)에 의해 수거하고, "절단 완충액"(0.05M 인산칼륨 완충액, pH 7.0, 3% 트리톤 X-100, 15% 글리세롤, 3mM 디티오쓰레이톨, 1/의 칠면조 난백 트립신 억제제, 5mM EDTA 및 0.04mM TPP[티아민 피로포스페이트] 함유) 5에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 프렌치 프레스로 옮기고 세포들을 5,000xpsi에서 1회 통과시켜 파괴시켰다. 이어서 상기 프렌치 압축물 1.5분액을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 14,000rpm에서 30초간 원심분리에 의해 등명화시켰다. 각각의 상등액 100분액을 효소 분석당 사용하였다. 단백질 농도를 바이오-래드 단백질 분석(Bio-Rad Laboratories, 미합중국 캘리포니아주 리치몬드 소재)을 사용하여 측정하며, 상기 분석은 브래드포드 염료-결합 공정(Bradford, M., Anal. Biochem., 72:248, 1976)을 기본으로 한다.
[B. 에스.아베르미틸리스 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제(BCKDH) 복합체 E1 성분에 대한 분석]
BCKDH E1 활성을 상술한 방사성 화학 분석의 편법(Chuang, D.T., 1988, Methods Enzymol., 166:146-154; 및 Hafner, E.W. et al., 1991, J. Antibiotics, 44:349)에 의해 측정하였다. 15유리 섬광 바이알의 기부에 0.25M 인산 칼륨 완충액(pH 6.5) 0.148; 0.1M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 이나트륨 염) 0.002; 0.1M MgCl20.004; 3.7mM 티아민 피로포스페이트(TPP) 0.02; 37mM NaAsO20.02; 37mM 2,6-디클로로페놀인도페놀(나트륨 염,Sigma D-1878) 0.01; 알파-[1-14C]케토이소카프로에이트 원액(나중에 기술하는 바와 같이 제조) 0.08; 물 0.058및 등명화된 무 세포 추출물 0.1을 가하였다. 상기 바이알의 입구를 Solvable(NEW-Dount으로부터 구입한 티슈 및 겔용해액)로 침지시킨 와트만(Whatman) 4CHR 종이(와트만 제품번호 3004614)로 즉시 덮었다. 이어서 플라스틱 캡을 상기 바이알에 단단히 씌우고, 상기 캡과 상기 바이알의 상부 1/2을 파라필름으로 싸고, 30℃에서 2시간 동안 서서히 진탕시키면서 배양시켰다. 상기 배양의 완료시에, 여과지를 4의 "Ready Safe"(Beckman) 액체 섬광 칵테일을 함유하는 7유리 섬광 바이알로 옮겨 방사능을 측정하였다. 상기 알파-[1-14C]케토이소카프로에이트 원액은 20mM 알파-케토이소카프로에이트(나트륨 염, Sigma K-0629) 5.6, 알파-[1-14C]케토이소카프로에이트(55mCi/mmol, 50μ Ci/, Amersham) 50및 최종 부피 1로 만들기에 충분한 물을 혼합하여 제조하였다. 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제의 E1성분의 비활성은 하기 표 1에 나타내는 바와 같이 단백질당 분당 방출된 이산화 탄소의 피코몰로 표시된다.
[서열 식별 번호의 설명]
서열 식별 번호 1은 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E1-알파 소단위를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 상기 서열은 또한 염기403-1548로서 제4도에 도시되었다.
서열 식별 번호 2는 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E1-베타 소단위를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 상기 서열은 또한 염기1622-2626으로서 제4도에 도시되었다.
서열 식별 번호 3는 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E2 소단위의 아미노 말단 영역을 암호화하는 개방 판독 프레임을 개시하는 DNA 서열을 나타낸다. 상기 서열은 또한 염기2626-2727으로서 제4도에 도시되었다.
서열 식별 번호 4는 pCD539의 염기 3-251을 나타내는 DNA 서열이다. 이는 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E2 소단위를 암호화하는 유전자의 부분적인 중간 서열이다. 상기 서열은 제5도에 도시되었다.
서열 식별 번호 5는 제4도에 도시되고 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E1-알파,E1-베타 및 E2(부분) 소단위의 개방 판독 프레임을 함유하는 에스.아베르미틸리스 게놈 DNA 단편의 2728 염기쌍을 나타내며 제4도에 도시되었다.
서열 식별 번호 6은 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E1-알파 소단위의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 아미노산 서열은 서열 식별 번호 1의 DNA 서열에 의해 암호화된다.
서열 식별 번호 7은 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E1-베타 소단위의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 아미노산 서열은 서열 식별 번호 2의 DNA 서열에 의해 암호화된다.
서열 식별 번호 8은 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E2 소단위의 아미노 말단 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 아미노산 서열은 서열 식별 번호 3의 DNA 서열에 의해 암호화된다.
서열 식별 번호 9는 pCD539의 염기 3-251에 의해 나타내는 DNA 서열(서열 식별 번호 4)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 아미노산 서열은 에스.아베르미틸리스 BCKDH의 E2 소단위의 중간 펩티드 단편을 나타낸다.
[서열 목록]
(1) 일반 정보
(i) 출원인(미합중국을 제외한 모든 지정국):
(A) 명칭 : 화이자 인코포레이티드
(B) 거리 : 이스트 42번 스트리트 235, 20층
(C) 도시 : 뉴욕
(D) 주 : 뉴욕
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : 10017-5755
(ⅱ) 출원인(미합중국을 위한)
(A) 클라우디오 디. 데노야(Claudio D. Denoya)
(B) 거리 : 스파이글래스 써클 80
(C) 도시 : 그로톤
(D) 주 : 코넥티컷
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : 06340
(ⅲ) 발명의 명칭 : 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로 부터의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 유전자
(ⅳ) 교신 주소 :
(A) 수신인 : 피터 씨. 리챠드슨(Peter C. Richardson)
(B) 거리 : 화이자 인코포레이티드, 이스트 42번 스트리트 235, 20층
(C) 도시 : 뉴욕
(D) 주 : 뉴욕
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : 10017-5155
(ⅴ) 현재 출원 자료 :
출원인
(A) 출원번호 : 08/100,518
(B) 출원일 : 1993년 7월 30일
(C) 분류 번호 :
(ⅵ) 우선 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : 미합중국 08/100,518
(B) 출원일 : 1993년 7월 30일
(ⅶ) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 셰이카, 로버트 에프.(Sheyka, Robert F.)
(B) 등록 번호 : 31,304
(C) 참고/일람 번호 : PC8346
(ⅷ) 통신 정보 :
(A) 전화 : (212)573-1189
(B) 팩스 : (212)573-1939
(C) 텔렉스 : N/A
(ⅸ) 서열 수 : 9
(ⅹ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(2)서열식별번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1146 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : cDNA
(ⅲ) 가설 : 없음
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 1:
(2)서열식별번호 2에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1005 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : cDNA
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 2:
(2)서열식별번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 102 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : cDNA
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 3
(2)서열식별번호 4에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 249 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : cDNA
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 4:
(2)서열식별번호 5에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 2728 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : cDNA
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 5:
(2)서열식별번호 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 381 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : 펩티드
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 6:
(2)서열식별번호 7에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 334 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : 펩티드
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 7:
(2)서열식별번호 8에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : 펩티드
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 8:
(2)서열식별번호 9에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 83 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 타입 : 펩티드
(xi) 서열 기술 : 서열식별번호 : 9:

Claims (13)

  1. 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 미생물의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하고, 서열식별번호 1, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4, 또는 서열식별번호 5의 DNA 서열을 포함하는, 단리된 DNA 단편.
  2. 제1항에 있어서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 단리된 DNA 단편.
  3. 제1항에 있어서, 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체의 발현을 조절하는 DNA 영역을 또한 포함하는 단리된 DNA 단편.
  4. 제2항에 있어서, 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체의 발현을 조절하는 DNA 영역을 또한 포함하는 단리된 DNA 단편.
  5. 제1항에 따른 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA.
  6. 제5항에 따른 재조합 DNA 가 포함된 숙주 세포.
  7. 제5항에 따른 재조합 DNA를 포함하는 플라스미드.
  8. pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 및 pCD557로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 제3도에 도시된 게놈 제한 지도를 갖는 DNA 단편.
  9. 제8항에 따른 DNA 단편이 포함된 숙주 세포.
  10. 제1항에 있어서, 서열식별번호 1, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4 또는 서열식별번호 5의 DNA 서열의 전사 또는 번역을 조절하는 DNA 영역을 포함하는 DNA 단편.
  11. 제8항에 따른 DNA 단편에 함유된 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체의 유전자.
  12. 서열식별번호 1, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4 또는 서열식별번호 5의 DNA 서열의 일부분을 포함하며, 탐침으로서 사용시 서열식별번호 1, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4 또는 서열식별번호 5의 DNA 서열에 각각 하이브리드를 형성시킬 수 있거나, 또는 폴리머라제 쇄 반응 프라이머로서 사용시 상기 서열의 전부 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편.
  13. 서열식별번호 6, 서열식별번호 7, 서열식별번호 8 또는 서열식별번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
KR1019960700455A 1993-07-30 1994-05-30 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로 부터의 측쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체를 암호화하는 유전자 KR100221385B1 (ko)

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