KR100374672B1 - 플라스미드 - Google Patents

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Abstract

숙주가 본래갖고 있지 않는 RNA 폴리머라아제에 의해 인식될 수 있고 목적 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 서열과 외래인자에 의한 유도하에서 카피수를 증가시키는 복제 오리진을 갖는 것을 특징으로하는 플라스미드 벡터; 이 벡터를 이용한 목적 유전자의 발현 및 단리 방법; AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 폴리펩티드를 코딩하는 DNA. 본 발명은 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는 외래 목적 유전자를 숙주에 도입할 수 있는 플라스미드 벡터, 이 벡터를 이용하여 단백질을 효율적으로 발현시키는 방법 및 또한 종래기술에서는 어려웠던 수식효소유전자의 부재하에서조차 제한-수식 시스템을 구성하는 제한효소유전자가 단리되도록하는 방법을 제공한다.

Description

플라스미드
유전자 재조합 기술로 목적 유전자의 발현 시스템을 구축하는데 있어서, 유전자의 발현은 사용하는 숙주의 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터의 지배하에 유전자를 배치함으로서 제어한다. 그러나, 숙주에 해로운 단백질을 코딩하는 유전자의 경우에 있어서, 플라스미드 구축자체는 종종 사용하는 프로모터의 발현 제어가 엄격히 제어되지 않는 것에 기인하여 유전자산물의 발현에 의해 방해받는다.
이러한 문제점을 해결하는 발현 시스템으로서, 대장균을 숙주로서, 대장균을 감염하는 박데리오파아지 T7의 RNA 폴리머라아제를 이용하는 pET 시스템 (노바겐사제) 를 개발하였다 [Journal of Molecular Biology, Vol. 189, pp. 113-130(1986); Gene. Vol. 56, pp. 125-135 (1987)]. pET 시스템은, 프로모터 인식특이성 및 전사활성이 높은 T7 RNA 폴리머라아제가 대장균내 발현되도록하여. T7 RNA 폴리머라아제가 발현 벡터상의 T7 프로모터의 하류에 배치된 목적 유전자를 전사하여 유전자를 고발현시키는 시스템이다. 목적 유전자의 전사는 T7 RNA 폴리머라아제의 존재하에서 발생하기 때문에, 숙주가 이 폴리머라아제를 생산하지 않으면, 숙주내 플라스미드 구축은 목적 유전자의 발현없이도 가능하고; 목적 유전자를 숙주의 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터의 지배하에 두면서 발현 시스템을 구축하는 경우에서와 같이, 플라스미드 구축자체는 결코 방해받지 않는다.
그러나, T7 RNA 폴리머라아제 유전자는 λ-파아지 벡터상에 클론되고 발현 숙주로 용원화되기 때문에.,숙주선택의 자유는 없고; 숙주가 변경되면 번잡한 조작이 필요하다. 또한, 숙주내 T7 RNA 폴리머라아제의 발현은 엄밀히 제어되지 않기 때문에, T7 RNA 폴리머라아제는 숙주가 비유도상태의 경우에서조차 발현되어, 그 결과 비유도상태에서 조차 발현 벡터상의 T7 프로모터의 하류에 배치된 목적 유전자의 발현을 가져온다. 비유도상태에서의 목적 유전자의 이러한 발현을 억제하기 위해서는, T7 RNA 폴리머라아제 억제제인 T7 라이소자임을 이용하여 T7 RNA 폴리머라아제활성을 억제하거나 [Journal of Molecular Biology. Vol, 219, pp. 37-44 (1991)]. 또는 락토오스 오퍼레이터를 T7 프로모터의 하류에 배치함으로서 T7 RNA 폴리머라아제를 T7 프로모터에 접근하지 못하도록 한다 [Journal of Molecular Biology Vol. 219. pp. 45-59 (1991)].
그러나, 비록 이러한 조치도 고 전사활성의 T7 RNA 폴리머라아제에 대한 효과면에서 불만족스러워, 비유도상태의 T7 RNA 폴리머라아제의 활성은 완전히 저지될수 없다. 이러한 이유로, 목적유전자 산물은 숙주에 치명적이면, 플라스미드 구축이 가능한 경우에서 조차, 유전자의 발현을 위한 형질전환체를 제조하는 것은 몇몇의 경우에서는 불가능하다. 즉, pET 시스템에는 해결하여야 할 두가지의 문제점을 갖는다; 하나는 숙주를 자유롭게 변경할 수 없는 점이고, 다른 하나는 T7 RNA 폴리머라아제 발현 제어의 부정확함이다.
한편, 박테리오파아지 T7 과 유사한 특성을 갖으며, 살모넬라 타이피무륨 (Salmonella typhimurium) 을 감염하는 박테리오파아지 SP6 [Science. Vol, 133. pp. 2069-2070 (1961)] 으로 공지된 박테리오파아지가 있다. 약 100,000 의 분자량을 갖는 단일 펩티드인, 박테리오파아지 SP6 에 의해 생산되는 RNA 폴리머라아제는, 높은 프로모터 인식특이성 및 전사 활성을 갖기 때문에 생체외 RNA 합성에 통상 사용된다 [Journal of Biological Chemistry. Vol. 257, pp. 5772-5778 (1982), Journal of Biological Chemistry, Vol. 257, pp. 5779-5788 (1982)]. 이외에, SP6 RNA 폴리머라아제 유전자가 이미 클론화되어 있고 대장균에서 대량으로 발현되었다 [Nucleic Acids Research, Vol. 15, pp. 2653-2664 (1987)].
발현산물이 숙주에 치명적으로 작용하는 유전자는 제한효소 유전자에로 예증된다. 본래, 제한효소는 제한효소를 생산하는 미생물의 세포에 침입하는 파아지 등의 외래 RNA 를 절단하여 자가방어를 위해 사용된다. 한편, 제한효소를 생산하는 미생물은 대부분 제한효소와 동일한 염기서열을 인식하는 수식효소 (modification enzyme) 를 생산하여 제한효소에 의한 절단에 대항하여 자체 DNA 를 보호한다. 구체적으로 수식효소는 수식효소에의해 인식되는 염기서열내 하나이상의 염기에 메틸기를 첨가하여 DNA 를 수식하여, 수식효소와 동일한 서열을 인식하는 제한효소가 결합하거나 DNA를 절단하는 것을 불가능하게한다. 이러한 메카니즘은 제한수식시스힘으로 불리우고. 제한수식시스템을 구성하는 제한효소와 수식효소의 유전자쌍을 제한수식시스템 유전자라 부른다. 그러므로, 제한효소 유전자가 제한수식시스템 유전자에서 수식효소 유전자가 결핍된 미생물내에서 발현되는 경우, 미생물의 DNA 는 절단되어 세포가 죽게된다. 사실, MboI 제한수식시스템유전자내에는 두 개의 수식효소 유전자가 있다; 제한효소유전자의 클로닝은 양 수식효소유전자중의 하나의 공존하에서의 불완전한 메틸화의 경우에서는 숙주 DNA 의 불완전한 수식으로 인해 불가능함이 보고되었다 [Nucleic Acids Research, Vol. 21, pp. 2309-2313 (1993)].
또한, 제한수식시스템유전자가 제한수식시스템유전자를 보유하는 세포로부터 결실되면, 세포에서의 수식활성의 결핍은 게놈 DNA의 불완전한 메틸화를 초래하여, 잔존하는 제한효소의 극소량에 의해 자체 게놈 DNA 의 치명적인 절단을 유발함이 실증되었다 [Science. Vol. 267, pp. 897-899 (1995)]. 요약하면, 제한수식시스템을 구성하는 수식효소의 부재하에서, 제한효소는 세포에 매우 유해한 단백질로서 작용하며; 이의 유전자의 개별적인 클로닝 및 발현은 종래기술로는 불가능하다.
제한효소에 있어서, 제한효소는 이들의 효소특성에 의해 세가지의 유형으로 분류할 수 있다: I, II 및 III, 특히, 특정의 DNA 염기 서열을 인식하고, 이를 서열내부 또는 부근의 특정 위치에서 절단하는 II 형 제한효소는 유전공학분야에서 광범위하게 사용되며, 다양한 특성을 갖는 이런 유형의 제한효소는 다양한 미생물로부터 단리된다[Nucleic Acids Research. Vol. 24. pp. 223-235 (1996)]. 본 발명의 명세서에 있어서, II 형 제한효소는 이후 "제한효소" 로 칭한다. 그러나, 몇몇의 미생물은 단지 소량의 제한효소만을 생산하고, 나머지들은 복수의 제효소를 생산함을 주지하여야 한다. 예컨대 제한효소 AccIII 은 통상산업성공업지술원미생물공업기술연구소 [주소: 일본 이바라끼껭 쓰꾸바군 야따베마찌 히가시 1 쵸메 1 방 3 고] 에 1985 년 11 월 9 일자로 기탁번호 FERM BP-935 로 기탁된 아시네토박터 칼코아세티커스 (Acinetobatter calcoaceticus) (이후 Acc 균으로 약칭함) 에 의해 생산되나, 생산된 효소의 양은 적고 이 미생물은 또한 제한효소 AccI 및 AccII 를 동시에 생산한다. 그러므로, 이 미생물을 이용하여 고순도 및 저경비의 시약으로서 제한효소 AccIII 를 제공하기 위해서는 향상된 생산기술이 필요하다. 고순도 및 저경비의 시약으로 제한효소를 제공시에, 목적 제한효소유전자를 단리하고 유전공학기술로 목적 제한효소를 대량으로 선택적으로 생산하는 것이 효과적이다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 제한효소유전자를 단리하는 몇몇의 방법이 보고되어 있다.
첫째로, 제한효소를 생산하는 미생물의 게놈 DNA 를 적당한 제한효소를 이용하여 절단하여, 생성된 단편을 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하고, 제한효소 유전자를 발현시키는 클론을 선택하는, "샷건" 방법을 들수 있다. 목적하는 클론을 위한 스크리닝 방법의 예로는 제한수식시스템 유전자를 숙주에 도입시 숙주에의해 획득되는 자가방어기능에 기초하여, 지표서 파아지 감염에 대한 내성으로 제한수식시스템 유전자를 단리되는 방법을 들 수 있다 [Pstl : Proceedings of the NationalAcademy of Science of the USA. Vol. 78. pp. 1503-1507 (1981)]. 그러나, 이 방법은 제한수식시스템 유전자의 크기는 이의 단리를 가능케하는 범위내이고, 단리된 제한수식시스템 유전자의 발현은 충분한 파아지 내성을 보여 숙주를 선택적으로 생존시키는 것을 필요로한다. 한편, 제한수식시스템 유전자의 일반적 특징으로서, 제한효소 유전자 및 수식 효소 유전자의 게놈상의 밀접한 위치를 언급할 수 있고, 사실, 이것은 지금까지 수득되었던 많은 제한수식시스템 유전자에서 확인된다 [Nucleic Acids Research, Vol. 19, pp. 2539-2566 (1991). 따라서, 전술한 특징에 기초하여 지표로서 수식효소 유전자의 발현으로 대한수식시스템 유전자를 스크리닝하는 방법이 있다 [일본 특허공개 제 63-27982: Nucleic Acids Research, Vol. 19, pp. 1831-1835 (1991). 그러나, 제한효소 유전자가 수식효소유전자와 가깝지 않은 경우. 이 방법으로는 제한효소유전자를 수득할 수 없다.
더욱이, 전술한 "샷건" 방법은 게놈 DNA 원 유기체와 숙주사이의 전사-번역 기제에서의 차이와 관련된 근본적인 문제점을 노정한다. 예컨대, 제한수식시스템 유전자를 수반하는 프로모터 및 리보좀 결합 부위가 숙주내에서 잘 기능하는 것의 실패로 인해 유전자 발현이 불충분한 경우, 비록 수득하더라도, 목적 유전자를 함유하는 형질전환체를 선택하기 위해서는 노고를 필요로 한다. 이러한 결점을 피하기 위해서, 제한효소단백질의 아미노산 서열을 분석하고, 수득한 서열 데이터를 기초로한 PCR-기초 DNA 증폭을 하여 제한효소를 생산하는 미생물의 게놈 DNA 로 부터 제한효소유전자를 수득하며, 공지된 단백질 발현 시스템을 이용하는 방법이 있다 [일본 특허공개 제 6-277O7O 호]. 제한효소의 존재가 통상적 단백질 발현 시스템에서 숙주에 치명적이기 때문에, 예컨대, 효소와 함께 제한 수식시스템을 구성하는 수식효소가 공존되도록하여 숙주를 보호할 필요가 있다.
비록 전술한 모든 제한효소유전자의 단리방법은 이 유전자와 함께 제한수식시스템 유전자를 구성하는 수식효소유전자와 제한효소 유전자를 동시에 단리시킬 필요가 있지만, 제한효소유전자만을 단리하는 또다른 방법이 보고되어 있다 [Nucle Acids Research, Vol. 22, pp. 2399-2403 (1994)]. 그러나, 이 방법에서는, 효소활성에 대한 최적의 온도가 약 7O℃ 인 제한효소를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한것이고; 수식효소유전자의 공존은 단리시킬 유전자가 숙주배양온도부위에서 높은 특이활성을 보이는 제한효소를 코딩하는 경우 필요하다.
예외적으로, 제한효소 DpnI 와 같이, 제한효소의 DNA 인식서열내 특정 핵산염기가 메틸화에 의해 수식되지 않는다면, 절단활성을 보이지 않는 제한효소가 존재한다. 이러한 특성을 갖는 제한효소용 유전자는, 적당한 숙주 유기체를 선택함으로서 또다른 특정 유전자의 부재하에서 조차 단리될 수 있다는 점에서 예외적인 것으로 생각되어 진다. 사실, II 형 제한효소가 아니라 메틸화 핵산염기를 포함하는 특정 DNA 염기서열을 인식하고 DNA 절단 활성을 보이는, Mrr 단백질을 코딩하는 mrr 유전자가 단리된다 [Journal of Bacteriolgy, Vol. 173. pp. 52O7-5219 (1991)].
전술한 바와 같이, 종래기술에 의한 제한효소 유전자의 단리는 특수한 경우는 제외하고, 이 유전자와 함께 제한수식시스템 유전자를 구성하는 수식효소유전자와 제한효소유전자를 동시에 발한시킬 필요가 있다.
본 발명은 유전자 재조합 기술에서 사용할 수 있는 플라스미드 벡터 및 이 플라스미드 벡터를 사용하여 유전자를 발현시키기는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 플라스미드 벡터를 이용하여 목적 유전자를 단리하는 방법에 관한 것이다. 이외에, 본 발명은 유전공학시약으로 이용할 수 있는 제한 효소 및 이의 유전자, 좀더 상세히는 AccIII 제한효소(restriction endonuclease) 및 이를 코딩하는 DNA 에 관한 것이다.
도 1 은 모델 발현 플라스미드 pMSP6L 및 pMSP6F 의 구성을 보여준다.
도 2 는 모델 발현 플라스미드 pMSP6O 의 구성을 보여준다.
도 3 (A) 및 (B) 는 런어웨이 플라스미드 pMS287O 의 구축의 절차를 보여준다.
도 4 는 런어웨이 플라스미드 pMS287O 의 구성을 보여준다.
도 5 (A) 및 (B) 는 플라스미드 pCRS04 의 구축의 절차를 보여준다.
도 6 은 플라스미드 pCRS04 의 구성을 보여준다.
도 7 은 플라스미드 pCRA19 의 구성을 보여준다.
도 8 (A),(B),(C),(D) 및 (E) 는 시스템 플라스미드 pFSP6 의 구축의 절차를 보여준다.
도 9 (A) 및 (B) 는 플라스미드 pACE601 의 구축의 절차를 보여준다.
도 10 은 플라스미드 pACE611 의 구성을 보여준다.
도 11 (A) 및 (B) 는 플라스미드 pACE611 의 구축의 절차를 보여준다.
도 12 (A) 및 (B) 는 플라스미드 pCRS7O 의 구축의 절차를 보여준다.
도 13 (A) 및 (B) 는 플라스미드 pACE701 및 pACE7O2 의 구축의 절차를 보여준다.
도 14 는 대장균 HB101 에 pFSP6 및 pACE601 또는 pFSP6 및 pACE601-NspIII 을 도입한후, IPTG 유도의 유무에 따른 Nsp7524III 제한효소활성의 발현을 λ-DNA 의 분해반응액의 아가로오스겔전기영동으로 조사한 도이다. 이 도에서, M 은 λ-EcoT141 사이즈 마커를 나타내고; 1 은 Aval 소화 λ-DNA 를 나타내며; 2 는 유도후 HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내고; 3 은 유도전 HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내며; 4 는 유도후 HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타내고; 5는 유도전 HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타낸다.
제 15 도는 대장균 HB101 에 pFSP6 및 pACE601 또는 pFSP6 및 pACE601-NspIII 을 도입한후 IPTG 의 유도 또는 비유도에 따른 λ-DNA 의 분해반응의 2 및 3 시간-연장의 경우에서의 아가로오스겔 전기영동의 결과를 보여준다. 이 도에서, M 은 λ-EcoT141 사이즈 마커를 나타내고, 1 은 Aval 소화 λ-DNA 를 나타내며; 2 는 1 시간후(유도)HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내고; 3 은 2 시간후 (유도) HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내며; 4 는 3 시간후 (유도)HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내고; 5 는 1 시간후 (비유도) HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내며; 6 은 2 시간후 (비유도) HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내고; 7 은 3 시간후 (비유도) HB101/pFSP6/pACE601 를 나타내고; 8 은 1 시간후 (유도) HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타내고; 9 는 2 시간후 (유도) HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타내며; 10 은 3 시간후 (유도) HB101/pFSP6/pACE6Ol-NspIII 를 나타내고, 11 은 1 시간후 (비유도) HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타내며; 12 는 2 시간후 (비유도) HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타내고; 13 은 3 시간후 (비유도) HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 를 나타낸다.
도 16 은 AccIII 제한 수식 시스템 유전자의 구축을 보여준다.
그러므로, 본 발명의 첫 번째 목적은 단리 또는 발현 시스템의 구축이, 유전자산물이 숙주에 치명적이거나 해롭기 때문에 종래기술에서 어려웠던 것과 같은 유전자를 단리시키고, 숙주에 도입하여 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있는 플라스미드 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 두 번째 목적은 이 플라스미드 벡터를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 세 번째 목적은 이 플라스미드 벡터를 이용하여 목적유전자를 단리하는, 특히 제한수식시스템을 구성하는 수식효소유전자의 공존없이 제한효소유전자를 단리하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 네 번째 목적은 AccIII 제한 효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다섯 번째 목적은 AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 를 제공하는 것이다.
첫째로, pET 시스템에서의 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명자는 새로운 정확한 발현 제어 발현시스템으로서 SP6 RNA 폴리머라아제를 이용한 발현시스템을 구축하고, 이를 평가시험하였다.
발현시스템은 SP6 RNA 폴리머라아제가 miniF 플라스미드에 삽입된 시스템 플라스미드를 이용하여 구축하기 때문에, 목적유전자에 대한 발현 시스템은 SP6 프로모터의 하류에 클론된 목적 유전자를 내포하는 발현벡터와 상기 시스템 플라스미드를 숙주에 동시에 도입하여 대장균의 다양한 균주에서 구축할 수 있다. 이외에, lac 프로모터 및 안티센스 기술을 이용하여, 본 발명자는 시스템 플라스미드상의 SP6 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현의 정확한 제어를 가능케하였다. 리포터 유전자로서 β-갈락토시다아제 유전자를 이용하는 상기 발현 시스템의 평가결과는 SP6 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현은 상기 시스템에서 정확히 제어되며, 비유도상태에서 SP6 RNA 폴리머라아제의 발현이 거의 존재하지 않으며, 유도후 목적 유전자를 효과적으로 발현시키기에 충분한 양의 SP6 RNA 폴리머라아제의 발현 및 고 수준에서의 목적 유전자의 후속 발현이 뒷따름을 실증한다
그러나, 사용하는 숙주가 대장균인 경우, SP6 프로모터의 하류의 목적 유전자는 SP6 프로모터는 매우 약하나 대장균 RNA 폴리머라아제에 의해 정확하게 인식되기 때문에 비유도상태에서 조차 매우 소량으로 발현됨이 또한 보여진다. 따라서 유전자 산물이 매우 해롭고 치명적으로 대장균에 작용하는 경우, 발현 시스템 구축은 불가능하게 되어 본 발명의 목적은 달성될 수 없음이 입증되었다.
이러한 발견을 염두에 두고, 본 발명자는 추가로 광범위한 연구결과, 두 제어방법의 조합, 즉, 유전자의 카피수의 제어 및 프로모터를 통한 전사제어를 이용하여 목적유전자의 발현을 제어하는 새로운 시스템을 이용하여, 뜻밖으로 (i) 비유도상태에서의 목적 유전자의 발현은 비검출수준으로 억제될 수 있고, (ii) 발현유도는 목적 유전자를 함유하는 플라스미드의 카피수를 증가시키고 RNA 폴리머라아제 발현을 유발하여, RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터의 하류에 위치한 목적 유전자의 전사 및 번역을 가져옴을 발견하였다. 즉, 본 발명의 플라스미드 벡터는 유전공학의 분야예서의 상기 문제점들을 해결하는 독특한 특징을 갖는 플라스미드 벡터이다. 본 발명자는 상기의 발견을 기초로하여 추가의 연구를 행하였고, 이 벡터를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법을 개발하였다.
또한 본 발명자는 발현산물이 숙주에 치명적으로 작용하는 유전자를 전술한 플라스미드 벡터를 이용하여 단리하는 방법, 좀더 구체적으로는 종래기술의 결점없이 제한효소 유전자를 단리하는 방법을 개발하였다.
또한 본 발명자는 전술한 방법을 이용하여, AccIII 수식효소의 공존없이, 지금까지 수득된 적이 없는 AccIII 제한효소를 코딩하는 DNA 를 단리하고, AccIII 제한효소를 대량으로 발현시킬 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 요지는 이하와 관련된 것이다 :
(1) 숙주가 본래갖고 있지 않는 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는, 목적 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 서열 및 외래인자에 의해 유도됨으로서 카피수를 증가시키는 복제 오리진을 갖는 것을 특징으로하는 플라스미드 백터;
(2) 프로모터 서열은 박테리오파아지 유래의 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 상기 (1) 항 기재의 플라스미드 벡터;
(3) 프로모터 서열은 SP6 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 상기 (2) 항 기재의 플라스미드 벡터;
(4) 프로모터 서열은 서열목록의 SEQ ID NO : 30 의 염기서열을 포함하는 상기 (3) 항 기재의 플라스미드 벡터;
(5) 복제 오리진은 프로모터 제어하에 있는 상기 (1) 내지 (4) 항중 어느 한 항 기재의 플라스미드 벡터;
(6) 복제 오리진은 lac 프로모터의 제어하에 있는 상기 (1) 내지 (5) 항중 어느 한 항 기재의 플라스미드 벡터;
(7) 선택 마커로서 약제내성 유전자를 포함하는, 상기 (1) 내지 (6) 항중 어느 한 항 기재의 플라스미드 벡터;
(8) pACE601, pACE61l, pACE701 및 pACE702 으로 선택하는, 상기 (7) 항에 기재된 플라스미드 벡터;
(9) 발현시킬 목적 유전자가 상기 (1) 내지 (8) 항중 어느 한 항에 기재된 플라스미드 벡터에 통합되어 있는 플라스미드 벡터;
(10) 상기 (1) 내지 (8) 항중 어느 한 항에 기재된 플라스미드 벡터에 목적 유전자가 통합된 플라스미드 벡터와 이 플라스미드 벡터내 프로모터 서열을 인식하는 RNA 폴리머라아제 유전자를 숙주에 도입하고, 외래 인자를 이용하여 상기 플라스미드 벡터의 카피수의 증가 및 상기 RNA 폴리머라아제의 발현을 유도하여 목적 유전자를 전사 및 번역하는 것을 특징으로하는 목적유전자의 발현방법;
(11) 플라스미드 벡터의 카피수의 증가 및 RNA 폴리머라아제의 발현은 각각의 외래인자에 의해 유도되는 것을 특징으로하는, 상기 (10) 항 기재의 목적유전자의 발현 방법;
(12) 플라스미드 벡터의 카피수의 증가 및 RNA 폴리머라아제의 발현은 동일한 외래인자에 의해 유도되는 것을 특징으로하는, 상기 (10) 항 기재의 목적유전자의 발현 방법:
(13) 플라스미드 벡터의 카피수의 증가를 유도하는 외래인자가 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)의 첨가, 락토오스의 첨가, 갈락토오스의 첨가, 아라비노오스의 첨가, 트립토판농도의 감소 및 형질전환체 배양온도의 조정으로 구성된군에서 선택한 1 종이상인 것인, 상기 (10) 내지 (12) 항중 어느 한 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법;
(14) RNA 폴리머라아제의 발현을 유도하는 외래인자가 이소프로필-2-β-티오갈락토시드(IPTG)의 첨가, 락토오스의 첨가, 갈락토오스의 첨가, 아라비노오스의 첨가, 트립토판농도의 감소 및 형질전환체 배양온도의 조정으로 구성된 군에서 선택한 1 종이상인 것인, 상기 (10) 내지 (12) 항중 어느 한 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법:
(15) RNA 폴리머라아제 유전자는 기타의 플라스미드 벡터 또는 파아지 벡터에 의해 숙주에 도입되는 것을 특징으로하는, 상기 (10) 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법.
(16) RNA 폴리머라아제 유전자는 숙주의 염색체에 통합시키는 것을 특징으로하는, 상기 (10) 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법;
(17) RNA 폴리머라아제 유전자는 SP6 파아지로부터 유래하는 것을 특징으로하는, 상기 (15) 또는 (16) 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법;
(18) 목적 유전자가 숙주에 대하여 치명적인 또는 해로운 단백질을 코딩하는, 상기 (10) 내지 (17) 항 중 어느 한 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법:
(19) 대장균을 숙주로 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 (10) 내지 (18) 항중 어느 한 항에 기재된 목적 유전자의 발현 방법:
(2O) 상기 (1) 내지 (8) 항중 어느 한 항에 기재된 플라스미드 벡터를 목적 유전자의 단리방법에 사용하는 것을 특징으로하는, 목적 유전자의 단리방법;
(21) 목적 유전자가 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는, 상기 (2O) 항에 기재된 목적 유전자의 단리방법;
(22) 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는 유전자는 제한효소 유전자인 상기 (21) 항에 기재된 목적 유전자의 단리방법;
(23) 서열 목록내 SEQ ID NO : 1 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드;
(24) 서열 목록내 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열 또는 이의 일부에서 하나이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가, 삽입 또는 치환중 하나이상에 의해 생성되는 아미노산 서열을 갖고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드;
(25) 서열목록내 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA;
(26) 서열목록내 SEQ ID NO : 2 의 DNA 의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA 이며, 이 DNA 의 발현산물이 AccIII 제한효소활성을 갖는 DNA;
(27) 서열 목록내 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열 또는 이의 일부에서 하나이상의 아미노산 잔기와 결실, 첨가, 삽입 또는 치환중 하나이상에 위해 생성되고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA; 및
(28) 상기 (25) 내지 (27) 항중 어느 한 항에 기재된 DNA 에 혼성화될 수 있고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
본 발명의 첫 번째 발명은 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는. 플라스미드 벡터는 숙주가 본래 갖고 있지않는 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되고; 목적 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 서열 및 외래인자에 의한 유도로 카피수를 증가시키는 복제 오리진을 함유하는 플라스미드 벡터를 특징으로하는 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 서열은 목적 유전자의 발현을 제어하는, 플라스미드 벡터내 함유된 프로모터 서열은 임의의 프로모터 서열일 수 있고; 특정 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터 서열, 예컨대 T7, T3, SP6 및 기타 박테리오파아지로부터 유래한 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터 서열을 사용할 수 있으며, SP6 파아지로부터 유래한 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터 서열이 바람직하다. SP6 파아지로부터 유래한 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터의 최소 영역의 염기 서열, 즉, SP6 프로모터는 서열목록내 SEQ ID NO : 30 으로 나타내었다. 더욱이, 플라스미드 벡터는 선택 마커로 사용하는 약제내성유전자를 갖을 수 있다.
본 발명의 플라스미드 벡터의 카피수의 제어, 즉, 플라스미드 벡터의 복제 오리진의 기능을 제어하는 외래인자는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예로서, 다양한 화학물질, 예컨대 락토오스 또는 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 와 같은 구조유사물, 갈락토오스 또는 구조유사물 및 아라비노오스 또는 구조유사물의 첨가; 트립토판 농도의 감소; 및 형질전환체 배양 온도의 조정을 들 수 있다. 상기 인자들로 제어될 수 있는 프로모터의 제어하에 복제 오리진을 둠으로서, 카피수 제어가 가능해진다. 이러한 목적으로 유용한 프로모터는 전술한 목적을 달성할 수 있는한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 사용하는 숙주가 대장균인 경우 lac. trp.tac. gal. ara 및 PL프로모터 등을 들 수 있다. 또한 이러한 프로모터는 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현을 유도하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 플라스미드 벡터의 복제 오리진은 특별히 한정되는 것은 아니지만 예로서 lac 프로모터의 제어하에서 런어웨이 플라스미드의 복제 오리진으로서 작용하는 플라스미드 벡터를 들 수 있다. 이 경우에서. 카피수제어는 락토오스 및 구조유사물의 첨가, 좀더 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 의 첨가로 달성된다.
본 발명의 두 번째 발명은 본 발명의 플라스미드 벡터에 목적 유전자를 통합하여 제조한 플라스미드 벡터 및 플라스미드 벡터상의 프로모터 서열을 인식하는 RNA 폴리머라아제 유전자를 숙주 세포에 도입하고, 외래인자로 플라스미드 벡터의 카피수의 증가 및 RNA 폴리머라아제의 발현을 유도하여 목적 유전자를 전사 및 번역시키는 것을 특징으로하는 발현될 목적 유전자의 발현 방법에 관한 것이다. 플라스미드 벡터상의 프로모터 서열을 인식하는 RNA 폴리머라아제 유전자는 특별히 한정되지 않지만, 예로서 전술한 박테리오파아지로부터 유래한 RNA 폴리머라아제를 들 수 있으며. SP6 파아지로부터 유래한 RNA 폴리머라아제 유전자가 바람직하다. 이러한 RNA 폴리머라아제의 발현 또는 플라스미드 벡터의 카피수의 증가를 유도하는 외래인자는 특별히 한정되지 않지만, 예로서 다양한 화학물질, 예컨대 락토오스 또는 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 와 같은 구조유사물, 갈락토오스 또는 구조유사물 및 아라비노오스 또는 구조유사물의 첨가; 트립토판 농도의 감소;및 형질전환체 배양 온도의 조정을 들 수 있다.
플라스미드 벡터의 카피수에서의 증가의 유도 및 RNA 폴리머라아제의 발현의 유도는 각각의 외래인자 또는 동일한 외래인자의 작용으로 달성될 수 있다. 또한, 이 경우에서는 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자는 숙주의 염색체상에 통합될 수 있거나, 또는 본 발명의 플라스미드 벡터외의 플라스미드 벡터 또는 파아지 벡터로 숙주에 도입할 수 있다. 후자의 경우에서, 숙주는 목적에 따라 쉽게 변경될 수 있다. 이 경우에서, 숙주로의 RNA 폴리머라아제 유전자를 갖는 벡터의 도입은 본 발명의 플라스미드 벡터의 도입에 선행하거나 뒷따를 수 있다.
비록 본 발명의 목적 유전자는 한정되지 않지만, 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는 경우에 의미가 있다. 이러한 단백질의 예로는 전술한 제한효소, 기타 뉴클레아제, 핵산-결합 단백질 및 프로테아제를 들 수 있다.
본 발명은 전술한 바와 같이, 두가지의 제어방법, 즉. 유전자의 카피수의 제어 및 프로모터를 통한 전사의 제어의 조합으로 목적 유전자의 발현을 제어하는 시스템을 제공한다. 통상의 제어와는 다르게, 본 발명내 플라스미드상에 클론된 목적 유전자의 발현의 제어는 매우 엄밀하여 이의 발현은 비유도상태에서는 검출할 수 없을 수준으로 억제될 수 있다. 발현 유도에 의해, 플라스미드의 카피수, 즉, 목적 유전자의 카피수가 RNA 폴리머라아제의 발현과 함께 증가하는 경우, 목적 유전자는 RNA 폴리머라아제의 작용에 의해 프로모터의 제어하에서 전사 및 번역된다.
그러므로 종래의 기술로는 달성하기 어려운 일인, 본 발명의 플라스미드 벡터를 사용하여 숙주에 해롭거나 치명적인 유전자를 함유하는 형질전환체를 제조하고, 이 유전자를 발현시키는 것이 가능하다.
예컨대, Nsp7524 III 제한효소를 코딩하는 유전자의 클로닝을 본 발명의 플라스미드 벡터를 이용하여 시도하는 경우, 유전자는 대응하는 수식효소유전자의 공존없이 대장균내 성공적으로 보유된다. 또한 RNA 폴리머라아제 유전자를 함유하는 시스템 플라스미드를 형질전환체에 도입하여 Nsp7524 III 제한효소의 발현을 유도하여 생성된 형질전환체의 세포내에서 Nsp7524III 제한효소를 발현시키는 것이 가능하다.
또한, 유전자 라이브러리의 제조용 클로닝 벡터로서 본 발명의 플라스미드 벡터를 사용하여, 통상의 방법으로는 단리될 수 없는 유전자를 단리하고, 단일 숙주내에서 이의 발현물의 활성을 확인하는 것이 가능하다. 본 발명의 플라스미드 백터의 용도는 물론 숙주에 해로운 산물을 코딩하는 유전자의 클로닝에만 한정되지 않으며, 일반 목적 플라스미드 벡터로서는 사용할 수 있다.
본 발명과 관련된 RNA 폴리머라아제는 예컨대 플라스미드 pFSP6 및 파아지 M13sp6 를 이용하여 숙주에 도입할 수 있다. 플라스미드 pESP6 의 구축의 상세한 것은 참조예 (2) 에 나타내었다. 대장균 HB101/pFSP6 로 명명된 플라스미드로 형질전환 대장균 HB101 는 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소 [주소 : 일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고] 에 기탁번호 FERM BP-5742 로 l995 년 12 월 22 일 (원기탁일) 로 기탁되었다. 파아지 M13sp6 의 구축을 위한 방법은 실시예 2 (6) 에 기재되어 있다.
이후 본 발명은 플라스미드 pFSP6 를 이용하는 경우를 참조로하여 좀더 상세히 기술한다.
기술된 첫 번째의 것은 구축된 멀티카피 모델 발현 플라스미드 pMSP6L, pMSP6F (도1) 및 pMSP6O (도2) 를 이용하여 행한 실험의 결과이고, 이 모든 것은 SP6 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터 서열 및 리포터 유전자로서 β-갈락토시다아제 유전자를 갖으며, 전술한 시스템 플라스미드 pFSP6 를 이용하여 목적 유전자의 발현을 가능케한다.
이러한 모델 발현 플라스미드의 구축의 상세한 것은 참조예 (3) 에 나타내었다. 이러한 플라스미드에는 SP6 프로모터 (pMSP6L) 의 최소영역, 내생 SP6 프로모터 영역 (pMSP6F), 또는 SP6 프로모터와 lac 오퍼레이터 영역(pMSP6O) 의 양 최소영역을 각각 SP6 플라스미드 서열로서 통합되어 있다.
플라스미드 pMSP6L 또는 pMSP6F 만을 표 1 에 나타낸 대장균 균주에 도입하는 경우, 표 2 에 나타낸 바와 같이 숙주 대장균이 SP6 RNA 폴리머라아제를 발현하지 않는 다는 사실에도 불구하고, β-갈락토시다아제 활성이 눈에 띄며, 이의 양은 SP6 프로모터를 갖지 않는 플라스미드 pMS434 로 수득되는 것보다 더 크다. 즉, SP6 프로모터는 대장균으로부터 유래한 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되고, 이의 하류의 β-갈락토시다아제 유전자는 전사 및 번역됨을 추측할 수 있다. 또한, pcnB 유전자에 변이를 갖고, 상기의 모델 발현 플라스미드와 같이 ColE1 로부터 유래한 복제 오리진를 갖는 플라스미드의 카피수가 친주 MRi7 의 것의 l/6 내지 l/l3 으로 감소하는 균주인 대장균 MRi80 를 숙주로 사용하는 경우, 또한 β-갈락토시다아제 활성은 MRi7 의 것의 l/7 내지 l/14 로 감소한다. 이것은 β-갈락토시다아제 유전자 발현 수준과 도입된 플라스미드의 카피수 사이의 상관관계를 시사한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
다음, 동일한 모델의 발현 플라스미드를 전술한 시스템 플라스미드 pFSP6 와 함께 대장균에 도입하고 β-갈락토시다아제 활성을 SP6 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현이 유도되지 않는 상태하에서 측정하는 경우, β-갈락토시다아제 활성은 표 3 에 나타낸 바와 같이 시스템 플라스미드를 함유하지 않는 대장균으로 수득한 것과 같은 정도이다. 이것은 플라스미드 pFSP6 상의 SP6 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현은 비유도상태에서 거의 완전히 억제됨을 실증한다. 한편, SP6 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현을 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG) 의 첨가로 유도되는 경우,β-갈락토시다아제 활성은 18 내지 32 배 증가되며, 이는 β-갈락토시다아제 유전자는 SP6 프로모터를 통해 발현될 수 있음을 실증한다. 사용하는 숙주가 대장균 MRi80 인 경우, 특히, β-갈락토시다아제 활성은, 비록 비유도상태에서의 활성은 매우 낮은 수준으로 남아있지만, 유도 4 시간후, 비유도상태에서 수득되는 것보다 25 내지 32 배의 수준으로 증가한다.
Figure pct00003
SP6 프로모터의 하류의 lac 오퍼레이터 서열을 운반하는 플라스미드 pMSP6O 에서, 비유도상태하의 β-갈락토시다아제 활성은 기타 모델 발현 플라스미드에서의 것보다 낮으나; 이의 발현은 완전히 억제될 수 없다. 이러한 결과는 목적 유전자의 발현을 멀티카피 플라스미드를 사용하는 발현 시스템에서 완전히 억제되기 어렵고, 목적 유전자를 함유하는 플라스미드의 카피수를 제어하는 것이 시스템 플라스미드상의 RNA 폴리머라아제 유전자의 발현을 제어하는 것보다 상기 문제를 해결하는데 더 효과적임을 시사한다.
따라서 본 발명자는 이러한 결과를 기초로하여 추가로 조사한 결과 발현 벡터를 개발하였고, 본 발명의 플라스미드 벡터를 개발하였다.
구체적으로, 본 발명자는 유도후 충분한 발현을 확보하기 위하여 비유도상태에서 발현수준을 감소시킬 수 있는 런어웨이 플라스미드 벡터를 구축하였다. 첫째로, 시스템 플라스미드내 SP6 RNA 폴리머라아제 발현은 IPTG 에 의해 유도된다는 사실을 고려하여, IPTG 유도에 의한 카피수를 증가시키는 런어웨이 복제 오리진을 갖는 플라스미드는 도 3 에 나타낸 절차에 따라 구축한다. 첫째로, 플라스미드 벡터 pUC19 (다까라슈조사제) 의 NdeI 부위에 서열 목록 SEQ ID NO : 3 및 SEQ ID NO : 4 에 나타낸 염기서열을 갖는 두 개의 DNA 가닥으로부터 제조한 106-NdeI DNA 단편을 도입하여 수득한, 플라스미드 pUC106A 로부터 lac 프로모터 및 오퍼레이터 영역을 함유하는 PvuII 단편을 제거하여 플라스미드 pUC106AdPO 를 구축한다.
다음, 이 플라스미드를 주형으로하여, RNAII 영역 (플라스미드의 복제 오리진)부근에 배치된 RNAIIA 프라이머 (서열목록내 SEQ ID NO : 5 로 나타낸 염기 서열) 및 106 NdeI 서열의 말단에 배치된 1870 프라이머 (서열목록내 SEQ ID NO : 6 으로 나타낸 염기 서열) 를 이용한 PCR 로 수득된 RNAl87O 단편을 플라스미드 pSTV28 (다까라슈조사제) 의 XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pHS287O 를 수득할 수 있다. 이렇게 구축된 플라스미드 pHS287O 은 도 4에 나타내었다. 일반적으로, 플라스미드는 대장균 세포당 약 30 카피의 카피수로 존재하나; 이 카피수는 IPTG 의 첨가로 수백으로 증가한다.
이어서 플라스미드 pSTV28 로부터 유래한 P15A 복제 오리진을 함유하는 AccI-NspI 단편을 플라스미드로부터 제거한후 (플라스미드 pCRSO1), 불필요한 제한효소부위를 함유하는 EcoRI-XbaI 단편을 제거하고 (플라스미드 pCRSO2), 이어서 플라스미드 pMJR156O 으로부터 유래한 락토오스 리프레서 (lacIq) 유전자를 함유하는 DNA 단편 [Gene, Vol.51, pp. 225-267 (1987)] 를 도입하여 플라스미드 pCRSO4 를 수득한다. 플라스미드 pHS287O 으로부터 플라스미드 pCRSO4 의 구축의 순서도를 도 5 에 나타내었다. 이렇게 구축한 플라스미드 pCRSO4 를 도 6 에 나타내었다. 플라스미드는 IPTG 에 의해 유도된 런어웨이 플라스미드이고; 일반적으로, 플라스미드는 대장균 세포당 1 내지 2 의 카피수로 존재하나; 이 카피수는 IPTG 의 첨가로 수백으로 증가한다.
플라스미드에 삽입된 목적 유전자의 발현을 제어하기 위해서, SP6 프로모터 서열 및 lac 오퍼레이터 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드인 Psp6-OlacEX 링커는 플라스미드의 NheI 부위에 도입하여 플라스미드 pACE601 을 구축할 수 있다. Psp6-OlacEX 링커는 염기서열을 서열목록내 SEQ ID NO : 7 및 SEQ ID NO : 8 로 나타낸 두개의 DNA 가닥으로부터 제조한다. 플라스미드 pACE601 은 선택마커로서 클로르암페니콜 내성 유전자를 갖는 런어웨이 플라스미드 벡터이다.
또한, 플라스미드 벡터 pUC118 (다까라슈조사제) 로부터 유래한 β-락탐아제 유전자를 함유하는 BspHI 단편을 전술한 플라스미드 pCRSO4 의 NheI 부위에 도입하고 (플라스미드 pCRS7O), 이어서 클로르암페니콜 내성 유전자를 함유하는 NcoI-BsaAI 단편을 제거하고, 이를 전술한 Psp6-OlacEX 링커로 치환하여, 플라스미드 pACE701 및 pACE7O2 를 구축할 수 있으며, 이 플라스미드는 상호 반대편에 삽입된링커를 갖는다. 이 플라스미드는 선택 마커로서 암피실린 내성 유전자를 갖는 런어웨이 플라스미드 벡터이다.
목적 유전자의 발현을 제어하기위해 사용되는 이렇게 수득한 플라스미드 pACE601, pACE701 및 pACE7O2 의 능력은 전술한 바와 같이, 리포터 유전자로서 β-갈락토시다아제 유전자를 이용하여 측정할 수 있다. 주형을 플라스미드 pMS434 [Gene, Vol. 57, pp. 89-99(1987)] 로 하여 프라이머 trpA-N-Ncol 및 lacZ-C-NcoI 를 사용한 PCR로 증폭된 β-갈락토시다아제 유전자를 함유하는 DNA 단편을 전술한 세 개의 플라스미드의 각각의 SP6 프로모터의 하류의 NcoI 부위에 삽입하여 모델 발현 플라스미드를 구축하는 것이 가능한다. 프라이머 trpA-N-NcoI 및 lacZ-C-NcoI 의 염기 서열은 서열목록내 SEQ ID NO : 9 및 SEQ ID NO : 10 으로 각각 나타내었다. 이렇게 수득한 플라스미드는 각각 pACE6O1Z, pACE7O1Z 및 pACE7O2Z 로 명명하였다. 이러한 모델 발현 플라스미드로 형질전환된 대장균에 있어서, 절대적으로 β-갈락토시다아제 활성은 검출되지 않으며, 이는 β-갈락토시다아제 유전자의 발현의 매우 정확한 제어를 실증한다.
Nsp7524 III 제한효소 유전자를 사용하여, 발현산물이 숙주에 치명적으로 작용하는 유전자는 본 발명의 플라스미드를 이용하여 단리 및 발현시킬 수 있음을 확인하는 것이 가능하다. 플라스미드 pBRU3 은 Msp7524 III 제한수식시스템 유전자를 함유한다. 대장균 MC1061/pBRN3 으로 명명된, 플라스미드로 형질전환된 대장균 MC1O61 은 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소 [주소 : 일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고] 에 기탁번호 FERM BP-5741 로 l995 년 9 월 28일 (원기탁일) 로 기탁되었다. 주형을 형질전환체로부터 제조한 플라스미드 pBRN3 으로하여 한쌍의 프라이머 L-ORF 및 NspR-ORF3 을 이용한 PCR-기초 DNA 증폭반응으로, NsP7524 III 제한 효소유전자만을 함유하는 DNA 단편을 수득할 수 있다. 프라이머 L-ORF 및 NspR-ORF3 의 염기서열은 서열목록내 SEQ ID NO : 11 및 SEQ ID NO : 12 로 각각 나타내었다. 얻어진 DNA 단편을 전술한 플라스미드 pACE601 의 SP6 프로모터 하류의 NcoI 부위에 삽입하여 수득되는 플라스미드 pACE601-NspIII 를 대장균 HB101 에 도입하여, 형질전환체 대장균 HB101/pACE601-NspIII 을 수득할 수 있다. 형질전환체는 Nsp7524 III 수식효소유전자의 부재에도 불구하고 숙주가 Nsp7524 III 제한효소유전자를 안정하게 보유하도록 해준다.
더욱이, 형질전환체 대장균 HB1O1/pFSP6/pACE601-NspIII 는 전술한 시스템 플라스미드 pFSP6를 형질전환체에 도입하여 제조할 수 있다. 형질전환체를 배양하고 적당한 시기에 IPTG 를 첨가하여 발현을 유도하여, 배양물내에서 Nsp7524 III 제한효소의 생산 가능성을 확인할 수 있다.
본 발명의 세 번째 발명은 전술한 플라스미드 벡터를 이용하는 것을 특징으로하는 목적 유전자를 단리하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 단리방법은 발현산물이 숙주에 치명적이거나 해로운 유전자, 특히 제한효소유전자의 단리에 적합하게 적용한다. 본 방법을 이용하여, 지금까지 단리된 적이 없는 제한효소유전자, 예컨대 AccIII 제한효소 유전자를, AccIII 수식효소유전자의 부재하에서 조차, 단리할 수 있다. 제한효소유전자의 단리는 목적 효소를 생산하는 미생물의 게놈 DNA 가 적당한 제한효소로 절단되고, 생성된 DNA 단편은 예컨대 직접적으로 플라스미드pACE611 에 삽입되는 "샷건 방법" 뿐만아니라, 제한효소를 생산하는 미생물의 게놈 DNA의 카세트 라이브러리를 사용하여 달성할 수 있다. 주형을 카세트 라이브러리로 하여 DNA 증폭으로 유전자를 수득하여, 전사메카니즘이 숙주와는 상이한 미생물로부터 제조한 유전자를 발현시키는 것이 가능하다. 이후 카세트 라이브러리를 이용하여 제한효소유전자를 단리하는 방법을 AccIII 제한효소를 포함하는 실시예를 참조로 기술한다.
AccIII 제한효소를 생산하는 미생물, 즉, Acc균의 게놈 DNA 의 카세트 라이브러리는 하기와 같이 제조할 수 있다; 게놈 DNA 는 Acc균의 세포 배양물로부터 추출하고, 적당한 제한효소로 소화시킨후, 생성된 DNA 단편을 단편에 상보적인 돌출 말단을 갖는 카세트에 접합시킨다. 여러 유사한 카세트 라이브러리를 게놈 DNA 절단을 위한 상이한 제한효소를 이용하여 제조한다. 이러한 라이브러리는 Acc 게놈 카세트 라이브러리로 일반적으로 칭한다. 다음, 목적 제한효소단백질은 Acc균으로부터 정제하고, 이의 아미노산 서열은 부분적으로 측정하며, 프라이머는 이 서열에 기초하여 합성한다. 이 프라이머 및 카세트 프라이머를 사용하여 주형을 각각의 카세트 라이브러리로 하여 PCR-기초 DNA 증폭반응을 행하여, AccIII 제한효소유전자 단편을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. 수득한 DNA 단편의 염기서열은 예컨대. PCR산물의 직접적 시퀸싱으로 결정하여, AccIII 제한효소유전자의 전장 염기서열을 결정한다.
염기서열로부터 AccIII 제한효소유전자의 전장서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 설계하고, 주형을 Acc균의 게놈 DNA 로하고 상기 프라이머를 사용하여 PCR-기초 DNA 증폭을 행하여, AccIII 제한효소 유전자의 전장 서열을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. 수득한 DNA 단편을 플라스미드 pACE611 의 SP6 프로모터의 하류에 삽입하여 코돈 프레임을 조정하고, 생성된 재조합 플라스미드를 예컨대. 대장균 JM109 에 삽입하여 형질전환체를 수득한다. 발현할 수 있는 상태에서 AccIII 제한효소 유전자를 함유하는 형질전환체는, 각각의 형질전환체에 의해 내포되어진 플라스미드 DNA 의 제한효소지도를 그릴 뿐만아니라, 각각의 형질전환체를 배양하고, 본 발명의 유전자 발현 방법으로 유전자발현을 유도하며, 수득한 각각의 배양물에서 AccIII 제한효소 활성을 측정하여 선택할 수 있다.
이렇게 수득한 AccIII 제한효소유전자는 실제적으로 플라스미드 pACE611 로 삽입되고, 생성된 플라스미드는 pCRA19 로 명명한다. 이 플라스미드의 제한효소지도는 도 7 에 나타내었고, 여기에서 굵은실선은 AccIII 제한효소 유전자를 함유하는 DNA 단편을 나타낸다. 대장균 JM1O9/pCRAl9 로 명명한, 플라스미드 pCRA19 가 도입된 대장균 JM1O9 는 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소 [주소 : 일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1 방 3고] 에 기탁번호 FERM BP-5743 으로 1996 년 5 월 28 일 (원기탁일) 로 기탁되었다. 형질전환체는 자체에 AccIII 수식효소유전자의 부재에도 불구하고 안정하게 제한효소유전자를 보유한다. 전술한 방법으로, 제한효소유전자는 제한수식시스템유전자를 구성하는 수식효소유전자의 공존이 없이도 단리할 수 있다.
본 발명의 네 번째 발명은 AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
본 명세서에서, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드의 총칭으로서 용어 "AccIII 제한효소" 를 몇몇의 경우에서 사용할 수 있다. 본 발명의 AccIII 제한효소는 예컨대 서열목록내 SEQ ID NO : 1에 기술된 아미노산 서열을 포함한다.
또한 본 발명의 AccIII 제한효소는 상기에만 한정되지 않고, 서열몰록내 SEQ ID N0 : 1 에 기재된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 서열목록의 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열 또는 일부의 하나이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가, 삽입 또는 치환중의 하나 이상에 의해 발생하는 아미노산 서열을 갖고 AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드는 본 발명의 범위에 포함된다.
일반적으로, 천연으로 발생하는 단백질은 체내에서의 또는 정제중 단백질의 수식 및 이를 코딩하는 유전자의 다형성 및 변이에 기인하여 그의 아미노산 서열내에 아미노산 잔기의 상실, 삽입, 첨가 및 기타 변이를 겪을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 생리학적 및 생물학적인 측면에서 변이가 없는 단백질과 실질적으로 동일한 몇몇 폴리펩티드가 알려져 있다. 따라서, 해당 단백질과 구조적으로 상이하나 상기 단백질과 기능 또는 활성에서 현저한 차이점이 없는 단백질은 본 발명의 범위안에 있다. 또한, 단백질의 아미노산 서열에 상기 변이를 인위적으로 도입시킬 경우에도 동일하며, 상기의 경우, 보다 다양한 변이체를 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 보도에 의하면 대장균에서 발현시킨 단백질 N-말단의 메티오닌 잔기가 종종 메티오닌 아미노펩티다아제의 작용에 의해 제거되나, 상기 제거는 단백질의 종류에 따라 완전히 수행되는 것은 아니며, 어떤 발현 단백질은 메티오닌을 갖고 있고 다른 것들은 안 갖고 있다. 그러나, 대부분의 경우 메티오닌 잔기의 유무가 단백질 활성에 영향을 주지 않는다. 또한, 사람 인터루킨 2 (IL-2) 의 아미노산 서열중 특정 시스테인 잔기가 세린으로 대치되어 생성된 폴리펩티드가 IL-2 활성을 유지한다는 것이 공지되어 있다 [Science, 224, 1431 (1984)].
또한, 유전공학에 의한 단백질의 제조에서, 목적단백질은 종종 융합단백질의 형태로 발현된다. 예를 들어, 다른 아미노산으로부터 유래된 N-말단 펩티드 사슬을 목적단백질의 N-말단에 첨가하여 목적단백질의 발현을 증진시키거나, 목적단백질의 N- 또는 C-말단에 적절한 펩티드 사슬을 첨가하고, 상기 단백질을 발현시키고, 첨가된 펩티드 사슬에 대해 친화성을 나타내는 담체를 사용함으로써 목적단백질의 정제를 촉진한다. 따라서, 폴리펩티드가 본 발명의 AccIII 제한효소와 부분적으로 상이한 아미노산 서열을 갖는다 할지라도, 그것이 본 발명의 AccIII 제한효소와 본질적으로 동일한 활성을 갖는 한 본 발명의 범위내에 있다.
예를 들어, AccIII 제한효소 유전자를 함유하는 상기의 형질전환체 대장균 JM1O9/pCRA19 를 배양하고, pCRAl9 의 카피수를 증가시키기 위하여 배양중 적절한 때에 유도제 IPTG 를 첨가하고, 이어서 파아지 M13sp6 로 감염시켜 AccIII 제한효소를 수득할 수 있다.
AccIII 제한효소는, 예를 들어, 배양액으로부터 세포를 수집하고, 이어서 초음파 파쇄, 초원심분리 등에 의해 효소를 추출하고, 이후 핵산 제거, 염추출, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 조합에 의해 추출함으로써, 형질전환체 배양물로부터 수확될 수 있다. 상기 정제의 출발물질로 사용되는 상기 배양 물은 AccI 및 AccII 와 같은 다른 제한효소를 함유하지 않으므로, 원하는 순도의 효소가 통상적인 정제방법보다 용이하게 수득될 수 있다.
본 발명의 다섯번째 발명은 AccIII 제한효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 제공한다.
AccIII 제한효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 DNA는 서열목록내 SEQ ID NO : 1 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 함유하고, 예를 들어, 서열목록내 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 염기서열을 함유하는 DNA 를 포함하며, 여기에 제한되지는 않는다. 특별히, 하기 DNA 는 본 발명의 범위내에 있다.
(1) 서열목록내 SEQ ID NO : 1 에 기재되어 있는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 함유하며, AccIII 제한효소 활성을 갖는 DNA;
(2) DNA 의 발현물이 AccIII 제한효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 서열목록내 SEQ ID NO : 2 에 나타낸 DNA 전체 또는 일부를 함유하는 DNA;
(3) 서열목록내 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열 또는 그의 일부분에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 상실, 부가, 삽입 또는 치환중 하나 이상에 의해 생성되는 폴리펩티드를 코딩하며, AccIII 제한효소 활성을 갖는 DNA;
(4) 상기 (1) 내지 (3) 에 기재되어 있는 DNA 와 혼성화될 수 있고, AccIII 제한효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등.
또한, 탐침자로서 상기 수득된 DNA를 사용하여 엄격한 조건하에서 혼성화가 수행되는 경우, 수득된 DNA와는 약간 상이하나 동일한 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 유사한 DNA를 수득할 수 있다. 또한, 상기 DNA는 본 발명의 범위내에 포함된다.
상기 엄격한 조건은 막상에 고정된 DNA를 갖는 막을, 예를 들어 65℃ 에서 20시간동안 항온배양시키면서, 6X SSC (LX SSC 는 1 리터의 물중 NaCl 8.76 g, 소듐 시트레이트 4.41 g 의 용액이다), 1% SDS, 1OO㎍/ml 의 연어정자 DNA, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐피롤리돈 및 0.1% 피콜을 함유하는 용액중에서 탐침자와 혼성화시킨다.
혼성화에 의한 AccIII 제한효소를 코딩하는 유사한 DNA를 수득하기 위한 방법으로는, 예를 들어, 하기 방법들이 있다.
먼저, 적당한 유전자원으로부터 수득된 DNA를 플라스미드 또는 파아지 벡터에 DNA 라이브러리를 제조하는 통상적인 방법에 의해 접합시킨다. 상기 라이브러리를 적당한 숙주내에 도입하고; 생성된 형질전환체를 플레이트상에서 배양하고; 성장한 콜로니 또는 플라그를 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막상에 이동시켜 변성시킨 후, DNA를 막상에 고정시킨다. 상기 막들을 미리32P 등으로 표지한 탐침자 (사용되는 탐침자는 서열목록내 SEQ ID NO : 1에 나타낸 아미노산 서열 전체 또는 일부를 코딩하는 모든 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 서열목록내 SEQ ID NO : 2에 나타낸 염기서열 전체 또는 일부로 구성된 또는 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다) 를 함유하는 상기 조성의 용액에서 상기에 나타낸 조건하에 혼성화를 위하여 항온배양시킨다. 혼성화를 완료한 후, 비-특이적으로 흡착된 탐침자를 세척해 낸후, 방사선사진술 등에 의해 탐침자와 혼성화된 콜로니를 동정한다. 원하는 혼성화 콜로니를 단리할 때까지 상기 과정을 되풀이한다. 상기 수득된 콜로니는 목적 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로 보유하고 있다.
예를 들어, 상기 기재된 방법에 의해 수득된 DNA 의 염기서열을 결정하여 그것이 목적 효소 단백질을 코딩하고 있음을 확인하였다.
염기서열분석을 위하여, 숙주가 대장균일 경우 형질전환체를 시험관내에서 배양하고, 통상적인 방법에 의하여 플라스미드를 제조한다. 단, 형질전환체는 플라스미드 벡터를 사용하여 제조되었다. 원형 그대로의 주형으로 또는 삽입체를 취하여 M13 파아지 벡터 등에 서브클로닝한 후 수득된 플라스미드를 사용하여, 디데옥시 방법에 의하여 염기서열을 결정한다. 또한 파아지 벡터를 사용하여 제조된 형질전환체의 경우, 기본적으로 동일한 방법에 의해 염기서열을 결정할 수 있다.
배양에서부터 염기서열분석에 이르는 기본적인 실험과정은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1982, T. Maniatis 등, Cold Spring Harbor Laboratory 출판] 에 기재되어 있다.
수득된 DNA가 목적 AccIII 제한효소를 코딩하는 유사한 DNA 인가의 여부는 결정된 염기서열을 서열목록내 SEQ ID NO : 2 에 나타낸 염기서열과 비교하거나, 결정된 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열을 서열목록내 SEQ ID NO : 1 에 의해 나타낸 아미노산 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다.
수득된 DNA가 목적 제한효소를 코딩하는 영역 전체 또는 일부를 포함하지 않을 경우, 수득된 DNA를 기초로 하여 프라이머를 합성하고, 상기 프라이머를 사용하는 PCR 에 의해 부족한 영역을 증폭시키거나 또는 수득된 DNA 조각을 탐침자로서 사용하는 DNA 라이브러리의 스크리닝을 반복함으로써 전체 코딩 영역을 수득할 수 있다.
AccIII 제한효소를 코딩하는 상기 수득된 유사 DNA를 함유하는 형질전환체를 제조하고, 형질전환체가 상기 DNA 에 의해 코딩되는 효소단백질을 발현하도록 하고, 발현된 효소단백질을 정제하는 것이 가능하다. 형질전환체의 제조 및 효소단백질의 발현 및 정제는 모두 본 발명의 플라스미드를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 수득된 효소단백질은 AccIII 제한효소활성을 보유하고 있다.
추가적으로, AccIII 수식효소 및 상기 효소를 코딩하는 DNA (둘 다 이제까지 수득되지 않았음) 도 AccIII 제한효소를 코딩하는 상기 DNA를 사용하여 수득될 수 있다.
예를 들어, 많은 경우에 제한효소 유전자 및 수식효소 유전자의 상호 인접성을 기초로 하여, 주형인 카세트 라이브러리와의 DNA 증폭반응에 의해 제한효소 유전자 근처의 단백질을 코딩하는 유전자 영역을 수득하고, 이를 적당한 발현벡터내에 삽입하여 상기 유전자를 발현시키고, 적당한 방법에 의해 AccIII 수식효소활성을 확인함으로써 상기목적을 달성할 수 있다.
AccIII 수식효소활성 또한, 예를 들어, AccIII 제한효소의 절단활성에 대한 형질전환체로부터 제조된 DNA의 내성을 기초로 하여 확인될 수 있다. 단, 상기 기재된 유전자 영역의 염기서열을 결정하여 공지된 제한 수식 시스템의 수식효소 유전자간에 보존된 영역에 대한 상동성을 확인한 경우에는 [Journal of MolecularBiology, 206권, pp. 305-321 (1989)], 상기 유전자가 수식효소 유전자인가를 유전자 발현전에 어느 정도 예측할 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 Acc 박테리아의 게놈 DNA 의 카세트 라이브러리를 사용함으로써, Acc 수식효소 및 이를 코딩하는 DNA를 수득할 수 있다. 그의 아미노산 서열 및 염기서열이 각각 서열목록내 SEQ ID NO : 13 및 SEQ ID NO : 14 에 의해 나타나 있다.
여기에서 AccIII 수식효소는 상기 기재된 것에 제한되지 않는다. AccIII 제한효소의 설명에서 기술된 바와같이, 이는 서열목록내 SEQ ID NO : 13 에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 일부를 함유하는 폴리펩티드로 AccIII 수식효소활성을 갖는다. 또한, 서열목록내 SEQ ID NO : 13의 아미노산 서열 또는 그의 일부내 하나 이상의 아미노산 잔기의 상실, 부가, 삽입 또는 치환중 하나 이상에 의해 생성되고 AccIII 수식효소활성을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 범위내에 포함된다.
여기에서, 본 발명의 AccIII 수식효소활성을 코딩하는 DNA는 서열목록내 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함하며, 예를 들어 서열목록내 SEQ ID NO : 14에 기재된 염기서열 (그러나 여기에 제한되지 않는다) 을 함유하는 DNA를 포함한다. 특별히, 하기 DNA가 본 발명의 범위내에 있다.
(1) 서열목록내 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열 전체 또는 일부를 함유하며, AccIII 수식효소 활성을 갖는 DNA;
(2) DNA의 발현생성물이 AccIII 수식효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 서열목록내 SEQ ID NO : 14 에 나타낸 DNA 전체 또는 일부를 함유하는 DNA;
(3) 서열목록내 SEQ ID NO : 13 아미노산 서열 또는 그의 일부분에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 상실, 부가, 삽입 또는 치환중 하나 이상에 의해 생성되는 폴리펩티드를 코딩하며, AccIII 수식효소 활성을 갖는 DNA;
(4) 상기 (1) 내지 (3) 에 기재되어 있는 DNA 와 혼성화될 수 있고, AccIII 수식효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등.
이하에, 본 발명을 제한하지 않는 하기 참조예 및 작업예를 사용하여 본 발명을 보다 자세히 기재한다. 여기에 기재된 방법중, 플라스미드 제조, 제한효소 절단 등에 관한 기본적인 것들은 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, T. Maniatis 등 편저, Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1989] 에 기재되어 있는 방법에 따라 수행되었다.
참조예
(1) 배양배지 및 조건
LB 배지 (1% 트립신, 0.5% 효모추출물, 0.5% NaCl, pH 7.0) 를 사용하여 대장균을 37℃ 에서 호기적으로 배양하였다. 대장균이 보유하는 플라스미드에 따라 각 배지에 다양한 농도의 항생제를 하기와 같이 첨가하였다; pFSP6 에 대해서는 가나마이신 25 ㎍/㎖, pXX325에 대해서는 암피실린 20 ㎍/㎖, 암피실린-내성 CoIE1 형 플라스미드에 대해서는 암피실린 50 ㎍/㎖, 및 암피실린-내성 pUC 형 플라스미드에 대해서는 암피실린 100 ㎍/㎖. 발현유도실험에서, 정지상까지 배양한 후 수득된 배양액을 1% 의 농도로 신선한 배지에 접종하고, 이후 37℃ 에서 호기적으로 배양한 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 를 최종농도 0.2 mM 로 첨가하고, OD600값이 0.6 (6 X 108세포/㎖) 에 이르기까지 더 배양하였다.
(2) 시스템 플라스미드 pFSP6의 구축
도 8에 지시된 방법에 따라, 숙주로서 대장균 JM109를 사용하여 시스템 플라스미드 pFSP6를 구축하였다. 플라스미드 pSP6-2 [Nucleic Acid Research, Vol. 15, pp. 2653-2664 (1987)] 를 HindIII (다까라 슈조사제) 로 절단하고 양끝을 평활화시키고, BamHI 으로 더 절단하여 SP6 RNA 폴리머라아제 유전자를 함유하는 약 2.8 kb DNA 절편을 제조하고, 상기 절편을 미리 BamHI 및 HincII (다까라 슈조사제) 로 절단한 플라스미드 벡터 pUC18 (다까라 슈조사제)와 혼합한 후 접합시켜 플라스미드 pUCSP 를 구축하였다. 다음으로, 플라스미드 pMJR1560 [Gene, Vol. 51, pp. 225-267 (1987)] 을 KpnI 으로 절단하고 양끝을 평활화시킨 후, PstI (다까라 슈조사제) 으로 더 절단하여 lacIq 유전자를 함유하는 약 1.3 kb DNA 절편을 제조, 이후 단리하였다. 상기 플라스미드 pUCSP 를 HindIII 로 절단하고 양끝을 평활화시킨 후, PstI 으로 더 절단하여 DNA 절편을 제조하고, 상기 기재된 약 1.3 kb DNA 절편과 혼합하여 접합시켜 플라스미드 pUCSPlac 을 구축하였다.
또한, pUCKm [Journal of Molecular Biology, Vol. 147, pp. 217-226 (1981)] 의 PstI 절단에 의해 수득된, 가나마이신 내성 유전자를 함유하는, 약 1.5 kb DNA 절편을 상기 기재된 플라스미드 pUCSPlac 의 PstI 부위에 도입하여 플라스미드 pUCSPlacKm 을 구축하였다. 상기 플라스미드를 AatII (도요보사제) 로 자른 후, NspI (다까라슈조사제) 으로 부분절단하여 약 6.5 kb DNA 절편을 단리한 후,양끝을 평활화시켰다.
한편, 플라스미드 pXX325 [Proceedings of the National Academy of Science of the USA. Vol. 80: pp. 4784-4788 (1983)] 을 HindIII로 절단하고 양끝을 평활화시킨 후, SalI 으로 더 절단하여 miniF 플라스미드의 복제 오리진을 함유하는 약 6.8 kb DNA 절편을 단리한 후, 이를 상기 기재된 약 6.5 kb DNA 절편과 혼합하고 접합시켜 플라스미드 pFSP6 를 구축하였다. 상기 플라스미드로 대장균 HB101 을 형질전환시켜 대장균 HB101/pFSP6 를 구축하였다.
(3) 멀티카피 모델 발현 플라스미드의 구축
염기서열이 각각 서열목록내 SEQ ID NO : 15 및 SEQ ID NO : 16 에 의해 나타내어진 것과 같은 2 개의 DNA 가닥으로부터 SP6 프로모터의 최소영역을 함유하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드인 Psp6링커를 제조하여, 미리 XhoI (다까라 슈조사제) 및 HindIII 로 절단한 플라스미드 pMS434 [Gene, Vol. 57, pp. 89-99 (1987)] 과 혼합하고 접합시켜, 플라스미드상의 β-갈락토시다아제 유전자의 상류에 상기 기재된 프로모터 서열을 삽입한 모델 발현 플라스미드 pMSP6L 을 구축하였다 (도 1).
한편, pSP64 [Nucleic Acid Research, Vol. 12, pp. 7035-7056 (1984)] 를 AccII 및 HindIII 로 절단하여 수득된, 본래의 SP6 프로모터 서열을 함유하는 DNA절편을 상기 기재된 플라스미드 pMS434 의 Xhol-HindIII 부위에 삽입함으로써, 모델 발현 플라스미드 pMSP6F 를 구축하였다 (도 1). 또한, 염기서열이 각각 서열목록내 SEQ ID NO : 17 및 SEQ ID NO : 18 에 의해 나타내어진 것과 같은 2 개의 DNA 가닥으로부터 SP6 프로모터의 최소 영역 및 lac 오퍼레이터 영역을 포함하는 Psp6-Olac링커를 제조하고, 상기 기재된 플라스미드 pMS434의 XhoI-HindIII 부위사이에 삽입하여 모델 발현 플라스미드 pMSP6O 를 구축하였다 (도 2).
(4) 대장균 RNA 폴리머라아제를 위한 SP6 프로모터의 프로모터 활성
참조예 (3) 에서 제조된 플라스미드 pMSP6L 와 pMSP6F 및 SP6 프로모터 서열을 함유하지 않는 대조군으로서의 플라스미드 pMS434 를 각각 표 1 에 나타낸 대장균내에 도입하였다. 생성된 형질전환체를 각각 참조예 (1) 에 기재된 방법에 의해 배양한 후, 대수적 성장상중에 각 세포배양액을 수확하였다. 그중 일부분으로 수집된 각 배양액의 OD600값을 결정하고, 반면에 나머지 부분을 예비-냉각된 시험관에 옮겨 클로르암페니콜을 최종농도 100 mg/㎖ 로 보충하였다. 상기 배양액을 시료로 사용하여, 문헌 [Experiments in Molecular Genetics, J.H. Miller 편저, Cold Spring Harbor 출판, 1972] 에 기재된 방법에 의해 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다.
표 2 에서 나타낸 바와 같이, 모두 SP6 프로모터 서열을 포함하고 있는 모델 발현 플라스미드 pMSP6L 또는 pMSP6F 를 통합시킨 대장균 MC4100 은 삽입된 프로모터 서열과 관계없이, 규사한 수준의 낮은 β-갈락토시다아제 활성을 나타내었다. 그러나. SP6 프로모터를 함유하지 않는 플라스미드 pMS434 를 통합시킨 것은 단지 낮은 효소활성을 나타내었다. 또한, 숙주인 대장균 MRi7 및 MRi8O 의 비교는 MRi8O에서 감소된 β-갈락토시다아제 활성을 나타내었으며, 플라스미드의 카피수도 감소되었다.
(5) 시스템 플라스미드 pFSP6 의 평가
시스템 플라스미드 pFSP6 가 더 도입된, 참조예 (4) 에서 제조된 각 형질전환체를 참조예 (1) 에 기재된 방법에 의해 배양하였다; β-갈락토시다아제 활성은 비유도상태 및 IPTG 첨가 전후의 유도성 조건에서 측정하였다. 상기 결과를 표 3 에 나타내었다. 모든 형질전환체들이 비유도상태에서 표 2 에서 나타낸 플라스미드 pFSP6 의 부재하에 수득되는 것과 유사한 수준의 β-갈락토시다아제 활성을 나타내었다.
한편, IPTG 첨가에 의한 유도의 경우, pMSP6L 및 pMSP6F 를 통합시킨 형질전환체에서의 β-갈락토시다아제 활성은 비유도상태에서 수득된 것과 비교하여 18 내지 32 배인 반면에, 플라스미드 pMS434 를 통합시킨 형질전환체에서의 활성 증가는 나타나지 않았다.
(6) 발현 제어에 대한 lac 오펴레이터 서열의 효과
플라스미드 pMSP6L, pMSP6F, pMSP6O 및 pMS434 각각을 플라스미드 pFSP6 를 통합시킨 대장균 MC4100 내에 도입시킴으로써 수득된 형질전환체를 참조예 (1) 에 기재된 방법에 의해 배양하고, 비유도상태에서의 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 상기 결과를 표 4에 나타내었다. lac 오퍼레이터 서열을 함유하는, 플라스미드 pMSP6O 를 통합시킨 형질전환체는, 비록 그 활성 수준이 플라스미드 pMSP6L 및 pMSP6F 로 수득한 것보다는 낮다 하더라도, 여전히 약간의 β-갈락토시다아제 활성을 나타내었다. 간단히 말해서, 비유도상태에서의 발현은 단지 lac 오퍼레이터 서열의 도입에 의해 완전히 억제될 수는 없었다.
Figure pct00004
실시예 1
(1) 배양배지 및 조건
LB 배지 (1% 트립신, 0.5% 효모추출물, 0.5% NaCl, pH 7.0) 를 사용하여 대장균을 37℃ 에서 호기적으로 배양하였다. 대장균이 보유하는 플라스미드에 따라 각 배지에 다양한 농도의 항생제를 하기와 같이 첨가하였다; pFSP6 에 대해서는 가나마이신 25 ㎍/㎖, 암피실린-내성 ColE1 형 플라스미드에 대해서는 암피실린 50 ㎍/㎖, 암피실린-내성 pUC 형 플라스미드에 대해서는 암피실린 100 ㎍/㎖, 클로르암페니콜-내성 런어웨이 플라스미드에 대해서는 클로르암페니콜 100 ㎍/㎖ 및 암피실린-내성 런어웨이 플라스미드에 대해서는 암피실린 30 ㎍/㎖. 발현유도실험에서, 정지상까지 배양한 후 수득된 배양액을 1% 의 농도로 신선한 배지에 접종하고, 이후 37℃ 에서 호기적으로 배양한 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 최종농도 0.2 mM 로 첨가하고, OD600값이 0.6 (6 X 108세포/㎖)에 이르기까지 더 배양하였다.
(2) 런어웨이 플라스미드 pHS2870 의 구축
발현 플라스미드 제조의 기본을 제공하는 런어웨이 플라스미드 pHS287O 을 도 3 에 나타낸 방법에 의해 구축하였다. 염기서열이 각각 서열목록내 SEQ ID NO : 3 및 SEQ ID NO : 4 에 의해 나타내어진 2 개의 DNA 가닥으로부터 제조된 106 NdeI DNA 절편을, 접합을 위해, 미리 NdeI 으로 절단한 플라스미드 벡터 pUCl9 와 혼합하였다. 상기 수득된 플라스미드 pUC1O6A 를 PvulI 로 절단하고 자가접합시켜 플라스미드 pUC1O6AdPO 를 제조하였다. 이후에, 상기 플라스미드 pUC1O6AdPO 를 주형으로 사용하여, RNAILA 프라이머 (서열목록내 SEQ ID NO : 5 에 의해 나타내어진 염기 서열을 가짐) 및 1870 프라이머 (서열목록내 SEQ ID NO : 6 에 의해 나타내어진 염기서열을 가짐) 를 이용한 PCR 을 수행하여 증폭된 DNA 절편을 제조하고, 이후 XbaI 으로 절단하고, 미리 XbaI 으로 절단한 플라스미드 pSTV28 과 혼합하고 접합시켜 플라스미드 pHS2870 을 구축하였다. 플라스미드 pHS2870 의 제조를 도 4 에 나타낸다.
(3) 런어웨이 플라스미드 pCRSO4의 구축
AccI (다까라 슈조사제) 및 NspI 으로 절단한 후, 상기 기재된 플라스미드 pHS2870 의 양끝을 평활화시키고 자가접합시켜, P15A 복제 오리진이 결핍된 플라스미드 pCRSOl 을 구축하였다. 이후, 상기 플라스미드를 EcoRI (다까라 슈조사제) 및 XbaI 으로 절단한 후, 양끝을 평활화시키고 상기와 동일한 방식으로 자가접합시켜 플라스미드 pCRSO2 를 구축하였다. 플라스미드 pMJR1560 을 KpnI (다까라 슈조사제) 및 PstI 으로 절단시킴에 의해 수득된 약 1.2 kb DNA 절편의 양끝을 평활화시킨 후, 이를 미리 NsvV 및 VspI (둘 모두 다까라 슈조사제) 로 절단한 후 양끝을 평활화시킨, 상기 기재된 플라스미드 pCRSO2 와 혼합하고 접합시켜 플라스미드 pCRSO4 를 구축하였다. 플라스미드 pCRSO4 구축의 흐름도를 도 5에 나타내고, 플라스미드 pCRSO4 의 구축도를 도 6에 나타내었다.
(4) 런어웨이 발현 벡터 pACE601 의 구축
미리 NheI (다까라 슈조사제) 로 절단하고, 이어서 양끝을 평활화시킨, 상기 기재된 플라스미드 pCRSO4 를 서열목록내 SEQ ID NO : 7 및 SEQ ID NO : 8 에 의해 나타내어진 2 개의 DNA 가닥으로부터 제조된 Psp6-OlacEX 링커와 혼합하고 접합시켜 플라스미드 pACE601 을 구축하였다. 플라스미드 pACE601 제조의 흐름도를 도 9 에 나타내었다. 숙주로 대장균 JM1O9 를 이용하여 상기 플라스미드의 구축을 수행하였다.
(5) 런어웨이 발현 벡터 pACE611 의 구축
런어웨이 발현 벡터 pACE601 를 Xhol-HindIII 로 절단하고, 서열목록내 SEQ ID NO : 15 및 SEQ ID NO : 16 에 나타내어진 합성 올리고-DNA 로 구성된 Psp6링커를 그 부위에 삽입시켜 런어웨이 발현 벡터 pACE611 를 구축하였다. 구축된 pACE611 을 도 10에 나타내었다. 플라스미드 pACE611 구축의 흐름도를 도 11 에 나타내었다.
(6) 런어웨이 발현 벡터 pACE701 및 pACE702 의 구축
플라스미드 벡터 pUC118 (다까라 슈조사제)를 BspHI (NEB 사제) 로 절단시켜수득된 약 1kb DNA 절편의 양끝을 평활화시킨 후, 미리 NheI 으로 절단하고 양끝을 평활화시킨 상기 기재된 플라스미드 pCRS04 와 혼합하고 접합시켜 플라스미드 pCRS7O 을 구축하였다. 플라스미드 pCRSO4 구축의 흐름도를 도 12 에 나타내었다. 다음으로, 상기 플라스미드를 NcoI (다까라 슈조사제) 및 BsaAI (NEB 사제) 로 절단한 후, 양끝을 평활화시키고 상기 기재된 Psp6-OlacEX 링커와 혼합하고 접합시켜, 삽입된 링커가 서로 반대 방향으로 합임된 2 개의 플라스미드 pACE701 및 pACE702 를 구축하였다. 플라스미드 pACE701 및 pACE7O2 구축의 흐름도를 도 13 에 나타내었다. 숙주로 대장균 JM109 를 이용하여 상기 플라스미드의 구축을 수행하였다.
(7)모델 런어웨이 발현 플라스미드의 구축
주형으로서 상기 기재된 플라스미드 pMS434 를 사용하고, 프라이머 trpA-N-NcoI 및 lacZ-C-NcoI 을 사용하는 PCR을 수행하여 β-갈락토시다아제 유전자를 함유하는 DNA 절편을 수득하였다. 프라이머 trpA-N-NcoI 및 lacZ-C-NcoI 의 염기서열을 서열목록내 SEQ ID NO : 9 및 SEO ID NO : 10 에 각각 나타내었낸다. NcoI 으로 절단한 후, 미리 NcoI 으로 절단한 상기 기재된 플라스미드 pACE601, pACE701 및 pACE7O2 각각과 혼합하고 접합시켜, Psp6-OlacEX 링커의 하류에 도입시킨 β-갈락토시다아제 유전자를 함유하는, 모델 런어웨이 발현 플라스미드 pACE6O1Z, pACE7O1Z 및 pACE7O2Z를 제조하였다. 숙주로 대장균 JM109를 이용하여 상기 플라스미드들의 제조를 수행하였다.
(8) 비유도상태에서 런어웨이 발현 플라스미드의 발현 수준 평가
상기 기재된 모델 런어웨이 발현 플라스미드 pACE6O1Z, pACE7O1Z 및 pACE7O2Z 를, 상기 기재된 시스템 플라스미드 pF5P6 를 함유하는 대장균 MC4100 (이하 MC41OO/pFSP6 라 칭함) 에 각각 도입시켜 수득된 형질전환체 MC41OO/pFSP6/pACE610Z, MC4100/pFSP6/pACE7O1Z 및 MC41OO/pFSP6/pACE7O2Z 를 실시예 (1) 에 기재된 조건하에서 각각 배양하였다; 참조예 (4) 에 기재된 방법에 의해 대수학적 성장상중에 수집한 각 배양액의 β-갈락토시다아제 활성을 검정하였다. 조사한 모든 형질전환체에서, β-갈락토시다아제 활성은 검출한계 미만이었으며, 이는 참조예 (4) 에 나타낸 멀티카피 플라스미드로 수득된 것보다 큰 발현-억제 효과를 나타낸다.
(9) Nsp7524 III 제한효소 유전자 발현 플라스미드의 구축
대장균 MC1O6l/pBRN3 (FERM BP-5741) 로부터 Nsp7524 III 수식 시스템 유전자를 함유하는 플라스미드 pBRN3 를 제조하였다. 상기 플라스미드를 주형으로 사용하고, 프라이머 L-ORF 및 NspR-ORF3 를 사용하는 PCR 을 수행하여 Nsp7524 III 제한효소 유전자만을 함유하는 약 1kb DNA 절편을 제조하였다. 프라이머 L-ORF 및 NspR-ORF3 의 염기서열을 서열목록내 SEQ ID NO : 11 및 SEQ ID NO : 12 에 각각 나타낸다. NcoI 으로 절단한 후, 상기 절편을 미리 NcoI 으로 절단한 상기 기재된 플라스미드 pACE601 과 혼합하고 접합시켜, Psp6-OlacEX 서열의 하류에 도입시킨 Nsp7524 III 제한효소 유전자만을 함유하는, 플라스미드 pACE601-NspIII 를 구축하였다. 상기 플라스미드는 Nsp7524 III 제한효소 유전자를 함유하지 않는 대장균JM1O9 에서 안정적으로 유지되었다.
(10) Nsp7524 III 제한효소 유전자 발현 시스템의 구축
상기 기재된 플라스미드 pACE601-NspIII 를 도입시켜 수득되고, Nsp7524 III 제한효소 유전자를 함유하는 형질전환체 HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 와, 상기 기재된 시스템 플라스미드 pFSP6 를 함유하는 대장균 HB101 (이하 HB101/pFSP6 라 칭함) 내에 대조 플라스미드 pACE601 를 도입시켜 수득된 형질전환체 HB101/pFSP6/pACE601 을 각각 LB 배지내에서 정지상에 이르기까지 배양하였다; 수집된 각 배양액을 1% 의 농도로 신선한 배지의 2 시험관에 접종하고 37℃ 에서 호기적으로 배양하였다. OD600값이 0.6 에 도달하면, 하나의 시험관에 IPTG 를 최종농도 0.2 mM 로 첨가한 후 더 배양하였다. 배양완료후, 세포를 수집하고, 세포 파괴용 완충액 A (2O mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM 2-메르캅토에탄올) 내에 현탁하고, 초음파분쇄에 의해 파괴시킨 후 원심분리하여 조추출물을 제조하였다.
상기 조추출물중 1 ㎕ 를 30 ㎕ 의 반응혼합물 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 1 ㎍ λ-DNA) 에 첨가하고 37℃ 에서 1 시간동안 반응시킨 후, 상기 반응혼합물로 아가로오스 겔 전기영동을 실시하여 λ-DNA 의 절단을 조사하고 제한효소활성을 확인하였다. 도 14 에서 나타낸 바와 같이, IPTG 의 첨가에 의해 발현이 유도된 HB101/pFSP6/pACE601-NspIII 에서만 제한효소활성이 관찰되었으며, 그의 λ-DNA 절단양상은, Nsp7524 III 의 이소스키조머 (isoschizomer) 인 AvaI 의 것과 일치하였다.
2 및 3 시간의 장시간 수행된 상기 λ-DNA 절단반응의 결과를 도 15 에 나타낸다. 상기의 경우, 본 실험에서 사용된 조추출물이 숙주인 대장균으로부터 유래된 뉴클레아제를 함유하고 있기 때문에, Nsp7524 III 활성에 의해 생성된 DNA 절편은 대장균 뉴클레아제에 의한 분괴를 더 겪게되어, 결과적으로 반응시간이 길어질수록 (레인 8 내지 10) 감소되는 농도의 밴드가 생성되며, 레인 10 에서는 밴드가 나타나지 않았다. 레인 11 내지 13 에서는, 반응시간이 연장되는 경우에도 Nsp7524 III 의 부재로 인해 Nsp7524 III 절단절편이 만들어지지 않았으며, 이는 대장균 뉴클레아제의 직접적인 작용에 의해 λ-DNA 가 작은 분자량의 절편으로 되었음을 나타낸다. HB101/pFSP6/pACE601 의 조추출물에서는 제한효소활성이 탐지되지 않았다.
실시예 2
AccIII 제한효소 유전자의 단리 및 발현
(1) AccIII 제한효소 단백질의 N-말단 아미노산 서열의 결정 및 아미노산 서열에 해당하는 프라이머 DNA 의 합성
약 2 ku 의 AccIII 제한효소의 시판품 (다까라슈조사제) 를 세파크릴 S3OO 의 컬럼(파르마시아사제) 을 이용하여 겔여과시켜 AccIII 제한효소의 분자량을 측정한다. 활성이 검출된 용리위치로부터 판단하여, AccII 제한효소의 분자량은 약 70,000 으로 입증되었다. 대부분의 제한효소 단백질은 이량체이기 때문에, AccIII 제한효소 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 약 35,000 의 분자량에 대한 위치로 이동하리라 기대된다.
다음, AccIII 제한효소 단백질의 N-말단 아미노산 시퀀싱용 시료를 얻기 위해, 약 2ku 의 AccIII 제한효소의 시판품과 함께 단백질 분자량 마커를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨후, 단백질을 겔로부터 PVDF 막으로 옮기고 브로모페놀 블루로 염색시켜 단백질 위치를 확인한다. 10% 아세트산-50% 메탄올로 탈염색시킨후, 약 35,000 분자량의 단백질이 블롯화되어 있는 PVDF 막의 부분을 절단하고 단백질 시퀀서 G1OOOA (휴렛-팩커드사제) 를 이용하여 자동 에드만 분해시켜 서열목록내 SEQ ID NO : 19 에 나타낸 N-말단 아미노산 서열을 결정한다. 이어서 이러한 서열에 기초하여, 각각 서열목록내 SEQ ID N0 : 20 및 SEQ ID N0 : 21 로 나타낸 AccIII 프라이머 1 및 2 는 한쌍의 카세트 프라미어로 사용하기 위해 합성한다.
(2) Acc균의 게놈 DNA 의 제조
문헌 [Nucleic Acids Research, Vol. 13, pp. 8685-8694 (1985)] 에 기재된 기타 등의 방법에 따라, Acc균을 배양하여 습한 세포를 수득한다. 수득한 습한 세포의 2 g 을 버퍼 B [25 mM Tris-HCl (pH8.0), 5O mM 글루코오스, 1OmM EDTA] 에 현탁시키고, 버퍼 B 내 2 mg/ml 로 제조한 1 ml 의 라이소자임의 존재하 교반하며, 37℃ 에서 20 분간 정치시킨다. 다음, 버퍼 C 의 28 ml [100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0)] 를 이 용액에 첨가한후, 교반한다. TE [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH8.0)] 내 20 mg/ml 로 제조된 프로테아제 K 용액의 1 ml 및 10% SDS 용액 4 ml 를 추가로 첨가한후, 교반하고, 이어서 혼합용액을 37℃ 에서 1 시간동안 정치시킨다.
이 용액에, 5 M NaCl 수용액 6 ml 및 버퍼 D [10% CTAB (세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 0.7 m NaCl] 6 ml 를 첨가한후, 교반하고, 이어서 혼합 용액을 6O℃ 에서 2O 분간 정치시킨다. 이 용액을 페놀로 처리하고, 이어서 클로로포름으로 처리한후, 수층을 분리시킨다. 이 수층에, TE 내 IOmg/ml 로 제조한 RNaseA (시그마사제) 의 50㎕ 를 첨가하고, 이어서 교반한후, 이 혼합 용액을 37℃ 에서 40 분간 정치시킨다. 정치를 유지시킨후, 이 용액을 페놀로 처리하고 이어서 클로로포름으로 처리한후 수층을 분리한다. 이 수층에, 동부피의 차가운 에탄올을 가한다; 침전된 DNA 를 유리 모관 주위에 감아 회수한다. DNA 를 70% 에탄올로 세척하고 TE 의 3 ml 에 용해시켜 약 200 ug 의 게놈 DNA 를 수득한다.
(3) Acc 게놈 카세트 라이브러리의 제조
하기의 절차를 문헌 [Gene Engineering Guide" (1995-1996 년판), 다까라슈조사] 의 폐이지 F16-F17 에 기재된 방법에 따라 기본적으로 행한다.
(2) 에서 수득한 게놈 DNA 는 EcoRI (다까라슈조사제) 로 완전히 소화시키고; 수득한 DNA 단편은 여기에 사 상보적인 접합 말단을 갖는 EcoRI 카세트 (다까라슈조사제) 로 접합시켜 EcoRI 카세트 라이브러리를 수득한다. 마찬가지로, 게놈 DNA 는 제한효소 BgIII, EcoT14I, EcoT22I, HindIII, PstI. SalI 및 XbaI (모두 다까라슈조사제) 로 개별적으로 완전히 소화시킨다. 수득한 게놈 DNA 단편의 각각을 상보적인 돌출 말단을 갖는 여러 카세트 (다까라슈조사제) 중의 각각에 결합시켜 각각 BgIII, EcoT14I, EcoT22I, HindIII, PstI, SalI 및 XbaI 카세트 라이브러리를 수득한다. 이 카세트 라이브러리들은 일반적으로 Acc 게놈 카세트 라이브러리로 칭한다.
(4) AccIII 제한효소 유전자의 분석
PCR-기초 DNA 증폭 반응은, 주형을 (3) 에서 수득한 EcoRI 카세트 라이브러리로하여 AccIII 프라이며 1 및 카세트 프라이머 C1 (다까라슈조사제) 의 프라이머쌍을 이용하여 행한다. 목적 영역을 효율적이고 특이적으로 증폭 하가 위해서, 2 차 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 수득한 반응액의 일부와 함께 AccIII 프라이머 2 및 카세트 프라이머 C2(다까라슈조사제) 의 프라이머쌍을 이용하여 행하여 증폭된 DNA 단편을 수득한다. 마찬가지로, 각각 주형을 BgIII, EcoT14I, EcoT22I, HindIII, PstI, SalI 및 XbaI 카세트 라이브러리로 하여, 상기의 두 단계의 PCR-기초 DNA 증폭반응을 개별적으로 행하여 증폭된 DNA 단편을 수득한다. 각각의 증폭된 DNA 를 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하며; XbaI 카세트 라이브러리로부터 유래한 증폭된 DNA 단편은 특히 높은 증폭효율을 보여준다.
이를 염두에 두고, 주형을 XbaI 카세트 라이브러리로 하여 AccIII 프라이머 1 및 카세트 프라이머 Cl 의 프라이머쌍을 이용하여 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 다시 행한다. 이 반응 혼합물은 아가로오스 겔 전기영동시키고; 약 0.5 kb 증폭 DNA 단편을 겔로부터 회수한다. 주형을 수득한 DNA 단편으로 하여 AccIII 프라이머 2 및 카세트 프라이머 C2 의 프라이머쌍을 이용하여 제 2 의 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 실시한다. 수득한 약 0.5 kb 증폭 DNA 단편의 염기 시퀸싱은 단편은 N-말단 아미노산 서열이 (1) 에서 결정된 단백질의 일부를 코딩함을 실증한다. 한편, AccIII 제한효소 단백질의 추정 분자량은 약 35,000 이고, 단백질을 코딩하는 유전자는 약 1 kb 길이로 추정된다. 그러므로, 만일 약 0.5 kb 염기서열에 대한 전술한 정보외에, AccIII 프라이머 1 및 2 가 어닐링된 5'-말단 영역의 정확한 염기서열에 대한정보 및 3' 영역내 남아있는 약 0.5 kb 염기 서열에 대한 정보를 이용할 수 있으면, AccIII 제한효소 유전자의 염기서열을 결정할 수 있음이 기대된다.
이것을 염두에 두고, AccIII 제한효소 유전자영역의 5'-말단 영역의 정확한 염기 서열을 결정하기 위하여, 서열목록내 SEQ ID N0 : 22 로 나타낸 AccIII 프라이머 3 및 서열목록내 SEQ ID N0 : 23 으로 나타낸 AccIII 프라이머 4 를 합성한다. 다음, 주형을 (3) 에서 수득한 EcoRI 카세트 라이브러리로하여, AccIII 프라이머 4 및 카세트 프라이머 C1 의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 행한다. 상기 반응혼합물의 일부와 함께 AccIII 프라이머 3 및 카세트 프라이머 C2 의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 행한다. 마찬가지로, 각각 주형을 BgIII, EcoT14I, EcoT22I, HindIII, PstI, SalI 및 XbaI 카세트 라이브러리로 하여, 상기의 두 단계의 PCR-기초 DNA 증폭반응을 개별적으로 행한다. 증폭된 DNA 단편들 중에서, 주형으로 EcoT14I 카세트 라이브러리를 사용하여, 가장 짧은, 즉, 약 1 kb DNA 단편을 수득하고, 이의 염기서열을 결정한다.
더욱이, AccIII 제한효소 단백질을 코딩하는 것으로 추정되는 유전자 영역의 3' 측상의 약 0.5 kb 서열을 결정하기 위하여, 서열목록내 SEQ ID 140 : 24 로 나타낸 AccIII 프라이머 5 및 서열목록내 SEQ ID 140 : 25 으로 나타낸 AccIII 프라이머 6 을 합성한다. 다음, 주형을 (3) 에서 수득한 EcoRI 카세트 라이브러리로 하여, AccIII 프라이머 5 및 카세트 프라이머 C1 의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 행한다. 상기 반응혼합물의 일부와 함께 AccIII 프라이머 6 및 카세트 프라이머 C2 의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR-기초 DNA 증폭 반응을 행한다.마찬가지로, 각각 주형을 BgIII, EcoT14I, EcoT221, HindIII, PstI, SalI 및 XbaI 카세트 라이브러리로 하여, 상기 두 단계의 PCR-기초 DNA 증폭반응을 개별적으로 행한다.
증폭된 DNA 단편들중에서, 주형을 각각 EcoT22I 및 HindIII 카세트 라이브러리로 하여 수득한 각각의 약 0.5 kb 및 약 0.8 kb DNA 단편을 염기 시퀀싱시킨다. 결정된 세 개의 염기서열에 대한 결과를 합하여, 약 1.6 kb DNA 단편에 대한 염기 서열 정보를 얻는다. 이의 염기 서열은 서열목록내 SEQ ID N0 : 26 으로 나타내었다. 더욱이, 단백질을 코딩할 수 있는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 에 대한 조사결과로 염기번호 558 내지 1442 에 ORF1 이, 염기번호 l588 내지 1434 에 ORF2 로 추정되는 부분 및 염기번호 1 내지 535 에 ORF3 으로 추정되는 부분의 존재가 실증되었다. ORF1 은 N-말단 아미노산 서열이 (1) 에서 결정된 단백질을 코딩하며, ORF1 은 AccIII 제한효소 유전자일 것으로 추정된다. AccIII 제한효소 유전자의 염기서열은 서열목록내 SEQ ID NO : 2 로 나타내었고, 여기에서 5' 말단으로부터 네 번째의 염기는 C 이다. 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열은 목록내 SEQ ID N0 : 1 로 나타내었고, 여기에서 N 말단으로부터 두 번째의 아미노산은 Leu 이다. ORF2 의 번역의 방향은 ORF1 및 ORF3 와 반대이다.
(5) 플라스미드 pCRAl9 의 구축
다음, AccIII 제한효소 유전자의 발현용 플라스미드를 구축한다. 처음에, 유전자를 수득하기 위하여, 서열목록내 SEQ ID N0 : 27 로 나타낸 프라이머 Acc-RL 및 서열목록내 SEQ ID N0 : 28 로 나타낸 프라이머 Acc-RR 를 합성한다, 제한효소NcoI 인식 서열 부위를 양 프라이머에 도입한다. 전술한 프라이머 쌍을 이용하여, 주형을 Acc균의 게놈 DNA 로 하여 PCR로 수득한 증폭 DNA 단편으로부터의 AccIII 제한효소 유전자를 제한효소 NcoI 로 절단하는 것이 가능하고, 번역 코돈 프레임들은 유전자가 pACE611 벡터의 NcoI 부위에 삽입된 경우 SP6 프로모터의 제어하 상호 일치한다. 한편, 이러한 프라임 쌍의 사용은 AccIII 제한효소 유전자의 5' 말단으로부터 네 번째의 염기의 C로부터 G 로의 치환 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 N 말단으로 부터 두 번째 아미노산의 Leu 으로부터 Val 로의 치환을 가져온다. 주형을 (2) 에서 수득한 Acc균의 게놈 DNA 으로하고 상기 프라이머 쌍을 이용하여, PCR-기초 DNA 증폭 반응을 행한다. 이 DNA 단편은 제한효소 NcoI (다까라슈조사제) 로 완전히 소화시킨후, 이것을 아가로오스 겔 전기영동시킨다; 약 900 bp 사이즈의 DNA 단편을 회수한다. 다음, 이 DNA 단편을 pACE611 벡터의 NcoI 부위에 삽입하여 이것이 SP6 프로모터의 하류에 위치하도록한다.
이 재조합 DNA 는 대장균 JM109 에 도입하여 형질전환체를 수득한다. 30 개의 형질전환체를 무작위로 선택하고, 각각을 30 ㎍/ml 클로르암페니콜을 함유하는 LB 배지 5ml 에 접종하고 37℃ 에서 배양한다. 세포 배양 브로쓰의 OD600값이 0.6 에 도달하면, IPTG 를 2 mM 의 최종농도로 첨가하여 플라스미드 카피수를 증가시킨후, 추가로 37℃ 에서 2 시간동안 배양하고, 이어서 플라스미드 DNA 를 각각의 배양물로부터 제조한다. 수득한 각각의 플라스미드 DNA 를 동시에 제한 효소 HindIII 및 Xbal 로 절단한후, 아가로오스 겔 전기영동으로 생성된 DNA 단편의 길이를 확인하고; 우측방향으로 삽입된 유전자 영역를 함유하는 것으로 생각되는 플라스미드가 검출된다. pCRAl9 로 명명한 이 플라스미드는 대장균 JM109 에 도입하여 형질전환체를 수득하고; 이를 대장균 JMIO9/pCRAl9 로 명명하였다.
(6) AccIII 제한효소 유전자에 대한 발현 시스템의 구축
첫째로, SP6 RNA 폴리머라아제 유전자를 대장균 JM1O9 에 도입하여 유전자의 추가의 발현을 허용하는 파아지 벡터를 구축한다. 구체적으로는, pSP6-2 의 BamHI-HindIII 소화로 수득한 SP6 RNA 폴리머라아제 유전자 단편을 파아지 벡터 M13mp18 (다까라슈조사제) 의 시판품의 다중클로닝 부위내 BamHI-HindIII 부위에 삽입하여, SP6 RNA 폴리머라아제 발현 파아지 M13sp6 를 구축한다.
다음, 형질전환체 대장균 JM109/pCRA19 를 30㎍/ml 를 함유하는 LB 배지의 5 ml 에 접종하고 37℃ 에서 배양한다. 세포배양 브로쓰의 OD600값이 0.6 이 도달했을 때, IPTG 를 2mM 의 최종농도로 첨가하여 플라스미드 카피수를 증가시킨후, 추가로 37℃ 에서 2 시간동안 배양한다. 이어서 이 세포를 파아지 M13sp6 으로 감염시켜, AccIII 제한효소 유전자로 코딩된 단백질을 발현시킨후, 추가로 37℃ 에서 16 시간동안 배양한다. 수득한 습한 세포의 11 mg 을 세포파쇄용 버퍼 E [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM 2-메르캅토에탄올] 의 180㎕ 에 현탁시키고, 이어서 세포를 초음파로 파쇄한후, 원심분리 (18OOOg, 10 분) 하여 고형물 및 액체를 분리한다.
다까라슈조사제의 AccIII 제한효소에 부착된 데이터 쉬트에서 보여지는 활성 측정 조건하에서 상층액의 활성의 측정은 습한 세포의 g 당 약 8OOO 단위의 양으로AccIII 제한효소의 생산을 실증하며, 이는 습한 새포의 단위 중량당 Acc균으로 수득한 것보다 약 16 배의 수준이다. AccIII 이외의 제한효소의 활성 및 AccIII 수식효소 활성의 어느것도 수득한 상층액에서 눈에 띄지 않는다. 플라스미드 pCRA19 로 삽입된 AccIII 제한효소 유전자에 있어서, PCR 로 DNA 증폭을 행할시, 번역개시염기로부터 네 번째 염기는 C 에서 G 로 치환되어, 번역된 단백질의 N-말단으로부터 두 번째의 아미노산이 Leu 에서 Val 로 치환되며, 단백질은 AccIII 제한효소 활성을 갖음이 실증된다.
따라서 AccIII 수식 효소의 부재에서 AccIII 제한효소 유전자에 대한 단리/대량 생산 시스템을 개발하였다.
(7) AccIII 수식효소유전자의 단리
수식효소유전자 및 제한효소유전자는 종종 가깝게 위치한다. 이를 염두에 두고, 상기의 (4) 에서 추정된 ORF2 영역을 결정하기 위하여, 상기 (4) 에서의 AccIII 제한효소 유전자의 3' 영역을 결정하기 위하여 제조한 증폭된 DNA 단편으로부터, 주형으로 EcoRI 카세트 라이브러리를 이용하여 수득한 약 1.4 kb DNA 단편의 염기서열을 결정한다. 다음, 상기 (4) 에서 유추한 ORF3 영역을 결정하기 위하여, 상기 (4) 의 AccIII 제한효소 유전자의 5'-말단 영역을 결정하기 위하여 제조한 증폭된 DNA 단편으로부터, 주형으로 BglII 카세트 라이브러리를 이용하여 수득한 약 2.2 kb DNA 단편의 염기서열을 결정한다. 이러한 염기 서열과 (4) 에서 결정된 AccIII 제한효소 유전자 영역을 포함하는 약 1.6 kb DNA 단편의 염기 서열를 합친 것은 서열목록내 SEQ ID N0 : 29 로 나타낸 약 4.2 kb 염기서열에 대한 정보가 된다. AccIII 제한효소 유전자는 염기번호 1913 내지 2797 에, ORF2 는 염기번호 37l2 내지 2789 에, ORF3 는 염기번호 691 내지 1890 에 위치한다. 이 ORF들 중에서, ORF2 는 공지된 제한수식시스템내 수식효소중에서 보존영역에 매우 상동한 단백질을 포함하는 것으로 입증되었다.
다음, ORF2 영역을 수득하기 위하여 주형을 EcoRI 카체트 라이브러리로 하여, 각각의 단계에서 Acc 프라이머 6 및 카세트 프라이머 C1 의 프라이머쌍 및 Acc 프라이머 5 및 카세트 프라이머 C2 의 또다른 프라이머쌍을 이용한 2 단계 PCR 로 수득한 증폭 DNA 단편으로부터 EcoT22I 및 HpaI 를 이용하여 약 1.1 kb ORF2-함유 부분을 절단하고, pUC118 벡터내 lac 프로모터의 하류의 SmaI 부위에 삽입한다. 만일 이 재조합 플라스미드가 AccIII 제한효소 유전자를 함유하고, 만일 AccIII 수식효소가 대장균에서 발현될 수 있으면, 상기 재조합 플라스미드를 대장균 JM1O9 에 도입하여 수득한 형질전환체의 배양물에서의 DNA 는 AccIII 수식효소에 의한 메틸화반응을 겪고, AccIII 제한효소에 의한 절단에 대한 내성을 획득할 것이다.
상기 제조합 플라스미드를 구축하기 위하여 사용하는 pUC118 벡터는 AccIII 제한효소 인식 서열을 갖지 않기 때문에, 이 재조합 플라스미드 자체를 사용하여 AccIII 수식효소 활성을 확인하는 것은 부적당하다. 한편, 플라스미드 pSTV29 내 AccIII 제한효소 인식서열이 존재하고, 이는 대장균 JM109 에서 상기 재조합 플라스미드와 공존할 수 있다. 이것을 염두에 두고, AccIII 수식 효소의 발현의 지표로서 pSTV29 를 이용하기 위하여, 상기 재조합 플라스미드 및 pSTV29 양쪽을 대장균 JM109 에 도입하여 형질전환체를 수득한다. 세 개의 형질전환체는 각각 100 ㎍/ml암피실린, 30 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 2mM IPTG 를 함유하는 LB 배지 2 ml 에서 16 시간동안 37℃ 에서 배양한후, 각각의 배양물로부터 플라스미드 DNA 를 제조한다.
이렇게 제조한 DNA 는 pSTV29 와 전술한 재조합 플라스미드의 혼합물로서 이용할 수 있다. 각각의 DNA 시료를 AccIII 제한효소로 소화시킨 경우, AccIII 제한효소 활성에 내성을 보이는 모든 시료내의 pSTV29 는 DNA 시료내 포함된 재조합 플라스미드로 AccIII 제한효소 유전자가 삽입되었음을 실증한다. 더욱이, DNA 시료를 제한효소 HindIII 및 XbaI 로 동시에 절단한후, 아가로오스 겔 전기영동으로 생성된 DNA 단편의 길이를 분석하여, 재조합 플라스미드내 ORF2 의 존재를 확인한다. 따라서 ORF2 는 AccIII 수식 효소 유전자임으로 입증된다. 수득된 AccIII 수식효소 유전자의 염기서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열은 서열목록내 SEQ ID NO : 14 및 SEQ ID NO : 13 으로 각각 나타내었다.
본 발명에 따라 실증된 AccIII 제한 수식시스템 유전자의 구조는 도 16 에 나타내었고, 여기에서 M. R 및 화살표는 수식효소유전자, 제한효소유전자 및 ORF 의 배향을 각각 나타낸다.
본 발명은 처음으로 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는 외래 목적 유전자를 숙주에 도입할 수 있는 플라스미드 벡터, 플라스미드 벡터를 이용하여 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있는 방법을 제공한다. 또한 종래기술에서는 어려웠던, 수식효소유전자의 공존없이 제한수식 시스템을 구성하는 제한효소유전자를단리할 수 있는 방법을 제공한다. 더욱이, AccIII 제한 효소 유전자 및 AccIII 수식효소 유전자는 본 발명에 의해 단리되고, 이 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 대장균으로부터, 유전공학에서 유용한 AccIII 제한효소 또는 AccIII 수식효소를 종래정제방법과 비교하여 필요한 순도의 효소제제로 용이하게 수득할 수 있다.
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Claims (26)

  1. 숙주가 본래갖고 있지 않는 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는, 목적 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 서열 및 외래인자에 의해 유도됨으로서 카피수를 증가시키는 복제 오리진을 갖는 것을 특징으로 하는 플라스미드 벡터에 있어서, T7, T3, SP에서 선택한 박테리오파아지 유래의 RNA 폴리머라아제 의해 인식되는 프로모터 서열과 lac, trp, tac, gal, ara, PL로부터 선택되는 프로모터의 지배하에 놓인 복제 오리진을 갖는 플라스미드 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 프로모터 서열은 SP6 파아지 유래의 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 플라스미드 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 프로모터 서열은 서열목록에 나타낸 SEQ ID NO : 30 의 염기서열을 포함하는 플라스미드 벡터.
  4. 제 1 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, 복제 오리진은 lac 프로모터의 제어하에 있는 플라스미드 벡터.
  5. 제 1 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 선택 마커로서 약제내성 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서, pACE601, pACE611, pACE701 및 pACE702 으로부터 선택되는 플라스미드 벡터.
  7. 발현시킬 목적 유전자가 제 1 내지 3 항중 어느 한 항에 기재된 플라스미드 벡터에 통합되어 있는 플라스미드 벡터.
  8. 제 1 항에 기재된 플라스미드 벡터에 목적 유전자가 통합된 플라스미드 벡터와 이 플라스미드 벡터내 프로모터 서열을 인식하는 RNA 폴리머라아제 유전자를 숙주에 도입하고, 외래 인자를 이용하여 상기 플라스미드 벡터의 카피수의 증가의 유도 및 상기 RNA 폴리머라아제의 발현을 유도하여 목적 유전자를 전사 및 번역하는 것을 특징으로하는 목적유전자의 발현방법..
  9. 제 8 항예 있어서, 플라스미드 벡터의 카피수의 증가 및 RNA 폴리머라아제의 발현은 각각의 외래인자에 의해 유도되는 것을 특징으로하는 목적유전자의 발현 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 플라스미드 벡터의 카피수의 증가 및 RNA 폴리머라아제의 발현은 동일한 외래인자에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 목적유전자의 발현방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 플라스미드 벡터의 카피수의 증가를 유도하는 외래인자가 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)의 첨가, 락토오스의 첨가, 갈락토오스의 첨가, 아라비노오스의 첨가, 트립토판농도의 감소 및 형질전환체 배양온도의 조정으로 구성된 군에서 선택한 1 종이상인 것인 목적 유전자의 발현 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, RNA 폴리머라아제의 발현을 유도하는 외래인자가 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)의 첨가, 락토오스의 첨가, 갈락토오스의 첨가, 아라비노오스의 첨가, 트립토판농도의 감소및 형질전환체 배양온도의 조정으로 구성된 군에서 선택한 1 종이상인 것인 목적 유전자의 발현 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, RNA 폴리머라아제 유전자는 기타의 플라스미드 벡터 또는 파아지 벡터에 의해 속주어 도입되는 것을 특징으로하는 목적 유전자의 발현 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, RNA 폴리머라아제 유전자는 숙주의 염색체에 통합되는 것을 특징으로하는 목적유전자의 발현 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, RNA 폴리머라아제 유전자는 SP6 파아지로부터 유래하는 것을 특징으로하는 목적 유전자의 발현 방법.
  16. 제 8 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 있어서, 목적 유전자가 숙주에 대하여 치명적인 또는 해로운 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 발현 방법.
  17. 제 8 항 내지 제 14 항중 어느 한항에 있어서, 대장균을 숙주로 사용하는 것을 특징으로 하는 목적 유전자의 발현 방법.
  18. 제 1 항에 따른 플라스미드 벡터를 목적 유전자의 단리방법에 사용하는 것을 특징으로하는 목적 유전자의 단리방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 목적 유전자가 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는 목적 유전자의 단리방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 숙주에 치명적이거나 해로운 단백질을 코딩하는 유전자는 제한효소(restriction endonuclease) 유전자인 목적 유전자의 단리방법.
  21. 서열 목록내 SEQ 10 NO : 1 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드.
  22. 서열 목록내 SEQ ID :NO : 1 에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 일부에서 하나이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가, 삽입 또는 치환중의 하나이상에 의해 생성되는 아미노산 서열을 갖고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드.
  23. 서열 목록내 SEQ ID NO : 1 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
  24. 서열목록내 SEQ ID NO : 2 에 나타낸 DNA 의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA 이며, 이 DNA 의 발현산물이 AccIII 제한효소활성을 갖는 DNA.
  25. 서열 목록내 SEQ ID ,NO : 1 에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 일부에서 하나이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가, 삽입 또는 치환중의 하나이상에 의해 생성되고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
  26. 제 23 내지 제 25 항중 어느 한 항에 따른 DNA 에 혼성화될 수 있고, AccIII 제한효소의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569669B1 (en) * 2000-10-12 2003-05-27 New England Biolabs, Inc. Host strain for low uninduced expression of foreign RNA polymerase genes
GB0029539D0 (en) * 2000-12-04 2001-01-17 Isis Innovation Method for identifying modulatorss of transcription
US7794971B1 (en) 2003-07-01 2010-09-14 Epicentre Technologies Corporation Compositions and methods for controlling copy number for a broad range of plasmids and uses thereof
US20070202082A1 (en) * 2005-11-09 2007-08-30 Dong-Yan Jin Promoters for RNA interference
CN102174554A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 内蒙古民族大学 双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途
CN111378609A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 江苏金斯瑞生物科技有限公司 诱导质粒拷贝数增加的培养基及其应用
CN111705071B (zh) * 2020-06-16 2023-03-10 西北农林科技大学 一种人工设计质粒pM5500及其在DNA marker制备中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
GB8407498D0 (en) * 1984-03-22 1984-05-02 Biogen Nv High copy number expression vectors
US5354680A (en) * 1986-06-06 1994-10-11 New England Biolabs, Inc. Method for producing the DdeI restriction endonuclease and methylase
EP0618295B1 (en) * 1986-06-06 1996-03-06 New England Biolabs, Inc. Method for cloning the DdeI restriction modification system
JP2518051B2 (ja) * 1989-06-06 1996-07-24 東洋紡績株式会社 ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法
US5196318A (en) * 1990-06-26 1993-03-23 The Texas A&M University System Precisely regulated expression of deleterious genes
US5843703A (en) * 1993-01-22 1998-12-01 California Institute Of Technology Enhanced production of toxic polypeptides in prokaryotes
EP0832255B1 (en) * 1995-06-07 2005-12-14 Washington University Recombinant bacterial system with environmentally limited viability
JP3007584B2 (ja) 1997-01-31 2000-02-07 文化シヤッター株式会社 耐火スクリーン装置

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