JP2000325094A - 制限酵素及びその遺伝子 - Google Patents

制限酵素及びその遺伝子

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裕章 佐川
Harumi Ueno
はるみ 上野
Atsushi Oshima
淳 大島
Ikunoshin Kato
郁之進 加藤
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Takara Shuzo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】AccIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ド、及び上記ポリペプチドをコードするDNAの提供。 【解決手段】特定のアミノ酸配列の全部又はその一部、
あるいはその一部のアミノ酸配列に、1個若しくは複数
のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の少なくと
も1つがなされ、AccIII 制限酵素活性を有するポリ
ペプチド;特定の塩基配列のDNAの全部又はその一部
を含み、発現産物がAccIII 制限酵素活性を示すDN
A;あるいはその一部が欠失、付加、挿入若しくは置換
の少なくとも1つがなされ、AccIII 制限酵素活性を
示すポリペプチドをコードするDNA;前記いずれかの
DNAにハイブリダイズ可能な、AccIII 制限酵素活
性を有するポリペプチドをコードするDNA。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学試薬と
して有用な制限酵素及びその遺伝子、更に詳細にはAc
cIII 制限酵素及びそのDNAに関する。
【0002】
【従来の技術】遺伝子組換え技法によって目的とする遺
伝子の発現システムを構築する際には、用いる宿主のR
NAポリメラーゼに認識されるプロモーター支配下に目
的遺伝子を配置することにより、該遺伝子の発現を制御
することが行われる。しかし、宿主に対して有害なタン
パク質をコードする遺伝子の場合には、用いるプロモー
ターの発現制御が厳密に行えないことに起因して該遺伝
子産物の発現のためにプラスミドの構築自体が不可能に
なることがある。
【0003】そのような問題点を解決すべく開発された
発現システムとしては大腸菌を宿主とし、大腸菌に感染
するバクテリオファージ T7のRNAポリメラーゼを
利用したpET−システム(ノバジェン社製)がある
[ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.
Mol. Biol. )第189 巻、第113 〜130 頁 (1986)、
ジーン(Gene)、第 56 巻、第125 〜135 頁 (198
7)]。pET−システムは、プロモーター認識の特異
性及び転写活性の高いT7RNAポリメラーゼを大腸菌
内で発現させ、このT7RNAポリメラーゼが発現ベク
ター上のT7プロモーター下流に配置された目的遺伝子
を転写し、高発現されるシステムである。目的の遺伝子
の転写はT7RNAポリメラーゼによってのみ起こるた
め、該ポリメラーゼを生産しない宿主中では目的の遺伝
子を発現させることなくプラスミドの構築をすることが
可能であり、目的遺伝子を宿主の有するRNAポリメラ
ーゼに認識されるプロモーター支配下において発現シス
テムを構築する場合とは異なりプラスミドの構築自体が
不可能になることはない。
【0004】しかし、T7RNAポリメラーゼ遺伝子
は、λ−ファージベクター上にクローニングされて発現
用の宿主に溶原化されているために宿主を自由に選ぶこ
とができず、宿主を変更しようとする場合には煩雑な操
作が必要となる。さらに、宿主中のT7RNAポリメラ
ーゼの発現があまり厳密に制御されていないため、非誘
導状態の宿主内でもT7RNAポリメラーゼが発現され
ており、その結果、発現ベクター上のT7プロモーター
下流に配置された目的遺伝子の発現が非誘導状態におい
ても起こる。このような目的遺伝子の非誘導状態におけ
る発現を低下させるために、T7RNAポリメラーゼの
阻害物質であるT7リゾチームを用いてT7RNAポリ
メラーゼの活性を阻害したり[ジャーナル オブ モレ
キュラーバイオロジー( J. Mol. Biol.)第219 巻、第
37〜44頁(1991)]、T7プロモーター下流にラクトー
スオペレーターを配置してT7RNAポリメラーゼのT
7プロモーターへのアクセスを防いだりしている[ジャ
ーナル オブ モレキュラー バイオロジー( J. Mol.
Biol.)、第 219巻、第45〜59頁(1991)]。
【0005】しかし、これらの措置も転写活性の高いT
7RNAポリメラーゼに対しては十分でなく、非誘導状
態のT7RNAポリメラーゼの活性を完全に阻止するこ
とはできない。そのため、目的の遺伝子産物が宿主に対
して致死的な場合、プラスミドの構築はできてもその遺
伝子を発現させるための形質転換体を作製できないこと
がある。つまり、pET−システムには宿主を自由に変
更できないこと、およびT7RNAポリメラーゼの発現
制御が正確でないこと、以上2つの解決すべき問題点が
ある。
【0006】一方、バクテリオファージ T7に性質が
類似したバクテリオファージとして、サルモネラ属細菌
(Salmonella typhimurium)に感染するバクテリオファ
ージSP6がある[サイエンス(Science )、第 133
巻、第2069〜2070頁(1961)]。バクテリオファージS
P6が生産するRNAポリメラーゼは、分子量が約10
万のシングルペプチドであり、プロモーター認識の特異
性が強く転写活性も高いため試験管内RNA合成によく
用いられている[ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー(J. Biol. Chem.)第 257巻、第5772〜57
78頁(1982)、ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー(J. Biol. Chem.)、第257 巻、第5779〜57
88頁(1982)]。さらに、SP6RNAポリメラーゼ遺
伝子はすでにクローニングされ、大腸菌内で大量発現さ
れている[ヌクレイック アシッズリサーチ(Nucl. Ac
ids Res.)第15巻、第2653〜2664頁(1987)]。
【0007】宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺
伝子の例として、制限酵素(Restriction Endonucleas
e)遺伝子がある。本来制限酵素は、産生している微生
物の体内に侵入したファージ等の外来DNAを切断する
ことによる自己防御に利用される。一方、制限酵素を産
生する微生物は、大抵の場合、制限酵素と同じ塩基配列
を認識する修飾酵素を産生し、制限酵素による切断から
自己のDNAを防御している。すなわち、修飾酵素は認
識する塩基配列中の塩基の一つ以上にメチル基を添加し
てDNAを修飾し、同じ配列を認識する制限酵素の結
合、或いは該酵素によるDNA切断を不可能にする。こ
の機構を制限修飾系と呼び、構成する制限酵素及び修飾
酵素の遺伝子対を制限修飾系遺伝子と呼ぶ。従って、制
限修飾系遺伝子の修飾酵素遺伝子が欠損した微生物中で
制限酵素遺伝子が発現すると、微生物自身のDNAが切
断され細胞は死に到る。実際、MboI制限修飾系遺伝
子には二種類の修飾酵素遺伝子が存在しているが、この
うちの一方の修飾酵素遺伝子のみを共存させることによ
る不完全なメチル化では宿主DNAの修飾が不完全とな
り、制限酵素遺伝子のクローニングが不可能であること
が報告されている[ヌクレイック アシッズ リサーチ
(Nucl. Acids Res.)第21巻、第2309〜2313
頁(1993)]。
【0008】また、制限修飾系遺伝子を保持する細胞よ
り制限修飾系遺伝子の脱落が起こると、細胞内に存在す
る修飾活性が不足してゲノムDNAのメチル化が不完全
になり、細胞内に残存するごく少量の制限酵素によって
自分自身のゲノムDNAが切断されて致死的となること
が明らかにされている[サイエンス(Science )第26
7巻、第897〜899頁(1995)]。このように
制限修飾系を構成する修飾酵素非共存下では、制限酵素
は細胞にとって極めて有害なタンパク質であり、その遺
伝子を単独でクローニングし、さらに発現させることは
これまでの技術では不可能であった。
【0009】ここで制限酵素について触れると、その酵
素学的性質により制限酵素はI型、II型、III 型に分類
する事ができる。その中でも、特定のDNA塩基配列を
認識し、その配列の内部或いは近傍の特定の位置で切断
するII型制限酵素は、遺伝子工学の分野で広く使用さ
れ、これまでに種々の特異性を有する制限酵素が様々な
微生物から単離されている[ヌクレイック アシッズ
リサーチ(Nucl. AcidsRes.)第24巻、第223 〜235 頁
(1996)]。以下、本明細書ではII型制限酵素を「制限
酵素」と記載する。しかし、微生物によっては、産生し
ている制限酵素量が少なかったり、複数の制限酵素を産
生している場合がある。例えば、制限酵素AccIII は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所〔あて名:
日本国茨城県筑波郡谷田部町東1丁目1番3(郵便番号
305)〕に、昭和60年11月9日(原寄託日)より
FERM BP−935として寄託されているアチネト
バクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoa
ceticus )(以下Acc菌と略する)により生産される
が、該酵素の発現量は低く、また本菌はAccI及びA
ccII制限酵素を同時に産生している。従って、高純
度、安価な試薬として制限酵素AccIII を本菌を用い
提供するには高度な製造技術を要した。高純度で安価な
試薬として制限酵素を提供する場合、目的の制限酵素遺
伝子を単離し、目的制限酵素のみを大量生産する遺伝子
工学的生産は有効な手段である。この目的を達成するた
め、従来制限酵素遺伝子を単離する幾つかの方法が報告
されている。
【0010】まず制限酵素を産生している微生物のゲノ
ムDNAを適当な制限酵素により切断し、その断片を適
当なプラスミドベクターに挿入し、制限酵素遺伝子が発
現するクローンを選択する「ショットガン」方法が挙げ
られる。目的クローンのスクリーニング法として、例え
ば、宿主に制限修飾系遺伝子が導入されると、宿主が自
己防衛機能を獲得することを利用し、ファージの感染に
対する耐性を指標にし、制限修飾系遺伝子を単離する方
法[PstI:プロシーディングス オブ ザナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ USA
(Proc.Natl.Acad.Sci. )第78巻、第1503〜15
07頁(1981)]がある。しかし、本方法では、制
限修飾系遺伝子のサイズが単離可能な範囲に収まる必要
があり、さらに単離された制限修飾系遺伝子の発現が、
宿主を選択的に生存させうるに十分なファージ耐性を示
す必要がある。一方、制限修飾系遺伝子の一般的な特徴
として、制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子がゲノム上で
近接していることが挙げられ、実際、これまでに得られ
た制限修飾系遺伝子の多くで確認されている[ヌクレイ
ック アシッズ リサーチ(Nucl. Acids Res.)第19
巻、第2539〜2566頁(1991)]。そこで、
上記特徴を利用し、修飾酵素遺伝子の発現を指標とし制
限修飾系遺伝子をスクリーニングする方法[特開昭63
−87982、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nuc
leic.Acids Res.)第19巻、第1831〜1835頁
(1991)]がある。しかし本法は、修飾酵素遺伝子
に制限酵素遺伝子が近接していない場合、制限酵素遺伝
子を得ることはできない。
【0011】さらに上記の「ショットガン」方法には、
根本的な問題がある。それは、ゲノムDNA供給源とな
る生物と宿主との間の転写翻訳機構の違いである。例え
ば制限修飾系遺伝子に付随するプロモーター及びリボゾ
ーム結合部位が宿主内でうまく機能せず、十分な遺伝子
発現が起こらない場合には、たとえ目的の遺伝子を含有
する形質転換体を得られていても、その形質転換体を選
択する事に多大な労力を要する。この点を回避するに
は、例えば、制限酵素タンパク質のアミノ酸配列を解析
し、そのデータを基にPCRによるDNA増幅法によ
り、制限酵素産生菌のゲノムDNAより制限酵素遺伝子
を得、既知のタンパク質発現システムを利用する方法が
ある[特開平6−277070]。しかし、従来のタン
パク質発現システムでは、制限酵素の存在が宿主に対し
致死的となるため、何らかの方法、例えば該酵素と制限
修飾系を構成する修飾酵素を共存させ、宿主を保護する
必要がある。
【0012】前述の制限酵素遺伝子の単離方法はいずれ
も、該遺伝子とともに制限修飾系遺伝子を構成する修飾
酵素遺伝子を同時に単離することが必要であるが、制限
酵素遺伝子単独で単離する方法も報告されている[ヌク
レイック アシッズ リサーチ(Nucleic.Acids.Res.)
第22巻、第2399〜2403頁(1994)]。し
かし、この方法で例示されているのは、酵素活性至適温
度が70℃付近の制限酵素をコードする遺伝子の単離で
あり、宿主培養温度近辺で比活性の高い制限酵素をコー
ドする遺伝子を単離する場合には、やはり修飾酵素遺伝
子を共存させている。
【0013】また例外的に、制限酵素DpnIの様にD
NA認識配列中の特定の核酸塩基がメチル化による修飾
を受けていないと、切断活性を示さない制限酵素が存在
する。このような性質を有する制限酵素遺伝子は、宿主
菌を選択することにより、例外的に、他の特定の遺伝子
非共存下でも単離可能だと考えられる。実際、II型制限
酵素ではないが、メチル化を受けた核酸塩基を含む特定
のDNA塩基配列を認識し、DNA切断活性を有するM
rrタンパク質をコードしたmrr遺伝子が単離されて
いる[ジャーナル オブ バクテリオロジー(J.Bacteri
ol.)第173巻、第5207〜5219頁(199
1)]。
【0014】上述したように、従来の技術により制限酵
素遺伝子の単離を行うには、特殊な場合を除き、該遺伝
子と制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子を同時
に発現させる必要があった。
【0015】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の第1
の目的は、AccIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ドを提供することにある。さらに本発明の第2の目的は
AccIII 制限酵素活性を有するポリペプチドをコード
するDNAを提供することにある。
【0016】本発明者らはpET−システムの問題点を
解決するため、発現制御が正確な新しい発現システムと
して、まずSP6RNAポリメラーゼを用いた発現シス
テムの構築を行い、該システムの評価を試みた。
【0017】該発現システムは、SP6RNAポリメラ
ーゼ遺伝子をminiFプラスミドに組み込んだシステムプ
ラスミドを利用して構築されているため、目的の遺伝子
をSP6プロモーター下流にクローニングした発現ベク
ターとこのシステムプラスミドを同時に宿主に導入する
ことにより、様々な大腸菌で目的遺伝子の発現システム
を構築することができる。さらに、lacプロモーター
とアンチセンス技術を利用してシステムプラスミド上の
SP6RNAポリメラーゼ遺伝子の厳密な発現制御を可
能にした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺
伝子に用いて本発現システムを評価した結果、このシス
テムにおいてSP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発現は
正確に制御されており、非誘導状態でSP6RNAポリ
メラーゼがほとんど発現していないこと、および誘導後
には目的遺伝子の高発現に必要十分なSP6RNAポリ
メラーゼが発現し、目的遺伝子が高発現することが明ら
かになった。
【0018】しかしながら大腸菌を宿主とした場合に
は、SP6プロモーターは大腸菌のRNAポリメラーゼ
によって非常に弱いながら認識されるために、その下流
にある目的遺伝子は非誘導状態においてもごく少量発現
することが明らかになった。このため、遺伝子産物が大
腸菌に対して非常に有害で致死的に働く場合には発現シ
ステムの構築は不可能となり、本発明の目的を充分に達
成することはできないことが判明した。
【0019】そこで、本発明者らはさらに鋭意研究した
結果、目的遺伝子の発現を2種類の制御方法、すなわち
該遺伝子のコピー数の制御、およびプロモーターを介し
た転写制御とを組み合わせてコントロールする新規なシ
ステムを採用することにより、意外にも (i)非誘導状態
では目的遺伝子の発現を検出できないレベルに抑えるこ
とが可能であり、(ii)発現誘導を行った場合には目的遺
伝子を含有するプラスミドのコピー数を上昇させると共
にRNAポリメラーゼを発現させ、該RNAポリメラー
ゼの認識するプロモーター下流に配置された目的遺伝子
が転写、翻訳されることを見いだした。即ち、本発明の
プラスミドベクターは、上記課題を解決することができ
る、遺伝子工学的分野において画期的な性質を有するプ
ラスミドベクターであり、本発明者らはさらに該ベクタ
ーを利用した目的遺伝子の発現方法を完成するに至っ
た。
【0020】更に、上記プラスミドベクターを用いて、
宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺伝子を単離す
る方法、特に、従来技術の欠点を克服した制限酵素遺伝
子の単離方法を完成するに至った。
【0021】また上記の方法を利用することにより、従
来得られていなかったAccIII 制限酵素をコードする
DNAをAccIII 修飾酵素を共存させることなく単離
することができ、更にAccIII 制限酵素を大量発現さ
せることが確認できた。
【0022】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
(1) 配列表の配列番号:1に示されるアミノ酸配列
の全部、又はその一部を含むものであって、AccIII
制限酵素活性を有するポリペプチド、(2) 配列表の
配列番号:1に示されるアミノ酸配列又はその一部のア
ミノ酸配列において、1個若しくは複数のアミノ酸残基
が欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも1つがされて
おり、かつAccIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ド、(3) 配列表の配列番号:1に示されるアミノ酸
配列の全部、又はその一部を含むポリペプチドであっ
て、AccIII 制限酵素活性を示すポリペプチドをコー
ドするDNA、(4) 配列表の配列番号:2で示され
るDNAの全部、又はその一部を含むDNAであって、
該DNAの発現産物がAccIII 制限酵素活性を示すD
NA、(5) 配列表の配列番号:1で示されるアミノ
酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、1個若し
くは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置
換の少なくとも1つがされており、かつAccIII 制限
酵素活性を示すポリペプチドをコードするDNA、並び
に(6) 前記(3)〜(5)いずれか記載のDNAに
ハイブリダイズ可能な、AccIII 制限酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするDNA、に関するものであ
る。
【0023】
【発明の実施の形態】本発明の第1の発明はプラスミド
ベクターに関する。すなわち、宿主が本来有しないRN
Aポリメラーゼによって認識される、目的遺伝子の発現
を制御するプロモーター配列と、外来因子による誘導に
よってコピー数を増加させる複製起点とを有することを
特徴とするプラスミドベクターに関する。該プラスミド
ベクターが有する目的遺伝子の発現を制御するプロモー
ター配列としては、特に限定されるものではないが、あ
る特定のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモ
ーター配列、例えばT7、T3、SP6等のバクテリオ
ファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識される
プロモーター配列が使用でき、とりわけSP6ファージ
由来のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモー
ター配列が好ましい。SP6ファージ由来のRNAポリ
メラーゼによって認識されるプロモーター、すなわちS
P6プロモーターの最小領域の塩基配列を配列表の配列
番号30に示す。さらに、該プラスミドベクターは選択
マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子を有すること
ができる。
【0024】また、本発明のプラスミドベクターのコピ
ー数の制御、すなわち該プラスミドベクターの複製起点
の機能の制御を行う外来因子としては、特に限定される
ものではないが、例えばラクトース又はイソプロピル−
β−D−チオガラクトシド(IPTG)のようなその構
造類似物の添加、ガラクトース又はその構造類似物の添
加、アラビノース又はその構造類似物の添加等の種々の
化学物質の添加或いはトリプトファン濃度の低減、形質
転換体の培養温度の調整等を挙げることができる。これ
らの因子により制御可能なプロモーターの支配下に複製
起点をおくことによってコピー数の制御が可能となる。
この目的に使用可能なプロモーターとしては上記の目的
を達成できるものであれば特に制限はなく、たとえば宿
主が大腸菌である場合にはlac、trp、tac、g
al、ara、PL 等のプロモーターを使用できる。ま
たこれらのプロモーターはRNAポリメラーゼ遺伝子の
発現誘導にも使用することが可能である。
【0025】本発明のプラスミドベクターの複製起点
は、特に限定されるものではないが、例えばランナウエ
イプラスミドの複製起点であり、複製起点がlacプロ
モータの制御下にあるプラスミドベクターが例示され
る。この場合には、コピー数の制御はラクトース及びそ
の構造類似物の添加、特に好ましくはイソプロピル−β
−D−チオガラクトシド(IPTG)の添加によって達
成される。
【0026】本発明の第2の発明は、本発明のプラスミ
ドベクターに発現させようとする目的遺伝子を組み込ん
だプラスミドベクターと、該プラスミドベクター上のプ
ロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼ遺伝子と
を宿主に導入し、外来因子により該プラスミドベクター
のコピー数の増加を誘導すると共に該RNAポリメラー
ゼの発現の誘導を行って目的遺伝子の転写、翻訳を行う
ことを特徴とする、目的遺伝子の発現方法に関する。プ
ラスミドベクター上のプロモーター配列を認識するRN
Aポリメラーゼ遺伝子としては、特に限定されるもので
はないが、例えば前記のようなバクテリオファージ由来
のRNAポリメラーゼ遺伝子を挙げることができ、とり
わけSP6ファージ由来のRNAポリメラーゼ遺伝子が
好適である。また、かかるRNAポリメラーゼの発現
の、又はプラスミドベクターのコピー数の増加の誘導を
行う外来因子としては、特に限定されるものではない
が、例えばラクトース又はイソプロピル−β−D−チオ
ガラクトシド(IPTG)のようなその構造類似物の添
加、ガラクトース又はその構造類似物の添加、アラビノ
ース又はその構造類似物の添加等の種々の化学物質の添
加或いはトリプトファン濃度の低減、形質転換体の培養
温度の調整等を挙げることができる。
【0027】プラスミドベクターのコピー数の増加の誘
導とRNAポリメラーゼの発現の誘導とは、それぞれ別
の外来因子の作用により行うことも、あるいは同一の外
来因子の作用により行ってもよい。また、この場合RN
Aポリメラーゼをコードする遺伝子は、宿主の染色体上
に組み込まれていても、あるいは本発明のプラスミドベ
クターとは異なる別のプラスミドベクターやファージベ
クターによって宿主に導入されていてもかまわない。後
者の場合には目的に応じて宿主を変更することが容易に
行える。さらに、この場合にはRNAポリメラーゼ遺伝
子を有するベクターの宿主への導入は、本発明のプラス
ミドベクターより先に行われても、あるいは後で行われ
てもかまわない。
【0028】本発明における目的遺伝子は、特に限定さ
れるものではないが、宿主に対し致死的となる、あるい
は有害なタンパク質をコードするものである場合にその
意義が発揮される。このようなタンパク質としては、例
えば前記のような制限酵素、その他の核酸分解酵素、核
酸結合性のタンパク質、タンパク質分解酵素などが挙げ
られる。
【0029】本発明は、前記のように目的遺伝子の発現
を2種類の制御方法、すなわち該遺伝子のコピー数の制
御、およびプロモーターを介した転写制御とを組み合わ
せてコントロールするシステムを提供する。本発明にお
けるプラスミド上にクローニングされた目的遺伝子の発
現の制御は、従来のものと異なり極めて厳密であり、非
誘導状態ではその発現を検出できないレベルに抑えるこ
とが可能である。発現誘導を行いプラスミドのコピー
数、すなわち目的遺伝子のコピー数を上昇させると共に
RNAポリメラーゼを発現させると、該RNAポリメラ
ーゼの作用によってプロモーターに制御されて目的遺伝
子が転写、翻訳される。
【0030】従って、本発明のプラスミドベクターを用
いることによって、従来技術では困難であった宿主に対
して有害な、あるいは致死的な遺伝子を含有する形質転
換体を作製し、さらに該遺伝子の発現を行うことが可能
となる。
【0031】例えば、本発明のプラスミドベクターを使
用し、Nsp7524III 制限酵素をコードする遺伝子のク
ローニングを試みたところ、対応する修飾酵素遺伝子を
共存させることなく大腸菌に保持させることができた。
さらに、得られた形質転換体にRNAポリメラーゼ遺伝
子を含有するシステムプラスミドを導入して発現誘導を
行うことによりその菌体内にNsp7524III 制限酵素を
発現させることも可能であった。
【0032】また、本発明のプラスミドベクターを遺伝
子ライブラリー作製のためのクローニングベクターとし
て用いることにより、従来の方法を用いた場合には取得
できなかった遺伝子を単離し、さらにその発現産物の活
性を確認することを1つの宿主で行うことが可能とな
る。もちろん本発明のプラスミドベクターの利用は宿主
に対して有害な産物をコードする遺伝子のクローニング
に限られるものではなく、一般的なプラスミドベクター
としても利用可能である。
【0033】本発明に係るRNAポリメラーゼ遺伝子を
宿主に導入する方法として、例えば、プラスミドpFS
P6、ファージM13sp6を用いることができる。プ
ラスミドpFSP6の詳細な構築方法は参考例(2)に
記載されている。該プラスミドで形質転換された大腸菌
HB101は Escherichia coli HB101/pFSP
6と命名、表示され、平成7年12月22日(原寄託
日)より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
〔あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵
便番号305)〕に受託番号FERM BP−5742
として寄託されている。ファージM13sp6の構築方
法は実施例2(6)に記載されている。
【0034】以下に、プラスミドpFSP6を用いた場
合を例に挙げて、本発明について更に詳しく説明する。
【0035】まず、上記のシステムプラスミドpFSP
6を利用して目的遺伝子の発現を行うことができるプラ
スミドとして、SP6RNAポリメラーゼによって認識
されるプロモーター配列と、レポーター遺伝子としての
β−ガラクトシダーゼ遺伝子とを有するマルチコピーの
モデル発現プラスミドであるプラスミドpMSP6L、
pMSP6F(図1)、pMSP6O(図2)を構築
し、これらのモデル発現プラスミドを用いて行った試験
結果について説明する。
【0036】これらのモデル発現プラスミドの詳細な構
築方法は参考例(3)に記載されている。これらのプラ
スミドにはSP6プロモーター配列としてSP6プロモ
ーターの最小領域(pMSP6L)、ネイティブなSP
6プロモーター領域(pMSP6F)、又はSP6プロ
モーターの最小領域とlacオペレーター領域(pMS
P6O)がそれぞれ導入されている。
【0037】プラスミドpMSP6L又はpMSP6F
のみを表1に示す大腸菌に導入した場合には、表2に示
されるように宿主大腸菌がSP6RNAポリメラーゼを
発現しないにもかかわらずβ−ガラクトシダーゼ活性が
認められ、その量はSP6プロモーターを有していない
プラスミドpMS434を導入したものよりも高い。す
なわち、SP6プロモーターが大腸菌由来のRNAポリ
メラーゼによって認識され、その下流のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子が転写、翻訳されていると考えられる。ま
た、大腸菌MRi80はpcnB遺伝子に変異を有し、
上記のモデル発現プラスミドのようなColE1由来の
複製起点を持つプラスミドのコピー数が親株であるMR
i7に比べて1/6〜1/13に低下する株であるが、
これを宿主に用いた場合にはβ−ガラクトシダーゼ活性
もMRi7の1/7〜1/14に減少している。このこ
とから、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現のレベルと
導入されたプラスミドのコピー数との間には相関がある
ことが示される。
【0038】
【表1】
【0039】
【表2】
【0040】次に、同じモデル発現プラスミドを上記の
システムプラスミドpFSP6とともに大腸菌に導入し
たうえ、SP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導
しない条件下でβ−ガラクトシダーゼ活性を調べてみる
と、表3に示されるようにシステムプラスミドを有さな
い大腸菌の場合と同程度のβ−ガラクトシダーゼ活性し
か認められない。このことは非誘導状態においてはプラ
スミドpFSP6上のSP6RNAポリメラーゼ遺伝子
の発現がほぼ完全に抑えられていることを示している。
一方、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IP
TG)を添加してSP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発
現を誘導した場合にはβ−ガラクトシダーゼ活性は18
〜32倍上昇しており、SP6プロモーターを介してβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能であることを示し
ている。特に大腸菌MRi80を宿主とした場合には、
非誘導状態のβ−ガラクトシダーゼ活性は極めて低いレ
ベルにおさえられているが、誘導4時間後には非誘導状
態の25〜32倍に上昇している。
【0041】
【表3】
【0042】さらにSP6プロモーター下流にlacオ
ペレーター配列を挿入されているプラスミドpMSP6
Oでは、他のモデル発現プラスミドに比べて非誘導条件
下でのβ−ガラクトシダーゼ活性が低下しているが、そ
の発現を完全におさえることはできない。以上の結果
は、マルチコピーのプラスミドを使用した発現システム
では目的遺伝子の発現を完全におさえることが難しく、
また、この問題を解決するにはシステムプラスミド上の
RNAポリメラーゼ遺伝子の発現制御よりも目的遺伝子
を含むプラスミドのコピー数による制御の方が効果があ
ることを示唆している。
【0043】そこで、本発明者らはこれらの結果をもと
に新たな発現ベクターの開発を行い、本発明のプラスミ
ドベクターを見出すに到った。
【0044】即ち、本発明者らは非誘導状態での発現レ
ベルを下げ、誘導後の発現量を確保することができるラ
ンナウエイプラスミドベクターを構築した。まず、シス
テムプラスミドではSP6RNAポリメラーゼの発現が
IPTGによって誘導されることを考慮して、IPTG
の誘導によりコピー数を増加させることのできるランナ
ウエイ複製起点を有するプラスミドを図3に示す操作に
従って構築した。まず、プラスミドベクターpUC19
(宝酒造社製)のNdeIサイトに配列表の配列番号:
3および配列番号:4にその塩基配列を示した2つのD
NA鎖から作製される106NdeIDNA断片を導入
して得られるプラスミドpUC106Aより、lacプ
ロモーター、およびオペレーター領域を含むPvuII断
片を除いたプラスミドpUC106AdPOを構築す
る。
【0045】次に該プラスミドを鋳型とし、該プラスミ
ドの複製起点であるRNAII領域近傍に設定されたRN
AIIAプライマー(配列表の配列番号:5にRNAIIA
プライマーの塩基配列を示す)と106NdeI配列末
端部分に設定された1870プライマー(配列表の配列番
号:6に1870プライマーの塩基配列を示す)を用いたP
CRによって得られるRNA1870断片をプラスミドpS
TV28(宝酒造社製)のXbaIサイトに挿入したプ
ラスミドpHS2870を得ることができる。構築され
たプラスミドpHS2870を図4に示す。通常、大腸
菌1細胞あたりに該プラスミドは30コピー程度存在す
るが、IPTGの添加によりそのコピー数は数百に増加
する。
【0046】次に該プラスミドよりプラスミドpSTV
28由来のP15A複製起点を含むAccI−NspI
断片を除き(プラスミドpCRS01)、さらに不要の
制限酵素サイトを含むEcoRI−XbaI断片を除去
した後(プラスミドpCRS02)、プラスミドpMJ
R1560[ジーン(Gene)第51巻、第 225〜 267頁
(1987)]由来のラクトース・レプレッサー(lacI
q )遺伝子を含むDNA断片を導入したプラスミドpC
RS04を構築することができる。図5にプラスミドp
HS2870からプラスミドpCRS04を構築する過
程を示す。図6にこうして構築されたプラスミドpCR
S04を示す。該プラスミドはIPTGで誘導されるラ
ンナウエイプラスミドであり、通常は大腸菌1細胞あた
りに1〜2コピー存在するが、IPTGの添加によりそ
のコピー数は数百に増加する。
【0047】該プラスミド上に挿入される目的遺伝子の
発現を制御するために、該プラスミドのNheIサイト
にSP6プロモーター配列とlacオペレーター配列と
を含む2本鎖オリゴヌクレオチド、PSP6 −Olac EX
リンカーを導入し、プラスミドpACE601を構築す
ることができる。PSP6 −Olac EXリンカーは配列表
の配列番号:7および配列番号:8にその塩基配列を示
した2つのDNA鎖から作製される。該プラスミドpA
CE601は選択マーカーとしてクロラムフェニコール
耐性遺伝子を有するランナウエイプラスミドベクターで
ある。
【0048】また、上記のプラスミドpCRS04のN
heIサイトにプラスミドベクターpUC118(宝酒
造社製)由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むBspH
I断片を導入した後(プラスミドpCRS70)、さら
にクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むNcoI−B
saAI断片を除いて上記のPSP6 −Olac EXリンカ
ーに置換することにより、該リンカーの挿入方向の異な
るプラスミドpACE701およびpACE702を構
築することができる。これらのプラスミドは選択マーカ
ーとしてアンピシリン耐性遺伝子を有するランナウエイ
プラスミドベクターである。
【0049】こうして得られたプラスミドpACE60
1、pACE701およびpACE702を使用した場
合の目的遺伝子の発現制御の能力は上記同様にβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として調べるこ
とができる。プラスミドpMS434[ジーン(Gene)
第57巻、第89〜99頁(1987))]を鋳型とし、プライマ
ーtrpA−N−NcoI、およびプライマーlacZ
−C−NcoIを用いたPCRによって増幅されるβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を、上記の3
つのプラスミドそれぞれのSP6プロモーター下流に存
在するNcoIサイトに導入したモデル発現プラスミド
を構築することができる。プライマーtrpA−N−N
coI、およびプライマーlacZ−C−NcoIの塩
基配列をそれぞれ配列表の配列番号:9および配列番
号:10に示す。こうして得られたプラスミドはそれぞ
れプラスミドpACE601Z、pACE701Zおよ
びpACE702Zと命名されている。これらのモデル
発現プラスミドで形質転換された大腸菌ではβ−ガラク
トシダーゼ活性は全く検出されず、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現が極めて厳格に制御されていることが示
される。
【0050】本発明のプラスミドを用いて、宿主に対し
その発現産物が致死的に働く遺伝子を単離し、さらに該
遺伝子を発現させることが可能なことをNsp7524 III
制限酵素遺伝子を用いて確かめることができる。プラス
ミドpBRN3はNsp7524III制限修飾系遺伝子を含
有しており、該プラスミドで形質転換された大腸菌MC
1061は Escherichia coli MC1061/pBRN
3と命名、表示され、平成7年9月28日(原寄託日)
より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あ
て名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番
号305)〕に寄託番号FERM BP−5741とし
て寄託されている。該形質転換体より調製したプラスミ
ドpBRN3を鋳型とし、プライマーL−ORF、およ
びプライマーNspR−ORF3を対としたPCRによ
るDNA増幅反応により、Nsp7524 III制限酵素遺伝
子のみを含むDNA断片を取得することができる。配列
表の配列番号:11および配列番号:12にプライマー
L−ORF、およびプライマーNspR−ORF3の塩
基配列を示す。得られたDNA断片を上記のプラスミド
pACE601のSP6プロモーター下流のNcoIサ
イトに挿入して得られるプラスミドpACE601−N
sp IIIを大腸菌HB101に導入することにより形質
転換体 Escherichia coli HB101/pACE601
- Nsp IIIを得ることができる。該形質転換体はNs
p7524 III修飾酵素遺伝子が共存しないにもかかわらず
Nsp7524 III制限酵素遺伝子を、宿主に安定に保持さ
せることが可能である。
【0051】さらに該形質転換体に上記のシステムプラ
スミドpFSP6を導入した形質転換体 Escherichia c
oli HB101/pFSP6/pACE601- Nsp
IIIを作製することができる。該形質転換体を培養し、
その適当な時期にIPTGを添加して発現誘導を行うこ
とにより培養物中でNsp7524 III制限酵素が産生可能
なことを確認できる。
【0052】本発明の第3の発明は、上記プラスミドベ
クターを用いることを特徴とする、目的遺伝子の単離方
法を提供する。本発明の単離方法は、宿主に対しその発
現産物が致死的あるいは有害な遺伝子、特に制限酵素遺
伝子の単離に好適に適用される。本法を用いることによ
り、これまで単離されていない制限酵素遺伝子、例えば
AccIII 制限酵素遺伝子を、AccIII 修飾酵素遺伝
子非存在下でも単離することが可能となる。制限酵素遺
伝子の単離は、目的酵素産生菌のゲノムDNAを適当な
制限酵素により断片化し、得られたDNA断片を直接、
例えばプラスミドpACE611に組み込むことによ
る、いわゆる「ショットガン方法」のほか、例えば制限
酵素産生菌のゲノムDNAのカセットライブラリーを利
用し実施することも可能である。カセットライブラリー
を鋳型とし、DNA増幅法により遺伝子を獲得すること
により、宿主と転写機構の異なる微生物より調製した遺
伝子も発現させることが可能になる。以下、カセットラ
イブラリーを利用した制限酵素遺伝子の単離方法につい
て、AccIII 制限酵素を例として述べる。
【0053】AccIII 制限酵素産生菌、すなわちAc
c菌のゲノムDNAのカセットライブラリーは、以下の
ように作製できる。即ち、Acc菌を培養して得られる
菌体よりゲノムDNAを抽出し、適当な制限酵素で消化
した後、得られたDNA断片と相補的な突出末端を持つ
カセットとを連結する。ゲノムDNA切断に使用する制
限酵素の種類を変え、同様のカセットライブラリーを数
種作製する。これらを合わせてAccゲノムカセットラ
イブラリーと呼ぶことにした。次に、Acc菌より目的
制限酵素タンパク質を精製し、そのアミノ酸配列の一部
を決定し、この配列に基づいてプライマーを合成する。
このプライマーとカセットプライマーを用いて、個々の
カセットライブラリーを鋳型としたPCRによるDNA
増幅反応を行い、AccIII 制限酵素遺伝子断片を含む
DNA断片を取得する。得られたDNA断片の塩基配列
を、例えば、PCR産物のダイレクトシークエンシング
により決定し、AccIII 制限酵素遺伝子全長の塩基配
列を決定する。
【0054】該塩基配列よりAccIII 制限酵素遺伝子
全長を増幅することが可能なプライマーを設計し、Ac
c菌のゲノムDNAを鋳型とし、PCRによるDNA増
幅反応によりAccIII 制限酵素遺伝子全長を含むDN
A断片を取得する。得られたDNA断片をプラスミドp
ACE611のSP6プロモーターの下流にコドンフレ
ームが合うように挿入して得られる組み換えプラスミド
を、例えば、大腸菌JM109に導入することにより形
質転換体を得る。AccIII 制限酵素遺伝子が発現可能
な状態にある形質転換体の選択は、各形質転換体を培養
し、更に本発明の遺伝子発現方法によって遺伝子発現誘
導を行い、得られた各培養物中のAccIII 制限酵素活
性を確認するほか、例えば、各形質転換体に保持されて
いるプラスミドDNAの制限酵素地図を作成することに
より実施することができる。
【0055】実際、このようにして得られたAccIII
制限酵素遺伝子をプラスミドpACE611に挿入し、
得られたプラスミドはpCRA19と命名されている。
図7にその制限酵素地図を示す。図中、太い実線がAc
cIII 制限酵素遺伝子を含むDNA断片である。プラス
ミドpCRA19を導入した大腸菌JM109は Esche
richia coli JM109 / pCRA19と命名され、平成8年5月
28日(原寄託日)により通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所〔あて名:日本国茨城県つくば市東1
丁目1番3号(郵便番号305)〕に寄託番号FERM
BP−5743として寄託されている。該形質転換体
はAccIII 修飾酵素遺伝子が共存しないにもかかわら
ず、制限酵素遺伝子を安定に保持している。上記の方法
により、制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子の
共存を必要とせず、制限酵素遺伝子を単離することがで
きる。
【0056】本発明の第4の発明はAccIII 制限酵素
活性を有するポリペプチドを提供する。
【0057】本明細書において、AccIII 制限酵素活
性を有するポリペプチドの総称としてAccIII 制限酵
素なる用語を使用する場合がある。本発明のAccIII
制限酵素は、例えば配列表の配列番号:1に記載のアミ
ノ酸配列からなる。
【0058】また、本発明のAccIII 制限酵素は、前
記のものに限定されることはなく、配列表の配列番号:
1に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペ
プチドであって、AccIII 制限酵素活性を有するポリ
ペプチドをも含むものであり、さらに配列表の配列番
号:1に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸
配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、
付加、挿入又は置換の少なくとも一つがされており、か
つAccIII 制限酵素活性を有するポリペプチドも本発
明の範囲内である。
【0059】一般に天然に存在するタンパク質にはそれ
をコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のタンパ
ク質の生体内および精製中の修飾反応などによってその
アミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、挿入、付加、置
換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を
有しないタンパク質と実質的に同等の生理学的活性、生
物学的活性を示すものがあることが知られている。この
ように構造的に差異があってもその機能や活性について
は大きな違いが認められないものは、本発明の範囲内で
ある。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のよう
な変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさら
に多種多様の変異体を作製することが可能である。たと
えば、大腸菌で発現されたタンパク質のN末端に存在す
るメチオニン残基は多くの場合メチオニンアミノペプチ
ダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパ
ク質の種類によってはその除去が完全には行われず、メ
チオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成さ
れる。しかしこのメチオニン残基の有無はタンパク質の
活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインタ
ーロイキン2(IL−2)のアミノ酸配列中のあるシス
テイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインター
ロイキン2活性を保持することが知られている[サイエ
ンス(Science)、第224巻、1431頁(198
4)]。
【0060】さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産
を行う際には融合タンパク質として発現させることがし
ばしば行われる。たとえば目的タンパク質の発現量を増
加させるためにN末端に他のタンパク質由来のN末端ペ
プチド鎖を付加したり、目的タンパク質のN末端、ある
いはC末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、こ
のペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより
目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われて
いる。したがって本発明のAccIII 制限酵素とは一部
異なったアミノ酸配列を有するポリペプチドであって
も、それが本発明のAccIII 制限酵素と本質的に同等
の活性を示す限りにおいて、本発明の範囲内に属するも
のである。
【0061】AccIII 制限酵素を得る方法としては、
例えば、AccIII 制限酵素遺伝子を含有する、上記形
質転換体 Escherichia coli JM109 / pCRA19を培養し、
その適当な時期に誘導剤のIPTGを添加し pCRA19 コ
ピー数を増加させた後、ファージM13sp6を感染さ
せることにより、その目的を達成することができる。
【0062】形質転換体の培養物からAccIII 制限酵
素を採取するにあたっては、たとえば培養物より菌体を
集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出
し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグ
ラフィー法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー法等を組み合わせて精製すればよい。この精製におい
て出発原料となる上記培養物は、AccI、AccIIと
いった他の制限酵素を含まないため、従来の精製方法と
比べて容易に必要な純度の酵素標品を得ることができ
る。
【0063】本発明の第5の発明はAccIII 制限酵素
活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供す
る。
【0064】本発明のAccIII 制限酵素活性を有する
ポリペプチドをコードするDNAは、配列表の配列番
号:1に記載のアミノ酸配列をコードするDNAからな
るものであり、例えば配列表の配列番号:2に記載の塩
基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。即ち、配列表の配列番号:1に記
載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド
であって、AccIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNA、配列表の配列番号:2で示さ
れるDNAの全部、又はその一部を含むDNAであっ
て、該DNAの発現産物がAccIII 制限酵素活性を示
すDNA、配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配
列又はその一部のアミノ酸配列において、1個もしくは
複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入もしくは置換の
少なくとも一つがされており、かつAccIII 制限酵素
活性を有するポリペプチドをコードするDNA、上記
〜に記載のDNAにハイブリダイズ可能な、Acc
III 制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするD
NA、等も本発明の範囲内である。
【0065】また、上記で得られたDNAをプローブと
して厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、
得られたDNA(配列表の配列番号:2)と配列は少し
異なるが、同様な酵素活性を持つポリペプチドをコード
する類似のDNAを得ることができ、これも本発明の範
囲内のものである。
【0066】かかる厳密な条件下とは、例えば、DNA
を固定したナイロン膜を、6×SSC(1×SSCは塩
化ナトリウム8.76g 、クエン酸ナトリウム4.41
g を1リットルの水に溶かしたもの)、1% SDS、
100μg /mlサケ精子DNA、0.1% ウシ血清ア
ルブミン、0.1% ポリビニルピロリドン、0.1%
フィコールを含む溶液中で65℃にて20時間プロー
ブとともに保温してハイブリダイゼーションを行うこと
をいう。
【0067】AccIII 制限酵素をコードする類似のD
NAをハイブリダイゼーションにより得る方法として
は、たとえば以下の方法があげられる。
【0068】まず、適当な遺伝子源から得たDNAを常
法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してD
NAライブラリーを作製する。このライブラリーを適当
な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培
養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロ
ースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にDNA
を膜に固定する。この膜をあらかじめ32P等で標識した
プローブ(使用するプローブとしては、配列表の配列番
号:1に記載したアミノ酸配列の全部または一部をコー
ドするポリヌクレオチドであればよく、たとえば配列表
の配列番号:2に記載の塩基配列の全部または一部から
なるまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用すること
ができる)を含む上記の組成の溶液中、上記の条件で保
温し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼ
ーション終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流
し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブ
リッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイ
ブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。こう
して得られたクローンの中には、目的の酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするDNAが保持されている。
【0069】得られたDNAは、たとえば次のようにし
てその塩基配列を決定し、それが目的の酵素タンパク質
をコードするDNAであるかを確認する。
【0070】塩基配列の決定は、プラスミドベクターを
用いて作成された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒ
ア・コリであれば試験管等で培養を行い、常法に従って
プラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま
鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してM13フ
ァージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオ
キシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで
作成された形質転換体の場合も基本的に同様な操作によ
り塩基配列を決定することができる。
【0071】これら培養から塩基配列決定までの基本的
な実験法については、例えば、ティ・マニアティス(T.
Maniatis)らのモレキュラー・クローニング・ア・ラボ
ラトリー・マニュアル(Molecular Cloning : A Labora
tory Manual 、1982年、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー発行)等に記載されている。
【0072】得られたDNAが目的のAccIII 制限酵
素をコードする類似のDNAであるかどうかの確認は、
決定された塩基配列を配列表の配列番号:2に記載した
塩基配列と比較して、あるいは決定された塩基配列より
推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号:1に記載
したアミノ酸配列と比較して行うことができる。
【0073】得られたDNAが目的の制限酵素をコード
する領域の全てを含まない場合には、得られたDNAの
塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用い
たPCRによって足りない領域を増幅したり、あるいは
得られたDNAの断片をプローブとしてDNAライブラ
リーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード
領域を得ることができる。
【0074】こうして得られたAccIII 制限酵素をコ
ードする類似のDNAを含有する形質転換体を作成して
該DNAにコードされる酵素タンパク質を発現させ、さ
らに発現された酵素タンパク質を精製することができ
る。形質転換体の作成、酵素タンパク質の発現、精製は
いずれも本発明のプラスミドを使用することにより、実
施することができる。こうして得られた酵素タンパク質
はAccIII 制限酵素活性を保持している。
【0075】なお、従来得られていないAccIII 修飾
酵素及び該酵素をコードするDNAも、上記のAccII
I 制限酵素をコードするDNAを利用することにより得
ることができる。例えば、多くの場合に制限酵素遺伝子
と修飾酵素遺伝子とが接近して存在することを利用し、
制限酵素遺伝子近傍のタンパク質をコードする遺伝子領
域を、カセットライブラリーを鋳型としたDNA増幅反
応により得、適当な発現ベクターに組み込み、遺伝子発
現を行い、AccIII 修飾酵素活性を適当な方法で確認
することにより実施できる。AccIII 修飾酵素活性
は、例えば該形質転換体より調製したDNAが、Acc
III 制限酵素の切断活性に対する耐性を示すことによ
り、確認することもできる。なお、上記遺伝子領域の塩
基配列を決定し、既知の制限修飾系の修飾酵素遺伝子間
の保存領域[ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー(J.Mol.Biol.) 第206巻 第305〜321頁
(1989)]とのホモロジーが確認できれば、遺伝子
発現を行う前に、ある程度修飾酵素遺伝子であるとの予
測を立てることができる。
【0076】このようにして、Acc菌のゲノムDNA
のカセットライブラリーを利用することにより、Acc
III 修飾酵素及び該酵素をコードするDNAを得ること
ができる。配列表の配列番号:13にアミノ酸配列を、
配列番号:14に塩基配列を示す。
【0077】また、本発明におけるAccIII 修飾酵素
は前記のものに限定されることはなく、AccIII 制限
酵素の項で述べたように、配列表の配列番号:13に記
載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド
であって、AccIII 修飾酵素活性を有するポリペプチ
ドをも含むものであり、さらに配列表の配列番号:13
に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列に
おいて1もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿
入又は置換の少なくとも一つがされており、かつAcc
III 修飾酵素活性を有するポリペプチドも本発明の範囲
内である。
【0078】本発明におけるAccIII 修飾酵素をコー
ドするDNAは、配列表の配列番号:13に記載のアミ
ノ酸配列をコードするDNAからなるものであり、例え
ば配列表の配列番号:14に記載の塩基配列からなるD
NAが挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。すなわち、配列表の配列番号:13に記載のアミ
ノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドであっ
て、AccIII 修飾酵素活性を有するポリペプチドをコ
ードするDNA、配列表の配列番号:14で示される
DNAの全部、又はその一部を含むDNAであって、該
DNAの発現産物がAccIII 修飾酵素活性を示すDN
A、配列表の配列番号:13に記載のアミノ酸配列又
はその一部のアミノ酸配列において、1もしくは複数の
アミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも
一つがされており、かつAccIII 修飾酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするDNA、上記〜に記
載のDNAにハイブリダイズ可能な、AccIII 修飾酵
素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、など
も本発明の範囲内である。
【0079】
【実施例】以下に参考例および実施例をあげて本発明を
さらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに
限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作
のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的
な操作については1989年、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T. M
aniatis )ら編集、モレキュラー クローニング:ア
ラボラトリー マニュアル第2版(Molecular Cloning
: A Laboratory Manual 2nd ed. )に記載の方法によ
った。
【0080】参考例 (1)培地及び培養条件 大腸菌はLB培地(トリプトン1%、酵母エキス0. 5
%、NaCl0. 5%、pH7. 0)を用いて37℃で
好気的に培養した。抗生物質は大腸菌が保持しているプ
ラスミドに合わせて以下の濃度で培地に添加した。pF
SP6:25μg /mlのカナマイシン、pXX325:
20μg /mlのアンピシリン、アンピシリン耐性Col
E1タイププラスミド:50μg /mlのアンピシリン、
アンピシリン耐性pUCタイププラスミド:100μg
/mlのアンピシリン。発現誘導実験では、定常期まで培
養した培養液を新鮮な培地に1%植菌した後、37℃で
好気的に培養し、OD600 =0. 6(6×108 cell/
ml)に達した時点でイソプロピル−β−D−チオガラク
トシド(IPTG)を最終濃度が0. 2mMになるように
添加し、さらに培養を続けた。
【0081】(2)システムプラスミドpFSP6の構
築 システムプラスミドpFSP6は大腸菌JM109を宿
主とし、図8に示した手順で構築した。プラスミドpS
P6−2[ヌクレイック アシッズ リサーチ( Nucl.
Acids Res. )第15巻、第2653〜2664頁(1987)]をH
indIII (宝酒造社製)で消化し、末端を平滑化した
後、さらにBamHI(宝酒造社製)消化して得られる
SP6RNAポリメラーゼ遺伝子を含む約2. 8kbのD
NA断片をBamHIおよびHincII(宝酒造社製)
で消化したプラスミドベクターpUC18(宝酒造社
製)と混合してライゲーションを行い、プラスミドpU
CSPを構築した。次にプラスミドpMJR1560
[ジーン(Gene)第51巻、第225 〜267 頁(1987)]を
KpnIで消化し、末端を平滑化した後、更にPstI
(宝酒造社製)消化して得られるlacIq 遺伝子を含
む約1. 3kbのDNA断片を単離した。上記のプラスミ
ドpUCSPをHindIII で消化し、末端を平滑化し
た後、さらにPstIで消化し、これと上記の約1.3
kbのDNA断片とを混合してライゲーションを行い、
プラスミドpUCSPlacを構築した。
【0082】さらにpUCKm[ジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー( J. Mol. Biol.)、第 147
巻、第217 〜226 頁(1981)]をPstI消化して得ら
れる、カナマイシン耐性遺伝子を含む約1. 5kbのDN
A断片を上記のプラスミドpUCSPlacのPstI
サイトに導入してプラスミドpUCSPlacKmを構
築した。該プラスミドをAatII(東洋紡社製)消化し
た後にNspI(宝酒造社製)で部分消化を行って約
6. 5kbのDNA断片を単離し、さらにその両末端を平
滑化した。
【0083】一方、プラスミドpXX325[プロシー
ディングス オブ ザ ナショナルアカデミー オブ
サイエンス オブ ザ USA(Proc. Natl. Acad. Sc
i.USA)、第 80 巻、第4784〜4788頁(1983)]をHi
ndIII で消化し、末端を平滑化した後、さらにSal
I消化してminiFプラスミドの複製起点を含む約6. 8
kbのDNA断片を単離し、これを上記の約6. 5kbのD
NA断片と混合してライゲーションを行い、プラスミド
pFSP6を構築した。また、該プラスミドで大腸菌H
B101を形質転換し、Escherichia coli HB101
/pFSP6を作製した。
【0084】(3)マルチコピーのモデル発現プラスミ
ドの構築 SP6プロモーターの最小領域を含む2本鎖オリゴヌク
レオチドであるPSP6リンカーを配列表の配列番号:1
5および配列番号:16に塩基配列を示した2つのDN
A鎖から作製し、これとXhoI(宝酒造社製)および
HindIII で消化したプラスミドpMS434[ジー
ン(Gene)第57巻、第89〜99頁(1987)]を混合してラ
イゲーションを行い、該プラスミド上のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子上流に上記のプロモーター配列が挿入され
たモデル発現プラスミドpMSP6Lを構築した(図
1)。
【0085】一方、pSP64[ヌクレイック アシッ
ズ リサーチ( Nucl. Acids Res.)第12巻、第7035〜7
056頁(1984)]をAccIIおよびHindIII 消化し
て得られるネイティブなSP6プロモーター配列を含む
DNA断片を上記のプラスミドpMS434のXhoI
- HindIII サイト間に挿入することによりモデル発
現プラスミドpMSP6Fを構築した(図1)。さらに
SP6プロモーターの最小領域とlacオペレーター領
域とを含むPSP6 −Olac リンカーを配列表の配列番
号:17及び配列番号:18に塩基配列を示した2つの
DNA鎖から作製し、これを上記のプラスミドpMS4
34のXhoI−HindIII サイト間に挿入すること
によりモデル発現プラスミドpMSP6Oを構築した
(図2)。
【0086】(4)SP6プロモーターの大腸菌のRN
Aポリメラーゼに対するプロモーター活性 参考例(3)で構築されたプラスミドpMSP6L、p
MSP6F、および対照としてSP6プロモーター配列
を含まないプラスミドpMS434を表1に示す大腸菌
に導入し、得られた形質転換体を参考例(1)に示した
方法で培養後、それぞれの菌体の培養液を対数増殖期に
採取し、採取した培養液の一部でOD60 0 を測定し、残
りは予め冷やしておいた試験管に移して最終濃度が10
0mg/mlになるようにクロラムフェニコールを添加し
た。この培養液を試料として1972年、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー発行、J. H. ミラ
ー(J.H.Miller)著、エクスペリメンツ イン モレキ
ュラー ジェネティクス(Experiments in Molecular G
enetics )に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼ活性の
測定を行った。
【0087】表2に示されるように、SP6プロモータ
ーを含む配列が挿入されたモデル発現プラスミドpMS
P6L、あるいはpMSP6Fを導入された大腸菌MC
4100は、挿入されたプロモーター配列に関係なく、
同レベルの低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。し
かし、SP6プロモーターを含まないプラスミドpMS
434を導入されたものではこれよりも低い酵素活性し
か認められなかった。さらに大腸菌MRi7、MRi8
0を宿主として検討した結果、プラスミドのコピー数が
減少するMRi80ではβ−ガラクトシダーゼ活性も低
下した。
【0088】(5)システムプラスミドpFSP6の評
価 参考例(4)で作製した各形質転換体にシステムプラス
ミドpFSP6を導入したうえ参考例(1)に示した方
法で培養し、IPTG添加前後の非誘導状態と誘導状態
のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してその結果を表3
に示した。各形質転換体とも非誘導状態におけるβ−ガ
ラクトシダーゼ活性は表2に示されたプラスミドpFS
P6を導入されていない場合と同程度の値であった。
【0089】一方、IPTG添加による誘導を行うと、
プラスミドpMSP6L、およびpMSP6Fを導入さ
れたものでは非誘導状態と比較して18〜32倍のβ−
ガラクトシダーゼ活性が認められたのに対し、プラスミ
ドpMS434を導入されたものでは活性の上昇は見ら
れなかった。
【0090】(6)lacオペレーター配列の発現制御
への効果 プラスミドpFSP6を導入された大腸菌MC4100
にプラスミドpMSP6L、pMSP6F、pMSP6
O、およびpMS434をそれぞれ導入して得られる形
質転換体を参考例(1)に示した方法で培養し、非誘導
状態におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。そ
の結果を表4に示す。lacオペレーター配列を含むプ
ラスミドpMSP6Oを導入されたものではプラスミド
pMSP6L、pMSP6Fに比べてβ−ガラクトシダ
ーゼ活性が低くおさえられているが、なおわずかな活性
の発現が見られた。つまり、lacオペレーター配列の
導入だけでは完全に非誘導状態での発現を止めることは
できなかった。
【0091】
【表4】
【0092】実施例1 (1)培地及び培養条件 大腸菌はLB培地(トリプトン1%、酵母エキス0. 5
%、NaCl0. 5%、pH7. 0)を用いて37℃で
好気的に培養した。抗生物質は大腸菌が保持しているプ
ラスミドに合わせて以下の濃度で培地に添加した。pF
SP6:25μg /mlのカナマイシン、アンピシリン耐
性ColE1タイププラスミド:50μg /mlのアンピ
シリン、アンピシリン耐性pUCタイププラスミド:1
00μg/mlのアンピシリン、クロラムフェニコール耐
性ランナウエイプラスミド:30μg /mlのクロラムフ
ェニコール、アンピシリン耐性ランナウエイプラスミ
ド:30μg /mlのアンピシリン。発現誘導実験では、
定常期まで培養した培養液を新鮮な培地に1%植菌した
後37℃で好気的に培養し、OD600=0. 6(6×10
8 cell/ml)に達した時点でイソプロピル−β−D−チ
オガラクトシド(IPTG)を最終濃度が0. 2mMにな
るように添加し、さらに培養を続けた。
【0093】(2)ランナウエイプラスミドpHS28
70の構築 発現プラスミド構築の基になったランナウエイプラスミ
ドpHS2870の構築を図3に示す操作で行った。配
列表の配列番号:3および配列番号:4に塩基配列を示
した2つのDNA鎖から作製された106NdeIDN
A断片をNdeI消化したプラスミドベクターpUC1
9と混合してライゲーションを行った。こうして得られ
たプラスミドpUC106AをPvuII消化し、セルフ
ライゲーションを行ってプラスミドpUC106AdP
Oを得た。次いで、このプラスミドpUC106AdP
Oを鋳型とし、RNAIIAプライマー(配列表の配列番
号:5にRNAIIAプライマーの塩基配列を示す)と18
70プライマー(配列表の配列番号:6に1870プライマー
の塩基配列を示す)を用いたPCRによって得られる増
幅DNA断片をXbaI消化した後、XbaI消化した
プラスミドpSTV28と混合してライゲーションを行
なってプラスミドpHS2870を得た。図4にプラス
ミドpHS2870の構成を示す。
【0094】(3)ランナウエイプラスミドpCRS0
4の構築 上記のプラスミドpHS2870をAccI(宝酒造社
製)およびNspIで消化した後、末端を平滑化してセ
ルフライゲーションしてP15A複製起点を除いたプラ
スミドpCRS01を得た。次に該プラスミドをEco
RI(宝酒造社製)およびXbaIで消化した後、上記
同様に末端を平滑化してセルフライゲーションを行いプ
ラスミドpCRS02を構築した。さらにプラスミドp
MJR1560をKpnI(宝酒造社製)およびPst
Iで消化して得られる約1.2kbのDNA断片の末端を
平滑化した後、上記のプラスミドpCRS02をNsp
VおよびVspI(ともに宝酒造社製)で消化した後に
末端を平滑化したものと混合してライゲーションを行な
い、プラスミドpCRS04を得た。プラスミドpCR
S04構築の過程を図5に、またプラスミドpCRS0
4の構成を図6に示す。
【0095】(4)ランナウエイ発現ベクターpACE
601の構築 NheI(宝酒造社製)消化した後に末端を平滑化した
上記のプラスミドpCRS04と、配列表の配列番号:
7および配列番号:8に塩基配列を示した2つのDNA
鎖から作製されたPSP6 −Olac EXリンカーとを混合
してライゲーションを行ない、プラスミドpACE60
1を構築した。図9にプラスミドpACE601の構築
の過程を示す。なお、これらのプラスミドの構築は大腸
菌JM109を宿主として行った。
【0096】(5)ランナウエイ発現ベクターpACE
611の構築 ランナウエイ発現ベクターpACE601をXhoI−
HindIII で消化し、そのサイトに配列番号:15、
配列番号:16に記載の合成オリゴDNAからなるP
sp6 リンカーを挿入して、ランナウエイ発現ベクターp
ACE611の構築を行った。図10にpACE611
の構成を示す。また、図11にプラスミドpACE61
1の構築の過程を示す。
【0097】(6)ランナウエイ発現ベクターpACE
701およびpACE702の構築 プラスミドベクターpUC118(宝酒造社製)をBs
pHI(NEB社製)で消化して得られる約1kbのDN
A断片の末端を平滑化し、NheI消化した後に末端を
平滑化した上記のプラスミドpCRS04と混合してラ
イゲーションを行ない、プラスミドpCRS70を構築
した。図12にプラスミドpCRS70の構築の過程を
示す。次に該プラスミドをNcoI(宝酒造社製)、お
よびBsaAI(NEB社製)で消化した後に末端を平
滑化したうえ、上記のPSP6 −O lac EXリンカーと混
合してライゲーションを行ない、該リンカーの挿入方向
の異なる2種のプラスミドpACE701、およびpA
CE702を構築した。図13にプラスミドpACE7
01、およびpACE702の構築の過程を示す。な
お、これらのプラスミドの構築は大腸菌JM109を宿
主として行った。
【0098】(7)モデルランナウエイ発現プラスミド
の構築 上記のプラスミドpMS434を鋳型とし、プライマー
trpA−N−NcoI、およびプライマーlacZ−
C−NcoIを用いたPCRを行い、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含むDNA断片を得た。プライマーtrp
A−N−NcoI、およびプライマーlacZ−C−N
coIの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号:9およ
び配列番号:10に示す。該断片をNcoIで消化した
後、上記のプラスミドpACE601、pACE70
1、およびpACE702をNcoIで消化したものそ
れぞれと混合してライゲーションを行ない、PSP6 −O
lac配列下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入され
たモデルランナウエイ発現プラスミドpACE601
Z、pACE701Z、およびpACE702Zを得
た。なお、これらのプラスミドの構築は大腸菌JM10
9を宿主として行った。
【0099】(8)ランナウエイ発現プラスミドの非誘
導状態での発現レベルの評価 上記のシステムプラスミドpFSP6を導入された大腸
菌MC4100(以下MC4100/pFSP6と略
す)に上記のモデルランナウエイ発現プラスミドpAC
E601Z、pACE701Z、およびpACE702
Zを導入して得られる形質転換体MC4100/pFS
P6/pACE601Z、MC4100/pFSP6/
pACE701Z、およびMC4100/pFSP6/
pACE702Zを実施例(1)に示した条件で培養
し、対数増殖期に採取した培養液について参考例(4)
に示した方法でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
その結果、いずれの形質転換体においてもβ−ガラクト
シダーゼ活性は検出限界以下であり、参考例(4)に示
したマルチコピープラスミドを用いた場合に比べて顕著
な発現抑制効果が見られた。
【0100】(9)Nsp7524III 制限酵素遺伝子発現
プラスミドの構築 Nsp7524III 制限修飾系遺伝子を含有するプラスミド
pBRN3を Escherichia coli MC1061/pBR
N3(FERM BP−5741)より調製し、これを
鋳型としてプライマーL−ORF、およびプライマーN
spR−ORF3を用いたPCRを行い、Nsp7524II
I 制限酵素遺伝子のみを含む約1kbのDNA断片を得
た。配列表の配列番号:11および配列番号:12にプ
ライマーL−ORF、およびプライマーNspR−OR
F3の塩基配列を示す。該断片をNcoIで消化した
後、上記のプラスミドpACE601をNcoIで消化
したものと混合してライゲーションを行ない、PSP6
lac 配列下流にNsp7524III 制限酵素遺伝子のみを
導入されたプラスミドpACE601- NspIII を構
築した。該プラスミドは、Nsp7524III 修飾酵素遺伝
子を共存させていない大腸菌JM109に安定に保持さ
れた。
【0101】(10)Nsp7524III 制限酵素遺伝子の
発現システムの構築 上記のシステムプラスミドpFSP6を導入された大腸
菌HB101(以下HB101/pFSP6と略す)に
Nsp7524III 制限酵素遺伝子を含む上記のプラスミド
pACE601- NspIII 、及び対照として用いるプ
ラスミドpACE601をそれぞれ導入して得られる形
質転換体HB101/pFSP6/pACE601- N
spIII 、およびHB101/pFSP6/pACE6
01をLB培地で定常期まで培養し、この培養液を新鮮
な培地2本に1%ずつ植菌して37℃で好気的に培養
し、生育がOD600 =0.6に達した時点でその一方に
IPTGを最終濃度が0. 2mMになるように添加し、さ
らに培養終了後、集菌した菌体を破砕用緩衝液A(20
mM トリス−塩酸、pH7. 5、10 mM 2−メルカプ
トエタノール)に懸濁して超音波破砕した後、遠心分離
して粗抽出液を得た。
【0102】この粗抽出液1μl を30μl の反応液
(10 mM トリス−塩酸、pH7. 5、10mMのMgC
2 、1mMのDTT、50mMのNaCl、1μg λ−D
NA)に加え、37℃、1時間反応させた後、反応液を
アガロースゲル電気泳動に付してλ−DNAの分解を調
べ、制限酵素活性を確認した。図14に示されるように
IPTGを添加して発現誘導を行ったHB101/pF
SP6/pACE601−NspIII のみに制限酵素活
性が認められ、そのλ- DNA切断のパターンはNsp
7524III のアイソシゾマーであるAvaIのものと一致
した。
【0103】また、上記のλ−DNA消化反応の反応時
間を2時間、3時間まで延長した場合の結果を図15に
示す。この場合、本実験に使用した粗抽出液には宿主大
腸菌由来のヌクレアーゼが含まれているため、レーン8
〜10ではNsp7524III 活性によって生じたDNA断
片が大腸菌のヌクレアーゼによってさらに分解を受け、
反応時間を延長するにつれてバンドが薄くなり、レーン
10ではバンドが確認できなくなっている。レーン11
〜13ではNsp7524III が誘導されないため、反応時
間を延長してもNsp7524III 分解断片が生成せず、λ
−DNAが直接大腸菌のヌクレアーゼの作用を受けて低
分子化されていることが分かる。なお、HB101/p
FSP6/pACE601の粗抽出液では制限酵素活性
は検出されなかった。
【0104】実施例2 AccIII 制限酵素遺伝子の単離及び発現 (1)AccIII 制限酵素タンパク質のN末端アミノ酸
配列の決定及び該アミノ酸配列対応プライマーDNAの
合成 市販のAccIII 制限酵素(宝酒造社製)約2kuをSe
phacryl S300(ファルマシア社製)カラムを用いたゲル
ろ過に供し、AccIII 制限酵素の分子量を測定した。
活性の溶出位置より、AccIII 制限酵素の分子量は約
7万であることを確認した。制限酵素タンパク質はダイ
マーであることが多く、従ってSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動でAccIII 制限酵素タンパク質は分子
量約3万5千の位置に泳動されることが推定された。
【0105】次に、AccIII 制限酵素タンパク質のN
末端アミノ酸配列解析用のサンプルを得るため、市販の
AccIII 制限酵素約2kuをタンパク質分子量マーカ
ーとともにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した後、ゲルからPVDF膜にタンパク質を移し、タン
パク質位置の確認のために、ブロモフェノールブルーに
よるタンパク質染色をおこなった。10%酢酸−50%
メタノールで脱色後、分子量約3万5千のタンパク質が
ブロッティングされたPVDF膜の部分を切り取り、プ
ロテイン シークエンサー G1000A(ヒューレッ
ト パッカード社製)を用いた自動エドマン分解によ
り、配列表の配列番号:19で示すN末端アミノ酸配列
を決定した。次にこの配列に基づき、カセットプライマ
ーの対として用いる、配列表の配列番号:20で表され
るAccIII プライマー1と配列番号:21で表される
AccIII プライマー2を合成した。
【0106】(2)Acc菌ゲノムDNAの調製 ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Re
search)第13巻、第8685〜8694頁(198
5)に記載されている喜多らの方法に従いAcc菌を培
養し、湿菌体を得た。得られた湿菌体2gを10mlの
緩衝液B[25mM トリス−HCl(pH8.0)、
50mM グルコース、10mM EDTA]に懸濁
し、緩衝液Bで2mg/mlに調製した1mlのリゾチ
ーム溶液を加えて撹拌し、37℃で20分静置した。つ
ぎに、当該溶液に28mlの緩衝液C[100mM N
aCl、100mM トリス−HCl(pH8.0)]
を加え、撹拌し、さらにTE[10mM トリス−HC
l 1mM EDTA(pH8.0)]で20mg/m
lになるように調製した1mlのプロテイナーゼK溶液
と4mlの10%SDS溶液を加え、撹拌し、37℃で
1時間静置した。
【0107】当該溶液に6mlの5M NaCl水溶液
と6mlの緩衝液D[10% CTAB(セチル トリ
メチル アンモニウム ブロマイド)、0.7M Na
Cl]を加えて撹拌し、60℃で20分静置した。当該
溶液をフェノール処理、続いてクロロホルム処理を行い
水層を分取した。これに、TEで10mg/mlになる
ように調製したRNaseA(シグマ社製)溶液50μ
lを加えて攪拌し、37℃で40分静置した。当該溶液
を静置後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い水
層を分取後、これに等量の冷エタノールを加え、析出し
たDNAをガラスキャピラリーで巻き取って回収した。
DNAを70%エタノールで洗浄し3mlのTEに溶解
させ、約200μgのゲノムDNAを得た。
【0108】(3)Accゲノムカセットライブラリー
の作製 以後の操作は、基本的に、宝酒造社の遺伝子工学ガイド
(1995〜1996年版)F16〜F17頁記載の方
法に従い、実施した。
【0109】(2)で得られたゲノムDNAを、Eco
RI(宝酒造社製)で完全消化し、得られたDNA断片
と相補的な突出末端を有するEcoRIカセット(宝酒
造社製)を連結しEcoRIカセットライブラリーを作
製した。同様にゲノムDNAを制限酵素BglII、Ec
oT14I、EcoT22I、HindIII 、Pst
I、SalI、XbaI(以上宝酒造社製)で個別に完
全消化し得られたゲノムDNA断片と、相補的な突出末
端を有する数種のカセット(宝酒造社製)とを個別に結
合することによりBglII、EcoT14I、EcoT
22I、HindIII 、PstI、SalI、XbaI
各カセットライブラリーを作製した。各カセットライブ
ラリーを総称しAccゲノムカセットライブラリーとし
た。
【0110】(4)AccIII 制限酵素遺伝子の解析 (3)で得られたEcoRIカセットライブラリーを鋳
型とし、AccIII プライマー1とカセットプライマー
C1(宝酒造社製)をプライマー対として、PCRによ
るDNA増幅反応を行った。目的領域を効率よく特異的
に増幅させるために、該反応液の一部を用い、AccII
I プライマー2とカセットプライマーC2(宝酒造社
製)をプライマー対として、2度目のPCRによるDN
A増幅反応を行い、増幅DNA断片を得た。同様に、B
glII、EcoT14I、EcoT22I、HindII
I 、PstI、SalI、XbaI各カセットライブラ
リーを鋳型として、個別に上記2段階PCRによるDN
A増幅反応を行い、増幅DNA断片を得た。各増幅DN
Aをアガロースゲル電気泳動により解析したところ、X
baIカセットライブラリー由来の増幅DNA断片が、
特に高い増幅効率を示した。
【0111】そこで、XbaIカセットライブラリーを
鋳型とし、AccIII プライマー1とカセットプライマ
ーC1をプライマー対として、再度、PCRによるDN
A増幅反応を行った。この反応液をアガロースゲル電気
泳動に供し、約0.5kbの増幅DNA断片をゲルから
回収した。得られたDNA断片を鋳型とし、AccIII
プライマー2とカセットプライマーC2をプライマー対
として、2度目のPCRによるDNA増幅反応を行っ
た。得られた約0.5kbの増幅DNA断片の塩基配列
を決定したところ、(1)でN末端のアミノ酸配列を決
定したタンパク質の一部をコードしていることが明らか
となった。一方、AccIII 制限酵素タンパク質の推定
分子量は約3万5千であり、該タンパク質をコードして
いる遺伝子は、約1kbの長さと推定される。従って、
今回塩基配列を一部決定した遺伝子領域において、上記
約0.5kbの塩基配列情報に加え、AccIII プライ
マー1及びAccIII プライマー2がアニーリングした
5’端領域の正確な塩基配列情報及び3’側領域の残り
約0.5kbの塩基配列情報が得られれば、AccIII
制限酵素遺伝子の塩基配列を決定できると考えられた。
【0112】そこで、AccIII 制限酵素遺伝子領域の
正確な5’端領域の塩基配列を確認するために、配列表
の配列番号:22で表されるAccIII プライマー3、
配列番号:23で表されるAccIII プライマー4を合
成した。次に、(3)で得られたEcoRIカセットラ
イブラリーを鋳型とし、AccIII プライマー4とカセ
ットプライマーC1をプライマー対として、PCRによ
るDNA増幅反応を行った。この反応液の一部を用い、
AccIII プライマー3とカセットプライマーC2をプ
ライマー対として、PCRによるDNA増幅反応を行っ
た。同様に、BglII、EcoT14I、EcoT22
I、HindIII 、PstI、SalI、XbaI各カ
セットライブラリーを鋳型として、個別に上記2段階P
CRによるDNA増幅反応を行った。増幅したDNA断
片のうち最短の、EcoT14Iカセットライブラリー
を鋳型として得られた、約1kbのDNA断片の塩基配
列を決定した。
【0113】さらにAccIII 制限酵素タンパク質をコ
ードすると推定される遺伝子領域の3’側、約0.5k
bを決定するために、配列番号:24で表されるAcc
IIIプライマー5と、配列番号:25で表されるAccI
II プライマー6を合成した。(3)で得られたEco
RIカセットライブラリーを鋳型とし、AccIII プラ
イマー5とカセットプライマーC1をプライマー対とし
て、PCRによるDNA増幅反応を行った。この反応液
の一部を用い、AccIII プライマー6とカセットプラ
イマーC2をプライマー対として、PCRによるDNA
増幅反応を行った。同様に、BglII、EcoT14
I、EcoT22I、HindIII 、PstI、Sal
I、XbaI各カセットライブラリーを鋳型として、個
別に上記2段階PCRによるDNA増幅反応を行った。
【0114】増幅したDNA断片のうち、EcoT22
I、HindIII 各カセットライブラリーを鋳型として
得られた、約0.5kb、約0.8kbのDNA断片の
塩基配列を決定した。得られた3つの塩基配列の結果を
総合し、約1.6kbのDNA断片の塩基配列情報を得
た。その塩基配列を配列表の配列番号:26に示す。さ
らに、タンパク質をコードしうるオープンリーディング
フレーム(ORF)を検索した結果、塩基番号558〜
1442にORF1が、塩基番号1588〜1434に
ORF2と考えられる一部、及び塩基番号1〜535に
ORF3と考えられる一部が存在した。ORF1は、
(1)でN末端アミノ酸配列を決めたタンパク質をコー
ドしており、ORF1がAccIII 制限酵素遺伝子であ
ると推定された。AccIII 制限酵素遺伝子の塩基配列
を配列表の配列番号:2に示す。但し、この場合5’端
より4番目の塩基はCである。また、該塩基配列より推
定されるアミノ酸配列を、配列表の配列番号:1に示
す。但し、この場合N末端より2番目のアミノ酸はLe
uである。なお、ORF2の翻訳方向は、ORF1及び
ORF3とは逆方向である。
【0115】(5)プラスミド pCRA19 の構築 次に、AccIII 制限酵素遺伝子を発現させるためのプ
ラスミドの構築を行った。まず、該遺伝子を得るため、
配列表の配列番号:27で表されるAcc−RLプライ
マーと配列番号:28で表されるAcc−RRをプライ
マーを合成した。なお、両プライマーに制限酵素Nco
I認識配列部位を導入した。上記プライマー対を用いる
と、Acc菌のゲノムDNAを鋳型としたPCRにより
得られるDNA増幅断片より、AccIII 制限酵素遺伝
子を制限酵素NcoIで切り出すことが可能となり、ま
たpACE611ベクターのNcoI部位に挿入した
際、SP6プロモーター支配下、翻訳時のコドンフレー
ムが合うようになる。一方、このプライマー対の使用に
より、AccIII 制限酵素遺伝子の5’末端より4番目
の塩基がCからGに、該遺伝子にコードされるタンパク
質のN末端より2番目のアミノ酸が、LeuからVal
に置換される。上記プライマー対を用い、(2)で得ら
れたAcc菌のゲノムDNAを鋳型として、PCRによ
るDNA増幅反応を行った。このDNA断片を制限酵素
NcoI(宝酒造社製)で完全消化した後、アガロース
ゲル電気泳動し、約900bpの大きさのDNA断片を
回収した。次に、このDNA断片がSP6プロモーター
の下流に配置されるように、pACE611ベクターの
NcoI部位に挿入した。
【0116】この組換えDNAを大腸菌JM109に導
入し形質転換体を得た。適当に30個の形質転換体を選
択し、30μg /mlのクロラムフェニコール含む5m
lのLB培地に個別に接種し、37℃で培養した。菌体
培養液のOD600 が0.6になった時に、プラスミドコ
ピー数増加のために、最終濃度が2mMになるようにI
PTGを添加し、さらに37℃で2時間培養後、各培養
物より、個別にプラスミドDNAを調製した。得られた
各プラスミドDNAを制限酵素HindIII とXbaI
で同時に切断し、アガロースゲル電気泳動により生じた
DNA断片長を確認したところ、挿入した遺伝子領域が
正方向に挿入されたと考えられるプラスミドが、1個存
在した。本プラスミドDNAをpCRA19と命名し、
pCRA19を大腸菌JM109に導入し、得られた形
質転換体をEscherichia coli JM109 / pCRA19 と命名し
た。
【0117】(6)AccIII 制限酵素遺伝子の発現シ
ステムの構築 まず、大腸菌JM109にSP6RNAポリメラーゼ遺
伝子を導入し、さらに発現させることが可能なファージ
ベクターを構築した。すなわち、市販のファージベクタ
ーM13mp18(宝酒造社製)のマルチクローニング
サイト内のBamHI−HindIII サイトに、pSP
6−2をBamHI−HindIII 消化することにより
得たSP6RNAポリメラーゼ遺伝子断片を挿入するこ
とにより、SP6RNAポリメラーゼ発現ファージM1
3sp6を構築した。
【0118】次に、形質転換体(Esherichia coli JM10
9/pCRA19) をクロラムフェニコール30μg /mlを含
む5mlのLB培地に接種し、37℃で培養した。菌体
培養液のOD600 が0.6になった時に、プラスミドコ
ピー数増加のために、IPTGを最終濃度が2mMにな
るように添加し、更に37℃で2時間培養した。その
後、AccIII 制限酵素遺伝子にコードされたタンパク
質を発現させるため、ファージM13sp6を感染さ
せ、更に、37℃で16時間培養した。得られた湿菌体
11mgを、180μlの菌体破砕用緩衝液E[20m
M トリス−HCl(pH7.5)10mM 2−メル
カプトエタノール]に懸濁し、超音波処理により菌を破
砕し、遠心分離(18000g、10分間)により固液分離を
行った。
【0119】上清の活性を、宝酒造社製のAccIII 制
限酵素に添付されたデータシートに記載の活性測定条件
で測定したところ、湿菌体1g当り約8000ユニット
のAccIII 制限酵素が産生されていた。これはAcc
菌の産生量と比較して、湿菌体重量あたり約16倍の産
生量であった。また、得られた上清にはAccIII 以外
の制限酵素活性、及びAccIII 修飾酵素活性は認めら
れなかった。プラスミド pCRA19 に挿入されたAccII
I 制限酵素遺伝子は、PCRによるDNA増幅を行った
際、翻訳開始塩基より4番目の塩基がCからGに置換さ
れ、この結果、翻訳タンパク質のN末端から2番目のア
ミノ酸が、LeuからValに置換されているが、該タ
ンパク質はAccIII 制限酵素活性を有することが明ら
かとなった。
【0120】以上、AccIII 修飾酵素非共存下でのA
ccIII 制限酵素遺伝子の単離及び大量生産系が完成し
た。
【0121】(7)AccIII 修飾酵素遺伝子の単離 修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝子は近傍に存在すること
が多い。そこで(4)で推定されたORF2領域の決定
のために、(4)においてAccIII 制限酵素遺伝子
3’側領域を決定するために調製した増幅DNA断片の
うち、EcoRIカセットライブラリーを鋳型として得
られた、約1.4kbのDNA断片の塩基配列を決定し
た。さらに、(4)で推定されたORF3領域の決定の
ために、(4)においてAccIII 制限酵素遺伝子5’
端領域の塩基配列を決定するために調製した増幅DNA
断片のうち、BglIIカセットライブラリーを鋳型とし
て得られた約2.2kbのDNA断片の塩基配列を決定
した。これらと、(4)で決定したAccIII 制限酵素
遺伝子領域を含む約1.6kbのDNA断片の塩基配列
を総合して、配列表の配列番号:29に示す約4.2k
bの塩基配列情報が得られた。塩基番号1913〜27
97にAccIII 制限酵素遺伝子が、塩基番号3712
〜2789にORF2が、塩基番号691〜1890に
ORF3が存在した。各ORFのうち、既知の制限修飾
系における修飾酵素間の保存領域とホモロジーの高い部
分が、ORF2に存在することが判明した。
【0122】次に、ORF2領域を得るため、EcoR
Iカセットライブラリーを鋳型とし、Accプライマー
6、カセットプライマーC1及びAccプライマー5、
カセットプライマーC2を各々対とした二段階PCRに
より得られた増幅DNA断片より、EcoT22I、H
paI(宝酒造社製)を用いORF2を含む約1.1k
bの部分を切り出し、pUC118ベクターlacプロ
モーター下流の SmaI部位に挿入した。本組み換えプラ
スミドがAccIII 修飾酵素遺伝子を含んでおり、大腸
菌内でAccIII 修飾酵素が発現可能であれば、本組み
換えプラスミドを大腸菌JM109に導入し、得られた
形質転換体の培養物中のDNAはAccIII 修飾酵素に
よりメチル化を受け、AccIII 制限酵素による切断に
耐性を示すようになる。
【0123】しかし本組換えプラスミドの構築に用いら
れたpUC118ベクターにはAccIII 制限酵素認識
配列が存在しないため、本組換えプラスミド自体をAc
cIII 修飾酵素活性の確認に使用するのは不適当であ
る。一方、大腸菌JM109内で本組み換えプラスミド
と共存可能なプラスミドpSTV29にはAccIII 制
限酵素認識配列が存在する。そこでpSTV29をAc
cIII 修飾酵素発現の指標とするため、先の組み換えプ
ラスミドをpSTV29と共に大腸菌JM109に導入
し形質転換体を得た。3個の形質転換体を100μg/
mlのアンピシリン、30μg/mlのクロラムフェニ
コール及び2mM IPTGを含む2mlのLB培地で
個別に37℃、16時間培養し、各培養物よりプラスミ
ドDNAを調製した。
【0124】調製したDNAはpSTV29と上記の組
換えプラスミドの混合物として得られる。各DNAサン
プルをAccIII 制限酵素による切断反応に供したとこ
ろ、全てのサンプル中のpSTV29がAccIII 制限
酵素切断に対する耐性を示し、該DNAサンプルに含ま
れる組換えプラスミドに、AccIII 修飾酵素遺伝子が
挿入されていることが確認された。更に、該DNAサン
プルを、制限酵素HindIII とXbaIで同時に切断
し、アガロースゲル電気泳動にて生じたDNA断片長を
解析したところ、組換えプラスミド中にORF2が存在
することが確認された。従って、ORF2がAccIII
修飾酵素遺伝子であることが判明した。得られたAcc
III 修飾酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号:1
4に、また該配列より推定されるアミノ酸配列を配列番
号:13にそれぞれ示す。
【0125】本発明により明らかとなったAccIII 制
限修飾系遺伝子構造を図16に示す。図中、Mは修飾酵
素遺伝子、Rは制限酵素遺伝子、矢印はORFの方向を
示す。
【0126】
【発明の効果】本発明により、宿主に対し致死的とな
る、あるいは有害なタンパク質をコードする外来性の目
的遺伝子を該宿主に導入しうるプラスミドベクター、お
よび該プラスミドベクターを用いて効率よく該タンパク
質を発現させうる方法が初めて提供される。また、従来
技術では困難であった制限修飾系を構成する制限酵素遺
伝子を、修飾酵素遺伝子の非共存下で可能な単離方法が
提供される。さらに、本発明により AccIII 制限酵素遺
伝子及び AccIII 修飾酵素遺伝子が単離され、該遺伝子
を含有するプラスミドで形質転換した大腸菌により、遺
伝子工学において有用な AccIII 制限酵素あるいは修飾
酵素を、従来の精製方法と比べ、容易に必要な純度の酵
素標品を得ることが可能となる。
【0127】
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:295 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列の特徴:2(Val あるいは Leu) 配列: Met Xaa Pro Leu Asp Lys Asp Leu Gln Lys Ala Lys Ile Ser Ile 1 5 10 15 Thr Asp Phe Phe Glu Ile Thr Asn Arg Val Leu Asp Tyr Phe Pro 20 25 30 Asn Val Ile Asn Asn Thr Val Glu Lys Gly Asp Tyr Leu Ile Ser 35 40 45 Ser Ser Asn Ile Ala Gly Thr Ile Lys Phe Leu Arg Pro Ile Asn 50 55 60 Arg Lys Leu Phe Ile Gln Glu Lys Lys Val Phe Asn Asp Tyr Phe 65 70 75 Gln Lys Leu Ile Ile Val Phe Glu Asn Ile Arg Asn Lys Lys Thr 80 85 90 Val Thr Glu Glu Asp Lys Ile Ile Ile Asp Arg Val Ile Tyr Thr 95 100 105 Ile Gln Gln Ser Ile Gly Ile Gly Leu Asp Leu Met Val Asn Gln 110 115 120 Asn Ser Ala Arg Lys His Val Gly Asn Arg Phe Glu Glu Leu Ile 125 130 135 Arg Val Ile Phe Thr Glu Ile Ser Val Ser Asn Lys Arg Thr Val 140 145 150 Leu Gln Ile Pro Tyr Glu Thr Asp Glu Gly Gln Lys Ile Tyr Lys 155 160 165 Cys Glu Asn Asp Leu Ile Ile Ser Pro Phe Glu Asn Val Glu Ser 170 175 180 Thr Asn Lys His Leu Asp Glu Asn Glu Ile Val Val Ser Ile Lys 185 190 195 Thr Thr Ser Lys Asp Arg Met Gly Lys Met Phe Ile Asp Lys Ile 200 205 210 Leu Leu Glu Arg Phe Val Lys His Pro Gln Lys Val Ile Gly Ile 215 220 225 Phe Leu Asn Asp Val Gln Arg Lys Glu Asp Asn Asn Ile Ser Phe 230 235 240 Thr Leu Val Ser Gly Leu Phe Met Val Tyr Thr Lys Phe Leu Thr 245 250 255 Thr Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Leu Asp Pro Pro Pro Asn Ala Leu 260 265 270 Lys Leu Pro Tyr Ser Asn His Met Lys Arg Phe Ser Asp Leu Ile 275 280 285 Thr Glu Asp Leu Glu Lys Leu Phe Ser Ser 290 295
【0128】 配列番号:2 配列の長さ:885 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列: ATGSTACCAC TGGATAAAGA TTTACAAAAA GCAAAGATTT CAATTACTGA TTTTTTTGAA 60 ATTACAAATA GAGTTTTAGA TTATTTCCCC AATGTAATCA ATAATACAGT TGAAAAAGGA 120 GATTATTTAA TATCCTCATC AAATATTGCT GGAACAATAA AATTCCTAAG ACCAATCAAT 180 AGAAAGTTAT TTATTCAGGA AAAAAAAGTT TTCAATGATT ATTTTCAAAA ACTGATTATA 240 GTTTTTGAAA ATATAAGGAA CAAAAAAACT GTAACAGAGG AAGATAAAAT TATTATTGAT 300 AGGGTAATTT ACACAATACA GCAATCTATT GGAATTGGTT TAGATTTAAT GGTTAATCAA 360 AATAGTGCTA GAAAGCACGT TGGTAACCGA TTTGAAGAAT TAATTAGAGT CATTTTTACA 420 GAAATATCAG TATCGAATAA AAGAACTGTA TTACAAATTC CATATGAAAC TGATGAAGGA 480 CAGAAAATTT ACAAATGCGA GAATGACCTC ATTATTTCTC CTTTTGAAAA TGTAGAATCT 540 ACAAACAAAC ATCTAGATGA AAATGAGATT GTTGTTTCAA TAAAGACAAC ATCAAAAGAT 600 AGGATGGGAA AAATGTTTAT AGATAAAATT TTACTTGAAA GGTTTGTTAA ACACCCTCAA 660 AAAGTTATAG GGATTTTCCT CAATGATGTA CAAAGAAAAG AAGACAACAA TATCAGCTTT 720 ACACTTGTTT CAGGATTATT TATGGTGTAT ACTAAATTCT TAACTACTCT TGAAGGGATC 780 TATTATTTAG ATCCACCACC TAATGCATTG AAACTACCAT ATTCTAATCA TATGAAAAGA 840 TTTTCAGATT TAATTACAGA AGACCTTGAA AAATTATTCT CCTCT 885
【0129】 配列番号:3 配列の長さ:215 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TATGGATATG TTCATAAACA CGCATGTAGG CAGATAGATC TTTGGTTGTG AATCGCAACC 60 AGTGGCCTTA TGGCAGGAGC CGCGGATCAC CTACCATCCC TAATGACCTG CAGGCATGCA 120 AGCTTGCATG CCTGCAGGTC ATTAGGTACG GCAGGTGTGC TCGAGGCGAA GGAGTGCCTG 180 CATGCGTTTC TCCTTGGCTT TTTTCCTCTG GGACA 215
【0130】 配列番号:4 配列の長さ:215 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TATGTCCCAG AGGAAAAAAG CCAAGGAGAA ACGCATGCAG GCACTCCTTC GCCTCGAGCA 60 CACCTGCCGT ACCTAATGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTGC ATGCCTGCAG GTCATTAGGG 120 ATGGTAGGTG ATCCGCGGCT CCTGCCATAA GGCCACTGGT TGCGATTCAC AACCAAAGAT 180 CTATCTGCCT ACATGCGTGT TTATGAACAT ATCCA 215
【0131】 配列番号:5 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: AGATCTAGAG CAAACAAAAA AACCACCG 28
【0132】 配列番号:6 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: GGTCTAGATC CCAGAGGAAA AAAG 24
【0133】 配列番号:7 配列の長さ:100 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: CTCGAGATTT AGGTGACACT ATAGAATACG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCCAAGCTT 60 CACAGGAAAC AGACCATGGC TTAAGTAACT AGTGAATTCG 100
【0134】 配列番号:8 配列の長さ:100 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: CGAATTCACT AGTTACTTAA GCCATGGTCT GTTTCCTGTG AAGCTTGGAA TTGTTATCCG 60 CTCACAATTC CGTATTCTAT AGTGTCACCT AAATCTCGAG 100
【0135】 配列番号:9 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: AATCCCATGG AACGCTACGA ATCTCTG 27
【0136】 配列番号:10 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: CCGGCCATGG TTATTTTTGA CACCAGACC 29
【0137】 配列番号:11 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TAACTTGAAT CCATGGGTTC TCACCG 26
【0138】 配列番号:12 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TACTCAGTAG CCATGGCTCT CATAGACCG 29
【0139】 配列番号:13 配列の長さ:308 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Asn Glu Ile Ala Phe Asp Asn Tyr Ser Tyr Ile Pro Lys Leu 1 5 10 15 Lys Leu Tyr Ser Glu Ile Glu Leu Lys Pro Phe Phe Ile Ser Lys 20 25 30 Asn Gly Ser Leu Phe Asn Val Asp Ala Ile Asp Phe Leu Arg Lys 35 40 45 Leu Glu Ser Asn Ser Val Asp Leu Ile Phe Ala Asp Pro Pro Tyr 50 55 60 Asn Ile Lys Lys Ala Glu Trp Asp Ile Phe Ser Ser Gln Asn Glu 65 70 75 Tyr Leu Glu Trp Ser Lys Glu Trp Ile Met Glu Ala His Arg Val 80 85 90 Leu Lys Asp Asn Gly Ser Leu Tyr Val Cys Gly Phe Ser Glu Ile 95 100 105 Leu Ala Asp Ile Lys Phe Ile Thr Ser Lys Tyr Phe His Ser Cys 110 115 120 Lys Trp Leu Ile Trp Phe Tyr Arg Asn Lys Ala Asn Leu Gly Lys 125 130 135 Asp Trp Gly Arg Ser His Glu Ser Ile Leu Leu Leu Arg Lys Ser 140 145 150 Lys Asn Phe Ile Phe Asn Ile Asp Glu Ala Arg Ile Pro Tyr Asn 155 160 165 Glu His Thr Val Lys Tyr Pro Gln Arg Thr Gln Ala Glu Ser Ser 170 175 180 Gln Tyr Ser Asn Ser Lys Lys Gln Tyr Ile Trp Glu Pro Asn Pro 185 190 195 Leu Gly Ala Lys Pro Lys Asp Val Leu Glu Ile Pro Thr Ile Ser 200 205 210 Asn Gly Ser Trp Glu Arg Ser Ile His Pro Thr Gln Lys Pro Val 215 220 225 Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ile Leu Ser Ser Ser Asn Lys Asp Ser 230 235 240 Leu Ile Leu Asp Pro Phe Gly Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ala Val 245 250 255 Ala Glu Ala Phe Gly Arg Lys Trp Ile Gly Thr Glu Leu Asp Lys 260 265 270 Asn Tyr Cys Leu Glu Ile Gln Lys Arg Leu Lys Asp Glu Ser Met 275 280 285 Ile Asn Arg Ile Phe Ser Gly Asp Asp Asp Ser Asn Ser Gln Asn 290 295 300 Arg Arg Lys Lys Leu Arg Gly Glu 305
【0140】 配列番号:14 配列の長さ:924 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列: GTGAATGAAA TAGCGTTTGA TAATTACAGT TATATACCAA AATTAAAACT TTATTCGGAA 60 ATCGAGCTTA AACCATTTTT TATTTCAAAA AACGGTTCAC TTTTCAATGT TGATGCTATT 120 GATTTTTTAA GAAAATTAGA GAGTAATTCT GTGGATTTAA TTTTTGCAGA TCCACCTTAT 180 AACATTAAAA AGGCAGAGTG GGATATTTTT TCTTCTCAAA ATGAATATCT CGAATGGAGT 240 AAAGAATGGA TAATGGAAGC TCATAGAGTT TTAAAAGATA ATGGCAGTTT ATATGTTTGT 300 GGCTTTTCAG AAATTCTGGC AGACATAAAA TTTATCACTT CAAAATATTT TCACAGTTGT 360 AAATGGTTGA TTTGGTTCTA TAGAAACAAG GCAAATTTAG GTAAAGATTG GGGACGTTCA 420 CACGAAAGTA TACTGTTATT AAGAAAATCT AAAAATTTTA TTTTTAATAT TGATGAGGCA 480 CGAATCCCGT ATAATGAGCA TACAGTTAAA TATCCACAAA GAACCCAGGC CGAATCTTCG 540 CAATATTCGA ACTCAAAAAA GCAATATATT TGGGAGCCAA ACCCATTAGG AGCTAAGCCA 600 AAAGATGTTT TGGAGATTCC CACAATTTCA AATGGTTCTT GGGAAAGAAG TATTCACCCT 660 ACGCAAAAGC CAGTAGAATT GCTTAAAAAA ATAATTTTAT CTTCATCTAA TAAAGATAGT 720 TTAATTCTTG ATCCATTTGG TGGTTCGGGA ACTACATATG CTGTTGCGGA AGCTTTTGGC 780 AGAAAATGGA TTGGAACAGA GTTAGATAAA AATTATTGTC TGGAAATTCA AAAGCGATTG 840 AAAGACGAAA GTATGATCAA CAGGATTTTT TCAGGCGATG ATGATTCAAA TTCTCAAAAT 900 AGAAGAAAAA AATTAAGAGG AGAA 924
【0141】 配列番号:15 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TCGAGATTTA GGTGACACTA TAGAATACA 29
【0142】 配列番号:16 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: AGCTTGTATT CTATAGTGTC ACCTAAATC 29
【0143】 配列番号:17 配列の長さ:54 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TCGAGATTTA GGTGACACTA TAGAATACGG AATTGTGAGC GGATAACAAT TCCA 54
【0144】 配列番号:18 配列の長さ:54 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: AGCTTGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC GTATTCTATA GTGTCACCTA AATC 54
【0145】 配列番号:19 配列の長さ:20 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Leu Pro Leu Asp Lys Asp Leu Gln Lys Ala Lys Ile Ser Ile 1 5 10 15 Thr Asp Phe Phe Glu 20
【0146】 配列番号:20 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列の特徴:6、9、12(イノシン) 配列: ATGTTNCCNY TNGAYAARGA YYT 23
【0147】 配列番号:21 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列の特徴:9(イノシン) 配列: AAGGATTTNC ARAARGCNAA RAT 23
【0148】 配列番号:22 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: TAAATCTAAA CCAATTCCAA TAGATTGCTG 30
【0149】 配列番号:23 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: CAAATCGGTT ACCAACGTGC TTTCTAGCAC 30
【0150】 配列番号:24 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: GAACTGTATT ACAAATTCCA TATGAAACTG 30
【0151】 配列番号:25 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: GACAGAAAAT TTACAAATGC GAGAATGACC 30
【0152】 配列番号:26 配列の長さ:1588 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列: CCATGGCACA CGTTTCAAAA AAGAAATCCT CGAAGTCAAA TATGATGAGA AAAACATCTC 60 AGACATCCTG CATATGACGG TGGATGAAGC ATTGGAATTT TTCTCGGAAA ATCACGAAGA 120 AAAAATTGTA ACCAAACTAA AACCTTTGCA GGACGTTGGT TTGGGTTATC TTCAGTTAGG 180 CCAGTCCTCC TCTACTCTTT CCGGCGGTGA AGCCCAAAGA GTGAAGCTCG CCTCTTTCCT 240 TGTGAAAGGT GTAACGACGG AAAAAACGTT ATTTGTTTTT GATGAACCAT CAACAGGATT 300 ACATTTCCAC GACATTCAAA AATTACTGAA ATCACTTCAG GCACTGATAG AATTAGGGCA 360 TTCGGTTGTA GTGATTGAGC ATCAGCCGGA TATTATCAAA TGCGCCGATT ACATCATCGA 420 TGTCGGACCC AATGCCGGAA AATACGGTGG CGAAATTGTT TTCACAGGAA CTCCGGAAGA 480 TTTGGTAAAA GAGAAAAAGT CGTTTACAGG GAAGTATATT AAGGAGAAGT TAAAGTAATT 540 TATTTATATT TGAAGTTATG CTACCACTGG ATAAAGATTT ACAAAAAGCA AAGATTTCAA 600 TTACTGATTT TTTTGAAATT ACAAATAGAG TTTTAGATTA TTTCCCCAAT GTAATCAATA 660 ATACAGTTGA AAAAGGAGAT TATTTAATAT CCTCATCAAA TATTGCTGGA ACAATAAAAT 720 TCCTAAGACC AATCAATAGA AAGTTATTTA TTCAGGAAAA AAAAGTTTTC AATGATTATT 780 TTCAAAAACT GATTATAGTT TTTGAAAATA TAAGGAACAA AAAAACTGTA ACAGAGGAAG 840 ATAAAATTAT TATTGATAGG GTAATTTACA CAATACAGCA ATCTATTGGA ATTGGTTTAG 900 ATTTAATGGT TAATCAAAAT AGTGCTAGAA AGCACGTTGG TAACCGATTT GAAGAATTAA 960 TTAGAGTCAT TTTTACAGAA ATATCAGTAT CGAATAAAAG AACTGTATTA CAAATTCCAT 1020 ATGAAACTGA TGAAGGACAG AAAATTTACA AATGCGAGAA TGACCTCATT ATTTCTCCTT 1080 TTGAAAATGT AGAATCTACA AACAAACATC TAGATGAAAA TGAGATTGTT GTTTCAATAA 1140 AGACAACATC AAAAGATAGG ATGGGAAAAA TGTTTATAGA TAAAATTTTA CTTGAAAGGT 1200 TTGTTAAACA CCCTCAAAAA GTTATAGGGA TTTTCCTCAA TGATGTACAA AGAAAAGAAG 1260 ACAACAATAT CAGCTTTACA CTTGTTTCAG GATTATTTAT GGTGTATACT AAATTCTTAA 1320 CTACTCTTGA AGGGATCTAT TATTTAGATC CACCACCTAA TGCATTGAAA CTACCATATT 1380 CTAATCATAT GAAAAGATTT TCAGATTTAA TTACAGAAGA CCTTGAAAAA TTATTCTCCT 1440 CTTAATTTTT TTCTTCTATT TTGAGAATTT GAATCATCAT CGCCTGAAAA AATCCTGTTG 1500 ATCATACTTT CGTCTTTCAA TCGCTTTTGA ATTTCCAGAC AATAATTTTT ATCTAACTCT 1560 GTTCCAATCC ATTTTCTGCC AAAAGCTT 1588
【0153】 配列番号:27 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: ATATTTGAAG CCATGGTACC ACTGG 25
【0154】 配列番号:28 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列: GATGATTCAA ATTCTCACCA TGGAAG 26
【0155】 配列番号:29 配列の長さ:4146 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列: AGATCTGGTC ATCCCAAACA AAAATCTTTC GGTTTACGAA GATGCAGTCG CTTCCTGGAA 60 AGGCGAAAGT ATGAGCGAAT GGAAAAAGGA ATTCATCAAA AAAGCCAAAG ATTTCCCAAT 120 TCACAAGCCT TATCATCAAC TCACAAAAGA GCAGAAACAG TTCCTTTGGA AAGGCGATAA 180 AACCAGAAGT TTCCCAAGTA TTGATAATTT TTTCAAAATG CTTGAAGAGA ATCTTTACAA 240 GATCCAATAC CGCGTAATGC TTTCGCGCTA TCGTGGGAAA ACACTTTGCC CCGATTGCGA 300 AGGATTACGA TTGCGGGAAG AAACAAGCTG GGTGAAGATT GACGGACACA ACATTCAGTC 360 TTTGATTGAA TTACCTTTGG ATGAACTCCT GCCATTGATC AAAAGCTTAA AACTGAACGT 420 CCACGACAGA GAAATTGCCA AACGCCTGAC TTACGAAATC GAAACGAGAT TAGAATTCCT 480 GACGAAAGTC GGCCTTGGAT ATCTGACTTT GAACCGAACA TCCAACACGC TTTCCGGAGG 540 AGAAAGCCAG AGAATCAATC TGGCGACAGC TTGGGAAGTT CGCTGGTTGG TTCTATTTAT 600 ATTTTGGATG AGCCGAGCAT TGGTCTGCAT TCCCGCGATA CAGAAAATCT GATTGGTGTC 660 CTCAAACAAC TCCGCGATTT GGGAANTACC GTGATTGTTG TAGAACACGA CGAAGATGTG 720 ATGCTTGCGG CAGNTTACAT TATAGATATT GGCCCNGNAG CGGGCTACCT TGGTGGCGAT 780 CTTGTTTTCA GCGNGGATTA TAAAGAGATG CTGAAGTNTN ATACTTTAAC CGCAAAATAC 840 CTGAATGGCG AACTGAAAAT AGAAGTTCCT GAAAAACGAA GAAAACCGAA GGAATTCATC 900 GCAATAAAAG GTGCCCGCCA GAATAATTTA AAAAATATTG ACGTTGATGT TCCGTTAGAA 960 TGTCTGACAG TTATCACAGG CGTTTCTGGA AGCGGGAAAT CCACTTTGAT GAAGGAAGTG 1020 ATGACCAATG CCATCCAGAT CCAACTGGGA ATGGGCGGCA AAAAAGCCGA TTACGATTCG 1080 GTGGAATTCC CGAAAAAGCT GATCCAGAAT ATCGAACTGA TTGACCAGAA CCCAATCGGG 1140 AAATCGTCCC GCTCCAACCC CGTGACTTAT CTGAAAGCTT ACGACGATAT CCGGGATCTT 1200 TTTGCGAAAC AAAAATCCGC AAAAATCCAG GGTTACAAAC CGAAGCATTT CTCCTTCAAT 1260 GTGGATGGCG GAAGATGTGA CGAGTGCAAA GGCGAAGGTA TCATTACCGT ATCAATGCAG 1320 TTTATGGCGG ACATCGAGCT GGAGTGTGAG CATTGCCATG GCACACGTTT CAAAAAAGAA 1380 ATCCTCGAAG TCAAATATGA TGAGAAAAAC ATCTCAGACA TCCTGCATAT GACGGTGGAT 1440 GAAGCATTGG AATTTTTCTC GGAAAATCAC GAAGAAAAAA TTGTAACCAA ACTAAAACCT 1500 TTGCAGGACG TTGGTTTGGG TTATCTTCAG TTAGGCCAGT CCTCCTCTAC TCTTTCCGGC 1560 GGTGAAGCCC AAAGAGTGAA GCTCGCCTCT TTCCTTGTGA AAGGTGTAAC GACGGAAAAA 1620 ACGTTATTTG TTTTTGATGA ACCATCAACA GGATTACATT TCCACGACAT TCAAAAATTA 1680 CTGAAATCAC TTCAGGCACT GATAGAATTA GGGCATTCGG TTGTAGTGAT TGAGCATCAG 1740 CCGGATATTA TCAAATGCGC CGATTACATC ATCGATGTCG GACCCAATGC CGGAAAATAC 1800 GGTGGCGAAA TTGTTTTCAC AGGAACTCCG GAAGATTTGG TAAAAGAGAA AAAGTCGTTT 1860 ACAGGGAAGT ATATTAAGGA GAAGTTAAAG TAATTTATTT ATATTTGAAG TTATGCTACC 1920 ACTGGATAAA GATTTACAAA AAGCAAAGAT TTCAATTACT GATTTTTTTG AAATTACAAA 1980 TAGAGTTTTA GATTATTTCC CCAATGTAAT CAATAATACA GTTGAAAAAG GAGATTATTT 2040 AATATCCTCA TCAAATATTG CTGGAACAAT AAAATTCCTA AGACCAATCA ATAGAAAGTT 2100 ATTTATTCAG GAAAAAAAAG TTTTCAATGA TTATTTTCAA AAACTGATTA TAGTTTTTGA 2160 AAATATAAGG AACAAAAAAA CTGTAACAGA GGAAGATAAA ATTATTATTG ATAGGGTAAT 2220 TTACACAATA CAGCAATCTA TTGGAATTGG TTTAGATTTA ATGGTTAATC AAAATAGTGC 2280 TAGAAAGCAC GTTGGTAACC GATTTGAAGA ATTAATTAGA GTCATTTTTA CAGAAATATC 2340 AGTATCGAAT AAAAGAACTG TATTACAAAT TCCATATGAA ACTGATGAAG GACAGAAAAT 2400 TTACAAATGC GAGAATGACC TCATTATTTC TCCTTTTGAA AATGTAGAAT CTACAAACAA 2460 ACATCTAGAT GAAAATGAGA TTGTTGTTTC AATAAAGACA ACATCAAAAG ATAGGATGGG 2520 AAAAATGTTT ATAGATAAAA TTTTACTTGA AAGGTTTGTT AAACACCCTC AAAAAGTTAT 2580 AGGGATTTTC CTCAATGATG TACAAAGAAA AGAAGACAAC AATATCAGCT TTACACTTGT 2640 TTCAGGATTA TTTATGGTGT ATACTAAATT CTTAACTACT CTTGAAGGGA TCTATTATTT 2700 AGATCCACCA CCTAATGCAT TGAAACTACC ATATTCTAAT CATATGAAAA GATTTTCAGA 2760 TTTAATTACA GAAGACCTTG AAAAATTATT CTCCTCTTAA TTTTTTTCTT CTATTTTGAG 2820 AATTTGAATC ATCATCGCCT GAAAAAATCC TGTTGATCAT ACTTTCGTCT TTCAATCGCT 2880 TTTGAATTTC CAGACAATAA TTTTTATCTA ACTCTGTTCC AATCCATTTT CTGCCAAAAG 2940 CTTCCGCAAC AGCATATGTA GTTCCCGAAC CACCAAATGG ATCAAGAATT AAACTATCTT 3000 TATTAGATGA AGATAAAATT ATTTTTTTAA GCAATTCTAC TGGCTTTTGC GTAGGGTGAA 3060 TACTTCTTTC CCAAGAACCA TTTGAAATTG TGGGAATCTC CAAAACATCT TTTGGCTTAG 3120 CTCCTAATGG GTTTGGCTCC CAAATATATT GCTTTTTTGA GTTCGAATAT TGCGAAGATT 3180 CGGCCTGGGT TCTTTGTGGA TATTTAACTG TATGCTCATT ATACGGGATT CGTGCCTCAT 3240 CAATATTAAA AATAAAATTT TTAGATTTTC TTAATAACAG TATACTTTCG TGTGAACGTC 3300 CCCAATCTTT ACCTAAATTT GCCTTGTTTC TATAGAACCA AATCAACCAT TTACAACTGT 3360 GAAAATATTT TGAAGTGATA AATTTTATGT CTGCCAGAAT TTCTGAAAAG CCACAAACAT 3420 ATAAACTGCC ATTATCTTTT AAAACTCTAT GAGCTTCCAT TATCCATTCT TTACTCCATT 3480 CGAGATATTC ATTTTGAGAA GAAAAAATAT CCCACTCTGC CTTTTTAATG TTATAAGGTG 3540 GATCTGCAAA AATTAAATCC ACAGAATTAC TCTCTAATTT TCTTAAAAAA TCAATAGCAT 3600 CAACATTGAA AAGTGAACCG TTTTTTGAAA TAAAAAATGG TTTAAGCTCG ATTTCCGAAT 3660 AAAGTTTTAA TTTTGGTATA TAACTGTAAT TATCAAACGC TATTTCATTC ACAAATGAAT 3720 CAATCTGCTG TTGTGTATAA ACCCTGTAAT TATTAATAGG ATGTCTTAAA CTTTTGAATT 3780 TTCCAGAATT ATCCCATCTT CCTTAATGTC TCAGAGTTAA CATCTAATAA TTTCGCCGCT 3840 TCTTTTATTG ATAAATAATC ATCCATATCT TACACAACAT TACACAAGTT TATACAGCAA 3900 ATATAAATAT TTTTTATACA TTGTAAAAAT TTTATTTACT TTTATTTTGT TCAATTGTCT 3960 CAATAAATAG TTAATCGAAA TACATTTTGA ATATGATAAA ATTGACTCCA ACAAATCTAA 4020 CACAATGACA TTAAAACCAA TAAAAACGGA AGAAGATTAC AATCAGGTTT TAGAAAGACT 4080 TTCACAAATT TTCGACGCTA AACCAAATAC CAAAGATGGA GATGAATTGG GAAATCTTGG 4140 GAATTC 4146
【0156】 配列番号:30 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列: ATTTAGGTGA CACTATAGAA TAC 23
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、モデル発現プラスミドpMSP6Lお
よびpMSP6Fの構成を示す図である。
【図2】図2は、モデル発現プラスミドpMSP60の
構成を示す図である。
【図3】図3(A,B) は、ランナウエイプラスミドpHS
2870の構築の手順を示す図である。
【図4】図4は、ランナウエイプラスミドpHS287
0の構成を示す図である。
【図5】図5(A,B) は、プラスミドpCRS04の構築
の手順を示す図である。
【図6】図6は、プラスミドpCRS04の構成を示す
図である。
【図7】図7は、プラスミドpCRA19の構成を示す
図である。
【図8】図8(A,B,C,D,E) は、システムプラスミドpF
SP6の構築の手順を示す図である。
【図9】図9(A,B) は、プラスミドpACE601の構
築の手順を示す図である。
【図10】図10は、プラスミドpACE611の構成
を示す図である。
【図11】図11(A,B) は、プラスミドpACE611
の構築の手順を示す図である。
【図12】図12(A,B) は、プラスミドpCRS70の
構築の手順を示す図である。
【図13】図13(A,B) は、プラスミドpACE701
およびpACE702の構築の手順を示す図である。
【図14】図14は、大腸菌HB101にpFSP6お
よびpACE601又はpFSP6およびpACE60
1−NspIII を導入し、IPTG誘導の有無によるN
sp7524III 制限酵素活性の発現をλ−DNAの分解反
応液のアガロースゲル電気泳動により調べた図である。
図中のMは、λ−EcoT141サイズマーカーを示
し、1はAvaI消化したλ−DNAを示し、2は誘導
後のHB101/pFSP6/pACE601を示し、
3は誘導前のHB101/pFSP6/pACE601
を示し、4は誘導後のHB101/pFSP6/pAC
E601−NspIII を示し、5は誘導前のHB101
/pFSP6/pACE601−NspIII を示す。
【図15】図15は、大腸菌HB101にpFSP6お
よびpACE601又はpFSP6およびpACE60
1−NspIII を導入し、IPTG誘導の有無によるλ
−DNAの分解反応を2時間および3時間まで延長した
場合のアガロースゲル電気泳動を示す図である。図中の
Mは、λ−EcoT141サイズマーカーを示し、1は
AvaI消化したλ−DNAを示し、2は1時間後(誘
導あり)のHB101/pFSP6/pACE601を
示し、3は2時間後(誘導あり)のHB101/pFS
P6/pACE601を示し、4は3時間後(誘導あ
り)のHB101/pFSP6/pACE601を示
し、5は1時間後(誘導なし)のHB101/pFSP
6/pACE601を示し、6は2時間後(誘導なし)
のHB101/pFSP6/pACE601を示し、7
は3時間後(誘導なし)のHB101/pFSP6/p
ACE601を示し、8は1時間後(誘導あり)のHB
101/pFSP6/pACE601−NspIII を示
し、9は2時間後(誘導あり)のHB101/pFSP
6/pACE601−NspIII を示し、10は3時間
後(誘導あり)のHB101/pFSP6/pACE6
01−NspIII を示し、11は1時間後(誘導なし)
のHB101/pFSP6/pACE601−NspII
I を示し、12は2時間後(誘導なし)のHB101/
pFSP6/pACE601−NspIII を示し、13
は3時間後(誘導なし)のHB101/pFSP6/p
ACE601−NspIII を示す。
【図16】図16は、AccIII 制限修飾系遺伝子構造
を示す図である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 配列表の配列番号:1に示されるアミノ
    酸配列の全部、又はその一部を含むものであって、Ac
    cIII 制限酵素活性を有するポリペプチド。
  2. 【請求項2】 配列表の配列番号:1に示されるアミノ
    酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、1個若し
    くは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の
    少なくとも1つがされており、かつAccIII 制限酵素
    活性を有するポリペプチド。
  3. 【請求項3】 配列表の配列番号:1に示されるアミノ
    酸配列の全部、又はその一部を含むポリペプチドであっ
    て、AccIII 制限酵素活性を示すポリペプチドをコー
    ドするDNA。
  4. 【請求項4】 配列表の配列番号:2で示されるDNA
    の全部、又はその一部を含むDNAであって、該DNA
    の発現産物がAccIII 制限酵素活性を示すDNA。
  5. 【請求項5】 配列表の配列番号:1で示されるアミノ
    酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、1個若し
    くは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置
    換の少なくとも1つがされており、かつAccIII 制限
    酵素活性を示すポリペプチドをコードするDNA。
  6. 【請求項6】 請求項3〜5いずれか記載のDNAにハ
    イブリダイズ可能な、AccIII 制限酵素活性を有する
    ポリペプチドをコードするDNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569669B1 (en) * 2000-10-12 2003-05-27 New England Biolabs, Inc. Host strain for low uninduced expression of foreign RNA polymerase genes
GB0029539D0 (en) * 2000-12-04 2001-01-17 Isis Innovation Method for identifying modulatorss of transcription
US7794971B1 (en) 2003-07-01 2010-09-14 Epicentre Technologies Corporation Compositions and methods for controlling copy number for a broad range of plasmids and uses thereof
US20070202082A1 (en) * 2005-11-09 2007-08-30 Dong-Yan Jin Promoters for RNA interference
CN102174554A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 内蒙古民族大学 双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途
CN111378609A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 江苏金斯瑞生物科技有限公司 诱导质粒拷贝数增加的培养基及其应用
CN111705071B (zh) * 2020-06-16 2023-03-10 西北农林科技大学 一种人工设计质粒pM5500及其在DNA marker制备中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
GB8407498D0 (en) * 1984-03-22 1984-05-02 Biogen Nv High copy number expression vectors
US5354680A (en) * 1986-06-06 1994-10-11 New England Biolabs, Inc. Method for producing the DdeI restriction endonuclease and methylase
JP2647847B2 (ja) * 1986-06-06 1997-08-27 ニユ−・イングランド・バイオレイブス・インコ−ポレイテツド BamHI制限修飾系のクローニング
JP2518051B2 (ja) * 1989-06-06 1996-07-24 東洋紡績株式会社 AccI制限エンドヌクレア―ゼの製造方法
US5196318A (en) * 1990-06-26 1993-03-23 The Texas A&M University System Precisely regulated expression of deleterious genes
US5843703A (en) * 1993-01-22 1998-12-01 California Institute Of Technology Enhanced production of toxic polypeptides in prokaryotes
ATE312934T1 (de) * 1995-06-07 2005-12-15 Univ Washington Rekombinant bakterielle system mit umweltbeschränkte lebensfähigkeit
JP3007584B2 (ja) 1997-01-31 2000-02-07 文化シヤッター株式会社 耐火スクリーン装置

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