JP2000325094A - 制限酵素及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ド、及び上記ポリペプチドをコードするＤＮＡの提供。 【解決手段】特定のアミノ酸配列の全部又はその一部、
あるいはその一部のアミノ酸配列に、１個若しくは複数
のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の少なくと
も１つがなされ、ＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリ
ペプチド；特定の塩基配列のＤＮＡの全部又はその一部
を含み、発現産物がＡｃｃIII 制限酵素活性を示すＤＮ
Ａ；あるいはその一部が欠失、付加、挿入若しくは置換
の少なくとも１つがなされ、ＡｃｃIII 制限酵素活性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡ；前記いずれかの
ＤＮＡにハイブリダイズ可能な、ＡｃｃIII 制限酵素活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学試薬と
して有用な制限酵素及びその遺伝子、更に詳細にはＡｃ
ｃIII 制限酵素及びそのＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技法によって目的とする遺
伝子の発現システムを構築する際には、用いる宿主のＲ
ＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター支配下に目
的遺伝子を配置することにより、該遺伝子の発現を制御
することが行われる。しかし、宿主に対して有害なタン
パク質をコードする遺伝子の場合には、用いるプロモー
ターの発現制御が厳密に行えないことに起因して該遺伝
子産物の発現のためにプラスミドの構築自体が不可能に
なることがある。

【０００３】そのような問題点を解決すべく開発された
発現システムとしては大腸菌を宿主とし、大腸菌に感染
するバクテリオファージ Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを
利用したｐＥＴ−システム（ノバジェン社製）がある
［ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J.
Mol. Biol. ）第189 巻、第113 〜130 頁 （1986）、
ジーン（Gene）、第 56 巻、第125 〜135 頁 （198
7）］。ｐＥＴ−システムは、プロモーター認識の特異
性及び転写活性の高いＴ７ＲＮＡポリメラーゼを大腸菌
内で発現させ、このＴ７ＲＮＡポリメラーゼが発現ベク
ター上のＴ７プロモーター下流に配置された目的遺伝子
を転写し、高発現されるシステムである。目的の遺伝子
の転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってのみ起こるた
め、該ポリメラーゼを生産しない宿主中では目的の遺伝
子を発現させることなくプラスミドの構築をすることが
可能であり、目的遺伝子を宿主の有するＲＮＡポリメラ
ーゼに認識されるプロモーター支配下において発現シス
テムを構築する場合とは異なりプラスミドの構築自体が
不可能になることはない。

【０００４】しかし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
は、λ−ファージベクター上にクローニングされて発現
用の宿主に溶原化されているために宿主を自由に選ぶこ
とができず、宿主を変更しようとする場合には煩雑な操
作が必要となる。さらに、宿主中のＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼの発現があまり厳密に制御されていないため、非誘
導状態の宿主内でもＴ７ＲＮＡポリメラーゼが発現され
ており、その結果、発現ベクター上のＴ７プロモーター
下流に配置された目的遺伝子の発現が非誘導状態におい
ても起こる。このような目的遺伝子の非誘導状態におけ
る発現を低下させるために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
阻害物質であるＴ７リゾチームを用いてＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼの活性を阻害したり［ジャーナル オブ モレ
キュラーバイオロジー（ J. Mol. Biol.）第219 巻、第
37〜44頁（1991）］、Ｔ７プロモーター下流にラクトー
スオペレーターを配置してＴ７ＲＮＡポリメラーゼのＴ
７プロモーターへのアクセスを防いだりしている［ジャ
ーナル オブ モレキュラー バイオロジー（ J. Mol.
Biol.）、第 219巻、第45〜59頁（1991）］。

【０００５】しかし、これらの措置も転写活性の高いＴ
７ＲＮＡポリメラーゼに対しては十分でなく、非誘導状
態のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を完全に阻止するこ
とはできない。そのため、目的の遺伝子産物が宿主に対
して致死的な場合、プラスミドの構築はできてもその遺
伝子を発現させるための形質転換体を作製できないこと
がある。つまり、ｐＥＴ−システムには宿主を自由に変
更できないこと、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現
制御が正確でないこと、以上２つの解決すべき問題点が
ある。

【０００６】一方、バクテリオファージ Ｔ７に性質が
類似したバクテリオファージとして、サルモネラ属細菌
（Salmonella typhimurium）に感染するバクテリオファ
ージＳＰ６がある［サイエンス（Science ）、第 133
巻、第2069〜2070頁（1961）］。バクテリオファージＳ
Ｐ６が生産するＲＮＡポリメラーゼは、分子量が約１０
万のシングルペプチドであり、プロモーター認識の特異
性が強く転写活性も高いため試験管内ＲＮＡ合成によく
用いられている［ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J. Biol. Chem.）第 257巻、第5772〜57
78頁（1982）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（J. Biol. Chem.）、第257 巻、第5779〜57
88頁（1982）］。さらに、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子はすでにクローニングされ、大腸菌内で大量発現さ
れている［ヌクレイック アシッズリサーチ（Nucl. Ac
ids Res.）第15巻、第2653〜2664頁（1987）］。

【０００７】宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺
伝子の例として、制限酵素（Restriction Endonucleas
e）遺伝子がある。本来制限酵素は、産生している微生
物の体内に侵入したファージ等の外来ＤＮＡを切断する
ことによる自己防御に利用される。一方、制限酵素を産
生する微生物は、大抵の場合、制限酵素と同じ塩基配列
を認識する修飾酵素を産生し、制限酵素による切断から
自己のＤＮＡを防御している。すなわち、修飾酵素は認
識する塩基配列中の塩基の一つ以上にメチル基を添加し
てＤＮＡを修飾し、同じ配列を認識する制限酵素の結
合、或いは該酵素によるＤＮＡ切断を不可能にする。こ
の機構を制限修飾系と呼び、構成する制限酵素及び修飾
酵素の遺伝子対を制限修飾系遺伝子と呼ぶ。従って、制
限修飾系遺伝子の修飾酵素遺伝子が欠損した微生物中で
制限酵素遺伝子が発現すると、微生物自身のＤＮＡが切
断され細胞は死に到る。実際、ＭｂｏＩ制限修飾系遺伝
子には二種類の修飾酵素遺伝子が存在しているが、この
うちの一方の修飾酵素遺伝子のみを共存させることによ
る不完全なメチル化では宿主ＤＮＡの修飾が不完全とな
り、制限酵素遺伝子のクローニングが不可能であること
が報告されている［ヌクレイック アシッズ リサーチ
（Nucl. Acids Res.）第２１巻、第２３０９〜２３１３
頁（１９９３）］。

【０００８】また、制限修飾系遺伝子を保持する細胞よ
り制限修飾系遺伝子の脱落が起こると、細胞内に存在す
る修飾活性が不足してゲノムＤＮＡのメチル化が不完全
になり、細胞内に残存するごく少量の制限酵素によって
自分自身のゲノムＤＮＡが切断されて致死的となること
が明らかにされている［サイエンス（Science ）第２６
７巻、第８９７〜８９９頁（１９９５）］。このように
制限修飾系を構成する修飾酵素非共存下では、制限酵素
は細胞にとって極めて有害なタンパク質であり、その遺
伝子を単独でクローニングし、さらに発現させることは
これまでの技術では不可能であった。

【０００９】ここで制限酵素について触れると、その酵
素学的性質により制限酵素はＩ型、II型、III 型に分類
する事ができる。その中でも、特定のＤＮＡ塩基配列を
認識し、その配列の内部或いは近傍の特定の位置で切断
するII型制限酵素は、遺伝子工学の分野で広く使用さ
れ、これまでに種々の特異性を有する制限酵素が様々な
微生物から単離されている［ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucl. AcidsRes.）第24巻、第223 〜235 頁
（1996）］。以下、本明細書ではII型制限酵素を「制限
酵素」と記載する。しかし、微生物によっては、産生し
ている制限酵素量が少なかったり、複数の制限酵素を産
生している場合がある。例えば、制限酵素ＡｃｃIII は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所〔あて名：
日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３（郵便番号
３０５）〕に、昭和６０年１１月９日（原寄託日）より
ＦＥＲＭ ＢＰ−９３５として寄託されているアチネト
バクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoa
ceticus ）（以下Ａｃｃ菌と略する）により生産される
が、該酵素の発現量は低く、また本菌はＡｃｃＩ及びＡ
ｃｃII制限酵素を同時に産生している。従って、高純
度、安価な試薬として制限酵素ＡｃｃIII を本菌を用い
提供するには高度な製造技術を要した。高純度で安価な
試薬として制限酵素を提供する場合、目的の制限酵素遺
伝子を単離し、目的制限酵素のみを大量生産する遺伝子
工学的生産は有効な手段である。この目的を達成するた
め、従来制限酵素遺伝子を単離する幾つかの方法が報告
されている。

【００１０】まず制限酵素を産生している微生物のゲノ
ムＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、その断片を適
当なプラスミドベクターに挿入し、制限酵素遺伝子が発
現するクローンを選択する「ショットガン」方法が挙げ
られる。目的クローンのスクリーニング法として、例え
ば、宿主に制限修飾系遺伝子が導入されると、宿主が自
己防衛機能を獲得することを利用し、ファージの感染に
対する耐性を指標にし、制限修飾系遺伝子を単離する方
法［ＰｓｔＩ：プロシーディングス オブ ザナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ＵＳＡ
（Proc.Natl.Acad.Sci. ）第７８巻、第１５０３〜１５
０７頁（１９８１）］がある。しかし、本方法では、制
限修飾系遺伝子のサイズが単離可能な範囲に収まる必要
があり、さらに単離された制限修飾系遺伝子の発現が、
宿主を選択的に生存させうるに十分なファージ耐性を示
す必要がある。一方、制限修飾系遺伝子の一般的な特徴
として、制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子がゲノム上で
近接していることが挙げられ、実際、これまでに得られ
た制限修飾系遺伝子の多くで確認されている［ヌクレイ
ック アシッズ リサーチ（Nucl. Acids Res.）第１９
巻、第２５３９〜２５６６頁（１９９１）］。そこで、
上記特徴を利用し、修飾酵素遺伝子の発現を指標とし制
限修飾系遺伝子をスクリーニングする方法［特開昭６３
−８７９８２、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nuc
leic.Acids Res.)第１９巻、第１８３１〜１８３５頁
（１９９１）］がある。しかし本法は、修飾酵素遺伝子
に制限酵素遺伝子が近接していない場合、制限酵素遺伝
子を得ることはできない。

【００１１】さらに上記の「ショットガン」方法には、
根本的な問題がある。それは、ゲノムＤＮＡ供給源とな
る生物と宿主との間の転写翻訳機構の違いである。例え
ば制限修飾系遺伝子に付随するプロモーター及びリボゾ
ーム結合部位が宿主内でうまく機能せず、十分な遺伝子
発現が起こらない場合には、たとえ目的の遺伝子を含有
する形質転換体を得られていても、その形質転換体を選
択する事に多大な労力を要する。この点を回避するに
は、例えば、制限酵素タンパク質のアミノ酸配列を解析
し、そのデータを基にＰＣＲによるＤＮＡ増幅法によ
り、制限酵素産生菌のゲノムＤＮＡより制限酵素遺伝子
を得、既知のタンパク質発現システムを利用する方法が
ある［特開平６−２７７０７０］。しかし、従来のタン
パク質発現システムでは、制限酵素の存在が宿主に対し
致死的となるため、何らかの方法、例えば該酵素と制限
修飾系を構成する修飾酵素を共存させ、宿主を保護する
必要がある。

【００１２】前述の制限酵素遺伝子の単離方法はいずれ
も、該遺伝子とともに制限修飾系遺伝子を構成する修飾
酵素遺伝子を同時に単離することが必要であるが、制限
酵素遺伝子単独で単離する方法も報告されている［ヌク
レイック アシッズ リサーチ（Nucleic.Acids.Res.）
第２２巻、第２３９９〜２４０３頁（１９９４）］。し
かし、この方法で例示されているのは、酵素活性至適温
度が７０℃付近の制限酵素をコードする遺伝子の単離で
あり、宿主培養温度近辺で比活性の高い制限酵素をコー
ドする遺伝子を単離する場合には、やはり修飾酵素遺伝
子を共存させている。

【００１３】また例外的に、制限酵素ＤｐｎＩの様にＤ
ＮＡ認識配列中の特定の核酸塩基がメチル化による修飾
を受けていないと、切断活性を示さない制限酵素が存在
する。このような性質を有する制限酵素遺伝子は、宿主
菌を選択することにより、例外的に、他の特定の遺伝子
非共存下でも単離可能だと考えられる。実際、II型制限
酵素ではないが、メチル化を受けた核酸塩基を含む特定
のＤＮＡ塩基配列を認識し、ＤＮＡ切断活性を有するＭ
ｒｒタンパク質をコードしたｍｒｒ遺伝子が単離されて
いる［ジャーナル オブ バクテリオロジー(J.Bacteri
ol.)第１７３巻、第５２０７〜５２１９頁（１９９
１）］。

【００１４】上述したように、従来の技術により制限酵
素遺伝子の単離を行うには、特殊な場合を除き、該遺伝
子と制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子を同時
に発現させる必要があった。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の第１
の目的は、ＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ドを提供することにある。さらに本発明の第２の目的は
ＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡを提供することにある。

【００１６】本発明者らはｐＥＴ−システムの問題点を
解決するため、発現制御が正確な新しい発現システムと
して、まずＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いた発現シス
テムの構築を行い、該システムの評価を試みた。

【００１７】該発現システムは、ＳＰ６ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子をminiＦプラスミドに組み込んだシステムプ
ラスミドを利用して構築されているため、目的の遺伝子
をＳＰ６プロモーター下流にクローニングした発現ベク
ターとこのシステムプラスミドを同時に宿主に導入する
ことにより、様々な大腸菌で目的遺伝子の発現システム
を構築することができる。さらに、ｌａｃプロモーター
とアンチセンス技術を利用してシステムプラスミド上の
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の厳密な発現制御を可
能にした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺
伝子に用いて本発現システムを評価した結果、このシス
テムにおいてＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現は
正確に制御されており、非誘導状態でＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼがほとんど発現していないこと、および誘導後
には目的遺伝子の高発現に必要十分なＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼが発現し、目的遺伝子が高発現することが明ら
かになった。

【００１８】しかしながら大腸菌を宿主とした場合に
は、ＳＰ６プロモーターは大腸菌のＲＮＡポリメラーゼ
によって非常に弱いながら認識されるために、その下流
にある目的遺伝子は非誘導状態においてもごく少量発現
することが明らかになった。このため、遺伝子産物が大
腸菌に対して非常に有害で致死的に働く場合には発現シ
ステムの構築は不可能となり、本発明の目的を充分に達
成することはできないことが判明した。

【００１９】そこで、本発明者らはさらに鋭意研究した
結果、目的遺伝子の発現を２種類の制御方法、すなわち
該遺伝子のコピー数の制御、およびプロモーターを介し
た転写制御とを組み合わせてコントロールする新規なシ
ステムを採用することにより、意外にも (i)非誘導状態
では目的遺伝子の発現を検出できないレベルに抑えるこ
とが可能であり、(ii)発現誘導を行った場合には目的遺
伝子を含有するプラスミドのコピー数を上昇させると共
にＲＮＡポリメラーゼを発現させ、該ＲＮＡポリメラー
ゼの認識するプロモーター下流に配置された目的遺伝子
が転写、翻訳されることを見いだした。即ち、本発明の
プラスミドベクターは、上記課題を解決することができ
る、遺伝子工学的分野において画期的な性質を有するプ
ラスミドベクターであり、本発明者らはさらに該ベクタ
ーを利用した目的遺伝子の発現方法を完成するに至っ
た。

【００２０】更に、上記プラスミドベクターを用いて、
宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺伝子を単離す
る方法、特に、従来技術の欠点を克服した制限酵素遺伝
子の単離方法を完成するに至った。

【００２１】また上記の方法を利用することにより、従
来得られていなかったＡｃｃIII 制限酵素をコードする
ＤＮＡをＡｃｃIII 修飾酵素を共存させることなく単離
することができ、更にＡｃｃIII 制限酵素を大量発現さ
せることが確認できた。

【００２２】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１） 配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列
の全部、又はその一部を含むものであって、ＡｃｃIII
制限酵素活性を有するポリペプチド、（２） 配列表の
配列番号：１に示されるアミノ酸配列又はその一部のア
ミノ酸配列において、１個若しくは複数のアミノ酸残基
が欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つがされて
おり、かつＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ド、（３） 配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸
配列の全部、又はその一部を含むポリペプチドであっ
て、ＡｃｃIII 制限酵素活性を示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ、（４） 配列表の配列番号：２で示され
るＤＮＡの全部、又はその一部を含むＤＮＡであって、
該ＤＮＡの発現産物がＡｃｃIII 制限酵素活性を示すＤ
ＮＡ、（５） 配列表の配列番号：１で示されるアミノ
酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、１個若し
くは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置
換の少なくとも１つがされており、かつＡｃｃIII 制限
酵素活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ、並び
に（６） 前記（３）〜（５）いずれか記載のＤＮＡに
ハイブリダイズ可能な、ＡｃｃIII 制限酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ、に関するものであ
る。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明の第１の発明はプラスミド
ベクターに関する。すなわち、宿主が本来有しないＲＮ
Ａポリメラーゼによって認識される、目的遺伝子の発現
を制御するプロモーター配列と、外来因子による誘導に
よってコピー数を増加させる複製起点とを有することを
特徴とするプラスミドベクターに関する。該プラスミド
ベクターが有する目的遺伝子の発現を制御するプロモー
ター配列としては、特に限定されるものではないが、あ
る特定のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモ
ーター配列、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６等のバクテリオ
ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼによって認識される
プロモーター配列が使用でき、とりわけＳＰ６ファージ
由来のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモー
ター配列が好ましい。ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリ
メラーゼによって認識されるプロモーター、すなわちＳ
Ｐ６プロモーターの最小領域の塩基配列を配列表の配列
番号３０に示す。さらに、該プラスミドベクターは選択
マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子を有すること
ができる。

【００２４】また、本発明のプラスミドベクターのコピ
ー数の制御、すなわち該プラスミドベクターの複製起点
の機能の制御を行う外来因子としては、特に限定される
ものではないが、例えばラクトース又はイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のようなその構
造類似物の添加、ガラクトース又はその構造類似物の添
加、アラビノース又はその構造類似物の添加等の種々の
化学物質の添加或いはトリプトファン濃度の低減、形質
転換体の培養温度の調整等を挙げることができる。これ
らの因子により制御可能なプロモーターの支配下に複製
起点をおくことによってコピー数の制御が可能となる。
この目的に使用可能なプロモーターとしては上記の目的
を達成できるものであれば特に制限はなく、たとえば宿
主が大腸菌である場合にはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｇ
ａｌ、ａｒａ、Ｐ_L 等のプロモーターを使用できる。ま
たこれらのプロモーターはＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の
発現誘導にも使用することが可能である。

【００２５】本発明のプラスミドベクターの複製起点
は、特に限定されるものではないが、例えばランナウエ
イプラスミドの複製起点であり、複製起点がｌａｃプロ
モータの制御下にあるプラスミドベクターが例示され
る。この場合には、コピー数の制御はラクトース及びそ
の構造類似物の添加、特に好ましくはイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって達
成される。

【００２６】本発明の第２の発明は、本発明のプラスミ
ドベクターに発現させようとする目的遺伝子を組み込ん
だプラスミドベクターと、該プラスミドベクター上のプ
ロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼ遺伝子と
を宿主に導入し、外来因子により該プラスミドベクター
のコピー数の増加を誘導すると共に該ＲＮＡポリメラー
ゼの発現の誘導を行って目的遺伝子の転写、翻訳を行う
ことを特徴とする、目的遺伝子の発現方法に関する。プ
ラスミドベクター上のプロモーター配列を認識するＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子としては、特に限定されるもので
はないが、例えば前記のようなバクテリオファージ由来
のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を挙げることができ、とり
わけＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が
好適である。また、かかるＲＮＡポリメラーゼの発現
の、又はプラスミドベクターのコピー数の増加の誘導を
行う外来因子としては、特に限定されるものではない
が、例えばラクトース又はイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のようなその構造類似物の添
加、ガラクトース又はその構造類似物の添加、アラビノ
ース又はその構造類似物の添加等の種々の化学物質の添
加或いはトリプトファン濃度の低減、形質転換体の培養
温度の調整等を挙げることができる。

【００２７】プラスミドベクターのコピー数の増加の誘
導とＲＮＡポリメラーゼの発現の誘導とは、それぞれ別
の外来因子の作用により行うことも、あるいは同一の外
来因子の作用により行ってもよい。また、この場合ＲＮ
Ａポリメラーゼをコードする遺伝子は、宿主の染色体上
に組み込まれていても、あるいは本発明のプラスミドベ
クターとは異なる別のプラスミドベクターやファージベ
クターによって宿主に導入されていてもかまわない。後
者の場合には目的に応じて宿主を変更することが容易に
行える。さらに、この場合にはＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を有するベクターの宿主への導入は、本発明のプラス
ミドベクターより先に行われても、あるいは後で行われ
てもかまわない。

【００２８】本発明における目的遺伝子は、特に限定さ
れるものではないが、宿主に対し致死的となる、あるい
は有害なタンパク質をコードするものである場合にその
意義が発揮される。このようなタンパク質としては、例
えば前記のような制限酵素、その他の核酸分解酵素、核
酸結合性のタンパク質、タンパク質分解酵素などが挙げ
られる。

【００２９】本発明は、前記のように目的遺伝子の発現
を２種類の制御方法、すなわち該遺伝子のコピー数の制
御、およびプロモーターを介した転写制御とを組み合わ
せてコントロールするシステムを提供する。本発明にお
けるプラスミド上にクローニングされた目的遺伝子の発
現の制御は、従来のものと異なり極めて厳密であり、非
誘導状態ではその発現を検出できないレベルに抑えるこ
とが可能である。発現誘導を行いプラスミドのコピー
数、すなわち目的遺伝子のコピー数を上昇させると共に
ＲＮＡポリメラーゼを発現させると、該ＲＮＡポリメラ
ーゼの作用によってプロモーターに制御されて目的遺伝
子が転写、翻訳される。

【００３０】従って、本発明のプラスミドベクターを用
いることによって、従来技術では困難であった宿主に対
して有害な、あるいは致死的な遺伝子を含有する形質転
換体を作製し、さらに該遺伝子の発現を行うことが可能
となる。

【００３１】例えば、本発明のプラスミドベクターを使
用し、Ｎｓｐ7524III 制限酵素をコードする遺伝子のク
ローニングを試みたところ、対応する修飾酵素遺伝子を
共存させることなく大腸菌に保持させることができた。
さらに、得られた形質転換体にＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を含有するシステムプラスミドを導入して発現誘導を
行うことによりその菌体内にＮｓｐ7524III 制限酵素を
発現させることも可能であった。

【００３２】また、本発明のプラスミドベクターを遺伝
子ライブラリー作製のためのクローニングベクターとし
て用いることにより、従来の方法を用いた場合には取得
できなかった遺伝子を単離し、さらにその発現産物の活
性を確認することを１つの宿主で行うことが可能とな
る。もちろん本発明のプラスミドベクターの利用は宿主
に対して有害な産物をコードする遺伝子のクローニング
に限られるものではなく、一般的なプラスミドベクター
としても利用可能である。

【００３３】本発明に係るＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を
宿主に導入する方法として、例えば、プラスミドｐＦＳ
Ｐ６、ファージＭ１３ｓｐ６を用いることができる。プ
ラスミドｐＦＳＰ６の詳細な構築方法は参考例（２）に
記載されている。該プラスミドで形質転換された大腸菌
ＨＢ１０１は Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＦＳＰ
６と命名、表示され、平成７年１２月２２日（原寄託
日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵
便番号３０５）〕に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４２
として寄託されている。ファージＭ１３ｓｐ６の構築方
法は実施例２（６）に記載されている。

【００３４】以下に、プラスミドｐＦＳＰ６を用いた場
合を例に挙げて、本発明について更に詳しく説明する。

【００３５】まず、上記のシステムプラスミドｐＦＳＰ
６を利用して目的遺伝子の発現を行うことができるプラ
スミドとして、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによって認識
されるプロモーター配列と、レポーター遺伝子としての
β−ガラクトシダーゼ遺伝子とを有するマルチコピーの
モデル発現プラスミドであるプラスミドｐＭＳＰ６Ｌ、
ｐＭＳＰ６Ｆ（図１）、ｐＭＳＰ６Ｏ（図２）を構築
し、これらのモデル発現プラスミドを用いて行った試験
結果について説明する。

【００３６】これらのモデル発現プラスミドの詳細な構
築方法は参考例（３）に記載されている。これらのプラ
スミドにはＳＰ６プロモーター配列としてＳＰ６プロモ
ーターの最小領域（ｐＭＳＰ６Ｌ）、ネイティブなＳＰ
６プロモーター領域（ｐＭＳＰ６Ｆ）、又はＳＰ６プロ
モーターの最小領域とｌａｃオペレーター領域（ｐＭＳ
Ｐ６Ｏ）がそれぞれ導入されている。

【００３７】プラスミドｐＭＳＰ６Ｌ又はｐＭＳＰ６Ｆ
のみを表１に示す大腸菌に導入した場合には、表２に示
されるように宿主大腸菌がＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを
発現しないにもかかわらずβ−ガラクトシダーゼ活性が
認められ、その量はＳＰ６プロモーターを有していない
プラスミドｐＭＳ４３４を導入したものよりも高い。す
なわち、ＳＰ６プロモーターが大腸菌由来のＲＮＡポリ
メラーゼによって認識され、その下流のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子が転写、翻訳されていると考えられる。ま
た、大腸菌ＭＲｉ８０はｐｃｎＢ遺伝子に変異を有し、
上記のモデル発現プラスミドのようなＣｏｌＥ１由来の
複製起点を持つプラスミドのコピー数が親株であるＭＲ
ｉ７に比べて１／６〜１／１３に低下する株であるが、
これを宿主に用いた場合にはβ−ガラクトシダーゼ活性
もＭＲｉ７の１／７〜１／１４に減少している。このこ
とから、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現のレベルと
導入されたプラスミドのコピー数との間には相関がある
ことが示される。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【００４０】次に、同じモデル発現プラスミドを上記の
システムプラスミドｐＦＳＰ６とともに大腸菌に導入し
たうえ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導
しない条件下でβ−ガラクトシダーゼ活性を調べてみる
と、表３に示されるようにシステムプラスミドを有さな
い大腸菌の場合と同程度のβ−ガラクトシダーゼ活性し
か認められない。このことは非誘導状態においてはプラ
スミドｐＦＳＰ６上のＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の発現がほぼ完全に抑えられていることを示している。
一方、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰ
ＴＧ）を添加してＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発
現を誘導した場合にはβ−ガラクトシダーゼ活性は１８
〜３２倍上昇しており、ＳＰ６プロモーターを介してβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能であることを示し
ている。特に大腸菌ＭＲｉ８０を宿主とした場合には、
非誘導状態のβ−ガラクトシダーゼ活性は極めて低いレ
ベルにおさえられているが、誘導４時間後には非誘導状
態の２５〜３２倍に上昇している。

【００４１】

【表３】

【００４２】さらにＳＰ６プロモーター下流にｌａｃオ
ペレーター配列を挿入されているプラスミドｐＭＳＰ６
Ｏでは、他のモデル発現プラスミドに比べて非誘導条件
下でのβ−ガラクトシダーゼ活性が低下しているが、そ
の発現を完全におさえることはできない。以上の結果
は、マルチコピーのプラスミドを使用した発現システム
では目的遺伝子の発現を完全におさえることが難しく、
また、この問題を解決するにはシステムプラスミド上の
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現制御よりも目的遺伝子
を含むプラスミドのコピー数による制御の方が効果があ
ることを示唆している。

【００４３】そこで、本発明者らはこれらの結果をもと
に新たな発現ベクターの開発を行い、本発明のプラスミ
ドベクターを見出すに到った。

【００４４】即ち、本発明者らは非誘導状態での発現レ
ベルを下げ、誘導後の発現量を確保することができるラ
ンナウエイプラスミドベクターを構築した。まず、シス
テムプラスミドではＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼの発現が
ＩＰＴＧによって誘導されることを考慮して、ＩＰＴＧ
の誘導によりコピー数を増加させることのできるランナ
ウエイ複製起点を有するプラスミドを図３に示す操作に
従って構築した。まず、プラスミドベクターｐＵＣ１９
（宝酒造社製）のＮｄｅＩサイトに配列表の配列番号：
３および配列番号：４にその塩基配列を示した２つのＤ
ＮＡ鎖から作製される１０６ＮｄｅＩＤＮＡ断片を導入
して得られるプラスミドｐＵＣ１０６Ａより、ｌａｃプ
ロモーター、およびオペレーター領域を含むＰｖｕII断
片を除いたプラスミドｐＵＣ１０６ＡｄＰＯを構築す
る。

【００４５】次に該プラスミドを鋳型とし、該プラスミ
ドの複製起点であるＲＮＡII領域近傍に設定されたＲＮ
ＡIIＡプライマー（配列表の配列番号：５にＲＮＡIIＡ
プライマーの塩基配列を示す）と１０６ＮｄｅＩ配列末
端部分に設定された1870プライマー（配列表の配列番
号：６に1870プライマーの塩基配列を示す）を用いたＰ
ＣＲによって得られるＲＮＡ1870断片をプラスミドｐＳ
ＴＶ２８（宝酒造社製）のＸｂａＩサイトに挿入したプ
ラスミドｐＨＳ２８７０を得ることができる。構築され
たプラスミドｐＨＳ２８７０を図４に示す。通常、大腸
菌１細胞あたりに該プラスミドは３０コピー程度存在す
るが、ＩＰＴＧの添加によりそのコピー数は数百に増加
する。

【００４６】次に該プラスミドよりプラスミドｐＳＴＶ
２８由来のＰ１５Ａ複製起点を含むＡｃｃＩ−ＮｓｐＩ
断片を除き（プラスミドｐＣＲＳ０１）、さらに不要の
制限酵素サイトを含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を除去
した後（プラスミドｐＣＲＳ０２）、プラスミドｐＭＪ
Ｒ１５６０［ジーン（Gene）第51巻、第 225〜 267頁
（1987）］由来のラクトース・レプレッサー（ｌａｃＩ
q ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入したプラスミドｐＣ
ＲＳ０４を構築することができる。図５にプラスミドｐ
ＨＳ２８７０からプラスミドｐＣＲＳ０４を構築する過
程を示す。図６にこうして構築されたプラスミドｐＣＲ
Ｓ０４を示す。該プラスミドはＩＰＴＧで誘導されるラ
ンナウエイプラスミドであり、通常は大腸菌１細胞あた
りに１〜２コピー存在するが、ＩＰＴＧの添加によりそ
のコピー数は数百に増加する。

【００４７】該プラスミド上に挿入される目的遺伝子の
発現を制御するために、該プラスミドのＮｈｅＩサイト
にＳＰ６プロモーター配列とｌａｃオペレーター配列と
を含む２本鎖オリゴヌクレオチド、Ｐ_SP6 −Ｏ_lac ＥＸ
リンカーを導入し、プラスミドｐＡＣＥ６０１を構築す
ることができる。Ｐ_SP6 −Ｏ_lac ＥＸリンカーは配列表
の配列番号：７および配列番号：８にその塩基配列を示
した２つのＤＮＡ鎖から作製される。該プラスミドｐＡ
ＣＥ６０１は選択マーカーとしてクロラムフェニコール
耐性遺伝子を有するランナウエイプラスミドベクターで
ある。

【００４８】また、上記のプラスミドｐＣＲＳ０４のＮ
ｈｅＩサイトにプラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒
造社製）由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むＢｓｐＨ
Ｉ断片を導入した後（プラスミドｐＣＲＳ７０）、さら
にクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＮｃｏＩ−Ｂ
ｓａＡＩ断片を除いて上記のＰ_SP6 −Ｏ_lac ＥＸリンカ
ーに置換することにより、該リンカーの挿入方向の異な
るプラスミドｐＡＣＥ７０１およびｐＡＣＥ７０２を構
築することができる。これらのプラスミドは選択マーカ
ーとしてアンピシリン耐性遺伝子を有するランナウエイ
プラスミドベクターである。

【００４９】こうして得られたプラスミドｐＡＣＥ６０
１、ｐＡＣＥ７０１およびｐＡＣＥ７０２を使用した場
合の目的遺伝子の発現制御の能力は上記同様にβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として調べるこ
とができる。プラスミドｐＭＳ４３４［ジーン（Gene）
第57巻、第89〜99頁（1987））］を鋳型とし、プライマ
ーｔｒｐＡ−Ｎ−ＮｃｏＩ、およびプライマーｌａｃＺ
−Ｃ−ＮｃｏＩを用いたＰＣＲによって増幅されるβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、上記の３
つのプラスミドそれぞれのＳＰ６プロモーター下流に存
在するＮｃｏＩサイトに導入したモデル発現プラスミド
を構築することができる。プライマーｔｒｐＡ−Ｎ−Ｎ
ｃｏＩ、およびプライマーｌａｃＺ−Ｃ−ＮｃｏＩの塩
基配列をそれぞれ配列表の配列番号：９および配列番
号：１０に示す。こうして得られたプラスミドはそれぞ
れプラスミドｐＡＣＥ６０１Ｚ、ｐＡＣＥ７０１Ｚおよ
びｐＡＣＥ７０２Ｚと命名されている。これらのモデル
発現プラスミドで形質転換された大腸菌ではβ−ガラク
トシダーゼ活性は全く検出されず、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現が極めて厳格に制御されていることが示
される。

【００５０】本発明のプラスミドを用いて、宿主に対し
その発現産物が致死的に働く遺伝子を単離し、さらに該
遺伝子を発現させることが可能なことをＮｓｐ7524 III
制限酵素遺伝子を用いて確かめることができる。プラス
ミドｐＢＲＮ３はＮｓｐ7524III制限修飾系遺伝子を含
有しており、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＭＣ
１０６１は Escherichia coli ＭＣ１０６１／ｐＢＲＮ
３と命名、表示され、平成７年９月２８日（原寄託日）
より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あ
て名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番
号３０５）〕に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４１とし
て寄託されている。該形質転換体より調製したプラスミ
ドｐＢＲＮ３を鋳型とし、プライマーＬ−ＯＲＦ、およ
びプライマーＮｓｐＲ−ＯＲＦ３を対としたＰＣＲによ
るＤＮＡ増幅反応により、Ｎｓｐ7524 III制限酵素遺伝
子のみを含むＤＮＡ断片を取得することができる。配列
表の配列番号：１１および配列番号：１２にプライマー
Ｌ−ＯＲＦ、およびプライマーＮｓｐＲ−ＯＲＦ３の塩
基配列を示す。得られたＤＮＡ断片を上記のプラスミド
ｐＡＣＥ６０１のＳＰ６プロモーター下流のＮｃｏＩサ
イトに挿入して得られるプラスミドｐＡＣＥ６０１−Ｎ
ｓｐ IIIを大腸菌ＨＢ１０１に導入することにより形質
転換体 Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＡＣＥ６０１
- Ｎｓｐ IIIを得ることができる。該形質転換体はＮｓ
ｐ7524 III修飾酵素遺伝子が共存しないにもかかわらず
Ｎｓｐ7524 III制限酵素遺伝子を、宿主に安定に保持さ
せることが可能である。

【００５１】さらに該形質転換体に上記のシステムプラ
スミドｐＦＳＰ６を導入した形質転換体 Escherichia c
oli ＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１- Ｎｓｐ
IIIを作製することができる。該形質転換体を培養し、
その適当な時期にＩＰＴＧを添加して発現誘導を行うこ
とにより培養物中でＮｓｐ7524 III制限酵素が産生可能
なことを確認できる。

【００５２】本発明の第３の発明は、上記プラスミドベ
クターを用いることを特徴とする、目的遺伝子の単離方
法を提供する。本発明の単離方法は、宿主に対しその発
現産物が致死的あるいは有害な遺伝子、特に制限酵素遺
伝子の単離に好適に適用される。本法を用いることによ
り、これまで単離されていない制限酵素遺伝子、例えば
ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子を、ＡｃｃIII 修飾酵素遺伝
子非存在下でも単離することが可能となる。制限酵素遺
伝子の単離は、目的酵素産生菌のゲノムＤＮＡを適当な
制限酵素により断片化し、得られたＤＮＡ断片を直接、
例えばプラスミドｐＡＣＥ６１１に組み込むことによ
る、いわゆる「ショットガン方法」のほか、例えば制限
酵素産生菌のゲノムＤＮＡのカセットライブラリーを利
用し実施することも可能である。カセットライブラリー
を鋳型とし、ＤＮＡ増幅法により遺伝子を獲得すること
により、宿主と転写機構の異なる微生物より調製した遺
伝子も発現させることが可能になる。以下、カセットラ
イブラリーを利用した制限酵素遺伝子の単離方法につい
て、ＡｃｃIII 制限酵素を例として述べる。

【００５３】ＡｃｃIII 制限酵素産生菌、すなわちＡｃ
ｃ菌のゲノムＤＮＡのカセットライブラリーは、以下の
ように作製できる。即ち、Ａｃｃ菌を培養して得られる
菌体よりゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で消化
した後、得られたＤＮＡ断片と相補的な突出末端を持つ
カセットとを連結する。ゲノムＤＮＡ切断に使用する制
限酵素の種類を変え、同様のカセットライブラリーを数
種作製する。これらを合わせてＡｃｃゲノムカセットラ
イブラリーと呼ぶことにした。次に、Ａｃｃ菌より目的
制限酵素タンパク質を精製し、そのアミノ酸配列の一部
を決定し、この配列に基づいてプライマーを合成する。
このプライマーとカセットプライマーを用いて、個々の
カセットライブラリーを鋳型としたＰＣＲによるＤＮＡ
増幅反応を行い、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子断片を含む
ＤＮＡ断片を取得する。得られたＤＮＡ断片の塩基配列
を、例えば、ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンシング
により決定し、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子全長の塩基配
列を決定する。

【００５４】該塩基配列よりＡｃｃIII 制限酵素遺伝子
全長を増幅することが可能なプライマーを設計し、Ａｃ
ｃ菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによるＤＮＡ増
幅反応によりＡｃｃIII 制限酵素遺伝子全長を含むＤＮ
Ａ断片を取得する。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐ
ＡＣＥ６１１のＳＰ６プロモーターの下流にコドンフレ
ームが合うように挿入して得られる組み換えプラスミド
を、例えば、大腸菌ＪＭ１０９に導入することにより形
質転換体を得る。ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子が発現可能
な状態にある形質転換体の選択は、各形質転換体を培養
し、更に本発明の遺伝子発現方法によって遺伝子発現誘
導を行い、得られた各培養物中のＡｃｃIII 制限酵素活
性を確認するほか、例えば、各形質転換体に保持されて
いるプラスミドＤＮＡの制限酵素地図を作成することに
より実施することができる。

【００５５】実際、このようにして得られたＡｃｃIII
制限酵素遺伝子をプラスミドｐＡＣＥ６１１に挿入し、
得られたプラスミドはｐＣＲＡ１９と命名されている。
図７にその制限酵素地図を示す。図中、太い実線がＡｃ
ｃIII 制限酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片である。プラス
ミドｐＣＲＡ１９を導入した大腸菌ＪＭ１０９は Esche
richia coli JM109 / pCRA19と命名され、平成８年５月
２８日（原寄託日）により通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１
丁目１番３号（郵便番号３０５）〕に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７４３として寄託されている。該形質転換体
はＡｃｃIII 修飾酵素遺伝子が共存しないにもかかわら
ず、制限酵素遺伝子を安定に保持している。上記の方法
により、制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子の
共存を必要とせず、制限酵素遺伝子を単離することがで
きる。

【００５６】本発明の第４の発明はＡｃｃIII 制限酵素
活性を有するポリペプチドを提供する。

【００５７】本明細書において、ＡｃｃIII 制限酵素活
性を有するポリペプチドの総称としてＡｃｃIII 制限酵
素なる用語を使用する場合がある。本発明のＡｃｃIII
制限酵素は、例えば配列表の配列番号：１に記載のアミ
ノ酸配列からなる。

【００５８】また、本発明のＡｃｃIII 制限酵素は、前
記のものに限定されることはなく、配列表の配列番号：
１に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペ
プチドであって、ＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリ
ペプチドをも含むものであり、さらに配列表の配列番
号：１に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸
配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、
付加、挿入又は置換の少なくとも一つがされており、か
つＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチドも本発
明の範囲内である。

【００５９】一般に天然に存在するタンパク質にはそれ
をコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のタンパ
ク質の生体内および精製中の修飾反応などによってその
アミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、挿入、付加、置
換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を
有しないタンパク質と実質的に同等の生理学的活性、生
物学的活性を示すものがあることが知られている。この
ように構造的に差異があってもその機能や活性について
は大きな違いが認められないものは、本発明の範囲内で
ある。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のよう
な変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさら
に多種多様の変異体を作製することが可能である。たと
えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在す
るメチオニン残基は多くの場合メチオニンアミノペプチ
ダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパ
ク質の種類によってはその除去が完全には行われず、メ
チオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成さ
れる。しかしこのメチオニン残基の有無はタンパク質の
活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインタ
ーロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中のあるシス
テイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインター
ロイキン２活性を保持することが知られている［サイエ
ンス（Science)、第２２４巻、１４３１頁（１９８
４）］。

【００６０】さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産
を行う際には融合タンパク質として発現させることがし
ばしば行われる。たとえば目的タンパク質の発現量を増
加させるためにＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペ
プチド鎖を付加したり、目的タンパク質のＮ末端、ある
いはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、こ
のペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより
目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われて
いる。したがって本発明のＡｃｃIII 制限酵素とは一部
異なったアミノ酸配列を有するポリペプチドであって
も、それが本発明のＡｃｃIII 制限酵素と本質的に同等
の活性を示す限りにおいて、本発明の範囲内に属するも
のである。

【００６１】ＡｃｃIII 制限酵素を得る方法としては、
例えば、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子を含有する、上記形
質転換体 Escherichia coli JM109 / pCRA19を培養し、
その適当な時期に誘導剤のＩＰＴＧを添加し pCRA19 コ
ピー数を増加させた後、ファージＭ１３ｓｐ６を感染さ
せることにより、その目的を達成することができる。

【００６２】形質転換体の培養物からＡｃｃIII 制限酵
素を採取するにあたっては、たとえば培養物より菌体を
集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出
し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグ
ラフィー法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー法等を組み合わせて精製すればよい。この精製におい
て出発原料となる上記培養物は、ＡｃｃＩ、ＡｃｃIIと
いった他の制限酵素を含まないため、従来の精製方法と
比べて容易に必要な純度の酵素標品を得ることができ
る。

【００６３】本発明の第５の発明はＡｃｃIII 制限酵素
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供す
る。

【００６４】本発明のＡｃｃIII 制限酵素活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡは、配列表の配列番
号：１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからな
るものであり、例えば配列表の配列番号：２に記載の塩
基配列からなるＤＮＡが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。即ち、配列表の配列番号：１に記
載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド
であって、ＡｃｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号：２で示さ
れるＤＮＡの全部、又はその一部を含むＤＮＡであっ
て、該ＤＮＡの発現産物がＡｃｃIII 制限酵素活性を示
すＤＮＡ、配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配
列又はその一部のアミノ酸配列において、１個もしくは
複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入もしくは置換の
少なくとも一つがされており、かつＡｃｃIII 制限酵素
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、上記
〜に記載のＤＮＡにハイブリダイズ可能な、Ａｃｃ
III 制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ、等も本発明の範囲内である。

【００６５】また、上記で得られたＤＮＡをプローブと
して厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、
得られたＤＮＡ（配列表の配列番号：２）と配列は少し
異なるが、同様な酵素活性を持つポリペプチドをコード
する類似のＤＮＡを得ることができ、これも本発明の範
囲内のものである。

【００６６】かかる厳密な条件下とは、例えば、ＤＮＡ
を固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩
化ナトリウム８．７６g 、クエン酸ナトリウム４．４１
g を１リットルの水に溶かしたもの）、１％ ＳＤＳ、
１００μg ／mlサケ精子ＤＮＡ、０．１％ ウシ血清ア
ルブミン、０．１％ ポリビニルピロリドン、０．１％
フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プロー
ブとともに保温してハイブリダイゼーションを行うこと
をいう。

【００６７】ＡｃｃIII 制限酵素をコードする類似のＤ
ＮＡをハイブリダイゼーションにより得る方法として
は、たとえば以下の方法があげられる。

【００６８】まず、適当な遺伝子源から得たＤＮＡを常
法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してＤ
ＮＡライブラリーを作製する。このライブラリーを適当
な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培
養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロ
ースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にＤＮＡ
を膜に固定する。この膜をあらかじめ³²Ｐ等で標識した
プローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番
号：１に記載したアミノ酸配列の全部または一部をコー
ドするポリヌクレオチドであればよく、たとえば配列表
の配列番号：２に記載の塩基配列の全部または一部から
なるまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用すること
ができる）を含む上記の組成の溶液中、上記の条件で保
温し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼ
ーション終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流
し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブ
リッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイ
ブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。こう
して得られたクローンの中には、目的の酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡが保持されている。

【００６９】得られたＤＮＡは、たとえば次のようにし
てその塩基配列を決定し、それが目的の酵素タンパク質
をコードするＤＮＡであるかを確認する。

【００７０】塩基配列の決定は、プラスミドベクターを
用いて作成された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒ
ア・コリであれば試験管等で培養を行い、常法に従って
プラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま
鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してＭ１３フ
ァージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオ
キシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで
作成された形質転換体の場合も基本的に同様な操作によ
り塩基配列を決定することができる。

【００７１】これら培養から塩基配列決定までの基本的
な実験法については、例えば、ティ・マニアティス（T.
Maniatis）らのモレキュラー・クローニング・ア・ラボ
ラトリー・マニュアル（Molecular Cloning : A Labora
tory Manual 、１９８２年、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー発行）等に記載されている。

【００７２】得られたＤＮＡが目的のＡｃｃIII 制限酵
素をコードする類似のＤＮＡであるかどうかの確認は、
決定された塩基配列を配列表の配列番号：２に記載した
塩基配列と比較して、あるいは決定された塩基配列より
推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号：１に記載
したアミノ酸配列と比較して行うことができる。

【００７３】得られたＤＮＡが目的の制限酵素をコード
する領域の全てを含まない場合には、得られたＤＮＡの
塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用い
たＰＣＲによって足りない領域を増幅したり、あるいは
得られたＤＮＡの断片をプローブとしてＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード
領域を得ることができる。

【００７４】こうして得られたＡｃｃIII 制限酵素をコ
ードする類似のＤＮＡを含有する形質転換体を作成して
該ＤＮＡにコードされる酵素タンパク質を発現させ、さ
らに発現された酵素タンパク質を精製することができ
る。形質転換体の作成、酵素タンパク質の発現、精製は
いずれも本発明のプラスミドを使用することにより、実
施することができる。こうして得られた酵素タンパク質
はＡｃｃIII 制限酵素活性を保持している。

【００７５】なお、従来得られていないＡｃｃIII 修飾
酵素及び該酵素をコードするＤＮＡも、上記のＡｃｃII
I 制限酵素をコードするＤＮＡを利用することにより得
ることができる。例えば、多くの場合に制限酵素遺伝子
と修飾酵素遺伝子とが接近して存在することを利用し、
制限酵素遺伝子近傍のタンパク質をコードする遺伝子領
域を、カセットライブラリーを鋳型としたＤＮＡ増幅反
応により得、適当な発現ベクターに組み込み、遺伝子発
現を行い、ＡｃｃIII 修飾酵素活性を適当な方法で確認
することにより実施できる。ＡｃｃIII 修飾酵素活性
は、例えば該形質転換体より調製したＤＮＡが、Ａｃｃ
III 制限酵素の切断活性に対する耐性を示すことによ
り、確認することもできる。なお、上記遺伝子領域の塩
基配列を決定し、既知の制限修飾系の修飾酵素遺伝子間
の保存領域［ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー(J.Mol.Biol.) 第２０６巻 第３０５〜３２１頁
（１９８９）］とのホモロジーが確認できれば、遺伝子
発現を行う前に、ある程度修飾酵素遺伝子であるとの予
測を立てることができる。

【００７６】このようにして、Ａｃｃ菌のゲノムＤＮＡ
のカセットライブラリーを利用することにより、Ａｃｃ
III 修飾酵素及び該酵素をコードするＤＮＡを得ること
ができる。配列表の配列番号：１３にアミノ酸配列を、
配列番号：１４に塩基配列を示す。

【００７７】また、本発明におけるＡｃｃIII 修飾酵素
は前記のものに限定されることはなく、ＡｃｃIII 制限
酵素の項で述べたように、配列表の配列番号：１３に記
載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチド
であって、ＡｃｃIII 修飾酵素活性を有するポリペプチ
ドをも含むものであり、さらに配列表の配列番号：１３
に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列に
おいて１もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿
入又は置換の少なくとも一つがされており、かつＡｃｃ
III 修飾酵素活性を有するポリペプチドも本発明の範囲
内である。

【００７８】本発明におけるＡｃｃIII 修飾酵素をコー
ドするＤＮＡは、配列表の配列番号：１３に記載のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡからなるものであり、例え
ば配列表の配列番号：１４に記載の塩基配列からなるＤ
ＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。すなわち、配列表の配列番号：１３に記載のアミ
ノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドであっ
て、ＡｃｃIII 修飾酵素活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、配列表の配列番号：１４で示される
ＤＮＡの全部、又はその一部を含むＤＮＡであって、該
ＤＮＡの発現産物がＡｃｃIII 修飾酵素活性を示すＤＮ
Ａ、配列表の配列番号：１３に記載のアミノ酸配列又
はその一部のアミノ酸配列において、１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも
一つがされており、かつＡｃｃIII 修飾酵素活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ、上記〜に記
載のＤＮＡにハイブリダイズ可能な、ＡｃｃIII 修飾酵
素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、など
も本発明の範囲内である。

【００７９】

【実施例】以下に参考例および実施例をあげて本発明を
さらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに
限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作
のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的
な操作については１９８９年、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（T. M
aniatis ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア
ラボラトリー マニュアル第２版（Molecular Cloning
: A Laboratory Manual 2nd ed. ）に記載の方法によ
った。

【００８０】参考例 （１）培地及び培養条件 大腸菌はＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０. ５
％、ＮａＣｌ０. ５％、ｐＨ７. ０）を用いて３７℃で
好気的に培養した。抗生物質は大腸菌が保持しているプ
ラスミドに合わせて以下の濃度で培地に添加した。ｐＦ
ＳＰ６：２５μg ／mlのカナマイシン、ｐＸＸ３２５：
２０μg ／mlのアンピシリン、アンピシリン耐性Ｃｏｌ
Ｅ１タイププラスミド：５０μg ／mlのアンピシリン、
アンピシリン耐性ｐＵＣタイププラスミド：１００μg
／mlのアンピシリン。発現誘導実験では、定常期まで培
養した培養液を新鮮な培地に１％植菌した後、３７℃で
好気的に培養し、ＯＤ₆₀₀ ＝０. ６（６×１０⁸ cell／
ml）に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０. ２mMになるように
添加し、さらに培養を続けた。

【００８１】（２）システムプラスミドｐＦＳＰ６の構
築 システムプラスミドｐＦＳＰ６は大腸菌ＪＭ１０９を宿
主とし、図８に示した手順で構築した。プラスミドｐＳ
Ｐ６−２［ヌクレイック アシッズ リサーチ（ Nucl.
Acids Res. ）第15巻、第2653〜2664頁（1987）］をＨ
ｉｎｄIII （宝酒造社製）で消化し、末端を平滑化した
後、さらにＢａｍＨＩ（宝酒造社製）消化して得られる
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む約２. ８kbのＤ
ＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃII（宝酒造社製）
で消化したプラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社
製）と混合してライゲーションを行い、プラスミドｐＵ
ＣＳＰを構築した。次にプラスミドｐＭＪＲ１５６０
［ジーン（Gene）第51巻、第225 〜267 頁（1987）］を
ＫｐｎＩで消化し、末端を平滑化した後、更にＰｓｔＩ
（宝酒造社製）消化して得られるｌａｃＩq 遺伝子を含
む約１. ３kbのＤＮＡ断片を単離した。上記のプラスミ
ドｐＵＣＳＰをＨｉｎｄIII で消化し、末端を平滑化し
た後、さらにＰｓｔＩで消化し、これと上記の約１．３
ｋｂのＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、
プラスミドｐＵＣＳＰｌａｃを構築した。

【００８２】さらにｐＵＣＫｍ［ジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー（ J. Mol. Biol.）、第 147
巻、第217 〜226 頁（1981）］をＰｓｔＩ消化して得ら
れる、カナマイシン耐性遺伝子を含む約１. ５kbのＤＮ
Ａ断片を上記のプラスミドｐＵＣＳＰｌａｃのＰｓｔＩ
サイトに導入してプラスミドｐＵＣＳＰｌａｃＫｍを構
築した。該プラスミドをＡａｔII（東洋紡社製）消化し
た後にＮｓｐＩ（宝酒造社製）で部分消化を行って約
６. ５kbのＤＮＡ断片を単離し、さらにその両末端を平
滑化した。

【００８３】一方、プラスミドｐＸＸ３２５［プロシー
ディングス オブ ザ ナショナルアカデミー オブ
サイエンス オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sc
i.USA）、第 80 巻、第4784〜4788頁（1983）］をＨｉ
ｎｄIII で消化し、末端を平滑化した後、さらにＳａｌ
Ｉ消化してminiＦプラスミドの複製起点を含む約６. ８
kbのＤＮＡ断片を単離し、これを上記の約６. ５kbのＤ
ＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、プラスミド
ｐＦＳＰ６を構築した。また、該プラスミドで大腸菌Ｈ
Ｂ１０１を形質転換し、Escherichia coli ＨＢ１０１
／ｐＦＳＰ６を作製した。

【００８４】（３）マルチコピーのモデル発現プラスミ
ドの構築 ＳＰ６プロモーターの最小領域を含む２本鎖オリゴヌク
レオチドであるＰ_SP6リンカーを配列表の配列番号：１
５および配列番号：１６に塩基配列を示した２つのＤＮ
Ａ鎖から作製し、これとＸｈｏＩ（宝酒造社製）および
ＨｉｎｄIII で消化したプラスミドｐＭＳ４３４［ジー
ン（Gene）第57巻、第89〜99頁（1987）］を混合してラ
イゲーションを行い、該プラスミド上のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子上流に上記のプロモーター配列が挿入され
たモデル発現プラスミドｐＭＳＰ６Ｌを構築した（図
１）。

【００８５】一方、ｐＳＰ６４［ヌクレイック アシッ
ズ リサーチ（ Nucl. Acids Res.）第12巻、第7035〜7
056頁（1984）］をＡｃｃIIおよびＨｉｎｄIII 消化し
て得られるネイティブなＳＰ６プロモーター配列を含む
ＤＮＡ断片を上記のプラスミドｐＭＳ４３４のＸｈｏＩ
- ＨｉｎｄIII サイト間に挿入することによりモデル発
現プラスミドｐＭＳＰ６Ｆを構築した（図１）。さらに
ＳＰ６プロモーターの最小領域とｌａｃオペレーター領
域とを含むＰ_SP6 −Ｏ_lac リンカーを配列表の配列番
号：１７及び配列番号：１８に塩基配列を示した２つの
ＤＮＡ鎖から作製し、これを上記のプラスミドｐＭＳ４
３４のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII サイト間に挿入すること
によりモデル発現プラスミドｐＭＳＰ６Ｏを構築した
（図２）。

【００８６】（４）ＳＰ６プロモーターの大腸菌のＲＮ
Ａポリメラーゼに対するプロモーター活性 参考例（３）で構築されたプラスミドｐＭＳＰ６Ｌ、ｐ
ＭＳＰ６Ｆ、および対照としてＳＰ６プロモーター配列
を含まないプラスミドｐＭＳ４３４を表１に示す大腸菌
に導入し、得られた形質転換体を参考例（１）に示した
方法で培養後、それぞれの菌体の培養液を対数増殖期に
採取し、採取した培養液の一部でＯＤ_{60 0} を測定し、残
りは予め冷やしておいた試験管に移して最終濃度が１０
０mg／mlになるようにクロラムフェニコールを添加し
た。この培養液を試料として１９７２年、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｊ. Ｈ. ミラ
ー（J.H.Miller）著、エクスペリメンツ イン モレキ
ュラー ジェネティクス（Experiments in Molecular G
enetics ）に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼ活性の
測定を行った。

【００８７】表２に示されるように、ＳＰ６プロモータ
ーを含む配列が挿入されたモデル発現プラスミドｐＭＳ
Ｐ６Ｌ、あるいはｐＭＳＰ６Ｆを導入された大腸菌ＭＣ
４１００は、挿入されたプロモーター配列に関係なく、
同レベルの低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。し
かし、ＳＰ６プロモーターを含まないプラスミドｐＭＳ
４３４を導入されたものではこれよりも低い酵素活性し
か認められなかった。さらに大腸菌ＭＲｉ７、ＭＲｉ８
０を宿主として検討した結果、プラスミドのコピー数が
減少するＭＲｉ８０ではβ−ガラクトシダーゼ活性も低
下した。

【００８８】（５）システムプラスミドｐＦＳＰ６の評
価 参考例（４）で作製した各形質転換体にシステムプラス
ミドｐＦＳＰ６を導入したうえ参考例（１）に示した方
法で培養し、ＩＰＴＧ添加前後の非誘導状態と誘導状態
のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してその結果を表３
に示した。各形質転換体とも非誘導状態におけるβ−ガ
ラクトシダーゼ活性は表２に示されたプラスミドｐＦＳ
Ｐ６を導入されていない場合と同程度の値であった。

【００８９】一方、ＩＰＴＧ添加による誘導を行うと、
プラスミドｐＭＳＰ６Ｌ、およびｐＭＳＰ６Ｆを導入さ
れたものでは非誘導状態と比較して１８〜３２倍のβ−
ガラクトシダーゼ活性が認められたのに対し、プラスミ
ドｐＭＳ４３４を導入されたものでは活性の上昇は見ら
れなかった。

【００９０】（６）ｌａｃオペレーター配列の発現制御
への効果 プラスミドｐＦＳＰ６を導入された大腸菌ＭＣ４１００
にプラスミドｐＭＳＰ６Ｌ、ｐＭＳＰ６Ｆ、ｐＭＳＰ６
Ｏ、およびｐＭＳ４３４をそれぞれ導入して得られる形
質転換体を参考例（１）に示した方法で培養し、非誘導
状態におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。そ
の結果を表４に示す。ｌａｃオペレーター配列を含むプ
ラスミドｐＭＳＰ６Ｏを導入されたものではプラスミド
ｐＭＳＰ６Ｌ、ｐＭＳＰ６Ｆに比べてβ−ガラクトシダ
ーゼ活性が低くおさえられているが、なおわずかな活性
の発現が見られた。つまり、ｌａｃオペレーター配列の
導入だけでは完全に非誘導状態での発現を止めることは
できなかった。

【００９１】

【表４】

【００９２】実施例１ （１）培地及び培養条件 大腸菌はＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０. ５
％、ＮａＣｌ０. ５％、ｐＨ７. ０）を用いて３７℃で
好気的に培養した。抗生物質は大腸菌が保持しているプ
ラスミドに合わせて以下の濃度で培地に添加した。ｐＦ
ＳＰ６：２５μg ／mlのカナマイシン、アンピシリン耐
性ＣｏｌＥ１タイププラスミド：５０μg ／mlのアンピ
シリン、アンピシリン耐性ｐＵＣタイププラスミド：１
００μg／mlのアンピシリン、クロラムフェニコール耐
性ランナウエイプラスミド：３０μg ／mlのクロラムフ
ェニコール、アンピシリン耐性ランナウエイプラスミ
ド：３０μg ／mlのアンピシリン。発現誘導実験では、
定常期まで培養した培養液を新鮮な培地に１％植菌した
後３７℃で好気的に培養し、ＯＤ₆₀₀=０. ６（６×１０
⁸ cell／ml）に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０. ２mMにな
るように添加し、さらに培養を続けた。

【００９３】（２）ランナウエイプラスミドｐＨＳ２８
７０の構築 発現プラスミド構築の基になったランナウエイプラスミ
ドｐＨＳ２８７０の構築を図３に示す操作で行った。配
列表の配列番号：３および配列番号：４に塩基配列を示
した２つのＤＮＡ鎖から作製された１０６ＮｄｅＩＤＮ
Ａ断片をＮｄｅＩ消化したプラスミドベクターｐＵＣ１
９と混合してライゲーションを行った。こうして得られ
たプラスミドｐＵＣ１０６ＡをＰｖｕII消化し、セルフ
ライゲーションを行ってプラスミドｐＵＣ１０６ＡｄＰ
Ｏを得た。次いで、このプラスミドｐＵＣ１０６ＡｄＰ
Ｏを鋳型とし、ＲＮＡIIＡプライマー（配列表の配列番
号：５にＲＮＡIIＡプライマーの塩基配列を示す）と18
70プライマー（配列表の配列番号：６に1870プライマー
の塩基配列を示す）を用いたＰＣＲによって得られる増
幅ＤＮＡ断片をＸｂａＩ消化した後、ＸｂａＩ消化した
プラスミドｐＳＴＶ２８と混合してライゲーションを行
なってプラスミドｐＨＳ２８７０を得た。図４にプラス
ミドｐＨＳ２８７０の構成を示す。

【００９４】（３）ランナウエイプラスミドｐＣＲＳ０
４の構築 上記のプラスミドｐＨＳ２８７０をＡｃｃＩ（宝酒造社
製）およびＮｓｐＩで消化した後、末端を平滑化してセ
ルフライゲーションしてＰ１５Ａ複製起点を除いたプラ
スミドｐＣＲＳ０１を得た。次に該プラスミドをＥｃｏ
ＲＩ（宝酒造社製）およびＸｂａＩで消化した後、上記
同様に末端を平滑化してセルフライゲーションを行いプ
ラスミドｐＣＲＳ０２を構築した。さらにプラスミドｐ
ＭＪＲ１５６０をＫｐｎＩ（宝酒造社製）およびＰｓｔ
Ｉで消化して得られる約１．２kbのＤＮＡ断片の末端を
平滑化した後、上記のプラスミドｐＣＲＳ０２をＮｓｐ
ＶおよびＶｓｐＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後に
末端を平滑化したものと混合してライゲーションを行な
い、プラスミドｐＣＲＳ０４を得た。プラスミドｐＣＲ
Ｓ０４構築の過程を図５に、またプラスミドｐＣＲＳ０
４の構成を図６に示す。

【００９５】（４）ランナウエイ発現ベクターｐＡＣＥ
６０１の構築 ＮｈｅＩ（宝酒造社製）消化した後に末端を平滑化した
上記のプラスミドｐＣＲＳ０４と、配列表の配列番号：
７および配列番号：８に塩基配列を示した２つのＤＮＡ
鎖から作製されたＰ_SP6 −Ｏ_lac ＥＸリンカーとを混合
してライゲーションを行ない、プラスミドｐＡＣＥ６０
１を構築した。図９にプラスミドｐＡＣＥ６０１の構築
の過程を示す。なお、これらのプラスミドの構築は大腸
菌ＪＭ１０９を宿主として行った。

【００９６】（５）ランナウエイ発現ベクターｐＡＣＥ
６１１の構築 ランナウエイ発現ベクターｐＡＣＥ６０１をＸｈｏＩ−
ＨｉｎｄIII で消化し、そのサイトに配列番号：１５、
配列番号：１６に記載の合成オリゴＤＮＡからなるＰ
_sp6 リンカーを挿入して、ランナウエイ発現ベクターｐ
ＡＣＥ６１１の構築を行った。図１０にｐＡＣＥ６１１
の構成を示す。また、図１１にプラスミドｐＡＣＥ６１
１の構築の過程を示す。

【００９７】（６）ランナウエイ発現ベクターｐＡＣＥ
７０１およびｐＡＣＥ７０２の構築 プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造社製）をＢｓ
ｐＨＩ（ＮＥＢ社製）で消化して得られる約１kbのＤＮ
Ａ断片の末端を平滑化し、ＮｈｅＩ消化した後に末端を
平滑化した上記のプラスミドｐＣＲＳ０４と混合してラ
イゲーションを行ない、プラスミドｐＣＲＳ７０を構築
した。図１２にプラスミドｐＣＲＳ７０の構築の過程を
示す。次に該プラスミドをＮｃｏＩ（宝酒造社製）、お
よびＢｓａＡＩ（ＮＥＢ社製）で消化した後に末端を平
滑化したうえ、上記のＰ_SP6 −Ｏ _lac ＥＸリンカーと混
合してライゲーションを行ない、該リンカーの挿入方向
の異なる２種のプラスミドｐＡＣＥ７０１、およびｐＡ
ＣＥ７０２を構築した。図１３にプラスミドｐＡＣＥ７
０１、およびｐＡＣＥ７０２の構築の過程を示す。な
お、これらのプラスミドの構築は大腸菌ＪＭ１０９を宿
主として行った。

【００９８】（７）モデルランナウエイ発現プラスミド
の構築 上記のプラスミドｐＭＳ４３４を鋳型とし、プライマー
ｔｒｐＡ−Ｎ−ＮｃｏＩ、およびプライマーｌａｃＺ−
Ｃ−ＮｃｏＩを用いたＰＣＲを行い、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。プライマーｔｒｐ
Ａ−Ｎ−ＮｃｏＩ、およびプライマーｌａｃＺ−Ｃ−Ｎ
ｃｏＩの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：９およ
び配列番号：１０に示す。該断片をＮｃｏＩで消化した
後、上記のプラスミドｐＡＣＥ６０１、ｐＡＣＥ７０
１、およびｐＡＣＥ７０２をＮｃｏＩで消化したものそ
れぞれと混合してライゲーションを行ない、Ｐ_SP6 −Ｏ
_lac配列下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入され
たモデルランナウエイ発現プラスミドｐＡＣＥ６０１
Ｚ、ｐＡＣＥ７０１Ｚ、およびｐＡＣＥ７０２Ｚを得
た。なお、これらのプラスミドの構築は大腸菌ＪＭ１０
９を宿主として行った。

【００９９】（８）ランナウエイ発現プラスミドの非誘
導状態での発現レベルの評価 上記のシステムプラスミドｐＦＳＰ６を導入された大腸
菌ＭＣ４１００（以下ＭＣ４１００／ｐＦＳＰ６と略
す）に上記のモデルランナウエイ発現プラスミドｐＡＣ
Ｅ６０１Ｚ、ｐＡＣＥ７０１Ｚ、およびｐＡＣＥ７０２
Ｚを導入して得られる形質転換体ＭＣ４１００／ｐＦＳ
Ｐ６／ｐＡＣＥ６０１Ｚ、ＭＣ４１００／ｐＦＳＰ６／
ｐＡＣＥ７０１Ｚ、およびＭＣ４１００／ｐＦＳＰ６／
ｐＡＣＥ７０２Ｚを実施例（１）に示した条件で培養
し、対数増殖期に採取した培養液について参考例（４）
に示した方法でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
その結果、いずれの形質転換体においてもβ−ガラクト
シダーゼ活性は検出限界以下であり、参考例（４）に示
したマルチコピープラスミドを用いた場合に比べて顕著
な発現抑制効果が見られた。

【０１００】（９）Ｎｓｐ7524III 制限酵素遺伝子発現
プラスミドの構築 Ｎｓｐ7524III 制限修飾系遺伝子を含有するプラスミド
ｐＢＲＮ３を Escherichia coli ＭＣ１０６１／ｐＢＲ
Ｎ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４１）より調製し、これを
鋳型としてプライマーＬ−ＯＲＦ、およびプライマーＮ
ｓｐＲ−ＯＲＦ３を用いたＰＣＲを行い、Ｎｓｐ7524II
I 制限酵素遺伝子のみを含む約１kbのＤＮＡ断片を得
た。配列表の配列番号：１１および配列番号：１２にプ
ライマーＬ−ＯＲＦ、およびプライマーＮｓｐＲ−ＯＲ
Ｆ３の塩基配列を示す。該断片をＮｃｏＩで消化した
後、上記のプラスミドｐＡＣＥ６０１をＮｃｏＩで消化
したものと混合してライゲーションを行ない、Ｐ_SP6 −
Ｏ_lac 配列下流にＮｓｐ7524III 制限酵素遺伝子のみを
導入されたプラスミドｐＡＣＥ６０１- ＮｓｐIII を構
築した。該プラスミドは、Ｎｓｐ7524III 修飾酵素遺伝
子を共存させていない大腸菌ＪＭ１０９に安定に保持さ
れた。

【０１０１】（１０）Ｎｓｐ7524III 制限酵素遺伝子の
発現システムの構築 上記のシステムプラスミドｐＦＳＰ６を導入された大腸
菌ＨＢ１０１（以下ＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６と略す）に
Ｎｓｐ7524III 制限酵素遺伝子を含む上記のプラスミド
ｐＡＣＥ６０１- ＮｓｐIII 、及び対照として用いるプ
ラスミドｐＡＣＥ６０１をそれぞれ導入して得られる形
質転換体ＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１- Ｎ
ｓｐIII 、およびＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６
０１をＬＢ培地で定常期まで培養し、この培養液を新鮮
な培地２本に１％ずつ植菌して３７℃で好気的に培養
し、生育がＯＤ₆₀₀ ＝０．６に達した時点でその一方に
ＩＰＴＧを最終濃度が０. ２mMになるように添加し、さ
らに培養終了後、集菌した菌体を破砕用緩衝液Ａ（２０
mM トリス−塩酸、ｐＨ７. ５、１０ mM ２−メルカプ
トエタノール）に懸濁して超音波破砕した後、遠心分離
して粗抽出液を得た。

【０１０２】この粗抽出液１μl を３０μl の反応液
（１０ mM トリス−塩酸、ｐＨ７. ５、１０mMのＭｇＣ
ｌ₂ 、１mMのＤＴＴ、５０mMのＮａＣｌ、１μg λ−Ｄ
ＮＡ）に加え、３７℃、１時間反応させた後、反応液を
アガロースゲル電気泳動に付してλ−ＤＮＡの分解を調
べ、制限酵素活性を確認した。図１４に示されるように
ＩＰＴＧを添加して発現誘導を行ったＨＢ１０１／ｐＦ
ＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１−ＮｓｐIII のみに制限酵素活
性が認められ、そのλ- ＤＮＡ切断のパターンはＮｓｐ
7524III のアイソシゾマーであるＡｖａＩのものと一致
した。

【０１０３】また、上記のλ−ＤＮＡ消化反応の反応時
間を２時間、３時間まで延長した場合の結果を図１５に
示す。この場合、本実験に使用した粗抽出液には宿主大
腸菌由来のヌクレアーゼが含まれているため、レーン８
〜１０ではＮｓｐ7524III 活性によって生じたＤＮＡ断
片が大腸菌のヌクレアーゼによってさらに分解を受け、
反応時間を延長するにつれてバンドが薄くなり、レーン
１０ではバンドが確認できなくなっている。レーン１１
〜１３ではＮｓｐ7524III が誘導されないため、反応時
間を延長してもＮｓｐ7524III 分解断片が生成せず、λ
−ＤＮＡが直接大腸菌のヌクレアーゼの作用を受けて低
分子化されていることが分かる。なお、ＨＢ１０１／ｐ
ＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１の粗抽出液では制限酵素活性
は検出されなかった。

【０１０４】実施例２ ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子の単離及び発現 （１）ＡｃｃIII 制限酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸
配列の決定及び該アミノ酸配列対応プライマーＤＮＡの
合成 市販のＡｃｃIII 制限酵素（宝酒造社製）約２ｋｕをSe
phacryl S300（ファルマシア社製）カラムを用いたゲル
ろ過に供し、ＡｃｃIII 制限酵素の分子量を測定した。
活性の溶出位置より、ＡｃｃIII 制限酵素の分子量は約
７万であることを確認した。制限酵素タンパク質はダイ
マーであることが多く、従ってＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動でＡｃｃIII 制限酵素タンパク質は分子
量約３万５千の位置に泳動されることが推定された。

【０１０５】次に、ＡｃｃIII 制限酵素タンパク質のＮ
末端アミノ酸配列解析用のサンプルを得るため、市販の
ＡｃｃIII 制限酵素約２ｋｕをタンパク質分子量マーカ
ーとともにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した後、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を移し、タン
パク質位置の確認のために、ブロモフェノールブルーに
よるタンパク質染色をおこなった。１０％酢酸−５０％
メタノールで脱色後、分子量約３万５千のタンパク質が
ブロッティングされたＰＶＤＦ膜の部分を切り取り、プ
ロテイン シークエンサー Ｇ１０００Ａ（ヒューレッ
ト パッカード社製）を用いた自動エドマン分解によ
り、配列表の配列番号：１９で示すＮ末端アミノ酸配列
を決定した。次にこの配列に基づき、カセットプライマ
ーの対として用いる、配列表の配列番号：２０で表され
るＡｃｃIII プライマー１と配列番号：２１で表される
ＡｃｃIII プライマー２を合成した。

【０１０６】（２）Ａｃｃ菌ゲノムＤＮＡの調製 ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Re
search）第１３巻、第８６８５〜８６９４頁（１９８
５）に記載されている喜多らの方法に従いＡｃｃ菌を培
養し、湿菌体を得た。得られた湿菌体２ｇを１０ｍｌの
緩衝液Ｂ［２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
５０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁
し、緩衝液Ｂで２ｍｇ／ｍｌに調製した１ｍｌのリゾチ
ーム溶液を加えて撹拌し、３７℃で２０分静置した。つ
ぎに、当該溶液に２８ｍｌの緩衝液Ｃ［１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］
を加え、撹拌し、さらにＴＥ［１０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ １ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で２０ｍｇ／ｍ
ｌになるように調製した１ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液
と４ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え、撹拌し、３７℃で
１時間静置した。

【０１０７】当該溶液に６ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ水溶液
と６ｍｌの緩衝液Ｄ［１０％ ＣＴＡＢ（セチル トリ
メチル アンモニウム ブロマイド）、０．７Ｍ Ｎａ
Ｃｌ］を加えて撹拌し、６０℃で２０分静置した。当該
溶液をフェノール処理、続いてクロロホルム処理を行い
水層を分取した。これに、ＴＥで１０ｍｇ／ｍｌになる
ように調製したＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）溶液５０μ
ｌを加えて攪拌し、３７℃で４０分静置した。当該溶液
を静置後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い水
層を分取後、これに等量の冷エタノールを加え、析出し
たＤＮＡをガラスキャピラリーで巻き取って回収した。
ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し３ｍｌのＴＥに溶解
させ、約２００μｇのゲノムＤＮＡを得た。

【０１０８】（３）Ａｃｃゲノムカセットライブラリー
の作製 以後の操作は、基本的に、宝酒造社の遺伝子工学ガイド
（１９９５〜１９９６年版）Ｆ１６〜Ｆ１７頁記載の方
法に従い、実施した。

【０１０９】（２）で得られたゲノムＤＮＡを、Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造社製）で完全消化し、得られたＤＮＡ断片
と相補的な突出末端を有するＥｃｏＲＩカセット（宝酒
造社製）を連結しＥｃｏＲＩカセットライブラリーを作
製した。同様にゲノムＤＮＡを制限酵素ＢｇｌII、Ｅｃ
ｏＴ１４Ｉ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＨｉｎｄIII 、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ（以上宝酒造社製）で個別に完
全消化し得られたゲノムＤＮＡ断片と、相補的な突出末
端を有する数種のカセット（宝酒造社製）とを個別に結
合することによりＢｇｌII、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＥｃｏＴ
２２Ｉ、ＨｉｎｄIII 、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ
各カセットライブラリーを作製した。各カセットライブ
ラリーを総称しＡｃｃゲノムカセットライブラリーとし
た。

【０１１０】（４）ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子の解析 （３）で得られたＥｃｏＲＩカセットライブラリーを鋳
型とし、ＡｃｃIII プライマー１とカセットプライマー
Ｃ１（宝酒造社製）をプライマー対として、ＰＣＲによ
るＤＮＡ増幅反応を行った。目的領域を効率よく特異的
に増幅させるために、該反応液の一部を用い、ＡｃｃII
I プライマー２とカセットプライマーＣ２（宝酒造社
製）をプライマー対として、２度目のＰＣＲによるＤＮ
Ａ増幅反応を行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。同様に、Ｂ
ｇｌII、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＨｉｎｄII
I 、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ各カセットライブラ
リーを鋳型として、個別に上記２段階ＰＣＲによるＤＮ
Ａ増幅反応を行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。各増幅ＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動により解析したところ、Ｘ
ｂａＩカセットライブラリー由来の増幅ＤＮＡ断片が、
特に高い増幅効率を示した。

【０１１１】そこで、ＸｂａＩカセットライブラリーを
鋳型とし、ＡｃｃIII プライマー１とカセットプライマ
ーＣ１をプライマー対として、再度、ＰＣＲによるＤＮ
Ａ増幅反応を行った。この反応液をアガロースゲル電気
泳動に供し、約０．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をゲルから
回収した。得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、ＡｃｃIII
プライマー２とカセットプライマーＣ２をプライマー対
として、２度目のＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を行っ
た。得られた約０．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片の塩基配列
を決定したところ、（１）でＮ末端のアミノ酸配列を決
定したタンパク質の一部をコードしていることが明らか
となった。一方、ＡｃｃIII 制限酵素タンパク質の推定
分子量は約３万５千であり、該タンパク質をコードして
いる遺伝子は、約１ｋｂの長さと推定される。従って、
今回塩基配列を一部決定した遺伝子領域において、上記
約０．５ｋｂの塩基配列情報に加え、ＡｃｃIII プライ
マー１及びＡｃｃIII プライマー２がアニーリングした
５’端領域の正確な塩基配列情報及び３’側領域の残り
約０．５ｋｂの塩基配列情報が得られれば、ＡｃｃIII
制限酵素遺伝子の塩基配列を決定できると考えられた。

【０１１２】そこで、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子領域の
正確な５’端領域の塩基配列を確認するために、配列表
の配列番号：２２で表されるＡｃｃIII プライマー３、
配列番号：２３で表されるＡｃｃIII プライマー４を合
成した。次に、（３）で得られたＥｃｏＲＩカセットラ
イブラリーを鋳型とし、ＡｃｃIII プライマー４とカセ
ットプライマーＣ１をプライマー対として、ＰＣＲによ
るＤＮＡ増幅反応を行った。この反応液の一部を用い、
ＡｃｃIII プライマー３とカセットプライマーＣ２をプ
ライマー対として、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を行っ
た。同様に、ＢｇｌII、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＥｃｏＴ２２
Ｉ、ＨｉｎｄIII 、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ各カ
セットライブラリーを鋳型として、個別に上記２段階Ｐ
ＣＲによるＤＮＡ増幅反応を行った。増幅したＤＮＡ断
片のうち最短の、ＥｃｏＴ１４Ｉカセットライブラリー
を鋳型として得られた、約１ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。

【０１１３】さらにＡｃｃIII 制限酵素タンパク質をコ
ードすると推定される遺伝子領域の３’側、約０．５ｋ
ｂを決定するために、配列番号：２４で表されるＡｃｃ
IIIプライマー５と、配列番号：２５で表されるＡｃｃI
II プライマー６を合成した。（３）で得られたＥｃｏ
ＲＩカセットライブラリーを鋳型とし、ＡｃｃIII プラ
イマー５とカセットプライマーＣ１をプライマー対とし
て、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を行った。この反応液
の一部を用い、ＡｃｃIII プライマー６とカセットプラ
イマーＣ２をプライマー対として、ＰＣＲによるＤＮＡ
増幅反応を行った。同様に、ＢｇｌII、ＥｃｏＴ１４
Ｉ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＨｉｎｄIII 、ＰｓｔＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＸｂａＩ各カセットライブラリーを鋳型として、個
別に上記２段階ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を行った。

【０１１４】増幅したＤＮＡ断片のうち、ＥｃｏＴ２２
Ｉ、ＨｉｎｄIII 各カセットライブラリーを鋳型として
得られた、約０．５ｋｂ、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片の
塩基配列を決定した。得られた３つの塩基配列の結果を
総合し、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列情報を得
た。その塩基配列を配列表の配列番号：２６に示す。さ
らに、タンパク質をコードしうるオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を検索した結果、塩基番号５５８〜
１４４２にＯＲＦ１が、塩基番号１５８８〜１４３４に
ＯＲＦ２と考えられる一部、及び塩基番号１〜５３５に
ＯＲＦ３と考えられる一部が存在した。ＯＲＦ１は、
（１）でＮ末端アミノ酸配列を決めたタンパク質をコー
ドしており、ＯＲＦ１がＡｃｃIII 制限酵素遺伝子であ
ると推定された。ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子の塩基配列
を配列表の配列番号：２に示す。但し、この場合５’端
より４番目の塩基はＣである。また、該塩基配列より推
定されるアミノ酸配列を、配列表の配列番号：１に示
す。但し、この場合Ｎ末端より２番目のアミノ酸はＬｅ
ｕである。なお、ＯＲＦ２の翻訳方向は、ＯＲＦ１及び
ＯＲＦ３とは逆方向である。

【０１１５】（５）プラスミド pCRA19 の構築 次に、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子を発現させるためのプ
ラスミドの構築を行った。まず、該遺伝子を得るため、
配列表の配列番号：２７で表されるＡｃｃ−ＲＬプライ
マーと配列番号：２８で表されるＡｃｃ−ＲＲをプライ
マーを合成した。なお、両プライマーに制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ認識配列部位を導入した。上記プライマー対を用いる
と、Ａｃｃ菌のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより
得られるＤＮＡ増幅断片より、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝
子を制限酵素ＮｃｏＩで切り出すことが可能となり、ま
たｐＡＣＥ６１１ベクターのＮｃｏＩ部位に挿入した
際、ＳＰ６プロモーター支配下、翻訳時のコドンフレー
ムが合うようになる。一方、このプライマー対の使用に
より、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子の５’末端より４番目
の塩基がＣからＧに、該遺伝子にコードされるタンパク
質のＮ末端より２番目のアミノ酸が、ＬｅｕからＶａｌ
に置換される。上記プライマー対を用い、（２）で得ら
れたＡｃｃ菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによ
るＤＮＡ増幅反応を行った。このＤＮＡ断片を制限酵素
ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で完全消化した後、アガロース
ゲル電気泳動し、約９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を
回収した。次に、このＤＮＡ断片がＳＰ６プロモーター
の下流に配置されるように、ｐＡＣＥ６１１ベクターの
ＮｃｏＩ部位に挿入した。

【０１１６】この組換えＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に導
入し形質転換体を得た。適当に３０個の形質転換体を選
択し、３０μg ／ｍｌのクロラムフェニコール含む５ｍ
ｌのＬＢ培地に個別に接種し、３７℃で培養した。菌体
培養液のＯＤ₆₀₀ が０．６になった時に、プラスミドコ
ピー数増加のために、最終濃度が２ｍＭになるようにＩ
ＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２時間培養後、各培養
物より、個別にプラスミドＤＮＡを調製した。得られた
各プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII とＸｂａＩ
で同時に切断し、アガロースゲル電気泳動により生じた
ＤＮＡ断片長を確認したところ、挿入した遺伝子領域が
正方向に挿入されたと考えられるプラスミドが、１個存
在した。本プラスミドＤＮＡをｐＣＲＡ１９と命名し、
ｐＣＲＡ１９を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた形
質転換体をEscherichia coli JM109 / pCRA19 と命名し
た。

【０１１７】（６）ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子の発現シ
ステムの構築 まず、大腸菌ＪＭ１０９にＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子を導入し、さらに発現させることが可能なファージ
ベクターを構築した。すなわち、市販のファージベクタ
ーＭ１３ｍｐ１８（宝酒造社製）のマルチクローニング
サイト内のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII サイトに、ｐＳＰ
６−２をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 消化することにより
得たＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子断片を挿入するこ
とにより、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ発現ファージＭ１
３ｓｐ６を構築した。

【０１１８】次に、形質転換体（Esherichia coli JM10
9/pCRA19) をクロラムフェニコール３０μg ／ｍｌを含
む５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で培養した。菌体
培養液のＯＤ₆₀₀ が０．６になった時に、プラスミドコ
ピー数増加のために、ＩＰＴＧを最終濃度が２ｍＭにな
るように添加し、更に３７℃で２時間培養した。その
後、ＡｃｃIII 制限酵素遺伝子にコードされたタンパク
質を発現させるため、ファージＭ１３ｓｐ６を感染さ
せ、更に、３７℃で１６時間培養した。得られた湿菌体
１１ｍｇを、１８０μｌの菌体破砕用緩衝液Ｅ［２０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ ２−メル
カプトエタノール］に懸濁し、超音波処理により菌を破
砕し、遠心分離(18000ｇ、１０分間）により固液分離を
行った。

【０１１９】上清の活性を、宝酒造社製のＡｃｃIII 制
限酵素に添付されたデータシートに記載の活性測定条件
で測定したところ、湿菌体１ｇ当り約８０００ユニット
のＡｃｃIII 制限酵素が産生されていた。これはＡｃｃ
菌の産生量と比較して、湿菌体重量あたり約１６倍の産
生量であった。また、得られた上清にはＡｃｃIII 以外
の制限酵素活性、及びＡｃｃIII 修飾酵素活性は認めら
れなかった。プラスミド pCRA19 に挿入されたＡｃｃII
I 制限酵素遺伝子は、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った
際、翻訳開始塩基より４番目の塩基がＣからＧに置換さ
れ、この結果、翻訳タンパク質のＮ末端から２番目のア
ミノ酸が、ＬｅｕからＶａｌに置換されているが、該タ
ンパク質はＡｃｃIII 制限酵素活性を有することが明ら
かとなった。

【０１２０】以上、ＡｃｃIII 修飾酵素非共存下でのＡ
ｃｃIII 制限酵素遺伝子の単離及び大量生産系が完成し
た。

【０１２１】（７）ＡｃｃIII 修飾酵素遺伝子の単離 修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝子は近傍に存在すること
が多い。そこで（４）で推定されたＯＲＦ２領域の決定
のために、（４）においてＡｃｃIII 制限酵素遺伝子
３’側領域を決定するために調製した増幅ＤＮＡ断片の
うち、ＥｃｏＲＩカセットライブラリーを鋳型として得
られた、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
た。さらに、（４）で推定されたＯＲＦ３領域の決定の
ために、（４）においてＡｃｃIII 制限酵素遺伝子５’
端領域の塩基配列を決定するために調製した増幅ＤＮＡ
断片のうち、ＢｇｌIIカセットライブラリーを鋳型とし
て得られた約２．２ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定
した。これらと、（４）で決定したＡｃｃIII 制限酵素
遺伝子領域を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列
を総合して、配列表の配列番号：２９に示す約４．２ｋ
ｂの塩基配列情報が得られた。塩基番号１９１３〜２７
９７にＡｃｃIII 制限酵素遺伝子が、塩基番号３７１２
〜２７８９にＯＲＦ２が、塩基番号６９１〜１８９０に
ＯＲＦ３が存在した。各ＯＲＦのうち、既知の制限修飾
系における修飾酵素間の保存領域とホモロジーの高い部
分が、ＯＲＦ２に存在することが判明した。

【０１２２】次に、ＯＲＦ２領域を得るため、ＥｃｏＲ
Ｉカセットライブラリーを鋳型とし、Ａｃｃプライマー
６、カセットプライマーＣ１及びＡｃｃプライマー５、
カセットプライマーＣ２を各々対とした二段階ＰＣＲに
より得られた増幅ＤＮＡ断片より、ＥｃｏＴ２２Ｉ、Ｈ
ｐａＩ（宝酒造社製）を用いＯＲＦ２を含む約１．１ｋ
ｂの部分を切り出し、ｐＵＣ１１８ベクターｌａｃプロ
モーター下流の SmaI部位に挿入した。本組み換えプラ
スミドがＡｃｃIII 修飾酵素遺伝子を含んでおり、大腸
菌内でＡｃｃIII 修飾酵素が発現可能であれば、本組み
換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた
形質転換体の培養物中のＤＮＡはＡｃｃIII 修飾酵素に
よりメチル化を受け、ＡｃｃIII 制限酵素による切断に
耐性を示すようになる。

【０１２３】しかし本組換えプラスミドの構築に用いら
れたｐＵＣ１１８ベクターにはＡｃｃIII 制限酵素認識
配列が存在しないため、本組換えプラスミド自体をＡｃ
ｃIII 修飾酵素活性の確認に使用するのは不適当であ
る。一方、大腸菌ＪＭ１０９内で本組み換えプラスミド
と共存可能なプラスミドｐＳＴＶ２９にはＡｃｃIII 制
限酵素認識配列が存在する。そこでｐＳＴＶ２９をＡｃ
ｃIII 修飾酵素発現の指標とするため、先の組み換えプ
ラスミドをｐＳＴＶ２９と共に大腸菌ＪＭ１０９に導入
し形質転換体を得た。３個の形質転換体を１００μｇ／
ｍｌのアンピシリン、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コール及び２ｍＭ ＩＰＴＧを含む２ｍｌのＬＢ培地で
個別に３７℃、１６時間培養し、各培養物よりプラスミ
ドＤＮＡを調製した。

【０１２４】調製したＤＮＡはｐＳＴＶ２９と上記の組
換えプラスミドの混合物として得られる。各ＤＮＡサン
プルをＡｃｃIII 制限酵素による切断反応に供したとこ
ろ、全てのサンプル中のｐＳＴＶ２９がＡｃｃIII 制限
酵素切断に対する耐性を示し、該ＤＮＡサンプルに含ま
れる組換えプラスミドに、ＡｃｃIII 修飾酵素遺伝子が
挿入されていることが確認された。更に、該ＤＮＡサン
プルを、制限酵素ＨｉｎｄIII とＸｂａＩで同時に切断
し、アガロースゲル電気泳動にて生じたＤＮＡ断片長を
解析したところ、組換えプラスミド中にＯＲＦ２が存在
することが確認された。従って、ＯＲＦ２がＡｃｃIII
修飾酵素遺伝子であることが判明した。得られたＡｃｃ
III 修飾酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号：１
４に、また該配列より推定されるアミノ酸配列を配列番
号：１３にそれぞれ示す。

【０１２５】本発明により明らかとなったＡｃｃIII 制
限修飾系遺伝子構造を図１６に示す。図中、Ｍは修飾酵
素遺伝子、Ｒは制限酵素遺伝子、矢印はＯＲＦの方向を
示す。

【０１２６】

【発明の効果】本発明により、宿主に対し致死的とな
る、あるいは有害なタンパク質をコードする外来性の目
的遺伝子を該宿主に導入しうるプラスミドベクター、お
よび該プラスミドベクターを用いて効率よく該タンパク
質を発現させうる方法が初めて提供される。また、従来
技術では困難であった制限修飾系を構成する制限酵素遺
伝子を、修飾酵素遺伝子の非共存下で可能な単離方法が
提供される。さらに、本発明により AccIII 制限酵素遺
伝子及び AccIII 修飾酵素遺伝子が単離され、該遺伝子
を含有するプラスミドで形質転換した大腸菌により、遺
伝子工学において有用な AccIII 制限酵素あるいは修飾
酵素を、従来の精製方法と比べ、容易に必要な純度の酵
素標品を得ることが可能となる。

【０１２７】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：295 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：２（Val あるいは Leu） 配列： Met Xaa Pro Leu Asp Lys Asp Leu Gln Lys Ala Lys Ile Ser Ile 1 5 10 15 Thr Asp Phe Phe Glu Ile Thr Asn Arg Val Leu Asp Tyr Phe Pro 20 25 30 Asn Val Ile Asn Asn Thr Val Glu Lys Gly Asp Tyr Leu Ile Ser 35 40 45 Ser Ser Asn Ile Ala Gly Thr Ile Lys Phe Leu Arg Pro Ile Asn 50 55 60 Arg Lys Leu Phe Ile Gln Glu Lys Lys Val Phe Asn Asp Tyr Phe 65 70 75 Gln Lys Leu Ile Ile Val Phe Glu Asn Ile Arg Asn Lys Lys Thr 80 85 90 Val Thr Glu Glu Asp Lys Ile Ile Ile Asp Arg Val Ile Tyr Thr 95 100 105 Ile Gln Gln Ser Ile Gly Ile Gly Leu Asp Leu Met Val Asn Gln 110 115 120 Asn Ser Ala Arg Lys His Val Gly Asn Arg Phe Glu Glu Leu Ile 125 130 135 Arg Val Ile Phe Thr Glu Ile Ser Val Ser Asn Lys Arg Thr Val 140 145 150 Leu Gln Ile Pro Tyr Glu Thr Asp Glu Gly Gln Lys Ile Tyr Lys 155 160 165 Cys Glu Asn Asp Leu Ile Ile Ser Pro Phe Glu Asn Val Glu Ser 170 175 180 Thr Asn Lys His Leu Asp Glu Asn Glu Ile Val Val Ser Ile Lys 185 190 195 Thr Thr Ser Lys Asp Arg Met Gly Lys Met Phe Ile Asp Lys Ile 200 205 210 Leu Leu Glu Arg Phe Val Lys His Pro Gln Lys Val Ile Gly Ile 215 220 225 Phe Leu Asn Asp Val Gln Arg Lys Glu Asp Asn Asn Ile Ser Phe 230 235 240 Thr Leu Val Ser Gly Leu Phe Met Val Tyr Thr Lys Phe Leu Thr 245 250 255 Thr Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Leu Asp Pro Pro Pro Asn Ala Leu 260 265 270 Lys Leu Pro Tyr Ser Asn His Met Lys Arg Phe Ser Asp Leu Ile 275 280 285 Thr Glu Asp Leu Glu Lys Leu Phe Ser Ser 290 295

【０１２８】 配列番号：２ 配列の長さ：885 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATGSTACCAC TGGATAAAGA TTTACAAAAA GCAAAGATTT CAATTACTGA TTTTTTTGAA 60 ATTACAAATA GAGTTTTAGA TTATTTCCCC AATGTAATCA ATAATACAGT TGAAAAAGGA 120 GATTATTTAA TATCCTCATC AAATATTGCT GGAACAATAA AATTCCTAAG ACCAATCAAT 180 AGAAAGTTAT TTATTCAGGA AAAAAAAGTT TTCAATGATT ATTTTCAAAA ACTGATTATA 240 GTTTTTGAAA ATATAAGGAA CAAAAAAACT GTAACAGAGG AAGATAAAAT TATTATTGAT 300 AGGGTAATTT ACACAATACA GCAATCTATT GGAATTGGTT TAGATTTAAT GGTTAATCAA 360 AATAGTGCTA GAAAGCACGT TGGTAACCGA TTTGAAGAAT TAATTAGAGT CATTTTTACA 420 GAAATATCAG TATCGAATAA AAGAACTGTA TTACAAATTC CATATGAAAC TGATGAAGGA 480 CAGAAAATTT ACAAATGCGA GAATGACCTC ATTATTTCTC CTTTTGAAAA TGTAGAATCT 540 ACAAACAAAC ATCTAGATGA AAATGAGATT GTTGTTTCAA TAAAGACAAC ATCAAAAGAT 600 AGGATGGGAA AAATGTTTAT AGATAAAATT TTACTTGAAA GGTTTGTTAA ACACCCTCAA 660 AAAGTTATAG GGATTTTCCT CAATGATGTA CAAAGAAAAG AAGACAACAA TATCAGCTTT 720 ACACTTGTTT CAGGATTATT TATGGTGTAT ACTAAATTCT TAACTACTCT TGAAGGGATC 780 TATTATTTAG ATCCACCACC TAATGCATTG AAACTACCAT ATTCTAATCA TATGAAAAGA 840 TTTTCAGATT TAATTACAGA AGACCTTGAA AAATTATTCT CCTCT 885

【０１２９】 配列番号：３ 配列の長さ：215 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TATGGATATG TTCATAAACA CGCATGTAGG CAGATAGATC TTTGGTTGTG AATCGCAACC 60 AGTGGCCTTA TGGCAGGAGC CGCGGATCAC CTACCATCCC TAATGACCTG CAGGCATGCA 120 AGCTTGCATG CCTGCAGGTC ATTAGGTACG GCAGGTGTGC TCGAGGCGAA GGAGTGCCTG 180 CATGCGTTTC TCCTTGGCTT TTTTCCTCTG GGACA 215

【０１３０】 配列番号：４ 配列の長さ：215 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TATGTCCCAG AGGAAAAAAG CCAAGGAGAA ACGCATGCAG GCACTCCTTC GCCTCGAGCA 60 CACCTGCCGT ACCTAATGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTGC ATGCCTGCAG GTCATTAGGG 120 ATGGTAGGTG ATCCGCGGCT CCTGCCATAA GGCCACTGGT TGCGATTCAC AACCAAAGAT 180 CTATCTGCCT ACATGCGTGT TTATGAACAT ATCCA 215

【０１３１】 配列番号：５ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGATCTAGAG CAAACAAAAA AACCACCG 28

【０１３２】 配列番号：６ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTCTAGATC CCAGAGGAAA AAAG 24

【０１３３】 配列番号：７ 配列の長さ：100 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTCGAGATTT AGGTGACACT ATAGAATACG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCCAAGCTT 60 CACAGGAAAC AGACCATGGC TTAAGTAACT AGTGAATTCG 100

【０１３４】 配列番号：８ 配列の長さ：100 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGAATTCACT AGTTACTTAA GCCATGGTCT GTTTCCTGTG AAGCTTGGAA TTGTTATCCG 60 CTCACAATTC CGTATTCTAT AGTGTCACCT AAATCTCGAG 100

【０１３５】 配列番号：９ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AATCCCATGG AACGCTACGA ATCTCTG 27

【０１３６】 配列番号：１０ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCGGCCATGG TTATTTTTGA CACCAGACC 29

【０１３７】 配列番号：１１ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAACTTGAAT CCATGGGTTC TCACCG 26

【０１３８】 配列番号：１２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TACTCAGTAG CCATGGCTCT CATAGACCG 29

【０１３９】 配列番号：１３ 配列の長さ：308 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Asn Glu Ile Ala Phe Asp Asn Tyr Ser Tyr Ile Pro Lys Leu 1 5 10 15 Lys Leu Tyr Ser Glu Ile Glu Leu Lys Pro Phe Phe Ile Ser Lys 20 25 30 Asn Gly Ser Leu Phe Asn Val Asp Ala Ile Asp Phe Leu Arg Lys 35 40 45 Leu Glu Ser Asn Ser Val Asp Leu Ile Phe Ala Asp Pro Pro Tyr 50 55 60 Asn Ile Lys Lys Ala Glu Trp Asp Ile Phe Ser Ser Gln Asn Glu 65 70 75 Tyr Leu Glu Trp Ser Lys Glu Trp Ile Met Glu Ala His Arg Val 80 85 90 Leu Lys Asp Asn Gly Ser Leu Tyr Val Cys Gly Phe Ser Glu Ile 95 100 105 Leu Ala Asp Ile Lys Phe Ile Thr Ser Lys Tyr Phe His Ser Cys 110 115 120 Lys Trp Leu Ile Trp Phe Tyr Arg Asn Lys Ala Asn Leu Gly Lys 125 130 135 Asp Trp Gly Arg Ser His Glu Ser Ile Leu Leu Leu Arg Lys Ser 140 145 150 Lys Asn Phe Ile Phe Asn Ile Asp Glu Ala Arg Ile Pro Tyr Asn 155 160 165 Glu His Thr Val Lys Tyr Pro Gln Arg Thr Gln Ala Glu Ser Ser 170 175 180 Gln Tyr Ser Asn Ser Lys Lys Gln Tyr Ile Trp Glu Pro Asn Pro 185 190 195 Leu Gly Ala Lys Pro Lys Asp Val Leu Glu Ile Pro Thr Ile Ser 200 205 210 Asn Gly Ser Trp Glu Arg Ser Ile His Pro Thr Gln Lys Pro Val 215 220 225 Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ile Leu Ser Ser Ser Asn Lys Asp Ser 230 235 240 Leu Ile Leu Asp Pro Phe Gly Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ala Val 245 250 255 Ala Glu Ala Phe Gly Arg Lys Trp Ile Gly Thr Glu Leu Asp Lys 260 265 270 Asn Tyr Cys Leu Glu Ile Gln Lys Arg Leu Lys Asp Glu Ser Met 275 280 285 Ile Asn Arg Ile Phe Ser Gly Asp Asp Asp Ser Asn Ser Gln Asn 290 295 300 Arg Arg Lys Lys Leu Arg Gly Glu 305

【０１４０】 配列番号：１４ 配列の長さ：924 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： GTGAATGAAA TAGCGTTTGA TAATTACAGT TATATACCAA AATTAAAACT TTATTCGGAA 60 ATCGAGCTTA AACCATTTTT TATTTCAAAA AACGGTTCAC TTTTCAATGT TGATGCTATT 120 GATTTTTTAA GAAAATTAGA GAGTAATTCT GTGGATTTAA TTTTTGCAGA TCCACCTTAT 180 AACATTAAAA AGGCAGAGTG GGATATTTTT TCTTCTCAAA ATGAATATCT CGAATGGAGT 240 AAAGAATGGA TAATGGAAGC TCATAGAGTT TTAAAAGATA ATGGCAGTTT ATATGTTTGT 300 GGCTTTTCAG AAATTCTGGC AGACATAAAA TTTATCACTT CAAAATATTT TCACAGTTGT 360 AAATGGTTGA TTTGGTTCTA TAGAAACAAG GCAAATTTAG GTAAAGATTG GGGACGTTCA 420 CACGAAAGTA TACTGTTATT AAGAAAATCT AAAAATTTTA TTTTTAATAT TGATGAGGCA 480 CGAATCCCGT ATAATGAGCA TACAGTTAAA TATCCACAAA GAACCCAGGC CGAATCTTCG 540 CAATATTCGA ACTCAAAAAA GCAATATATT TGGGAGCCAA ACCCATTAGG AGCTAAGCCA 600 AAAGATGTTT TGGAGATTCC CACAATTTCA AATGGTTCTT GGGAAAGAAG TATTCACCCT 660 ACGCAAAAGC CAGTAGAATT GCTTAAAAAA ATAATTTTAT CTTCATCTAA TAAAGATAGT 720 TTAATTCTTG ATCCATTTGG TGGTTCGGGA ACTACATATG CTGTTGCGGA AGCTTTTGGC 780 AGAAAATGGA TTGGAACAGA GTTAGATAAA AATTATTGTC TGGAAATTCA AAAGCGATTG 840 AAAGACGAAA GTATGATCAA CAGGATTTTT TCAGGCGATG ATGATTCAAA TTCTCAAAAT 900 AGAAGAAAAA AATTAAGAGG AGAA 924

【０１４１】 配列番号：１５ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCGAGATTTA GGTGACACTA TAGAATACA 29

【０１４２】 配列番号：１６ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCTTGTATT CTATAGTGTC ACCTAAATC 29

【０１４３】 配列番号：１７ 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCGAGATTTA GGTGACACTA TAGAATACGG AATTGTGAGC GGATAACAAT TCCA 54

【０１４４】 配列番号：１８ 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCTTGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC GTATTCTATA GTGTCACCTA AATC 54

【０１４５】 配列番号：１９ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Leu Asp Lys Asp Leu Gln Lys Ala Lys Ile Ser Ile 1 5 10 15 Thr Asp Phe Phe Glu 20

【０１４６】 配列番号：２０ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６、９、１２（イノシン） 配列： ATGTTNCCNY TNGAYAARGA YYT 23

【０１４７】 配列番号：２１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：９（イノシン） 配列： AAGGATTTNC ARAARGCNAA RAT 23

【０１４８】 配列番号：２２ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAAATCTAAA CCAATTCCAA TAGATTGCTG 30

【０１４９】 配列番号：２３ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAAATCGGTT ACCAACGTGC TTTCTAGCAC 30

【０１５０】 配列番号：２４ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAACTGTATT ACAAATTCCA TATGAAACTG 30

【０１５１】 配列番号：２５ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACAGAAAAT TTACAAATGC GAGAATGACC 30

【０１５２】 配列番号：２６ 配列の長さ：1588 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： CCATGGCACA CGTTTCAAAA AAGAAATCCT CGAAGTCAAA TATGATGAGA AAAACATCTC 60 AGACATCCTG CATATGACGG TGGATGAAGC ATTGGAATTT TTCTCGGAAA ATCACGAAGA 120 AAAAATTGTA ACCAAACTAA AACCTTTGCA GGACGTTGGT TTGGGTTATC TTCAGTTAGG 180 CCAGTCCTCC TCTACTCTTT CCGGCGGTGA AGCCCAAAGA GTGAAGCTCG CCTCTTTCCT 240 TGTGAAAGGT GTAACGACGG AAAAAACGTT ATTTGTTTTT GATGAACCAT CAACAGGATT 300 ACATTTCCAC GACATTCAAA AATTACTGAA ATCACTTCAG GCACTGATAG AATTAGGGCA 360 TTCGGTTGTA GTGATTGAGC ATCAGCCGGA TATTATCAAA TGCGCCGATT ACATCATCGA 420 TGTCGGACCC AATGCCGGAA AATACGGTGG CGAAATTGTT TTCACAGGAA CTCCGGAAGA 480 TTTGGTAAAA GAGAAAAAGT CGTTTACAGG GAAGTATATT AAGGAGAAGT TAAAGTAATT 540 TATTTATATT TGAAGTTATG CTACCACTGG ATAAAGATTT ACAAAAAGCA AAGATTTCAA 600 TTACTGATTT TTTTGAAATT ACAAATAGAG TTTTAGATTA TTTCCCCAAT GTAATCAATA 660 ATACAGTTGA AAAAGGAGAT TATTTAATAT CCTCATCAAA TATTGCTGGA ACAATAAAAT 720 TCCTAAGACC AATCAATAGA AAGTTATTTA TTCAGGAAAA AAAAGTTTTC AATGATTATT 780 TTCAAAAACT GATTATAGTT TTTGAAAATA TAAGGAACAA AAAAACTGTA ACAGAGGAAG 840 ATAAAATTAT TATTGATAGG GTAATTTACA CAATACAGCA ATCTATTGGA ATTGGTTTAG 900 ATTTAATGGT TAATCAAAAT AGTGCTAGAA AGCACGTTGG TAACCGATTT GAAGAATTAA 960 TTAGAGTCAT TTTTACAGAA ATATCAGTAT CGAATAAAAG AACTGTATTA CAAATTCCAT 1020 ATGAAACTGA TGAAGGACAG AAAATTTACA AATGCGAGAA TGACCTCATT ATTTCTCCTT 1080 TTGAAAATGT AGAATCTACA AACAAACATC TAGATGAAAA TGAGATTGTT GTTTCAATAA 1140 AGACAACATC AAAAGATAGG ATGGGAAAAA TGTTTATAGA TAAAATTTTA CTTGAAAGGT 1200 TTGTTAAACA CCCTCAAAAA GTTATAGGGA TTTTCCTCAA TGATGTACAA AGAAAAGAAG 1260 ACAACAATAT CAGCTTTACA CTTGTTTCAG GATTATTTAT GGTGTATACT AAATTCTTAA 1320 CTACTCTTGA AGGGATCTAT TATTTAGATC CACCACCTAA TGCATTGAAA CTACCATATT 1380 CTAATCATAT GAAAAGATTT TCAGATTTAA TTACAGAAGA CCTTGAAAAA TTATTCTCCT 1440 CTTAATTTTT TTCTTCTATT TTGAGAATTT GAATCATCAT CGCCTGAAAA AATCCTGTTG 1500 ATCATACTTT CGTCTTTCAA TCGCTTTTGA ATTTCCAGAC AATAATTTTT ATCTAACTCT 1560 GTTCCAATCC ATTTTCTGCC AAAAGCTT 1588

【０１５３】 配列番号：２７ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATATTTGAAG CCATGGTACC ACTGG 25

【０１５４】 配列番号：２８ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATGATTCAA ATTCTCACCA TGGAAG 26

【０１５５】 配列番号：２９ 配列の長さ：4146 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： AGATCTGGTC ATCCCAAACA AAAATCTTTC GGTTTACGAA GATGCAGTCG CTTCCTGGAA 60 AGGCGAAAGT ATGAGCGAAT GGAAAAAGGA ATTCATCAAA AAAGCCAAAG ATTTCCCAAT 120 TCACAAGCCT TATCATCAAC TCACAAAAGA GCAGAAACAG TTCCTTTGGA AAGGCGATAA 180 AACCAGAAGT TTCCCAAGTA TTGATAATTT TTTCAAAATG CTTGAAGAGA ATCTTTACAA 240 GATCCAATAC CGCGTAATGC TTTCGCGCTA TCGTGGGAAA ACACTTTGCC CCGATTGCGA 300 AGGATTACGA TTGCGGGAAG AAACAAGCTG GGTGAAGATT GACGGACACA ACATTCAGTC 360 TTTGATTGAA TTACCTTTGG ATGAACTCCT GCCATTGATC AAAAGCTTAA AACTGAACGT 420 CCACGACAGA GAAATTGCCA AACGCCTGAC TTACGAAATC GAAACGAGAT TAGAATTCCT 480 GACGAAAGTC GGCCTTGGAT ATCTGACTTT GAACCGAACA TCCAACACGC TTTCCGGAGG 540 AGAAAGCCAG AGAATCAATC TGGCGACAGC TTGGGAAGTT CGCTGGTTGG TTCTATTTAT 600 ATTTTGGATG AGCCGAGCAT TGGTCTGCAT TCCCGCGATA CAGAAAATCT GATTGGTGTC 660 CTCAAACAAC TCCGCGATTT GGGAANTACC GTGATTGTTG TAGAACACGA CGAAGATGTG 720 ATGCTTGCGG CAGNTTACAT TATAGATATT GGCCCNGNAG CGGGCTACCT TGGTGGCGAT 780 CTTGTTTTCA GCGNGGATTA TAAAGAGATG CTGAAGTNTN ATACTTTAAC CGCAAAATAC 840 CTGAATGGCG AACTGAAAAT AGAAGTTCCT GAAAAACGAA GAAAACCGAA GGAATTCATC 900 GCAATAAAAG GTGCCCGCCA GAATAATTTA AAAAATATTG ACGTTGATGT TCCGTTAGAA 960 TGTCTGACAG TTATCACAGG CGTTTCTGGA AGCGGGAAAT CCACTTTGAT GAAGGAAGTG 1020 ATGACCAATG CCATCCAGAT CCAACTGGGA ATGGGCGGCA AAAAAGCCGA TTACGATTCG 1080 GTGGAATTCC CGAAAAAGCT GATCCAGAAT ATCGAACTGA TTGACCAGAA CCCAATCGGG 1140 AAATCGTCCC GCTCCAACCC CGTGACTTAT CTGAAAGCTT ACGACGATAT CCGGGATCTT 1200 TTTGCGAAAC AAAAATCCGC AAAAATCCAG GGTTACAAAC CGAAGCATTT CTCCTTCAAT 1260 GTGGATGGCG GAAGATGTGA CGAGTGCAAA GGCGAAGGTA TCATTACCGT ATCAATGCAG 1320 TTTATGGCGG ACATCGAGCT GGAGTGTGAG CATTGCCATG GCACACGTTT CAAAAAAGAA 1380 ATCCTCGAAG TCAAATATGA TGAGAAAAAC ATCTCAGACA TCCTGCATAT GACGGTGGAT 1440 GAAGCATTGG AATTTTTCTC GGAAAATCAC GAAGAAAAAA TTGTAACCAA ACTAAAACCT 1500 TTGCAGGACG TTGGTTTGGG TTATCTTCAG TTAGGCCAGT CCTCCTCTAC TCTTTCCGGC 1560 GGTGAAGCCC AAAGAGTGAA GCTCGCCTCT TTCCTTGTGA AAGGTGTAAC GACGGAAAAA 1620 ACGTTATTTG TTTTTGATGA ACCATCAACA GGATTACATT TCCACGACAT TCAAAAATTA 1680 CTGAAATCAC TTCAGGCACT GATAGAATTA GGGCATTCGG TTGTAGTGAT TGAGCATCAG 1740 CCGGATATTA TCAAATGCGC CGATTACATC ATCGATGTCG GACCCAATGC CGGAAAATAC 1800 GGTGGCGAAA TTGTTTTCAC AGGAACTCCG GAAGATTTGG TAAAAGAGAA AAAGTCGTTT 1860 ACAGGGAAGT ATATTAAGGA GAAGTTAAAG TAATTTATTT ATATTTGAAG TTATGCTACC 1920 ACTGGATAAA GATTTACAAA AAGCAAAGAT TTCAATTACT GATTTTTTTG AAATTACAAA 1980 TAGAGTTTTA GATTATTTCC CCAATGTAAT CAATAATACA GTTGAAAAAG GAGATTATTT 2040 AATATCCTCA TCAAATATTG CTGGAACAAT AAAATTCCTA AGACCAATCA ATAGAAAGTT 2100 ATTTATTCAG GAAAAAAAAG TTTTCAATGA TTATTTTCAA AAACTGATTA TAGTTTTTGA 2160 AAATATAAGG AACAAAAAAA CTGTAACAGA GGAAGATAAA ATTATTATTG ATAGGGTAAT 2220 TTACACAATA CAGCAATCTA TTGGAATTGG TTTAGATTTA ATGGTTAATC AAAATAGTGC 2280 TAGAAAGCAC GTTGGTAACC GATTTGAAGA ATTAATTAGA GTCATTTTTA CAGAAATATC 2340 AGTATCGAAT AAAAGAACTG TATTACAAAT TCCATATGAA ACTGATGAAG GACAGAAAAT 2400 TTACAAATGC GAGAATGACC TCATTATTTC TCCTTTTGAA AATGTAGAAT CTACAAACAA 2460 ACATCTAGAT GAAAATGAGA TTGTTGTTTC AATAAAGACA ACATCAAAAG ATAGGATGGG 2520 AAAAATGTTT ATAGATAAAA TTTTACTTGA AAGGTTTGTT AAACACCCTC AAAAAGTTAT 2580 AGGGATTTTC CTCAATGATG TACAAAGAAA AGAAGACAAC AATATCAGCT TTACACTTGT 2640 TTCAGGATTA TTTATGGTGT ATACTAAATT CTTAACTACT CTTGAAGGGA TCTATTATTT 2700 AGATCCACCA CCTAATGCAT TGAAACTACC ATATTCTAAT CATATGAAAA GATTTTCAGA 2760 TTTAATTACA GAAGACCTTG AAAAATTATT CTCCTCTTAA TTTTTTTCTT CTATTTTGAG 2820 AATTTGAATC ATCATCGCCT GAAAAAATCC TGTTGATCAT ACTTTCGTCT TTCAATCGCT 2880 TTTGAATTTC CAGACAATAA TTTTTATCTA ACTCTGTTCC AATCCATTTT CTGCCAAAAG 2940 CTTCCGCAAC AGCATATGTA GTTCCCGAAC CACCAAATGG ATCAAGAATT AAACTATCTT 3000 TATTAGATGA AGATAAAATT ATTTTTTTAA GCAATTCTAC TGGCTTTTGC GTAGGGTGAA 3060 TACTTCTTTC CCAAGAACCA TTTGAAATTG TGGGAATCTC CAAAACATCT TTTGGCTTAG 3120 CTCCTAATGG GTTTGGCTCC CAAATATATT GCTTTTTTGA GTTCGAATAT TGCGAAGATT 3180 CGGCCTGGGT TCTTTGTGGA TATTTAACTG TATGCTCATT ATACGGGATT CGTGCCTCAT 3240 CAATATTAAA AATAAAATTT TTAGATTTTC TTAATAACAG TATACTTTCG TGTGAACGTC 3300 CCCAATCTTT ACCTAAATTT GCCTTGTTTC TATAGAACCA AATCAACCAT TTACAACTGT 3360 GAAAATATTT TGAAGTGATA AATTTTATGT CTGCCAGAAT TTCTGAAAAG CCACAAACAT 3420 ATAAACTGCC ATTATCTTTT AAAACTCTAT GAGCTTCCAT TATCCATTCT TTACTCCATT 3480 CGAGATATTC ATTTTGAGAA GAAAAAATAT CCCACTCTGC CTTTTTAATG TTATAAGGTG 3540 GATCTGCAAA AATTAAATCC ACAGAATTAC TCTCTAATTT TCTTAAAAAA TCAATAGCAT 3600 CAACATTGAA AAGTGAACCG TTTTTTGAAA TAAAAAATGG TTTAAGCTCG ATTTCCGAAT 3660 AAAGTTTTAA TTTTGGTATA TAACTGTAAT TATCAAACGC TATTTCATTC ACAAATGAAT 3720 CAATCTGCTG TTGTGTATAA ACCCTGTAAT TATTAATAGG ATGTCTTAAA CTTTTGAATT 3780 TTCCAGAATT ATCCCATCTT CCTTAATGTC TCAGAGTTAA CATCTAATAA TTTCGCCGCT 3840 TCTTTTATTG ATAAATAATC ATCCATATCT TACACAACAT TACACAAGTT TATACAGCAA 3900 ATATAAATAT TTTTTATACA TTGTAAAAAT TTTATTTACT TTTATTTTGT TCAATTGTCT 3960 CAATAAATAG TTAATCGAAA TACATTTTGA ATATGATAAA ATTGACTCCA ACAAATCTAA 4020 CACAATGACA TTAAAACCAA TAAAAACGGA AGAAGATTAC AATCAGGTTT TAGAAAGACT 4080 TTCACAAATT TTCGACGCTA AACCAAATAC CAAAGATGGA GATGAATTGG GAAATCTTGG 4140 GAATTC 4146

【０１５６】 配列番号：３０ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATTTAGGTGA CACTATAGAA TAC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、モデル発現プラスミドｐＭＳＰ６Ｌお
よびｐＭＳＰ６Ｆの構成を示す図である。

【図２】図２は、モデル発現プラスミドｐＭＳＰ６０の
構成を示す図である。

【図３】図３(A,B) は、ランナウエイプラスミドｐＨＳ
２８７０の構築の手順を示す図である。

【図４】図４は、ランナウエイプラスミドｐＨＳ２８７
０の構成を示す図である。

【図５】図５(A,B) は、プラスミドｐＣＲＳ０４の構築
の手順を示す図である。

【図６】図６は、プラスミドｐＣＲＳ０４の構成を示す
図である。

【図７】図７は、プラスミドｐＣＲＡ１９の構成を示す
図である。

【図８】図８(A,B,C,D,E) は、システムプラスミドｐＦ
ＳＰ６の構築の手順を示す図である。

【図９】図９(A,B) は、プラスミドｐＡＣＥ６０１の構
築の手順を示す図である。

【図１０】図１０は、プラスミドｐＡＣＥ６１１の構成
を示す図である。

【図１１】図１１(A,B) は、プラスミドｐＡＣＥ６１１
の構築の手順を示す図である。

【図１２】図１２(A,B) は、プラスミドｐＣＲＳ７０の
構築の手順を示す図である。

【図１３】図１３(A,B) は、プラスミドｐＡＣＥ７０１
およびｐＡＣＥ７０２の構築の手順を示す図である。

【図１４】図１４は、大腸菌ＨＢ１０１にｐＦＳＰ６お
よびｐＡＣＥ６０１又はｐＦＳＰ６およびｐＡＣＥ６０
１−ＮｓｐIII を導入し、ＩＰＴＧ誘導の有無によるＮ
ｓｐ7524III 制限酵素活性の発現をλ−ＤＮＡの分解反
応液のアガロースゲル電気泳動により調べた図である。
図中のＭは、λ−ＥｃｏＴ１４１サイズマーカーを示
し、１はＡｖａＩ消化したλ−ＤＮＡを示し、２は誘導
後のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１を示し、
３は誘導前のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１
を示し、４は誘導後のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣ
Ｅ６０１−ＮｓｐIII を示し、５は誘導前のＨＢ１０１
／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１−ＮｓｐIII を示す。

【図１５】図１５は、大腸菌ＨＢ１０１にｐＦＳＰ６お
よびｐＡＣＥ６０１又はｐＦＳＰ６およびｐＡＣＥ６０
１−ＮｓｐIII を導入し、ＩＰＴＧ誘導の有無によるλ
−ＤＮＡの分解反応を２時間および３時間まで延長した
場合のアガロースゲル電気泳動を示す図である。図中の
Ｍは、λ−ＥｃｏＴ１４１サイズマーカーを示し、１は
ＡｖａＩ消化したλ−ＤＮＡを示し、２は１時間後（誘
導あり）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１を
示し、３は２時間後（誘導あり）のＨＢ１０１／ｐＦＳ
Ｐ６／ｐＡＣＥ６０１を示し、４は３時間後（誘導あ
り）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１を示
し、５は１時間後（誘導なし）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ
６／ｐＡＣＥ６０１を示し、６は２時間後（誘導なし）
のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１を示し、７
は３時間後（誘導なし）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐ
ＡＣＥ６０１を示し、８は１時間後（誘導あり）のＨＢ
１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１−ＮｓｐIII を示
し、９は２時間後（誘導あり）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ
６／ｐＡＣＥ６０１−ＮｓｐIII を示し、１０は３時間
後（誘導あり）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６
０１−ＮｓｐIII を示し、１１は１時間後（誘導なし）
のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１−ＮｓｐII
I を示し、１２は２時間後（誘導なし）のＨＢ１０１／
ｐＦＳＰ６／ｐＡＣＥ６０１−ＮｓｐIII を示し、１３
は３時間後（誘導なし）のＨＢ１０１／ｐＦＳＰ６／ｐ
ＡＣＥ６０１−ＮｓｐIII を示す。

【図１６】図１６は、ＡｃｃIII 制限修飾系遺伝子構造
を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号：１に示されるアミノ
   酸配列の全部、又はその一部を含むものであって、Ａｃ
   ｃIII 制限酵素活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号：１に示されるアミノ
   酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、１個若し
   くは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の
   少なくとも１つがされており、かつＡｃｃIII 制限酵素
   活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号：１に示されるアミノ
   酸配列の全部、又はその一部を含むポリペプチドであっ
   て、ＡｃｃIII 制限酵素活性を示すポリペプチドをコー
   ドするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号：２で示されるＤＮＡ
   の全部、又はその一部を含むＤＮＡであって、該ＤＮＡ
   の発現産物がＡｃｃIII 制限酵素活性を示すＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号：１で示されるアミノ
   酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、１個若し
   くは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置
   換の少なくとも１つがされており、かつＡｃｃIII 制限
   酵素活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３〜５いずれか記載のＤＮＡにハ
   イブリダイズ可能な、ＡｃｃIII 制限酵素活性を有する
   ポリペプチドをコードするＤＮＡ。