DE69733540T2 - Plasmid - Google Patents

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Description

  • FACHGEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Plasmidvektor, der in der genetischen rekombinanten Technologie verwendet werden kann, und ein Verfahren zur Expression eines Gens durch Verwendung des Plasmidvektors. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens unter Verwendung eines solchen Plasmidvektors. Außerdem beschreibt die vorliegende Erfindung ein Restriktionsenzym und ein Gen davon, welches als ein Reagens zur genetischen Veränderung verwendbar ist, genauer gesagt die Restriktionsendonuclease AccIII und eine DNA, die dafür codiert.
  • STAND DER TECHNIK
  • Bei der Konstruktion eines Expressionssystems für ein gewünschtes Gen durch genetische rekombinante Technologie wird die Expression des Gens kontrolliert, indem es unter Kontrolle eines Promotors gebracht wird, der von der RNA-Polymerase des Wirtes erkannt wird. Im Falle eines Gens, welches ein Protein codiert, das für den Wirt schädlich ist, wird die Plasmidkonstruktion jedoch manchmal selbst, aufgrund des Unvermögens die Expression vom verwendeten Promotorstringent zu kontrollieren, durch die Expression des Produktes des Gens behindert.
  • Als ein Expressionssystem, das dieses Problem löst, ist das pET-System (hergestellt von Novagen) entwickelt worden, welches die RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, der Escherichia coli infiziert, mit Escherichia coli als einen Wirt verwendet [Journal of Molecular Biology, Bd. 189, Seiten 113–130 (1986); Gene, Bd. 56, Seiten 125–135 (1987)]. Das pET-System ist ein System, das es der T7-RNA-Polymerase, die eine hohe Spezifität der Promotor-Erkennung und eine hohe Transkriptionsaktivität aufweist, erlaubt in Escherichia coli exprimiert zu werden; diese T7-RNA-Polymerase transkribiert ein gewünschtes Gen, welches stromabwärts vom T7-Promotor auf einem Expressionsvektor platziert wird, und bewirkt eine hohe Expression des Gens. Da die Transkription des gewünschten Gens in der Anwesenheit von T7-RNA-Polymerase erfolgt, ist die Plasmidkonstruktion im Wirt ohne Expression des gewünschten Gens möglich, vorausgesetzt dass der Wirt die Polymerase nicht produziert; die Plasmidkonstruktion selbst ist, wie in Fällen, in welchen das Expressionssystem konstruiert ist, nie behindert, solange das gewünschte Gen unter der Kontrolle eines Promotors gehalten wird, der von der RNA-Polymerase des Wirtes erkannt wird.
  • Da das T7-RNA-Polymerasegen jedoch in den λ-Phagenvektor cloniert worden ist und in den Expressionswirt lysogenisiert wurde, gibt es keine freie Wirtswahl; äußerst mühsame Verfahren werden benötigt, wenn der Wirt geändert wird. Außerdem wird, da die Expression der T7-RNA-Polymerase im Wirt nicht stringent gesteuert wird, die T7-RNA-Polymerase sogar dann exprimiert, wenn der Wirt in einem nicht-induktiven Zustand vorliegt, was in einer Expression des gewünschten Gens, welches stromabwärts vom T7-Promotor auf dem Expressionsvektor platziert ist, sogar in einem nicht-induktivem Zustand resultiert. Um eine solche Expression des gewünschten Gens in einem nicht-induktiven Zustand zu unterdrücken, wird die T7-RNA-Polymerase unter Verwendung von T7-Lysozym, einem T7-RNA-Polymerase-Inhibitor [Journal of Molecular Biology, Bd. 219, Seiten 37–44 (1991)] unterdrückt, oder T7 RNA-Polymerase wird, durch Platzierung eines Lactose-Operators stromabwärts vom T7-Promotor daran gehindert Zugang zum T7-Promotor zu bekommen [Journal of Molecular Biology, Bd. 219, Seiten 45–59 (1991)].
  • Sogar diese Gegenmaßnahmen sind jedoch bezüglich des Effekts gegen T7-RNA-Polymerase mit hoher Transkriptionsaktivität unzulänglich, sodass die Aktivität der T7-RNA-Polymerase in einem nicht-induktiven Zustand nicht vollständig inhibiert werden kann. Aus diesem Grund ist es, falls das gewünschte Genprodukt für den Wirt tödlich ist, in manchen Fällen unmöglich eine Transformante für die Expression des Gens zu konstruieren, auch wenn die Plasmidkonstruktion möglich ist. Mit anderen Worten bringt das pET-System zwei Probleme mit sich, die gelöst werden müssen: eines ist die Unfähigkeit den Wirt unbehindert zu wechseln und das andere ist die ungenaue Kontrolle der Expression der T7-RNA-Polymerase.
  • Andererseits gibt es einen Bakteriophagen, welcher ähnliche Eigenschaften zu jenen des Bakteriophagen T7 aufweist, der als Bakteriophage SP6 [Science, Bd. 133, Seiten 2069–2070 (1961)] bekannt ist und der Salmonella Typhimurium infiziert. Die RNA-Polymerase, die vom Bakteriophagen SP6 produziert wird, ist ein einzelnes Peptid, welches ein Molekulargewicht von etwa 100.000 aufweist; es wird in herkömmlicher Weise für in vitro-RNA-Synthese verwendet, da es über hohe Promotor-Erkennungsspezifität und hohe Transkriptionsaktivität verfügt [Journal of Biological Chemistry, Bd. 257, Seiten 5772–5778 (1982); Journal of Biological Chemistry, Bd. 257, Seiten 5779–5788 (1982)]. Außerdem ist das SP6 RNA-Polymerasegen schon cloniert und in großen Mengen in Escherichia coli exprimiert worden [Nucleic Acids Research, Bd. 15, Seiten 2653–2664 (1987)].
  • Gene, deren Expressionsprodukt auf Wirte tödlich wirkt, werden durch Restriktionsendonuclease-Gene exemplarisch dargestellt. Im Wesentlichen werden Restriktionsendonucleasen für die Selbstverteidigung verwendet, indem sie Phagen und andere exogene DNA spalten, die in die Zellen von Mikroorganismen eindringen, welche die Restriktionsendonucleasen produzieren. Andererseits produzieren Mikroorganismen, die Restriktionsendonucleasen produzieren, meist Modifikationsenzyme, welche die gleiche Basensequenz wie jene der Restriktionsendonucleasen erkennen, um ihre eigene DNA gegen die Spaltung durch die Restriktionsendonucleasen zu schützen. Im Besonderen ändert ein Modifikationsenzym DNA durch den Zusatz einer Methylgruppe an einer oder mehreren Basen in der Basensequenz, die davon erkannt wird, um es für die Restriktionsendonuclease, welche die gleiche Sequenz wie das Modifikationsenzym erkennt, unmöglich zu machen daran zu binden oder die DNA zu spalten. Dieser Mechanismus wird als Restriktions-Modifikationssystem bezeichnet und das Paar der Gene der Restriktionsendonuclease und des Modifikationsenzyms, die das Restriktions-Modifikationssystem bilden, werden als Restriktions-Modifikationssystemgene bezeichnet. Wenn das Restriktionsendonuclease-Gen daher in einem Mikroorganismus exprimiert wird, dem ein Modifikationsenzym-Gen vom Restriktions-Modifikationssystemgen fehlt, wird die DNA von diesem Mikroorganismus gespalten, was in Zelltod resultiert. In Wirklichkeit gibt es zwei Modifikationsenzym-Gene in dem Mbo I Restriktions-Modifikationssystemgen; es wurde berichtet, dass die Clonierung der Restriktionsendonucleasen-Gene aufgrund unvollständiger Modifizierung der Wirts-DNA, im Falle von unvollständiger Methylierung in der gleichzeitigen Anwesenheit eines der beiden Modifikationsenzym-Gene alleine, unmöglich ist [Nucleic Acids Research, Bd. 21, Seiten 2309–2313 (1993)].
  • Es wurde auch gezeigt, dass, wenn ein Restriktions-Modifikationssystemgen von einer Zelle verloren geht, die das Restriktions-Modifikationssystemgen beibehält, ein Mangel an Modifikationsaktivität in der Zelle in unvollständiger Methylierung der genomischen DNA resultiert, was wiederum durch eine sehr kleine Menge an darin verbleibender Restriktionsendonuclease eine tödliche Spaltung seiner eigenen genomischen DNA bewirkt [Science, Bd. 267, Seiten 897–899 (1995)]. Zusammenfassend gesagt verhalten sich Restriktionsendonucleasen in der Abwesenheit von Modifikationsenzymen, die ein Restriktions-Modifikationssystem bilden, als Proteine, die für Zellen schädlich sind; getrennte Clonierung und Expression ihrer Gene sind mit den Technologien des Stands der Technik unmöglich gewesen.
  • Was Restriktionsendonucleasen anbelangt, so können Restriktionsendonucleasen durch ihre enzymatischen Eigenschaften in drei Typen: I, II und III, eingeteilt werden. Im Besonderen werden Typ-II-Restriktionsendonucleasen, von denen jede eine besondere DNA-Basensequenz erkennt und in oder nahe der Sequenz an einer besonderen Stelle schneidet, im Gebiet der Gentechnik weit reichend verwendet und es wurden Restriktionsendonucleasen dieses Typs mit verschiedenen Spezifitäten von einer Vielzahl an Mikroorganismen isoliert [Nucleic Acids Research, Bd. 24, Seiten 223–235 (1996)]. In der vorliegenden Beschreibung wird eine Typ-II-Restriktionsendonuclease nachstehend als „Restriktionsendonuclease" bezeichnet. Es sollte jedoch beachtet werden, dass manche Mikroorganismen nur geringe Mengen einer Restriktionsendonuclease produzieren und andere produzieren eine Vielzahl an Restriktionsendonucleasen. Zum Beispiel wird die Restriktionsendonuclease AccIII von Acinetobacter calcoaceticus (nachstehend als Acc-Bakterium bezeichnet) produziert, welches unter der Zugangsnummer FERM BP-935 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaraki, 305, Japan] seit 9. November 1985 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung), aber die Menge des produzierten Enzyms ist gering und dieser Mikroorganismus produziert gleichzeitig auch die Restriktionsendonucleasen AccI und AccII. Es wird daher eine fortgeschrittene Produktionstechnologie benötigt, um die Restriktionsendonuclease AccIII unter Verwendung dieses Mikroorganismus als ein preiswertes Reagens von hoher Reinheit bereitzustellen. Bei der Bereitstellung einer preiswerten Restriktionsendonuclease von hoher Reinheit als ein Reagens ist es wirkungsvoll, das Gen der gewünschten Restriktionsendonuclease zu isolieren und die gewünschte Restriktionsendonuclease in großen Mengen durch Gentechnik-Technologie selektiv zu produzieren. Es ist von einigen Verfahren zur Isolierung von Restriktionsendonucleasen-Genen berichtet worden, um dieses Ziel zu erreichen.
  • Als Erstes kann das „Shotgun-Verfahren" genannt werden, wobei die genomische DNA eines Mikroorganismus, der eine Restriktionsendonuclease produziert, unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsendonuclease gespalten wird, das daraus entstehende Fragment wird in einen entsprechenden Plasmidvektor inseriert und ein Clon, welcher das Restriktionsendonuclease-Gen exprimiert, wird ausgewählt. Durchmusterungsverfahren für die gewünschten Clone werden durch ein Verfahren veranschaulicht, wobei ein Gen des Restriktions-Modifikationssystems mit Resistenz gegenüber einer Phageninfektion als ein Indikator auf der Basis der Selbstverteidigungsfunktion isoliert wird, welche vom Wirt nach Einführung des Gens des Restriktions-Modifikationssystems in den Wirt erworben wird [PstI: Proceedings of the National Academy of Science of the USA, Bd. 78, Seiten 1503–1507 (1981)]. Dieses Verfahren setzt jedoch voraus, dass die Größe des Gens des Restriktions-Modifikationssystems in einen Bereich fällt, der seine Isolierung erlaubt und, dass die Expression des isolierten Gens des Restriktions-Modifikationssystems ausreichend Phagenresistenz aufweist, um das selektive Überleben des Wirtes zu ermöglichen. Andererseits, als ein allgemeines Merkmal der Restriktions-Modifikationssystemgene, kann die nahe Lage der Restriktionsendonuclease-Gene und der Modifikationsenzym-Gene auf dem Genom erwähnt werden; Tatsächlich ist das bei vielen Genen des Restriktions-Modifikationssystems bestätigt worden, die bis jetzt erhalten wurden [Nucleic Acids Research, Bd. 19, Seiten 2539–2566 (1991)]. Demgemäß gibt es ein Verfahren, wobei auf ein Gen eines Restriktions-Modifikationssystems durch Expression eines Modifikationsenzym-Gens als ein Indikator auf der Basis des vorstehend beschriebenen Merkmals durchmustert wird [offengelegtes Japanisches Patent Nr. 63-87982; Nucleic Acids Research, Bd. 19, Seiten 1831–1835 (1991)]. Wenn das Restriktionsendonuclease-Gen jedoch nicht nahe beim Gen des Modifikationsenzyms liegt, gelingt es mit diesem Verfahren nicht, das Gen der Restriktionsendonuclease zu erhalten.
  • Darüber hinaus wirft das vorstehend beschriebene „Shotgun"-Verfahren ein fundamentales Problem auf, welches mit dem Unterschied in Transkriptions-Translations-Mechanismus zwischen der genomischen DNA des Ausgangsorganismus und des Wirtes zusammenhängt. Zum Beispiel ist im Falle einer unzureichenden Genexpression aufgrund des Versagens des Promotors und der Ribosomenbindungsstelle, die mit dem Gen des Restriktions-Modifikationssystems assoziiert sind, damit es im Wirt gut funktioniert, großer Aufwand nötig, um Transformanten zu selektieren, die das gewünschte Gen beinhalten, sogar wenn sie erhalten werden. Um diesen Nachteil zu vermeiden, gibt es ein Verfahren, in welchem die Aminosäuresequenz des Restriktionsendonucleaseproteins analysiert wird, das Restriktionsendonuclease-Gen durch auf PCR basierender DNA-Amplifikation auf der Basis der erhaltenen Sequenzdaten von der genomischen DNA eines Mikroorganismus erhalten wird, der die Restriktionsendonuclease produziert, und ein bekanntes Protein-Expressionssystem benützt wird [offengelegtes Japanisches Patent Nr. 6-277070]. Nachdem die Anwesenheit einer Restriktionsendonuclease in herkömmlichen Protein-Expressionssystemen für den Wirt tödlich ist, ist es notwendig den Wirt zu schützen, zum Beispiel indem gestattet wird, dass ein Modifikationsenzym, welches ein Restriktions-Modifikationssystem darstellt, gleichzeitig mit dem Enzym vorhanden ist.
  • Obwohl alle der vorstehend beschriebenen Verfahren der Isolierung von Restriktionsendonuclease-Genen die gleichzeitige Isolierung des Restriktionsendonuclease-Gens und eines Modifikationsenzym-Gens erfordern, welches ein Gen des Restriktions-Modifikationssystems zusammen mit dem Gen darstellt, ist von einem anderen Verfahren zur Isolierung des Restriktionsendonuclease-Gens alleine berichtet worden [Nucleic Acids Research, Bd. 22, Seiten 2399–2403 (1994)]. In diesem Verfahren wird jedoch beabsichtigt ein Gen zu isolieren, das eine Restriktionsendonuclease codiert, deren optimale Temperatur für die Enzymaktivität etwa 70°C ist; die gleichzeitige Anwesenheit eines Modifikationsenzym-Gens ist nötig, wenn das zu isolierende Gen eine Restriktionsendonuclease codiert, die eine hohe spezifische Aktivität nahe der Züchtungstemperatur des Wirtes zeigt.
  • Als Ausnahme gibt es Restriktionsendonucleasen wie die Restriktionsendonuclease DpnI, die keine Spaltungsaktivität zeigen, außer wenn eine besondere Nucleinsäurebase in ihrer DNA-Erkennungssequenz nicht durch Methylierung modifiziert wurde. Gene für Restriktionsendonucleasen, die diese Eigenschaften haben, werden insofern als besonders erachtet, als sie sogar in der Abwesenheit eines anderen besonderen Gens durch Selektion des entsprechenden Wirtsorganismus isoliert werden können. Tatsächlich ist das mrr-Gen isoliert worden, welches das Mrr-Protein codiert, das keine Typ-II-Restriktionsendonuclease ist, sondern das eine besondere DNA-Basensequenz erkennt, die eine methylierte Nucleinsäurebase enthält, und das DNA-Spaltungsaktivität zeigt [Journal of Bacteriology, Bd. 173, Seiten 5207–5219 (1991)].
  • Wie vorstehend dargelegt benötigt, die Isolierung eines Restriktionsendonuclease-Gens durch Verfahren des Stands der Technik, mit der Ausnahme spezieller Fälle, die gleichzeitige Expression des Gens und eines Modifikationsenzym-Gens, welches ein Gen eines Restriktions-Modifikationssystems zusammen mit dem Gen darstellt.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt daher einen Plasmidvektor bereit, mit dem ein solches Gen isoliert werden kann, wobei dessen Isolierung oder die Konstruktion eines Expressionssystems dafür bisher im Stand der Technik schwierig war, weil das Genprodukt für einen Wirt tödlich oder schädlich ist, und der in einen Wirt eingeführt werden kann, um das Protein effizient zu exprimieren. Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens unter Verwendung dieses Plasmidvektors bereit. Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens durch Verwendung dieses Plasmidvektors bereit, besonders zur Isolierung eines Restriktionsendonuclease-Gens ohne das gleichzeitige Vorhandensein eines Modifikationsenzym-Gens, welches ein Restriktions-Modifikationsystem darstellt. Die Beschreibung beschreibt ein Polypeptid, welches eine Aktivität einer AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt. Außerdem wird eine DNA beschrieben, die ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität einer AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • Zuerst haben die hier genannten Erfinder unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase als ein neues genaues Expressionskontroll-Expressionsystem ein Expressionssystem konstruiert, um das Problem in dem pET-System zu lösen, und haben das System beurteilt.
  • Da das Expressionssystem unter Verwendung eines Systemplasmids konstruiert wurde, wobei das SP6-RNA-Polymerasegen in das MiniF-Plasmid inseriert wurde, können Expressionssysteme für das gewünschte Gen in verschiedenen Stämmen von Escherichia coli durch gleichzeitiges Einführen eines Expressionsvektors, der das gewünschte Gen stromabwärts vom SP6-Promotor cloniert enthält, und dieses Systemplasmids in den Wirt konstruiert werden. Außerdem haben es die hier genannten Erfinder unter Verwendung des lac-Promotors und der Antisense-Technologie möglich gemacht, die Expression des SP6-RNA-Polymerasegens auf dem Systemplasmid genau zu kontrollieren. Die Beurteilung dieses Expressionssystems unter Verwendung des β-Galactosidasegens als ein Reportergen zeigte, dass die Expression des SP6-RNA-Polymerasegens genau von diesem System kontrolliert wird, dass es in nicht-induktivem Zustand fast keine Expression der SP6-RNA-Polymerase gibt und dass die Induktion von der Expression einer ausreichenden Menge an SP6-RNA-Polymerase gefolgt wird, um das gewünschte Gen effizient zu exprimieren und anschließend das gewünschte Gen in großer Menge zu exprimieren.
  • Es wurde jedoch auch gezeigt, dass, wenn der verwendete Wirt Escherichia coli ist, das gewünschte, stromabwärts des SP6-Promotors liegende Gen auch in einem nicht-induktivem Zustand in sehr kleinen Mengen exprimiert wird, da der SP6-Promotor sehr schwach, aber doch von der Escherichia coli-RNA-Polymerase erkannt wird. Es wurde somit bewiesen, dass, wenn das Genprodukt auf Escherichia coli sehr schädlich und tödlich wirkt, die Konstruktion eines Expressionssystem unmöglich ist, sodass der Gegenstand der vorliegenden Erfindung nicht gut erreicht werden kann.
  • Diese Erkenntnisse bedenkend haben die hier genannten Erfinder weitere ausgiebige Untersuchungen durchgeführt und unerwarteterweise herausgefunden, dass (i) die Expression des gewünschten Gens in einem nicht-induktiven Zustand auf nicht nachweisbare Mengen unterdrückt werden kann und dass (ii) die Induktion der Expression die Kopienzahl des Plasmids erhöht, welches das gewünschte Gen enthält, und zur Expression der RNA-Polymerase führt, was in der Transkription und Translation des gewünschten Gens resultiert, das stromabwärts eines Promotors platziert wurde, der von der RNA-Polymerase erkannt wird, und zwar durch Verwendung eines neuen Systems zur Kontrolle der Expression des gewünschten Gens mittels einer Kombination von zwei Kontrollverfahren, d.h. Kontrolle der Kopienzahl des Gens und Transkriptionskontrolle über den Promotor. Mit anderen Worten ist der Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung ein Plasmidvektor, der einzigartige Merkmale aufweist, um die vorstehend erwähnten Probleme im Gebiet der Gentechnik zu lösen. Die hier genannten Erfinder machten, basierend auf dieser Entdeckung, weitere Untersuchungen und entwickelten ein Verfahren für die Expression des gewünschten Gens unter Verwendung des Vektors.
  • Die hier genannten Erfinder haben auch unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Plasmidvektors ein Verfahren zur Isolierung eines Gens entwickelt, dessen Expressionsprodukt tödlich auf den Wirt wirkt, genauer gesagt ein Verfahren zur Isolierung eines Restriktionsendonuclease-Gens ohne die Nachteile des Stands der Technik.
  • Die hier genannten Erfinder haben es auch geschafft die DNA zu isolieren, welche die AccIII-Restriktionsendonuclease codiert, die bis dahin ohne der gleichzeitigen Anwesenheit eines AccIII-Modifikationsenzym nicht erhalten werden konnte, sowie die AccIII-Restriktionsendonuclease in großen Mengen unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zu exprimieren.
    • (1) Das Ziel der vorliegenden Erfindung befasst sich mit: einem Plasmidvektor dadurch gekennzeichnet, dass er eine Promotorsequenz umfasst, um eine Expression eines gewünschten Gens zu kontrollieren, wobei die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, die dem Wirt nicht eigen ist, sowie einen Replikationsursprung zur Vermehrung der Kopienzahl durch Induktion mit einem exogenen Faktor;
    • (2) Der vorstehend in Punkt (1) beschriebene Plasmidvektor, wobei die Promotorsequenz durch RNA-Polymerase erkannt wird, die von Bakteriophagen abgeleitet ist;
    • (3) Der vorstehend in Punkt (2) beschriebene Plasmidvektor, wobei die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, die vom SP6-Phagen abgeleitet ist;
    • (4) Der vorstehend in Punkt (3) beschriebene Plasmidvektor, wobei die Promotorsequenz die Basensequenz von SEQ ID NR: 30 im Sequenzprotokoll enthält;
    • (5) Der in einem der vorstehenden Punkte (1) bis (4) beschriebene Plasmidvektor, wobei sich der Replikationsursprung unter der Kontrolle eines Promotors befindet;
    • (6) Der in einem der vorstehenden Punkte (1) bis (5) beschriebene Plasmidvektor, wobei sich der Replikationsursprung unter der Kontrolle des lac-Promotors befindet;
    • (7) Der in einem der vorstehenden Punkte (1) bis (6) beschriebene Plasmidvektor, umfassend ein Wirkstoffresistenz-Gen als einen Selektionsmarker;
    • (8) Der vorstehend in Punkt (7) beschriebene Plasmidvektor, der aus pACE601, pACE611, pACE701 und pACE702 ausgewählt ist;
    • (9) Ein Plasmidvektor, in welchem ein gewünschtes Gen, das exprimiert werden soll, in den Plasmidvektor eingebaut ist, der in einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8) beschrieben ist;
    • (10) Ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, gekennzeichnet durch Einführung eines Plasmidvektors in einen Wirt, wobei das gewünschte Gen in den in einem der vorstehenden Punkte (1) bis (8) beschriebenen Plasmidvektor eingebaut ist, und eines RNA-Polymerasegens, das eine Promotorsequenz in dem Plasmidvektor erkennt, und Induktion einer Zunahme der Kopienzahl des Plasmidvektors sowie einer Expression der RNA-Polymerase unter Verwendung eines exogen Faktors, um das gewünschte Gen zu transkribieren und zu translatieren;
    • (11) Ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, das vorstehend in Punkt (10) beschrieben ist, gekennzeichnet dadurch, dass die Zunahme in der Kopienzahl des Plasmidvektors und die Expression der RNA-Polymerase durch jeweilige exogene Faktoren induziert werden;
    • (12) Ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, das vorstehend in Punkt (10) beschrieben ist, gekennzeichnet dadurch, dass der Anstieg in der Kopienzahl des Plasmidvektors und die Expression der RNA-Polymerase durch einen gleichen exogenen Faktor induziert werden;
    • (13) Ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, das vorstehend in einem der Punkte (10) bis (12) beschrieben ist, wobei der exogene Faktor, der den Anstieg in der Kopienzahl des Plasmidvektors induziert, einer oder mehrere ist, ausgewählt von der Gruppe, die aus einer Beimengung von Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), einer Beimengung von Lactose, einer Beimengung von Galactose, einer Beimengung von Arabinose, einer Reduktion einer Tryptophankonzentration und einem Angleichen einer Transformanten-Züchtungstemperatur besteht;
    • (14) Das vorstehend in einem der Punkte (10) bis (12) beschriebene Verfahren zur Expression des gewünschten Gens, wobei der exogene Faktor, der die Expression der RNA-Polymerase induziert, einer oder mehrere ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Beimengung von Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG), einer Beimengung von Lactose, einer Beimengung von Galactose, einer Beimengung von Arabinose, einer Reduktion einer Tryptophankonzentration und einem Angleichen einer Transformanten-Züchtungstemperatur;
    • (15) Das vorstehend in Punkt (10) beschriebene Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Polymerasegen durch einen anderen Plasmidvektor oder einen Phagenvektor in den Wirt eingeführt wird;
    • (16) Das vorstehend in Punkt (10) beschriebene Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Polymerasegen in ein Chromosom des Wirts inkorporiert ist;
    • (17) Das vorstehend in Punkt (15) oder Punkt (16) beschriebene Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Polymerasegen vom SP6-Phagen abgeleitet ist;
    • (18) Das vorstehend in einem der Punkte (10) bis (17) beschriebene Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, wobei das gewünschte Gen ein Protein codiert, das für den Wirt tödlich oder schädlich ist;
    • (19) Das vorstehend in einem der Punkte (10) bis (18) beschriebene Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, dadurch charakterisiert, dass Escherichia coli als der Wirt verwendet wird;
    • (20) Ein Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmidvektor, der vorstehend in einem der Punkte (1) bis (8) beschrieben ist, in einem Verfahren zur Isolierung des gewünschten Gens zum Einsatz gelangt;
    • (21) Das vorstehend in Punkt (20) beschriebene Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens, wobei das gewünschte Gen ein Protein codiert, das für den Wirt tödlich oder schädlich ist;
    • (22) Das vorstehend in Punkt (21) beschriebene Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens, wobei das Gen, welches ein Protein codiert, das für den Wirt tödlich oder schädlich ist, ein Restriktionsendonuclease-Gen ist.
  • Die Beschreibung beschreibt ein Polypeptid, welches die gesamte oder einen Teil der durch SEQ ID NR: 1 im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz enthält und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • Die Beschreibung beschreibt auch ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz hat, die aus mindestens einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 im Sequenzprotokoll oder eines Teils davon resultiert und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt,
    eine DNA, welche ein Polypeptid codiert, das die gesamte oder einen Teil der durch SEQ ID NR: 1 im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz enthält und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt,
    eine DNA, welche die gesamte oder einen Teil der durch SEQ ID NR: 2 im Sequenzprotokoll gezeigten DNA enthält, wobei ein Expressionsprodukt der DNA eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt,
    eine DNA, welche ein Polypeptid codiert, das aus mindestens einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1 des Sequenzprotokolls oder eines Teils davon resultiert und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt; und
    eine DNA, welche im Stande ist mit der vorstehend beschriebenen DNA zu hybridisieren und ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Zusammensetzung der Modell-Expressionsplasmide pMSP6L und pMSP6F.
  • 2 zeigt die Zusammensetzung des Modell-Expressionsplasmids pMSP60.
  • 3(A), (B) zeigen das Verfahren der Konstruktion des Runaway-Plasmids pHS2870.
  • 4 zeigt die Zusammensetzung des Runaway-Plasmids pHS2870.
  • 5(A), (B) zeigen das Verfahren der Konstruktion des Plasmids pCRS04.
  • 6 zeigt die Zusammensetzung des Plasmids pCRS04.
  • 7 zeigt die Zusammensetzung des Plasmids pCRA19.
  • 8(A), (B), (C), (D), (E) zeigen das Verfahren der Konstruktion des Systemplasmids pFSP6.
  • 9(A), (B) zeigen das Verfahren der Konstruktion des Plasmids pACE601.
  • 10 zeigt die Zusammensetzung des Plasmids pACE611.
  • 11(A), (B) zeigen das Verfahren der Konstruktion des Plasmids pACE611.
  • 12(A), (B) zeigen das Verfahren der Konstruktion des Plasmids pCRS70.
  • 13(A), (B) zeigen das Verfahren der Konstruktion der Plasmide pACE701 und pACE702.
  • 14 zeigt die Expression der Aktivität der Nsp7524III-Restriktionsendonuclease in Abhängigkeit von der Induktion oder nicht-Induktion von IPTG durch Agarose-Gelelektrophorese der Abbau-Reaktionslösung von λ-DNA nach Einführung von pFSP6 und pACE601 oder pFSP6 und pACE601-NspIII in Escherichia coli HB101. In dieser Figur kennzeichnet M den λ-EcoT141- Größenmarker; 1 kennzeichnet mit AvaI verdaute λ-DNA; 2 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach Induktion; 3 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 vor Induktion; 4 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach Induktion; und 5 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII vor Induktion.
  • 15 zeigt ein Ergebnis einer Agarose-Gelelektrophorese im Falle einer 2- und 3-Stunden-Verlängerung der Abbau-Reaktion von λ-DNA, abhängig von der Induktion oder nicht-Induktion von IPTG, nach Einführung von pFSP6 und pACE601 oder pFSP6 und pACE601-NspIII in Escherichia coli HB101. In dieser Figur kennzeichnet M den λ-EcoT141-Größenmarker; 1 kennzeichnet mit AvaI gespaltene λ-DNA; 2 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach 1 Stunde (Induktion); 3 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach 2 Stunden (Induktion); 4 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach 3 Stunden (Induktion); 5 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach 1 Stunde (ohne Induktion); 6 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach 2 Stunden (ohne Induktion); 7 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601 nach 3 Stunden (ohne Induktion); 8 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach 1 Stunde (Induktion); 9 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach 2 Stunden (Induktion); 10 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach 3 Stunden (Induktion); 11 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach 1 Stunde (ohne Induktion); 12 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach 2 Stunden (ohne Induktion) 13 kennzeichnet HB101/pFSP6/pACE601-NspIII nach 3 Stunden (ohne Induktion).
  • 16 zeigt die Konstruktion des AccIII-Restriktions-Modifikationssystemgens.
  • BESTE METHODE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Plasmidvektor. Genauer gesagt betrifft er einen Plasmidvektor, dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmidvektor eine Promotorsequenz umfasst, die durch eine dem Wirt nicht eigene RNA-Polymerase erkannt wird, um die Expression des gewünschten Gens zu kontrollieren, und einen Replikationsursprung zur Erhöhung der Kopienzahl mittels Induktion mit einem exogenen Faktor. Die im Plasmidvektor enthaltene Promotorsequenz, deren Sequenz die Expression des gewünschten Gens kontrolliert, kann irgendeine Promotorsequenz sein; Promotorsequenzen, die von speziellen RNA-Polymerasen erkannt werden, z.B. jene, die durch RNA-Polymerasen, abgeleitet von T7, T3, SP6 und anderen Bakteriophagen, erkannt werden, können verwendet werden, bevorzugt werden jene, die durch RNA-Polymerase, abgeleitet vom SP6-Phagen, erkannt werden. Die Basensequenz des Minimalbereichs des Promotors, der von der RNA-Polymerase, abgeleitet vom SP6-Phagen, erkannt wird, d.h. der SP6-Promotor, wird im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 30 gezeigt. Darüber hinaus kann der Plasmidvektor ein Wirkstoff-Resistenzgen aufweisen, das als Selektionsmarker verwendet wird.
  • Exogene Faktoren, welche die Kopienzahl des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung kontrollieren, d.h. die Funktion des Replikationsursprung des Plasmidvektors, schließen zum Beispiel die Beimengung von verschiedenen Chemikalien wie zum Beispiel Lactose oder strukturell verwandte Substanzen wie Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), Galactose oder strukturell verwandte Substanzen und Arabinose oder strukturell verwandte Substanzen; Reduktion der Tryptophankonzentration; und Angleichen der Züchtungstemperatur von Transformanten ein, sind aber nicht auf sie beschränkt. Indem der Replikationsursprung unter die Kontrolle eines Promotors gebracht wird, der von diesen Faktoren kontrolliert werden kann, wird die Kontrolle der Kopienzahl möglich. Promotoren, die für diesen Zweck verwendet werden können, schließen, wenn der verwendete Wirt Escherichia coli ist, die lac-, trp-, tac-, gal-, ara- bzw. PL-Promotoren bzw. ein, sind aber nicht auf sie beschränkt, solange der vorstehend beschriebene Zweck erfüllt wird. Diese Promotoren können auch verwendet werden, um die Expression eines RNA-Polymerasegens zu induzieren.
  • Beispiele des Replikationsursprungs des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung schließen Plasmidvektoren ein, die als Replikationsursprünge von Runaway-Plasmiden unter der Kontrolle des lac-Promotors dienen, sind aber nicht auf sie beschränkt. In diesem Fall wird die Kontrolle der Kopienzahl durch die Beimengung von Lactose und strukturell verwandten Substanzen erreicht, am stärksten bevorzugt durch die Beimengung von Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG).
  • Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, das exprimiert werden soll, gekennzeichnet durch die Einführung eines Plasmidvektors, der durch Einbau des gewünschten Gens in den Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, und eines RNA- Polymerasegens in einen Wirt, das die Promotorsequenz auf dem Plasmidvektor erkennt, und Induzieren einer Erhöhung der Kopienzahl des Plasmidvektors und der Expression der RNA-Polymerase mit einem exogenen Faktor, um das gewünschte Gen zu transkribieren und zu translatieren. RNA-Polymerasegene, welche die Promotorsequenz auf dem Plasmidvektor erkennen, schließen zum Beispiel die von den vorstehend erwähnten Bakteriophagen abgeleiteten RNA-Polymerasegene ein, sind aber nicht auf sie beschränkt; dem RNA-Polymerasegen abgeleitet vom SP6-Phagen wird dabei der Vorzug gegeben. Exogene Faktoren, welche die Expression einer solchen RNA-Polymerase oder eine Zunahme der Kopienzahl des Plasmidvektors induzieren, schließen zum Beispiel die Beimengung von verschiedenen Chemikalien wie zum Beispiel Lactose oder strukturell verwandten Substanzen wie Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), Galactose oder strukturell verwandten Substanzen und Arabinose oder strukturell verwandten Substanzen; die Reduktion der Tryptophankonzentration; und das Angleichen der Züchtungstemperatur der Transformanten ein, sind aber nicht auf sie beschränkt.
  • Die Induktion einer Erhöhung der Kopienzahl des Plasmidvektors und der Expression der RNA-Polymerase können durch die Aktivität von jeweiligen exogenen Faktoren oder desselben exogenen Faktors erreicht werden. In diesem Fall kann auch das Gen, welches die RNA-Polymerase codiert, in das Chromosom des Wirts aufgenommen werden oder durch einen anderen Plasmidvektor als den Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung oder einen Phagenvektor in den Wirt aufgenommen werden. Im letzteren Fall kann der Wirt in Übereinstimmung mit dem Zweck leicht geändert werden. In diesem Fall kann die Einführung des Vektors, der ein RNA-Polymerasegen aufweist, in den Wirt der Einführung des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung vorangehen oder folgen.
  • Auch wenn das gewünschte Gen der vorliegenden Erfindung keiner Einschränkung unterliegt, ist es sinnvoll, wenn es ein Protein codiert, das für den Wirt tödlich oder schädlich ist. Solche Proteine schließen zum Beispiel die vorstehend erwähnten Restriktionsendonucleasen, andere Nucleasen, Nucleinsäure-bindende Proteine und Proteasen ein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System bereit, das die Expression des gewünschten Gens durch eine Kombination von zwei Kontrollverfahren kontrolliert, d.h. Kontrolle der Kopienzahl des Gens und Kontrolle der Transkription über einen Promotor, wie vorstehend beschrieben. Die Kontrolle der Expression des gewünschten Gens, welches auf das Plasmid der vorliegenden Erfindung cloniert wurde, ist im Gegensatz zu herkömmlicher Kontrolle sehr stringent, sodass seine Expression, unter einer nicht-induktiven Bedingung auf nicht nachweisbare Mengen unterdrückt werden kann. Wenn die Kopienzahl des Plasmids, d.h. die Kopienzahl des gewünschten Gens, bei gleichzeitiger Expression der RNA-Polymerase durch Expressionsinduktion erhöht wird, wird das gewünschte Gen unter der Kontrolle des Promotors durch die Aktivität der RNA-Polymerase transkribiert und translatiert.
  • Es ist daher möglich, den Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung zu verwenden, um eine Transformante zu erzeugen, die ein Gen enthält, das für den Wirt tödlich oder schädlich ist, und das Gen zu exprimieren; das ist eine Aufgabe, die mit dem Stand der Technik schwer zu erreichen ist.
  • Zum Beispiel wurde das Gen ohne die gleichzeitige Anwesenheit des entsprechenden Modifikationsenzym-Gens erfolgreich in Escherichia coli beibehalten, wenn die Clonierung eines Gens, welches die Nsp7524III-Restriktionsendonuclease codiert, unter Verwendung des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung versucht wurde. Es war auch möglich die Nsp7524III-Restriktions-Endonuclease in den Zellen der daraus resultierenden Transformante zu exprimieren und zwar durch die Einführung eines Systemplasmids, das ein RNA-Polymerasegen enthält, in die Transformante, um die Expression der Nsp7524III-Restriktionsendonuclease zu induzieren.
  • Auch ist es unter Verwendung des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung als einen Clonierungsvektor für die Herstellung einer Genbank möglich, ein Gen zu isolieren, das durch herkömmliche Verfahren nicht isoliert werden kann und die Aktivität seines Expressionsproduktes in einem einzigen Wirt zu überprüfen. Die Verwendung des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung ist natürlich nicht auf die Clonierung eines Gens beschränkt, das ein Produkt codiert, das für den Wirt schädlich ist, und kann als ein Plasmidvektor für allgemeine Zwecke verwendet werden.
  • Ein RNA-Polymerasegen, das die vorliegende Erfindung betrifft, kann zum Beispiel unter Verwendung des Plasmids pFSP6 und des Phagen M13sp6, in einen Wirt eingeführt werden. Genaue Angaben für die Konstruktion des Plasmids pFSP6 werden im Referenzbeispiel (2) gezeigt. Escherichia coli HB101, das mit dem Plasmid transformiert ist und als Escherichia coli HB101/pFSP6 bezeichnet wird, ist unter der Zugangsnummer FERM-BP5742 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [Adresse: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan] seit dem 22. Dezember 1995 hinterlegt worden (Datum der ursprünglichen Hinterlegung). Ein Verfahren für die Konstruktion des Phagen M13sp6 wird in Beispiel 2 (6) beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehender mit Hinweis auf einen Fall beschrieben, in dem das Plasmid pFSP6 verwendet wird.
  • Zuerst werden die Ergebnisse eines Versuchs beschrieben, der unter Verwendung der konstruierten Multi-Kopien-Modell-Expressionsplasmide pMSP6L, pMSP6F (1) und pMSP60 (2) durchgeführt wurde, die alle eine Promotorsequenz, welche durch SP6-RNA-Polymerase erkannt wird, und das β-Galactosidasegen als ein Reportergen aufweisen und alle die Expression des gewünschten Gens unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Systemplasmids pFSP6 ermöglichen.
  • Genaue Angaben zur Konstruktion dieser Modell-Expressionsplasmide werden im Referenzbeispiel (3) gezeigt. Diese Plasmide beinhalten die Minimalregion des SP6-Promotors (pMSP6L), eine inhärente SP6-Promotorregion (pMSP6F) oder jeweils sowohl die Minimalregion des SP6-Promotors als auch den lac-Operatorbereich (pMSP60) als eine SP6-Plasmidsequenz.
  • Wenn das Plasmid pMSP6L oder pMSP6F allein in die Escherichia coli-Stämme eingeführt wurde, die in Tabelle 1 gezeigt werden, wurde trotz der Tatsache, dass der Wirt Escherichia coli keine SP6-RNA-Polymerase exprimierte, β-Galactosidaseaktivität bemerkt; die Mengen waren, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, höher als jene, die mit dem Plasmid pMS434 erhalten wurden, welches keinen SP6-Promotor aufweist. Kurz gesagt kann vermutet werden, dass der SP6-Promotor durch eine RNA-Polymerase abgeleitet von Escherichia coli erkannt wird und dass das β-Galactosidasegen stromabwärts davon transkribiert und translatiert wird. Außerdem, wenn Escherichia coli MRi80 als ein Wirt verwendet wurde, ein Stamm der eine Mutation in dem pcnB-Gen aufweist und in welchem die Kopienzahl eines Plasmids, das einen Replikationsursprung abgeleitet von ColEi besitzt, wie das vorstehend beschriebene Modell des Expressionsplasmids, auf 1/6 bis 1/13 von dem des Elternstammes MRi7 reduziert wird, war auch die β-Galactosidaseaktivität auf 1/7 bis 1/14 von der von MRi7 vermindert. Das deutet darauf hin, dass eine Korrelation zwischen der Expressionsmenge des β-Galactosidasegens und der Kopienzahl des eingeführten Plasmids besteht.
  • Tabelle 1
    Figure 00190001
  • Tabelle 2
    Figure 00190002
  • Wenn als nächstes das gleiche Modell der Expressionsplasmide zusammen mit dem vorstehend beschriebenen Systemplasmid pFSP6 in Escherichia coli eingeführt wurde und β-Galactosidase-Aktivität unter solchen Bedingungen bestimmt wurde, dass die Expression der SP6-RNA-Polymerase nicht induziert wurde, war die β-Galactosidase-Aktivität, wie in Tabelle 3 gezeigt, höchstens so hoch wie jene, die mit Escherichia coli erreicht wurde, welches das Systemplasmid nicht enthielt. Das zeigt, dass die Expression des SP6-RNA-Polymeraegens auf dem Plasmid pFSP6 in einem nicht-induktiven Zustand fast komplett unterdrückt wird. Andererseits war die β-Galactosidase-Aktivität um das 8 bis 32-Fache erhöht, wenn die Expression des SP6-RNA-Polymerasegens durch die Beimengung von Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG) induziert wurde, was zeigt, dass das β-Galactosidasegen mit Hilfe des SP6-Promotors exprimiert werden kann. Wenn der verwendete Wirt Escherichia coli MRi80 war, war insbesondere die β-Galactosidase-Aktivität 4 Stunden nach Induktion auf eine 25 bis 32-fache Menge, von jener in einem nicht-induktiven Zustand erhaltenen erhöht, obwohl die Aktivität in einem nicht-induktiven Zustand auf einem sehr niedrigen Niveau verblieb.
  • Tabelle 3
    Figure 00200001
  • Im Plasmid pMSP60, welches die Sequenz des lac-Promotors stromabwärts vom SP6-Promotor trägt, ist die β-Galactosidase-Aktivität unter nicht induktiven Bedingungen niedriger als jene in anderen Modell-Expressionsplasmiden; seine Expression kann jedoch nicht vollständig unterdrückt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression des gewünschten Gens in einem Expressionssystem unter Verwendung eines Multikopien-Plasmids schwer vollständig unterdrückbar ist und dass die Kontrolle der Kopienzahl des Plasmids, das das gewünschte Gen enthält, bei der Lösung des Problems effektiver ist als die Kontrolle der Expression des RNA-Polymerasegens auf dem Systemplasmid.
  • Die hier genannten Erfinder haben daher weitere Untersuchungen basierend auf diesen Ergebnissen durchgeführt, um einen neuen Expressionsvektor zu erforschen, und den Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung entwickelt.
  • Im Besonderen haben die hier genannten Erfinder ein Runaway-Plasmid konstruiert, das im Stande ist die Expressionsmengen in einem nicht-induktiven Zustand zu vermindern, um ausreichende Expression nach Induktion zu gewährleisten. Zuerst wurde gemäß den in 3 gezeigten Verfahren unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die SP6-RNA-Polymeraseexpression in einem Systemplasmid durch IPTG induziert wird, ein Plasmid konstruiert, welches einen Runaway-Replikationsursprung aufweist, der einen Anstieg in der Kopienzahl durch Induktion mit IPTG ermöglicht. Als Erstes wurde das Plasmid pUC106AdP0 durch Entfernung des PvuII-Fragmentes konstruiert, das den lac-Promotor und den Operatorbereich von Plasmid pUC106A enthält, welcher durch Einführung des 106-NdeI-DNA-Fragments, hergestellt aus den beiden DNA-Strängen, deren Basensequenzen im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 gezeigt werden, in die NdeI-Stelle des Plasmidvektors pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo) erhalten wird.
  • Als Nächstes kann das Plasmid pHS2870 durch Insertion des RNA1870-Fragments, das durch PCR unter Verwendung des RNAIIA-Primers (Basensequenz im Sequenzprotokoll gezeigt durch SEQ ID NR: 5), der nahe der RNAII-Region angeordnet ist (Replikationsursprung des Plasmids), und des 1870-Primers (Basensequenz im Sequenzprotokoll gezeigt durch SEQ ID NR: 6), der an einem Terminus der 106-NdeI-Sequenz angeordnet ist, mit dem Plasmid als Matrize erhalten wurde, in die XbaI-Stelle des Plasmids pSTV28 (hergestellt von Takara Shuzo) erhalten werden. Das auf diese Weise konstruierte Plasmid pHS2870 wird in 4 gezeigt. Im Allgemeinen ist das Plasmid in einer Kopienzahl von etwa 30 Kopien pro Escherichia coli-Zelle vorhanden; diese Kopienzahl wird jedoch durch die Beimengung von IPTG auf mehrere Hundert erhöht.
  • Das AccI-NapI-Fragment, das den P15A-Replikationsursprung enthält, der vom Plasmid pSTV28 abgeleitet ist, wird dann von dem Plasmid (Plasmid pCRS01) entfernt, gefolgt von einer weiteren Entfernung des EcoRI-XbaI-Fragments, das eine überflüssige Restriktionsendonuclease-Stelle (Plasmid pCRS02) aufweist; danach wird ein DNA-Fragment eingeführt, welches das Lactose-Repressor (lacIq)-Gen, abgeleitet vom Plasmid pMJR1560 [Gene, Bd. 51, Seiten 225–267 (1987)] enthält, um das Plasmid pCRS04 zu ergeben. Ein Flußdiagramm der Konstruktion des Plasmids pCRS04 von Plasmid pHS2870 wird in 5 gezeigt. Das auf diese Weise konstruierte Plasmid pCRS04 wird in 6 gezeigt. Das Plasmid ist ein Runaway-Plasmid, welches durch IPTG induziert wird; Im Allgemeinen liegt das Plasmid in einer Kopienzahl von 1 bis 2 Kopien pro Escherichia coli-Zelle vor; diese Kopienzahl wird jedoch durch die Beimengung von IPTG auf mehrere Hundert erhöht.
  • Um die Expression des gewünschten Gens, welches in das Plasmid inseriert ist, zu kontrollieren, kann der PSP6-OlacEX-Linker, ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das die SP6-Promotorsequenz und die lac-Operatorsequenz enthält, in die NheI-Stelle des Plasmids eingeführt werden, um das Plasmid pACE601 zu konstruieren. Der PSF6-OlacEX-Linker wird aus den beiden DNA-Strängen hergestellt, deren Basensequenzen im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 7 und SEQ ID NR: 8 gezeigt werden. Das Plasmid pACE601 ist ein Runaway-Plasmidvektor, der ein Chloramphenicol-Resistenzgen als einen Selektionsmarker aufweist.
  • Ferner können durch Einführung des BspHI-Fragments, welches das β-Lactamasegen, abgeleitet vom Plasmidvektor pUC118 (hergestellt von Takara Shuzo), enthält, in die NheI-Stelle des vorstehend beschriebenen Plasmids pCRS04 (Plasmid pCRS70), anschließende Entfernung des NcoI-BsaAI-Fragments, welches das Chloramphenicol-Resistenzgen enthält, und Ersatz durch den vorstehend beschriebenen PSP6-OlacEX-Linker die Plasmide pACE701 und pACE702 konstruiert werden; diese Plasmide haben den Linker in einander entgegengesetzten Richtungen inseriert. Diese Plasmide sind Runaway-Plasmidvektoren, welche das Ampicillin-Resistenzgen als einen Selektionsmarker aufweisen.
  • Die Wirksamkeit der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pACE601, pACE701 und pACE702, die zur Kontrolle der Expression des gewünschten Gens verwendet werden, kann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung des β- Galactosidasegens als ein Reportergen bestimmt werden. Es ist möglich Modell-Expressionsplasmide durch Einführung eines DNA-Fragments, welches das β-Galactosidasegen, das durch PCR unter Verwendung der Primer trpA-N-NcoI und lacZ-C-NcoI mit dem Plasmid pMS434 (Gene, Bd. 57, Seiten 89–99 (1987)] als eine Matrize amplifiziert wurde, in die NcoI-Stelle stromabwärts des SP6-Promotors in jedem der vorstehend beschriebenen drei Plasmide zu konstruieren. Die Basensequenzen der Primer trpA-N-NcoI und lacZ-C-NocI werden im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 9 bzw. SEQ ID NR: 10 gezeigt. Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide werden als pACE601Z, pACE701Z bzw. pACE702Z bezeichnet. In mit diesen Modell-Expressionplasmiden transformierten Escherichia coli wurde absolut keine β-Galactosidaseaktivität nachgewiesen, was auf eine sehr genaue Kontrolle der Expression des β-Galactosidasegens hinweist.
  • Unter Verwendung des Nsp7524III-Restriktionsendonuclease-Gens ist es möglich zu bestätigen, dass ein Gen, dessen Expressionsprodukt auf den Wirt tödlich wirkt; isoliert und unter der Verwendung des Plasmids der vorliegenden Erfindung exprimiert werden kann. Das Plasmid pBRN3 enthält das Nsp7524III-Restriktionsmodifikationsystem-Gen. Mit diesem Plasmid transformierter Escherichia coli MC1061, der als Escherichia coli MC1061/pBRN3 bezeichnet wird, ist unter der Zugangsnummer FERM-BP-5741 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Adresse: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan] seit dem 28. September 1995 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) hinterlegt worden. Durch eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von einem Paar der Primer L-ORF und NspR-ORF3 mit dem von der Transformante hergestellten Plasmid pBRN3 als Matrize kann ein DNA-Fragment erhalten werden, welches das Nsp7524III-Restriktionsendonuclease-Gen alleine enthält. Die Basensequenzen der Primer L-ORF und NspR-ORF3 werden im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 11 bzw. SEQ ID NR: 12 gezeigt. Durch Einführung des Plasmids pACE601-NspIII in Escherichia coli HB101, welches durch Insertion des resultierenden DNA-Fragments in die NcoI-Stelle stromabwärts vom SP6-Promotor des vorstehend beschriebenen Plasmids pACE601 erhalten wird, kann die Transformante Escherichia coli HB101/pACE601-NspIII erhalten werden. Die Transformante erlaubt dem Wirt das Nsp7524III-Restriktionsendonuclease-Gen trotz der Abwesenheit des Nsp7524III-Modifikationsenzym-Gens stabil beizubehalten.
  • Darüber hinaus kann die Transformante Escherichia coli HB101/pFSP6/pACE601-NspIII durch Einführung des vorstehend beschriebenen Systemplasmids pFSP6 in die Transformante erzeugt werden. Durch Züchtung der Transformante und Induktion der Expression durch die Beimengung von IPTG zur entsprechenden Zeit kann die Möglichkeit der Produktion der Nsp7524III-Restriktionsendonuclease in der Kultur bestätigt werden.
  • Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens bereit, gekennzeichnet durch die Verwendung des vorstehend beschriebenen Plasmidvektors. Das Isolierungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird geeigneterweise auf die Isolierung eines Gens, besonders eines Restriktionsendonuclease-Gens, angewandt, dessen Expressionsprodukt für den Wirt tödlich oder schädlich ist. Durch Verwendung des vorliegenden Verfahrens ist es möglich ein Restriktionsendonuclease-Gen zu isolieren, das bis jetzt noch nicht isoliert worden ist, z.B. das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen, sogar in Abwesenheit des AccIII-Modifikationsenzym-Gens. Die Isolierung eines Restriktionsendonuclease-Gens kann nicht nur durch das „Shotgun-Verfahren" erzielt werden, wobei die genomische DNA eines Mikroorganismus, der das gewünschte Enzym produziert, mit der entsprechenden Restriktionsendonuclease geschnitten wird und das daraus resultierenden DNA-Fragment zum Beispiel direkt in das Plasmid pACE611 inseriert wir, sondern auch durch die Verwendung einer Kassetten-Genbank der genomischen DNA eines Mikroorganismus, der die Restriktionsendonuclease produziert. Durch Erhalt eines Gens durch DNA-Amplifikation mit der Kassetten-Genbank als eine Matrize ist es möglich ein Gen zu exprimieren, das von einem Mikroorganismus erzeugt wurde, dessen Transkriptionsmechanismus sich von dem des Wirtes unterscheidet. Das Verfahren der Isolierung eines Restriktionsendonuclease-Gens unter Verwendung einer Kassetten-Genbank wird nachstehend mit Hinweis auf ein Beispiel beschrieben, das die AccIII-Restriktionsendonuclease einschließt.
  • Eine Kassetten-Genbank der genomischen DNA eines Mikroorganismus, der die AccIII-Restriktionsendonuclease produziert, d.h. ein Acc-Bakterium, kann wie folgt hergestellt werden: genomische DNA wird aus der Zellkultur eines Acc- Bakteriums isoliert und mit der entsprechenden Restriktionsendonuclease gespalten, danach wird das entsprechende DNA-Fragment in eine Kassette ligiert, die ein überhängendes Ende hat, das komplementär zum Fragment ist. Mehrere ähnliche Kassetten-Genbanken werden unter Verwendung verschiedener Restriktionsendonucleasen für die Spaltung von genomischer DNA hergestellt. Diese Genbanken werden im Allgemeinen als eine genomische Acc-Kassetten-Genbank bezeichnet. Als Nächstes wird das gewünschte Restriktionsendonuclease-Protein vom Acc-Bakterium gereinigt, seine Aminosäuresequenz wird teilweise bestimmt und ein Primer wird auf Basis der Sequenz synthetisiert. Unter Verwendung dieses Primers und des Kassettenprimers wird eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion mit jeder Kassetten-Genbank als eine Matrize durchgeführt, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das ein AccIII-Restriktionsendonuclease-Genfragment enthält. Die Basensequenz des erhaltenen DNA-Fragments wird zum Beispiel durch direkte Sequenzierung des PCR-Produktes bestimmt, um die gesamte Länge der Basensequenz des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens zu bestimmen.
  • Durch Entwurf eines Primers, der im Stande ist die Sequenz des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens in gesamter Länge von der Basensequenz zu amplifizieren, und Durchführung einer auf PCR basierenden DNA-Amplifikationsreaktion unter Verwendung dieses Primers mit der genomischen DNA des Acc-Bakteriums als eine Matrize wird ein DNA-Fragment erhalten, welches die Sequenz des AccIII-Restriktionsendonucleasen-Gens in gesamter Länge enthält. Das erhaltene DNA-Fragment wird stromabwärts vom SP6-Promotor des Plasmids pACE611 inseriert, sodass die Codon-Leserahmen angeglichen werden, und das sich daraus ergebende rekombinante Plasmid wird zum Beispiel in Escherichia coli JM109 eingeführt, um Transformanten zu ergeben. Transformanten, die das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen in einem exprimierbaren Zustand enthalten, können durch Züchtung jeder Transformante, Induktion der Genexpression durch das Genexpressionverfahren der vorliegenden Erfindung und Bestimmung der AccIII-Restriktionsendonuclease-Aktivität in jeder erhaltenen Kultur sowie durch Erstellung der Restriktionsendonuclease-Karte der in jeder Transformante enthaltenen Plasmid-DNA ausgewählt werden.
  • Das auf diese Weise erhaltene AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen wurde jetzt in das Plasmid pACE611 inseriert und das daraus resultierende Plasmid wurde als pCRA19 bezeichnet. Die Restriktionsendonuclease-Karte dieses Plasmids wird in 7 gezeigt, wobei die fettgedruckte Linie das DNA-Fragment anzeigt, welches das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen enthält. Escherichia coli JM101, welcher das Plasmid pCRA19 enthält, bezeichnet als Escherichia coli JM109/pCRA19, ist unter der Zugangsnummer FERM-BP-5743 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [Adresse: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan] seit dem 28. Mai 1996 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) hinterlegt worden. Die Transformante behält das Restriktionsendonuclease-Gen trotz der Abwesenheit des AccIII-Modifikationsenzym-Gens darin stabil bei. Durch das vorstehend beschriebene Verfahren kann ein Restriktionsendonuclease-Gen ohne die gleichzeitige Anwesenheit eines Modifikationsenzym-Gens, das ein Restriktions-Modifikationssystemgen darstellt, isoliert werden.
  • Die Beschreibung beschreibt ein Polypeptid, das eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • In der vorliegenden Beschreibung kann der Begriff „AccIII-Restriktionsendonuclease" in manchen Fällen als ein allgemeiner Begriff eines Polypeptids verwendet werden, welches eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt. Die AccIII-Restriktionsendonuclease umfasst zum Beispiel die im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 1 beschriebene Aminosäuresequenz.
  • Die AccIII-Restriktionsendonuclease schließt auch das Polypeptid ein, welches die gesamte oder einen Teil der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 1 beschriebenen Aminosäuresequenz enthält und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt, ist aber nicht auf sie beschränkt. Darüber hinaus wird in der vorliegenden Erfindung das Polypeptid beschrieben, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus mindestens einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 oder einem Teil davon im Sequenzprotokoll resultiert und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • Im Allgemeinen kann ein natürlich vorkommendes Protein eine Deletion, Insertion, Addition, Substitution und andere Variationen von Aminosäureresten in seiner Aminosäuresequenz aufgrund von Modifikationen usw. des Proteins in vivo oder während der Reinigung, sowie auf Grund von Polymorphismus und Variation des Gens, das die codiert, durchmachen. Trotzdem ist bekannt, dass es einige solcher Polypeptide gibt, welche im Wesentlichen hinsichtlich physiologischer und biologischer Aktivität äquivalent zu den variationsfreien Proteinen sind. Daher liegen jene, die strukturell von dem entsprechenden Protein verschieden sind, die aber keinen maßgeblichen Unterschied in Funktion oder Aktivität von dem Protein aufweisen, im Bereich der vorliegenden Erfindung. Es ist auch das Gleiche, wenn die vorstehenden Variationen künstlich in die Aminosäuresequenz eines Proteins eingeführt werden und es ist in diesem Fall möglich mehr verschiedenartige Varianten zu erzeugen. Zum Beispiel wird der Methioninrest am N-Terminus eines Proteins, welches in Escherichia coli exprimiert wird, Berichten zufolge oft durch die Aktivität der Methionin-Aminopeptidase entfernt, aber die Entfernung wird, abhängig von der Art der Proteine, nicht komplett durchgeführt und manche solche exprimierten Proteine weisen den Methioninrest auf und andere nicht. Die Anwesenheit oder Abwesenheit der Methioninreste beeinflusst die Enzymaktivität jedoch in den meisten Fällen nicht. Es ist auch bekannt, dass ein Polypeptid, welches aus dem Austausch eines besonderen Cysteinrestes mit Serin in der Aminosäuresequenz des menschlichen Interleukin 2 (IL-2) resultiert, seine IL-2-Aktivität beibehält [Science, 224, 1431 (1984)].
  • Durch die Herstellung eines Proteins mittels Gentechnik wird das gewünschte Gen außerdem oft als ein Fusionsprotein exprimiert. Zum Beispiel wird die N-terminale Peptidkette, die von einem anderen Protein abgeleitet wurde, an den N-Terminus des gewünschten Gens angehängt, um die Expression des gewünschten Proteins zu verstärken oder die Reinigung des gewünschten Proteins wird durch die Anheftung einer geeigneten Peptidkette an den N- oder C-Terminus des gewünschten Proteins, Expression des Proteins und Verwendung eines Trägerstoffes, der Affinität für die hinzugefügte Peptidkette zeigt, erleichtert. Folglich wird das Polypeptid, auch wenn es eine Aminosäuresequenz aufweist, die teilweise verschieden von der AccIII-Restriktionsendonuclease ist, in der Beschreibung beschrieben, solange als es im Wesentlichen äquivalente Wirkung zu der der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • Die AccIII-Restriktionsendonuclease kann zum Beispiel durch Züchtung der vorstehend beschriebenen Transformante Escherichia coli JM109/pCRA19, welche das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen enthält, durch Zugabe des induzierenden Wirkstoffes IPTG zu einer angemessenen Zeit während seiner Züchtung, um die Kopienzahl von pCRA19 zu erhöhen, und durch anschließende Infektion mit dem Phagen M13sp6 erhalten werden.
  • Die AccIII-Restriktionsendonuclease kann von der Kultur der Transformante zum Beispiel durch Sammlung der Zellen von der Kultur, anschließende Extraktion des Enzyms durch Aufbrechen mittels Ultraschall, Ultrazentrifugation usw., und dann Reinigung des Enzyms durch eine Kombination aus Nucleinsäure-Entfernung, Ausfällung mit Salz, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Ionen-Austauschchromatographie usw., geerntet werden Da die vorstehend beschrieben Kultur, die als Startmaterial für diese Reinigung dient, keine anderen Restriktionsendonucleasen wie zum Beispiel AccI und AccII enthält, kann eine Enzympräparation von gewünschter Reinheit leichter erzielt werden als durch herkömmliche Reinigungsverfahren.
  • Die Beschreibung beschreibt darüber hinaus eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt.
  • Die DNA, die ein Polypeptid codiert, welches eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt, umfasst eine DNA, welche die im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 1 beschriebene Aminosäuresequenz codiert, und schließt zum Beispiel eine DNA ein, ist aber nicht darauf beschränkt, umfassend die im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 2 beschriebene Basensequenz. Im Besonderen werden die folgenden DNAs beschrieben:
    • (1) eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das die Gesamte oder einen Teil der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 1 beschriebenen Aminosäuresequenz enthält und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt;
    • (2) eine DNA, welche die Gesamte oder einen Teil der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 2 gezeigten DNA enthält, wobei das Expressionsprodukt der DNA eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt;
    • (3) eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das aus mindestens einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 im Sequenzprotokoll oder einem Teil davon resultiert und eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt; und
    • (4) eine DNA, die im Stande ist mit der vorstehend in (1) bis (3) beschriebenen DNA zu hybridisieren und die ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease besitzt, usw..
  • Wenn die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen unter Verwendung der vorstehend erhaltenen DNA als Sonde durchgeführt wird, kann außerdem eine ähnliche DNA erhalten werden, die etwas unterschiedlich von der erhaltenen DNA ist (SEQ ID NR: 2 im Sequenzprotokoll), die aber ein Polypeptid codiert, das die gleiche Enzymaktivität aufweist.
  • Eine solche stringente Bedingung bezieht sich auf jene, der die Membran mit der darauf immobilisierten DNA unterworfen wird, um zum Beispiel mit der Sonde in einer Lösung zu hybridisieren, die 6 × SSC (1 × SSC ist eine Lösung von 8,76 g NaCl und 4,41 g Natrium-Citrat in einem Liter Wasser), 1% SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Polyvinylpyrrolidon und 0,1% Ficoll enthält, wobei die Inkubation bei 65°C für 20 Stunden erfolgt.
  • Die Verfahren zur Erlangung ähnlicher DNA, welche die AccIII-Restriktionsendonuclease codiert, durch Hybridisierung schließen zum Beispiel das folgende Verfahren ein.
  • Zuerst wird DNA, die von einer geeigneten Gen-Quelle erhalten wird, durch ein herkömmliches Verfahren an ein Plasmid oder einen Phagenvektor ligiert, um eine DNA-Genbank zu ergeben. Diese Genbank wird in einen geeigneten Wirt eingeführt; die daraus resultierenden Transformanten werden auf Platten gezüchtet; Kolonien oder Plaques, die gewachsen sind, werden auf Nitrocellulose oder Nylonmembranen transferiert und denaturiert, danach wird die DNA an die Membran gebunden. Diese Membranen werden unter den vorstehend gezeigten Bedingungen zur Hybridisierung in einer Lösung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung inkubiert, die eine Sonde enthält, die zuvor mit 32P, usw. markiert wurde (die verwendete Sonde kann jedes Polynucleotid sein, das die Gesamte oder eine Teilsequenz der Aminosäuresequenz codiert, die im Sequenzprotokoll von SEQ ID NR: 1 gezeigt wird, veranschaulicht durch ein Polynucleotid, welches aus der gesamten oder einem Teil der Basensequenz besteht oder sie enthält, welche im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 2 gezeigt wird). Nach Beendigung der Hybridisierung wird die nicht-spezifisch angelagerte Sonde weggewaschen, gefolgt von Autoradiographie, usw., um Clone zu identifizieren, die an die Sonde hybridisiert haben. Dieser Ablauf wird wiederholt, bis der gewünschte hybridisierende Clon isoliert wurde. Der auf diese Weise erhaltene Clon behält DNA bei, die ein Polypeptid codiert, welches die gewünschte Enzymaktivität aufweist.
  • Die erhaltene DNA wird zum Beispiel durch das nachstehend beschriebene Verfahren auf ihre Basensequenz hin bestimmt, um zu bestätigen, dass sie das gewünschte Enzymprotein codiert.
  • Für die Basensequenzierung wird, wenn der Wirt Escherichia coli ist, die Transformante in einem Probenröhrchen, usw. gezüchtet und ein Plasmid wird durch ein herkömmliches Verfahren erzeugt, vorausgesetzt, dass die Transformante unter Verwendung eines Plasmidvektors hergestellt worden ist. Unter Verwendung des erhaltenen Plasmids als eine Matrize, wie es ist oder nachdem die Insertion entfernt wurde und in den M13 Phagenvektor, usw. subcloniert wurde, wird die Basensequenz durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Im Falle einer auch unter Verwendung eines Phagenvektors hergestellten Transformante kann die Basensequenz grundsätzlich durch die gleichen Verfahren bestimmt werden.
  • Diese grundsätzlichen experimentellen Abläufe von der Züchtung zur Basensequenzierung werden zum Beispiel in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, T. Maniatis et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben.
  • Ob die erhaltene DNA ähnlich der DNA ist, welche die gewünschte AccIII-Restriktionsendonuclease codiert, oder nicht, kann durch Vergleich der bestimmten Basensequenz mit der Basensequenz, die im Sequenzprotokoll von SEQ ID NR: 2 gezeigt wird, oder durch Vergleich der Aminosäuresequenz, die von der bestimmten Basensequenz abgeleitet wurde, mit der Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 1 gezeigt wird, bestätigt werden.
  • Wenn die erhaltene DNA nicht den gesamten Teil des Bereichs enthält, der die gewünschte Restriktionsendonuclease codiert, kann der gesamte codierende Bereich durch Synthese eines Primers basierend auf der Basensequenz der erhaltenen DNA und Amplifizierung der fehlenden Region durch PCR unter Verwendung des Primers oder Wiederholung der Durchmusterung der DNA-Genbank unter Verwendung des erhaltenen DNA-Fragments als Sonde erhalten werden.
  • Es ist möglich eine Transformante zu erzeugen, welche die auf diese Weise erhaltene ähnliche DNA beinhaltet, welche die AccIII-Restriktionsendonuclease codiert, um der Transformante die Expression des von der DNA codierten Enzymproteins zu ermöglichen und das exprimierte Enzymprotein zu reinigen. Die Erzeugung der Transformante und die Expression und Reinigung des Enzymproteins können alle durch Verwendung des in dieser Beschreibung beschriebenen Plasmids erreicht werden. Das auf diese Weise erhaltene Enzymprotein behält die AccIII-Restriktionsendonuclease-Aktivität bei.
  • Außerdem können das AccIII-Modifikationsenzym und die das Enzym codierende DNA, die beide bis jetzt noch nicht erhalten wurden, auch unter Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA, welche die AccIII-Restriktionsendonuclease codiert, erhalten werden.
  • Zum Beispiel kann auf der Basis der in vielen Fällen gegenseitig nahen Lage eines Restriktionsendonuclease-Gens und eines Modifikationsenzym-Gens dieses Ziel durch Erhalt eines Genbereichs, der ein Protein nahe dem Restriktionsendonuclease-Gen codiert, mittels einer DNA-Amplifikationsreaktion mit einer Kassetten-Genbank als eine Matrize und durch seine Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor, um dem Gen die Expression zu ermöglichen, sowie durch Bestätigung der Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms mittels eines entsprechenden Verfahrens erreicht werden. Die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms kann zum Beispiel auch auf der Basis der Resistenz der von der Transformante erzeugten DNA gegen die Spaltungsaktivität der AccIII-Restriktionsendonuclease bestätigt werden. Vorausgesetzt, dass die Basensequenz des vorstehend beschriebenen Genbereichs bestimmt wird, um die Homologie zu einem konservierten Bereich zwischen den Modifikationsenzym-Genen eines bekannten Restriktionsmodifikationssystems zu bestätigen [Journal of Molecular Biology, Bd. 206, Seiten 305–321 (1989)], kann zu einem gewissen Grad vor der Genexpression erwartet werden, dass das Gen ein Modifikationsenzym-Gen ist.
  • Unter Verwendung einer wie vorstehend beschriebenen Kassetten-Genbank der genomischen DNA des Acc-Bakteriums kann das AccIII-Modifikationsenzym und die es codierende DNA erhalten werden. Seine Aminosäurensequenz und Basensequenz werden im Sequenzprotokoll von SEQ ID NR: 13 bzw. SEQ ID NR: 14 gezeigt.
  • Das AccIII-Modifikationsenzym hierin ist nicht auf das vorstehend beschriebene beschränkt. Wie in der Beschreibung der AccIII-Restriktionsendonuclease dargelegt, ist es ein Polypeptid, das die Gesamte oder einen Teil der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 13 beschriebenen Aminosäuresequenz enthält und die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms besitzt. Darüber hinaus wird auch das Polypeptid beschrieben, das aus mindestens einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 13 im Sequenzprotokoll oder einem Teil davon resultiert und die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzym besitzt.
  • Zum Beispiel umfasst eine DNA, die das AccIII-Modifikationsenzym hierin codiert, eine DNA, welche die im Sequenzprotokoll in der SEQ ID NR: 13 beschriebene Aminosäuresequenz codiert, und schließt eine DNA ein, ist aber nicht darauf beschränkt, welche die Basensequenz umfasst, die im Sequenzprotokoll in der SEQ ID NR: 14 beschrieben ist. Im Besonderen werden in der Beschreibung die folgenden DNAs beschrieben:
    • (1) eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das die gesamte oder einen Teil der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 13 beschriebenen Aminosäuresequenz enthält und die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms besitzt;
    • (2) eine DNA, welche die gesamte oder einen Teil der im Sequenzprotokoll in SEQ ID NR: 14 gezeigten DNA enthält, wobei das Expressionsprodukt der DNA die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms besitzt;
    • (3) eine DNA, welche ein Polypeptid codiert, das aus mindestens einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 13 im Sequenzprotokoll oder einem Teil davon resultiert und die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms besitzt; und
    • (4) eine DNA, die im Stande ist mit der vorstehend in (1) bis (3) beschriebenen DNA zu hybridisieren und ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms besitzt, usw.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend an Hand der folgenden Referenzbeispiele und Arbeitsbeispiele ausführlicher beschrieben; diese Beispiele sind nicht als limitierend auszulegen. Von den hierin beschriebenen Verfahren wurden die grundlegenden Verfahren betreffend Plasmidpräparation, Spaltung mit Restriktionsendonucleasen, usw. gemäß den in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von T. Maniatis et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschriebenen Verfahren ausgeführt.
  • Referenzbeispiel
  • (1) Züchtungsmedium und Bedingungen
  • Escherichia coli wurde aerob bei 37°C unter Verwendung von LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefe-Extrakt, 0,5% NaCl, pH-Wert 7,0) gezüchtet. Jedes Antibiotikum wurde, abhängig vom in Escherichia coli beinhalteten Plasmid, in verschiedenen Konzentrationen wie folgt hinzugefügt: 25 μg/ml Kanamycin für pFSP6, 20 μg/ml Ampicillin für pXX325, 50 μg/ml Ampicillin für Ampicillin-resistentes ColE1-Typ-Plasmid und 100 μg/ml Ampicillin für ein Ampicillin-resistentes pUC-Typ-Plasmid. Im Expressions-Induktionsexperiment wurde die nach der Züchtung bis zur stationären Phase erhaltene Kulturlösung zu 1% in ein frisches Medium inokuliert und dann aerob bei 37°C gezüchtet, danach wurde Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM nach Erreichen eines OD600-Werts von 0,6 (6 × 108 Zellen/ml) hinzugefügt, gefolgt von weiterer Züchtung.
  • (2) Konstruktion des Systemplasmids pFSP6
  • Das Systemplasmid pFSP6 wurde mit Escherichia coli JM109 als Wirt gemäß dem in 8 angezeigten Verfahren konstruiert. Das Plasmid pSP6-2 (Nucleic Acids Research, Bd. 15, Seiten 2653–2664 (1987)] wurde mit HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) gespalten und beidseitig mit glatten Enden versehen, danach wurde es mit BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) weiter gespalten, um ein etwa 2,8 kb-DNA-Fragment zu ergeben, welches das SP6-RNA-Polymerasegen enthielt; dieses Fragment wurde zur Ligierung mit dem Plasmidvektor pUC18 (hergestellt von Takara Shuzo) gemischt, der vorher mit BamHI und HincII (hergestellt von Takara Shuzo) gespalten wurde, um das Plasmid pUCSP zu konstruieren. Als Nächstes wurde das Plasmid pMJR1560 [Gene, Bd. 51, Seiten 225–267 (1987)] mit KpnI gespalten und beidseitig mit glatten Enden versehen, danach wurde es mit PstI (hergestellt von Takara Shuzo) weiter gespalten, um ein etwa 1,3 kb-DNA-Fragment zu ergeben, welches das lacIq-Gen enthielt, das dann isoliert wurde. Das vorstehende Plasmid pUCSP wurde mit HindIII gespalten und beidseitig mit glatten Enden versehen, danach wurde es mit PstI weiter gespalten, um ein DNA-Fragment zu ergeben, welches mit dem vorstehend beschriebenen etwa 1,3 kb DNA-Fragment zur Ligierung gemischt wurde, um das Plasmid pUCSPlac zu konstruieren.
  • Darüber hinaus wurde ein etwa 1,5 kb-DNA-Fragment, das durch PstI-Spaltung von pUCKm [Journal of Molecular Biology, Bd. 147, Seiten 217–226 (1981)] erhalten wurde, welches das Kanamycin-Resistenzgen enthält, in die PstI-Stelle des vorstehend beschriebenen Plasmids pUCSPlac eingeführt, um das Plasmid pUCSPlacKm zu konstruieren. Das Plasmid wurde mit AatII (hergestellt von Toyobo) gespalten, danach wurde es teilweise mit NspI (hergestellt von Takara Shuzo) gespalten, um ein etwa 6,5 kb-DNA-Fragment zu isolieren, welches dann beidseitig mit glatten Enden versehen wurde.
  • Andererseits wurde das Plasmid pXX325 [Proceedings of the National Academy of Science of the USA, Bd. 80, Seiten 4784–4788 (1983)] mit HindIII gespalten und beidseitig mit glatten Enden versehen, danach wurde es mit SalI weiter gespalten, um ein etwa 6,8 kb-DNA-Fragment zu isolieren, das den Replikationsursprung des MiniF-Plasmids enthält; dieses Fragment wurde dann zur Ligierung mit dem vorstehend beschriebenen etwa 6,5 kb-DNA-Fragment gemischt, um das Plasmid pFSP6 zu konstruieren. Escherichia coli HB101 wurde mit dem Plasmid transformiert, um Escherichia coli HB101/pFSP6 zu bilden.
  • (3) Konstruktion von Multikopien-Modell-Expressionsplasmiden
  • Der PSP6 Linker, ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das den Minimalbereich des SP6-Promotors enthält, wurde von den beiden DNA-Strängen erzeugt, deren Basensequenzen im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 15 bzw. SEQ ID NR: 16 gezeigt werden, und wurde zur Ligierung mit dem Plasmid pMS434 [Gene, Bd. 57, Seiten 89–99 (1987)] gemischt, welches vorher mit XhoI (hergestellt von Takara Shuzo) und HindIII gespalten wurde, um das Modell-Expressionsplasmid pMSP6L zu konstruieren, das die vorstehend beschriebene Promotorsequenz stromaufwärts vom β-Galactosidasegen auf dem Plasmid beinhaltete (1).
  • Andererseits wurde das Modell-Expressionsplasmid pMSP6F durch Inserierung eines DNA-Fragments, das die inhärente SP6-Promotorsequenz enthielt, die durch Spaltung von pSP64 [Nucleic Acids Research, Bd. 12, Seiten 7035–7056 (1984)] mit AccII und HindIII erhalten wurde, in die XhoI-HindIII-Stelle des vorstehend beschriebenen Plasmids pMS434 konstruiert (1). Darüber hinaus wurde der PSP6-Olac-Linker, der den Minimalbereich des SP6-Promotors und den lac-Operatorbereich enthielt, von den beiden DNA-Strängen erzeugt, deren Basensequenzen im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 17 bzw. SEQ ID NR: 18 gezeigt werden, und wurde zwischen die XhoI-HindIII-Stelle des vorstehend beschriebenen Plasmids pMS343 inseriert, um das Modell-Expressionsplasmid pMSP60 (2) zu konstruieren.
  • (4) Die Promotoraktivität des SP6-Promotors für die Escherichia coli-RNA-Polymerase
  • Die Plasmide pMSP6L und pMSP6F, die im Referenzbeispiel (3) konstruiert wurden, und das Plasmid pMS434, das keine SP6-Promotorsequenz enthält, als eine Kontrolle wurden jedes in Escherichia coli eingebracht, gezeigt in Tabelle 1. Die daraus resultierenden Transformanten wurden alle durch das in Referenzbeispiel (1) beschriebene Verfahren gezüchtet, danach wurde jede Zellkulturbrühe während der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Der OD600-Wert von jeder eingesammelten Kulturlösung wurde bei einem Teil davon bestimmt, während der verbleibende Teil in ein vorgekühltes Proberöhrchen transferiert wurde und mit Chloramphenicol zu einer Endkonzentration von 100 mg/ml ergänzt wurde. Mit dieser Kulturbrühe als eine Probe wurde die Aktivität der β-Galactosidase mittels des in Experiments in Molecular Genetics, herausgegeben bei J. H. Miller, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, beschriebenen Verfahrens bestimmt.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, wies Escherichia coli MC4100, welches das Modell-Expressionsplasmid pMSP6L oder pMSP6F beinhaltete, die beide eine Sequenz des SP6-Promotors enthielten, ähnliche Niveaus an niedriger β-Galactosidaseaktivität auf, unabhängig von der inserierten Promotorsequenz. Derjenige, der Plasmid pMS434 beinhaltete, das keinen SP6-Promotor enthielt, wies jedoch nur niedrige Enzymaktivität auf. Außerdem zeigte der Vergleich von Escherichia coli MRi7 und MRi80 als Wirt verminderte β-Galactosidaseaktivität in MRi80, wobei die Kopienzahl des Plasmids auch vermindert war.
  • (5) Bewertung des Systemplasmids pFSP6
  • Jede der in Referenzbeispiel (4) erzeugten Transformante, in welche das Systemplasmid pFSP6 weiter eingeführt wurde, wurde durch das in Referenzbeispiel (1) beschriebene Verfahren gezüchtet; die Aktivität der β-Galactosidase wurde sowohl unter nicht-induktiver Bedingung als auch unter induktiver Bedingung vor und nach der Zugabe von IPTG bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Alle Transformanten zeigten β-Galactosidaseaktivität unter nicht-induktiver Bedingung auf einem Niveau ähnlich zu dem, welches in der Abwesenheit des Plasmids pFSP6 erhalten wird, gezeigt in Tabelle 2.
  • Andererseits war die β-Galactosidaseaktivität bei Induktion durch IPTG-Zugabe in den Transformanten, welche die Plasmide pMSP6L und pMSP6F beinhalteten, 18 bis 32-Mal höher verglichen mit der, die unter nicht-induktiver Bedingung erhalten wurde, während in den Transformanten, welche das Plasmid pMS434 beinhalteten, kein Anstieg in der Aktivität vorlag.
  • (6) Effekt der lac-Operatorsequenz auf die Expressionskontrolle
  • Transformanten, die durch Einführung der Plasmide pMSP6L, pMSP6F, pMSP60 bzw. pMS434 in Escherichia coli MC4100 erhalten wurden, welcher das Plasmid pFSP6 enthielt, wurden durch das in Referenzbeispiel (1) beschriebene Verfahren gezüchtet und die β-Galactosidaseaktivität wurde unter nicht-induktiver Bedingung bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Die Transformante, die das Plasmid pMSP60 beinhaltete, welches die lac-Operatorsequenz enthielt, zeigte nach wie vor etwas β-Galactosidaseaktivität, obwohl das Aktivitätsniveau niedriger war als jene, die mit den Plasmiden pMSP6L und pMSP6F erhalten wurden. Kurz gesagt konnte die Expression einfach durch Einführung der lac-Operatorsequenz unter nicht-induktiver Bedingung nicht vollständig unterdrückt werden.
  • Tabelle 4
    Figure 00370001
  • Beispiel 1
  • (1) Kulturmedium und Bedingungen
  • Escherichia coli wurde aerob bei 37°C unter Verwendung von LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefe-Extrakt, 0,5% NaCl, pH-Wert 7,0) gezüchtet. Jedes Antibiotikum wurde, abhängig vom in Escherichia coli beinhalteten Plasmid, in verschiedenen Konzentrationen wie folgt zum Medium hinzugefügt: 25 μg/ml Kanamycin für pFSP6, 50 μg/ml Ampicillin für Ampicillin-resistentes ColE1-Typ-Plasmid, 100 μg/ml Ampicillin für ein Ampicillin-resistentes pUC-Typ-Plasmid, 30 μg/ml Chloramphenicol für Chloramphenicol-resistentes Runaway-Plasmid und 30 μg/ml Ampicillin für Ampicillin-resistentes Runaway-Plasmid. Im Expressions-Induktionsexperiment wurde die Kulturbrühe, die nach der Züchtung bis zur stationären Phase erhalten wurde, zu 1% in frisches Medium inokuliert und dann aerob bei 37°C gezüchtet, danach wurde Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) nach Erreichen eines OD600 Werts von 0,6 (6 × 108 Zellen/ml) bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt, gefolgt von weiterer Züchtung.
  • (2) Konstruktion des Runaway-Plasmids pHS2870
  • Das Runaway-Plasmid pHS2870, das eine Basis für die Konstruktion des Expressionsplasmids bereitstellte, wurde durch die in 3 gezeigten Verfahren konstruiert. Das 106-NdeI-DNA-Fragment, welches von den beiden DNA-Strängen hergestellt wurde, deren Basensequenzen im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 3 bzw. SEQ ID NR: 4 gezeigt werden, wurde zur Ligierung mit dem vorher mit NdeI gespaltenen Plasmidvektor pUC19 gemischt. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid pUC106A wurde mit PvuII gespalten und der Selbstligierung unterzogen, um das Plasmid pUC106AdP0 zu ergeben. Mit diesem Plasmid pUC106AdP0 als eine Matrize wurde dann PCR unter Verwendung des RNAIIA-Primers (dessen Basensequenz im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 5 gezeigt wird) und des 1870 Primers (dessen Basensequenz im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 6 gezeigt wird) durchgeführt, um ein amplifiziertes DNA-Fragment zu ergeben, welches dann mit XbaI gespalten und mit dem vorher mit XbaI gespaltenen Plasmid pSTV28 zur Ligierung gemischt wurde, um das Plasmid pHS2870 zu ergeben. Das Konstrukt des Plasmids pHS2870 wird in 4 gezeigt.
  • (3) Konstruktion des Runaway-Plasmids pCRS04
  • Nach Spaltung mit AccI (hergestellt von Takara Shuzo) und NspI wurde das vorstehend beschriebene Plasmid pHS2870 beidseitig mit glatten Enden versehen und der Selbstligierung unterzogen, um das Plasmid pCRS01 zu ergeben, dem der P15A-Repliktionsursprung fehlt. Das Plasmid wurde dann mit EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und XbaI gespalten, danach wurde es, in der gleichen Art, wie vorstehend erwähnt, beidseitig mit glatten Enden versehen und der Selbstligierung unterzogen, um Plasmid pCRS02 zu konstruieren. Nachdem ein etwa 1,2 kb-DNA-Fragment, welches durch Spaltung des Plasmids pMJR1560 mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und PstI erhalten wurde, beidseitig mit glatten Enden versehen wurde, wurde es mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pCRS02 zur Ligierung gemischt, das vorher mit NspV und VspI (beide hergestellt von Takara Shuzo) gespalten und dann beidseitig mit glatten Enden versehen wurde, um das Plasmid pCRS04 zu ergeben. Das Flußdiagramm der Konstruktion des Plasmids pCRS04 wird in 5 gezeigt und das Konstrukt des Plasmids pCRS04 in 6.
  • (4) Konstruktion des Runaway-Expressionsvektors pACE601
  • Das vorstehend beschriebene Plasmid pCRS04, das vorher mit NheI (hergestellt von Takara Shuzo) gespalten und anschließend beidseitig mit glatten Enden versehen wurde, wurde mit dem PSP6-OlacEX-Linker zur Ligierung gemischt, welcher aus beiden DNA-Strängen hergestellt wurde, deren Basensequenzen im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 7 bzw. SEQ ID NR: 8 gezeigt werden, um das Plasmid pACE601 zu konstruieren. Das Flußdiagramm der Konstruktion des Plasmids pACE601 wird in 9 gezeigt. Die Konstruktion dieser Plasmide wurde mit Escherichia coli JM109 als Wirt durchgeführt.
  • (5) Konstruktion des Runaway-Expressionsvektors pACE611
  • Der Runaway-Expressionsvektor pACE601 wurde mit XhoI-HindIII gespalten und der PSP6-Linker, der aus den synthetischen Oligo-DNAs besteht, die im Sequenzprotokoll von SEQ ID NR: 15 bzw. SEQ ID NR: 16 gezeigt werden, wurde in diese Stelle inseriert, um den Runaway-Expressionsvektor pACE611 zu konstruieren. Das Konstrukt von pACE611 wird in 10 gezeigt. Das Flußdiagramm der Konstruktion des Plasmid pACE611 wird in 11 gezeigt.
  • (6) Konstruktion der Runaway-Expressionsvektoren pACE701 und pACE702 Ein etwa 1 kb-DNA-Fragment, hergestellt durch Spaltung des Plasmidvektors pUC118 (hergestellt von Takara Shuzo) mit BspHI (hergestellt von NEB), wurde beidseitig mit glatten Enden versehen, danach wurde es zur Ligierung mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pCRS04 gemischt, welches vorher mit NheI gespalten und beidseitig mit glatten Enden versehen wurde, um das Plasmid pCRS70 zu konstruieren. Das Flußdiagramm der Konstruktion von Plasmid pCRS70 wird in 12 gezeigt. Als Nächstes wurde das Plasmid mit NcoI (hergestellt von Takara Shuzo) und BsaAI (hergestellt von NEB) gespalten, danach wurde es beidseitig mit glatten Enden versehen und zur Ligierung mit dem vorstehend beschriebenen PSP6-OlacEX-Linker gemischt, um die beiden Plasmide pACE701 und pACE702 zu konstruieren, die den Linker, inseriert in einander entgegengesetzte Richtungen, enthalten. Die Flußdiagramme der Konstruktion der Plasmide pACE701 und pACE702 werden in 13 gezeigt. Die Konstruktion dieser Plasmide wurde mit Escherichia coli JM109 als Wirt durchgeführt.
  • (7) Konstruktion von Modell-Runaway-Expressionsplasmiden
  • PCR wurde unter Verwendung der Primer trpA-N-NcoI und lacZ-C-NcoI mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pMS434 als eine Matrize durchgeführt, um ein DNA-Fragment zu ergeben, welches das β-Galactosidasegen enthält. Die Basensequenzen der Primer trpA-N-NcoI und lacZ-C-NcoI werden im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 9 bzw. SEQ ID NR: 10 gezeigt. Nach Spaltung mit NcoI wurde das Fragment mit jedem der vorstehend beschriebenen Plasmide pACE601, pACE701 und pACE702 zur Ligierung gemischt, die alle vorher mit NcoI gespalten wurden, um die Modell-Runaway-Expressionsplasmide pACE601Z, pACE701Z und pACE702Z zu erhalten, welche alle das β-Galactosidasegen, eingeführt stromabwärts von der PSP6-Olac-Sequenz, enthalten. Die Konstruktion dieser Plasmide wurde mit Escherichia coli JM109 als Wirt durchgeführt.
  • (8) Bewertung der Expressionsmengen des Runaway-Expressionsplasmids unter einer nicht-induktiven Bedingung
  • Jede der Transformanten MC4100/pFSP6/pACE601Z, MC4100/pFSP6/pACE701Z und MC4100/pFSP6/pACE702Z, die nach der Einführung der vorstehend beschriebenen Modell-Runaway-Expressionsplasmide pACE601Z, pACE701Z bzw. pACE702Z in Escherichia coli MC4100 erhalten wurden, der das vorstehend beschriebene Systemplasmid pFSP6 (nachstehend als MC4100/pFSP6 bezeichnet) beinhaltet, wurden unter den in Beispiel (1) beschriebenen Bedingungen gezüchtet; jede während der logarithmischen Wachstumsphase gesammelte Kulturbrühe wurde durch das in Referenzbeispiel (4) beschriebene Verfahren auf β-Galactosidaseaktivität getestet. In allen untersuchten Transformanten war die β-Galactosidaseaktivität unter der Nachweisgrenze und demonstrierte daher einen größeren Expressions-Unterdrückungseffekt als jenen, der mit den in Referenzbeispiel (4) gezeigten Multicopy-Plasmiden erhalten wurde.
  • (9) Konstruktion des Expressionsplasmids des Nsp7524III-Restriktionsendonuclease-Gens
  • Das Plasmid pBRN3, welches das Nsp7524III-Restriktions-Modifikationssystem-Gen enthielt, wurde von Escherichia coli MC1061/pBRN3 (FERM BP-5741) erzeugt. PCR wurde unter Verwendung der Primer L-ORF und NspR-ORF3 mit diesem Plasmid als eine Matrize durchgeführt, um ein etwa 1 kb-DNA-Fragment zu ergeben, welches das Nsp7524III-Restriktionsendonucleasen-Gen alleine enthält. Die Basensequenzen der Primer L-ORF und NspR-ORF3 werden im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 11 bzw. SEQ ID NR: 12 gezeigt. Nach Spaltung mit NcoI wurde das Fragment zur Ligierung mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pACE601, das vorher mit NcoI gespalten wurde, gemischt, um das Plasmid pACE601-NspIII zu konstruieren, welches das Nsp7524III-Restriktionsenzym-Gen, eingeführt stromabwärts von der PSP6-Olac-Sequenz, alleine enthält. Das Plasmid wurde stabil in Escherichia coli JM109 beibehalten, das kein Nsp7524III-Modifikationsenzym-Gen enthielt.
  • (10) Konstruktion des Nsp7524III-Restriktionsendonuclease-Genexpressionssystem
  • Die Transformanten HB101/pFSP6/pACE601-NspIII und HB101/pFSP6/pACE601, die nach der Einführung des vorstehend beschriebenen Plasmids pACE601-NspIII, welches das Nsp7524III Restriktionsendonuclease-Gen enthält, und des Kontrollplasmids pACE601 in Escherichia coli HB101 erhalten wurden, welches das vorstehend beschriebene Systemplasmid pFSP6 beinhaltet (nachstehend als HB101/pFSP6 bezeichnet), wurden jedes bis zur stationären Phase in LB-Medium gezüchtet; jede gesammelte Kulturbrühe wurde in zwei Röhrchen mit frischem Medium zu 1% inokuliert und aerob bei 37°C gezüchtet. Nach Erreichen eines OD600-Werts von 0,6 wurde IPTG zu einem der Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt, gefolgt von weiterer Züchtung. Nach Beendigung der Züchtung wurden die Zellen geerntet, in Zellaufschlußpuffer A (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol) suspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen, gefolgt von Zentrifugation, um einen Rohextrakt zu ergeben.
  • Ein μl-Teil dieses Rohextrakts wurde zu 30 μl einem Reaktionsgemisch hinzugefügt (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 1 μg λ-DNA) und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt, danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um die Spaltung der λ-DNA zu überprüfen und die Restriktionsendonuclease-Aktivität zu bestätigen. Wie in 14 gezeigt wird, wurde nur in HB101/pFSP6/pACE601-NspIII, wobei die Expression durch die Zugabe von IPTG induziert wurde, Restriktionsendonuclease-Aktivität beobachtet und die λ-DNA-Spaltungsmuster stimmten mit jenen von AvaI, einem Isoschizomer von Nsp7524III, überein.
  • Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen λ-DNA-Spaltungsreaktion, die für verlängerte Zeiträume von 2 und 3 Stunden durchgeführt wurden, werden in 15 gezeigt. In diesem Fall macht das von der Nsp7524III-Aktivität resultierende DNA-Fragment weiteren Abbau durch die Escherichia coli-Nuclase durch, da der Rohextrakt, der im vorliegenden Experiment verwendet wurde, Nuclease, abgeleitet vom Wirt Escherichia coli, enthielt; das resultierte auf den Spuren 8 bis 10 in Banden deren Dichte abnahm, wenn die Reaktionszeit zunahm, wobei keine Banden in Spur 10 nachgewiesen wurden. Auf den Spuren 11 bis 13 wurde das Nsp7524III-Spaltungsfragment aufgrund der Abwesenheit der Nsp7524III-Induktion nicht erzeugt, auch wenn die Reaktionszeit verlängert wurde, was zeigt, dass die λ-DNA durch direkte Wirkung der Escherichia coli-Nuclease in Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht umgewandelt wurde. Im Rohextrakt von HB101/pFSP6/pACE601 wurde keine Restriktiorsendonuclease-Aktivität festgestellt.
  • Beispiel 2
  • Isolierung und Expression des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens
  • (1) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des AccIII-Restriktionsendonuclease-Proteins und Synthese der Primer-DNA entsprechend der Aminosäuresequenz
  • Etwa 2 kE eines im Handel erhältlichen Produkts der AccIII-Restriktionsendonuclease (hergestellt von Takara Shuzo) wurden der Gelfiltration unter Verwendung einer Säule aus Sephacryl S300 (hergestellt von Pharmacia) unterzogen, um das Molekulargewicht der AccIII-Restriktionsendonuclease zu bestimmen. Der Elutionsposition nach zu urteilen, in welcher Aktivität nachgewiesen wurde, wurde das Molekulargewicht der AccIII-Restriktionsendonuclease mit etwa 70.000 bestätigt. Da die meisten Restriktionsendonuclease-Proteine Dimere sind, wurde vom AccIII-Restriktionsendonuclease-Protein erwartet, dass es in einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese bis auf eine Position für ein Molekulargewicht von etwa 35.000 bewegt werden würde.
  • Als nächstes wurden, um eine Probe für die N-terminale Aminosäuresequenzierung des AccIII-Restriktionsendonuclease-Proteins zu erhalten, etwa 2 kE eines im Handel erhältlichen Produkts der AccIII-Restriktionsendonuclease gemeinsam mit einem Protein-Molekulargewichtsmarker einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, danach wurde das Protein vom Gel auf eine PVDF-Membran transferiert und mit Bromphenol-Blau gefärbt, um die Proteinposition zu bestätigen. Nach dem Entfärben mit 10% Essigsäure-50% Methanol wurde der Teil der PVDF-Membran, auf dem ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 35.000 übertragen wurde, ausgeschnitten und unter Verwendung des Protein-Sequenziergeräts G1000A (hergestellt von Hewlett-Packard) einem automatischen Edman-Abbau unterzogen, um die N-terminale Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 19 gezeigt wird, zu bestimmen. Auf der Basis dieser Sequenz wurden dann die AccIII-Primer 1 und 2, die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 20 bzw. SEQ ID NR: 21 gezeigt werden, zur Verwendung als ein Kassettenprimer-Paar synthetisiert.
  • (2) Herstellung von genomischer DNA des Acc-Bakteriums
  • In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Kita et al., beschrieben in Nucleic Acids Research, Bd. 13, Seiten 8685–8694 (1985), wurde das Acc-Bakterium gezüchtet, um feuchte Zellen zu erhalten. Zwei Gramm der erhaltenen feuchten Zellen wurden in 10 ml Puffer B [25 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 50 mM Glucose, 10 mM EDTA] suspendiert, in Anwesenheit von 1 ml einer Lysozym-Lösung, hergestellt zu 2 mg/ml in Puffer B, gerührt und bei 37°C für 20 Minuten stehen gelassen. Als Nächstes wurden 28 ml Puffer C [100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0)] zu dieser Lösung hinzugefügt, gefolgt von Rühren. Ein Milliliter einer Proteinase-K-Lösung, hergestellt in TE [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH-Wert 8,0)] zu 20 mg/ml, und 4 ml einer 10% SDS-Lösung wurden außerdem hinzugefügt, gefolgt von Rühren, danach wurde die gemischte Lösung bei 37°C für 1 Stunde stehen gelassen.
  • Zu dieser Lösung wurden 6 ml einer 5 M wässrigen Lösung von NaCl und 6 ml Puffer D [10% CTAB (Cetyltrimetylammoniumbromid), 0,7 M NaCl] hinzugefügt, gefolgt von Rühren, danach wurde die gemischte Lösung bei 60°C für 20 Minuten stehen gelassen. Diese Lösung wurde mit Phenol und anschließend mit Chloroform behandelt, danach wurde die wässrige Schicht abgetrennt. Zu der wässrigen Schicht wurden 50 μl einer RNase A (hergestellt von Sigma)-Lösung hinzugefügt, erzeugt in TE zu 10 mg/ml, gefolgt von Rühren, danach wurde die gemischte Lösung bei 37°C für 40 Minuten stehen gelassen. Nach dem Stehen wurde diese Lösung mit Phenol und anschließend mit Chloroform behandelt, danach wurde die wässrige Schicht abgetrennt. Zu der wässrigen Schicht wurde ein gleiches Volumen an kaltem Ethanol hinzugefügt; die ausgefällte DNA wurde dann durch wickeln um eine Glaskapillare gewonnen. Die DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 3 ml TE aufgelöst, um etwa 200 μg an genomischer DNA zu ergeben.
  • (3) Herstellung einer genomischen Acc-Kassettengenbank
  • Die folgenden Verfahren wurden grundsätzlich gemäß dem auf den Seiten F16–F17 in „Gene Engineering Guide" (1995–1996er Ausgabe), Takara Shuzo beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • Die in (2) erhaltene genomische DNA wurde mit EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) vollständig gespalten; das erhaltene DNA-Fragment wurde mit einer EcoRI-Kassette (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, die ein kohäsives, dazu komplementäres Ende aufwies, um eine EcoRI-Kassettengenbank zu ergeben. Auf ähnliche Weise wurde die DNA gesondert vollständig mit den Restriktionsendonucleasen BglII, EcoT14I, EcoT22I, HindIII, PstI, SalI und XbaI (alle hergestellt von Takara Shuzo) gespalten. Die erhaltenen genomischen DNA-Fragmente wurden jedes an jede von mehreren Kassetten (hergestellt von Takara Shuzo) gebunden, die komplementäre überhängende Enden aufwiesen, um die BglII-EcoT14I-, EcoT22I-, HindIII-, PstI-, SalI- bzw. XbaI-Kassettengenbanken zu ergeben. Diese Kassettengenbanken werden allgemein als die genomische Acc-Kassettengenbank bezeichnet.
  • (4) Analyse des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens
  • Eine auf PCR basierende DNA-Amplifikation wurde unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 1 und Kassettenprimer C1 (hergestellt von Takara Shuzo) mit der in (3) erhaltenen EcoRI-Kassettengenbank als eine Matrize durchgeführt. Um die gewünschte Region effizient und spezifisch zu amplifizieren, wurde eine zweite auf PCR basierende DNA-Amplifikation unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 2 und Kassettenprimer C2 (hergestellt von Takara Shuzo) mit einem Teil der erhaltenen Reaktionsflüssigkeit durchgeführt, um ein amplifiziertes DNA-Fragment zu erhalten. Auf ähnliche Weise wurde die vorstehend beschriebene zweistufige auf PCR basierende DNA-Amplifikationsrekation gesondert mit den BglII-, EcoT14I-, EcoT22I-, HindIII-, PstI-, SalI- bzw. XbaI- Kassettengenbanken durchgeführt, um amplifizierte DNA-Fragmente zu ergeben. Jede amplifizierte DNA wurde durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert; das amplifizierte DNA-Fragment, abgeleitet von der XbaI-Kassettengenbank, zeigte eine besonders hohe Amplifikationseffizienz.
  • Das bedenkend wurde noch einmal eine auf PCR basierende DNA-Amplifikation unter Verwendung des Primerpaares AccIII Primer 1 und Kassettenprimer C1 mit der XbaI-Kassettengenbank als Matrize durchgeführt. Dieses Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen; ein amplifiziertes etwa 0,5 kb-DNA-Fragment wurde aus dem Gel gewonnen. Eine zweite auf PCR basierende DNA-Amplifikation wurde unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 2 und Kassettenprimer C2 mit dem erhaltenen DNA-Fragment als Matrize durchgeführt. Die Basensequenzierung des erhaltenen amplifizierten etwa 0,5 kb-DNA-Fragments zeigte, dass das Fragment einen Teil des Proteins codiert, dessen N-terminale Sequenz in (1) bestimmt wurde. Andererseits ist das mutmaßliche Molekulargewicht des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens etwa 35.000 und von dem Gen, welches das Protein codiert, wird angenommen, dass es etwa 1 kb lang ist. Es wurde daher erwartet, dass die Basensequenz des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens bestimmt werden könnte, vorausgesetzt, dass Informationen über die genaue Basensequenz des 5'-terminalen Bereiches, an welchen sich die AccIII-Primer 1 und 2 anlagern, und Informationen über die verbleibende etwa 0,5 kb Basensequenz im 3'-Bereich erhältlich wären, zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Information über die etwa 0,5 kb-Basensequenz.
  • Das bedenkend wurden der AccIII-Primer 3, gezeigt im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 22, und der AccIII-Primer 4, gezeigt im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 23, synthetisiert, um die genau Basensequenz des 5'-terminalen Bereiches des AccIII-Restriktionsendonuclease-Genbereichs zu bestimmen. Als Nächstes wurde eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 4 und Kassettenprimer C1 mit der in (3) erhaltenen EcoRI-Kasettengenbank als Matrize durchgeführt. Eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion wurde unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 3 und Kassettenprimer C2 mit einem Teil dieses Reaktionsgemischs durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde die vorstehend beschriebene zweistufige, auf PCR-basierende DNA-Amplifikationsreaktion getrennt mit den BglII-, EcoT14I-, EcoT22I-, HindIII-, PstI-, SalI- bzw. XbaI-Kassettengenbanken als eine Matrize durchgeführt. Von den amplifizierten DNA-Fragmenten wurde das kürzeste, d.h. ein etwa 1 kb-DNA-Fragment mit der EcoT14I-Kassettengenbank als eine Matrize erhalten und davon wurde die Basensequenz bestimmt.
  • Darüber hinaus wurden der AccIII-Primer 5, der im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 24 gezeigt wird, und AccIII-Primer 6, der im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 25 gezeigt wird synthetisiert, um die etwa 0,5 kb-Sequenz an der 3'-Seite des Genbereichs zu bestimmen, von welchem angenommen wurde, dass er das AccIII-Restriktionsendonuclease-Protein codiert. Eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion wurde unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 5 und Kassettenprimer C1 mit der in (3) erhaltenen EcoRI-Kassettengenbank als eine Matrize durchgeführt. Eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion wurde unter Verwendung des Primerpaares AccIII-Primer 6 und Kassettenprimer C2 mit einem Teil von diesem Reaktionsgemisch durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde eine zweistufige, auf PCR basierende DNA-Amplifikation mit den BglII-, EcoT14I-, EcoT22I-, HindIII-, PstI-, SalI- bzw. XbaI-Kassettengenbanken gesondert durchgeführt.
  • Von den amplifizierten DNA-Fragmenten wurden die etwa 0,5 kb- und etwa 0,8 kb-DNA-Fragmente einer Basensequenzierung unterzogen, die beide mit den EcoT22I- bzw. HindIII-Kassetten-Genbanken als eine Matrize erhalten wurden. Durch Vereinigung der Ergebnisse der drei bestimmten Basensequenzierungen wurde die Basensequenz-Information für ein etwa 1,6 kb-DNA-Fragment erhalten. Seine Basensequenz wird im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 26 gezeigt. Darüber hinaus wies die Suche nach einem offenen Leserahmen, der im Stande ist das Protein zu codieren, die Anwesenheit von ORF1 bei Basennummern 558 bis 1442, einen Teil, von dem angenommen wird, dass er ORF2 darstellt, bei Basennummern 1588 bis 1434 und einen Teil, von dem angenommen wird, dass er ORF3 darstellt, bei Basennummern 1 bis 535 nach. ORF1, der das Protein codiert, dessen N-terminale Aminosäuresequenz in (1) bestimmt wurde, wurde als AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen betrachtet. Die Basensequenz des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens wird im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 2 gezeigt, wobei die vierte Base, gezählt vom 5'-Terminus, ein C ist. Die von der Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz wird im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 1 gezeigt, wobei die zweite Aminosäure, gezählt vom N-Terminus, ein Leu ist. Die Translationsrichtung des ORF2 ist entgegengesetzt zu der von ORF1 und ORF3.
  • (5) Konstruktion des Plasmids pCRA19
  • Als Nächstes wurde ein Plasmid für die Expression des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens konstruiert. Zuerst wurden die Primer Acc-RL, gezeigt im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 27, und Primer Acc-RR, gezeigt im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 28, synthetisiert, um das Gen zu erhalten. Eine Erkennungssequenzstelle der Restriktionsendonuclease NcoI wurde in beide Primer eingeführt. Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Primerpaares ist es möglich das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen von einem amplifizierten DNA-Fragment, das durch PCR mit der genomischen DNA des Acc-Bakteriums als eine Matrize erhalten wurde, unter Verwendung der Restriktionsendonuclease NcoI herauszuschneiden und die Leserahmen der Translationscodons treffen unter Kontrolle des SP6-Promotors zusammen, wenn das Gen in die NcoI-Stelle des pACE611-Vektors inseriert wird. Andererseits resultiert eine Verwendung dieses Primerpaares im Austausch der vierten Base von C auf G, gezählt vom 5'-Terminus des AccIII-Restriktionsenconuclease-Gens, und der zweiten Aminosäure von Leu auf Val, gezählt vom N-Terminus des Proteins, das von dem Gen codiert wird. Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Primerpaares mit der in (2) erhaltenen genomischen DNA des Acc-Bakteriums als eine Matrize wurde eine auf PCR basierende DNA-Amplifikationsreaktion durchgeführt. Dieses DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuclease NcoI (hergestellt von Takara Shuzo) vollständig gespalten, danach wurde es einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen; ein DNA-Fragment von etwa 900 bp-Größe wurde gewonnen. Als Nächstes wurde dieses DNA-Fragment in die NcoI-Stelle des Vektors pACE611 inseriert, sodass es stromabwärts vom SP6-Promotor gelegen war.
  • Diese rekombinante DNA wurde in Escherichia coli JM109 eingeführt, um Transformanten zu ergeben. 30 Transformanten wurden wahllos ausgewählt und jede in 5 ml eines LB-Mediums inokuliert, das 30 μl/ml Chloramphenicol enthielt, und bei 37°C gezüchtet. Sobald der OD600-Wert der Zellkulturbrühe 0,6 erreichte, wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM hinzugefügt, um die Kopienzahl des Plasmids zu erhöhen, gefolgt von weiterer Züchtung bei 37°C für 2 Stunden; danach wurde Plasmid-DNA von jeder Kultur erzeugt. Jede erhaltene Plasmid-DNA wurde gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und XbaI gespalten, gefolgt von Bestätigung der Länge des daraus resultierenden DNA-Fragments durch Agarose-Gelelektrophorese; ein Plasmid wurde nachgewiesen, von dem angenommen wurde, dass es den in der richtigen Orientierung inserierten Genbereich enthält. Dieses Plasmid, bezeichnet als pCRA19, wurde in Escherichia coli JM109 eingeführt, um eine Transformante zu ergeben, die als Escherichia coli JM109/pCRA19 bezeichnet wurde.
  • (6) Konstruktion des Expressionssystems für das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen
  • Als Erstes wurde das SP6-RNA-Polymerasegen in Escherichia coli JM109 eingeführt, um eine Phagenvektor zu konstruieren, der eine weitere Expression des Gens erlaubt. Genau gesagt wurde der SP6-RNA-Polymerase-Expressionsphage M13sp6 durch Insertion eines SP6-RNA-Polymerase-Genfragments, das durch BamHI-HindIII-Spaltung von pSP6-2 erhalten wurde, in die BamHI-HindIII-Stelle innerhalb der Multiclonierungsstelle eines im Handel erhältlichen Produktes des Phagenvektors M13mp18 (hergestellt von Takara Shuzo) konstruiert.
  • Als Nächstes wurde die Transformante Escherichia coli JM109/pCRA19 in 5 ml eines LB-Mediums inokuliert, das 30 μg/ml Chloramphenicol enthielt, und bei 37°C gezüchtet. Sobald der OD600-Wert der Zellkulturbrühe 0,6 erreicht hatte, wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM hinzugefügt, um die Kopienzahl des Plasmids zu erhöhen, gefolgt von weiterer Züchtung bei 37°C für 2 Stunden. Diese Zellen wurden dann mit dem Phagen M13sp6 infiziert, um das Protein zu exprimieren, das von dem AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen codiert wird, gefolgt von weiterer Züchtung bei 37°C für 16 Stunden. Ein 11 mg-Anteil der erhaltenen feuchten Zellen wurde in 180 μl Zellaufschlußpuffer E [20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM 2-Mercaptoethanol] suspendiert, danach wurden die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen, gefolgt von einer Zentrifugation (18.000 g, 10 Minuten), um das Feste vom Flüssigen zu trennen.
  • Die Bestimmung der Aktivität des Überstands unter den Aktivitätsbestimmungsbedingungen, die im beigehefteten Datenblatt der AccIII-Restriktionsendonuclease, hergestellt von Takara Shuzo, gezeigt werden, weis die Produktion der AccIII-Restriktionsendonuclease in einer Menge von etwa 8000 Einheiten pro Gramm an feuchten Zellen nach, eine Menge, die etwa 16-mal größer als die ist, die mit dem Acc-Bakterium pro Einheitsgewicht an feuchten Zellen erhalten wird. Es wurde weder Aktivität von anderen Restriktionsendonucleasen als AccIII noch Aktivität des AccIII-Modifikationsenzyms im erhaltenen Überstand bemerkt. Im Hinblick auf das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen, welches in das Plasmid pCRA19 inseriert wurde, wurde gezeigt, dass die vierte Base, gezählt von der Translationsinitiationsbase, nach DNA-Amplifikation durch PCR von einem C auf ein G verändert war; das resultierte im Austausch der zweiten Aminosäure, gezählt vom N-Terminus des translatierten Proteins, von Leu auf Val, wobei das Protein AccIII-Restriktionsendonuclease-Aktivität besitzt.
  • Es wurde daher ein Isolierungs-/Massenproduktionssystem für das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen in der Abwesenheit des AccIII-Modifikationsenzyms entwickelt.
  • (7) Isolierung des AccIII-Modifikationsenzym-Gens
  • Modifikationsenzym-Gene und Restriktionsendonucleasen-Gene liegen oft nahe beieinander. Das bedenkend wurde, um den ORF2-Bereich, der vorstehend in (4) abgeleitet wurde, zu bestimmen, die Basensequenz eines etwa 1,4 kb-DNA-Fragments bestimmt, welches unter Verwendung der EcoRI-Kassettengenbank als eine Matrize aus den amplifizierten DNA-Fragmenten erhalten wurde, die hergestellt wurden, um die 3'-Region des AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens in (4) vorstehend zu bestimmen. Als Nächstes wurde, um den ORF3-Bereich, abgeleitet in (4) vorstehend, zu bestimmen, die Basensequenz eines etwa 2,2 kb-DNA-Fragments, welches unter Verwendung der BglIII-Kassettengenbank als eine Matrize erhalten wurde, aus den amplifizierten DNA-Fragmenten bestimmt, die hergestellt wurden, um den 5'-terminalen Bereich des vorstehend in (4) beschriebenen AccIII-Restriktionsendonuclease-Gens zu bestimmen. Die Vereinigung dieser Basensequenzen und der Basensequenz des etwa 1,6 kb-DNA-Fragments, welches den AccIII-Restriktionsendonuclease-Genbereich enthält, der in (4) bestimmt wurde, resultierte in der Information über die etwa 4,2 kb-Basensequenz, die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 29 gezeigt wird. Das AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen war bei Basennummern 1913 bis 2797 gelegen, ORF2 bei Basennummern 3712 bis 2789 und ORF3 bei Basennummern 691 bis 1890. Von diesen ORFs enthielt ORF2 nachweislich einen Anteil, der sehr homolog zu dem konservierten Bereich unter den Modifikationsenzymen in einem bekannten Restriktions-Modifikationssystem, war.
  • Als Nächstes wurde, um den ORF2-Bereich zu erhalten, unter Verwendung von EcoT22I und HpaI (hergestellt von Takara Shuzo) ein ORF2-enthaltender Anteil von etwa 1,1 kb von einem amplifizierten DNA-Fragment herausgeschnitten, welches durch eine zweistufige PCR unter Verwendung des Primerpaares Acc-Primer 6 und Kassettenprimer C1 und des anderen Primerpaares Acc-Primer 5 und Kassettenprimer C2 in den jeweiligen Schritten mit der EcoRI-Kassettengenbank als eine Matrize erhalten wurde, und in die SmaI-Stelle stromabwärts vom lac-Promotor in den pUC118-Vektor inseriert. Wenn dieses rekombinante Plasmid das AccIII-Modifikationsenzym-Gen enthält und wenn das AccIII-Modifikationsenzym-Gen in Escherichia coli exprimiert werden kann, würde die DNA in der Kultur der Transformante, die durch Einführung dieses rekombinanten Plasmids in Escherichia coli JM109 erhalten wurde, Methylierung durch das AccIII-Modifikationsenzym durchmachen und Resistenz gegen die Spaltung durch die AccIII-Restriktionsendonuclease erlangen.
  • Da der zur Konstruktion dieses rekombinanten Plasmids verwendete pUC118-Vektor keine AccIII-Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz aufweist, ist es jedoch nicht angebracht, dieses rekombinante Plasmid alleine zu verwenden, um die AccIII- Modifikationsenzymaktivität zu bestätigen. Andererseits gibt es im Plasmid pSTV29, das gleichzeitig mit diesem rekombinanten Plasmid in Escherichia coli JM109 vorhanden sein kann, eine AccIII-Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz. Das bedenkend, um pSTV29 als ein Zeichen für die Expression des AccIII-Modifikationsenzyms zu verwenden, wurden sowohl das vorstehend beschriebene rekombinante Plasmid als auch pSTV29 in Escherichia coli JM109 eingeführt, um Transformanten zu erhalten. Drei Transformanten wurden jeweils bei 37°C für 16 Stunden in 2 ml LB-Medium gezüchtet, das 100 μg/ml Ampicillin, 30 μg/ml Chloramphenicol und 2 mM IPTG enthielt, danach wurde Plasmid-DNA von jeder Kultur erzeugt.
  • Die auf diese Weise erzeugte DNA liegt als ein Gemisch von pSTV29 und dem vorstehend beschriebenen rekombinanten Plasmid vor. Bei Spaltung jeder DNA-Probe mit der AccIII-Restriktionsendonuclease, zeigte pSTV29 in allen Proben Resistenz gegen die AccIII-Endonucleasenaktivität, was auf die Insertion des AccIII-Modifikationsenzym-Gens in das in der DNA-Probe enthaltene rekombinante Plasmid hinwies. Darüber hinaus wurde die Anwesenheit des ORF2 im rekombinanten Plasmid bestätigt, wenn die DNA-Probe gleichzeitig mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und XbaI gespalten wurde, gefolgt von der Analyse der Länge der daraus resultierenden DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese. Es wurde auf diese Weise bewiesen, dass ORF2 das AccIII-Modifikationsenzym-Gen ist. Die Basensequenz des erhaltenen AccIII-Modifikationsenzym-Gens und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz werden im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 14 bzw. SEQ ID NR: 13 gezeigt.
  • Die Struktur des AccIII-Restriktions-Modifikationssystemgens, das gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird, wird in 16 gezeigt, wobei M, R und der Pfeil das Modifikationsenzym-Gen, das Restriktionsendonuclease-Gen bzw. die Orientierung des ORF darstellen.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal einen Plasmidvektor, der im Stande ist ein exogenes gewünschtes Gen, das ein Protein codiert, in einen Wirt einzuführen, das für den Wirt tödlich oder schädlich ist, und ein Verfahren bereit, welches im Stande ist, das Protein unter Verwendung des Plasmidvektors effizient zu exprimieren. Auch ein Verfahren wird bereitgestellt, womit ein Restriktionsendonuclease-Gen isoliert werden kann, das ein Restriktions-Modifikationssystem ohne die gleichzeitige Anwesenheit eines Modifikationsenzym-Gens darstellt, was im Stand der Technik schwierig war. Darüber hinaus werden in der Beschreibung ein AccIII-Restriktionsendonuclease-Gen und ein AccIII-Modifikationsenzym-Gen beschrieben und es ist möglich, verglichen mit den vorherigen Verfahren zur Reinigung von Escherichia coli, der mit dem das Gen enthaltenden Plasmid transformiert ist, eine AccIII-Restriktionsendonuclease oder ein AccIII-Modifikationsenzym leicht zu erhalten, die/das in der Gentechnik in einer gewünschten Reinheit von einer Enzympräparation erhältlich ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (13)

  1. Plasmidvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Promotorsequenz umfasst, um die Expression eines gewünschten Gens zu kontrollieren, wobei die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, die vom Phagen SP6 abgeleitet ist, und einem Replikationsursprung, wobei der Replikationsursprung in der Lage ist, durch Induktion unter Verwendung eines exogenen Faktors die Kopienanzahl des Plasmids zu erhöhen, wobei der Plasmidvektor in der Lage ist, ein Restriktionsendonuclease-Gen ohne die gleichzeitige Gegenwart eines entsprechenden Modifikationsenzym-Gens zu behalten.
  2. Plasmidvektor nach Anspruch 1, wobei der Promotor die Sequenz von SEQ ID NR: 30 enthält.
  3. Plasmidvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Replikationsursprung unter der Kontrolle eines Promotors steht, vorzugsweise des lac-Promotors.
  4. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend ein Arzneistoffresistenz-Gen als einen Selektionsmarker.
  5. Plasmidvektor nach Anspruch 4, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Plasmid pACE601 wie in 9B gezeigt, Plasmid pACE611 wie in 10 gezeigt und Plasmide pACE701 und pACE702 wie in 13B gezeigt.
  6. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in den ein gewünschtes, zu exprimierendes Gen eingebaut ist.
  7. Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens, gekennzeichnet durch: (a) Einführen des Plasmidvektors nach Anspruch 6, in einen Wirt sowie eines Gens, das eine RNA-Polymerase codiert, die eine Promotorsequenz in dem Plasmidvektor erkennt; und (b) Induzieren einer Zunahme der Kopienanzahl des Plasmidvektors und der Expression der RNA-Polymerase, durch Verwendung eines exogenen Faktors, um das gewünschte Gen zu transkribieren und zu translatieren.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zunahme der Kopienanzahl des Plasmidvektors und der Expression der RNA-Polymerase durch entsprechende oder den gleichen exogenen Faktor induziert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der exogene Faktor, der die Zunahme der Kopienanzahl des Plasmidvektors und/oder der Expression der RNA-Polymerase induziert, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactosid, Lactose, Galactose, Arabinose, einer Verminderung der Tryptophan-Konzentration, und einer Anpassung der Kulturtemperatur.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Polymerase-Gen durch ein anderes Plasmid oder Phagenvektor in den Wirt oder in ein Chromosom des Wirts eingeführt wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt Escherichia coli ist.
  12. Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Gens, umfassend die Schritte: (a) Verwenden des Plasmidvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer Genbibliothek; und (b) Identifizieren und Isolieren eines gewünschten Gens.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei das gewünschte Gen ein Protein codiert, das letal oder schädlich für einen Wirt ist, vorzugsweise ein Restriktionsendonuclease-Gen.
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