JP3522292B2 - ベクター、非相同ポリペプチドを発現することのできる宿主、その製法及びポリペプチドの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、誘導的（誘導をうけて
発現される）選択遺伝子を有するベクター、このベクタ
ーを含有する宿主及びこのベクター及び宿主の製法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】多くのバクテリアクローニング及び発現
ベクターは、選ばれた細菌性宿主内でのプラスミドの選
択を保持するための簡単な手段として、抗生物質抵抗性
マーカーを含有する。これは、通例アンピシリンであ
る。それというのも、構成されたこのオリジナルクロー
ニングベクターの１つｐＢＲ３２２は、アンピシリン抵
抗決定子を担持する（Ｂｏｌｉｖａｒ等のＧｅｎｅ ２
（１９７７）９５−１１３参照）からである。このプラ
スミドの誘導体の１つは、ｐＡＴ１５３である（Ｔｗｉ
ｇ及びＳｈｅｒｒａｔｔ（１９８０）、Ｎａｔｕｒｅ
２８３：２１６−２１８）。このアンピシリン抵抗マー
カーは、構造的にコントロールされており、多くの抵抗
がコードされたプラスミドも同様である。

【０００３】ポリペプチドの製造のためのベクターのク
ローニングにおいて多くの選択系が使用されているが、
なお、改良された選択系が必要である。

【０００４】本発明によれば、誘導的選択遺伝子よりな
るベクター及び異種ポリペプチドをコードする配列が提
供される。

【０００５】ここで使用されている「ベクター」とは、
広い意味で用いられており、その意味の中には、１個の
細胞から他に組換えＤＮＡ物質を移送することのできる
レプリコンも包含される。本発明は、宿主内への組込み
に好適なベクター及び組換えＤＮＡを宿主に転移するた
めの構成ベクター中で有用であるベクター例えばプラス
ミド内への挿入のために好適であるベクターを包含す
る。

【０００６】誘導的選択遺伝子（又は選択マーカー）
は、一般に、選択を促進し、誘導を受けて発現される遺
伝子を包含する。この誘導的選択遺伝子は、選択を促進
する物質をコードする第１遺伝子及びこの物質の発現
を、所定条件下でのみ発現が起るようにコントロールす
る第２遺伝子より成る。従って、例えば、第１遺伝子
は、抗生物質に対する抵抗を与える物質をコードする遺
伝子より成っていてよく、第２遺伝子は、リプレッサー
をコードする遺伝子より成っていてよい。抗生物質の存
在で、この系は誘導され、第１遺伝子の発現は、抗生物
質耐性を与えるように起こり、従って、選択されるべき
選択遺伝子を担持する組換えベクターを許容する。抗生
物質の不存在では、抑制が起り、従って、第１遺伝子の
発現は起こらず、ベクター内で抗生物質耐性を与えない
物質は産生されない。

【０００７】好適な誘導的選択遺伝子の特別な例は、ｔ
ｅｔＡ及びｔｅｔＲ遺伝子を含有するものである。ｔｅ
ｔＡ遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を与える
物質をコードする遺伝子であり、ｔｅｔＲ遺伝子は、ｔ
ｅｔＡ遺伝子の発現を阻止することのできるリプレッサ
ー蛋白質をコードする。この系は、テトラサイクリンの
存在で誘導され、従って、その存在で、ｔｅｔＡ遺伝子
が発現されて、選択遺伝子を担持するベクター上にテト
ラサイクリン抵抗を与える。テトラサイクリンの不在で
は、このｔｅｔＡ遺伝子は、ｔｅｔＲ遺伝子により抑制
されて、ｔｅｔＡの発現は起こらず、この遺伝子の産生
物は生成されない。

【０００８】従って、本発明の特別な態様においては、
ｔｅｔＡ及びｔｅｔＲ遺伝子を有する誘導的選択遺伝子
より成るベクター及び異種ポリペプチドをコードする配
列が提供される。

【０００９】このベクターは、前記配列に加えて、特別
な用途に好適な他のＤＮＡ配列例えば適当なコントロー
ル配列を有していてよい。例えば、このベクターは、プ
ロモーター、リボソーム結合部位及び転写ターミネータ
ー配列を有していてよい。このベクターは、一般に、例
えばプラスミドｐＡＴ１５３から誘導された複製起点を
有する。

【００１０】好適なプロモーターの特別な例は、トリプ
トファン（ｔｒｐ）プロモーターである。他のプロモー
ターを使用することもできる。例えば、本発明のもう１
つの態様においては、このベクターは、Ｔ７Ａ３プロモ
ーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２）を有し、この場合
に、このベクターは、１個のオペレーター例えばｌａｃ
Ｏ（殊にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３の短縮されたｌａｃＯ
配列）をも有していてよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２に
示されているＴ７Ａ３プロモーター配列は、ｍＲＮＡの
開始の前の塩基に示されており、従って、ｌａｃＯ配列
と共に用いられる場合に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３のｌ
ａｃＯ配列は、＋１（ｍＲＮＡの開始）から伸びてい
る。

【００１１】転写ターミネーターの特別な例は、バクテ
リオファージＴ４遺伝子３２中に認められる転写ターミ
ネーター配列の誘導体である。

【００１２】このベクター上に安定性を与える配列も存
在していてよい。このような配列の例は、ｃｅｒ配列で
ある（例えば、Ｃｅｌｌ ３６、１０９７−１１０３、
１９８４参照）。

【００１３】このベクターは、リボソーム結合配列及び
異種ポリペプチド等の挿入を促進するマルチクローニン
グ配列を有していてよい。

【００１４】この異種ポリペプチドは、薬学的特性を有
し、従って医療で使用されるポリペプチドより成ってい
てよい。このようなポリペプチドの特別な例は、免疫毒
素の製造に使用できるリシンＡである。もう１つの例
は、Ｇ−ＣＳＦ又はその類縁体として公知のポリペプチ
ドである。

【００１５】顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は
ワレット（Ｗａｌｌｅｔ）Ｋ．等によるＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２巻 １５２６−
１５３０頁に記載されており、欧州特許公開第１６９５
６６号及びＰＣＴ特許公開第ＷＯ ８７／０１１３２号
明細書中にも記載されている。Ｇ−ＣＳＦは、生体内で
の顆粒球生成を刺激し、最小の副作用で機能することが
示されている。結果として、ヒトＧ−ＣＳＦは、化学療
法、Ｘ線療法、放射線事故又は自己骨髄移植と組み合わ
された好中球減少症の治療で有効な用途を有することが
判明している。更に、Ｇ−ＣＳＦは、エイズ（ＡＩＤ
Ｓ）に関連する骨髄抑圧の刺激に有効で、顆粒球機能異
常の特徴を示す脊髄異形成（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓ
ｔｉｃ）症候群の治療に、かつ重症の感染症の治療のた
めの補助として有効性を有する。

【００１６】ここで用いられている「ヒトＧ−ＣＳＦ」
とは、天然に存在し、ＳＥＱ ＩＤＮＯ４１に記載のよ
うなアミノ酸配列を有する２個のポリペプチドを有する
ことが判明しているＧ−ＣＳＦである。これらの２個の
ポリペプチドは、３５と３６位の間の１個のポリペプチ
ド内にはトリペプチド挿入Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕが存
在し、他方では不在であることで異なっているだけであ
る。本明細書中全体で使用されている番号は、Ｖａｌ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ挿入なしの天然由来ポリペプチドを基準
としている。

【００１７】Ｇ−ＣＳＦの類縁体には、天然由来Ｇ−Ｃ
ＳＦのそれとは、１個以上のアミノ酸残基の独自性又は
場所において異なるポリペプチドが包含される。例え
ば、このような類縁体は、置換基又は末端又は中間付加
物を有していてよいか又はこのような残基を欠失してい
てよい。このような類縁体は、顆粒球産生を刺激するこ
とのできる天然Ｇ−ＣＳＦの特性を分担する。

【００１８】特に、本発明は、前記定義のベクターを有
する複製可能な発現ベヒクルを提供する。

【００１９】本発明の特別な１態様においては、ｔｅｔ
Ａ及びｔｅｔＲより成る誘導的選択遺伝子及び異種ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する複製可能なプ
ラスミド型発現ベヒクルが提供される。

【００２０】前記のように、この発現ベヒクルには、発
現ベヒクル上に安定性を与えることのできる配列例えば
ｃｅｒ配列が包含されうる。

【００２１】本発明のもう１つの態様においては、プロ
モーター、ｃｅｒ配列、バクテリオファージＴ４の遺伝
子３２の末端に認められる転写ターミネーター、複製起
点及び異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列より成
る複製可能なプラスミド型発現ベヒクルより成るベクタ
ーが提供される。

【００２２】本発明によれば、ポリペプチドの製法も提
供され、この方法は、本発明のベクターを有する宿主を
培養してポリペプチドを発現させることより成る。

【００２３】この方法は、選択時に使用された生成物の
不在下に実施することができる。選択系がｔｅｔＡ及び
ｔｅｔＲより成る場合には、この方法は、テトラサイク
リンの不在下に実施することができる。

【００２４】前記の方法は、任意の適当な宿主細胞例え
ば細菌、酵母又は哺乳動物細胞を用いて実施することが
できる。好適な宿主の特別な例は、細菌細胞例えばＥ・
コリーより成る。

【００２５】所望の代謝物が宿主から有用な割合で得ら
れない場合には、この宿主を培養しかつ完全細胞として
収穫し、所望のポリペプチドを、例えば宿主細胞の成長
に必要な栄養を含有する培地からの分離の後に引続き細
胞を抽出することにより回収する。代謝生成物が、宿主
細胞から周囲の培養液中に出る場合には、このポリペプ
チドを通常法での抽出により回収することができる。

【００２６】本発明によれば、異種ポリペプチドを発現
することができ、ここに定義のようなベクター（例えば
複製可能なプラスミド型発現ベヒクル）を有する宿主も
提供される。

【００２７】本発明の特別な１態様では、ｔｅｔＡ及び
ｔｅｔＲ遺伝子及び異種ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列よりなる複製可能なプラスミド型発現ベヒクルで
形質転換された宿主が提供される。

【００２８】本発明のもう１つの態様によれば、前記定
義の宿主の製法が提供され、この方法は、宿主内に前記
定義のようなベクター（例えば複製可能なプラスミド型
発現ベヒクル）の挿入により、宿主を形質転換させるこ
とよりなる。

【００２９】宿主内への異種遺伝子物質の導入のために
好適な方法は、文献から公知である。このような方法に
は、ベクター及び異種遺伝子物質よりなる複製可能な発
現ベヒクルの形成及び宿主内へのこのベヒクルの導入よ
り成る。宿主内へのこのベヒクルの導入は、宿主を適当
に処理することにより、例えばＥ．コリーの場合には、
塩化カルシウム溶液での処理により、促進することがで
きる。

【００３０】本発明は、所望のポリペプチドをコードし
ている配列をベクター（前記定義の）内へ、適当な挿入
部位で挿入して、ポリペプチドの所望の合成を可能にす
るベクター（有利に、複製可能なプラスミド型発現ベヒ
クルの形で）を得ることより成る、前記定義のようなベ
クターの製法をも提供する。

【００３１】本発明のもう１つの態様によれば、選択遺
伝子よりなるベクターが提供される。この選択遺伝子は
前記のように定義でき、例えば、これは、ｔｅｔＡ及び
ｔｅｔＲ遺伝子より成っていてよい。

【００３２】本発明のベクターは、誘導的選択遺伝子を
有効化する。これは、特に有利であることが判明した。
それというのも、この遺伝子（有利な態様におけるｔｅ
ｔＡ）の産生物は、遺伝子操作の構成及び試験相の間に
のみ発現されるからである。このクローン化された遺伝
子を担持している後続のプラスミドがその細菌宿主内に
安定に保持されるなら、選択の必要性は止む。従って、
クローン化された遺伝子産生物を発現する培養は、選択
薬剤の添加を要求せず、結果的に、選択遺伝子の産生物
を発現しない。このような産生物は大抵のベクター内で
は避けられない。それというのも、これらは、構造的に
発現された選択遺伝子を担持するからである。このよう
な不所望の産生物は、不利である。それというのもそれ
らは、クローン化された遺伝子産生物から代謝エネルギ
ーをそらし、不所望の不純物を生じるからである。特
に、本発明のベクターは、選択マーカーとしてのペニシ
リンの使用を避ける。このことは、ヒトにおけるペニシ
リン又はその分解生成物に対するアレルギー反応が流行
しているので、特に有利である。このプラスミドでコー
ド化されたβ−ラクタマーゼの存在は、活性抗生物質と
して不純化β−ラクタムの簡単な検出を阻止する。

【００３３】選択系としてのｔｅｔＡ／ｔｅｔＲ遺伝子
の使用は、特に有利であり、一般に、この選択系を有す
るベクターは意想外に安定であることが判明したので特
に有利である。この安定性は、発現レベルを保持し、ポ
リペプチド例えばリシンＡの蓄積を改良する助けをす
る。

【００３４】本発明のベクターの安定性は、ｐＩＣＩ
００４２（これは、ｔｅｔＡ／ｔｅｔＲ選択遺伝子を有
する）で例示されている。このプラスミドは、ｃｅｒ配
列の存在なしでも、予想外にそのペアレントｐＡＴ１５
３上での獲得安定性を有することが判明した。これは予
想外であるが、このプラスミドの構成の非常に好ましい
利点である。

【００３５】次の実施例及び添付図面と関連させて本発
明を更に詳述する：図１は、転写ターミネーター配列を
説明している。

【００３６】図２は、ｐＴＢ３４４の製造を説明してい
る。

【００３７】図３は、ｐＩＣＩ ００４２の製造を説明
している。

【００３８】図４は、ｐＩＣＩ ００４２のプラスミド
地図である。

【００３９】図５は、プラスミドの製造に使用されるフ
ラグメントを示している。

【００４０】図６は、ｐＩＣＩ １０７９のプラスミド
地図である。

【００４１】図７は、ｐＬ Ｂ０１５のプラスミド地図
である。

【００４２】図８は、ｐＣＧＧ１のプラスミド地図であ
る。

【００４３】図９は、［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷］Ｇ−ＣＳＦの配
列を示している。

【００４４】図１０は、ｈ−ＧＣＳＦの配列を示してい
る。

【００４５】図１１は、ｐＣＧ５４のプラスミド地図で
ある。

【００４６】図１２は、ｐＩＣＩ ００２０の構成を説
明している。

【００４７】図１３は、ｐＩＣＩ １０７８の構成を説
明している。

【００４８】図１４は、ｐＩＣＩ １１０２の構成を説
明している。

【００４９】図１５は、Ｅ・コリーリゼートのクマシー
染色ＳＤＳゲルを示しており、ここでトラックＡはｐＩ
ＣＩ １１０２、ＢはｐＩＣＩ ００２０、Ｃは分子量
マーカーである。

【００５０】図１６は、ｐＩＣＩ １１０２のゲルプロ
フィルを示しており、ここでピークＲは、リシンＡを表
わしている。

【００５１】図１７は、ｐＩＣＩにより産生されたリシ
ンＡのウエスタンブロットであり、ここで、トラック１
は分子量マーカー、２及び３は非リシン産生クローン、
４はＰＩＣＩ １１０２及び５はｐＩＣＩ ００２０
（対照プラスミド−リシンＡ配列でない）である。

【００５２】図１８はｐＩＣＩ １１０２の部分配列で
ある。

【００５３】図１９は、ｐＩＣＩ １１８７の構成を説
明している。

【００５４】関連配列を、実施例の後の配列リストに示
し、配列は慣用の５′から３′の方向で記載する。

【００５５】制限酵素用緩衝液 安定性：−２０℃で安定 緩衝液組成： 緩衝剤成分 最終濃度（ｍモル／ｌ） （１：１０稀釈セット緩衝液） Ｂ Ｍ Ｈ トリス−ＨＣｌ １０ １０ ５０ ＭｇＣｌ₂ ５ １０ １０ ＮａＣｌ １００ ５０ １００ ジチオエリスリトール（ＤＴＦ） − １ １ ２−メルカプトエタノール １ − − ３７℃でのｐＨ ８．０ ７．５ ７．５ 前記緩衝液は、ベーリンガー マンハイム社（Ｂｏｅｈ
ｒｉｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手される。

【００５６】部位−方向付け突然変異生成法−例７にお
いて、 緩衝液１ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０） １００ｍＭ ＮａＣｌ １００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ２０ｍＭ 緩衝液２ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍＭ ＮａＣｌ ２０ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍＭ 緩衝液３ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．７） １２ｍＭ ＮａＣｌ ３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １０ｍＭ ２−メルカプトエタノール ８ｍＭ 緩衝液４ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０） ６０ｍＭ ＮａＣｌ ９０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ６ｍＭ ＤＴＴ １０ｍＭ ヌクレオチドミックス１：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ＝Ｓ（ｄＣＴＰのホスホロチオエート誘導体）、ｄＴ
ＴＰの各々２５０ｍＭ及びＡＴＰ１ｍＭ。

【００５７】ヌクレオチドミックス２：ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各々２５０μＭ及びＡＴＰ３
５０μＭＭ９最小培地 塩化アンモニウム １ｇ オルト燐酸水素二ナトリウム ６ｇ オルト燐酸二水素カリウム ３ｇ 塩化ナトリウム ０．５ｇ 蒸留水 １ｌ中補充物／７５ｍｌ ５０％グルコース ３００μｌ １Ｍ ＭｇＳＯ₄ ７５μｌ ０．１Ｍ ＣａＣｌ₂ ７５μｌ チアミン４ｍｇ／ｍｌ ７５μｌ ２０％カゼインアミノ酸 ７５μｌ微小元素溶液（ＴＥＳ） ＴＥＳは次の組成を有する： ｍｇ／脱イオン水１０ｍｌ ＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ ２．０ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．８ ＫＣｒ（ＳＯ₄）₂・１２Ｈ₂Ｏ ０．２ ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．２ Ｈ₃ＢＯ₃ ０．１ ＫＩ ２．０ ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ ２．０ ＮｉＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ ０．０９ Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．４ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．４ジェネクリーン（Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ）（ＴＭ） このキットは、１）沃化ナトリウム６Ｍ；２）塩化ナト
リウム／エタノール／水洗液を製造するための濃塩化ナ
トリウム液、トリス及びＥＤＴＡ；３）グラスミルク
（ＴＭ）−水中のシリカマトリックスの懸濁液１．２５
ｍｌを含有する１．５ｍｌバイアルを有する。

【００５８】これは、プロシ−ディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ）
（１９７９）７６巻６１５頁に記載されているフォーゲ
ルシュタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）及びギレスピイ
（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）の方法によるＤＮＡ精製のため
の技術である。

【００５９】モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリィ・マニュアル［Ｍｏｌｅｃｕｌａｙ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；第２
版、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），フリッチ（Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ）及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，１９８９］に記載の方法も使用できる。

【００６０】 ファルマシアのランダム・ラベル・キット・プロダクト（Ｒａｎｄｏｍ Ｌａｂ ｅｌ Ｋｉｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＮＯ２７−９２５ ０ この方法は、モレキュラー・クローニング−・ア・ラボ
ラトリィ・マニュアル第２版 サンブルーク，フリッチ
及びマニアチスｐｐ１０．１３−１０．１７（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，１９８７発行）に記載されている。

【００６１】シークエナーゼ（Ｓｅ ｑｕｅｎａｓｅ）
（ＴＭ） 化学的に変性されたＴ７ＤＮＡ−ポリメラーゼ プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ィ・オブ・サイエンシスＵＳＡ（１９８７）８４巻、４
７６７−４７７１頁に記載のテーバー（Ｔａｂｏｒ）及
びリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）の方法に基
づく。

【００６２】Ｔ４ＤＮＡリガーゼ モレキュラー・クローニング−・ア・ラボラトリィ・マ
ニュアル第２版、サンブルーク，フリッチ及びマニアチ
ス５．６０−５．６４（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９発行）及びワ
イス（Ｗｅｉｓｓ）Ｂ．等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２４３巻 ４５４３頁（１９６８）に記載されている。

【００６３】Ｅ・コリー菌株 Ｅ・コリー菌株ＨＢ１０１及びＣＧＳＣ６３００（ここ
ではＭＳＤ５２２とも記載される）は、自由に入手可能
である。従って、例えば、これらは、Ｅ・コリージエネ
ティック・ストック・センター（Ｅ・Ｃｏｌｉ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｙａｌｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ＵＳＡ）から得られる。更に、Ｅ・
コリーＨＢ１０１は、例えば、ＧＩＢＣＯ社（ＧＩＢＣ
Ｏ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｕｎｉｔ ４、Ｃｏｗｌｅｙ Ｍ
ｉｌｌ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｅｓｔａｔｅ，Ｌｏｎｇｂｒ
ｉｄｇｅ Ｗａｙ，Ｕｘｂｒｉｄｇｅ，ＵＢ８ ２Ｙ
Ｇ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）又はジブコ
ラボラトリィス（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．３
１７５ Ｓｔａｌｅｙ Ｒｏｒｄ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ １４０７２，ＵＳＡ）から提供されたＢ
ＲＬから入手できる。菌株ＨＢ１０１の遺伝子型（ｇｅ
ｎｏｔｙｐｅ）は、前記のモレキュラー・クローニング
−ア・ラボラトリィ・マニアル中に、Ｓｕｐ Ｅ４４
ｈｓｄ Ｓ２０（Ｙв^-ｍв^-）ｒｅｃ Ａ１３ ａｒａ
−１４Ｆ^-ｌｅｕ ６ ｔｈｉ−１ ｐｒｏ Ａ２ ｌ
ａｃＹ１ ｇａｌ Ｋ２ ｒｐｓ Ｌ２０ ｘｙｌ^-５
ｍｔｌ^-１として記載されている。ＭＳＤ５２２（ＣＧ
ＳＣ６３００）の遺伝子型は例３に記載されている。

【００６４】

【実施例】次の非制限的実施例は説明としてのみ記載す
る。

【００６５】例 １ ｔｒｐプロモーター／ｔｅｔＡ／ｔｅｔＲ遺伝子を含有
するプラスミドの製造 （ａ）ｐＩＣＩ００４２の製造 多数のプラスミドベクターは、原クローニングベクター
の１つ：ｐＢＲ３２２を基礎にしている（Ｂｏｌｉｖａ
ｒおよび協力者，１９７７年，“Ｇｅｎｅ”第２巻，第
９５頁〜第１１３頁）。非移動性ｐＡＴ１５３はこの１
つの誘導体である（Ｔｗｉｇｇ及びＳｈｅｒｒａｔｔ，
１９８０年，“Ｎａｔｕｒｅ”，第２８３巻，第２１６
頁〜第２１８頁）。これら２つのプラスミドは、アンピ
シリン耐性決定子、ＴＥＭ β−ラクタマーゼである。

【００６６】プラスミドｐＩＣＩ００４２は、天然に出
現するプラスミドＲＰ４に見出されたように、抑制され
たテトラサイクリン耐性決定子を利用する。この抑制さ
れた系は、テトラサイクリンの不在におけるｔｅｔＡ遺
伝子の発現を遮断し、これに反して多くの薬剤耐性機構
は構成的発現を有する。

【００６７】ｔｅｔ座は最初にバース（Ｂａｒｔｈ）お
よびグリンター（Ｇｒｉｎｔｅｒ）（“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，”第１１３巻，第４５５頁〜第４７４頁，１
９７７年）によりＲＰ４においてマッピングされた。こ
れは、隣接遺伝子：ｔｅｔＡ（構造耐性遺伝子）および
ｔｅｔＲ（リプレッサー遺伝子）からなることを示し、
この領域は配列決定された（Ｋｌｏｃｋおよび協力者，
“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ”，第１６１巻，第３２６頁
〜第３３２頁，１９８５年）。これらの遺伝子は隣接Ｂ
ｇＩＩＩ−ＳｍａＩおよびＳｍａＩ−ＳｍａＩフラグメ
ントに位置定めされる。ＢｇＩＩＩ部位はＲＰ４におい
ては唯一であるが、５つのＳｍａＩ部位が存在する（Ｌ
ａｎｋａ，ＬｕｒｚおよびＦｕｒｓｔｅ，“Ｐｌａｓｍ
ｉｄ”，第１０巻，第３０３頁〜第３０７頁，１９８３
年）。

【００６８】（ｉ）ｔｅｔＡ＋ｔｅｔＲ 遺伝子のクロー
ニング プラスミドＲＰ４は十分に立証され（Ｄａｔｔａおよび
協力者，“Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ”，第１０８巻，第１２
４４頁，１９７１年）かつ自由に入手しうる。さらに、
プラスミドＲＰ４は、ナショナル・コレクション・オブ
・タイプ・カルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；６
１Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，
ＮＷ９５ＨＴ）で受理番号５００７８および５０４３７
で寄託されている。ここではＮＤａｔｔａ （Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ）から得たＲＰ４を使用した。このプラ
スミドを含有するＥ・コリ菌株は、選択ブイヨン培地中
で成長させ、プラスミドＤＮＡはホルメスおよびクイグ
リィ法（Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｑｕｉｇｌｅｙ，“Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．”，第１１４巻，第１９３頁
〜第１９７頁，１９８１年）の拡大によって単離した。
２．５Ｍの酢酸アンモニウムでの処理により除タンパク
され、イソプロパノールで再沈させた。このプラスミド
ＤＮＡは、供給者の推奨する条件により制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩで処理し、切断して完成した。次いで、希釈酵素お
よび短かい培養時間を使用することによりＸｍａＩによ
り部分的に切断した。ＸｍａＩはＳｍａＩのアイソシゾ
マーであって、その切断部位に４−ヌクレオチド付着末
端を生じる。

【００６９】ベクタープラスミドｐＵＣ８（Ｙａｎｉｓ
ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎ
ｇ，“Ｇｅｎｅ”，第３３巻，第１０３頁〜第１１９
頁，１９８５年）は、類似に製造され、ＢａｍＨＩおよ
びＸｍａＩで切断して完成した。ＲＰ４フラグメント
は、１２℃で１６時間Ｔ４リガーゼで結合することによ
りこのベクターにクローン化した。これは、塩化カルシ
ウム法により受容能力を有するようにしたＥ・コリＣ６
００を形質転換するために使用した（Ｍａｎｉａｔｉｓ
および協力者，“Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ”，１９８２年）。次に、培
養物を、テトラサイクリン耐性のために選択された培地
上へ接種した。

【００７０】Ｅ・コリＣ６００は、受理番号ＧＣＳＣ３
００４で、Ｅ・コリ・ジェネテイック ストック・セン
ター（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ，エ
ール大学，米国）のような多数の培養物収集所を包含す
る多数の出所から自由に入手できる。

【００７１】この耐性を有する若干のコロニーを、期待
される表現型につき調べた（アンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性、しかしＲＰ４自体を表示するカナマイ
シン耐性なし）。正しい耐性を有するコロニーを、プラ
スミドＤＮＡを単離することによりクローン分析を実施
した（ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙ法）。これら
の調製品をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切
断し、ゲル電気泳動により分析した。これは、クローン
化された挿入断片のサイズを確認し、ＲＰ４からのＢｇ
ｌＩＩ−ＸｍａＩ−ＸｍａＩフラグメントにつき予言さ
れた２．４５ｋｂであることを見出した。ｔｅｔＡおよ
びｔｅｔＲ遺伝子を含有するこのフラグメントを有する
クローンは、ｐＴＢ３４４と表示した（図２）。

【００７２】（ii）ｐＡＴ１５３から のｔｅｔ遺伝子の
除去 遺伝子不安定性の原因である遺伝子重複を阻止するた
め、ＲＰ４からのｔｅｔＡ＋ｔｅｔＲカセットを挿入す
る前にベクタープラスミドｐＡＴ１５３からｔｅｔ遺伝
子を除去することが必要であった。また、ｔｅｔ遺伝子
は非同種のｔｅｔＲによって有効に抑制することができ
ない。除去は、プラスミドｐＡＴ１５３ＤＮＡを単離
し、ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩで切断することによって
行なった。これらの部位の間へ、次の配列を有する合成
オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＮＮｏ．４０）：

【００７３】

【化１】

【００７４】をクローン化した。これらはＥｃｏＲＩお
よびＡｖａＩ付着末端に適合し、さらにＳｐｈＩ，Ｂａ
ｍＨＩおよびＣｌａＩ部位を含有する。形質転換および
選択後、コロニーをテトラサイクリン耐性決定基の喪失
につき試験した。１つのクローンからのプラスミドＤＮ
Ａを、配列決定して、予言した配列の正しいことを確認
した。このプラスミドはｐＩＣＩ００１９と表示した
（図３）。

【００７５】（iii）ｔｅｔＡ＋ｔｅｔＲ遺伝子の挿入 ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔＩフラグメントにおけるｐＴＢ３４４から単離し
た。ｐＵＣ８ベクターを、それがｐＩＣＩ００１９と同
じ選択決定基（アンピシリン耐性）を有するので、Ｓｓ
ｐＩで切断することにより破壊した。プラスミドｐＩＣ
Ｉ００１９ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断
し、次にｔｅｔ遺伝子を有する２．４５ｋｂフラグメン
トで結合した。これをＥ・コリＣ６００を形質転換する
ために使用した。培養物を、テトラサイクリン耐性コロ
ニーに対し選択下に平板培養する。ｔｅｔ遺伝子の挿入
はｐＣＨ１９中のｂｌａ遺伝子の多くが置換されたこと
を示し、こうしてｐＣＨ１９はそのアンピシリン耐性決
定基を喪失する。形質転換体からのアンピシリン耐性の
喪失を確認した。次いで、少数のクローンを、プラスミ
ドＤＮＡを単離するために使用し、該ＤＮＡを制限分析
した。これで、製造されたプラスミドが意図した構造を
有することを確認した。このものはｐＴＢ３５１と表示
した（図３）。

【００７６】（iv）ｃｅｒ配列の挿入 天然に出現するプラスミドＣｏｌＥＩはＥ・コリ中に非
常に安定して維持されているが、その誘導体ｐＢＲ３２
２およびｐＡＴ１５３はそうではない。サマーズ（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ）およびシエラット（Ｓｈｅｒｒａｔｔ）
（“Ｃｅｌｌ”，第３６巻，第１０９７頁〜第１１０３
頁，１９８４年）は、これが親プラスミド中に存在する
ｃｅｒと呼ばれる短かい（２８３ｂｐ）配列を含有しな
い誘導体のためであることを証明した。この配列は、部
位特異性プラスミド多量体分解系を含有し、該系は相同
組換えにより形成されるプラスミド多量体の蓄積を妨げ
る。かかる多量体は、細菌の細胞分裂の間娘プラスミド
の安定な遺伝を確保する分配過程に対して有害な効果を
有する。

【００７７】ｃｅｒ配列（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｄおよび協
力者，“ＭＧＧ”，第２０１巻，第３３４頁〜第３３８
頁，１９８５年）は、プラスミドｐＫＳ４９２（Ｄ．Ｓ
ｈｅｒｒａｔｔにより提供された）から、ＢａｍＨＩお
よびＴａｑＩで切断することによって２８９ｂｐフラグ
メントとして単離した。プラスミドｐＴＢ３５１は、Ｅ
・コリのｄａｍ菌株からＤＮＡとして、そのＣｌａＩ部
位がｄａｍ⁺メチル化系によって封鎖されるのを阻止す
るために単離した。このＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＣｌ
ａＩで切断した（これら両部位は、このクローニングの
ため合成オリゴヌクレオチドに導入された）。ｃｅｒフ
ラグメントを切断ベクターで結合し、Ｅ・コリＣ６００
を形質転換するために使用し、テトラサイクリン耐性に
関し選択する。形質転換体コロニーに、ＡｖａＩ制限に
よるクローン分析およびゲル電気泳動を行なった。約３
００ｂｐの外部ＤＮＡの存在は、ｃｅｒフラグメントの
獲得を指示した。さらに、得られるプラスミドが正しい
構造を有することを確認するために制限分析を使用し
た。これらプラスミドの１つはｐＩＣＩ００４２と表示
した（図３および図４）。

【００７８】（v）ｐＩＣＩ００４２に対する試験 このプラスミドは、デュ・ポン社のジェネシス（Ｇｅｎ
ｅｓｉｓ）２０００マシンを使用して完全に配列決定さ
れている（図３および図４）。

【００７９】テトラサイクリン耐性の誘導性を調べた。
はじめに、（ｐＩＣＩ００４２）Ｃ６００に対するテト
ラサイクリンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。こ
れは、この菌株の培養物をテトラサイクリン０．５μｇ
／ｍｌで誘導することによって行なった。成長後、この
培養物を順次に希釈し、テトラサイクリン０〜５００μ
ｇ／ｍｌの量を含有するブイヨン培地上へ塗布して平板
あたり約１００コロニーを得た。ＭＩＣは約２００μｇ
／ｍｌであることを見出した。次いで、（ｐＩＣＩ００
４２）Ｃ６００の培養物を、テトラサイクリンの不在に
おけるルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨン中で初期対数増殖
期に成長させた。これを、テトラサイクリン誘導を有す
るか有しないブイヨン中に平行培養物を接種するのに使
用した。これらの培養物は誘導された発現を許容するた
め３７℃で９０分、通気で成長させた。次いで、これら
の培養物の順次希釈物を、テトラサイクリン１００μｇ
／ｍｌを有するか有しない濃厚培地上へ塗布した。得ら
れるコロニーは誘導されなかった培養物の生存度がテト
ラサイクリン培地で誘導された培養物よりも１６００倍
低いことを証明した。これは、ｐＩＣＩ００４２中のｔ
ｅｔＡ＋ｔｅｔＲ誘導系が満足に作用することを確認す
る。

【００８０】Ｅ．コリＣ６００中のｐＴＢ３５１及びｐ
ＩＣＩ００４２の保持安定性を調べた。これは、それを
その親プラスミドｐＡＴ１５３と比較し、ｐＩＣＩ００
４２中のｃｅｒ配列の効果を注目するためであった。培
養物を選択なしに成長させ、試料を５０，１００および
１５０世代の成長後にプラスミドの存在につき調べた。
この期間を通じて菌株によるプラスミド喪失は認められ
なかった。こうしてｐＴＢ３５１は、ｃｅｒ配列なしで
も、その親ｐＡＴ１５３を越える安定性を得たものと思
われる。これは、そのｔｅｔ遺伝子の欠落の結果であ
る。天然に出現するプラスミドは常に、誘導的制御下に
テトラサイクリン耐性を有し、ｐＡＴ１５３中の構成ｔ
ｅｔ遺伝子はテトラサイクリンの不在において逆選択性
である。これは、テトラサイクリン耐性機構が細胞質膜
輸出ポンプとして働くという事実のためである。必要と
されない場合、膜構造を損傷し、必要な代謝産物を輸出
するかまたは代謝エネルギーを浪費することによって細
胞を傷つける。ｐＩＣＩ００４２中のｃｅｒ配列の存在
は、高レベルで組換え遺伝子を表現するために使用する
逆選択条件下でさえも、プラスミド保持安定性に寄与す
る。

【００８１】（ｂ）プラスミドｐＣＨ１ ０１の製造 プラスミドｐＣＨ１０１は、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラ
グメント（第５ａ図参照）がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４
（５ｂ図も参照）およびエッジ（Ｅｄｇｅ Ｍ．Ｄ．）
および協力者（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ”，１９８３年，第１１巻，第６４１９頁〜
第６４３５頁）によって記載されたようなインターフェ
ロンα₂遺伝子配列からなるフラグメントによって置換
されている点を除き、ｐＩＣＩ００２０（例５ｃ参照）
に相当する。この点に関して、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３
４の３′−末端ＡＴＧコドンは、上述したエッジ（Ｅｄ
ｇｅ）および協力者（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”）のインターフェロンα₂配列中の
システィン（アミノ酸１）をコードするＴＧＴコドンの
直前にある。こうして、５′−ヌクレオチド配列ＧＡＴ
ＣＣＡＴＧおよび相補的３′−ヌクレオチド配列ＧＴＡ
Ｃが、上述した対照のヌクレオチド配列から省略されて
いる。

【００８２】（ｃ）ｐＩＣＩ００４２中への発現カセッ
トの挿入 ｔｒｐプロモーター、リボソーム結合部位およびインタ
ーフェロンα_２遺伝子からなる発現カセットを、Ｅｃｏ
ＲＩないしＳｐｈＩ制限フラグメントにおけるプラスミ
ドｐＣＨ１０１（上記ｂ参照）から単離した。これを、
ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで同様に切断した産生ベクタ
ー（ｐＩＣＩ００４２）（上記参照）中へ結合した。こ
のＤＮＡをＥ．コリＣ６００の受容能のある培養物を形
質転換するために使用し、テトラサイクリン耐性コロニ
ーを単離した。これらの少数の、発現カセットに担持さ
れたＳｓｔＩ制限部位獲得を、ＤＮＡクローン分析によ
って試験した。さらに、これに関して正のクローンを、
期待された作図が正しいことを調べるために制限マッピ
ングによって試験した。これらは、クーマシーブルーで
染色したポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで分析した際
にインターフェロンα_２タンパク質を産生する授与され
た能力についても調べた。こうして確認されたクローン
をｐＬＢ００５と表示した。

【００８３】（ｄ）ｐＴＢ２４４中への Ｔ４転写ターミ
ネーターの 挿入 ＳａｌＩないしＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（６７塩基
対長）（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．３３および図１ｂ参照）の
形のＴ４転写ターミネーター配列を、中間体ベクターｐ
ＴＢ２４４（ヨーロッパ特許公告第２３７２６９号に記
載されている）のマルチクローニング部位に、そのＳａ
ｌＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で挿入した。この組立の
構造（ｐＴＢ２４４−Ｔ４ｔｅｒ）を確認するためにク
ローン分析を使用した。次に、このベクターから、マル
チクローニング部位およびＴ４ターミネーターの大多数
を含有するＳｓｔＩないしＳｐｈＩフラグメントを単離
した。これを、ＳｓｔＩおよびＳｐｈＩで同様に切断し
たｐＬＢ００５中へ挿入し、これによりインターフェロ
ンα₂遺伝子を置換し、ｔｒｐプロモーター、マルチク
ローニング部位およびＴ４ターミネーターからなるカセ
ットを脱離する。この組立を、クローン分析によって確
認し、このプラスミドをｐＬＢ０１３と表示した。

【００８４】（ｅ）マルチクローニング 部位の置換 ｐＬＢ０１３中のマルチクローニング部位は幾つかの点
でこのベクターに対して理想的ではない：ＳａｌＩ，Ｂ
ａｍＨＩおよびＳｍａＩ部位は珍しくはなく、プラスミ
ド上の他の個所に存在する。それ故、このフラグメント
をＳｓｔＩおよびＸｂａＩ（双方共珍しい）で切断する
ことによって切除し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５の配
列：

【００８５】

【化２】

【００８６】を有する合成オリゴヌクレオチドをその位
置に挿入した。クローンを、新しい制限部位の獲得に関
し分析し、次いで配列決定により確認した。１つのかか
るプラスミドをｐＬＢ０１４と表示した。こうして挿入
された新しいクローニング部位は次のとおりである：Ｎ
ｄｅＩ，ＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩ，ＸｈｏＩおよびＳｃａ
Ｉ、これに既述ののＸｂａＩおよびＳａｌＩが続く。

【００８７】（ｆ）他の変更 ｐＬＢ０１４中の隣接ＳｓｔＩおよびＮｄｅＩ部位は、
多分その密接な近接性のため、これら両制限酵素により
同時にまたは順次に切断することができなかった。それ
故、付加的配列をその間に挿入した。これは、ｐＬＢ０
１４をＳｓｔＩおよびＫｐｎＩで切断し、次いでＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３６：

【００８８】

【化３】

【００８９】の合成オリゴヌクレオチドを挿入すること
によって行なった。クローンを、外部ＰｖｕＩＩまたは
ＰｓｔＩ部位の獲得に関し分析し、次に配列決定により
確認した。１つのかかるプラスミドをｐＬＢ０１５（＝
ｐＩＣＩ００８０）（図７参照）と表示した。このプラ
スミド（ｐＬＢ０１４とは異なる）は、ＳｓｔＩおよび
ＮｄｅＩによって有効に切断される。これは、発現すべ
き遺伝子のＡＴＧ出発コドンを設けるため、上流ｔｒｐ
プロモーター（ＮｄｅＩと表示）に関して正確に位置定
めされた種々のリボソーム結合部位配列を挿入するため
の位置を与えることができる。

【００９０】例 ２ ｔｒｐプロモーターを包含するベクターを用いる［Ａｒ
ｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒトＧ−ＣＳＦの製造 ａ）プラスミドｐＩＣＩ１２３９（例７に記載）は、上
述したように、緩衝液Ｈ中でＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ
で消化した。ｔｒｐプロモーター、リボソーム結合部位
および［Ａｒｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒトＧ−ＣＳ
Ｆの遺伝子を含有する小さいＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラ
グメントを、０．７％のアガロースゲルからジーンクリ
ーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（ＴＭ））の使用により単離
した。ベクターフラグメントは、ｐＩＣＩ００８０（例
１ｆ参照）から緩衝液Ｈ中でＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ
で消化することによりベクターフラグメントを製造し、
大きいＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントを０．７％ア
ガロースゲルからジーンクリーン（ＴＭ）の使用により
単離した。小さいＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント
を、既述したようにベクターに対し２：１モル過剰の挿
入体を使用して、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩベクターフラグ
メント中へ結合し、結合混合物をＥ・コリ菌株ＭＳＤ５
２２を形質転換するために使用した。この形質転換体
を、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ
−寒天平板上での成長のために選択した。３つのコロニ
ーを選択し、補助剤およびテトラサイクリン（１５μｇ
／ｍｌ）を含有するＭ９最小培地中で往復振とう器で２
０時間３７℃で成長させた。全細胞リゼイトのクーマシ
ーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査すること
によりタンパク質蓄積を測定した。これら３つのクロー
ンは［Ａｒｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ｈｕ Ｇ−ＣＳ
Ｆと表示した。コロニーの１つからのプラスミドＤＮＡ
はｐＩＣＩ１３２７と表示し、プロモーターおよび遺伝
子の配列は、既述したような標準ジデオキシ配列決定法
によって確認した。

【００９１】ｂ）発酵 ｐＩＣＩ１３２７はＥ・コリ菌株ＭＳＤ５２２に形質転
換し、得られる組換え体をグリセロールストック上で−
８０℃で精製し、保持した。

【００９２】培養物のアリコートをストックから取出
し、寒天平板上へ線状に接種し、３７℃で夜どおし成長
させた後、単一コロニーを分離した。単一の所望コロニ
ーを取除き、テトラサイクリンブイヨン１０ｍｌ中へ再
懸濁させ、１００μｌをテトラサイクリンブイヨン７５
ｍｌを含有する３つの２５０ｍｌの三角フラスコのそれ
ぞれ中へ直接に接種した。往復振とう器上で３７℃で１
６時間の成長後、フラスコの内容物をプールし、成長培
地２０ｌを含有する発酵槽を接種するのに使用した。

【００９３】

【表１】

【００９４】次いで、発酵を温度３７℃、６．７のｐＨ
（６Ｍの水酸化ナトリウム溶液の自動的添加によって制
御）で実施した。溶存酸素張力（Ｏｘｙｇｅｎ ｔｅｎ
ｓｉｏｎ；ｄＯＴ）整定値は５０％空気飽和であり、は
じめに発酵槽撹拌機速度の自動的調整によって制御し
た。発酵槽への空気流（最初２０ｌ／ｍｉｎ，１容量／
容量／分（ＶＶＭ）に相当）は、発酵槽撹拌機速度がそ
の最大の８０〜９０％に接近した場合５０ｌ／ｍｉｎ
（２．５ＶＶＭ）に増加した。発酵槽の酸素移動速度
（ＯＴＲ）は、記載された条件下で５０のＯＤ₅₅₀に相
当するよりも大きい細胞密度における細菌の酸素取込み
速度（ＯＵＲ）を満足できなかったので、これよりも大
きい細胞密度における発酵槽中のｄＯＴは、細菌酸素消
費速度を制限することにより、５０％空気飽和に維持し
た。これは、炭素を制限してＯＤ₅₅₀が５０になるよう
に培地を配合し、次いで制限炭素源の供給を、硫酸アン
モニウムおよび酵母エキスと一緒に、細菌成長速度を制
限する速度で適用することによって達成された。発酵は
１８時間実施し、その時間中、光学的密度（Ｏ
Ｄ₅₅₀）、細胞乾燥重量および細胞内の［Ａｒｇ¹¹，Ｓ
ｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒトＧ−ＣＳＦの蓄積を測定するた
めに試料を取出し、当業界に周知であるように試料採取
した細菌の全細胞リゼイトのクーマシーブルー染色した
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査することによって測定し
た。

【００９５】ＯＤ₅₅₀が３５に達した場合（８．５時
間）、カゼイン加水分解物溶液（Ｏｘｚｏｉｄ Ｌ４１
１００ｇ／ｌ）を発酵槽中へ０．７５ｇ／ｌ／ｈの速
度でポンプで送入した。

【００９６】ＯＤ₅₅₀が約５０に達した場合、発酵バッ
チ中の炭素源の供給量は消尽されるに到り、ｄＯＴは５
０％空気飽和から急速に上昇する。この点で、グリセロ
ール（４７０ｇ／ｌ）、酵母エキス（１１８ｇ／ｌ）お
よび硫酸アンモニウム（１１８ｇ／ｌ）を含有する供給
量をポンプで発酵槽中へ、返送速度で送入し、次いで発
酵槽撹拌機をその最大の約７０〜８０％にしてｄＯＴを
５０％空気飽和に維持した。カゼイン加水分解物供給
は、終始０．７５ｇ／ｌ／ｈに維持した。約１８時間後
に、培養物の顕微鏡検査が大多数の細胞内に大きい封入
体の存在を示した場合、細菌をソーバル（Ｓｏｒｖａ
ｌ）ＲＣ３Ｂ型遠心機（７０００ｇ，３０分，４℃）で
収穫し、−８０℃で凍結貯蔵した。

【００９７】例 ３ Ｔ７Ａ３プロモーターを含有するベクターを用いる［Ａ
ｒｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒトＧ−ＣＳＦの製造 ａ）Ｔ７Ａ３プロモーター、ｔｒｐリーダーリボソーム
結合部位配列および［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ
の遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント
を、例５のｄ）部に記載したように、ＭＢ ｍｐ１８中
へサブクローン化した。ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩの配列は
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２および第９図に記載されてお
り、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２はＥｃｏＲＩ制限部位
（ヌクレオチド１〜６）、バクテリオファージＴ７のＡ
３プロモーター配列（ヌクレオチド７〜５２）、ｔｒｐ
リーダーリボソーム結合部位配列（ヌクレオチド５３〜
７８）および翻訳開始コドン（ヌクレオチド７９〜８
１）からなる。図９は、ＳａｌＩ制限部位に終る［Ｓｅ
ｒ¹⁷ _' ²⁷］ヒトＧ−ＣＳＦのヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２の３′末端ＡＴＧコドンは、
図９中でトレオニン（アミノ酸１）をコードするＡＣＴ
コドンのすぐ前にあることが認められる。こうして、
５′ヌクレオチド配列ＡＡＴＴＣＡＧＴはＥｃｏＲＩ−
ＳａｌＩフラグメントからは欠如する。ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌＩフラグメントは、ｐＩＣＩ１２９５（例８参照）
から切除によって製造することができる。部位指示の突
然変異誘発は、１本鎖ＤＮＡにおいて、１１位における
ＧｌｎのコドンをＡｒｇに変換するためにオリゴヌクレ
オチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８を用いる例７に記載さ
れたプロトコルに記載されているように実施した。２本
鎖ＲＦ ＤＮＡは、Ｇｌｎ¹¹→Ａｒｇ¹¹変化を含有する
プラークから、例６に記載されたように、ただしＢ₃接
種工程において５時間の代りに３時間、ＥｃｏＲＩ（既
述したように）およびＳｎａＢＩを用いて消化（１０単
位、１ｘＭ緩衝液、ＢＣＬ，３０μｌ，２時間，３７
℃）した点を除いて製造した。得られる、Ｔ７Ａ３プロ
モーター、ｔｒｐリーダーリボソーム結合部位配列およ
びＡｒｇ¹¹コドンを有する遺伝子フラグメントを含有す
る１４４ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩフラグメントを
単離し、ｐＩＣＩ１３２７（Ｓｅｒ⁶⁰およびＳｅｒ⁶⁵の
コドンを含有し、例２に記載されている）からＥｃｏＲ
Ｉ−ＳｎａＢＩ切断ベクターに結合した。結合混合物を
Ｅ・コリ菌株ＭＳＤ５２２に形質転換するために使用
し、形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｇ）
を含有するＬ寒天培地上での成長のために選択した。期
待されたＴ７Ａ３プロモーターおよび［Ａｒｇ¹¹，Ｓｅ
ｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子配列を含有す
るコロニーからのプラスミドＤＮＡは、単離されたプラ
スミド（ｐＩＣＩ１３８６と表示）からのＤＮＡ配列決
定によって同定された。

【００９８】発酵は下記の２つのいずれかの方法（ｂ）
および（ｃ）によって行なった。方法（ｂ）は３７℃で
行なわれ、記載したように１６時間発酵の後、微生物バ
イオマスは３５ｇ／ｌであり、［Ａｒｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _'
²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒトＧ−ＣＳＦは発酵ブロス１ｌあたり７ｇ
を蓄積すると推定された。方法（ｃ）は３０℃で行なわ
れ、従って発酵は低い発酵温度のため遅かった。方法
（ｃ）に関して、３５時間後、微生物バイオマスは５５
ｇ／ｌであり、［Ａｒｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒト
Ｇ−ＣＳＦ収量は、発酵ブロス１ｌあたり１５ｇが蓄積
されると推定された。ｂ）Ｅ・コリ遺伝子保存センター
（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ）から得
たＥ・コリ菌株ＣＧＳＣ６３００（遺伝子型Ｆ^-，λ^-，
ｌａｃ＋）を、プラスミドｐＩＣＩ１３８６で形質転換
した。産生菌株ＣＧＳＣ６３００（ｐＩＣＩ１３８６）
を精製し、グリセロール貯蔵液中に−８０℃に保持し
た。培養物のアリコートを貯蔵液から取出し、Ｌ−テト
ラサイクリンの寒天培地上へ線状に接種して、３７℃で
夜どおし成長させた後（１６時間）単一コロニーを分離
した。ＣＧＳＣ６３００（ｐＩＣＩ１３８６）の単一コ
ロニーを取出し、Ｌ−テトラサイクリンブイヨン１０ｍ
ｌ中に再懸濁させ、１００μｌを直接に、Ｌ−テトラサ
イクリンブイヨン７５ｍｌを含有する１２個の２５０ｍ
ｌ三角フラスコのそれぞれに接種した。往復振とう器で
３７℃で１６時間の成長後、フラスコの内容物をプール
し、変更ＬＣＭ５０成長培地２０ｌを含有する発酵槽を
接種するのに使用した。成長培地の組成は第１表に存在
する。

【００９９】

【表２】

【０１００】次いで、発酵を温度３７℃、６．７のｐＨ
（６Ｍ水酸化ナトリウム溶液の自動的添加により制御）
で実施した。溶存酸素張力（ｄＯＴ）整定値は、５０％
空気飽和であり、最初に発酵槽撹拌機速度の自動的調節
によって制御した。発酵槽への空気流は最初は２０ｌ／
ｍｉｎ（１．０容量容量／分（ＶＭＭ）に相当）であ
り、発酵槽撹拌機速度がその最大（１０００ｒｐｍ）に
達したとき、手動で４５ｌ／ｍｉｎに増加した。発酵は
１６時間実施し、その時間中、培養物の光学密度（ＯＤ
₅₅₀バイオマス濃度）、全微生物タンパク質濃度および
細菌細胞内の［Ａｒｇ¹¹，Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷ _' ⁶⁰ _' ⁶⁵］ヒトＧ
−ＣＳＦの蓄積を測定するため試料を採取した。蓄積
は、当業界に周知であるように、採取した細菌の全細胞
リゼイトのクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルを走査することにより測定した。全微生物タンパク
質は、ロウウィー（Ｌｏｗｒｙ）の方法によって確認し
た。酵母エキスの溶液（２２５ｇ／ｌ）を発酵槽中へポ
ンプで、接種後４．５時間１．７ｇ／ｌ／ｈで送入し
た。成長培地中の炭素源（グリセロール）の供給量が消
尽された場合、ｄＯＴは５０％空気飽和から急速に増加
した。この時点で、グリセロール（７１４ｇ／ｌ）およ
び硫酸アンモニウム（１４３ｇ／ｌ）を含有するフィー
ドをポンプで送入した。細菌の酸素取込み速度（ＯＵ
Ｒ）は、バッチ成長培地中の供給炭素源が消尽される直
前の発酵槽の最大酸素移動速度（ＯＴＲ）に接近してい
るので、フィードは発酵槽中へポンプで、細菌ＯＵＲが
発酵槽の最大ＯＴＲの約８０〜９０％に制限されている
割合で送入した。供給速度を手動でリターンに調整し、
次いでｄＯＴを記載した条件下５０％空気飽和に維持し
た。

【０１０１】ｃ）（ｂ）に記載した発酵法を、温度３０
℃で３５時間繰返した。３０℃の発酵温度を除き、培地
および発酵条件は（ｂ）に記載したものと同じであっ
た。

【０１０２】例 ４ プラスミドｐＡＧ８８の製造 ａ）ヒトＧ−ＣＳＦの合成遺伝子の製造 図１０のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ配列（図１０）は、次の考慮によって設計した： １）１本鎖結合末端はプラスミド中の適当な部位に結合
できる。

【０１０３】２）遺伝子を通じて一連の制限エンドヌク
レアーゼ配列はサブシーケンス遺伝子操作を容易にす
る。

【０１０４】３）翻訳終止コドン。

【０１０５】４）解読領域の５′−末端におけるコドン
は通常Ａ／Ｔ大きいように選択された。他のコドンは通
常、Ｅ・コリ中での表現に対し好ましいものとして選択
された。

【０１０６】この遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１な
いしＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８と表定された１８のオリ
ゴヌクレオチドから組立てられた。

【０１０７】オリゴヌクレオチドの 製造 下記に示したオリゴヌクレオチド配列は、５′−ジメト
キシトリチル塩基保護されたヌクレオシド−２−シアノ
エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイトから
アプライド バイオシステムス社（（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）の３８０Ａ ＤＡＮ
シンセサイザーで製造され、アプライドシステム社によ
り供給されたプロトコルによれば０．２μＭの大きさで
制御された細孔ガラス支持体に結合して保護されてい
た。

【０１０８】また、オリゴヌクレオチド配列は、アトキ
ンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）およびスミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）により“オリゴヌクレオチド合成、実際のアプロー
チ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ，ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”）
（Ｍ．Ｔ．Ｇａｉｔ，編集者ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘ
ｆｃｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，第３５頁〜第
８１頁）に記載されているような手操作法によって製造
することもできる。

【０１０９】詳細には、オリゴヌクレオチド配列の製造
はアプライドバイオシステム社の３８０Ａ ＤＮＡシン
セサイザーの使用により、次のようにして行なった：そ
れぞれのオリゴヌクレオチドを、固体支持体から剥離
し、すべての保護基を除去した後、水（１ｍｌ）に溶か
した。３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．６；４０μ
ｌ）およびエタノール（１ｍｌ）をオリゴヌクレオチド
溶液（４００μｌ）に加え、混合物を−７０℃で２０時
間保存した。得られる沈殿物を遠心分離（１３００ｒｐ
ｍ、１０分間）によって集め、ペレットをエタノール対
水（７：３）（２００μｌ）で洗浄し、次に真空中で短
時間乾燥し、水（１５μｌ）に溶かし、ホルムアミド／
染料混合物（ＮａＯＨ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ０．５ｍＭ、
プロムフェノールブルー０．０１％、キシレンシアノー
ル０．０１％、ホルムアミド８０％）１０μｌを加え
た。

【０１１０】オリゴヌクレオチドを、尿素８．３Ｍを含
有するトリスーホウ酸塩５０ｍＭ（ｐＨ８．３）中の１
０％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。正しい長さ
のオリゴヌクレオチドは、ＵＶシヤドウイング法（Ｎａ
ｒａｎｇおよび協力者、１９７９年、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，第６８巻、第９０頁〜
第９８頁）によって同定した−普通最も顕著なバンド
（ゲルから切除し、５ｍＭトリスーホウ酸塩（ｐＨ８．
３）中で３００ｍＶで３〜４時間電気溶離した）。水溶
液をｎ−ブタノールでの処理（混合、スピンおよび有機
上層の除去）によって約２００μｌに濃縮した。精製し
たオリゴヌクレオチドは０．３Ｍ酢酸ナトリウム溶液か
らエタノール（２．５容量）の添加により−７０℃で２
０時間沈殿させた。

【０１１１】遺伝子のアッセンブリ ー オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２〜ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１７（それぞれ４００ｐＭ）［下記に定
義］を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（３．６単位）
を用い、ＡＴＰ（８００ｐＭ，γ−³²Ｐ ＡＴＰ２５ｐ
Ｍ含有）、スペルミン１００μＭ，ＭｇＣｌ₂２０ｍ
Ｍ、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）５０ｍＭおよびＥＤ
ＴＡ０．１ｍＭを含有する溶液２５μｌ中で３７℃で２
時間リン酸化した。溶液を、１００℃で５分間加熱して
反応を終結させ、次いで第１表に示したように１対に混
合して二重らせんＡないしＩを得た（オリゴヌクレオチ
ドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１８（２５μｌ中４００ｍＭ）を使用した、不リン酸
化）。０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６，２００μ
ｌ）およびエタノール（８５０μｌ）を加え、−２０℃
で２０時間二重らせんを沈殿させた。得られる沈殿物を
遠心分離によって集め、エタノール対水（７：３）で洗
浄し、次いで水（５０μｌ）に溶かした。オリゴヌクレ
オチドの対を、まず溶液を沸騰水浴中で２分間１００℃
に加熱することによって一緒にアニーリングした。次
に、浴を徐々に４０℃に放冷した（約４時間）。３対の
二重らせんを含有する溶液を図示した（第１表参照）よ
うに合してグループＩ〜ＩＩＩを得、凍結乾燥し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（１単位；ＢＲＬ）、トリス（ｐＨ７．
６）５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、ＰＥＧ８０
００ ５％（ｗ／ｖ）、ＡＴＰ１ｍｍ、ＤＴＴ１ｍｍ
（ＢＲＬ，Ｆｏｃｕｓ第８巻、Ｎｏ．１、１９８６年
冬）を含有する溶液３０μｌに溶かし、ＤＮＡを３０℃
で５分間、次に１６℃で２０時間結合した。３Ｍ酢酸ナ
トリウム（２０μｌ）および水（１５０μｌ）を加え、
生成物をエタノールを添加し、２０時間−２０℃に冷却
することによって沈殿させた。沈殿物を遠心分離によっ
て集め、エタノール（１ｍｌ）で洗浄し、次に水（１５
μｌ）およびホルムアミド／染料混合物（１０μｌ）に
溶かし、トリスーホウ酸塩（ｐＨ８．３）、ＥＤＴＡ１
ｍＭおよび尿素８．３Ｍ中の１０％ポリアクリルアミド
ゲル上で精製した。適当な長さ（１７３〜１８６の塩
基）のストランドの束を、個々のオリゴヌクレオチド配
列につき上述したように、オートラジオグラフィーによ
って同定し、単一ゲル薄片から電気溶離によって一緒に
単離した。ＤＮＡ鎖をまず、水溶液（５０μｌ）を１０
０℃で２分間加熱し、次いでそれを４時間にわたり４０
℃に冷却させることによってアニーリングした。

【０１１２】グループＩ、ＩＩおよびＩＩＩを、大体に
おいてグループ製造につき記載したように一緒に結合し
て、生成物として図１０に示した遺伝子配列を得る。沈
殿後、遺伝子を、個々のオリゴヌクレオチドにつき既述
したように、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
し、次いで水（２０μｌ）中に溶解した。

【０１１３】 第１表 二重らせん オリゴヌクレオチド 塩基の数 トップ鎖中 ボトム鎖中 Ａ SEQ ID No.1+SEQ ID No.2 ６２ ６４ Ｂ SEQ ID No.3+SEQ ID No.4 ６０ ６０ Ｃ SEQ ID No.5+SEQ ID No.6 ４８ ５１ Ｄ SEQ ID No.7+SEQ ID No.8 ６３ ６０ Ｅ SEQ ID No.9+SEQ ID No.10 ６３ ６３ Ｆ SEQ ID No.11+SEQ ID No.12 ６０ ６３ Ｇ SEQ ID No.13+SEQ ID No.14 ６３ ６０ Ｈ SEQ ID No.15+SEQ ID No.16 ６０ ６０ Ｉ SEQ ID No.17+SEQ ID No.18 ５５ ５３ Ｉ Ａ＋Ｂ＋Ｃ １７０ １７５ ＩＩ Ｄ＋Ｅ＋Ｆ １８６ １８６ ＩＩＩ Ｇ＋Ｈ＋Ｉ １７８ １７３ ｂ）ヒトＧ−ＣＳＦの合成遺伝子のクローニング 上記に記載した合成遺伝子は、プラスミドベクター、ｐ
ＳＴＰ１（Ｗｉｎｄａｓｓおよび協力者、“Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，１９８３年、
第１０巻、第６６３９頁）中へクローン化した。

【０１１４】ベクター製造のために、ＳＴＰ１ １０μ
ｇを水（３７．５μｌ）および１０ＸＢ制限緩衝液
（４．５μｌ）（ＢＣＬ）に溶かした。制限エンドヌク
レアーゼＳａｌＩ（３μｌ）（ＢＣＬ、８単位／μｌ）
を加え、混合物を３７℃で１時間、線状プラスミドガス
ーパーコイルでニックを有する環状よりも優勢になるま
で恒温保持した。このＤＮＡをエタノールで４℃で３分
間沈殿させ、エタノール対水（７：３）で洗浄し、次い
で水（３９．５μｌ）、１０ＸＨ緩衝液（４．５μｌ）
（ＢＣＬ）に溶かした。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ（１μｌ）（ＢＣＬ、９０単位／μｌ）を加え、混
合物を３７℃で１時間、大きいＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフ
ラグメントが優勢になるまで恒温保持した。ＤＮＡを−
２０℃で２０時間沈殿させ、エタノール対水（７：３）
で洗浄し、次に水（２０μｌ）に溶かした。

【０１１５】大きいＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント
を、１％分配アガロースゲル上で精製し、電気溶離し、
既述したように沈殿させ、次いで水（２０μｌ）に溶か
した。合成遺伝子の結合のため、ベクターＤＮＡ（Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント溶液２μｌ）、合成遺伝
子（既述した水溶液５μｌ、５Ｘリガーゼ緩衝液（６μ
ｌ−２５０ｍＭトリスｐＨ７．６，５０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂、２５％ｗ／ｖＰＥＧ８０００、５ＭＭ ＡＴＰ，５
ｍＭ ＤＴＴｅｘＢＲＬ）水（１５μｌ）およびＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（２μｌ、１Ｕ／μｌ）の混合物を１６℃
で４時間恒温保持した。ＤＮＡ混合物を直接（純結合混
合物１μｌまたは水で５倍に希釈した結合混合物２μ
ｌ）を、Ｅ・コリ菌株ＨＢ１０１を形質転換するために
使用した。ＤＮＡ混合物（１または２μｌ）を氷上の受
容能のあるＥ・コリＨＢ１０１細胞（２０μｌ，ＢＲ
Ｌ）に加え、混合物を氷上で４５分間恒温保持し、次い
で４２℃で４５秒間熱ショックした。氷上で２分後、Ｓ
ＯＣ緩衝液（バクトトリプトン２％；酵母エキス０．５
％；ＮａＣｌ１０ｍＭ；ＫＣｌ２．５ｍｍ；ＭｇＣ
ｌ₂，ＭｇＳＯ₄２０ｍｍ（それぞれ１０ｍｍ）；グルコ
ース２０ｍｍ）１００μｌを加え、混合物を３７℃で１
時間恒温保持した。懸濁液のアリコートをアンピシリン
５０μｌ／ｍｌを有するＬ−平板上に塗布した。形質転
換体を、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）および協力者
により“モレキュラー・クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）”および英国特許出願
第８５０２６０５号に記載された標準法を用いるコロニ
ー・雑種形成分析により、クローン化合成遺伝子の存在
を選抜した。１００のコロニーの全体をフィルター（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）上へ線状に
接種し、３７℃で２０時間成長させ、溶菌し、ベーキン
グした。フィルターを、ランダムーラベルキット（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）の使用によりオリゴヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１から製造した放射性プローブで
６５℃で２０時間雑種形成した。正の雑種形成信号を与
えた５つのコロニー１〜５を、小規模（１００ｍｌ）で
Ｌブイヨン中、３７℃で２０時間成長させ、プラスミド
ＤＮＡを本質的にマニアタス（Ｍａｎｉａｔａｓ）およ
び協力者（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に
より“モレキュラー・クローニング：実験室マニュアル
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）”に記載されているような
塩化セシウム勾配の遠心分離によって製造した。

【０１１６】ＤＮＡを、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）およ
び協力者により“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．”，米国、第７４巻、第５４６３頁〜第５４６７頁
（１９７７年）に記載されたような標準ジデオキシ鎖停
止法により、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ商品
名）キット（米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ社製品）を用いて配列決定した。オリゴヌ
クレオチドＳＥＱ ＩＤＮｏ．１９〜ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２３（下記に記載および第２表参照）を、配列決定
プライマーとして使用した。

【０１１７】 第２表 コード プライミング部位 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９ トップストランド ２１４−２３４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０ トップストランド ３３３−３５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１ ボトムストランド ３７５−３９５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２ ボトムストランド ２０７−２２７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３ ボトムストランド ６９− ９３ クローン５からのプラスミドＤＮＡは、図１０に示した
ＤＮＡ配列を含有していた。このプラスミドはｐＡＧ８
８と表示され、標準法により次のＥ・コリ菌株ＨＢ１０
１およびＣＧＳＣ６３３（下記にＭＳＤ５２２と呼称）
の受容能のある細胞を形質転換するために使用した。

【０１１８】例５ ［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷]ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有するＭ１３
ｍｐ１８鋳型の製造 例４における工程ａ）およびｂ）の法を、下記の変更で
繰返した：ＳＥＱ ＩＤＮｏ．１，２，３および４（下
記に定義）をオリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２４，２５，２６および２７（下記に定義）にそれぞれ
交換。

【０１１９】ｃ）［Ｓｅｒ^{１７，２７}］ヒトＧ−ＣＳＦ
の遺伝子の発現ベクター中へのクローニング 上記した遺伝子（図９参照およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
３１）をプラスミドベクターｐＩＣＩ００２０中へクロ
ーン化した。このベクターは、６５１ｂｐ ＥｃｏＲＩ
−ＡｃｃＩ領域が次のものからなる１６７ｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩ−ＣｌａＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０）によって
置換されたｐＡＴ１５３を主体とするプラスミドであ
る： （１）合成Ｅ．コリｔｒｐプロモーターおよびｔｒｐリ
ーダーリボソーム結合部位 （２）翻訳開始コドン （３）Ｍ１３ｍｐ１８から誘導された多重制限酵素認識
配列（ＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，Ｐ
ｓｔＩ，ＳｐｈおよびＨｉｎａＩＩＩに対する部位含
有） （４）合成転写終結配列 この領域のＤＮＡ配列は図５ａに示されている。

【０１２０】ｐＩＣＩ００２０発現ベクターは、１０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム中のＫｐｎＩ（ＢＣｌ）で消化して完結させた。Ｄ
ＮＡは、０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含有する溶液から−
２０℃でエタノールで沈殿させ、次に３′−付着末端を
３７℃で１０分間Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理するこ
とにより除去した： 氷（１６μｌ）中ＤＮＡ（１μｇ） １０ＸＴ４ポリメラーゼ緩衝液（２μｌ） ０．３３Ｍトリス酢酸塩（ｐＨ７．９） ０．１Ｍ酢酸マグネシウム ０．６６Ｍ酢酸カリウム ５ｍＭジチオトレイトール １ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ＰＥＮＴＡ
ＸフラクションＶ） ２ｍＭｄＮＴＰ混合物（１μｌ） Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（１μｌ；２．５単位／μｌＢ
ＣＬ） 水（８０μｌ）を加え、混合物をフェノール／クロロホ
ルム（１００μｌ）で抽出し、次にクロロホルム（１０
０μｌ）で抽出した。ＤＮＡは、３Ｍ酢酸ナトリウム
（１０μｌ）の添加後、−２０℃でエタノール（２５０
μｌ）で沈殿させ、次いで１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）中のＳａｌＩ（ＢＣＬ）で消化して完結させ
た。Ｋｐｎ平滑断端−ＳａｌＩは０．７％アガロースゲ
ルから精製し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ商
品名）を使用し、製造業者（ＢｉＯ１０１、米国）の推
奨する方法に従って単離した。

【０１２１】合成遺伝子は次のようにしてｐＳＴＰ１ベ
クターから単離した。ベクターを、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）中のＳａｌＩおよびＳａｌＩ（双方共Ｂ
ＣＬから）で消化した。５３０ｂｐフラグメントを０．
７％アガロースゲルから精製し、ジェンクリーン（Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ，商品名）を使用し次の製造業者ＢｉＯ
１０１の推奨する方法に従って単離した。

【０１２２】結合のため、５０ｍＭトスリＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＡＴＰ、１
ｍＭ ＤＴＴ、５％ｗ／ｖＰＥＧ８０００およびＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（２単位；ＢＲＬ）を含有する溶液２０μ
ｌ中のＳｃａＩ−ＳａｌＩ遺伝子フラグメント（５０ｎ
ｇ）およびｐＩＣＩ００２０の混合物を１６℃で２０時
間恒温保持した。得られる混合物を、記載したように、
受容能にあるＥ・コリＨＢ１０１細胞（ＢＲＬにより供
給）を形質転換のために使用した。形質転換体を、アン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬ−寒天平板上での
成長によって選択し、記載したように³²Ｐ標識プローブ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４）でのコロニー雑種形成に
よる遺伝子の存在につき選抜。プラスミドＤＮＡは、６
つの正に雑種形成するコロニーから製造し、塩化セシウ
ム勾配での遠心分離により精製し、記載したジデオキシ
配列決定によって配列決を確認した。

【０１２３】この遺伝子を含有するプラスミドｐＩＣＩ
１０８０と表示した。

【０１２４】ｄ）［Ｓｅｒ^{１７，２７}］Ｇ−ＣＳＦの遺
伝子を含有する発現カセットのＭ１３ｍｐ１８中へのサ
ブクローニング 例３〜８に詳述したＧ−ＣＳＦ誘導体製造のための出発
点を設けるため次のサブクローニングを行なった。

【０１２５】ｐＩＣＩ１０８０からのプラスミドＤＮＡ
（塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製）をＥｃｏ
ＲＩおよびＳａｌＩ（ＢＣＬ）を用いて製造業者の指示
により消化して完結した。ｔｒｐプロモーターおよび
［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷]Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する小さいＥｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、０．７％アガロース
ゲルから、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ；商品
名）の使用により単離した。このフラグメントを、Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩ切断Ｍ１３ｍｐ１８ベクター（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより供給さ
れるＤＮＡ；ＢＣＬからの酵素）中へのクローン化し
た。フラグメントを、５Ｘ ＢＲＬ結合緩衝液中でＢＲ
Ｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（既述した）を用いて一緒に結
合した。結合混合物を受容能力のあるＥ・コリＴＧ１細
胞（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｉａｔｉｓおよ
び協力者Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載されたＭ
ａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの塩化カルシウム法により受
容能力形成）を移入するために使用した。移入した細胞
を、ＤＭＦ中の２％Ｘ−Ｇａｌおよび対数増殖期Ｅ・コ
リＴＧ１細胞２００μｌを含有するＴＹ上層寒天（ｔｏ
ｐ ａｇａｒ）中に懸濁させ、２ＸＴＹ寒天平板上へ塗
布した（ＴＹ上層寒天−滅菌Ｈ₂Ｏ５００μｌ中のバク
トトリプトン８ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、
バクト寒天３．７５ｇ；ＴＹ平板−滅菌Ｈ₂Ｏ５００ｍ
ｌ中バクトトリプトン８ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、バクト寒天７．５ｇ）上に塗布した。

【０１２６】４つの白色プラークを、ＴＹブイヨン（滅
菌水５００ｍｌ中バクトトリプトン８ｇ、酵母エキス５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ）アリコート中の１％Ｅ・コリＴＧ
１細胞４Ｘ２ｍｌ中へ採取し、３７℃で６時間成長させ
た。培養物２ｍｌを０．５ｍｌおよび１．５ｍｌのアリ
コートに分割した。細菌を、エツペンドルフ（Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ；商品名）の微量遠心分離管中の溶液から遠
心分離し、上澄みを滅菌したエツペンドルフ管に移し
た。０．５ｍｌのアリコートを−２０℃でファージスト
ックとして保存した。

【０１２７】１．５ｍｌのアリコートを、アメルシャム
インターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ）Ｍ１３配列決定ハンドブック（下記参
照）中の方法に従い１本鎖ＤＮＡを製造するために使用
した。次に、これらのＤＮＡ試料を、オリゴヌクレオチ
ドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
３およびＭ１３ユニバーサル配列決定プライマーを使用
して配列決定した。反応は、製造業者の指示によりシー
ケナーゼキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｋｉｔ，商品
名）を使用して実施した。４つのクローンは全部、［Ｓ
ｅｒ¹⁷ _' ²⁷]Ｇ−ＣＳＦの正しいＤＮＡ配列を有してい
た。

【０１２８】大規模１本鎖ＤＮＡの 製造 ＤＮＡ２００〜５００μｇ／ｍｌの１本鎖ＤＮＡ製造の
ため、アメルシャム・インターナショナルの“オリゴヌ
クレオチド・ダイレクテッド・ムタゲヌシス（Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）”中の方法を使用した。詳細な方法は
次のように実施する： 大規模１本鎖ＤＮＡの製造： Ａ．１ｍｌファージストックの製造 １．グルコース／最小培地平板から単一ＴＧ１Ｅ・コリ
コロニーを採取、２ＸＴＹ培地中で夜どおし成長、３７
℃で３時間振とう。 ２．１０ｍｌの滅菌培養管中の２ＸＴＹ培地１ｍｌを、
工程１からの３時間培養物１００μｌで接種。 ３．培養物１ｍｌを組換えプラークで接種。 ４．３７℃で振とうしながら４時間恒温保持、微量遠心
分離管に移す。 ５．外界温度で５分間遠心分離。上澄みを新しい管中へ
注入。 ４℃で夜どおし保存。次の工程のためのTG1E・コリの夜
どおし培養物を準備。

【０１２９】Ｂ．１００ｍｌのファージ培養物の成長 １．１００ｍｌの２ＸＴＹ培地をＴＧ１の夜どおし培養
物１ｍｌで接種、３７℃で振とうして０．Ｄ₅₀₀ ０．
３にする。 ２．Ａ５（上記）からのファージ上澄み１ｍｌを１００
ｍｌ培養物に添加。 ３．３７℃で振とうしながら５時間恒温保持。遠心分離
管に移す。 ４．４℃で３０分間５０００ｘｇで遠心分離。 ５．上澄みをきれいな遠心分離管に移す。任意の細胞を
持出さないように注意（ＲＦ ＤＮＡ製造のための細菌
ペレットは保持）。 ６．上澄みに２．５Ｍ ＮａＣｌ中の２％ｗ／ｖＰＥＧ
６０００ ０．２容量を添加。十分に混合、次いで４℃
で１時間放置。 ７．４℃で２０分間５０００ｘｇで遠心分離。上澄みを
投棄。 ８．５分間５０００ｘｇで遠心分離、すべての残留ＰＥ
Ｇ／ＮａＣｌをパスツールピペットで吸取る。 ９．ウイルスペレットを５００μｌの水（２回蒸留）中
へ再懸濁させ、微量遠心分離管（１．５ｍｌ）に移す。 １０．残留細胞を除くため微量遠心分離管中で５分間遠
心分離。上澄みを新しい微量遠心分離管に移す。 １１．上澄みに２０％ＰＥＧ１２．５Ｍ ＮａＣｌ ２
００μｌを加え、良く混合し、次いで１５分間外界温度
で放置。 １２．５分間遠心分離、上澄みを投棄。 １３．２分間遠心分離、痕跡のすべてのＰＥＧ／ＮａＣ
ｌを抜取りパスツールピペットで慎重に除去。 １４．ウイルスペレットを２回蒸留水５００μｌ中へ再
懸濁。 １５．トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で飽和したフェノー
ル２００μｌ、１ｍＭＥＤＴＡを添加、短時間渦動。 １６．管を室温で１５分間放置。 １７．３分間遠心分離。 １８．上澄みを新しい管に移す。 １９．工程１５〜１８を繰返す。 ２０．クロロホルム５００μｌを加えて水相を２回抽
出。 ２１．３Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌおよび無水エタノー
ル１ｍｌを添加。混合。 ２２．ドライアイス・エタノール浴中に２０分間入れ
る。 ２３．１５分間遠心分離。 ２４．各ペレットを−２０℃のエタノール１ｍｌで洗
浄、注出する。 ２５．ペレットを真空乾燥し、２回蒸留水５０μｌ中を
上昇させる。 この方法は、１本鎖ＤＮＡ１００〜２００μｇを生じ
る。

【０１３０】例６ ｐＩＣＩ１１０７９製造 例５に記載した方法を次の点を除いて繰返した：二重ら
せんＩをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、
１ＸＨ緩衝液（ＢＣＬ；３０μｌ）中のＭｓｔＩＩ（１
０単位で、３７℃で２時間消化した。

【０１３１】エタノールでの沈殿に続き、１４３ｂｐＥ
ｃｏＲＩ−ＭｓｔＩＩフラグメントを７Ｍ尿素を含有す
る１０％ポリアクリルアミドゲル上で精製し、ゲル薄片
から電気溶離によって単離し、ＤＮＡ鎖を例４に記載し
たようにアニーリングした。

【０１３２】上記した記載した合成ＥｃｏＲＩ−Ｍｓｔ
ＩＩフラグメントを、例４に記載のプラスミドベクター
ｐＡＧ８８中へクローン化した。ベクター製造のため、
ｐＡＧ８８（１０μｇ）をＭｓｔＩＩ（２０単位；ＢＣ
Ｌ）で、３７℃で２時間消化した。ＤＮＡを０．３Ｍ酢
酸ナトリウムから−２０℃でエタノールで沈殿させ、次
いで１ＸＨ緩衝液（ＢＣＬ；１００μｌ）中でＥｃｏＲ
Ｉ（２０単位；ＢＣＬ）を用いて３７℃で２時間消化し
た。エタノールでの沈殿に続き、大きいＥｃｏＲＩ−Ｍ
ｓｔＩＩフラグメントを１％アガロースゲル上で精製
し、製造業者（ＢｉＯ１０１、米国）により記載された
ようにジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ商品名）を
用いて精製した。合成フラグメントを含有するコロニー
を、オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）か
ら製造した放射性プローブで選抜することにより確認
し、正しい配列は例５（上記）に記載したようにＤＮＡ
配列決定することによって確認した。［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷]Ｇ
−ＣＳＦの遺伝子を含有するプラスミドｐＩＣＩ１１０
７と表示した。

【０１３３】例７ プラスミドｐＩＣＩ１２３９の製造 下記に記載した部位特異的変異誘発方法を、例５または
６（上記）に記載した［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷]Ｇ−ＣＳＦの遺伝
子を含有する変異誘発性鋳型Ｍ１３ｍｐ１８を用いて使
用した。使用した変異誘発性オリゴヌクレオチドは、Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
９（下記に定義）で消化する。

【０１３４】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８中のトリプレッ
トＡＣＧは、位置１１のＧｌｎをＡｒｇに変えるのに役
立ち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９中の前後のＡＧＡトリ
プレットは位置６５および６０のＰｒｏをＳｅｒに変え
るのに役立つ。突然変異誘発は、下記のようにＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２９を用いて単一プライング突然変異誘発
で実施した。生じた単一プラークは、Ｐｒｏ６０Ｓｅｒ
およびＰｒｏ６５Ｓｅｒ変換を併有していた。１本鎖Ｄ
ＮＡはこのプラークから、下記の突然変異誘発方法に記
載したように製造した。このＤＮＡを、突然変異誘発性
プライマーとしてＳＥＱ Ｎｏ．２８を使用する単一プ
ライミング突然変異誘発における突然変異誘発性鋳型と
して使用した。これは＞１００のプラークを生成し、そ
の３つは既述したようにＤＮＡ配列決定により選抜し
た。３つ全部が、組込まれたフルセットの変換を有して
いた。２本鎖ＲＦ ＤＮＡは、プラークの１つから、１
本鎖ＤＮＡの大規模製造の方法（例５における工程ｄ）
によって製造した。ＲＦ ＤＮＡは、細菌ペレットから
ビルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリィ（Ｄ
ｏｌｙ）のアルカリ溶解方法（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，（１９７９年），第７
巻，第１５１３頁〜第１５２３頁）によって抽出し、サ
ムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｆｖｉ
ｔｓｃｈ）およびマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によ
り、“モレキュラークローニング：実験室マニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）に記載され
たような塩化セシウム密度勾配遠心分離法によって精製
した。精製したＲＦ ＤＮＡは緩衝液Ｈ中ＥｃｏＲＩお
よびＳａｌＩで既述したように消化し、ｔｒｐプロモー
タ、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび［Ｓｅ
ｒ¹⁷ _' ²⁷]Ｇ−ＣＳＦの遺伝子に含有する６１９ｂｐフラ
グメントは、０．７％アガロースゲルからゲンクリーン
（ＴＭ）の使用によって単離した。このフラグメント
は、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩと表示されたｐＩＣＩ００２
０ベクター中へ、ベクターに対し２：１モル過剰の挿入
断片を使用し、本質的に既述したように、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＢＲＬ）およびリガーゼ緩衝液を用いて結合し
た。結合混合物を、Ｅ・コリ菌株ＨＢ１０１を形質転換
するために使用した。形質転換体はアンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌを含有するＬ−寒天平板上での成長により選択
した。コロニーを、“モレキュラークローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”に記載されたような、ビルンボ
イム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリィ（Ｄｏｌｙ）
の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａ
ｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｃｎ））によって製造されたプラス
ミドＤＮＡの制限分析により挿入されたＤＮＡの存在に
つき選抜した。期待された６１９ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ挿入断片を含有するプラスミドＤＮＡは、Ｅ・コリ
菌株ＭＳＤ５２２を形質転換するために使用し、ｐＩＣ
Ｉ１２３９と表示した。

【０１３５】部位特異的突然変異誘 発プロトコル エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）および協力者のホ
スホロチオエート法を使用した： ティラー（Ｔａｙｌｏｒ，ＪＷ）および協力者 “ヌクレイック・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）” （１９８５年）第８７４９頁〜第８７６４頁 ティラー（Ｔａｙｌｏｒ，ＪＷ）および協力者 “ヌクレイック・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）” （１９８５年）第８７６５頁〜第８７８５頁 ナカマイエ（Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ）および協力者 “ヌクレイック・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）” （１９８６年）、第９６７９頁〜第９６９８頁 セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ，ＪＲ）および協力者 “ヌクレイック・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）” （１９８８年）、第７９１頁〜第８０２頁 方法は、アメルシャムインターナショナル（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｉｎｔｅｎａｔｉｏｎａｌ）によって供給され
るキットを使用して実施することができる。この方法は
下記に概説されかつ原方法に対し１以上の突然変異誘発
性オリゴヌクレオチドの使用および塩基の長さが３０よ
りも大きいオリゴヌクレオチドに対する培養温度に関す
る変更を含んでいる。

【０１３６】１．１本鎖ＤＮＡ鋳型に対する突然変異体
オリゴヌクレオチドのアニーリング １本鎖ＤＮＡ鋳型（１μｇ／μｌ） ５μｌ リン酸化突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（１．６ｐｍｏｌ／１μｌ） ２．５μｌ 緩衝液１ ３．５μｌ 水 ６μｌ ２つの突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを同時に使用
した場合には、各リン酸化オリゴヌクレオチド２．５μ
ｌ（１．６ｐｍｏｌ／１μｌ）を、緩衝液１ ３．５μ
ｌおよび水３．５μｌ中の１本鎖ＤＮＡ鋳型（１μｇ／
μｌ）５μｌに加えた。３の突然変異誘発性オリゴヌク
レオチドを使用した場合には、各リン酸化オリゴヌクレ
オチド２．５μｌ（１．６ｐｍｏｌ／１μｌ）を１本鎖
ＤＮＡ（緩衝液１ ３．５μｌおよび水１μｌ中１μｇ
／μｌ）５μｌに加えた。上記成分を、蓋をした管に入
れて、オリゴヌクレオチドが塩基の長さ＜３０である場
合には、３分間７０℃の水浴に入れるか、またはオリゴ
ヌクレオチドが塩基の長さ＞３０である場合には、３分
間沸騰水浴に入れた。次に、管を３０分間３７℃の水浴
に入れた。

【０１３７】２．突然変異体ＤＮＡ鎖の合成および結合 アニーリング反応のために次のものを加えた： ＭｇＣｌ₂溶液 ５μｌ ヌクレオチドミックス１ １９μｌ （ｄＣＴＰのＳ含有） 水 ６μｌ クレノウフラグメント（６単位） １．５μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（５単位） ２μｌ 上記成分を１６℃の水浴に入れ、夜どおし放置した。

【０１３８】３．使い捨て遠心分離フィルターユニット
を用いる１本鎖（非突然変異体）ＤＮＡの除去 工程２からの反応に、次の成分を加えた： 水 １７０μｌ ５Ｍ ＮａＣｌ ３０μｌ ２５０μｌの試料を、フィルターユニットの頂部１／２
に加え、ソルバル（ＳＯＲＶＡＬＬ）Ｈ１００Ｂ振動ロ
ータ使用のソルバル（ＳＯＲＶＡＬＬ）ＲＴ６０００Ｂ
ベンチトップ式遠心機中で、室温で１０分間、１５００
ｒｐｍで遠心分離した。次に、ペレットを緩衝液２ １
０μｌ中に再懸濁させた。

【０１３９】４．Ｎｃｉ１を用いる非突然変異体鎖のニ
ッキング 工程３からの反応混合物に、緩衝液３ ６５μｌおよび
Ｎｃｉ８単位（１μｌ）を加えた。混合物を９０分間３
７℃の水浴に入れた。

【０１４０】５．エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて非
突然変異体鎖の消化 工程４からの反応混合物に次のものを加えた： ５０ｍＭ ＮａＣｌ １２μｌ 緩衝液４ １０μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ（５０単位） ２μｌ 混合物を３７℃の水浴に入れ、３７℃で３０分間温置
し、エキソヌクレアーゼＩＩＩ５０単位が３０分間に約
３０００塩基に消化される。次に混合物を、酵素を不活
性にするため、１５分間７０℃の水浴に入れた。

【０１４１】６．ギャップＤＮＡの再重合および結合 工程５からの反応混合物に次のものを加えた： ヌクレオチドミックス２ １３μｌ ＭｇＣｌ₂溶液 ５μｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ（４単位） １μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２．５単位） １μｌ 混合物を３時間１６℃の浴に入れた。

【０１４２】７．受容能のある宿主Ｅ・コリＴＧ１細胞
のＤＮＡでの形質転換：新しく製造した受容能のあるＥ
・コリＴＧ１細胞（ＭａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの方法
に従って製造）３００μｌを、工程６からの反応混合物
２０μｌで形質転換した（複製）。

【０１４３】形質転換体を、ＴＹ平板上のＴＹ上面寒天
中の対数相ＴＧｌ細胞の菌叢中に接種し、３７℃で夜ど
おし恒温保持した。

【０１４４】Ｅ・コリ菌株ＴＧ１は、たとえば米国のＥ
・コリ ジェネティックストックセンター（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ）、エール大学からお
よび英国のアメルシャムインターナショナル（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏ
ｎｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ
ｒｅ ＨＰ７ ９ＮＡから、その“インビトロ”突然変
異誘発系、オリゴヌクレオチド向けキット（製品コード
ＲＰＮ１５２３）で供給されるように、自由に入手でき
る。

【０１４５】例 ８プラスミドｐＩＣＩ １２９５（ｐＣＧ３００とも表わ
される）の調製 （ａ） ｐＩＣＩ １０７９からｐＣＧ５４の製造 ｐＩＣＩ １０７９は、ＥｃｏＲＩ及びＳｔｙｌＩ制限
サイトの間に次の要素を包含するアンピシリン耐性ｐＡ
Ｔ１５３誘導プラスミドである： （ｉ） λファージからのＣＩ８５７； （ｉｉ） λＰ_Lプロモータ； （ｉｉｉ） 合成リボソーム結合サイト； （ｉｖ） 合成インターフェロンα₂遺伝子配列； （ｖ） ＳａｌＩ及びＳｔｙＩ制限サイトの間でＴ
４ファージから誘導された合成転写ターミネータ配列。

【０１４６】この転写ターミネータのＤＮＡ配列は図１
（ｂ）に図示されておりかつＳＥＱＩＤ Ｎｏ．３７で
ある。

【０１４７】ｐＩＣＩ １０７９は図６に図示されてい
る。

【０１４８】ｐＩＣＩ １０７９はブダペスト条約に基
いてＮＣＩＭＢ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉ
ｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ；２３ Ｓ
ｔ． ＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ａ
Ｂ２，１ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，英国在）に寄託され
た（ＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０３７０，寄託日１９９１年
２月１９日）。

【０１４９】ｐＣＧ５４は、前記の同じプロモータ、リ
ボソーム結合サイト及び転写ターミネータ配列、すなわ
ちλＰ_L、ＲＢＳ７及びＴ４を含有するが、特異的なタ
ンパク質の製造をコードする遺伝子配列を有していない
発現ベクターを使用可能にするために構成した。このよ
うな構成物は、引続くクローニングによりこのベクター
中に導入される該当するタンパク質を産生するための転
写及びほん訳を可能にする必須成分を含有する基本発現
ベクターの能力を与える。

【０１５０】このベクターの組立てはｐＩＣＩ １０７
９をそれぞれそのＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩサイトで制限
エンドヌクレアーゼにより切断して開始した。この切断
工程は、プラスミド複製機能及び抗生物質耐性機能のた
めの遺伝子並びにＴ４転写ターミネータ配列でもって完
成される、ｐＩＣＩ １０７９基本骨格を含有するベク
ターフラグメントを生成した。このフラグメントを、Ｄ
ＮＡフラグメントの最終精製用ジーンクリーン（Ｇｅｎ
ｅｃｌｅａｎ）を使ってアガロースゲル精製工程により
単離した。

【０１５１】このベクターフラグメントに約１．２ｋｂ
の第２の小さなＤＮＡフラグメントを導入した。この第
２フラグメントは、例えば前記のようにｐＩＣＩ１０７
９から得られた小さなＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ制限フラグ
メントのＤＮＡ合成もしくは部位又はＰＣＲ突然変異に
より得られる。この第２フラグメントは、元々ｐＩＣＩ
１０７９中存在するのと全く同じプロモータ及びリボ
ソーム結合サイト配列並びに付加的にそれぞれ５′及び
３′末端にＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩサイトを有している
ので、ｐＩＣＩ １０７９フラグメントへの連結に相容
な末端が得られる。Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ酵素Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ及び緩衝液の存在における連結反応により構
成物ｐＣＧ５４が形成された。

【０１５２】この構成物を含有するクローンは、連結反
応混合物のアリコートを菌株ＨＢ１０１のＥ．コリ コ
ンピテント細胞中に形質転換してから初めて単離され
た。

【０１５３】回収した構成物ｐＣＧ５４は３．６８２ｋ
ｂでありかつ図１１の染色体地図に示したような基本的
特徴を有していた。

【０１５４】（ｂ） ｐＣＧ５４（ｐＩＣＩ５４とも表
わされる）からｐＣＧ６１の製造 合成オリゴヌクレオチド配列は、Ｔ４Ａ３プロモータの
天然配列及び、それに隣接してクローン化されたポリペ
プチド遺伝子配列の正しいプロセッシングを可能にする
有効なほん訳開始領域を供給する配列の両方を含有する
ように設計された。この後者の領域に好適な候補配列は
ＲＢＳ１、ｔｒｐリボソーム結合配列であると認められ
た。それ故、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８及びＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．３９と同定された２つの相補性オリゴヌクレ
オチドを合成して、Ｔ７Ａ３プロモータ及びＲＢＳ１配
列を取り込む２本鎖ＤＮＡリンカーを生成する。

【０１５５】オリゴヌクレオチドはＡＢＩ遺伝子合成装
置を用いて標準プロトコルにより８４マーとして生成し
た。それらは、２本鎖形で合成フラグメントがそれぞれ
５′及び３′末端で制限エンドヌクレアーゼサイトＥｃ
ｏＲＩ及びＫｐｎＩを有するように設計した。長さに応
じてオリゴマーはＨＰＬＣにより精製することができ、
かつ精製は１０％アクリルアミドを使ってアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて行なった：７Ｍウレアゲル（Ｕ
ｒｅａ ｇｅｌ）。

【０１５６】精製する前に、オリゴマーを初めにサイズ
決定ゲル上でチェックして、オリゴマーが正しいサイズ
を有することばかりでなく、生成したサンプルがその大
部分の割合として所望のオリゴマーを含有しかつ合成の
副産物として生じる小さい二次オリゴヌクレオチドを高
い割合で混入含有していないことを確認した。

【０１５７】アクリルアミドゲルは標準法によりゲル重
合の触媒として使われる過硫酸アンモニウム及びＮ，
Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンを用い
て生成した。

【０１５８】オリゴヌクレオチドのサイズ決定には、そ
れらが電気泳動後に可視化できることが必要である。そ
れ故、サンプルを³²Ｐを使って放射性標識することが必
要であった。これにより、電気泳動の次にオートラジオ
グラフィによりサンプル品質を評価することができた。

【０１５９】オリゴヌクレオチドサンプルはホスホリル
化されていない粗製形で供給した。これは放射性標識す
るために使用した。即ちサンプルを５′末端で酵素Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼを使ってホスホリル化するこ
とにより放射性（ｈｏｔ）標識することができた。

【０１６０】オリゴマーは合成によりホスホリル化され
ていない形で得られ、かつ精製後にそれぞれ各オリゴマ
ーを、各分子の５′末端をホスホリル化するためにＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼの存在においてＡＴＰを使用
するホスホリル化反応にもたらした（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｆｒｉｓｔｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｐ
５．６８−５．７１参照）。

【０１６１】ホスホリル化したら、２つの相補性オリゴ
ヌクレオチドと一緒にアニーリングしてＴ７Ａ３プロモ
ータ及びＲＢＳ１配列を含有する２本鎖ＤＮＡを形成し
た。

【０１６２】ベクター分子ｐＣＧ５４を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＫｐｎＩで切断した。制限消化の際に、２．３
ｋｂベクターフラグメント並びにλＰ_LプロモータとＲ
ＢＳ１配列とを含有する１．１ｋｂフラグメントが生成
する。このクローニング工程はλＰ_L−ＲＢＳ１配列を
Ｔ７Ａ３−ＲＢＳ１配列を包含するＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ
Ｉ合成フラグメントにより代えるためである。ｐＣＧ５
４の消化により生成した２．３ｋｂベクターフラグメン
トを常法によりアガロースゲル電気泳動法及びアガロー
スフラグメントからＤＮＡを除去するためのジーンクリ
ーン法を適用して精製した。

【０１６３】８４ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ合成フラ
グメントを前記のように生成したベクター分子中に連結
しかつ連結したＤＮＡをＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質
転換するのに使用した。正の組換えクローンの選択はア
ンピシリン耐性により行なった。形質転換に続いて組換
えプラスミドを含有する多数のコロニーをスクリーニン
グのために選択した。クローニングでベクター中に組み
込まれた合成フラグメントは、簡単なスクリーニング法
と同様に組換えプラスミドＤＮＡ試料の制限分析を不適
当にするようなサイズ（８４マー）を有する。そのよう
な小さいサイズの挿入はアガロースゲル電気泳動では容
易には明らかではない。フラグメント自体は、その存在
を認めることのできる内部制限エンドヌクレアーゼ切断
サイトを含有していない。それ故、組換えクローンの最
初のスクリーニングはコロニーハイブリッド形成法によ
り行なった［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７２，３９
６１（１９７５）参照］。組換えクローンからの固定化
プラスミドＤＮＡを含有するニトロセルロースフィルタ
ーを、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３８及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９をラ
ンダムに放射性標識することにより生成したサンプルに
対してハイブリッド形成した。ＤＮＡをα³²Ｐ−ｄＣＴ
Ｐを用いて標識し、かつクレノーポリメラーゼを用いて
３７℃で２時間恒温保持した。正のハイブリッド形成反
応を行なう組換えコロニーをプラスミドＤＮＡ生成用に
選択した。それぞれプラスミドＤＮＡは、純度を確認す
るためにＣｓＣｌ密度勾配遠心法を組込む相対的に大き
なスケール法により調製した［“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ”第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ 及び
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９），ｐ１．４２
〜１．５２参照］。

【０１６４】組換えクローンから単離したすべてのプラ
スミドＤＮＡは配列分析により第二スクリーン中に含ま
れており、これはクローニング結合部及びＴ７Ａ３−Ｒ
ＢＳ１フラグメントのオリゴヌクレオチド配列が完全に
正しいことを明らかにするものであった。使った配列決
定プロトコルはシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）
のそれでありかつ使用するために選択した配列決定プラ
イマーは例えばｐＢＲ３２２ＵＰ（ｐＢＲユニバーサル
プライマー）であった。配列決定はサンガーのジデオキ
シ連鎖末端配列決定法を適用して行なった。正しい配列
を有するクローンを新しい発現構成物ｐＣＧ６１として
使用し、かつそれはＴ７Ａ３プロモータ、ＲＢＳ１配列
及びＴ４ターミネータ配列を含有していた（図８参
照）。

【０１６５】例 ９リシンＡの調製 次にリシンＡを調製する際のプラスミドｐＩＣＩ ００
４２の使用について説明する。リシンＡをコードするＤ
ＮＡ配列を、ｔｒｐプロモータの制御下にプラスミドｐ
ＩＣＩ ００４２中に挿入した。リシンＡのＤＮＡ配列
は、例えばヨーロッパ特許第１４５１１１号、Ｌａｍ
ｂ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１９８５，１４８，２６５−２７０；及びＯ′Ｈ
ａｒｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．，
１９８７，２１６，７３−７８に記載されている。次に
組換えリシンＡを調製するのに使用する有利なベクター
を誘導する際のいくつかの中間工程を説明する。

【０１６６】９．１ 合成オリゴヌクレオチド 合成オリゴヌクレオチドはリシン遺伝子の特異的ＤＮＡ
配列変種（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を導入するために
使用した。次に記載のすべてのオリゴヌクレオチドはア
プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ ＤＮＡ合成装置でＡｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．により提供さ
れたプロトコルにより、５′−ジメトキシトリチル塩基
保護されたヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホラミジット及び０．２μｍｏｌス
ケールでコントロールド・ポア・グラス・サポーツ（ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｓｕｐｐ
ｏｒｔｓ）に結合した保護ヌクレオシドから調製した。

【０１６７】固定サポートからの切断及びすべての保護
基の除去後の各オリゴヌクレオチドを水（１ｍｌ）中に
溶かしかつ２６０ｎｍの吸光度測定により濃度を測定し
た。

【０１６８】９．２ 酵 素 種々の制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素を下
記の操作で使用した。これらは多数の供給元（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ 又は Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の１つから購入
し、反応条件については製造元のプロトコルにより使用
した。

【０１６９】９．３ ｐＩＣＩ発現ベクターの組立て ９．３ ａ） ｐＩＣＩ ００２０ 例５（ｃ）に記載したように、プラスミドベクターｐＩ
ＣＩ ００２０はｐＡＴ１５３をベースとするプラスミ
ドであり、その際に６５１ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ
領域が１６７ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメント
により代えられており、このフラグメントは、 （１） 合成Ｅ．コリｔｒｐプロモータ及びｔｒｐリー
ダーリボソーム結合サイト （２） ほん訳開始コドン （３） ＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，
ＰｓｔＩ，ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのサイトを含有
するＭ１３ｍｐ１８から誘導される多重制限酵素認識配
列 （４） 合成転写終止配列 より成っている。

【０１７０】合成ｔｒｐプロモータ配列を含有するプラ
スミドベクターの組立てについては記載されている（Ｗ
ｉｎｄａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１０，ｐ６６３９−６６５７，１９８２）。プ
ロモータフラグメントは、そのようなベクターから、酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｐａＩで消化しかつ電気溶離により
アガロースゲルからの好適なバンドを精製した後で単離
した（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＳａｍｂｒｏｏｋ，ＣＳＨ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ出版，第２版，１９８９，以下“Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ”と記載する）。

【０１７１】天然ｔｒｐリーダーリボソーム結合サイ
ト、ほん訳開始コドン及び３′ＫｐｎＩクローニングサ
イトを提供する、プロモータフラグメントのＨｐａＩ末
端に連結することになる一組みの相補性合成オリゴヌク
レオチドを生成した。これらのオリゴヌクレオチドを等
モル濃度で混合し、１００℃に加熱してアニーリング
し、次いで徐々に室温に冷却した。

【０１７２】このプロモータフラグメントとアニーリン
グしたオリゴヌクレオチドとを連結しかつ好適なバンド
をポリアクリルアミドゲルから電気溶離により単離し
た。次にこのフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩサイト中
にクローニングしたｔｒｐアテニューエータ配列（合成
オリゴヌクレオチドから生成）を含有しかつ付加的なＣ
ｌａＩ制限サイト３′をアテニューエータに導入するＭ
１３ｍｐ１８ベクター誘導体と連結した。連結したＤＮ
ＡをＣａＣｌ₂法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ
１ｐ８２）によりコンピテントにしたＥ．コリ菌株Ｊ
Ｍ１０９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，ｐ１０３，１９８５）中にトラ
ンスフェクションした。プレートに拡げ、このプレート
を恒温保持した後で、プラークをＢｅｔｏｎ及びＤａｖ
ｉｅｓの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ ４
ｐ４１）により予め単離したＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩプロ
モータフラグメントのニックトランスレーション法によ
り産生した³²Ｐ標識プローブを用いてスクリーニングし
た。１本鎖ＤＮＡを正にハイブリッド形成するプラーク
から標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ ４ｐ
２９） により調製し、かつＭ１３ユニバーサルプライ
マー及び多くのサプライヤーによってキットの形で、例
えばシークエナーゼ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ）で提供されるようなサンガージデオ
キシ連鎖終結法を使って配列決定した。

【０１７３】ＲＦ ＤＮＡは、プロモータ／リボソーム
結合サイト／アテニューエータ配列が確認された１つの
単離物から調製した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＣｌ
ａＩで消化し、好適なフラグメントを前記のようにポリ
アクリルアミドゲルから単離した。プラスミドｐＡＴ１
５３を酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩを用いて消化し、か
つ単離したプロモータフラグメントと連結した。連結し
たＤＮＡはコンピテントなＥ．コリＨＢ１０１（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）を形質転換するために用い、かつアンピシリン耐
性コロニーを選択した。いくつかのクローンからのプラ
スミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列はＥｃｏＲＩとＣｌ
ａＩサイトの間の領域から誘導した。正しいプロモータ
ー／アテニュエーター領域を含有すると確認された１つ
のクローンをｐＩＣＩ００２０と命名した。

【０１７４】この組立て法は図１２に略述した。

【０１７５】９．３ ｂ） ｐＩＣＩ １０７９ 例８（ａ）に記載したように、ｐＩＣＩ １０７９は、
ＥｃｏＲＩ及びＳｔｙｌＩ制限サイトの間に次の要素を
包含するアンピシリン耐性ｐＡＴ１５３誘導プラスミド
である： （ｉ） λファージからのＣＩ８５７遺伝子； （ｉｉ） λＰ_Lプロモータ； （ｉｉｉ） 合成リボソーム結合サイト； （ｉｖ） 合成インターフェロンα₂遺伝子配列； （ｖ） ＳａｌＩ及びＳｔｙＩ制限サイトの間でＴ
４ファージから誘導された合成転写ターミネータ配列。

【０１７６】この転写ターミネータのＤＮＡ配列は図１
（ｂ）に図示されている。

【０１７７】ｐＩＣＩ １０７９は図６に図示されてい
る。

【０１７８】ｐＩＣＩ １０７９はブダペスト条約に基
いてＮＣＩＭＢ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉ
ｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ；２３ Ｓ
ｔ． ＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ａ
Ｂ２，１ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，英国在）に寄託され
た（ＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０３７０，寄託日１９９１年
２月１９日）。

【０１７９】このプラスミドは、リシンＡ発現クローン
ｐＩＣＩ １１８５（下記の９．５ｄ）参照）の生成の
ためのＴ４転写ターミネーターの供給源を提供するため
に用いた。このプラスミドの生成のための出発点は、ｐ
ＩＣＩ １０４３であった。ｐＩＣＩ １０４３はｐＩ
ＣＩ ００２０（前記の９．３ａ）参照）をベースとし
たプラスミドであり、この中で、λＰ_Lプロモーターお
よびインターフェロンα２遺伝子を含有する発現カセッ
ト（Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１１ ｐ６４１９−６４３５，１９８３）はＥｃ
ｏＲＩおよびＳａｌＩサイトの間に存在する。

【０１８０】オリゴヌクレオチドの相補的ペアを、５′
ＳａｌＩおよび３′ＳｐｈＩ付着末端を有するバクテリ
オファージＴ４の遺伝子３２から転写ターミネーターの
生成のために合成した。このフラグメントを、ＳａｌＩ
およびＳｐｈＩで完全に消化されたｐＩＣＩ １０４３
から単離したプラスミドフラグメントと連結した。この
ように製造した中間プラスミド（ｐＩＣＩ １０７８）
は、Ｔ４ターミネーターおよびｔｒｐアテニュエーター
配列を縦に並んで含有した。

【０１８１】相補的オリゴヌクレオチドの第２のペア
は、次に、ｔｒｐアテニュエーター配列（およびテトラ
サイクリン耐性遺伝子の残りの部分）を、ｐＩＣＩ１０
７８のＳｐｈＩおよびＳｔｙＩサイトの間へ挿入により
置き換えるために使用した。ユニークなＢａｍＨＩサイ
トを、この合成フラグメント内に導入した。

【０１８２】この操作を、図１３に概略した。

【０１８３】９．４ リシンＡ発現クローンの生成 ９．４ ａ） ｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡの製造 リシンＡをコードするＤＮＡを含有するクローン（ｐＵ
Ｃ８ＲＡ）を生成した。このクローンは、プラスミドｐ
ＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．Ｇｅｎｅ，１９，ｐ２５９，１９８２）中に公開さ
れたｃＤＮＡ配列（Ｌａｍｂ，Ｉ．Ｆ．，Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ，１９８５，１４８，ｐ２６５−２７９）に従
って、リーダー配列中の塩基番号−７４からＢ−鎖内
（塩基番号８５７）でＢａｍＨＩサイトまでＡ鎖ｃＤＮ
Ａを含有する。さらに、部位突然変異を、成熟リシンＡ
の最終コドンに対して３′付近のほん訳終結コドンを生
成するために用いた（Ｏ′Ｈａｒｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ，１９８７，２１６，ｐ７３−７
８に報告）。全Ａ鎖コーディング領域はこのクローンか
らのＢａｍＨＩフラグメントに含まれる。

【０１８４】少量のｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡは、
創作者から得られた。後の保存のために、このＤＮＡの
希釈液を、Ｅ．コリＤＨ５αコンピテント細胞（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）中に形質転換するために使用し、アンピシリン耐
性形質転換体を選択した。このクローンからのプラスミ
ドＤＮＡは変更Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ １ｐ２５）により調製し
た。このＤＮＡのサンプルは、ＢａｍＨＩおよびＢａｎ
Ｉを用いて別々に消化し、アガロースゲル上で電気泳動
の後に、ＤＮＡのオリジナルサンプルの相応する消化物
と比較した。制限パターンにおける差異は観察されず、
これに基づき２つのＤＮＡサンプルは同一と断定され
た。

【０１８５】９．４ ｂ） Ｍ１３へのサブクローニン
グ ｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物およ
びファージＭ１３菌株Ｋ１９（Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からのＲＦ（複製型）ＤＮＡ
を、標準の条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ
１ｐ６８）を用いてショットガン連結した。対照連結も
実施した。これらの連結したＤＮＡは、ＣａＣｌ₂法
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ １ｐ８２）によ
りコンピテントにしたＥ．コリ菌株ＴＧ１（Ｇｉｂｓｏ
ｎ，１９８４／Ａｎｇｌｉａｎ）を形質転換するために
用いた。

【０１８６】有効連結および組み換えファージを表わす
形質転換率は子孫に現われた。組み換えファージは、ｌ
ａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の分解のためＩ
ＰＴＧ＋Ｘ−ｇａｌ（ＢＲＬ）含有プレート上に透明プ
ラークを生じることが予想させた。野生型ファージは、
βガラクトシダーゼによるＸ−ｇａｌの転換のため青色
プラークを生じる。

【０１８７】いくつかの透明プラークを一本鎖ＤＮＡの
調製のために取った。溶菌したファージ懸濁液の直接ゲ
ル電気泳動は、１つのファージクローンが、リシンＡ鎖
コーディング配列を配列決定により確認されたかなりの
大きさの挿入物を含有することを示した。成熟リシンＡ
コーディング配列の１８２塩基だけが確認されたが、こ
れは完全リシンＡ遺伝子の存在に対する十分な形跡とし
て受け取られた。このクローンはＭ１３Ｋ１９ＲＡと命
名した。

【０１８８】９．４ ｃ） Ｍ１３Ｋ１９ＲＡの突然変
異誘発 成熟リシンＡの開始部でｐＩＣＩ発現ベクターと相容な
ＫｐｎＩサイトの生成のために、次の変化（アンダーラ
インで示した）が必要である：

【０１８９】

【化４】

【０１９０】を

【０１９１】

【化５】

【０１９２】に変化させ、ＫｐｎＩサイトをオーバーラ
ップするＡＴＧコドンが生じる。リシンＡを含有するＫ
ｐｎＩフラグメントは、突然変異体から切断し、一連の
ＩＣＩ発現ベクター中に挿入することができる。２つの
Ｎ末端アミノ酸修飾が行なわれた（ｉｌｅ−ｐｈｅから
ｍｅｔ−ｖａｌ）。

【０１９３】Ｍ１３Ｋ１９ＲＡから製造した一本鎖ＤＮ
Ａは、それぞれの突然変異戦略のための突然変異誘発工
程の鋳型である。この戦略のための突然変異の全ての変
化を誘導する単一のオリゴヌクレオチド（ＤＴＲ１６）
が合成された。

【０１９４】

【化６】

【０１９５】いくつかのプロトコルが、部位突然変異に
よる特異的ＤＮＡ配列変化の導入のために存在する。以
下に概略したこれらのプロトコルは、キットの形（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で提供さ
れているような、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ． ａｌ（Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１９８５，１３ ｐ８７４
９−８７６４および１９８６，１４，ｐ９６７９−９６
９８）の方法を用いて達成され、その製造手引書に従っ
て使用した。

【０１９６】この方法の原則は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を突
然変異オリゴヌクレオチドで開始し、ｄＡＴＰの代わり
にｄＡＴＰαＳを組み込んだ相補的鎖を合成することで
ある。このヌクレオチドの使用は、ホスホロチオエート
結合の形成を生じさせ、この結合は特定の制限酵素（た
とえばＮｃｉＩ）により切断されない。第２の鎖の合成
の後に、ＮｉｃＩは親鎖の切断のために用い、エキソヌ
クレアーゼＩＩＩを突然変異点を過ぎて後方を消化させ
るために添加した。ＤＮＡポリメラーゼＩは親鎖を再合
成させる。結果として、この突然変異オリゴヌクレオチ
ドは再合成の鋳型として行動し、この突然変異は、形質
転換する前に双方の鎖に導入される。全子孫の９６％ま
での突然変異率が要求され、スクリーニングはＤＮＡ配
列分析のためランダムでプラークのピッキングにより簡
単に行なった。

【０１９７】ここでの実験において、４つのプラークの
中の４つが正確に突然変異を起こしていた。１つの突然
変異体（ＭＲＡ１６）を選択してから、ＲＦ ＤＮＡを
調製し、かつ新たに生成した制限フラグメント、たとえ
ばＫｐｎＩの存在について確認した。

【０１９８】９．４ ｄ） クローニング、発現および
最初の特性表示 発現ベクター（セクション５参照）の一連のｐＩＣＩ
は、Ｔｒｐプロモーターに隣接したユニークＫｐｎＩ制
限サイト中にクローンされたＤＮＡフラグメントを受け
入れることができる。ＫｐｎＩサイトは翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）をオーバーラップし、このコドンはこのプロ
モーターのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏサイト（ＡＧ
ＧＡ）から８ｂｐ下流に位置している。

【０１９９】ＭＲＡ１６の配列の確認の後、大規模の
（−５μｇ ＲＦ ＤＮＡ）ＫｐｎＩ消化を行ない、か
つ関連するリシンＡコーディングＤＮＡフラグメント
を、製造元手引書に従って、アガロースゲル（Ｎｕ−Ｓ
ｉｅｖｅ ＧＴＧ アガロース、ＦＭＣ Ｂｉｏ−生成
物）から、切除したゲルスライスのフェノール抽出によ
り単離した。

【０２００】ｐＩＣＩ ００２０（９．３ａ参照）は、
ＫｐｎＩで消化し、次に、子牛腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ（ＣＩＰ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）を用いて脱ホスホリルした。後の処理は、連結の際
のベクターの再環化を防ぎ、これは形質転換子孫中の親
の高い割合を導く。

【０２０１】連結は、多様な戦略のために、８：１（ｗ
／ｗ）〜１：３のプラスミドベクター対単離したフラグ
メントの割合で始めた。ホスファターゼ処理、リガーゼ
活性等の効果を試験するための対照連結を包含した。こ
の連結条件は、使用したＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ 又は Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）の供給源にとって適当であった。反応物は一般に
１５℃で一晩恒温保持した。

【０２０２】それぞれの連結（５μｌ）反応物の５０％
を１００μｌまで１×ＴＮＥ（トリス５０ｍＭ、ＮａＣ
ｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ）で希釈し、コンピテ
ントＥ．コリＤＳ４１０ ２００μｌを添加した。標準
の形質転換手引書（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ
１ｐ７４）に従って、細胞を、ストレプトマイシン
（２５μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ）を添加したＬ寒天上に拡げ、３７℃で一晩中、恒
温保持した。Ｅ．コリＤＳ４１０は染色体ストレプトマ
イシン耐性遺伝子を有している。

【０２０３】形質転換プレートを恒温保持の後に試験し
た。一般に、リガーゼなしの対照と比較して５〜１０倍
のコロニーが、連結において観察された。これらのいく
つかの場合、リガーゼの存在または不在で産生されるク
ローンの数においてわずかな差異が生じ、これはベクタ
ーの不完全な消化または乏しいリガーゼ活性を示す。

【０２０４】形質転換体、さらに関連する対照を、ハイ
ブリッド形成スクリーニングのためのＬ寒天プレート上
に置いたニトロセルロースフィルターに採った（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ １ｐ９８に記載されたよ
うに、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの方法
を基礎とする）。恒温保持の後、コロニーを１０％ＳＤ
Ｓおよび１Ｍ ＮａＯＨを用いてその場で溶菌し、１Ｍ
トリス（ｐＨ７．５）を用いて中和し、真空中、８０℃
で２時間乾燥した。

【０２０５】ハイブリダイゼーションプローブを、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、突然変異オリゴヌ
クレオチドの³²Ｐ標識により生成した。このフィルター
は、室温で試験し、次いで、段階的に５５〜６５℃まで
で洗浄し、オートラジオグラフィーの前に、非特異的結
合カウントを除去した。特異的ハイブリダイゼーション
は推定のリシンＡ ＤＮＡ含有クローンを示した。

【０２０６】小規模ＤＮＡ調製物（Ｍａｎｉａｔｉｓ，
ｃｈａｐｔｅｒ １ｐ２５に特徴付けられたように、Ｈ
ｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙまたはＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ−Ｄｏｌｙの方法による）はポジティブにハイブリッ
ド形成するクローンから作った。このＤＮＡは、関連す
る制限酵素、たとえばＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ／Ｂｇ
ｌＩＩＩを用いて消化し、アガロースゲル上での電気泳
動により分析した。ベクターＤＮＡおよび突然変異ＲＦ
ＤＮＡを、同じ酵素により切断して、正確なクローン
について予想されるフラグメントサイズを立証した。

【０２０７】それぞれのクローンの大規模プラスミドＤ
ＮＡ調製物（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ）は、より詳
細な制限分析、たとえばＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩおよびＳ
ｃａＩに使用した。アガロースゲル上で、これらの消化
物は挿入されたフラグメントのサイズ、この配向の表
示、およびいくつかのユニークなリシンＡ−鎖酵素サイ
トの獲得を示した。

【０２０８】９．４ ｅ） 発現試験 ハイブリダイゼーションおよび制限スクリーニングによ
り明確に同定したこれらのクローンを、全細胞溶菌物の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりリシンＡの発現について試
験した。発現試験のための標準条件は次の通りであっ
た： １） Ｌ−ブイヨン＋抗生物質１０ｍｌに単一コロニー
を接種し、温和に振盪させながら一晩３７℃で生長させ
た。

【０２０９】２） 一晩で、Ｌ−ブイヨン７５０μｌを
取り、マイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で、
（６５００ｒｐｍで１分）細胞をペレット化した。

【０２１０】３） ペレットをＭ９培養基（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，ａｐｐｅｎｄｉｘ Ａ．３）３００μｌ＋０．
０２％のカゼイン水解物＋０．２％グルコース＋チアミ
ン５０μｇ／ｍｌに再懸濁させ、かつそれと同じもの１
０ｍｌ中へ接種した。

【０２１１】４） 温和に振盪させながら７時間または
一晩３７℃で恒温保持した。

【０２１２】５） 恒温保持の後、ＯＤ₅₄₀を測定し、
セルをペレット化し、ＯＤ₅₄₀＝１０／ｍｌまで、Ｌｅ
ａｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔ
ｅｒ １８ｐ５３）中に再懸濁させた。１５分間煮沸し
た。

【０２１３】６） 全細胞溶菌物２０μｌをＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル上に移し、電気泳動し、クーマシー
ブルーで染色し、脱色し、可視化した。

【０２１４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調査したクローン
の中の一つだけは、〜２９ＫＤの当分子量を有する付加
的バンドを示した（グリコシル化されていない成熟リシ
ンＡに対して評価されたものと同じ）。ゲル走査は、全
細胞タンパク質の５〜１０％の発現レベルを示した。こ
のクローンはｐＩＣＩ １１０２と命名した。

【０２１５】ｐＩＣＩ １１０２の組み立ては図１４に
概略した。発現試験の結果は図１５および図１６に示し
た。

【０２１６】９．４ ｆ） 組換えリシンＡのウエスタ
ントランスファーおよび免疫検出 まず、ＳＤＳ−ポリアクリレートアミドゲルのクーマシ
ーブルー染色により観察した組換えリシンＡ鎖タンパク
質は、ウエスタンブロットにより追認した。タンパク質
バンドをニトロセルロースフィルターに移し、リシンＡ
に特異的な抗体、引き続きペルオキシダーゼにより標識
したアンチグロブリンを用いて検出した。

【０２１７】１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、８ｍＡで
一晩経過させ、少なくとも３０分間トランスファー緩衝
液中で平衡化させた。

【０２１８】次に、ゲル上のタンパク質バンドを、Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ ＴｒａｎｓＢｌｏｔ装置中、７０Ｖで３時
間電気泳動により、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ
−Ｃ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。このフィルター
は、乾燥した後、封止プラスチックバック中、−２０℃
で貯蔵することができた。

【０２１９】リシンＡ．１は、ウサギ中で、リシンＡの
合成ペプチドフラグメントに対して生成したポリクロナ
ール抗体であった。予備試験ではリシンＡに対して良好
な親和性を示したが、多数のＥ．ｃｏｌｉタンパク質と
の著しい交叉反応性を示した。この交叉反応性により引
き起こされる高いバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕ
ｎｄ）を克服するため、抗体をＥ．コリ溶菌物と予め恒
温保持した。

【０２２０】このように、Ｅ．コリ菌株ＤＳ４１０のＬ
−ブイヨンオーバーナイト培地１０ｍｌを、４０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離して、細胞をペレット化した。
このペレットを細菌緩衝液５ｍｌに再懸濁させ、かつ４
〜６μを、氷上で３０秒間の冷却間隔で、６×１０秒間
バーストで音波処理した。

【０２２１】次に、音波処理物０．５ｍｌをリシンＡ．
１抗血清０．５ｍｌと混合し、室温で９０分間恒温保持
した。細胞の残骸は５分間１３０００ｒｐｍで降下さ
せ、かつ上澄みを−２０℃で貯蔵した。

【０２２２】ウエスタントランスファーからのニトロセ
ルロースフィルターは、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン
中、室温で一晩恒温保持することによりブロックした
（ＰＢＳ ツイーン＝ＰＢＳ１リットルあたりツイーン
２０ ５ｍｌ）。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄
した。０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン中のブロック
されたリシンＡ．１抗体の１／４０００希釈液を用い
て、室温で２時間（または一晩）恒温保持した。ＰＢＳ
／ツイーン中で３×３分間洗浄した。０．５％ＢＳＡ−
ＰＢＳ／ツイーン中のヤギ−抗−ウサギ抗血清の１／１
０００希釈液を用いて１時間恒温保持した。ＰＢＳ／ツ
イーン中で３×３分間洗浄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ／ツイーン中のウサギペルオキシダーゼ−抗−ペルオ
キシダーゼ抗血清の１／５０００希釈液と共に、室温で
１時間恒温保持した。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間
洗浄した。ＰＢＳで１２０ｍｌにし、かつ過酸化水素１
２μｌを含有するメタノール２０ｍｌ中の４−クロロナ
フトール（６０ｍｇ）の溶液中に浸漬することにより展
開し、バンドが可視化したらすぐにこの膜を溶液から除
去し、乾燥し、撮影した。

【０２２３】典型的なウエスタンブロット分析を図１７
に示した。

【０２２４】９．４ ｇ） 組換えリシンＡタンパク質
の生物学的アッセイ この目的は、リシンＡ鎖を精製する際にＥ．コリ細胞か
ら産生する試料を、細胞を含まない試験管内タンパク質
合成アッセイにおいて生物学的活性について試験するこ
とのできる条件を確定することであった。

【０２２５】ウサギの網状赤血球リゼートを、Ａｌｌｅ
ｎおよびＳｃｈｗｅｅｔ［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１
９６２），２３７，７６０−７６７］の方法により調製
した。このアッセイは、細胞を含まない系におけるタン
パク質合成の阻害を、新たに合成されたタンパク質中へ
の¹⁴Ｃ標識ロイシンの組み込みの欠乏により示す。

【０２２６】９．４ ｇ．ｉ） アッセイプロトコル 貯蔵溶液：１ｍＭアミノ酸混合物−ロイシン。ロイシン
を除く全てのＬ−アミノ酸を１ｍＭで含有する溶液（Ｎ
ａＯＨでｐＨ７．４に調節し、−７０℃で貯蔵）。

【０２２７】溶液Ａ 酢酸マグネシウム ４０ｍＭ 酢酸アンモニウム ２Ｍ トリス ０．２Ｍ （ＨＣｌでｐＨ７．４、４℃で貯蔵） 溶液Ｂ ＡＴＰ（シグマ Ａ５３９４） ２４６ｍｇ／ｍｌ ＧＴＰ（シグマ Ｇ８７５２） ２４．４ｍｇ／ｍｌ アッセイ混合物：アミノ酸混合物 １ｍｌ 溶液Ａ １ｍｌ 溶液Ｂ ０．１ｍｌ クレアチンホスフェート １０３ｍｇ クレアチンキナーゼ １ｍｇ Ｈ₂Ｏ ５１０μｌ Ｌ−¹⁴Ｃ−ロイシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃ
ｌｅａｒ，ＮＥＣ−２７９Ｅ） ６００μｌ（６０
μＣｉ） 反応混合物：テストサンプル ２５μｌ アッセイ混合物 １２．５μｌ ウサギ網状赤血球リゼート ２５μｌ ブランク溶液はＰＢＳ中のＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌであっ
た。

【０２２８】全てのアッセイは２重で行なった。

【０２２９】アッセイ混合物１２．５μｌを無菌ガラス
管に置いた。ブランクのために最初の４つのそれぞれの
管にＰＢＳ中のＢＳＡ ２５μｌを添加した。テストサ
ンプル２５μｌを残りの試験管に添加した。０．１Ｍ
ＫＯＨ １ｍｌを最初の２つの試験管に添加した（バッ
クグラウンドブランク）。この試験管を水浴中で２８℃
に平衡化した。ウサギ網状赤血球リゼート（液体窒素温
度から溶かした）２５μｌを、２０秒間隔でそれぞれの
試験管に添加した。最初の試験管を１２分間恒温保持し
た際に、０．１Ｍ ＫＯＨ １ｍｌを、再び２０秒間隔
でそれぞれの試験管に添加し、全ての試験管を１２分間
恒温保持させた。２０％過酸化水素２滴をそれぞれの試
験管に添加し、引き続き２０％ＴＣＡ１ｍｌを添加し
た。試験管内容物を混合し、少なくとも１時間、または
一晩４℃で放置した。沈殿物を、２．５ｃｍのＧＦＣデ
ィスクに対して濾過し、５％ＴＣＡ３×４ｍｌで洗浄
し、シンチレーションバイアルに移し、シンチラント
（Ｒｅａｄｙ−Ｓｏｌｖ．ＭＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ）１０
ｍｌを添加した。１時間後にこのバイアルを振盪し、計
測した。

【０２３０】９．４ ｇ．ｉｉ） Ｅ．コリリゼートを
用いるための技術の確立 Ｌ−ブイヨン一晩培養液１０ｍｌを３７℃で生長させ
た。アリコート４００μｌを１３０００ｒｐｍで３０秒
間ペレット化し、上澄み液の大半をデカントした。この
ペレットに、ドライアイス／ＥｔＯＨ中での急速冷凍、
引き続き３７℃で解凍を２回行なった。５０ｍＭトリス
ＨＣｌ ｐＨ８．０中の２５％スクロース１２μｌを添
加し、引き続きリゾチームの１０ｍｇ／ｍｌ溶液４μｌ
を添加した。１５分間氷上で恒温保持した後、０．２５
Ｍ ＥＤＴＡ ８μｌを添加し、１５分間恒温保持を続
けた。サンプルを水で４００μｌに希釈することによ
り、浸透圧により溶菌を起こさせた。この方法は１ｍｌ
あたり８０〜１００の生存細胞数を製造した。

【０２３１】このリゼートのアリコート２５μｌをアッ
セイ反応混合物に添加すると、新たに合成されたタンパ
ク質への¹⁴Ｃ−ロイシンの組み込み率は、リゼートを含
まないブランクの〜１０％であった。これは、リシンＡ
８ｎｇ／ｍｌにより製造されたものと同様の阻害率であ
った。次にＥ．コリリゼートの希釈物を調製し、このア
ッセイを繰り返した。この結果は、リゼートの効果をブ
ランクのものと等しくなるまで減少させるためには最低
１６倍の希釈が必要であったことを明らかに示した。

【０２３２】Ｅ．コリの溶菌およびＥ．コリリゼートが
リシンＡ毒性に影響を及ぼさないことを可能なかぎり確
実にするため、２つの対照アッセイを行なった。最初
は、植物由来のリシンＡを、１６倍希釈Ｅ．コリ細胞ペ
レットに添加し、細胞溶菌後のアッセイ混合物中の８ｎ
ｇ／ｍｌの最終濃度にした。双方のこの対照は、リシン
Ａの阻害活性に関してリゼートまたは溶菌法からの有害
な影響を示さなかった。これらの技術は、生化学的に活
性な、ｐＩＣＩ １１０２からの組換えリシンＡおよび
次に記載するクローンの合成を確認するために用いた。

【０２３３】９．４ ｈ） ＤＮＡ配列分析 プラスミドＤＮＡ配列決定は、ｐＩＣＩ １１０２の分
析のために用いた。選択したプロトコルはＺａｇｕｒｓ
ｋｙ ｅｔ，ａｌ（Ｇｅｎｅ ＡｎａｌｙｓｉｓＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ ２，Ｎｏ．５）を変更し、プ
ライマーのアニーリングの前の２本鎖プラスミドＤＮＡ
のアルカリ性変性およびいくつかの製造元からキットの
形（たとえばシーケナーゼ：Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で提供されるような標準的
方法による配列決定を包含する。β−ラクタマーゼの
３′末端で開始するためのオリゴヌクレオチドおよびい
くつかのＡ鎖中間プライマーを使用する際に、プロモー
ターおよびリシンＡ遺伝子の双方の鎖の配列決定が可能
であった。

【０２３４】この最初の配列決定データは、付加的Ｋｐ
ｎＩフラグメントがプロモータとリシンＡをコードする
配列との間に存在するという意想外の結果を示した。す
なわち、

【０２３５】

【化７】

【０２３６】付加的ＫｐｎＩフラグメントは、Ｍ１３Ｋ
１９ＲＡから得られ、制限酵素サイトに加えてｐＵＣ８
ＲＡからクローンしたリシンリーダー配列部分を含む。
リシンＡ鎖の５′領域は突然変異誘発の間に誘導される
塩基変化を含む。

【０２３７】この配列の試験は、最初の翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）がリシンＡをコードする領域と共に枠外にあ
ることを表わす。さらに、リシンＡ開始コドンおよび、
第２のＡＴＧから翻訳を再開始することができる推定Ｓ
ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（ＡＧＧＡ）の前に、
枠内終止コドン（ＴＡＧ）が存在する。

【０２３８】その後の試験で、Ｅ．コリ中のリシンＡ鎖
の蓄積レベルに関して、この付加的ＤＮＡフラグメント
が、これを除去したクローンと比較して明らかな利点を
与えることを表わし、予想外であった。

【０２３９】ｐＩＣＩ １１０２に含まれるリシンＡ遺
伝子の完全ＤＮＡ配列は図１８に示した。

【０２４０】９．５ 引き続くリシンＡ発現クローンの
産生 ９．５ ａ） サブクローニングさせるためのリシンＡ
クローンｐＩＣＩ １１０２の突然変異 リシンＡ発現のために正しい方向で、偶発的に生成した
ｐＩＣＩ １１２０から２つのＫｐｎＩフラグメントを
サブクローンすることは困難である。従って、単一塩基
置換（ＡからＴ）により、内部ＫｐｎＩ認識サイトを変
更することを計画した。これは、このサイトでのＫｐｎ
Ｉ切断を妨げ、単一のＫｐｎＩフラグメントをｔｒｐ／
ＲＢＳベクターの領域中にサブクローニングさせる。

【０２４１】ＫｐｎＩ認識サイト（ＧＧＴＡＣＣ）のア
デニンを、チミン（即ちＧＧＴＴＣＣ）に置換すること
により、リシンＡの最初の残基は変化しない（ＧＴＡ／
ＧＴＴ＝Ｖａｌ）。即ち、

【０２４２】

【化８】

【０２４３】を

【０２４４】

【化９】

【０２４５】に変化させる。

【０２４６】この変化を起させるために合成したオリゴ
ヌクレオチドは、次の配列を有し、アンダーラインで示
した塩基は突然変異的変化を表わす。

【０２４７】 ５′ ＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＡＴＡＣ ３′ 比較による発現試験のために、突然変異させたリシンＡ
フラグメントをｔｒｐ発現ベクターの領域中にクローン
することを計画した。ｐＩＣＩ ００２０へのクローニ
ングをｐＩＣＩ １１０２と比較して、唯一の塩基置換
が行なわれた場合に、それが発現に及ぼす効果を測定す
るためである。

【０２４８】９．５ ｂ） 突然変異誘発 突然変異誘発のための鋳型はＭＲＡ１６であり、これは
ｐＩＣＩ １１０２中に存在する２つのＫｐｎＩフラグ
メントを含むＭ１３クローンである。突然変異誘発の後
に、所望の突然変異を有する単離体は、ランダムサンプ
リングおよび突然変異オリゴヌクレオチドが特異的に結
合する領域にわたるＤＮＡ配列測定により同定した。

【０２４９】１つの突然変異した鋳型は、ＭＲＡ２２と
命名した。さらに、非特異的突然変異の不在の確認のた
めに、リシンＡをコードする全配列をＤＮＡ配列決定す
ることにより分析した。

【０２５０】９．５ ｃ） サブクローニング 突然変異した一本鎖ＤＮＡを、単一プラークを製造する
ためコンピテントＥ．コリＴＧ１細胞を形質転換するの
に用いた。次に、個々のプラークを採り、複製型（Ｒ
Ｆ、二本鎖）ＤＮＡを、塩化セシウム／エチジウムブロ
ミド浮遊密度勾配でバンド形成させて精製した。精製し
たＲＦ ＤＮＡはＫｐｎＩにより完全に消化させた。ク
ローニングは、消化させたＲＦ ＤＮＡを切断した好適
なＫｐｎＩおよびホスファターゼ処理した発現ベクター
とショットガン連結することにより、またはリシンＡを
アガロースゲルからのその精製後に特異的に連結させる
ことにより行なった。連結したＤＮＡをＥ．コリＴＧ１
またはＨＢ１０１へ形質転換した。

【０２５１】リシンＡを含有するクローンは、他のリシ
ンＡを含有するクローン（ｐＩＣＩ１１２１）から単離
したＫｐｎＩフラグメントのランダムヘキサヌクレオチ
ドプライミングにより製造した³²Ｐ標識リシンＡプロー
ブを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングによ
り同定した。正のハイブリダイゼーションを示すコロニ
ーは、さらにＫｐｎＩ単一消化およびＥｃｏＲＩ／Ｂｇ
ｌＩＩ二重消化を用いるプラスミドＤＮＡの制限分析に
よりスクリーニングした。ＫｐｎＩは挿入されたフラグ
メントのサイズを同定し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩはフ
ラグメントの配向を決定する。

【０２５２】発現に関して正しい配向でリシンＡフラグ
メントを有していると確認されたクローンは、クローン
選択成長およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析、引き続き
クーマシーブルー染色および複製ゲルのウエスタンブロ
ッティングにもたらした。これらのクローン中のリシン
Ａ蓄積のレベルは、ｐＩＣＩ １１０２から検出したも
のと同様であった。

【０２５３】１つの単離物を選択し、ｐＩＣＩ １１３
１と命名した。

【０２５４】９．５ ｄ） 択一的(ａｌｔ ｅｒｎａｔ
ｉｖｅ)転写ターミネータ要素の使用 この実験では、ｐＩＣＩ １１３１からのｔｒｐプロモ
ータ及びリシンＡフラグメントを酵素ＥｃｏＲＩ及びＳ
ａｌＩで消化させることにより除去した。後者の酵素は
リシンＡをコードする配列の３′末端とｔｒｐ転写ター
ミネータとの間を切断する。生成フラグメントをアガロ
ースゲル（２％Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧＡｇａｒｏｓ
ｅ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）から除去し、か
つフェノール及びクロロホルム抽出により精製し、次に
エタノール沈殿させた。精製フラグメントをＥｃｏＲＩ
及びＳａｌＩにより切断したｐＩＣＩ １０７９と連結
した。この後者のプラスミドはユニークなＳａｌＩサイ
トとＳｐｈＩサイトとの間にＴ４ターミネータを含有す
る。

【０２５５】連結したＤＮＡは、コンピテントＥ．コリ
ＨＢ１０１（ＢＲＬ）を形質転換するために用い、かつ
先の実験においてと同様に、リシンＡ ＤＮＡの存在を
検出するためにハイブリダイゼーションスクリーニング
を用いた。正にハイブリッド形成するクローンはプラス
ミドＤＮＡ調製のために選択し、引き続いて適当なサイ
ズのフラグメントの存在を確認するために、ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩを用いて制限分析を行なった。

【０２５６】正しい組み立てを有する単離物を同定し、
ｐＩＣＩ １１８５と命名した。

【０２５７】９．５ ｅ） 世代誘導テトラサイクリン
選択ベクター プラスミドＤＮＡをｐＩＣＩ １１８５から調製し、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いて消化してｔｒｐプロモ
ータ／ＲＢＳ１／リシンＡ（ＭＲＡ２２）フラグメント
／Ｔ４ターミネータを有する発現カセットを除去した。
このフラグメントを、９．４ｄ）に概略した方法により
単離し、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにより切断したｐＩ
ＣＩ ００４２と連結した。

【０２５８】連結したＤＮＡは、Ｅ．コリＨＢ１０１を
形質転換するために用いた。ＨＢ１０１形質転換物を、
Ｌ寒天＋テトラサイクリン上に拡げ、３７℃で一晩恒温
保持し、コロニーを³²Ｐ標識リシンＡ ＤＮＡプローブ
を用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニング
した。

【０２５９】両方の場合において、正に同定されたコロ
ニーを、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩ／Ｂｇ
ｌＩＩ消化を用いるプラスミドＤＮＡの制限分析により
確認した。３つの単離物は同定され、即ちｐＩＣＩ １
１８７．１−３であった。

【０２６０】図１９にｐＩＣＩ １１８５及びｐＩＣＩ
１１８７の組立ては略示されている。

【０２６１】９．５ ｆ） クローン選択 単離したクローンをＥ．コリ７１．１８を形質転換する
のに使用し、かつ単一コロニーをクローン選択試験用に
採取した。生成する全細胞リゼートを複製ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル上で電気泳動させ、その１つをクーマシーブル
ーで染色しかつ他のものはウエスタンブロット分析に使
用した。

【０２６２】染色したゲルは、Ｅ．コリ７１．１８から
同時移動する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｎｇ）タンパク質
が存在するためにリシンＡ発現に関して最少のデータを
提供した。ウエスタンブロット分析ではリシンＡ発現が
正及び負の対照サンプルに比べて明確に認められた。１
つの単離体を下記の発酵に使用した。

【０２６３】リシンＡ鎖の発酵 プラスミドｐＩＣＩ １１８７をＥ．コリ菌株ＭＳＤ６
８中に形質転換し、生成した組換え体（ＭＳＤ１０５
１）を精製しかつグリセロールストックに−８０℃に維
持した。

【０２６４】培地のアリコートを取りかつＬ−テトラサ
イクリンの寒天プレート上にストリークし、３７℃で一
晩生長させて単一コロニーを分離させた。ＭＳＤ１０５
１の単一コロニーを取り、かつＬ−テトラサイクリンブ
イヨン１０ｍｌ中に再懸濁し、かつ直ちに１００μｌを
Ｌ−テトラサイクリンブイヨン７５ｍｌを含有する２５
０ｍｌ−三角フラスコ１０個にそれぞれ接種した。往復
振盪機上で１６時間３７℃で生長させた後でフラスコの
内容物をプールし、かつ変性ＬＣＭ５０生長培地２０ｌ
を含有する発酵槽に接種するのに使用した。

【０２６５】変性ＬＣＭ５０の組成 蒸留水から調製 ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ３．０ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６．０ ＮａＣｌ ０．５ カゼイン水解物（Ｏｘｏｉｄ Ｌ４１） ２．０ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０．００ イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ） ２０．００ グリセロール ３５．００ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．０３ チアミン ０．００８ ＦｅＳＯ₄／クエン酸 ０．９４／０．０２ 微量元素溶液（ＴＥＳ） ０．５ｍｌ 次に発酵を温度３７℃及び６Ｍ水酸化ナトリウム溶液の
自動添加により調節されるｐＨ６．７で実施した。溶解
酸素張力（ｄＯＴ）セットポイントは５０％空気飽和度
であり、かつ発酵槽撹拌速度の自動調整により調節し
た。初め１容量／容量／分（ＶＶＭ）に相当する２０ｌ
／分の発酵槽への空気流を発酵槽の撹拌速度がその最大
値の８０〜９０％に達したら４５ｌ／分に高めた。

【０２６６】発酵の間、光学密度（ＯＤ₅₅₀）、細胞乾
燥重量、細胞中のリシンＡ鎖の蓄積を測定するためにサ
ンプルを取った。リシンＡ鎖蓄積は、公知のように、試
料採取した細菌の全ての細胞リゼートのクーマシーブル
ー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査することにより測定
した。

【０２６７】接種して４ １／２時間後、イーストエキ
ス（Ｄｉｆｃｏ）溶液（２２５ｇ／ｌ）を１．７ｇ／ｌ
／ｈで発酵槽中にポンプ装入した。

【０２６８】１２時間後にＯＤ₅₅₀が約５０に達しかつ
発酵が酸素限界になる前に、細菌をＳｏｒｖａｌ ＲＣ
３Ｂ遠心分離機で収集し（７００ｇ、３０分間、４
℃）、かつ蓄積したタンパク質を細菌から回収した。

【０２６９】注：Ｅ．コリＤＳ４１０（本明細書ではＭ
ＳＤ６８とも表わす）は十分に知られており（Ｄｏｕｇ
ａｎ及びＳｈｅｒｒａｔｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５
１，ｐ１５１−１６０，１９７７）かつ遺伝子型Ｆ^-
ａｒａ ａｚｉ ｔｏｎＡ ｌａｃＹ ｍｉｎＡ ｍｉ
ｎＢ ｒｐｓＬ ｍａｌＡ ｘｙｌ ｍｔｌ ｔｈｉを
有する。この菌株は自由に得られ、かつブダペスト条約
に基いて１９８５年６月７日に本出願人により寄託され
た（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ＆ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ Ｌｔｄ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎ
ｄ；寄託番号１２１００）。

【０２７０】細胞を発酵ブイヨンから捕集した（ｃｏｎ
ｔｉｎｕｏｎｓ ｄｉｓｃ ｓｔａｃｋ ｉｎｔｅｒｍ
ｉｔｔｅｎｔ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｓｅｐａｒａｔｏ
ｒを使う）。このブイヨン（２５ｌ発酵２回から５０
ｌ）を初めに発酵槽から５０ｌトランドルタンクに移
し、かつ前記セパレータとホモゲナイザーに連結してい
る多数の保持タンクより成るコンテナー系に輸送した。

【０２７１】トランドルタンクをこの系に連結し、かつ
ブイヨンを遠心分離機を通して流速４０ｌ／ｈでポンプ
供給した、排出速度は、遠心上澄みが上澄み排出線の眼
鏡視覚検査により澄明であるように調節した。上澄みは
廃棄する前に０．１Ｍ水酸化ナトリウム衛生化溶液２０
ｌを含有する殺滅タンク中に捕集した。細胞を緩衝液Ａ
（５０ｍＭオルトリン酸二水素ナトリウム、２５ｍＭエ
チレンジアミンテトラ酢酸、５ｍＭベンズアミジン、２
ｍＭジチオトレイトール、５Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ
６．３）４０ｌ中に再懸濁し、かつ固体受容器中で８℃
に前冷却した。その後、懸濁した細胞を操作圧６００バ
ールに調整したホモゲナイザーを介してトランドルタン
クに戻した。生成した均質物（６０ｌ）を＜２０℃に冷
却し、かつポリテネミン（ｐｏｌｙｔｈｅｎｅｍｉｎ
ｅ）について１０％（ｖ／ｖ）溶液２．５ｌの添加によ
り０．５％にした。懸濁液を遠心分離機を介して保持タ
ンクに移す前に１０分間凝集させた。その後で、澄明な
上澄みを深部濾過器（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）及び
正負荷の０．２μ膜濾過器を通して精製することにより
滅菌した。

【０２７２】滅菌澄明上澄みを１２ｌの容量に濃縮し
（ａｓｐｉｒａｌ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｃｒｏｓｓ
ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅを使
用）、かつ溶液を固体硫酸アンモニウム結晶２．９ｋｇ
の添加により４０％飽和度にした。溶液を１５℃で一晩
緩やかに撹拌することにより凝集させ、その後で連続式
フロー遠心機を使って遠心分離した。その後の処理に必
要とされるまで、排出したスラリーを７０℃で貯蔵し
た。

【０２７３】硫酸アンモニウム沈殿を緩衝液Ｂ（５０ｍ
Ｍオルトリン酸二水素ナトリウム、２５ｍＭエチレンジ
アミンテトラ酢酸、２ｍＭジチオトレイトール、５Ｎ水
酸化ナトリウムでｐＨ６．３）１４ｌの存在において溶
解した。３０分後、懸濁液を遠心分離により澄明にし、
かつ緩衝液Ｂ ７０ｌに対するダイアフィルトレーショ
ンにより脱塩し、かつコンダクティビティが３ＭＳ／ｃ
ｍ以下に低下していたことを認めた。更に、脱塩溶液を
遠心分離により澄明にしかつ直ちに処理した。

【０２７４】脱塩溶液を、緩衝液Ｂ ６０ｌで均衡化し
たＤＥＡＥセルロース２ｋｇを含有するバッチクロマト
グラフィタンクに徐々に添加した。６．５時間撹拌した
後で、未結合のγ−リシン溶液をポンプによりタンクの
底から平衡化したＤＥＡＥセルロースを充填したカラム
１１．３ｃｍ（直径）×１０ｃｍを流速８０ｍｌ／分で
通した。γ−リシンＡのバルクは結合せず、かつ不銹鋼
釜中に捕集した。

【０２７５】γ−リシンＡ溶液を１Ｍオルトホスホン酸
でｐＨ５．５に調節し、かつ緩衝液Ｃ（２５ｍＭオルト
リン酸二水素ナトリウム、５ｍＭエチレンジアミンテト
ラ酢酸、２ｍＭジチオトレイトール、５Ｎ水酸化ナトリ
ウムでｐＨ５．５）１０ｌで平衡化したカルボシメチル
アガロースの１０ｃｍ（直径）×１０ｃｍに施した。こ
のカラムに結合し、かつ緩衝液Ｃ １０ｌで洗浄後のγ
−リシンＡを緩衝液Ｄ（２５ｍＭオルトリン酸二水素ナ
トリウム、５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、１００
ｍＭ塩化ナトリウム、５Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５．
５）で溶離した。純粋なγ−リシンＡを単一ピークとし
て溶離し、これを捕集し、かつ更に処理するのに必要と
されるまで４℃で滅菌溶液として貯蔵した。γ−リシン
Ａはこの条件下に２ケ月間までは安定である。

【０２７６】配列リスト 次に、本発明に関係する配列のリストを示す。これらの
配列は、慣用の５′から３′の方向で記載されている。

【０２７７】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １： 配列の長さ： ６２塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC ４７ CTG CTG AAG TGT CTC ６２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２： 配列の長さ： ６４塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CTG TTC GAG ACA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT TGC ４５ TGG ACC CAG TGG AGT ACTG ６４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GAA CAG GTA CGA AAA ATT CAA GGC GAT GGT GCG GCT CTG CAG GAA ４５ AAG CTG TGC GCA ACC ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TTT GTA GGT TGC GCA CAG CTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC ATC GCC ４５ TTG AAT TTT ACG TAC ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ５： 配列の長さ： ４８塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TAC AAA CTG TGC CAC CCT GAG GAA CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT CTG ４８ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ６： 配列の長さ： ５１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CGG GAT CCC CAG AGA GTG ACC GAG CAG CAC CAG TTC CTC AGG GTG ４５ GCA CAG ５１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ７： 配列の長さ： ６３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GGG ATC CCG TGG GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAA GCT TTA ４５ CAA CTG GCA GGC TGC TTG ６３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CTG GCT CAA GCA GCC TGC CAG TTG TAA AGC TTG GGA CGG GCA AGA ４５ GCT CAG TGG AGC CCA ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ９： 配列の長さ： ６３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AGC CAG CTG CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG CTG CAG ４５ GCT CTA GAA GGC ATC TCT ６３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １０： 配列の長さ： ６３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TTC AGG AGA GAT GCC TTC TAG AGC CTG CAG CAG ACC CTG GTA CAG ４５ GAA CAG ACC GGA GTG CAG ６３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １１： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CCT CAA TTG GGG CCC ACC CTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTT GCC ４５ GAC TTC GCT ACT ACC ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １２： 配列の長さ： ６３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TTG CCA TAT GGT AGT AGC GAA GTC GGC AAC GTC CAG CTG CAG TGT ４５ GTC CAG GGT GGG CCC CAA ６３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １３： 配列の長さ： ６３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 ATA TGG CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG GCT CCG GCA CTG CAG ４５ CCG ACT CAG GGT GCG ATG ６３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １４： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TGC TGG CAT CGC ACC CTG AGT CGG CTG CAG TGC CGG AGC CAT ACC ４５ CAG TTC CTC CAT CTG ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １５： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CCA GCA TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGG CGC GCA GGC GGT GTT CTG ４５ GTT GCC TCC CAT CTT ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １６： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GCT CTG AAG ATG GGA GGC AAC CAG AAC ACC GCC TGC GCG CCG CTG ４５ GAA AGC AGA GGC GAA ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １７： 配列の長さ： ５５塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CAG AGC TTC CTC GAG GTG TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC ４５ CAG CCG TTAG ５５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １8： 配列の長さ： ５３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TCGACTTA CGG CTG GGC CAG GTG ACG CAG AAC GCG GTA AGA CAC CTC ４７ GAG GAA ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １９： 配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TACAACTGGCAGGCTGCTTGA ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２０： 配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GACGTTGCCGACTTCGCTACT ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２1： 配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TGCCGGAGCCATACCCAGTTC ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２２：配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GCCTGCCAGTTGTAAAGCTTG ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２３： 配列の長さ： ２６塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GCACCATCGCCTTGAATTTTACGTAG ２６ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２４： 配列の長さ： ６２塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC ４７ CTG CTG AAG TCT CTC ６２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２５： 配列の長さ： ６４塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CTG TTC GAG AGA CTT CAG GAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT TGC ４５ TGG ACC CAG TGG AGT ACTG ６４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２６： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC AGC GGT GCG GCT CTG CAG GAA ４５ AAG CTG TGC GCA ACC ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２７： 配列の長さ： ６０塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 TTT GTA GGT TGC GCA CAG CTT TTC CTG CAG ACG CGC ACC GCT GCC ４５ TTG AAT TTT ACG TAC ６０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２８： 配列の長さ： ２９塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CTT CAG CAG GAA AGA ACG CGG CAG AGA GC ２９ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２９： 配列の長さ： ３３塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GC TTC GGA AGA GCA AGA GCT CAG AGC AGC CCA C ３２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３０： 配列の長さ： １６８＋１６６塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： ２本鎖 トポロジー： 直鎖状 AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACT ５０ GACCGT TTATAAGACT TTACTCGACA ACTGTTAATT AGTAGCTTGA ４６ AGTTAACTAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA GGGTATCGAC ９０ TCAATTGATC ATGCGTTCAA GTGCATTTTT CCCATAGCTG ８６ AATGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTAG １４０ TTACCATGGG CCCCTAGGAG ATCTCAGCTG GACGTCCGTA CGTTCGAATC １３６ CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT TTTTTTAT １６８ GGGCGGATTA CTCGCCCGAA AAAAAATAGC １６６ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１： 配列の長さ： ５３４塩基 配列の型： 相応する蛋白質を有するヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状

【０２７８】

【化１０】

【０２７９】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２： 配列の長さ： ８１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GAATTCAACA AAACGGTTGA CAACATGAAG TAAACACGGT ACGATGTACC ５０ ACAAGTTCAC GTAAAAAGGG TATCGAATG ８１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３３： 配列の長さ： ６７＋６７塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： ２本鎖 トポロジー： 直鎖状 TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA TTTTAAAAAG ６０ GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT AAAATTTTTC ５６ CATGCGA ６７ GTACGCTTCGA ６７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３４： 配列の長さ： １１８塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACT ５０ AGTTAACTAG TACGCAGAGC TCAATCTAGA GGGTATTAAT AATGTTCCCA １００ TTGGAGGATG ATTAAATG １１８ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３５： 配列の長さ： ２３＋３５塩基 鎖の数： ２本鎖 トポロジー： 直鎖状 AGCTCCATAT GGTACCAGAT CTCTCGAGAG TACTT ３５ GGTATA CCATGGTCTA GAGAGCTCTC ATGAAGATC ３５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３６： 配列の長さ： ３５＋１５塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： ２本鎖 トポロジー： 直鎖状 AGCTCAGCTG CAGCATATGG TAC ２３ GTCGAC GTCGTATAC １５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３７： 配列の長さ： ７２＋７２塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： ２本鎖 トポロジー： 直鎖状 TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA TTTTAAAAAG ６０ GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT AAAATTTTTC ５６ CATGGCGGATC CC ７２ GTACGCCTAG GGGAAC ７２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３８： 配列の長さ： ８４塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AAT TCA ACA AAA CGG TTG ACA ACA TGA TGA AAA CAC GGT ACG ATG ４５ TAC CAC AAG TTC ACG TAA AAA GGG TAT CGA CAA TGG TAC ８４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３９： 配列の長さ： ７６塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 CAT TGT CGA TAC CCT TTT TAC GTG AAC TTG TGG TAC ATC GTA CCG ４５ TGT TTA CTT CAT GTT GTC AAC CGT TTT GTT G ７６ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４０： 配列の長さ： ２４＋２４塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： ２本鎖 トポロジー： 直鎖状 AATTCGCATG CGGATCCATC GATC ２４ GCGTAC GCCTAGGTAG CTAGAGCC ２４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４１： 配列の長さ： １７４／１７７アミノ酸 配列の型： アミノ酸 トポロジー： 直鎖状

【０２８０】

【化１１】

【０２８１】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４２： Ｔ７Ａ３ プロモーター配列 配列の長さ： ４６塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AACAAAACGG TTGACAACAT GAAGTAAACA CGGTACGATG TACCAC ４６ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４３： ｌａｃＯ 配列 配列の長さ： ２２塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AATTGTGAGC GGATAACAAT TT ２２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４４： 配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GATAACAACA TATTCCCCAA A ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４５： 配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 GATAACAACA TGGTACCCAA A ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４６： 配列の長さ： ２１塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AACAACATGG TACCCAAACA A ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４７： 配列の長さ： ８６塩基 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： １本鎖 トポロジー： 直鎖状 AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC ACATTAGAGG ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC ８６

【図面の簡単な説明】

【図１】転写ターミネーター配列を説明している図。

【図２】ｐＴＢ ３４４の製造を説明している図。

【図３】ｐＩＣＩ ００４２の製造を説明している図。

【図４】ｐＩＣＩ ００４２のプラスミド地図。

【図５】プラスミドの製造に使用されるフラグメントを
示している図。

【図６】ｐＩＣＩ １０７９のプラスミド地図。

【図７】ｐＬ ＢＯ１５のプラスミド地図。

【図８】ｐＣＧＧ１プラスミド地図。

【図９】［Ｓｅｒ¹⁷ _' ²⁷］Ｇ−ＣＳＦの配列。

【図１０】ｈ−ＧＣＳＦの配列。

【図１１】ｐＣＧ５４のプラスミド地図。

【図１２】ｐＩＣＩ ００２０の構成を説明している
図。

【図１３】ｐＩＣＩ １０７８の構成を説明している
図。

【図１４】ｐＩＣＩ １１０２の構成を説明している
図。

【図１５】Ｅ・コリーリゼートのクマシー染色ＳＤＳゲ
ルを示す図。

【図１６】ｐＩＣＩ １１０２のゲルプロフィルを示す
図。

【図１７】ｐＩＣＩにより産生されたリシンＡのウエス
タンブロットを示す図。

【図１８】ｐＩＣＩ １１０２の部分配列。

【図１９】ｐＩＣＩ １１８７の構成を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 平２−86780（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．90（１）， ｐ．145−148 （1990) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ ＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｓ ｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅ ｑ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｔｅｔＡ及びｔｅｔＲ遺伝子を有する誘
   導的選択マーカー、プロモーター、リボソーム結合部
   位、転写ターミネーター、ｃｅｒ配列及び異種ポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ配列を有する、ベクター。
2. 【請求項２】 転写ターミネーターがバクテリオファー
   ジＴ４の遺伝子３２の末端に認められるような転写ター
   ミネーターである、請求項１記載のベクター。
3. 【請求項３】 プロモーターがｔｒｐプロモーター及び
   Ｔ７Ａ３プロモーターから選択される、請求項１又は２
   記載のベクター。
4. 【請求項４】 異種ポリペプチドはリシンＡ、顆粒球産
   生を刺激する能力を有するＧ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ類縁
   体から選択されている、請求項１から３までのいずれか
   １項記載のベクター。
5. 【請求項５】 細菌宿主が請求項１から４までのいずれ
   か１項記載のベクターを有する、異種ポリペプチドを発
   現可能な細菌宿主。
6. 【請求項６】 細菌宿主が大腸菌である、請求項５記載
   の細菌宿主。
7. 【請求項７】 請求項５記載の細菌宿主の製法におい
   て、該方法は、請求項１から４までのいずれか１項記載
   のベクターを細菌宿主に挿入することにより細菌宿主を
   形質転換させることによりなる、請求項５記載の細菌宿
   主の製法。
8. 【請求項８】 ポリペプチドを製造する方法において、
   該方法は、請求項５に記載の細菌宿主を培養してポリペ
   プチドを発現させ、かつ、この細菌宿主細胞培養物から
   ポリペプチドを回収することよりなる、ポリペプチドの
   製法。
9. 【請求項９】 選択薬剤の不在下に異種ポリペプチドを
   発現させるためのベクターの構築における、ｔｅｔＡ及
   びｔｅｔＲ遺伝子を有する誘導的選択マーカー並びにｃ
   ｅｒ配列の使用。
10. 【請求項１０】 異種ポリペプチドはリシンＡ、顆粒球
    産生を刺激する能力を有するＧ - ＣＳＦ及びＧ - ＣＳＦ類
    縁体から選択されている、請求項９記載の使用。