KR100355963B1 - 영양요구성을 보완함으로써 항생제 없이 선별되는 원핵세포 숙주/벡터 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 a) 복제 기원, b) 영양요구성 표지 유전자, c) 원핵세포에서 작용적으로 활성인 프로모터(promoter) 및 d) 이 프로모터의 조절하에 발현되는 외부 유전자를 포함하는, 원핵세포 유기체의 게놈(genome)과 상동 재조합될 수 없는 최소 원핵세포 발현 벡터에 관한 것으로, 이 벡터는 항생제를 첨가하지 않고 선별하는데 특히 적합하다.

Description

영양요구성을 보완함으로써 항생제 없이 선별되는 원핵세포 숙주/벡터 시스템{Prokaryotic host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy}
본 발명은 항생제를 첨가하지 않고 선별될 수 있는 신규한 원핵세포 발현 시스템 및 재조합 단백질 생산에서의 그의 용도에 관한 것이다.
알려진 원핵세포 발현 플라스미드는 하나 또는 몇가지 항생제 저항성 유전자(들) 이외에도, 반드시 필요하지 않으면서 세포 대사에 부담을 주는 추가의 DNA 서열을 포함한다. 이들 서열은 클로닝 과정중 생성된 DNA 서열, 및 예를 들어 mRNA의 시험관내 합성을 위한 특정 프로모터(promoter) 및 단일 스트랜드(strand) DNA의 합성을 위한 특정 파지(phage)의 복제 기원과 같은 다목적 벡터의 잔재인 DNA 단편을 포함하고, 넓게는 바람직하지 않은 플라스미드 재배열의 원인이 될 수 있는 미숙하게 복제되는 벡터 서열까지 포함한다.
플라스미드, 특히 발현 벡터의 존재는 세포에게 추가의 대사적 부담이 된다. 이것은 플라스미드가 없는 세포가 생성되도록 유도하는 선별 압력을 제공하는데, 이러한 현상은 항생제 선별에 의해서 대부분 방지될 수 있다.
암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 및 클로람페니콜과 같은 항생제가 일반적으로 선별에 사용된다. 특히 암피실린과 같은 β-락탐계 항생제의 사용은 치료적 산물을 생산(발효)하는데 문제가 된다.
전술한 이유로 β-락탐계 항생제에 의한 항생제 플라스미드 선별은 최근에는 사용하지 않는다. 몇가지 경우에 사용된 숙주/벡터 시스템은 초기배양 및 주 발효중에 플라스미드 선별을 생략할 수 있을 정도로 매우 안정한 것으로 판명되었다(웨어(Weir, A. N. C.) 및 마운틴(Mountain, A.)에게 허여된 유럽 특허 제 0 651 803 호 참조). 그러나, 일반적으로 이러한 경우에는 생성물 수율이 감소된다. 항생제 선별이 반드시 필요한 경우에, 테트라사이클린이 종종 암피실린의 대용물로 사용된다(카터(Carter, P) 등의 문헌[1992] 참조). β-락탐계 항생제와는 반대로, 테트라사이클린은 화학 화합물과 반응하지 않아서 발효중에 효소적 변형에 의해 불활성화되지 않는다. 테트라사이클린 저항성 유전자는 세균막을 변형시키는 단백질을 암호화하므로 테트라사이클린이 세포로 들어오는 것을 막는다.
스트룰(Struhl, K.) 및 그의 조수들은 한 예로서 이미다졸 글리세롤 포스페이트 탈수효소(HIS3)를 사용하여 적절한 이 콜라이 돌연변이주(hisB)가 효모 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 직접적으로 보완(complementation)될 수 있으며, HIS3에 의해 암호화된 효모 효소가 이 콜라이에서 작용적으로 발현된다는 것을 나타내었다(스트룰 등의 문헌[1976] 참조). 이 콜라이에서 돌연변이를 보완하는 유전자의 이러한 능력은, 예를 들어 다른 효모 유전자(LEU2, URA3, TRP5 및 ARG4)를 클로닝(보완성 클로닝)하는데 선별 기준으로 사용되었다.
안정한 돌연변이(복귀 비율<10-10; 바람직하게는 비복귀형 결손 돌연변이주)의 이 콜라이 숙주 균주가 보완성에 의한 선별에 필요하다. 그러나, 알려진 돌연변이의 복귀 비율은 10-10보다 크다(슐레겔(Schlegel, H. G.)의 문헌[1981] 참조).
알려진 이 콜라이 실험실 균주는 대부분의 경우 방사선 조사(X선 또는 자외선(UV) 조사), 화학적 돌연변이원(예를 들어, 염기 유사체, 아질산 및 알킬화 화합물) 또는 생물학적 기법(예를 들어, 파지 Mu 및 트랜스포손(transposon) 돌연변이 유발)에 의한 무방향성 돌연변이 유발에 의해 생성되는 개개의 돌연변이주와는 유전형에서 다르다(바흐만(Bachman, B. J.)의 문헌[1986] 참조).
본 발명의 목적은 항생제에 의한 플라스미드 선별이 필요하지 않은 안정한 원핵세포(바람직하게는 이 콜라이) 숙주/벡터 시스템(발현 시스템)을 개발하는 것이다. 선별 이론은 적절한 효모 유전자에 의해 원핵세포 숙주 세포의 안정한 영양요구성을 보완하는데 기초한다.
도 1은 유전자 교환 기법에 의해 이 콜라이(E. coli) trpC 결손 돌연변이주를 구성하는 설계도를 도시한 것이다. 제거될 trpC 유전자를 둘러싸는 서열이 벡터 pMAK705로 삽입된다. 이 플라스미드는 44℃에서는 복제할 수 없고 함께 삽입된 균주 (co-integrate)를 형성하기 때문에, 단지 상동 재조합 및 플라스미드의 염색체로의 삽입에 의해 형질전환된 이 콜라이 균주만이 클로람페니콜을 첨가하여 44℃에서 배양할 때 생육한다. 이후에 클로람페니콜 선별하에 30℃에서 배양하면 플라스미드가 염색체 외부로 잘라져나오는 2차 상동 재조합이 유도된다. 이러한 함께 삽입된 균주를 파괴하면 초기 플라스미드 pMAK705-trpD/B(A) 또는 추가로 trpC 유전자를 포함하는 pMAK705-trpD/C/B 플라스미드 유도체(B)가 제조될 수 있다. 이 콜라이 염색체상의 trpC 유전자는 단지 B 경우에서만 제거된다.
도 2는 OripBR-TRP1, OripBR-URA3 및 OripBR-TET의 기본 벡터를 구성하는 설계도를 도시한 것이다. 플라스미드 OripBR-TRP1(1497 bp), OripBR-URA3(1697 bp) 및 OripBR-TET(2012 bp)는 절단 부위 SfiI 및 XhoI을 사용하여 pBR322의 복제 기원을 포함하는 DNA 단편을 플라스미드 pBR322, yEP24, yRP7로부터 단리된 표지 유전자 TET, URA3 및 TRP1과 연결시킴으로써 제조된다.
도 3은 T5-PN25/03/04혼성 프로모터, 리보솜 결합 부위 RBSII, 다중 클로닝(cloning) 절단 부위(NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII) 및 λ-T0 종결유전자로 구성된 발현 카세트(cassette)의 뉴클레오티드 서열(서열번호:24)을 도시한 것이다.
본 발명은 a) 복제 기원, b) 영양요구성 표지 유전자, c) 원핵세포에서 작용적으로 활성인 프로모터 및 d) 이 프로모터의 조절하에 발현되는 외부 유전자(외부 서열)를 포함하는, 원핵세포 유기체의 게놈(genome)과 상동 재조합될 수 없는 최소 원핵세포 발현 벡터와 관련되어 있다.
이와 관련하여, 영양요구성 표지 유전자의 전사 및 발현될 외부 유전자의 전사는 바람직하게는 반대 방향이다. 또한 표지 유전자는 숙주 세포로 사용된 원핵세포 유기체에 이종인 것이 바람직하다. 영양요구성이 숙주 세포에서 보완될 때, 본 발명에 기술된 숙주/벡터 시스템내 영양요구성 표지 유전자의 발현 수율은 숙주 세포에서 발현된 총 단백질의 1% 이하인 것이 또한 바람직하다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 영양요구성 표지 유전자의 판독틀 및 발현될 유전자의 판독틀이 반대로 배향되고 동일한 전사 종결유전자나 일련으로 배열된 몇가지 전사 종결유전자에 의해 종결됨을 특징으로 한다.
영양요구성 표지 유전자는 선택적 배양 조건하에서 영양요구성 숙주 세포의 세포 생육을 가능하게 하는 유전자로 이해된다. 특히 바람직한 영양요구성 표지 유전자는 숙주 유기체의 필수 대사 경로에서 결손(돌연변이)을 보완하는 이종의 진핵세포 유전자, 바람직하게는 효모 유전자이다. 이 콜라이가 숙주 유기체인 경우, 표지 유전자에 의해서 보완될 수 있는, 트립토판, 루신 또는 우라실 생합성 경로에서 결손을 갖는 돌연변이주가 바람직하다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵세포 영양요구성 숙주 세포이고, 이 숙주 세포는 발현 벡터의 영양요구성 선별 표지 유전자에 의해 보완될 수 있는 염색체 유전자가 작용 산물을 전혀 발현시킬 수 없도록 돌연변이(결손)된다. 결손은 바람직하게는 발현 벡터의 영양요구성 표지 유전자에 상응하는 필수 염색체 유전자내에서 일어난다. 본 발명의 또 다른 요지는 본 발명에 따른 발현 벡터의 영양요구성 표지에 상응하는 유전자가 돌연변이되거나 결손되어 이러한 유전자의 작용 산물을 전혀 발현시킬 수 없는 원핵세포 영양요구성 세포에 상기 발현 벡터를 도입시킴을 포함하는 원핵세포 발현 시스템의 제조 방법이다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 숙주 세포에 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여 목적한 단백질을 이종적으로 발현시키고, 최소 배지 또는 합성 완전 배지에서 발효를 행하여 수득된 세포 또는 상청액으로부터 발현된 산물을 단리하는 이종 단백질의 생산 방법이다.
본 발명의 또 다른 요지는 본 발명에 따른 발현 벡터의 영양요구성 표지 유전자에 의해 보완될 수 있는 염색체 유전자가 돌연변이되어 이러한 유전자의 작용 산물을 전혀 발현시킬 수 없는 원핵세포 숙주 세포에 상기 발현 벡터를 도입시킴을 특징으로 하는 원핵세포 발현 시스템의 제조 방법이다.
본 발명에서는, 항생제에 의한 일반적인 선별 대신 적절한 효모 유전자(TRP1, URA3)의 플라스미드-암호화 발현에 의해 필수 염색체상의 이 콜라이 영양요구성(trpC, pyrF)을 보완하여 선별되는 신규한 이 콜라이 숙주/벡터 시스템을 개발하였다. 또한, 이 시스템은 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는다.
1) 최적화된(최소화된) 크기를 갖는 신규한 발현 벡터를 최소 작용 요소(선택 표지, 복제 기원 및 발현 카세트)를 사용하여 구성하였다.
2) 비복귀성 숙주 균주를 목적하는 이 콜라이 염색체 유전자(trpC, pyrF)의 상동 재조합(결손)에 의해 분리하였다.
3) 신규한 숙주/벡터 시스템의 구성요소(발현 플라스미드 및 숙주 균주)를 모델 유전자(인터페론-α-2b)의 발현에 기초하여 작용성과 성능면에서 조사하였다.
이를 위해, 1) 염색체 유전자 trpC 및 pyrF의 안정한 돌연변이(결손)를 갖는 이 콜라이 숙주 균주 및 2) 보완성 효모 유전자 TRP1(트슘퍼(Tschumper, G.)의 문헌[1980] 참조) 또는 URA3(로즈(Rose, M.)의 문헌[1984] 참조)를 포함하는 벡터를 구성하였다.
이중 돌연변이주 또는 결손 돌연변이주가 바람직하게는 안정한 숙주 균주로 구성된다.
본 발명에 따른 최소 벡터는 바람직하게는 매우 작고(2000bp보다 더 작다), 단지 발현 플라스미드의 절대 필수 요소, 즉 복제 기원, 이종 선택 표지 유전자 및 이종 발현 카세트만을 포함한다(이들은 원핵세포 숙주 세포의 게놈과 상동 재조합하지 않도록 가능한 한 가장 작은 크기를 갖는다). 본 발명의 의미내에서 상동 재조합은 본 발명에 따른 벡터와 숙주 세포의 게놈 사이의 DNA 서열 교환으로 이해된다. 상동 재조합은 벡터와 게놈 사이에 상당한 서열 일치성(50 내지 1000bp 이상)이 존재할 때 발생할 수 있다. 서열에서의 일치성이 낮으면(50bp 미만) 본 발명의 의미내에서 측정가능한 정도의 상동 재조합은 일어나지 않는다.
적절한 숙주 세포의 예는 불활성 N-(5'-포스포-리보실)-안트라닐레이트 이성질화효소(EC 5.3.1.24)를 특징으로 하는 이 콜라이 TrpC 돌연변이주 및 불활성 오로티딘-5'-포스페이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.23)를 특징으로 하는 이 콜라이 pyrF 돌연변이주이다. 이러한 돌연변이주는 트립토판 또는 우라실을 합성할 수 없어서 이러한 성분이 부족한 영양 배지에서는 자랄 수 없다. 반대로, 이들은 트립토판 및 우라실이 적절한 양으로 존재하는 완전 배지에서는 정상적인 생육을 나타낸다.
영양요구성 trpC 및 pyrF 돌연변이주는 각각의 생합성에 관련된 부재 유전자 또는 결손 유전자를 돌연변이되지 않은 상태로 포함하는 본 발명에 따른 플라스미드에 의해서 보완된다. 그러나, 보완 유전자는 이 콜라이로부터 유래하지 않고 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래한다. 이들은 상응하는 이 콜라이 유전자가 암호화하는 효소와 동일한 효소를 암호화한다. 효모 프로모터의 불량한 작용으로 인해, 상기 보완 유전자의 이 콜라이에서의 전사는 이 콜라이 숙주 내부의 유사한 유전자들의 전사보다 떨어진다. URA3 효모 유전자(pBR322플라스미드 유도체)의 플라스미드-암호화 발현은, 예를 들어 유사한 염색체 pyrF 유전자의 발현의 단지 3분의 1이다(로즈의 문헌[1984] 참조). 이것은 유전자 투입 효과에도 불구하고 표지 유전자가 대량발현되지 않으며, 세포가 대사적으로 추가로 스트레스를 받지 않는 이점을 가진다.
플라스미드는 수천개의 뉴클레오티드 형성 단위로 이루어진 길이를 갖고 세포 1개당 몇개 내지 수백개로 복사되는 염색체외(에피좀(episome)내) 원형 이중-스트랜드 DNA 분자이다. 이것은 염색체 DNA 복제와 독립적으로 자가 플라스미드 복제/증식이 가능한 DNA 단편, 소위 복제 기원을 갖는다.
본 발명에 의해, 항생제에 의한 플라스미드 선별이 필요하지 않은 안정한 이 콜라이 숙주/벡터 시스템이 개발되었다. 선별 이론은 적절한 효모 유전자에 의해 안정한 이 콜라이 영양요구성을 보완하는데 기초한다.
바람직하게 이 콜라이 숙주 균주는 염색체 유전자 trpC 및/또는 pyrF에서 안정한, 바람직하게는 비복귀성 돌연변이(결손)를 포함하고 보완성 효모 유전자 TRP1 및/또는 URA3를 포함하는 발현 플라스미드를 포함한다.
기본적인 발현 플라스미드는 1) 항생제 저항성 유전자가 없고 2) 크기가 매우 작은(2000bp 미만) 특징을 갖는다.
이들 플라스미드는 이 콜라이에서 복제되고 목적하는 유전자를 발현시키는데 필요한, 가능한 한 최소 크기의 하기 1) 내지 3)의 절대 필수 요소만을 포함한다:
1) 복제 기원,
2) 선별 표지 유전자 및
3) 원핵세포 또는 진핵세포 발현 카세트(유전자 치료용).
복제 기원
세포에서 플라스미드의 자가 복제를 위한 복제 기원은 원핵세포 플라스미드, 바람직하게는 본래 이 콜라이 플라스미드로부터 유래한다. 현재 사용되는 대부분의 이 콜라이 플라스미드는 플라스미드 ColE1과 미소한 차이만을 갖는 플라스미드 pMB1(서트클리프(Sutcliffe, G.) 등의 문헌[1979] 참조)에 기초한레플리콘(replicon)(DNA 복제 기원)을 갖는 클로닝 벡터 pBR322(볼리버(Boliver, F.) 등의 문헌[1979] 참조)의 유도체이다. 플라스미드 pBR322의 복제는 또한 ColE1 유형의 복제로 지칭된다(백만(Backman, K.) 등의 문헌[1978] 참조). pBR322플라스미드의 자가 복제를 담당하는 최소 DNA 서열은 580 내지 650bp 길이의 DNA 서열까지 그 크기가 감소되었다(백만 등의 문헌[1978] 참조). 세포 1개당 플라스미드 복제수는 복제 기원의 유형에 따라 결정된다. 가능한 세포 1개당 복제수에 따라 저복제수(약 10개의 복제수, pACYC 플라스미드), 중복제수(약 50개의 복제수, pBR 플라스미드) 및 고복제수(약 500개의 복제수, pUC 플라스미드)의 플라스미드로 지칭된다. 고복제수 pUC 플라스미드의 복제 기원은 단지 점 돌연변이(point mutation)된 pBR의 복제 기원에 기초한다(챔버스(Chambers, S. P.) 등의 문헌[1988] 참조). 유전자의 발현 수율은 일반적으로 발현되는 유전자의 복제수와 관련된다.
발현 카세트
발현 카세트(이종 전사 단위)는 1) 프로모터, 2) 리보솜 결합 부위, 3) 다중 클로닝 절단 부위 및 4) 전사 종결유전자(rho-독립 종결)로 구성된다.
다중 클로닝 절단 부위는 발현될 유전자(구조 유전자)를 삽입시키는 작용을 하는데, 이를 위해 이 부위는 벡터에는 단지 한군데만 존재하는 2종 이상의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위로 구성된다. 절단 부위로는 바람직하게는, 예를 들어 제한 효소 NcoI, BspHI, SpHI 및 NdeI의 인식 서열과 같이 인식 서열에서 ATG 개시 코돈(codon)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 프로모터를 향한 절단 부위가 사용된다. 이것은 프로모터와 구조 유전자 사이의 정확한 연결을 촉진시킨다.
프로모터는 mRNA 합성의 개시 및 mRNA 분자가 형성되어 발현 카세트에서 작용적으로 활성이 되는 빈도에 대한 제어 신호를 포함하는 DNA 단편이다. 전형적인 본래 이 콜라이 프로모터는 80 내지 300개의 염기쌍 길이를 가지며, 다양한 프로모터들에서 공통으로 존재하고 서열 비교에 의해 확인되는 몇가지 특징적인(동종의) 영역을 포함한다(로젠베르크(Rosenberg, M.) 및 코트(Court, D.)의 문헌[1979] 참조; 할리(Harley, C. B.) 및 레이놀즈(Reynolds, R. P.)의 문헌[1987] 참조). 널리 보존된 영역은 1) mRNA 합성 개시 부위의 전방으로 35개 염기쌍에 위치한 모티프(motif) 5'-TTGACA-3'로 이루어진 RNA 중합효소의 인식 부위, 2) mRNA 합성 개시 부위의 전방으로 10개 염기쌍에 위치한 코돈상 원형 서열 5'-TATAAT-3'로 이루어진 프리브노우 스칼러 박스(Pribnow Schaller box) 또는 소위 TATA 박스 및 3) 강한 프로모터내 "-43" 위치 주위의 AT-풍부한 영역이다.
프로모터가 인식되는 빈도에 따라, 약한 프로모터 및 강한 프로모터로 분류된다. 또한 항구성(constitutive) 프로모터 및 조절성(유도성, 억제해재성) 프로모터로도 분류된다. 단백질의 산업적 생산과 관련하여 양호한 프로모터는 일반적으로 세포 생육중에는 불활성이고 요구될 때, 예를 들어 발효의 후반부에 특이적으로 바뀌어 활성일 수 있는 강한, 엄격히 조절되는 프로모터이다. 매우 높은 수준의 활성을 가지면서 동시에 활성이 엄격하게 조절되는 프로모터가 요구됨에 따라, 최근에 바람직하게 사용되는 혼성 프로모터가 구성되었다. 용이하게 조절될 수 있는 tac 혼성 프로모터의 경우, 강한 항구성 trp 프로모터의 "-35" 영역이 유도성 lac 프로모터의 "-10" 영역과 융합된다(드보어(DeBoer, H. A.) 등의 문헌[1983]; 아만(Amann, E.) 등의 문헌[1983] 참조). 또 다른 예는 강한 항구성 T5 박테리오파지 프로모터에 기초하고 용이하게 조절될 수 있는 강한 프로모터를 형성하도록 2개의 lac 작동유전자(lacO)가 조합/삽입되어 재구성된 T5-PN25/03/04혼성 프로모터이다(스튀버(Stuber, D.) 등의 문헌[1990] 참조). tac 혼성 프로모터 및 T5-PN25/03/04혼성 프로모터는 lac 작동유전자(들)와의 상호작용에 의해 프로모터의 전사를 막는 lacI 억제유전자에 의해 음성 조절된다. 천연 유도체 락토스 또는 매우 효과적인 비대사성 락토스 유사체 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하면 lacI 억제인자가 떨어져 나가 목적하는 mRNA의 형성 및 단백질 합성이 이루어지게 된다.
전사 종결유전자는 RNA 중합효소에 mRNA 합성을 종결하는 신호를 제공하는 50 내지 100개 염기쌍 길이의 DNA 서열이다. 이것은 구조적으로 상보적 염기쌍(대부분 G/C-풍부)에 의한 헤어핀(hairpin)-형 2차 구조의 형성을 특징으로 한다. 작용상 이것은 배향 위치와는 독립적으로 작용한다. 발현 카세트의 3' 말단에 존재하는 매우 효율적인(강한) 종결유전자는 특히 강한 프로모터가 사용될 때 RNA 중합효소가 계속 판독하는 것을 중지시킨다. 비효율적인 전사 종결유전자는 오페론(operon)형 mRNA가 형성되도록 유도할 수 있으며, 이로 인해 바람직하지 않은 플라스미드-암호화 유전자가 발현될 수 있다. 또한 종결유전자에 의해 형성된 mRNA의 3' 말단의 2차 구조는 3' 엑소뉴클리아제(히긴스(Higgins, C. F.) 등의 문헌[1993] 참조)에 의한 분해를 방해하여 mRNA의 반감기를 증가시키고 따라서 합성된 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 종종 사용되는 전사 종결유전자의 예는 박테리오파지 λ의 T0 종결유전자(슈바르츠(Schwarz, E.) 등의 문헌[1978] 참조), fd 박테리오파지 종결유전자(벡크(Beck, E.) 및 진크(Zink, B.)의 문헌[1981] 참조) 및 이 콜라이 rrnB 오페론의 T1 종결유전자(브로시우스(Brosius, J.) 등의 문헌[1981] 참조)이다.
리보솜 결합 부위(RBS)도 또한 단백질 생합성을 효과적으로 개시하는데 필요하다. 이 부위는 ATG 개시 코돈으로부터 소위 공통 모티프 AGGA의 샤인 달가노(Shine Dalgarno, SD) 서열까지의 서열로 구성된다. ATG 개시 코돈과 SD 서열 사이의 거리는 5 내지 15개 염기쌍으로 다양하고 A/T가 풍부하다. mRNA 합성의 개시점과 ATG 해독 개시 코돈 사이의 거리는 대체적으로 15 내지 80개 염기쌍으로 다양하다.
임의의 서열이 본 발명의 요지내에서 외부 서열로 적합하다. 이러한 핵산 서열은 바람직하게는 신체의 대사에 영향을 미치는 폴리펩타이드를 암호화한다. 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드는 바람직하게는 사이토킨과 같은 치료적으로 적절한 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 호르몬이다.
이 콜라이 숙주 균주를 구성하는데 적합한 이 콜라이 돌연변이주를 제조하기위해 사용할 수 있는 다수의 기법이 있다. 이러한 기법은 전체 세포를 돌연변이 유발시켜 목적하는 표현형을 선별하는 것에서, 개별 염기 또는 정확하게 정의된 유전자나 게놈 구역을 특이적으로 돌연변이 유발시키는 것까지 다양하다. 이러한 방법은 밀러(Miller, J. H.)의 문헌[1972], 나이트하르트(Neidhardt, F. C.) 등의 문헌[1987] 및 빈낙커(Winnacker, E. -L.)의 문헌[1985]에 기술되어 있다.
안정한 비복귀성 영양요구성 표지는 그의 전체 유전자 또는 더 큰 유전자 분획을 해밀톤(Hamilton, C. M.) 등의 문헌[1989]의 방법에 따라 상동 재조합의 수단으로 지향성 결손시킴으로써 숙주 균주에 도입된다. 원 유전형은 이러한 기법에서 유지되고, 즉 추가의 돌연변이가 이 콜라이 게놈으로 도입되지 않는다. 유전자 교환 기법의 이론은 trpC 결손 돌연변이주의 구성을 예로 들어 더욱 상세히 설명하겠다.
예를 들어, 이 콜라이의 트립토판 오페론(야노프스키(Yanofsky, C.) 등의 문헌[1981] 참조)으로부터 완전한 trpC 유전자(1355bp)가 제거된다. 이를 위해, trpC 유전자의 측위 영역(flanking region)(경우마다 700 내지 800bp)을 적절한 프라이머(primer) 및 주형으로서 염색체 이 콜라이 DNA를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 수단으로 증폭시킨다. 프라이머의 돌출 부위(overhang)는 유전자 trpD 및 trpB의 증폭된 DNA 단편을 직접 융합에 의해 벡터 pMAK705로 연결시키기 위해 제한 효소의 단일 절단 부위를 포함한다. 벡터 pMAK705는 44℃에서 불활성인 온도-감수성 복제 기원(pSC101의 복제 기원) 및 클로람페니콜 저항성 유전자를 포함하는 특징을 갖는다. 염색체 trpC 유전자를 제거하기 위해, pMAK705-trpD/B 플라스미드로 목적하는 이 콜라이 균주를 형질전환시킨다. 플라스미드와 이 콜라이 염색체 사이의 상동 재조합의 필수 조건은 재조합-컴피턴트(competent) 이 콜라이 균주(recA+유전형)이다. recA-유전형을 갖는 균주는 상동 재조합을 할 수 없어서 부적절하다. 형질전환된 세포는 클로람페니콜의 존재하에 44℃에서 배양된다. 이 플라스미드는 온도-감수성 복제 기원(orits)에 의해 44℃에서는 복제되지 않으므로, 예를 들어 상동 재조합에 의해 염색체내로 벡터가 삽입된 세포만이 생존한다. 이러한 함께 삽입된 균주는 단리되고 30℃에서 몇회의 계대배양을 거쳐 클로람페니콜의 선별하에 배양된다. 염색체상에 위치한, 이 온도에서 활성인 플라스미드 pMAK705-trpD/B의 복제 기원은 함께 삽입된 균주의 생육 속도를 급격히 감소시킨다. 2차 재조합에 의해 염색체로부터 플라스미가 제거된 세포는 다시 정상적으로 생육한다. 이들은 클로람페니콜의 존재하에 30℃에서 복제하는, 염색체로부터 단리된 플라스미드를 포함한다. 플라스미드를 포함하는 세포는 함께 삽입된 균주보다 과도하게 증식하여 몇회의 계대배양 후에는 배양액에서 다수를 차지하는 결과가 나타난다. 도 1에서 설명한 바와 같이, 삽입된 플라스미드는 염색체로부터 A 및 B의 두가지 방법으로 단리될 수 있다. 그다음 플라스미드는 제거된 유전자 trpC를 포함하거나(B) 또는 상동 재조합에 따라 세포에서 다시 그의 원래 형태로 존재한다(A). 염색체 trpC 유전자를 갖는 플라스미드를 포함한 세포는 목적하는 trpC 결손을 가질 것이다. 이러한 결손은 플라스미드의 제한지도 분석법에 의해 확인되며, 44℃에서 1회 배양하고 클로람페니콜의 부재하에 30℃에서 수회 배양함으로써 플라스미드에서 복원된다. 이어서 트립토판이 존재하는 배지 및 존재하지 않는 배지에 개개의 콜로니(colony)를 도말하여(복사체 도말) 클론(clone)의 trpC 영양요구성을 시험한다.
특정 이 콜라이 숙주/벡터 시스템 및 숙주 균주
매우 엄격히 조절되는 숙주/벡터 시스템은 특히 이 콜라이에 독성인 단백질의 발현의 경우 여전히 문제가 될 수 있는 유전자의 기본 발현(basal expression)을 막기 위해 개발되었다. 스터디어(Studier, F.) 등의 문헌[1990]의 T7 중합효소 시스템은 T7 프로모터에 절대적으로 선택적이고 특이적인 박테리오파지 T7의 특정 RNA 중합효소에 기초한다. 이 콜라이 숙주의 RNA 중합효소는 이 T7 프로모터를 인식하지 않으므로, T7 중합효소는 1) 예를 들어, λ 박테리오파지 유도체 CE6과 같은 적절한 파지로 배양액을 감염시키는 방법 또는 2) lacUV5/lacI 프로모터 조절하에 염색체상에 삽입된 T7 중합효소를 유도하는 방법에 의해 유도될 때 생성된다.
T7 중합효소 유전자를 포함하는 특정 이 콜라이 숙주 균주 BL21(DE3) 및 HMS174(DE3)는 용균성 λ 박테리오파지 유도체 DE3가 염색체에 삽입되어 구성된다. 실험실에서 종종 사용되는 이러한 시스템은 하기 1) 내지 3)의 이유로 산업상 목적에 덜 적합하다:
1) 단지 제한된 수의 숙주 균주(2개)만이 이용가능한 점,
2) DE3 용원균이 발효기에서 절대적으로 안정하지 않은 점, 및
3) 세포 생육이 유도된 후에 정지되고 따라서 고밀도 세포액으로의 생육이 어렵다는 점.
하기 실시예, 공개공보, 서열 프로토콜(protocol) 및 도면을 참고로 하여 첨부된 특허청구의 범위로부터 유도되는 본 발명의 보호성 범주를 설명하겠다. 기술된 방법은 변형된 후에도 여전히 본 발명의 요지를 기술하는 실시예로서 이해해야 한다.
일반적인 방법
샘브루크(Sambrook, J.) 등의 문헌[In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold, Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약을 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
벡터 pBR322(중복제수) 및 벡터 pUC20(고복제수)의 복제 기원을 본 발명의 복제 기원으로 사용하였다. 이러한 플라스미드의 자가 복제를 위한 최소 DNA 서열은 580 내지 650 bp이다(백만 등의 문헌[1978] 참조).
효모 유전자 TRP1 및 URA3를 선별 표지 유전자로 선택하였다. 테트라사이클린 저항성 유전자를 사용하여 동질 유전자형의 표준 기준 플라스미드를 구성하였다.
실시예
실시예 1
기본 벡터 OripBR-TRP1, OripBR-URA3 및 OripBR-TET의 구성
1.1 기본 벡터 OripBR-TRP1의 구성
플라스미드 OripBR-TRP1은 뮬리스(Mullis, K. B.) 및 팔로나(Faloona, F. A.)의 문헌[1987]의 방법에 따른 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한 2개의 DNA 단편으로 구성하였다. 첫 번째 PCR 반응에서 서트클리프 등의 문헌[1979]에서공개된 바에 따라 bp 위치 2517 내지 3160의 플라스미드 pBR322의 복제 기원을 하기 프라이머 N1(서열번호:1), 프라이머 N2(서열번호:2) 및 주형 DNA로서 pBR322를 사용하여 증폭시켰다:
단일 SfiI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 PCR 프라이머 N1의 5' 말단 돌출 부위를 사용하여 도입시켰고, 단일 XhoI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 PCR 프라이머 N2의 5' 말단 돌출 부위를 사용하여 도입시켰다.
트슘퍼 및 카본(Carbon, J.)의 문헌[1980]에 공개된 바에 따른 bp 위치 22 내지 777의 TRP1 효모 유전자(5' 측위 영역 및 TRP1 구조 유전자)는 하기 프라이머 N3(서열번호:3), 프라이머 N4(서열번호:4) 및 주형 DNA로서 YRP7(코페츠키(Kopetzki, E.) 등의 문헌[1989] 참조)를 사용하여 두 번째 PCR 반응에서 증폭시켰다:
단일 SfiI 절단 부위 및 NotI 절단 부위를 PCR 프라이머 N3의 5' 말단 돌출 부위를 사용하여 도입시켰고, 두 번째 해독 종결 코돈, 위치 1522 내지 1570의 박테리오파지 fd의 fd 전사 종결유전자(벡크 및 진크의 문헌[1981] 참조) 및 2개의 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(MAKHI 및 XhoI)를 PCR 프라이머 N4의 5' 말단 돌출 부위를 사용하여 TRP1 구조 유전자의 암호화 영역의 3' 말단에 도입시켰다.
SfiI 및 XhoI으로 분해된 2개의 PCR 단편을 아가로스(agarose) 겔 전기영동에 의해 정제한 후에 연결시켰다. 이후에, 이 콜라이 K12 균주 JA300(thr, leuB6, thi, thyA, trpC1117, hsrK, HsmK, strR; DSMZ(도이췌 잠룽 푸르 미크로오르가니즘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung fur Mikroorganism und Zellkulturen GmbH) 수탁번호 4776)을 하나한(Hanahan, D.)의 문헌[1983]의 방법에 따른 염화칼슘 방법 또는 피들러(Fiedler, S.) 및 비르트(Wirth, R.)의 문헌[1988]의 프로토콜에 따른 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 상기 단편으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 디프코 캄파니(Difco Company)로부터 구입한 0.5%(중량/부피)의 카사미노산(트립토판을 포함하지 않은 산-가수분해된 카세인)을 포함하는 M9 최소 배지(제조 방법: 샘브루크 등의 문헌[1989] 참조)의 한천 평판에서 선별한 후 액체 배지에서 생육시켰다. 목적하는 플라스미드 OripBR-TRP1(1497 bp)은 제한지도 분석법으로 확인하였다.
1.2 기본 벡터 OripBR-URA3의 구성
플라스미드 OripBR-URA3는 플라스미드 OripBR-TRP1과 같이 2개의 PCR 단편으로 구성하였다. 그러나, URA3 효모 유전자를 TRP1 선별 표지 유전자 대신 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응은 실시예 1.1을 참조한다.
로즈의 문헌[1984]에 공개된 바에 따라 bp 위치 75 내지 1030의 URA3 효모 유전자(5' 측위 영역 및 URA3 구조 유전자)를 하기 프라이머 N5(서열번호:5), 프라이머 N6(서열번호:6) 및 주형 DNA로서 YEp24(보트스테인(Botstein, D.) 등의 문헌[1979] 참조)를 사용하여 두 번째 PCR 반응에서 증폭시켰다:
단일 SfiI 절단 부위 및 NotI 절단 부위를 PCR 프라이머 N5의 5' 말단 돌출 부위를 사용하여 도입시켰고, 두 번째 해독 종결 코돈, 위치 1522 내지 1570의 박테리오파지 fd(안티-네이티브(anti-native) 배향)의 fd 전사 종결유전자(벡크 및 진크의 문헌[1981] 참조) 및 2개의 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(BamHI 및 XhoI)를 PCR 프라이머 N6의 5' 말단 돌출 부위를 사용하여 TRP1 구조 유전자의 암호화 영역의 3' 말단에 도입시켰다.
SfiI 및 XhoI으로 분해된 2개의 PCR 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한 후에 연결시켰다. 이후에, 이 콜라이 K12 균주 CSH28(△lacpro, supF, trp, pyrF, his, strA, thi)(출처: 밀러의 문헌[Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972])을 하나한의 문헌[1983]의 방법에 따른 염화칼슘 방법 또는 피들러 및 비르트의 문헌[1988]의 프로토콜에 따른 일렉트로포레이션에 의해 상기 단편으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 디프코 캄파니로부터 구입한 0.5%(중량/부피)의 카사미노산 및 5㎎/㎖의 트립토판을 포함하는 M9 최소 배지(제조 방법: 샘브루크 등의 문헌[1989] 참조)의 한천 평판에서 선별한 후 액체 배지에서 생육시켰다. 목적하는 플라스미드 OripBR-URA3(1697 bp)는 제한지도 분석법으로 확인하였다.
1.3 항생제-저항성 유전자를 포함하는 기준 벡터 OripBR-TET의 구성
플라스미드 OripBR-TET는 플라스미드 OripBR-TRP1 및 OripBR-URA3와 같이 2개의 PCR 단편으로 구성하였다. 그러나, 플라스미드 pBR322의 테트라사이클린 저항성 유전자(TET)를 TRP1 또는 URA3 선별 표지 유전자 대신 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응은 실시예 1.1을 참조한다.
서트클리프의 문헌[1979]에 공개된 바에 따라 bp 위치 3 내지 1275의 TET 저항성 유전자(프로모터 및 TET 구조 유전자)를 하기 프라이머 N7(서열번호:7), 프라이머 N8(서열번호:8) 및 주형 DNA로서 pBR322(서트클리프의 문헌[1979] 참조)를 사용하여 두 번째 PCR 반응에서 증폭시켰다:
단일 SfiI 절단 부위 및 NotI 절단 부위를 PCR 프라이머 N7의 5' 말단 돌출부위를 사용하여 도입시켰고, 위치 1522 내지 1570의 박테리오파지 fd(안티-네이티브 배향)의 fd 전사 종결유전자(벡크 및 진크의 문헌[1981] 참조) 및 2개의 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(XhoI 및 XbaI)를 PCR 프라이머 N8의 5' 말단 돌출부위를 사용하여 TET 구조 유전자의 암호화 영역의 3' 말단에 도입시켰다.
SfiI 및 XhoI으로 분해된 2개의 PCR 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한 후에 연결시켰다. 이후에, 이 콜라이 K12 균주 JA300(thr, leuB6, thi, thyA, trpC1117, hsrK, HsmK, strR; DSMZ(도이췌 잠룽 푸르 미크로오르가니즘 운트 젤쿨투렌 게엠베하) 수탁번호 4776)을 하나한의 문헌[1983]의 방법에 따른 염화칼슘 방법 또는 피들러 및 비르트의 문헌[1988]의 프로토콜에 따른 일렉트로포레이션에 의해 상기 단편으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 12.5㎍/㎖의 테트라사이클린을 포함하는 LB 완전 배지(제조 방법: 샘브루크 등의 문헌[1989] 참조)(한천 평판)에서 선별한 후 액체 배지에서 생육시켰다. 목적하는 플라스미드 OripBR-TET(2012 bp)는 제한지도 분석법으로 확인하였다.
1.4 플라스미드 OripBR-TRP1, OripBR-URA3 및 OripBR-TET에서 NdeI 절단 부위의 제거
이어서 기본 벡터 OripBR-TRP1, OripBR-URA3 및 OripBR-TET를 연결시키는 중에 절단 부위 NotI과 SfiI 사이의 2개의 PCR 단편으로부터 형성된 바람직하지 않은 NdeI 절단 부위를 NotI/SfiI 뉴클레오티드 어뎁터(adaptor)를 사용하여 제거하였다.
이를 위해, 플라스미드 OripBR-TRP1, OripBR-URA3 및 OripBR-TET를 NotI 및 SfiI으로 분해시키고, 벡터 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 다음 NotI/SfiI 뉴클레오티드 어뎁터로 연결시켰다. 목적하는 플라스미드(NdeI 절단 부위가 제거된)를 제한지도 분석법으로 확인하였다.
NotI/SfiI 어뎁터는 서로 상보성인 올리고뉴클레오티드 N9(서열번호:9) 및 N10(서열번호:10)을 혼성화시켜 제조하였다. 이를 위해, 각각 10nmol의 올리고뉴클레오티드 N9 및 N10을 100㎕의 12.5mmol/ℓ 트리스-HCl(pH 7.0) 및 12.5mmol/ℓ MgCl2에 혼합하고 이 혼합물을 95℃에서 5분간 가열한 다음 실온으로 천천히 냉각시켰다.
NotI/SfiI 어뎁터
실시예 2
원핵세포 발현 카세트의 구성
사용된 발현 카세트(이종 전사 단위)를 하기 1) 내지 4)의 요소로 구성하였다:
1) 조절성 T5-PN25/03/04혼성 프로모터(부자드(Bujard, H.) 등의 문헌[1987]; 스튀버 등의 문헌[1990] 참조),
2) 합성 리보솜 결합 부위 RBSII(스튀버 등의 문헌[1990] 참조),
3) 단일 절단 부위 NdeI, SalI, XmaI, EcoRV 및 CelII를 갖는 다중 클로닝 절단 부위, 및
4) λ-T0 박테리오파지 전사 종결유전자(슈바르츠 등의 문헌[1978] 참조).
T5-PN25/03/04혼성 프로모터(도 3 참조; bp 위치: 1 내지 87)를 EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII 링커(linker)를 사용하여 λ-T0 종결유전자(도 3 참조; bp 위치: 146 내지 241)에 연결시켰다.
발현 카세트는 pDS56/RBSII 플라스미드(스튀버 등의 문헌[1990] 참조)를 재구성하여 수득하였다. 이를 위해, pDS56/RBSII 플라스미드의 유도체를 EcoRI 및 CelII로 분해시키고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제된 EcoRI/CelII-pDS56 벡터 단편을 EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII 링커와 연결시켰다.
EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII 링커는 서로 상보성인 올리고뉴클레오티드 N11(서열번호:11) 및 N12(서열번호:12)를 혼성화시켜 제조하였다. 각각 10nmol의 올리고뉴클레오티드 N11 및 N12를 100㎕의 12.5mmol/ℓ 트리스-HCl(pH 7.0) 및 12.5mmol/ℓ의 MgCl2에 혼합하고 이 혼합물을 95℃에서 5분간 가열한 다음 실온으로 천천히 냉각시켰다.
EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII 링커
목적하는 플라스미드 p16074a를 제한지도 분석법으로 확인하고 발현 카세트는 DNA 서열을 분석하여 조사하였다.
실시예 3
발현 플라스미드 OripBR-TRP1-EK, OripBR-URA3-EK 및 OripBR-TET-EK의 구성
조절성 T5-PN25/03/04혼성 프로모터, 합성 리보솜 결합 부위 RBSII, 단일 절단 부위 NdeI, SalI, XmaI, EcoRV 및 CelII로 이루어진 다중 클로닝 절단 부위 및 λ-T0 종결유전자로 구성된 플라스미드 p16074a의 발현 카세트(도 3 참조)를 PCR에 의해 증폭시키고 플라스미드 OripBR-TRP1, OripBR-URA3 및 OripBR-TET로 삽입시켰다.
3.1 발현 플라스미드 OripBR-TRP1-EK의 구성
발현 카세트(도 3 참조)를 프라이머 N13(서열번호:13), 하기 프라이머 N14(서열번호:14) 및 주형 DNA로서 플라스미드 p16074a를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
단일 BamHI 절단 부위를 PCR 프라이머 N14에 의해 발현 카세트의 3' 말단(λ-T0 종결유전자)에 도입시켰다.
PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamHI으로 분해시키고 약 255 bp 길이의 XhoI/BamHI 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 후에 약 1490 bp 길이의 XhoI/BamHI-OripBR-TRP1 벡터 단편과 연결시켰다(실시예 2 참조). 목적하는 플라스미드 OripBR-TRP1-EK(1728 bp)를 제한지도 분석법으로 확인하였고, PCR에 의해증폭된 발현 카세트의 서열은 DNA 서열을 분석하여 확인하였다.
3.2 발현 플라스미드 OripBR-URA3-EK의 구성
발현 플라스미드 OripBR-URA3-EK(1928 bp)를 플라스미드 OripBR-TRP1-EK와 유사하게 제조하였다. 그러나, 기본 벡터 OripBR-URA3를 기본 벡터 OripBR-TRP1을 대신하여 사용하였다.
3.3 기준 플라스미드 OripBR-TET-EK의 구성
발현 카세트(도 3 참조)를 프라이머 N13(서열번호:13), 하기 프라이머 N15(서열번호:15) 및 주형 DNA로서 플라스미드 p16074a를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
단일 XbaI 절단 부위를 PCR 프라이머 N15에 의해 발현 카세트(λ-T0 종결유전자)의 3' 말단에 도입시켰다.
PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 XbaI로 분해시키고 약 255 bp 길이의 XhoI/XbaI 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 후에 약 2000 bp 길이의 XhoI/XbaI-OripBR-TET 벡터 단편과 연결시켰다(실시예 2 참조). 목적하는 플라스미드 OripBR-TET-EK(2243 bp)를 제한지도 분석법으로 확인하였고, PCR에 의해 증폭된 발현 카세트의 서열은 DNA 서열을 분석하여 확인하였다.
실시예 4
발현 플라스미드 OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK 및 OripUC-TET-EK의 구성
중복제수 플라스미드 pBR322의 복제 기원을 고복제수 pUC 플라스미드의 복제 기원으로 치환시켜 플라스미드 OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK 및 OripUC-TET-EK를 구성하였다.
이를 위해, pUC 복제 기원을 프라이머 N1(서열번호:1), 프라이머 N2(서열번호:2)(실시예 1 참조) 및 주형 DNA로서 플라스미드 pUC20를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. SfiI 및 NotI으로 분해된 약 650 bp 길이의 SfiI/NotI-pUC 복제 기원 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 후에 상응하는 벡터 단편 SfiI/NotI-OripBR-TRP1-EK, SfiI/NotI-OripBR-URA3-EK 및 SfiI/NotI-OripBR-TET-EK에 연결시켰다. 목적하는 플라스미드 OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK 및 OripUC-TET-EK를 증가된 플라스미드 복제수에 기초하여 확인하였다(표준 제조 후에 플라스미드 수율이 3 내지 5배 증가하였다).
실시예 5
인터페론(IFN)-α2b 발현 플라스미드의 구성
5.1 인터페론-α2b 모델 유전자의 합성
발현 벡터를 이종으로 발현되어야 하는 모델 유전자로서 인터페론-α2b 유전자(신호 서열이 없는 Met-IFN-α2b 구조 유전자)를 사용하여 플라스미드 안정성 및 IFN-α2b 합성에 대해 시험하였다.
화학적으로 제조된 Met-IFN-α2b 구조 유전자는 성숙한 IFN-α2b에 대해 인덱스 노미늄(Index Nominum)(국제 약명부(International Drug Directory) 1992/1993)에 수록된 아미노산 서열에 기초한다. Met-IFN-α2b 구조 유전자는 추가로 ATG 개시 코돈을 포함한다. 합성 리보솜 RBSII 결합 부위 및 단일 EcoRI 절단 부위는 Met-IFN-α2b 구조 유전자의 5' 말단에서 업스트림(upstream)에 위치한다(스튀버 등의 문헌[1990] 참조). 이 콜라이에서 바람직하게 사용되는 코돈(이 콜라이 코돈 사용범위(codon usage))을 Met-IFN-α2b 유전자의 유전자 설계도에서 고려하였다. 또한 적절한 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(EcoRI 및 HindIII)를 다양한 유전자를 구성하고 Met-IFN-α2b DNA 분획을 재클로닝하기 위해 암호화 영역내 Met-IFN-α2b 구조 유전자의 말단에 도입시켰다.
IFN-α2b 유전자(RBSII-Met-IFN-α2b 유전자)는 화학 합성법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 지노시스(Genosys) 회사(영국 캠브리지 소재의 지노시스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies Inc.))에서 제조되었다. 이중-스트랜드 RBSII-Met-IFN-α2b 유전자를 올리고뉴클레오티드의 어닐링(annealing) 및 연결에 의해 조합하고 이어서 스트래타진(Stratagene) 회사(독일 하이델베르크 소재의 스트래타진 게엠베하(Stratagene GmbH))로부터 구입한 이 콜라이 표준 벡터 pBluescriptSK(+)의 EcoRI 및 HindIII 절단 부위에 클로닝시켰다. 클로닝된 RBSII-Met-IFN-α2b 구조 유전자의 미리 결정된 DNA 서열을 DNA 서열을 분석하여 확인하였다. 이어서 약 535 bp 길이의 EcoRI/HindIII-RBSII-Met-IFN-α2b 분획을 EcoRI 및 HindIII로 분해된 pDS56/RBSII 플라스미드에 재클로닝시켰다(pDS-IFN). 이러한 방식으로 RBSII-Met-IFN-α2b 유전자를 약 540 bp 길이의 EcoRI/CelII-RBSII-Met-IFN-α2b 분획의 형태로 제조할 수 있다.
5.2 IFN-α2b 발현 플라스미드의 구성
RBSII-Met-IFN-α2b 유전자를 약 540 bp 길이의 EcoRI/CElII-RBSII-Met-IFN-α2b 단편 형태의 플라스미드 pDS-IFN으로부터 단리한 다음 EcoRI 및 CelII로 분해된 플라스미드 OripBR-TRP1-EK, OripBR-URA3-EK, OripBR-TET-EK, OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK 및 OripUC-TET-EK 각각에 연결시켰다. 목적한 플라스미드 OripBR-TRP1-EK-IFN, OripBR-URA3-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN, OripUC-TRP1-EK-IFN, OripUC-URA3-EK-IFN 및 OripUC-TET-EK-IFN을 제한지도 분석법에 의해 확인하였다.
실시예 6
비복귀성 trpC 및 pyrF 이 콜라이 숙주 균주의 구성
목적한 영양요구성 표지 trpC 또는 pyrF의 전체 유전자 또는 더 큰 유전자 분획을 해밀톤 등의 문헌[1989]의 방법에 따른 상동 재조합에 의해 지향성 제거시킴으로써 상기 표지를 이미 사용중인 실험실 균주에 도입시켰다.
6.1 결손 플라스미드의 구성
6.1.1 결손 플라스미드 pMAK705-trpD/B의 구성
전체 염색체 trpC 유전자(1355 bp)를 제거하기 위해, 700 내지 800 bp의 5' 측위 영역(trpD) 및 700 내지 800 bp의 3' 측위 영역(trpB)을 PCR로 각각 클로닝하고, 이것을 PCR 프라이머에 의해 도입된 공통 절단 부위(NotI)를 사용하여 직접 융합(trpD/B)의 형태로 벡터 pMAK705내에 연결시켰다(해밀톤 등의 문헌[1989] 참조). 이 콜라이의 트립토판 오페론의 DNA 서열은 야노프스키 등의 문헌[1981]에 공개되어 있다.
trpC 유전자의 5' 측위 영역(trpD)을 하기 프라이머 N16(서열번호:16), 프라이머 N17(서열번호:17) 및 주형으로서 이 콜라이 염색체 DNA를 사용하여 증폭시켰다:
단일 BamHI 절단 부위를 프라이머 N16에 의해 5' 말단에 도입시키고, 프라이머 N17에 의해 단일 NotI 절단 부위를 증폭된 trpD 분획의 3' 말단에 도입시켰다.
trpC 유전자의 3' 측위 영역(trpB)을 하기 프라이머 N18(서열번호:18), 프라이머 N19(서열번호:19) 및 주형으로서 이 콜라이 염색체 DNA를 사용하여 증폭시켰다:
단일 NotI 절단 부위를 프라이머 N18에 의해 5' 말단에 도입시키고, 프라이머 N19에 의해 단일 SpHI 절단 부위를 증폭된 trpB 분획의 3' 말단에 도입시켰다.
trpD PCR 단편을 BamHI 및 NotI으로 분해하고(약 710 bp), trpB PCR 단편을 NotI 및 SpHI으로 분해하였다(약 820 bp). 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 후에, DNA 단편을 공통된 NotI 절단 부위에 의해 직접 융합 형태로 3개의 단편을 연결시켜 약 5650 bp 길이의 BamHI/SpHI-pMAK705 벡터 단편에 연결시켰다. 목적한 플라스미드 pMAK705-trpD/B(7104 bp)를 제한지도 분석법으로 확인하고 PCR에 의해 증폭된 trpD/B 서열을 DNA 서열을 분석하여 확인하였다.
6.1.2 결손 플라스미드 pMAK705-△pyrF의 구성
염색체 pyrF 유전자의 암호화 영역으로부터 약 260 bp를 제거하기 위해, pyrF의 700 내지 800 bp의 측위 영역을 PCR로 각각 클로닝하고 PCR 프라이머에 의해 도입된 공통 절단 부위(XbaI)를 사용하여 직접 융합(△pyrF)의 형태로 벡터 pMAK705내에 연결시켰다. 이 콜라이의 pyrF 오페론의 DNA 서열은 턴보우(Turnbough, C. L. Jr) 등의 문헌[1987]에 공개되어 있다. △pyrF 유전자의 5' 측위 영역을 하기 프라이머 N20(서열번호:20), 프라이머 N21(서열번호:21) 및 주형으로서 이 콜라이 염색체 DNA를 사용하여 증폭시켰다:
단일 BamHI 절단 부위를 프라이머 N20에 의해 5' 말단에 도입시키고, 프라이머 N21에 의해 단일 XbaI 절단 부위를 증폭된 DNA 단편의 3' 말단에 도입시켰다.
△pyrF 유전자의 3' 측위 영역을 하기 프라이머 N22(서열번호:22), 프라이머 N23(서열번호:23) 및 주형으로서 이 콜라이 염색체 DNA를 사용하여 증폭시켰다:
단일 XbaI 절단 부위를 프라이머 N22에 의해 5' 말단에 도입시키고, 프라이머 N23에 의해 단일 SpHI 절단 부위를 증폭된 DNA 단편의 3' 말단에 도입시켰다.
△pyrF의 5' 측위 단편을 BamHI 및 XbaI으로 분해하고(약 600 bp), △pyrF의 3' 측위 단편을 XbaI 및 SpHI으로 분해하였다(약 690 bp). 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 후에, DNA 단편을 공통된 XbaI 절단 부위에 의해 직접 융합 형태로 3개의 단편을 연결시켜 약 5650 bp 길이의 BamHI/SpHI-pMAK705 벡터 단편에 연결시켰다. 목적한 플라스미드 pMAK705-△pyrF(6788 bp)를 제한지도 분석법으로 확인하고 PCR에 의해 증폭된 pyrF 서열을 DNA 서열을 분석하여 확인하였다.
6.2 이 콜라이 결손 돌연변이주의 단리
벡터 pMAK705는 44℃에서 불활성인 온도-감수성 복제 기원(pSC101의 복제 기원)을 갖고 클로람페니콜 저항성 유전자를 갖는 특징을 갖는다. 염색체 유전자를 제거하기 위해, 적절한 pMAK705 플라스미드 유도체로 목적한 이 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 플라스미드와 이 콜라이 염색체 사이의 상동 재조합의 필수조건은 재조합-컴피턴트 이 콜라이 균주(recA+유전형)이다. 유전형이 recA-인 균주는 상동 재조합을 일으킬 수 없으므로 부적절하다.
이 콜라이 K12 균주 UT5600(ara, proC-14, leuB6, azi-6, lacY1, tsx-67, entA403, trpE38+, rpsL109, xyl-5, mtl-1, thi-1, △ompT)(그로트베르크(Grodberg, J.) 및 던(Dunn, J. J.)의 문헌[1988] 참조)을 플라스미드 pMAK705-trpD/B 및 플라스미드 pMAK705-△pyrF로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 첨가한 후에, 형질전환 제조물을 얼음에서 30분간, 37℃에서 5분간(열 쇼크(shock)) 및 30℃에서 30분간 항온처리하였다. 형질전환 제조물을 20㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유한 3㎖의 LB 배지에 옮기고 이 세포를 하룻밤 동안 배양하였다.
플라스미드가 함께 삽입된 균주, 즉 상동 재조합에 의해 플라스미드가 염색체내로 삽입된 세포를 선별하기 위해, 하룻밤 동안 배양한 배양액의 10-5희석액 300㎕를 20㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유한 LB 한천 평판배지에 도말하였다. 한천 평판배지를 항온기에서 50 내지 60℃에서 초기 가온시키고, 세포를 도말한 후에 즉시 정확히 44℃에서 배양하였다. pMAK705 플라스미드는 이 온도에서 복제되지 않으므로, 단지 염색체상으로 삽입된 플라스미드를 갖는 콜로니 세포만이 생육한다. 이어서 함께 삽입된 콜로니를 정제하기 위해 44℃에서 20㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유한 LB 한천 평판배지에서 2 내지 3회 계대배양하였다(희석식 도말).
함께 삽입된 균주를 파괴하고 염색체로부터 해체된 플라스미드를 회복시키기 위해, 정제된 함께 삽입된 클론을 30℃에서 클로람페니콜이 없는 LB 배지에서 수회(2 내지 6회) 계대배양하였다. 이후에, 세포를 LB 배지에서 희석시켜 분리하고 목적하는 유전형인지에 대해 시험하였다.
6.2.1 결손 돌연변이주 UT5600(△trpC)의 특성 분석
LB 배지에서 희석시켜 분리된 세포/클론을 트립토판(50㎎/㎖)이 존재하는 배지(0.5% 카사미노산이 함유된 M9 최소 배지) 및 트립토판이 존재하지 않는 배지(0.5% 카사미노산이 함유된 M9 최소 배지)에 도말하여 목적하는 trp 영양요구성에 대해 분석하였다. 또한 클로람페니콜(20㎍/㎖)이 존재하는 LB 배지 및 클로람페니콜이 존재하지 않는 LB 배지에 클론을 도말하여 클로람페니콜 감수성을 조사하였다. 또한 초기 균주와 결손 돌연변이주를 PCR 프라이머 N1, 프라이머 N4 및 주형 DNA로서 상응하는 염색체 DNA를 사용하여 비교 PCR 분석법을 수행하여 염색체 trpC 결손을 확인하였다. 초기 균주의 PCR 생성물은 이론적으로 계산하 바와 같이 약 2900 bp 길이인데 반해, trpC 결손 돌연변이주의 PCR 생성물은 약 1430 bp 길이이었다.
6.2.2 결손 돌연변이주 UT5600(△pyrF)의 특성 분석
LB 배지에서 희석시켜 분리된 세포/클론을 우라실(20㎎/㎖)이 존재하는 배지(0.5% 카사미노산이 함유된 M9 최소 배지) 및 우라실이 존재하지 않는 배지(0.5% 카사미노산이 함유된 M9 최소 배지)에 도말하여 목적하는 pyrF 영양요구성에 대해 분석하였다. 또한 클로람페니콜(20㎍/㎖)이 존재하는 LB 배지 및 클로람페니콜이 존재하지 않는 LB 배지에 클론을 도말하여 클로람페니콜 감수성을 조사하였다. 또한 초기 균주와 결손 돌연변이주를 PCR 프라이머 N1, 프라이머 N6 및 주형 DNA로서 상응하는 염색체 DNA를 사용하여 비교 PCR 분석법을 수행하여 염색체 pyrF 결손을 확인하였다. 초기 균주의 PCR 생성물은 이론적으로 계산하 바와 같이 약 1550 bp 길이인데 반해, pyrF 결손 돌연변이주의 PCR 생성물은 약 1290 bp 길이이었다.
실시예 7
이종 모델 유전자(IFN-α2b)의 발현
항생제를 첨가하지 않고 영양요구성을 보완하여 선별되는 신규한 숙주/벡터 시스템을 이종으로 발현되어야 하는 모델 유전자로서 인터페론-α2b를 사용하여 그의 작용성과 성능을 평가하였다.
7.1 trpC 영양요구성의 보완에 의한 선별
IFN-α2b 유전자를 발현시키기 위해, 이 콜라이 K12 균주 UT5600(△trpC)(실시예 6 참조)을 실시예 5에 기술된 발현 플라스미드 OripBR-TRP1-EK-IFN, OripUC-TRP1-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN 및 OripUC-TET-EK-IFN 각각으로 형질전환시켰다. 형질전환된 UT5600(△trpC)/OripBR-TRP1-EK-IFN 및 UT5600(△trpC)/OripUC-TRP1-EK-IFN 세포는 0.5% 카사미노산(디프코 제품)이 함유된 M9 최소 배지에서, 기준 세포 UT5600(△trpC)/OripBR-TET-EK-IFN 및 UT5600(△trpC)/OripUC-TET-EK-IFN은 50mg/㎖의 트립토판, 12.5㎍/㎖의 테트라사이클린 및 0.5% 카사미노산(디프코 제품)이 함유된 M9 최소 배지에서, 모두 37℃에서 쉐이킹(shaking)하에 550㎚에서의 광학 밀도(OD550)가 0.6 내지 0.9가 될 때까지 생육시킨 후, IPTG(최종 농도 1 내지 5mmol/ℓ)로 유도하였다. 37℃에서 4 내지 8시간의 유도상 후에, 세포를 원심분리(소르발(Sorvall) RC-5B 원심분리기, GS3 회전자, 6000rpm, 15분)하여 회수하고, 50mmol/ℓ의 트리스-HCl 완충액(pH 7.2)으로 세척한 다음 이후 공정에 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다.
7.2 pyrF 영양요구성의 보완에 의한 선별
IFN-α2b 유전자를 발현시키기 위해, 이 콜라이 K12 균주 UT5600(△pyrF)(실시예 6 참조)을 실시예 5에 기술된 발현 플라스미드 OripBR-URA3-EK-IFN, OripUC-URA3-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN 및 OripUC-TET-EK-IFN 각각으로 형질전환시켰다. 형질전환된 UT5600(△pyrF)/OripBR-URA3-EK-IFN 및 UT5600(△pyrF)/OripUC-URA3-EK-IFN 세포는 0.5% 카사미노산(디프코 제품)이 함유된 M9 최소 배지에서, 기준 세포 UT5600(△pyrF)/OripBR-TET-EK-IFN 및 UT5600(△pyrF)/OripUC-TET-EK-IFN은 20㎎/㎖의 우라실, 12.5㎍/㎖의 테트라사이클린 및 0.5% 카사미노산(디프코 제품)이 함유된 M9 최소 배지에서, 모두 37℃에서 쉐이킹하에 550㎚에서의 광학 밀도(OD550)가 0.6 내지 0.9가 될 때까지 생육시킨 후, IPTG(최종 농도 1 내지 5mmol/ℓ)로 유도하였다. 37℃에서 4 내지 8시간의 유도상 후에, 세포를 원심분리(소르발 RC-5B 원심분리기, GS3 회전자, 6000rpm, 15분)하여 회수하고, 50mmol/ℓ의 트리스-HCl 완충액(pH 7.2)으로 세척한 다음 이후 공정에 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다.
7.3 표준 시스템에서의 발현 분석
IFN-α2b의 합성은 발현 플라스미드 OripBR-TRP1-EK-IFN, OripUC-TRP1-EK-IFN, OripBR-URA3-EK-IFN, OripUC-URA3-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN 및 OripUC-TET-EK-IFN으로 형질전환된 UT5600(△trpC) 세포 또는 UT5600(△pyrF) 세포에서 분석하였다. 이를 위해, 3 OD550단위(1 OD550=OD5501에 해당하는 1㎖의 세포 현탁액)의 배양 배지를 원심분리하여 수득한 세포 펠렛(pellet)을 0.25㎖의 10mmol/ℓ 트리스-HCl(pH 7.2)에 재현탁시키고 세포를 브란손 캄파니(Branson Company)(독일 하이젠스탐 소재)로부터 구입한 소니피어(Sonifier, 등록상표) 세포 파괴기 B15를 사용하여 초음파 처리하여(50% 강도로 30초간 2 펄스(pulse)) 세포용해시켰다. 불용성 세포 성분을 침강시키고(에펜도르프(Eppendorf) 5415 원심분리기, 14000rpm, 5분), 상청액을 1/5 부피의 5×SDS 샘플 완충액(1×SDS 샘플 완충액: 50mmol/ℓ 트리스-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 1% 메르캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루)과 혼합하였다. 불용성 세포 찌꺼기 분획(펠렛)을 6 내지 8M 우레아를 함유한 0.3㎖의 1×SDS 샘플 완충액에 재현탁시키고 샘플을 95℃에서 5분간 항온처리한 다음 다시 원심분리하였다. 이어서 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)(래믈리(Laemmli, U. K.)의 문헌[1970] 참조)으로 분리하고 코오마시에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R 염료로 염색하였다.
합성된 IFN-α2b 단백질은 동종이었고 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(inclusion body, IB)의 형태로 불용성 세포 찌꺼기 분획에서 대량으로 발견되었다. 발현 수율은 모든 클론/세포에서 측정 정확도의 범주내에서 나타났고 총 이 콜라이 단백질에 대해 30 내지 50%이었다.
실시예 8
플라스미드의 안정성 조사
세포를 유도하기 전에 샘플을 취하여(실시예 7 참조) 플라스미드 안정성 시험을 행하였다. 이를 위해, 샘플을 직접 0.5% 카사미노산이 함유된 M9 최소 배지에 희석하고 각 희석 단계의 30㎕를 비선별적 한천 평판배지(0.5% 카사미노산, 50㎎/㎖의 트립토판 및 20㎎/㎖의 우라실이 보충된 M9 최소 배지)에 도말하였다. 이어서 각 클론으로부터 400개의 개별 콜로니를 우선 적절한 선별적 한천 평판배지(0.5% 카사미노산이 함유된 M9 최소 배지 또는 0.5% 카사미노산, 50㎎/㎖ 트립토판, 20㎎/㎖ 우라실 및 12.5㎍/㎖의 테트라사이클린이 함유된 M9 최소 배지)에 이쑤시개로 찍어서 도말하고 그다음 비선별적 한천 평판배지(0.5% 카사미노산, 50㎎/㎖의 트립토판 및 20㎎/㎖의 우라실이 보충된 M9 최소 배지)에 이쑤시개로 찍어서 도말하였다.
플라스미드-함유 세포의 수는 선별적 및 비선별적 한천 평판배지 모두에서 콜로니를 형성한 세포의 수를 세어 결정하였다. 선별적 한천 평판배지에서 생육하지 않는 세포는 영양요구성을 보완하는 플라스미드 또는 항생제-저항성을 형성하는 플라스미드(TET 기준 플라스미드)를 손실한 세포이다. 세포를 유도하기 전에, 플라스미드 안정성은 선별 방법 및 플라스미드 유형에 상관없이 모든 세포액에서 100%이었다.
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본 발명에 의해, 항생제를 첨가할 필요없이 영양요구성을 보완하여 선별될 수 있는 신규한 원핵세포(특히, 이 콜라이) 숙주/벡터 시스템을 수득할 수 있다.

Claims (17)

  1. (a) 원핵세포 복제 기원;
    (b) 진핵세포 프로모터(promoter)의 조절하에 영양요구성 원핵세포의 생존에 필요한 산물을 합성하는데 요구되는 효소를 암호화하는 하나 이상의 진핵세포 영양요구성 표지 유전자;
    (c) 원핵세포 프로모터의 직접적인 조절을 받아 mRNA가 생성되는 외부 유전자; 및
    (d) 하나 이상의 전사 종결유전자
    를 포함하고, 숙주 세포 서열의 연속된 염기쌍을 50개 이하로 포함하는, 숙주 세포에서 사용하기 위한 원핵세포 발현 벡터.
  2. 삭제
  3. 숙주 세포 서열의 연속된 염기쌍을 50개 이하로 포함하고, 추가로 (a) 원핵세포 복제 기원, (b) 진핵세포 프로모터의 조절하에 영양요구성 원핵세포의 생존에 필요한 산물을 합성하는데 요구되는 효소를 암호화하는 하나 이상의 진핵세포 영양요구성 표지 유전자, 및 (c) 하나 이상의 전사 종결유전자를 포함하는 원핵세포 발현 벡터에서 원핵세포 프로모터의 직접적인 조절하에 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시킴을 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    리보솜 결합 부위 및 다중 클로닝(cloning) 부위를 추가로 포함하는 원핵세포 발현 벡터.
  5. 제 1 항에 있어서,
    영양요구성 표지 유전자 및 외부 유전자가 반대 방향으로 배향되고, 전사 종결유전자가 상기 영양요구성 표지 유전자 및 외부 유전자 사이에 배치되어 양 유전자의 전사를 종결시키는 원핵세포 발현 벡터.
  6. 제 1 항에 있어서,
    영양요구성 표지 유전자가 효모 유전자인 원핵세포 발현 벡터.
  7. 제 5 항에 있어서,
    영양요구성 표지 유전자가 효모 유전자인 원핵세포 발현 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    영양요구성 표지 유전자가 URA3 또는 TRP1인 원핵세포 발현 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    영양요구성 표지 유전자가 URA3 또는 TRP1 유전자의 5' 측위 영역(flanking region)으로부터 발현되는 원핵세포 발현 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서,
    원핵세포 프로모터가 T5-PN25/03/04인 원핵세포 발현 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서,
    전사 종결유전자가 박테리오파지 fd 또는 λ-T0으로부터 유래한 원핵세포 발현 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서,
    복제 기원이 pBR 또는 pUC 플라스미드로부터 유래한 원핵세포 발현 벡터.
  13. 제 1 항의 원핵세포 발현 벡터를 포함하며, 이 발현 벡터의 영양요구성 표지 유전자에 의해 발현되는 산물을 발현할 수 없도록 1회 이상 돌연변이된 원핵세포 영양요구성 숙주 세포.
  14. 제 13 항에 있어서,
    에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포인 원핵세포 영양요구성 숙주 세포.
  15. 제 14 항에 있어서,
    trpC 유전자 산물 또는 pyrF 유전자 산물중 하나를 생산할 수 없는 원핵세포 영양요구성 숙주 세포.
  16. 제 15 항에 있어서,
    영양요구성 표지 유전자가 URA3 또는 TRP1이고, 영양요구성 표지 유전자와 외부 유전자가 반대 방향으로 배향되어 있으며, 전사 종결유전자가 상기 영양요구성 표지 유전자와 외부 유전자 사이에 배치되어 양 유전자의 전사를 종결시키는 제 1 항의 원핵세포 발현 벡터를 포함하는 원핵세포 영양요구성 숙주 세포.
  17. 제 16 항에 있어서,
    URA3 유전자 산물 또는 TRP1 유전자 산물을 최소 배지상에서 생존하기에는 충분한 양으로 생산하지만, 세포에서 생산되는 단백질 총량의 1.0% 이상을 차지하는 양으로는 생산하지 않는 원핵세포 영양요구성 숙주 세포.
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