CN114846024A - Il-37融合蛋白及其用途 - Google Patents

Il-37融合蛋白及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114846024A
CN114846024A CN202080087413.1A CN202080087413A CN114846024A CN 114846024 A CN114846024 A CN 114846024A CN 202080087413 A CN202080087413 A CN 202080087413A CN 114846024 A CN114846024 A CN 114846024A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
lys
val
pro
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080087413.1A
Other languages
English (en)
Inventor
G·蒂芬塔勒
A·布约泽克
L·拉里维尔
F·舒马赫
A·埃利斯顿
C·诺德
M·诺德
J·惠斯托克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monash University
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
Monash University
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monash University, F Hoffmann La Roche AG filed Critical Monash University
Publication of CN114846024A publication Critical patent/CN114846024A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本发明涉及多肽，特别是包含白介素‑37(IL‑37)的融合蛋白变体及其相关治疗剂和组合物。更具体地，本发明涉及包含突变型IL‑37多肽和抗体Fc区的融合蛋白。与参考IL‑37构建体如野生型IL‑37多肽或IL‑37多肽的突变变体相比，所述融合蛋白的生物物理稳定性如热稳定性可得到改进。还涉及用于治疗炎性疾病或病症的融合多肽变体和组合物。此外，本发明涉及编码此类融合蛋白的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体和宿主细胞。

Description

IL-37融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及多肽，特别是包含白介素-37(IL-37)的融合蛋白变体及其相关治疗剂和组合物。更具体地，本发明涉及包含突变型IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白。还涉及用于治疗炎性疾病或病症的融合多肽变体和组合物。此外，本发明涉及编码此类融合蛋白的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体和宿主细胞。
背景技术
细胞因子的IL-1家族在先天性和适应性免疫中具有独特和广泛的抗炎作用，例如作为抵抗病原微生物和物理损伤/应激的第一防御线。迄今为止，已经鉴定了11个IL-1家族成员，包括七种受体激动剂(IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ)、三种具有拮抗剂活性的配体(IL-1Ra、IL-36Ra和IL-38)和一种相当新重命名的抗炎细胞因子IL-37(Garlanda C,等人Immunity.2013年12月12日；39(6):1003-18；Smith DEJ LeukocBiol.2011年3月；89(3):383-92；Dinarello CA等人Blood.2011；117:3720-3732v)。
IL-37，最初称为IL-1家族成员7(IL-1F7)，是2000年通过计算克隆发现的IL-1家族的第七个成员，并且在2010年被重命名(Dinarello C,等人Nat Immunol.2010年11月；11(11):973)。IL-37具有五种不同的同种型，包括IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d和IL-37e(Boraschi D等人Eur Cytokine Netw.2011年9月；22(3):127-47；Tete S,等人Int JImmunopathol Pharmacol.2012年1月-3月；25(1):31-8)。
所有的IL-1家族成员都具有相似的桶状结构并与Ig样受体结合。人IL-37基因位于2号染色体上，长度为3,617kb，包括六个编码17-26KDa蛋白的外显子。IL-37具有约17-25kDa的分子量。IL-37的结构由12条β管状线组成(Boraschi D等人Eur CytokineNetw.2011年9月；22(3):127-47)。IL-37基因经历选择性剪接；已经鉴定了IL-37的五种不同的剪接变体，称为IL-37a-e，其中IL-37b是最大的(218个氨基酸)且被最多表征的同种型。未成熟IL-37前体肽的每种同种型在表达过程中通过半胱天冬酶-1的切割从无活性的前体肽状态转变为活性状态，并且所有亚型彼此调节形成相对稳定的状态。例如，IL-37b具有最大的分子量(218个氨基酸)，具有最复杂的生物学功能，并且IL-37b在半胱天冬酶-1的作用下从无活性的前肽转变为有活性的成熟肽(Boraschi D等人Eur Cytokine Netw.2011年9月；22(3):127-47；Busfield S.J.,Comrack C.A.,Yu G.,等人Genomics.2000；66(2):213-216)。具体地，由IL-37b编码的转录变体含有外显子1和2并具有N末端前结构域，其包括潜在的半胱天冬酶-1切割位点，导致IL-37b前体被剪接成成熟的IL-37b(Boraschi D,等人Eur Cytokine Netw.2011年9月；22(3):127-47；Ye L,Huang Z Oncotarget.2015年9月8日；6(26):21775-6)。此外，IL-37b还编码外显子4-6，其含有形成IL-1样β三叶式二级结构所必需的12条推定的β链(Boraschi D,等人Eur Cytokine Netw.2011年9月；22(3):127-47；Murzin AG,Lesk AM,Chothia C J Mol Biol.1992年1月20日；223(2):531-43)。
此外，IL-37可在多种正常细胞和组织，特别是人组织中检测到，包括自然杀伤(NK)细胞、经刺激的B细胞、单核细胞、皮肤角质形成细胞、上皮细胞、淋巴结、胸腺、肺、结肠、子宫和骨髓，但在健康人组织中表达水平低(Nold MF等人Nat Immunol.2010年11月；11(11):1014-22；Boraschi D等人Eur Cytokine Netw.2011年9月；22(3):127-47)。然而，一些IL-37同种型以组织特异性方式表达。脑仅表达IL-37a，肾脏仅表达IL-37b，心脏仅表达IL-37c，骨髓和睾丸仅表达IL-37d。IL-37b最初在骨髓中发现，并且还主要在血细胞(如外周血单个核细胞(PBMC))、上皮细胞、树突状细胞、单核细胞和角质形成细胞以及呼吸道和胃肠道中发现(Chen等人J.Trans.Med.2015；Li Y,Wang Y,Liu Y,Wang Y,Zuo X,Li Y,LuX Mediators Inflamm.2014；2014():136329)。此外，在人细胞系如A431、THP-1、U937、IMTLH、KG-1、HL60、HPBMC、HFcolitis、PT-4、和NHDC中检测到IL-37表达(Gao W.,等人TheJournal of Immunology.2003；170(1):107-113)。
据估计，IL-37易位至细胞核并在细胞内与细胞外位点之间重新分布，从而影响细胞应答(Li Y,Wang Y,Liu Y,Wang Y,Zuo X,Li Y,Lu X Mediators Inflamm.2014；2014():136329)。
因此，IL-37可以分泌到外部以结合表面受体，此外，IL-37也可以分泌到细胞内。就此而论，由于已经显示IL-37在人细胞和组织中以低水平表达，但是被包括几种toll样受体(TLR)激动剂、IL-18、干扰素(IFN)γ、IL-1b、转化生长因子β1和肿瘤坏死因子(TNF)的炎性刺激物和前细胞因子上调，因此有新的证据表明IL-37可以通过细胞内和细胞外途径发挥抗炎作用。例如，IL-37可通过与IL-18受体α和IL-1R8(Sigirr)的相互作用在细胞膜处和通过与Smad3的相互作用在细胞内引发信号传导。IL-18是一种促炎细胞因子，其可诱导T细胞增殖和分化，促进和维持Th17细胞分泌IL-17，并促进基于Th17细胞的细胞免疫应答。IL-37可与IL-18Rα结合，以与IL-18BP(IL-18的天然拮抗剂)形成复合物，以增强IL-18BP对IL-18的抑制作用，从而降低IL-18的活性以及Th1细胞、NK细胞和IFN-γ的水平(Kumar S.,等人Cytokine.2002；18(2):61-71；Moretti S.等人PLoS Pathogens.2014；10(11)；Nold M.,等人Biochemical Pharmacology.2003；66(3):505-510)。
鉴于上文，IL-37已被证明是由促炎细胞因子如IL-1β和TNF经由它们的受体以及Toll样受体配体介导的免疫应答的生理抑制剂，并且在由感染或其他非感染性攻击触发的炎症中具有广泛的保护作用(Nold MF等人Nat Immunol.2010年11月；11(11):1014-22；Tete S,等人Int J Immunopathol Pharmacol.2012年1月-3月；25(1):31-8)。因此，IL-37可能通过减少由Toll样受体(TLR)激动剂诱导的促炎细胞因子的产生而可以抑制先天性免疫应答，例如IL-37可以减少促炎细胞因子(如IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ)以及趋化因子(如MIP-2/CXCL2、CCL12/MCP-5和BCA-1/CXCL13)的产生。它还可抑制M-GSF和GM-CSF的表达，但增加TGF-β1的产生，TGF-β1被认为是免疫抑制因子。因此，总之，IL-37通过与IL-18受体结合而起作用，并需要IL-1家族诱饵受体IL-1R8来发挥其抗炎功能。已经表明，被IL-37减少的促炎细胞因子(TNF-α、IL-1α、IL-1β、IFN-γ)可以在实验性自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病或实验性自身免疫性糖尿病发生中起关键作用，这可表明IL-37与这些疾病的生物学和潜在治疗相关性(Li S,等人；Proc Natl Acad Sci USA；2015；第2497-2502页)。因此，IL-37已作为慢性炎性和自身免疫性障碍以及还有癌症中免疫应答的天然抑制剂而被研究。在这方面，已经证明IL-37在多种疾病中表达并发挥抗炎作用，所述疾病包括黑素瘤、类风湿性关节炎、急性冠脉综合征、病态肥胖症、接触性超敏反应、特应性皮炎、肝脏炎性损伤、系统性红斑狼疮(SLE)和IBD等(LiY,Wang Z,Yu T,Chen B,Zhang J,Huang K,Huang Z PLoS One.2014；9(9):e107183)。在体外，IL-37已被证明有效消除促炎细胞因子在包括PBMC的几种细胞类型中的表达。在体内，在小鼠模型中IL-37减少炎症反应和脑缺血、心肌缺血/再灌注损伤、银屑病和哮喘的临床症状(Chen等人J.Trans.Med.2015)。总之，这些数据表明IL-37在不同疾病中的复杂生物学功能，其中IL-37在自身免疫病中的表达似乎降低过度的炎性免疫应答。
此外，IL-37在保护身体免受内毒素性休克、缺血再灌注损伤和心血管疾病中起作用。此外，IL-37具有潜在的抗肿瘤作用。因此，IL-37可作为肿瘤研究、诊断和治疗的靶标。在此情境下，IL-37在非小细胞肺癌小鼠模型中显示抗肿瘤作用(Ge G.,Wang A.,Yang J.,等人Journal of Experimental&Clinical Cancer Research.2016；35)。与对照组相比，稳定表达IL-37的转染小鼠显示肿瘤生长速度、微血管密度、以及VGEF和CD34的表达水平显著降低，并且IL-37治疗还显著抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长和血管生成。推测IL-37可抑制肿瘤血管生成并因此在肿瘤抑制中起作用。IL-37还显示在肾细胞癌和宫颈癌中对肿瘤细胞的抑制作用(Jiang Y,等人Med Oncol.2015年11月；32(11):250；Wang S.,An W.,Yao Y.,等人Journal of Cancer.2015；6(10):962-969)。这些研究表明，IL-37可通过抑制STAT3表达和磷酸化来抑制肿瘤细胞迁移、增殖并诱导细胞凋亡。
总之，作为新型抗炎抑制剂，IL-37在免疫应答中起重要作用，抵抗炎性疾病和自身免疫病，使得该细胞因子可以成为诊断和治疗癌症、炎性疾病和自身免疫病的新靶标。
发明内容
诸位发明人开发了包含突变型IL-37多肽和抗体Fc区的新型IL-37融合蛋白。此外，诸位发明人出人意料地发现可以产生所述IL-37融合蛋白，其中IL-37多肽的氨基酸序列包含在氨基酸位置181处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸；在氨基酸位置183处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸；以及在氨基酸位置207处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸。优选地，IL-37多肽的氨基酸序列在氨基酸位置181、183和207处包含丝氨酸残基。所述IL-37融合蛋白可在哺乳动物细胞系如HEK293细胞中稳定表达，并可以以高产物产率产生。例如，所述IL-37融合蛋白的氨基酸序列可包含氨基酸46至218。另外，与野生型IL-37和/或IL-37多肽的已知突变变体相比，如本文所述和所附实施例中说明的融合蛋白具有改善的特性，如增加的抗炎活性。作为另一个例子，如本文所述的融合蛋白具有以较高产物产率产生的能力，同时保持已知IL-37构建体(如野生型IL-37和/或IL-37多肽的已知突变变体)的效力。与参考IL-37多肽(如野生型IL-37或IL-37多肽的已知突变变体)相比，这种效力可包括抗炎活性和/或生物物理稳定性(如热稳定性)。如本文所述和本领域已知的参考IL-37构建体和/或多肽可包括但不限于WO 2016/201503和WO 2018/175403中所述的那些。特别地，这些参考IL-37构建体和/或多肽可以包含突变变体或野生型多肽和/或构建体，如融合构建体。
特别地，诸位发明人发现如本文所述的融合蛋白可在有需要的受试者，如患有炎性疾病或病症的患者中诱导抗炎反应。换句话说，如本文所述的融合蛋白可诱导足以治疗有需要的受试者(如患有炎性疾病或病症的患者)的抗炎反应。他们进一步发现，与包含IL-37的蛋白质如野生型IL-37多肽相比，所述融合蛋白可以以高产率产生。因此，如本文所述的融合蛋白可用作疾病(如炎性疾病或病症)的治疗性治疗，并且可以以高产率产生。例如，与包含IL-37的已知蛋白如野生型IL-37多肽的产物产率相比，可实现本发明融合蛋白的更高产物产率。
因此，本发明涉及包含IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白，其中IL-37多肽的氨基酸序列包含在氨基酸位置181处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸；
在氨基酸位置183处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸；以及
在氨基酸位置207处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸。
优选地，融合蛋白在氨基酸位置181、183和207处包含丝氨酸。
优选地，融合蛋白是抗炎融合蛋白。
优选地，融合蛋白的IL-37多肽是同种型A或同种型B，更优选同种型B。
优选地，融合蛋白的IL-37多肽的氨基酸序列包含氨基酸46至218。
优选地，融合蛋白的IL-37多肽与SEQ ID NO.1具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％，优选至少95％、96％、97％或98％，更优选至少95％或96％，甚至更优选至少96％的序列同一性。
优选地，与野生型IL-37多肽相比，融合蛋白的IL-37多肽还包含额外的二硫桥。更优选地，融合蛋白的额外的二硫桥在IL-37多肽的两个半胱氨酸之间形成，并且其中所述半胱氨酸中的一个是半胱氨酸的取代突变，优选在位置169处。
优选地，融合蛋白的抗体Fc区是IgG更优选IgG1的Fc区。
优选地，融合蛋白的IL-37多肽在C末端与Fc区融合。可替代地，融合蛋白的IL-37多肽在C末端经由接头与Fc区融合。
优选地，融合蛋白的Fc区包含两个重链片段，更优选所述重链的CH2和CH3结构域。
优选地，融合蛋白的IL-37多肽还包含在氨基酸位置119处的异亮氨酸和/或在氨基酸位置178处的选自苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和甘氨酸的氨基酸。
优选地，其中融合蛋白的IL-37多肽不包含位于位置71至74、78、80、83至88和184处的任何氨基酸的突变。可替代地，融合蛋白的IL-37多肽包含位于选自位置71至74、78、80、83至88和184的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸的突变。
优选地，融合蛋白的IL-37多肽的氨基酸序列包含位于氨基酸位置85处的丙氨酸。
本发明还涉及包含融合蛋白的药物组合物。
优选地，融合蛋白或包含融合蛋白的药物组合物还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
优选地，融合蛋白或包含融合蛋白的药物组合物用于治疗或预防炎性疾病或病症。更优选地，炎性疾病或病症选自炎性肠病；红斑狼疮；关节炎；优选类风湿性关节炎；银屑病、过敏性鼻炎；格雷夫斯病；强直性脊柱炎；缺血再灌注损伤，优选选自心肌梗塞和中风；哮喘；牙周炎；糖尿病和代谢综合征；癌症，优选实体癌类型以及动脉粥样硬化和白塞氏病。甚至更优选地，炎性疾病或病症是炎性肠病。
本发明还涉及核酸分子、包含编码融合蛋白的核酸分子的载体和细胞。
同样地，本发明涉及一种治疗或预防患者的炎性疾病或病症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的融合蛋白或包含融合蛋白的药物组合物。
具体实施方式
将理解，本文公开和限定的本发明扩展至所提到或从文本或附图中明显的两个或更多个单独特征的全部替代性组合。所有这些不同的组合构成本发明的各种替代方面。本文提及的所有专利和出版物通过引用以其整体并入。
除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。在本说明书和实施方案通篇中，将理解词语“包含(comprise)”或者变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”暗示包括所述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
与以前用于产生IL-37融合蛋白的方法相比，本发明的特点是对IL-37多肽的较小修饰的作用，其产生具有改进特性的IL-37融合蛋白。例如，与野生型IL-37(即天然存在的或内源表达的IL-37)相比，如下文所述的融合蛋白可展现出增加的抗炎活性。另外，与野生型IL-37(即天然存在的或内源表达的IL-37)相比，本发明的融合蛋白可以以更高的产率产生。特别地，本发明的融合蛋白可以以更高的产率产生，同时至少保持野生型IL-37的抗炎活性。换句话说，本发明的融合蛋白可以是具有野生型IL-37的至少一种生物化学或生物物理活性的蛋白，例如，它可以结合白介素18受体(IL-18R1/IL-1Rrp)，并且可以是所述白介素18受体的配体。它也可结合白介素18结合蛋白(IL-18BP)(一种白介素18(IL-18)的抑制性结合蛋白)并随后与IL-18受体β链形成复合物，通过该复合物可抑制IL-18的活性。IL-37的其他生物化学或生物物理活性包括与IL-1R8(Sigirr)结合、阻断人或鼠免疫细胞中由广谱炎性攻击触发的促炎但非抗炎细胞因子(包括TLR配体、IFNγ、TNF和IL-1β)的产生、抑制树突状细胞的激活(减少CD86和MHC II的表面表达)、触发细胞内激酶的调节的特定模式(包括mTOR、MAPK和NF-κΒ途径的阻断)和诱导抗炎激酶(如Mer和PTEN)。如上所解释，与参考IL-37构建体如野生型IL-37多肽或IL-37多肽的突变变体相比，如本文所述的融合蛋白具有改进的生物物理稳定性。生物物理稳定性可以包括生物物理特性的稳定性，如但不限于热稳定性、热容量、聚集状态、溶解度、pH稳定性、对化学变性的抗性和/或对蛋白水解降解的抗性。因此，如本文所述和如所附实施例中所展示，与参考IL-37构建体如野生型IL-37多肽或如上下文所述的IL-37多肽的突变变体相比，融合蛋白具有改进的生物物理稳定性，如改进的热稳定性。换句话说，与参考IL-37构建体如IL-37多肽的野生型或突变变体相比，融合蛋白的热稳定性增加。如本文所用的热稳定性可指对变性剂诱导的解折叠的抗性增加和对热诱导的解折叠的抗性增加。
融合蛋白的高生物物理稳定性如热稳定性可导致重组系统中的高表达产率并且可能是重要的，因为其可与高溶解度相关联，因此使融合蛋白能够以高浓度有效地配制成药物。同样出于治疗目的，高生物物理稳定性如热稳定性对于避免融合蛋白在各种制造步骤(包括表达和纯化)期间和在储存期间聚集可能是重要的。因此，避免聚集对于使融合蛋白的药物生产工艺的经济可行性最大化是重要的。最后，同样出于治疗目的，高生物物理稳定性如热稳定性对于在患者和疾病模型二者中均获得长的融合蛋白半衰期是重要的。
例如，与参考IL-37构建体如IL-37多肽的野生型或突变变体相比，如本文所述的融合蛋白的聚集可减少。作为另一个例子，如本文所述的融合蛋白的聚集可减少，同时保持参考IL-37构建体(如IL-37多肽的野生型或突变变体)的热稳定性。作为又另一个例子，与参考IL-37构建体如IL-37多肽的野生型或突变变体相比，如本文所述的融合蛋白的聚集可减少，同时增加热稳定性。
因此，本发明涉及包含IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白，其中IL-37多肽的氨基酸序列包含在氨基酸位置181处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸，在氨基酸位置183处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸，以及在氨基酸位置207处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基。最优选地，IL-37多肽的氨基酸序列在氨基酸位置181、183和207处包含丝氨酸残基。本发明针对由融合蛋白或其组合物诱导的抗炎反应，并因此针对用于治疗需要这种治疗的受试者的炎性疾病或病症的融合蛋白或其组合物。因此，在本发明的上下文中优选的是，在目前用融合蛋白或其组合物治疗受试者的情况下，融合蛋白或其组合物在受试者中诱导抗炎反应。
本发明的方法可用于治疗需要这种治疗的受试者的疾病。例如，所述方法可用于向受试者施用治疗有效量的融合蛋白或其组合物。所述方法也可用于预防疾病，例如通过向受试者施用治疗有效量的融合蛋白或其组合物。药剂(例如，药物配制品)的“有效量”或“治疗有效量”是指在必要的剂量下并且持续必要的时间有效实现所需治疗或预防结果的量。
在本发明的上下文中，“融合蛋白”涉及由来自不同来源的多肽部分组成的蛋白质。因此，它也可以理解为“嵌合蛋白”。本发明的融合蛋白是指其中IL-37多肽直接或间接连接至抗体Fc区(如IgG Fc区)的融合蛋白。例如，融合蛋白包含与人IgG Fc区连接的人IL-37多肽。作为另一个例子，融合蛋白包含与人IgG1 Fc区连接的人IL-37多肽。前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL-37多肽在C末端与Fc区融合。
通常，融合蛋白是通过连接最初编码单独蛋白的两个或更多个基因(或优选cDNA)产生的蛋白。该融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单一多肽，优选具有源自每种原始蛋白质的功能特性。重组融合蛋白通过重组DNA技术人工产生，以用于生物研究或治疗。本发明的融合蛋白还可以通过与另一部分缀合或融合而被修饰，以促进纯化或增加融合蛋白的体内半衰期。本文考虑的修饰包括但不限于侧链修饰、在多肽合成期间掺入非天然氨基酸和/或其衍生物、以及使用交联剂和对本发明的多肽施加构象限制的其他方法。例如，本发明的融合蛋白可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白连接等进行修饰。
本发明的融合蛋白通常是抗炎融合蛋白。在此情境下，“白介素-37”或“IL-37”是指白介素1细胞因子(IL-1)家族的成员，并且主要是抗炎细胞因子，其减少全身和局部炎症。表达由几种toll样受体(TLR)配体和促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α、IFN-γ高度诱导。IL-37也称为白介素-37(FIL1ζ；IL-1ζ；IL-1F7b(IL-1H4、IL-1H、IL-1RP1)；IL-1X蛋白；IL1F7(规范产品IL-1F7b)；白介素1家族成员7；白介素1ζ；白介素-1同源物4；白介素-1超家族z；白介素-1相关蛋白和白介素-23)。本发明的多肽的抗炎特性可通过本文所述的任何方法，特别是实施例中所述的方法测定。
IL-37具有与IL-18显著的序列相似性并在炎症组织中高度表达，抑制过度的炎症反应。换句话说，IL-37是通过将细胞因子平衡从过度炎症中转移出来的有效的先天免疫抑制剂。在此情境下，IL-37可以结合白介素18受体(IL-18R)，并且可以是白介素18受体(IL-18R)的配体。该细胞因子还结合白介素18结合蛋白(IL18BP)(一种白介素18(IL18)的抑制性结合蛋白)并随后与IL18受体β亚基形成复合物，通过该复合物抑制IL18的活性。本发明的融合蛋白可结合IL-18R，可导致IL-18R下游信号传导。如本发明上下文中所用的融合蛋白能够结合IL-18R并能够导致IL-18R下游信号传导。本发明的融合蛋白的功能和/或活性可通过本领域已知的方法测定，包括而不限于ELISA和配体-受体结合测定。除非另有说明，否则如本文所用的术语“IL-37”或“IL-37多肽”或“IL-37蛋白”广泛指来自任何哺乳动物来源的任何天然IL-37，包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的IL-37以及由细胞中的加工产生的任何形式的IL-37。例如，本发明涵盖全长IL-37和成熟形式二者，其中IL-37通过在表达期间半胱天冬酶-1的切割从无活性前体状态转化为活性状态。所述术语还涵盖天然存在的IL-37变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性IL-37的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。如本文所用，所述包含SEQ ID NO.:1的IL-37多肽，如包含氨基酸46至218的IL-37多肽的氨基酸序列，可以指野生型IL-37多肽。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
已经报道了编码IL-37的五种不同同种型的五种选择性剪接的转录物变体。值得注意的是，IL-37的同种型B的氨基酸53至206的序列与IL-37的同种型A的氨基酸27至181的序列相同。如本文所用，IL-37可以是IL-37的任何同种型，如IL37a-e的任何同种型。在本发明的上下文中，IL-37是IL-37的同种型A或B，优选IL-37的同种型B。
在本发明的上下文中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是人工化学模拟物或相应的天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。因此，在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及包含通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的链或由所述链组成的分子。肽键是当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成的共价化学键。本文中“多肽”不限于具有确定长度的分子。因此，本文术语“多肽”涉及包含氨基酸链的肽、寡肽、蛋白质或多肽，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。然而，本文中术语“多肽”还涵盖此类蛋白质/多肽的肽模拟物，其中一个或多个氨基酸和/或一个或多个肽键已被功能性类似物替代。术语多肽还指但不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此类修饰在本领域中有充分描述。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号表示。
“抗体”是指各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即，构成所述群体的各抗体是相同的和/或结合相同表位，但是例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体抗体除外，此类变体通常以少量存在)获得的抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，所述多种技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。“多特异性抗体”是对至少两个不同位点(即不同抗原上的不同表位或同一抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))以及“杵臼结构(knob-in-hole)”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168和Atwell等人,J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过工程化静电转向效应来制备，以制备抗体Fc-异二聚体分子(参见例如WO 2009/089004)或交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science,229:81(1985))。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)、和从抗体片段形成的多特异性抗体。
所述术语还涉及人抗体(特别是重组人抗体)、异源抗体和异源杂合抗体。“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或者源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。特别地，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人序列抗体，如从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体；使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组组合人抗体文库分离的抗体、或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。因此，此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，可将此类抗体进行体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，从而尽管重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列源自人种系VH和VL序列且与其相关，但是重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为可能不是天然存在于体内人抗体种系库内的序列。
一般而言，抗体可以源自对动物进行免疫，或源自重组抗体文库，包括基于已经在计算机上设计并由合成产生的核酸编码的氨基酸序列的抗体文库。例如，通过分析人序列的数据库并利用由此获得的数据设计多肽序列来实现抗体序列的计算机设计。例如，用于设计和获得计算机创建的序列的方法描述于Knappik等人,J.Mol.Biol.(2000)296:57；Krebs等人,J.Immunol.Methods.(2001)254:67；以及授予Knappik等人的美国专利号6,300,064中。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。换句话说，Fc区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。在本发明的上下文中，Fc区包含两个重链片段，优选所述重链的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
在一些方面，融合蛋白不展现出任何效应子功能或任何可检测的效应子功能。“效应子功能”或“效应子活性”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型的变化而变化。抗体效应子功能的例子包括：C 1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；和CytoTox
Figure BDA0003696441660000081
非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康辛州)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中披露的动物模型中)评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定，以证实所述抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929 Al)。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297的至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。例如，抗体变体可包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，所述取代例如在Fc区的位置234和235处的取代(残基的EU编号)。例如，取代是L234A和L235A(LALA)(参见例如WO2012/130831)。此外，可在Fc区中进行改变，所述改变导致改变(即，减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在一些方面，Fc区包括补体(C1q)和/或Fcγ受体(FcγR)结合位点的突变。在一些方面，此类突变可使融合蛋白不能产生抗体定向细胞毒性(ADCC)和补体定向细胞毒性(CDC)。如本发明上下文中使用的Fc区不触发细胞毒性，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
术语“Fc区”还包括天然序列Fc区和变体Fc区。Fc区可包括重链的羧基末端。宿主细胞产生的抗体可经历从重链的C末端一个或多个氨基酸，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子而产生的抗体可包括全长重链，或可包括全长重链的切割变体。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所描述。可以考虑抗体Fc区的氨基酸序列变体。抗体Fc区的氨基酸序列变体可以通过在编码所述抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体Fc区的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需特征，例如诱导或支持抗炎反应。
将IL-37融合至抗体的Fc区可产生对IL-37的生产力具有有益影响的构建体。特别地，将IL-37融合至抗体的Fc区可产生与参考(如野生型或突变型IL-37多肽或构建体)相比具有提高的生产力的构建体。另一方面，将IL-37融合至抗体的Fc区可产生对IL-37的生产力具有有益影响，同时保持已知的IL-37构建体和本领域已知的融合蛋白的效力的构建体。换句话说，与参考(如野生型或突变型IL-37多肽或构建体)相比，将IL-37融合至抗体的Fc区可提高IL-37的生产力，同时保持已知的IL-37构建体和本领域已知的融合蛋白的效力。如本文所用的关于本发明融合蛋白的术语“效力”是指融合蛋白结合IL-18R和/或激活下游IL-18R的能力。特别地，本发明的融合蛋白的效力是指如本文上下文所述的抗炎活性。可以在受体结合测定或基于细胞的结合测定中评估效力。效力可与参考IL-37多肽如野生型IL-37多肽比较。
如本文所用，术语“生产力”是指在给定体积内形成的蛋白质(如本文所述的融合蛋白)的量(例如mg产物/ml)。如本文所用的术语“量”是指蛋白质的产物产量，例如如本文所述的融合蛋白的浓度。因此，“提高蛋白质(如本文所述的融合蛋白)的生产力”是指与相应的参考(如野生型IL-37、突变型IL-37多肽或其构建体)相比，给定体积中蛋白质的量增加。
在一些方面，融合蛋白的产物产量为至少43mg/ml，优选至少186mg/ml。
抗体的Fc区可以是任何类别抗体如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的Fc区。抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些抗体可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。因此，如在本发明的上下文中所使用，抗体可以是IgG的Fc区。例如，抗体的Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3或IgG4的Fc区。在一些方面，本发明的融合蛋白包含抗体Fc区的IgG。在本发明的上下文中，抗体的Fc区是IgG优选IgG1的Fc区。
此外，本文提供的融合蛋白可包含接头(或“间隔物”)。在本发明的上下文中，IL-37多肽经由接头在C末端处与Fc区融合。接头通常是具有多至20个氨基酸的长度的肽。术语“连接至”或“融合至”是指在两个部分之间形成的共价键，例如肽键。因此，在本发明的上下文中，接头可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。例如，本文提供的融合蛋白可包含IL-37多肽与抗体Fc区之间的接头，如Fc区的N末端与IL-37多肽的C末端之间的接头。作为另一个例子，本文提供的融合蛋白可包含IL-37多肽和抗体Fc区之间的接头，如Fc区的C末端和IL-37多肽的N末端之间的接头。特别地，IL-37多肽可经由接头在C末端处与Fc区的N末端融合。此类接头的优点是它们可以使融合蛋白的不同多肽更可能独立地折叠并按预期表现。因此，在本发明的上下文中，IL-37多肽和抗体的Fc区可以包含在单链多功能多肽中。在一些方面，本发明的融合蛋白包括肽接头。在一些方面，肽接头将IL-37多肽与抗体的Fc区连接。在一些方面，肽接头可以包括氨基酸序列Gly-Gly-Ser(GGS)、Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)。在一些方面，肽接头可包含氨基酸序列GGGGS。
已经对一些在哺乳动物细胞中表达的IL-37进行了测序，发现其始于Val46(Pan等人,2001,Cytokine 13:1-7)。还检测到未加工(未切割)的序列。在一些方面，本发明的融合蛋白包括IL-37的片段，例如IL-37多肽的片段，或IL-37同种型的片段。例如，当与全长天然蛋白比较时，此类片段可以在N末端或C末端被截短，或者可以缺少内部残基。某些片段缺少对于本发明的IL-37多肽的所需生物活性不是必需的氨基酸残基。因此，在某些方面，IL-37多肽的片段具有生物活性。
在本发明的上下文中，IL-37多肽的氨基酸序列包含氨基酸46至218。例如，IL-37多肽的氨基酸序列可包含同种型B的氨基酸46至218。作为另一个例子，IL-37多肽的氨基酸序列可包含SEQ ID NO.1的氨基酸46至218。作为再另一个例子，IL-37多肽的氨基酸序列可包含氨基酸21至218，如同种型B的氨基酸21至218。作为再另一个例子，IL-37多肽的氨基酸序列可包含氨基酸21至218，如SEQ ID NO.1的氨基酸21至218。在一些方面，IL-37多肽的氨基酸序列由氨基酸46至218组成。在一些方面，IL-37多肽的氨基酸序列由同种型B的氨基酸46至218组成。在一些方面，IL-37多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO 1的氨基酸46至218组成。
在一些方面，IL-37多肽包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。前述权利要求中任一项所述的抗炎融合蛋白，其中所述IL-37多肽与SEQ ID NO.1具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％，优选至少95％、96％、97％或98％，更优选至少95％或96％，甚至更优选至少96％的序列同一性。然而，应当理解，本发明还考虑了较小的序列变异，如IL-37的插入、缺失、取代，尤其是保守氨基酸取代，这些不会不利地影响IL-37的功能和/或活性。例如，IL-37的天然序列(如SEQ ID NO.1)的变异可使用例如美国专利号5,364,934中所述的保守和非保守突变的任何技术和指南进行。如本文所用的术语“保守取代”是指用具有类似空间特性的天然或非天然存在的氨基酸或肽模拟物替代肽中的天然序列中存在的氨基酸。当待替代的天然氨基酸的侧链呈极性或疏水性时，保守取代应当用也呈极性或疏水性(还具有与被替代的氨基酸的侧链相同的空间特性)的天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或肽模拟物部分进行。
变异可以是编码天然序列或变体IL-37的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，导致其氨基酸序列与相应的天然序列或变体IL-37(如SEQ ID NO 1)相比而言的改变。任选地，变异是通过用天然序列IL-22多肽的一个或多个结构域中的任何其他氨基酸取代至少一个氨基酸。通过将IL-22的序列与同源的已知蛋白质分子的序列进行比较并使高同源性区域中发生的氨基酸序列变化的数目最小化，可以发现关于确定哪个氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而不会不利地影响所需活性方面的指导。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代一种氨基酸的结果，如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。所允许的变异可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并测试所得变体的活性(例如在本领域已知的体外测定中)来确定。
如本文所用，在相当于SEQ ID NO:1中的位置的位置处的氨基酸残基可通过本领域技术人员已知的任何方式确定。例如，将一个或多个序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对，使得本领域技术人员能够确定在相当于SEQ ID NO:1中的位置的位置处的氨基酸。本领域技术人员可以将多肽的三维结构与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的三维结构进行比较，并确定在与SEQ ID NO:1的位置等同的位置处的氨基酸残基。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列和引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比，并且出于比对的目的不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以按本领域技术范围内的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括对所比较序列的全长实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且已将源代码与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)(华盛顿特区(Washington D.C.)20559)，并在美国版权局以美国版权注册号TXU510087进行了注册并描述于WO 2001/007611中。
除非另有说明，出于本文的目的，使用FASTA程序包版本36.3.8c或更高版本的检索程序采用BLOSUM50比较矩阵产生氨基酸序列同一性百分比值。FASTA程序包的作者是W.R.Pe arson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.E nzymol.266:227-258；以及Pearson等人(1997)Genomics 46:24-36，并且可从www.fasta.b ioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi访问的公共服务器可用于使用检索(全局蛋白质:蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)比较序列，以确保执行全局而不是局部比对。氨基酸同一性百分比在输出比对标头中给出。
在本发明的上下文中，与野生型IL-37多肽相比，本发明的融合蛋白可进一步包含额外的二硫桥。换句话说，与野生型IL-37多肽相比，本发明的融合蛋白包含在融合蛋白的第一半胱氨酸残基与所述融合蛋白的第二不同的半胱氨酸之间形成的额外的二硫键。又换句话说，本发明的融合蛋白的IL-37包含第一半胱氨酸和第二半胱氨酸，所述第一半胱氨酸可以通过在所述IL-37中突变而引入，所述第二半胱氨酸可以是IL-37的天然存在的半胱氨酸残基，并且所述第一和所述第二半胱氨酸形成二硫键。例如，二硫桥可与IL-37多肽的位置122处的半胱氨酸形成。例如，所述野生型IL-37多肽可包含SEQ ID NO.:1，如SEQ IDNO.:1的氨基酸46至218。引入非天然二硫桥用于稳定的技术描述于例如WO 94/029350、US5,747,654、Rajagopal,V.,等人,Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Reiter,Y.,等人,Nature Biotechnology 14(1996)1239-1245；Reiter；Y.,等人,Protein Engineering；8(1995)1323-1331；Webber,K.O.,等人Molecular Immunology 32(1995)249-258；Reiter,Y.,等人,Immunity 2(1995)281-287；Reiter,Y.,等人,JBC 269(1994)18327-18331；Reiter,Y.,等人,Inter.J.of Cancer 58(1994)142-149、或Reiter,Y.,Cancer Res.54(1994)2714-2718中。在本发明的一个优选方面，在IL-37多肽的两个半胱氨酸之间形成额外的二硫桥，并且其中所述半胱氨酸之一是半胱氨酸的取代突变，优选在位置169。可以通过本领域技术人员已知的各种方式如通过插入、缺失和/或取代来改变天然氨基酸序列以产生突变多肽。例如，位点特异性突变可以通过将包含修饰位点的合成寡核苷酸连接至表达载体中来引入。可替代地，可使用寡核苷酸定向位点特异性诱变程序，如Walder等人,Gene 42:133(1986)；Bauer等人,Gene 37:73(1985)；Craik,Biotechniques,12-19(1995年1月)；以及美国专利号4,518,584和4,737,462中所披露的。引入突变的优选方式是QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene，拉霍亚，加利福尼亚州)。任何适当的表达载体(例如，如Pouwels等人,Cloning Vectors:A Laboratory Manual(Elsevier,N.Y.:1985)中所述)和相应的合适宿主可用于产生重组多肽。表达宿主包括但不限于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属内的细菌物种，哺乳动物或昆虫宿主细胞系统(包括杆状病毒系统)(例如，如Luckow等人,Bio/Technology 6:47(1988)所述)，和已建立的细胞系如COS-7、C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系等。本领域技术人员知道表达宿主的选择对产生的多肽类型有影响。例如，在酵母或哺乳动物细胞(例如COS-7细胞)中产生的多肽的糖基化将不同于在细菌细胞如大肠杆菌中产生的多肽的糖基化。可替代地，可以使用本领域普通技术人员熟知的标准肽合成技术(例如，如Bodanszky,Principles of Peptide Synthesis(Springer-Verlag,Heidelberg:1984)中概述的)合成本发明的多肽。特别地，可以使用固相合成的程序(参见例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Barany等人,Int.J.Peptide Protein Res.30:705-739(1987)；以及美国专利号5,424,398)合成多肽。如果需要，可以使用自动肽合成仪进行。叔丁氧羰基(t-BOC)或9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸封闭基团的去除和多肽从树脂的分离可以通过例如在降低的温度下进行酸处理来完成。然后可以例如用二甲醚提取含有多肽的混合物以除去非肽有机化合物，并且可以从树脂粉末中提取合成的多肽(例如，用约25％w/v乙酸)。在合成多肽之后，可以任选地进行进一步的纯化(例如，使用高效液相色谱(HPLC))以消除任何不完全的多肽或游离氨基酸。可以对合成的多肽进行氨基酸和/或HPLC分析以验证其身份。对于根据本发明的其他应用，可优选将多肽作为较大融合蛋白的一部分产生(如通过本文所述的方法或其他遗传方式)，或作为较大缀合物的一部分产生(如通过物理或化学缀合)，如本领域普通技术人员已知和本文所述的。
在本发明的一个方面，IL-37多肽还可包含在氨基酸位置119处的异亮氨酸和/或在氨基酸位置178处的选自苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和甘氨酸的氨基酸。
在本发明的一个方面，IL-37多肽不包含位于位置71至74、78、80、83至88和184处的任何氨基酸的突变
在本发明的另一方面，IL-37多肽包含位于选自位置71至74、78、80、83至88和184的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸的突变。在本发明的优选方面，IL-37多肽的氨基酸序列包含位于氨基酸位置85处的丙氨酸。
例如，IL-37多肽可在一个或多个氨基酸处包含突变，如WO2016/201503中所述。例如，在SEQ ID NO:1中的位置71、72、73、74、78、80、83、84、85、86、87、88和/或184处或与其等同的位置处的氨基酸残基可以发生突变。
在此情境下，位于选自位置71至74、78、80、83至88和184的氨基酸位置的一个或多 个氨基酸的突变可以含有相对于在该位置处如在该位置的SEQ ID NO.1中出现的氨基酸而言的非保守取代突变。
如本文所用的短语“非保守取代”或“非保守残基”是指亲本序列中存在的氨基酸被具有不同电化学和/或空间特性的另一种天然或非天然存在的氨基酸替代。因此，取代氨基酸的侧链可显著大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链和/或可具有与被取代的氨基酸显著不同的电子特性的官能团。这种类型的非保守取代的例子包括苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代丙氨酸、异亮氨酸取代甘氨酸、或-NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-取代天冬氨酸。非保守取代包括不认为是保守的任何突变。
非保守氨基酸取代可由以下方面的变化引起：(a)取代区域中氨基酸主链的结构；(b)氨基酸的电荷或疏水性；或(c)氨基酸侧链的体积。通常预期在蛋白质特性方面产生最大变化的取代是如下取代，其中：(a)亲水性残基取代疏水性残基(或被疏水性残基取代)；(b)脯氨酸取代任何其他残基(或被任何其他残基取代)；(c)具有大侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代不具有侧链的残基(例如甘氨酸)(或被不具有侧链的残基取代)；或(d)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰)取代负电性残基(例如谷氨酰或天冬氨酰)(或被负电性残基取代)。
例如，突变可以是用丙氨酸或带相反电荷的氨基酸替代。作为另一个例子，位置85处的氨基酸可以是丙氨酸，位置83处的氨基酸可以是谷氨酸，位置73处的氨基酸可以是丙氨酸和/或位置73处的氨基酸可以是赖氨酸。
本发明的一个方面涉及编码如本文提供的融合蛋白的核酸分子。术语“核酸分子”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由以下构成：碱基，具体为嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))；糖(即脱氧核糖或核糖)；和磷酸基团。通常，核酸分子由碱基序列描述，凭此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常从5'到3'表示。本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式、以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生糖或磷酸骨架连接或化学修饰残基的经修饰核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合于在体外和/或体内(例如在宿主或患者中)直接表达本发明抗体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如，cDNA)或RNA(例如，mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或所编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人,Nature Medicine 2017,2017年6月12日在线发布,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。因此，“编码”选定多肽的核酸序列是当置于适当调节序列的控制下时在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。
本发明的一个方面涉及包含编码如本文提供的融合蛋白的核酸分子的载体。因此，本发明提供了用于预防或治疗炎性疾病或病症的载体，其包含编码本发明多肽的多核苷酸序列。如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。所使用的技术可以在若干熟知的参考文献中的任一个中找到，如：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook,等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)、PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,等人1990.Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚州)、以及Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港，纽约州)。表达载体在分子生物学领域中常规构建，并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子和其他元件，例如可能必需的并且以正确取向定位的聚腺苷酸化信号，以便允许表达本发明的肽。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是清楚的。关于这一点，作为进一步的例子，我们参考Sambrook等人。
本发明的一个方面涉及包含编码如本文提供的融合蛋白的核酸分子的细胞或包含编码如本文提供的融合蛋白的核酸分子的载体。如本文所用，细胞可指宿主细胞。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。转化细胞包括瞬时或稳定转化细胞。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。在一些方面，将宿主细胞用外源核酸瞬时转染。在另一方面，将宿主细胞用外源核酸稳定转染。“分离的”融合蛋白是从重组产生融合蛋白的宿主细胞的环境中分离的融合蛋白。在一些方面，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法确定的，将本发明的融合蛋白纯化至大于95％或99％的纯度。对于评估纯度的方法的综述，参见例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
在本发明的上下文中，提供了包含如本文所述的融合蛋白的药物组合物。术语“药物组合物”或“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。此外，在本发明的上下文中，提供了用于治疗或预防患者的炎性疾病或病症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的如本发明上下文中使用的融合蛋白或药物组合物。因此，本发明的方法或用途，或通过本发明的融合蛋白或药物组合物，可用于减少、抑制或预防由其他介质如其他细胞因子(IL-1、IFNγ等)、其他介质(例如补体、白三烯等)以及化学和物理损伤诱导的炎症。
如本文所用，“治疗”(treatment)(及其语法变体，如“治疗”(treat)或“治疗”(treating))是指试图改变所治疗个体的疾病的自然历程的临床干预，并且可以针对预防或在临床病理过程中进行。希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的减轻、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。例如，关于IBD，“治疗”可指发生IBD的可能性降低、发生IBD的速率降低和疾病严重程度的降低。“减轻”(“Alleviation”、“alleviating”)或其等同物是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是改善、预防、减缓(减小)、减少或抑制疾病或病症，例如动脉粥样硬化斑块的形成。需要治疗的患者包括已经患有疾病或病症的患者，以及易于患有疾病或病症的患者，或者疾病或病症有待预防的患者。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，所述个体或受试者是人。
在本发明的一个方面，药物组合物包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。与本发明的组合物结合使用的术语“药学上可接受的”是指这样的组合物的分子实体和其他成分，它们在生理学上是可耐受的并且当施用给哺乳动物(例如人)时通常不产生不良反应。术语“药学上可接受的”还可以意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在哺乳动物体内、更特别地在人体内使用。“药学上可接受的载体”是指药物组合物或配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。此类药学上可接受的载体可以是无菌液体，如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物载体描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”A.R.Gennaro,第20版中。
在本发明的一个方面，药物组合物用于治疗或预防炎性疾病或病症。
如本文可互换使用的“障碍”、“疾病”或“病症”是将受益于用本文所述的组合物(例如药物组合物)，例如包含本发明的融合蛋白的组合物(例如药物组合物)治疗的任何病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患讨论中的障碍的那些病理状态。在一些方面，障碍是IL-37相关障碍。在一些方面，炎性疾病或病症选自炎性肠病；红斑狼疮；关节炎；优选类风湿性关节炎；银屑病、过敏性鼻炎；格雷夫斯病；强直性脊柱炎；缺血再灌注损伤，优选选自心肌梗塞和中风；哮喘；牙周炎；糖尿病和代谢综合征；癌症，优选实体癌类型以及动脉粥样硬化和白塞氏病。在本发明的一个优选方面，炎性疾病或病症是炎性肠病。
如本文可互换使用的术语“炎性肠障碍”、“炎性肠病”和“IBD”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括发病机理涉及肠(包括小肠和结肠)中的复发性炎症的所有疾病和病理病症。IBD包括例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD不限于UC和CD。该疾病的表现包括但不限于炎症和肠道上皮完整性的降低。
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，根据以上提供的一般描述可以实施各种其他实施方案。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和例子的方式详细地描述了前述发明，但是描述和例子不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利文件和科学文献的披露内容明确地通过引用以其整体并入。
实施例
产生期望的基因/蛋白(例如包含一个或多个氨基酸的一个或多个取代突变的IL- 37多肽变体，和包含IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白)
分子生物学方法
如Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)中所述，使用标准方法操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
在Geneart(雷根斯堡，德国)通过化学合成制备所需的基因区段。将合成的基因片段克隆到大肠杆菌质粒中进行增殖/扩增。可替代地，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR组装短合成DNA片段。通过metabion(Planegg-Martinsried，德国)制备相应的寡核苷酸。可替代地，在Twist Bioscience(旧金山，加利福尼亚州，美国)制备含有所需cDNA的完整表达质粒。通过DNA测序验证克隆和/或亚克隆基因片段的所有DNA序列。
为了在HEK293细胞中表达所需基因/蛋白(例如IL-37多肽，其野生型或突变变体，如一个或多个氨基酸的一个或多个取代突变；或融合至例如IgG-Fc的人Fc区(Fc片段)(其野生型或突变变体)的IL-37多肽(其野生型或突变变体))，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自包括内含子A的人巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链可变区信号序列，
-待表达的基因/蛋白(例如IL-37多肽，或包含IL-37多肽和人IgG的人Fc区或其突变变体的融合蛋白)，和
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括待表达的所需基因的表达单元/盒外，基本/标准哺乳动物表达质粒还含有
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
为了在大肠杆菌细胞中表达所需基因/蛋白(例如IL-37多肽，其野生型或突变变体，如一个或多个氨基酸的一个或多个取代突变；或融合至例如IgG-Fc的人Fc区(Fc片段)(其野生型或突变变体)的IL-37多肽(其野生型或突变变体))，使用包含以下功能元件的转录单元：
-T5启动子
-lac操作子
-待表达的基因/蛋白(例如IL-37多肽，或包含IL-37多肽和人IgG的人Fc区或其突变变体的融合蛋白)
-终止子
除了包括待表达的所需基因的表达单元/盒外，基本/标准大肠杆菌表达质粒还含有
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制
-lacI表达盒，以允许目的基因的诱导型表达
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶表达盒
-URA3表达盒，其允许在适当的大肠杆菌菌株中使用互补进行无抗生素表达。
IL-37多肽和包含IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白的产生
重组IL-37多肽由以下组成：i)野生型人IL-37多肽或人IL-37多肽的突变变体(所述突变变体含有特定氨基酸交换)，和任选地用于纯化(例如His-标签、C-标签等)或酶促缀合目的(定位酶-标签)的蛋白质标签。可替代地，IL-37多肽(野生型或突变变体)经由接头序列与IgG的人Fc区(Fc片段)或其突变变体遗传融合。
用于在HEK293细胞中瞬时表达可溶性IL-37多肽或包含IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白的表达质粒除了包含IL-37多肽表达盒外，还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
IL-37多肽的转录单元包含以下功能元件：
-来自包括内含子A的人巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-N末端截短的金黄色葡萄球菌定位酶A编码核酸，和
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
用于在大肠杆菌细胞中表达IL-37多肽的表达质粒除包含IL-37多肽表达盒外还包含来自载体pUC18的复制起点。这允许该质粒在大肠杆菌中复制。此外，它含有在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶表达盒、允许目的基因的诱导型表达的lacI表达盒、和允许在适当的大肠杆菌菌株中使用互补进行无抗生素表达的URA3表达盒。
包含IL-37多肽的突变变体和抗体Fc区的融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)中培养的HEK293细胞(源自人胚肾细胞系293)进行重组生产。可替代地，使用Expi293表达系统(Invitrogen)。为了产生含有抗体Fc区和仅单个IL-37多肽(即单个IL-37部分)的IL-37融合蛋白，使用杵臼结构技术，用含有相应IL-37多肽和抗体Fc单元(即IL-37-Fc单元)的质粒和编码非融合Fc片段(即非融合Fc单元)的第二质粒共转染细胞。转染通过本领域已知并如各自制造商的说明书中所规定的方法进行。转染后三至七(3-7)天收获细胞培养上清液。将上清液储存在降低的温度(例如-80℃)下。
从哺乳动物培养物中纯化IL-37多肽
使用以50mM NaH2PO4、300mM NaCl(pH 7.0)平衡的HiTrap complete His-Tag(Roche，巴塞尔，瑞士)通过亲和色谱捕获含有IL-37多肽的培养上清液。通过用平衡缓冲液洗涤去除未结合的蛋白质。将IL-37多肽用10CV按照至50mM NaH2PO4、300mM NaCl、500mM咪唑(pH 7.0)的梯度进行洗脱。使用Superdex 75TM(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州，美国)上的尺寸排阻色谱作为第二纯化步骤，并合并单体蛋白级分。尺寸排阻色谱在20mMHistidin，140mM NaCl，pH 6.0中进行。通过测量280nm处的光密度(OD)，以320nm处的OD作为背景校正，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定纯化的IL-37多肽的浓度。在变性和还原条件下通过CE-SDS分析IL-37多肽的纯度。使用BioSuiteTM HR分析尺寸排阻柱(Waters，米尔福德，马萨诸塞州，美国)通过SEC测定聚集体含量。将纯化的蛋白质储存在-80℃下。
从哺乳动物培养物中纯化IL-37-Fc融合蛋白
使用以1x PBS(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7,4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)通过亲和色谱捕获含有融合蛋白(包含IL-37多肽和抗体Fc区)的培养上清液。通过用平衡缓冲液洗涤去除未结合的蛋白质，并用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 2.8)洗脱IL-37-Fc融合蛋白，将其立即用2M Tris-碱(pH 9.0)中和至pH6.0。使用Superdex 200TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱作为第二纯化步骤，并合并单体蛋白级分。尺寸排阻色谱在20mM Histidin，140mM NaCl，pH 6.0中进行。通过测量280nm处的光密度(OD)，以320nm处的OD作为背景校正，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定纯化的IL-37-Fc融合蛋白的蛋白浓度。在变性和还原条件下通过CE-SDS分析IL-37-Fc融合蛋白的纯度。使用BioSuiteTM HR分析尺寸排阻柱(Waters)通过SEC测定聚集体含量。将纯化的蛋白质储存在-80℃下。
IL-37多肽的突变变体在大肠杆菌(包涵体)中的表达
为了表达IL-37多肽的突变变体(21kDa)，使用大肠杆菌宿主/载体系统，其使得能够通过大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)的互补来进行无抗生素质粒选择(EP 0 972 838和US6,291,245)。
用表达质粒D1AC9528或D1AC7778通过电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-25(ΔpyrF)。转化的大肠杆菌细胞首先在37℃下在琼脂板上生长。将从该板挑取的菌落转移到3mL滚动培养物中并在37℃下生长至光密度为1-2(在578nm下测量)。然后将1000μl培养物与1000μl无菌86％甘油混合并立即在-80℃下冷冻以长期储存。首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达，并用SDS-Page分析，之后转移到10L发酵罐。
预培养：
对于预培养，将研究种子库安瓿中的1.0ml接种在具有四个挡板的1000ml锥形瓶中的220ml化学成分确定的培养基中。在旋转振荡器上在37℃和170rpm下培养12小时，直到获得>5的光密度(578nm)。接种体积按Vinoc.＝1000mL*5/ODPC计算并且因此取决于预培养的光密度，从而用等量细胞接种每个生物反应器运行的分批培养基。
发酵：
为了在10l Biostat C，DCU3发酵罐(Sartorius，梅尔松根，德国)中发酵，使用化学成分确定的分批培养基。从4.2l无菌分批培养基加上来自预培养的100ml接种物开始，在31℃，pH 6.9±0.2，800mbar背压和10l/min的初始曝气速率下进行分批发酵。通过将搅拌器速度提高到1500rpm，在整个发酵过程中溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。在最初补充的葡萄糖耗尽(由溶解氧值的急剧增加指示)后，发酵在进料开始时进入补料分批模式。进料1的速率以预定的进料曲线在5.5小时内从90g/h逐步增加至最终的210g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，曝气速率在5小时内从10l/min不断增加到20l/min。通过在约120的光密度下添加2.4g IPTG诱导重组蛋白的表达。靶蛋白在细胞质内部分可溶地表达。
培养24小时后，光密度达到250，并将整个肉汤冷却至4℃-8℃。使用流通式离心机(13,000rpm，13l/h)经由离心收获细菌，并将获得的生物质储存在-20℃下直至进一步加工(细胞破碎)。产量为67g干细胞/升。
产物形成分析：
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中取出的样品，一个在诱导前，其他在诱导蛋白质表达后的特定时间点。将来自每个样品的相同量的细胞(OD目标＝10)悬浮在5mL PBS缓冲液中，并通过在冰上超声破碎。然后将100μL各悬浮液离心(15,000rpm，5分钟)，并取出各上清液并转移至单独的小瓶中。这是为了区分可溶性和不溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性蛋白质级分)中添加100μL和向各沉淀(＝不溶性蛋白质级分)中添加200μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。将样品在95℃下在强烈混合下加热15分钟以溶解和还原样品中的所有蛋白质。冷却至室温后，将5μL各样品转移至4％-20％TGX标准免染聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)。另外，应用5μl分子量标准品(Precision Plus Protein Standard，Bio-Rad)。
电泳在200V下运行60分钟，之后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)并用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。通过比较产物条带的体积与分子量标准品的25kDa条带的体积进行蛋白质表达的相对定量。
上清液制备：
用于纯化10L发酵物的上清液制备开始于将收获的细菌细胞重悬浮于破坏缓冲液(50mM NaP，300mM NaCl，1mM DTT，pH 7,0，“完全”蛋白酶抑制剂)中。缓冲液体积是生物质湿重的5倍，重悬浮以在900bar(APV LAB60，通过1次)下进行均质化以破坏细菌。然后将悬浮液离心，并将获得的上清液立即转移到DSP部门进行纯化。
从大肠杆菌培养物中纯化IL-37多肽
将过滤的裂解物加载到在50mM NaH2PO4、300mM NaCl、1mM DTT pH 7.0中平衡的HiTrap cOmplete His-Tag柱(Roche)上。通过用平衡缓冲液洗涤去除未结合的蛋白质。将IL-37多肽用10CV按照至50mM NaH2PO4、300mM NaCl、1mM DTT、250mM咪唑(pH 7.0)的梯度进行洗脱。使用Superdex 75TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱作为精制步骤，并在合并单体蛋白质级分之后进行。尺寸排阻色谱在50mM Tris-碱、150mM NaCl、5mM CaCl2(pH 7.5)中进行。经由280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定纯化的IL-37多肽的浓度。在变性和还原条件下通过CE-SDS分析IL-37蛋白(即，IL-37多肽)的纯度。使用BioSuiteTM HR分析尺寸排阻柱(Waters)通过SEC测定聚集体含量。将纯化的蛋白质储存在-80℃下。
IL-37多肽与抗体Fc区的酶促缀合
将纯化的人Fc转移到缀合缓冲液(50mM Tris-碱，150mM NaCl，5mM CaCl2，pH7.5)中。对于定位酶反应，使用5倍摩尔过量的IL-37多肽和0.8倍摩尔过量的定位酶(Roche)。充分混合后，将反应溶液在25℃下孵育90分钟。缀合后，使用以50mM NaH2PO4、300mM NaCl、1mM DTT pH 7.0平衡的HiTrap complete His-Tag(Roche)运行亲和色谱步骤。在此，将包含IL-37多肽和抗体Fc区的所需融合蛋白(即IL37-Fc缀合物)收集在流通物中。用双蒸水稀释IL37-Fc融合蛋白的合并级分至约3ms/cm的电导率，并加载到用20mMHistidin(pH5.6)平衡的POROS HS 50柱(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马塞诸塞州，美国)上。用20CV按照至20mM Histidin、1M NaCl(pH 5.6)缓冲液的梯度进行洗脱。Superdex 75TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱用作精制步骤。尺寸排阻色谱在20mMHistidin、140mM NaCl(pH 6.0)中运行。经由280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定纯化的IL-37-Fc缀合物(即，融合蛋白)的蛋白浓度。在变性和还原条件下通过CE-SDS分析IL-37融合蛋白的纯度。使用BioSuiteTM HR分析尺寸排阻柱(Waters)通过SEC测定聚集体含量。将纯化的蛋白质储存在-80℃下。
通过质谱证明IL37内二硫键C54-C94
为了检测融合蛋白的闭合二硫键，进行了二硫键作图实验。这里，将待研究的样品变性(6.5M终浓度盐酸胍)和进行S-羧甲基化以加帽游离半胱氨酸。随后，将其缓冲液更换为消化缓冲液(50mM Tris，pH 6.9)，随后进行胰蛋白酶消化(16h，37℃)。用10％甲酸终止反应。通过UHPLC-MS/MS使用与Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific)耦合的nanoAcquity UPLC(Waters)进一步分析样品。对于数据解释和可视化，使用PMI(ProteinMetrics Inc.)和Xcalibur软件包。
通过检测质量为3356.55Da的相应连接的胰蛋白酶肽GEFLLYCDK(C54)和AQVGSWNMLECAAHPGWFIR(C94)，显示融合蛋白的IL37部分中Cys54和Cys94之间形成的二硫键。
体外稳定性测试
对于纯化蛋白(P1AE1164、P1AE1771、P1AE2450、P1AE3281、P1AE4682和P1AF2874)的热稳定性测试，使用Uncle装置(UNCHAINED LABS，波士顿，马萨诸塞州，美国)。在266nm和473nm下的静态光散射和同步固有荧光在此用于测定纯化蛋白质的聚集温度(Tagg)和熔融温度(Tm)。温度以0.1℃/min的步长从30℃升温至90℃。对于每个样品使用具有9μl体积的玻璃比色皿，并且在20mM Histidin、140mM NaCl(pH 6.0)缓冲液中的浓度为1mg/mL。为了分析，使用软件UNcle分析(UNCHAINED LABS)。
为了进行分子评估，将如表1所示的纯化的IL-37多肽和融合蛋白以1.0mg/ml的终浓度转移到两种不同的缓冲液中。缓冲液A：1x PBS(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl.pH 7,4)，缓冲液B：20mM Histidin，140mM NaCl，pH 6.0。对于透析，使用D-TubeTM Dialyzer Mini MWCO 6-8kDa(Millipore，伯灵顿，马萨诸塞州，美国)。缓冲液A样品在37℃孵育，缓冲液B样品在40℃孵育，各14天。孵育后，对于如表1所示的IL-37多肽和融合蛋白，通过SEC使用BioSuiteTM HR分析尺寸排阻柱(Waters)和通过CE-SDS在变性和还原条件下分析。
表1：生物物理稳定性
Figure BDA0003696441660000191
表2：热稳定性
Figure BDA0003696441660000192
*在解折叠后立即聚集。
生物活性测试(HK-2测定)
为了测试IL-37突变变体(P1AE1164、P1AE1771、P1AE2450、P1AE3281、P1AE4682和P1AF2874)对LPS刺激的HK-2细胞的Il-8释放的抑制，将IL-37变体在测定培养基(RPMI培养基1640(Anprotec；目录号AC-LM-0060)+2mM L-谷氨酰胺(L-谷氨酰胺200mM，Gibco，目录号25030-024)+1x ITS(ITS 100x，Sigma，I3146)+0.1％BSA(MACS BSA储备溶液，Miltenyi，130-031-376)中稀释至2.5μM的2倍终浓度。制备1:3阶梯的连续稀释液，并将50μL/孔的IL-37突变变体稀释液转移到96孔测定板中。通过胰蛋白酶消化(胰蛋白酶，PAN，P10-023100)收获细胞并在300g下沉淀5分钟。在测定培养基中重悬浮至4.0E+05个细胞/mL的浓度后，将25μL/孔转移到测定板，得到1.0E+04个细胞/孔的总数。将LPS(Sigma，L2654)在测定培养基中稀释至2μg/mL。将每孔25μL转移到测定板(终浓度0.5μg/mL)并将板在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育过夜。第二天，将板以300g离心3分钟。收集上清液并根据制造商的说明书通过人IL-8未包被ELISA试剂盒(人IL-8未包被ELISA试剂盒，Invitrogen，88-8086-22)测定IL-8浓度。
表3：HK-2细胞中的生物活性
Figure BDA0003696441660000193
生物活性测试(人PBMC)
用IL-37的不同突变变体(P1AE1164、P1AE2450、P1AE3281和P1AE1771)处理来自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)，如Nold M.,等人(2003)[IL-18BPa:Fc cooperateswith immunosuppressive drugs in human whole blood.Biochem Pharmacol 66,505-510]和Ellisdon,Nold-Petry等人,(2017)[Science Immunology第2卷,第8期,eaaj1548]所述。简言之，通过密度梯度离心从健康志愿者的外周静脉血中分离PBMC，如Nold M.,等人(2003)[IL-18BPa:Fc cooperates with immunosuppressive drugs in human wholeblood.Biochem Pharmacol 66,505-510]所述。将PBMC在含有1％v/v人血清和1:500MycoZap PR(Lonza)的RPMI培养基中铺板为3个重复，然后用媒介物或突变变体IL-37(浓度为10ng/ml至1pg/ml之间)预处理30min，然后用1ng/ml LPS刺激20h。然后根据制造商的说明书通过Alphalisa(Perkin Elmer)对上清液进行IL-1β分析。计算单独健康供体反应者经受LPS后，IL-1β被IL-37抑制的变化％。
图3示出用LPS刺激后从新鲜分离的人PBMC分泌IL-1β(IL-1β)受到抑制。在添加1ng/ml LPS之前30min以指定浓度添加IL-37变体，并在20h后测量细胞因子时分泌的IL-1β(IL-1β)的量减少约20％。这表明测试变体的抗炎活性。
生物活性测试(人PBMC)
用IL-37变体P1AE4682处理来自健康供体或患者(呼吸系统疾病RESP、系统性红斑狼疮、SLE、类风湿性关节炎RA、炎性肠病IBD)的外周血单个核细胞(PBMC)，如Nold M.,等人(2003)[IL-18BPa:Fc cooperates with immunosuppressive drugs in human wholeblood.Biochem Pharmacol 66,505-510]和Ellisdon,Nold-Petry等人,(2017)ScienceImmunology第2卷,第8期,eaaj1548]所述。简言之，通过密度梯度离心从患者或健康志愿者的外周静脉血中分离PBMC，如Nold M.,等人(2003)[IL-18BPa:Fc cooperates withimmunosuppressive drugs in human whole blood.Biochem Pharmacol 66,505-510]所述。将PBMC在含有1％v/v人血清和1:500MycoZap PR(Lonza)的RPMI培养基中铺板为3个重复，然后用媒介物或变体IL-37(浓度为100pg/ml至0.01pg/ml)预处理30min，然后用500μM洛索立宾刺激20h。然后根据制造商的说明书通过Alphalisa(Perkin Elmer)对上清液进行IL-6分析。计算单独健康供体反应者和患者经受洛索立宾后，IL-6被IL-37抑制的变化％。
图4示出用洛索立宾刺激后从新鲜分离的人健康供体和患者来源的PBMC分泌IL-6受到抑制。在添加500μM洛索立宾之前30min以指定浓度添加稳定的IL-37-Fc融合物，并在20h后测量细胞因子时分泌的IL-6的量减少约20％-25％。这表明所测试的变体在以下各种疾病中的抗炎活性：RESP(呼吸系统疾病)、SLE(系统性红斑狼疮)、RA(类风湿性关节炎)、IBD(炎性肠病)。
生物活性测试(C57Bl/6WT小鼠)
对C57Bl/6WT小鼠皮下(s.c.)注射不同浓度的P1AE3281-005、P1AE1771-016、P1AE4682或媒介物。一小时后，小鼠通过尾静脉注射接受100mg/kg洛索立宾(Jomar liferesearch)。连续监测室温和湿度。
注射洛索立宾后两小时，将小鼠麻醉，并通过将心脏放血至BD血清管中获得血清。根据制造商的说明书，通过Alphalisa(Perkin Elmer)测定血清鼠IL-6并且通过ELISA(Perkin Elmer)测定IFNα。
图5A和图5B示出用洛索立宾刺激后C57Bl/6WT小鼠中IL-6分泌受到抑制。以指定浓度皮下注射各种IL-37-Fc融合物，随后以100mg/kg的浓度注射洛索立宾。2h后血清IL-6降低40％-70％表明所测试的变体的强抗炎活性。
表4：序列概述
Figure BDA0003696441660000211
Figure BDA0003696441660000221
Figure BDA0003696441660000231
Figure BDA0003696441660000241
Figure BDA0003696441660000251
Figure BDA0003696441660000261
Figure BDA0003696441660000271
Figure BDA0003696441660000281
Figure BDA0003696441660000291
Figure BDA0003696441660000301
Figure BDA0003696441660000311
附图说明
图1：SS连接的肽GEFLLYCDK和AQVGSWNMLECAAHPGWFIR的提取离子计数色谱图。在电荷态2、3、4和5下检测连接的肽，在60.7min处洗脱。
图2：SS连接的肽GEFLLYCDK和AQVGSWNMLECAAHPGWFIR在电荷态5下的同位素模式。
图3：在健康人PBMC中的活性。
图4：在健康和患者来源的人PBMC中的活性。
图5A和图5B：在C57Bl/6WT小鼠中的活性。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
莫纳什大学
<120> IL-37融合蛋白及其用途
<130> AC2584 PCT S3
<150> EP 19 21 8657.5
<151> 2019-12-20
<160> 45
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wt IL-37
<400> 1
Met Ser Phe Val Gly Glu Asn Ser Gly Val Lys Met Gly Ser Glu Asp
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Gly Ser
20 25 30
Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Thr Met Asn Phe Val His Thr
35 40 45
Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp
50 55 60
Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val
65 70 75 80
Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser
85 90 95
Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly
100 105 110
Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln
115 120 125
Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala
130 135 140
Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln
145 150 155 160
Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe
165 170 175
Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys
180 185 190
Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys
195 200 205
Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
210 215
<210> 2
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有His-标签和C-标签的wt IL-37 (46-218)
<400> 2
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala
180 185
<210> 3
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wt IL-37 (46-218)
<400> 3
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
165 170
<210> 4
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端融合至在两个重链上的人Fc的人IL-37 (46-218)；含有切割位点以释放IL37
<400> 4
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
210 215 220
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
260 265 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
275 280 285
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435
<210> 5
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端融合至在两条重链上的人Fc的人IL-37 (46-218)；含有切割位点以释放IL37
<400> 5
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser His His His His His His Glu Pro Glu Ala Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
210 215 220
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
260 265 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
275 280 285
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435
<210> 6
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端融合至仅在一条HC上的人Fc的wt IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 7
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端融合至仅在一条HC上的人Fc的wt IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 7
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端融合至仅在一条HC上的人Fc的wt IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端融合至仅在一条HC上的人Fc的wt IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro
245 250 255
Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp
260 265 270
Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu
275 280 285
Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys
290 295 300
Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys
325 330 335
Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro
340 345 350
Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser
355 360 365
Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu
370 375 380
Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe
385 390 395 400
Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser
405 410 415
Asp
<210> 10
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端融合至仅在一条HC上的人Fc的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 11
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端融合至仅在一条HC上的人Fc的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 11
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端融合至仅在一条HC上的人Fc的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 13
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端融合至仅在一条HC上的人Fc的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218) (KiH)
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro
245 250 255
Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp
260 265 270
Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu
275 280 285
Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys
290 295 300
Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys
325 330 335
Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro
340 345 350
Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser
355 360 365
Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu
370 375 380
Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe
385 390 395 400
Ser Phe Gln Pro Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser
405 410 415
Asp
<210> 14
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N末端定位酶标签的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 14
Met Gly Gly Gly Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro
1 5 10 15
Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp
20 25 30
Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu
35 40 45
Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys
50 55 60
Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr
65 70 75 80
Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro
100 105 110
Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser
115 120 125
Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu
130 135 140
Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe
145 150 155 160
Ser Phe Gln Pro Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Glu Pro Glu Ala
180
<210> 15
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C末端定位酶标签的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 15
Met Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe
1 5 10 15
Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn
20 25 30
Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro
50 55 60
Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys
65 70 75 80
Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu
85 90 95
Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe
100 105 110
Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His
115 120 125
Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly
130 135 140
Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln
145 150 155 160
Pro Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly His His His His His His
180 185 190
<210> 16
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 定位酶缀合至来自HEK的人Fc (P1AD9547)的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 16
Met Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe
1 5 10 15
Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn
20 25 30
Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro
50 55 60
Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys
65 70 75 80
Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu
85 90 95
Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe
100 105 110
Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His
115 120 125
Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly
130 135 140
Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln
145 150 155 160
Pro Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Leu Pro Glu Thr Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
180 185 190
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
195 200 205
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
210 215 220
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
225 230 235 240
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
245 250 255
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
260 265 270
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
275 280 285
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
290 295 300
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
305 310 315 320
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
325 330 335
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
340 345 350
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
355 360 365
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
370 375 380
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
385 390 395 400
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410
<210> 17
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 定位酶缀合至来自HEK的人Fc (P1AD9547)的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 17
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 18
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C末端定位酶标签的C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 18
Met Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe
1 5 10 15
Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn
20 25 30
Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro
50 55 60
Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys
65 70 75 80
Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu
85 90 95
Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe
100 105 110
Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His
115 120 125
Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly
130 135 140
Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln
145 150 155 160
Pro Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly His His His His His His
180 185 190
<210> 19
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 定位酶缀合至来自HEK的人Fc (P1AD9547)的C181S, C183S, C207S IL-37(46-218)
<400> 19
Met Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe
1 5 10 15
Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn
20 25 30
Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro
50 55 60
Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys
65 70 75 80
Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu
85 90 95
Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe
100 105 110
Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His
115 120 125
Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly
130 135 140
Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln
145 150 155 160
Pro Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Leu Pro Glu Thr Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
180 185 190
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
195 200 205
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
210 215 220
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
225 230 235 240
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
245 250 255
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
260 265 270
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
275 280 285
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
290 295 300
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
305 310 315 320
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
325 330 335
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
340 345 350
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
355 360 365
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
370 375 380
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
385 390 395 400
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410
<210> 20
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 定位酶缀合至来自HEK的人Fc (P1AD9547)的C181S, C183S, C207S IL-37(46-218)
<400> 20
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 21
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C末端定位酶标签的Y85A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 21
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Ser Leu
165 170 175
Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly His His His His His His
180 185
<210> 22
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C119I, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 22
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 23
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C119I, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 23
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Ile Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 24
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C122L, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 24
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 25
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C122L, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 25
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Leu Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 26
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 27
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178A, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 27
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Ala Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 28
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178M, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 28
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 29
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178M, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 29
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Met Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 30
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178R, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 31
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178R, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 31
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Arg Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178T, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 32
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 33
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C178T, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 33
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Thr Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 34
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C169C, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 34
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 35
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C169C, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 35
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Cys Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 36
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C119I, C122L, C178T, C181S, C183S, C207S IL-37(46-218)
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 37
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C119I, C122L, C178T, C181S, C183S, C207S IL-37(46-218)
<400> 37
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Thr Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 38
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C119I, S169C, C178R, C181S, C183S, C207S IL-37(46-218)
<400> 38
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 39
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的Y85A, C119I, S169C, C178R, C181S, C183S, C207S IL-37(46-218)
<400> 39
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Ala Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Ile Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Cys Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Arg Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 40
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的C119I, S169C, C178R, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 41
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至人Fc的C119I, S169C, C178R, C181S, C183S, C207S IL-37 (46-218)
<400> 41
Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser
1 5 10 15
Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala
35 40 45
Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Ile Leu Tyr Cys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met
85 90 95
Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr
100 105 110
Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Cys Ala Ala His Pro
115 120 125
Gly Trp Phe Ile Arg Thr Ser Ser Asn Ser Asn Glu Pro Val Gly Val
130 135 140
Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro
145 150 155 160
Val Ser Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His
180 185 190
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与IL-37多肽的肽接头
<400> 42
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与IL-37多肽的肽接头
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SS连接的肽 (Cys54)
<400> 44
Gly Glu Phe Leu Leu Tyr Cys Asp Lys
1 5
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SS连接的肽 (Cys94)
<400> 45
Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Cys Ala Ala His Pro Gly
1 5 10 15
Trp Phe Ile Arg
20

Claims (15)

1.一种包含IL-37多肽和抗体Fc区的融合蛋白，
其中所述IL-37多肽的氨基酸序列包含
在氨基酸位置181处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸，
在氨基酸位置183处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸，以及
在氨基酸位置207处的选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基，优选丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其在氨基酸位置181、183和207处包含丝氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是抗炎融合蛋白。
4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL-37多肽的氨基酸序列包含氨基酸46至218。
5.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL-37多肽与SEQ ID NO.1具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％，优选至少95％、96％、97％或98％，更优选至少95％或96％，甚至更优选至少96％的序列同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中与野生型IL-37多肽相比，所述IL-37多肽还包含额外的二硫桥。
7.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体的Fc区是IgG优选IgG1的Fc区。
8.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL-37多肽的氨基酸序列包含位于氨基酸位置85处的丙氨酸。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求9所述的药物组合物，用于治疗或预防炎性疾病或病症。
11.根据权利要求10所述的用于治疗或预防炎性疾病或病症的融合蛋白或药物组合物，其中所述炎性疾病或病症选自炎性肠病；红斑狼疮；关节炎；优选类风湿性关节炎；银屑病、过敏性鼻炎；格雷夫斯病；强直性脊柱炎；缺血再灌注损伤，优选选自心肌梗塞和中风；哮喘；牙周炎；糖尿病和代谢综合征；癌症，优选实体癌类型以及动脉粥样硬化和白塞氏病。
12.根据权利要求11所述的用于治疗或预防炎性疾病或病症的融合蛋白或药物组合物，其中所述炎性疾病或病症是炎性肠病。
13.一种编码根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。
14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的核酸分子。
15.一种细胞，其包含根据权利要求13所述的核酸分子或根据权利要求14所述的载体。
CN202080087413.1A 2019-12-20 2020-12-18 Il-37融合蛋白及其用途 Pending CN114846024A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19218657 2019-12-20
EP19218657.5 2019-12-20
PCT/EP2020/087031 WO2021123173A1 (en) 2019-12-20 2020-12-18 Il-37 fusion proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114846024A true CN114846024A (zh) 2022-08-02

Family

ID=69411148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080087413.1A Pending CN114846024A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 Il-37融合蛋白及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230192793A1 (zh)
EP (1) EP4077363A1 (zh)
JP (1) JP2023506956A (zh)
CN (1) CN114846024A (zh)
WO (1) WO2021123173A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023102605A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Monash University Il-38 variants
CN116987202B (zh) * 2023-09-27 2023-12-01 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DK1225226T3 (da) 1992-03-13 2008-04-14 Biomerieux Bv Peptider og nucleinsyresekvenser beslægtet med Epstein-Barr-virus
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP4436457B2 (ja) 1995-08-18 2010-03-24 モルフォシス アイピー ゲーエムベーハー 蛋白質／（ポリ）ペプチドライブラリー
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP0972838B1 (en) 1998-07-15 2004-09-15 Roche Diagnostics GmbH Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy
US6291245B1 (en) 1998-07-15 2001-09-18 Roche Diagnostics Gmbh Host-vector system
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1196570A2 (en) 1999-07-26 2002-04-17 Genentech, Inc. Human polypeptides and methods for the use thereof
CA2561533C (en) 2004-04-13 2015-06-16 Yvo Graus Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
ES2774337T3 (es) 2008-01-07 2020-07-20 Amgen Inc Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
WO2013120929A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
KR20180034390A (ko) 2015-06-15 2018-04-04 모나쉬 유니버시티 Il-37 변이체
US11524985B2 (en) 2017-03-20 2022-12-13 Bio-Techne Corporation IL-37 fusion protein and methods of making and using same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023506956A (ja) 2023-02-20
US20230192793A1 (en) 2023-06-22
WO2021123173A1 (en) 2021-06-24
EP4077363A1 (en) 2022-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP4122951A1 (en) Interleukin-2 mutant and use thereof
EP2035452B1 (en) Soluble heterodimeric receptors and uses thereof
US9644020B2 (en) Human Tim-3 fusion protein capable of blocking Tim-3 signaling pathway
Zimmermann et al. Native versus recombinant high-mobility group B1 proteins: functional activity in vitro
CN114846024A (zh) Il-37融合蛋白及其用途
KR20030032940A (ko) 신규 화합물
KR20170017846A (ko) Ｓｉｒｐ-알파 변이체 구성체 및 이의 용도
KR101243951B1 (ko) 가용성 종양 괴사 인자 수용체 돌연변이
US20060121460A1 (en) Toll-like receptor 11
KR20160113268A (ko) 이기능 융합단백질,이의 제조방법 및 용도
KR102088789B1 (ko) 항 TNF/IFN scFv-Fc 이중 표적 항체 및 이의 이용
CA2462687A1 (en) Novel class ii cytokine receptor
US11673948B2 (en) Anti-TNF/IFN scFv-Fc bispecific antibody and uses thereof
WO2013144345A2 (en) Toll-like receptor 2 binding epitope and binding members thereto
WO2023120643A1 (ja) Ｃｘｃｒ３発現細胞遊走活性が増強したｃｘｃｒ３リガンド。
WO2001090382A2 (fr) Proteines de fusion agissant en tant que fas-ligand
CN103124904B (zh) 食蟹猴ccl17
US20230272020A1 (en) Modified semaphorin 3a, compositions comprising the same and uses thereof
Lee et al. Development of isoform-specific monoclonal antibodies against human IL-18 binding protein
JP2014218510A (ja) 三量体形成融合タンパク質
EP1251178A1 (en) Novel polypeptide-human shc protein 43 and polynucleotide encoding it
Gao et al. Expression and purification of a soluble B lymphocyte stimulator mutant modified with the T-helper cell epitope
Duncan et al. ATP Binding by Monarch-1/NLRP12 Is
JP2016210791A (ja) 三量体形成融合タンパク質
JP2015143270A (ja) 三量体形成融合タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40068945

Country of ref document: HK

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination