KR101243951B1 - 가용성 종양 괴사 인자 수용체 돌연변이 - Google Patents

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Abstract

가용성 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFRII) 돌연변이는 야생형 TNFRII와 비교하여 92Glu 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 상기 돌연변이는 TNFα 및 림포톡신을 중화하는 세포독성 효과를 개선시킨다. 상기 돌연변이 및 이를 포함하는 융합 단백질은 TNFα 및 림포톡신 관련 질환의 치료에 유용하다.

Description

가용성 종양 괴사 인자 수용체 돌연변이{A SOLUBLE TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR MUTANT}
본 발명은 생물 약학 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양 괴사 인자(TNF)의 유도체 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다.
종양 괴사 인자α(TNFα)는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리에 속하며, 면역 반응, 세포 자살, 세포 분화 등을 조절하는 생물학적 활성을 가진다. TNFα는 2가지 세포내 수용체, TNF 수용체 1(TNFRp55) 및 TNF 수용체 2(TNFRp75)를 가진다. TNFα의 과다 생산은 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환의 원인 메카니즘이다. 이타너셉트(Etanercept)와 같은 가용성 TNFRp75:Fc 융합 단백질 및 인플릭시맵(Infliximab)과 같은 항-TNF 단일클론 항체 등의 길항제에 의한 과잉 TNFα의 차단이 류마티스 관절염을 효과적으로 치료한다는 것이 검증되었다.
이타너셉트는 TNFα 및 림포톡신(LT: lymphotoxin) 둘다에 결합하지만, 약 25-50 mg의 비교적 다량의 임상 투여량이 요구되어, 피하 주사로 투여하였을 때 홍반 발생을 유발하는 경향이 있다. 따라서, TNF 및 리포톡신에 고친화성으로 결합할 수 있는 TNFRp75의 개발이 요구되고 있으며, 또한, 항체 약물로서 TNFRp75:Fc 융합 단백질의 개발도 매우 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 TNFα 및/또는 림포톡신에 대해 높은 중화 활성을 가진 가용성 수용체를 제공하여, TNFα 중화에 필요한 가용성 수용체의 용량을 낮추고, 자가 면역 질환에 대한 치료 효과를 향상시키고, 약물의 생산 단가를 낮추고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 중화 활성이 보다 높은 가용성 수용체와 부가적인 아미노산 단편 간에 형성되는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 가용성 수용체 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 TNFα 및/또는 림포톡신에 대해 높은 중화 활성을 가진 가용성 수용체 또는 이의 융합 단백질의, 약학적 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 가용성 수용체 또는 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 분자 구조 모델링을 통해 TNF 수용체 2, TNFα 및 LT의 구조에 대한 광범위한 연구를 진행하여, TNF 수용체 2의 92번 아미노산이 TNFα 및 LT와의 결합에 중요하다는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은, 아미노산 92번 위치에 적절한 점 돌연변이를 만들어, TNFα 및 림포톡신에 대해 우수한 중화 활성을 가진, TNF 수용체 2의 가용성 돌연변이를 수득하였다.
일 측면에서, 본 발명은 야생형 서열(서열번호 1)의 아미노산 92번 위치에 아미노산 치환이 있는 가용성 TNFRp75 돌연변이를 개시한다. 상기 가용성 TNFRp75 돌연변이의 TNFα 및 림포톡신의 세포독성에 대한 중화 활성은 야생형에 비해 30% 이상 높다.
바람직한 구현예에서, 아미노산 92번 위치에서 글루탐산 잔기(E)는 Asn, His, Ser, Ala, Lys 및 Gln 중 하나로 치환된다. 즉, 서열번호 1에 기재된 서열의 92번 위치의 아미노산 E가, 각각 N, H, S, A, K 또는 Q로 치환된다. 예시적인 구현예는 다음과 같다.
TNFRp75 (E92H) 돌연변이의 아미노산 서열은, 92번이 히스티딘(His)이고, N-말단 아미노산 잔기 1-22가 신호 펩타이드인, 서열번호 2에 기재된 서열이다.
TNFRp75 (E92A) 돌연변이의 아미노산 서열은, 92번이 알라닌(Ala)이고, N-말단 아미노산 잔기 1-22가 신호 펩타이드인, 서열번호 3에 기재된 서열이다.
TNFRp75 (E92N) 돌연변이의 아미노산 서열은, 92번이 아스파라긴(Asn)이고, N-말단 아미노산 잔기 1-22가 신호 펩타이드인, 서열번호 4에 기재된 서열이다.
TNFRp75 (E92S) 돌연변이의 아미노산 서열은, 92번이 세린(Ser)이고, N-말단 아미노산 잔기 1-22가 신호 펩타이드인, 서열번호 5에 기재된 서열이다.
일부 바람직한 구현예들에서, 92번 위치의 Glu(E) 치환과 더불어, 89번 위치의 트립토판(Trp)이 Tyr, Phe, His, Lys, Met 또는 Leu로 추가적으로 치환된다. 예시적인 구현예는 다음과 같다.
TNFRp75 (E92N, W89Y) 돌연변이의 서열은 서열번호 6에 기재되어 있으며, 89번 위치는 타이로신(Tyr)이고, 92번 위치는 아스파라긴(Asn)이고, N-말단 아미노산 잔기들 1-22는 신호 펩타이드이다.
TNFRp75 (E92S, W89Y) 돌연변이의 서열은 서열번호 7에 기재되어 있으며, 89번 위치는 타이로신(Tyr)이고, 92번 위치는 세린(Ser)이고, N-말단 아미노산 잔기들 1-22는 신호 펩타이드이다.
TNFRp75 (E92N, W89F) 돌연변이의 서열은 서열번호 8에 기재되어 있으며, 89번 위치는 페닐알라닌(Phe)이고, 92번 위치는 아스파라긴(Asn)이고, N-말단 아미노산 잔기들 1-22는 신호 펩타이드이다.
제2 측면에서, 본 발명은 가용성 TNFRp75 돌연변이 및 부가적인 아미노산 단편을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 상기 부가적인 아미노산 단편은 상기 TNFRp75 돌연변이의 안정성을 증가시키며 생물학적 반감기를 향상시킨다.
상기 부가적인 아미노산 단편은 인간 면역글로불린(IgG) 불변 영역(Fc) 및 알부민의 5가지의 기능성 영역 중 한가지 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 부가적인 아미노산 단편은 TNFRp75 돌연변이의 C-말단에 존재한다.
바람직한 구현예에서, 상기 부가적인 아미노산 단편은 인간 면역글로불린(IgG) 불변 영역(Fc)의 232개의 아미노산 잔기이다. 융합 단백질은 가용성 TNFRp75 돌연변이와, 인간 IgG의 C-말단에 Fc 단편의 232개의 아미노산에 의해 형성되며, 2가지 성분 사이에 부가적인 연결 단편이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 바람직하게는 부가적인 연결 단편은 존재하지 않는다. 예시적인 구현예는 다음과 같다:
TNFRp75 (E92H)의 아미노산 서열: 서열번호 9에 기재된 Fc;
TNFRp75 (E92A)의 아미노산 서열: 서열번호 10에 기재된 Fc;
TNFRp75 (E92N)의 아미노산 서열: 서열번호 11에 기재된 Fc;
TNFRp75 (E92S)의 아미노산 서열: 서열번호 12에 기재된 Fc;
TNFRp75 (E92N, W89Y)의 아미노산 서열: 서열번호 13에 기재된 Fc;
TNFRp75 (E92S, W89Y)의 아미노산 서열: 서열번호 14에 기재된 Fc;
TNFRp75 (E92N, W89F)의 아미노산 서열: 서열번호 15에 기재된 Fc.
제3 측면에서, 본 발명은 전술한 융합 단백질 또는 가용성 수용체를 코딩하는 DNA 서열을 개시한다. 당해 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 가용성 수용체 또는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 코돈 축퇴(codon degeneracy) 및 여러가지 숙주 세포의 코돈 편향성에 따라 달라질 수 있지만, 이들 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 바뀌지 않는 한, 본 발명의 범위에 이들 DNA 서열이 포함된다.
제4 측면에서, 본 발명은 상기 가용성 TNFRp75 돌연변이 또는 이의 전술한 융합 단백질의 약학적 용도, 특히 TNFα 및/또는 림포톡신의 과다 발현과 관련있는 질환의 치료적 용도를 개시하며, 상기 질환으로는 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직성 척수염, 홍반성 루푸스, 피부근염 및 전신 홍반성 루푸스-유사 증후군이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
제5 측면에서, 본 발명은 가용성 TNFRp75 돌연변이 또는 이의 전술한 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 개시한다.
본 발명에서, TNFRp75 돌연변이 및 이의 융합 단백질은 TNF 및 림포톡신에 대한 증가된 결합력을 보인다. 예컨대, TNFα에 대한 가용성 TNFRp75 (E92N): Fc의 중화 활성은, 야생형 가용성 TNFRp75: Fc (ENBREL, AMGEN)의 중화 활성의 1.33배이고, LT에 대한 중화 활성은 야생형 가용성 TNFRp75: Fc (ENBREL, AMGEN)의 중화 활성의 2.77배이다. TNFRp75 돌연변이 및 이의 융합 단백질은 본 발명에서 TNFα 및 LT와 관련있는 질환의 치료에 유용하다. 증가된 활성으로 인해, 피하 주사에 의한 약물 투여시 홍반이 발생할 가능성을 줄이기 위해 임상 용량을 낮출 수 있다. 또한, TNFα 결합 측면에서의 해리 시간 증가는 약물의 작용시간을 연장시킨다는 점에서 유익할 것이다.
도 1-6: TNFα 또는 LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 돌연변이: Fc 융합 단백질의 중화, 야생형 TNFRp75: Fc 융합 단백질은 각 실험에 대조군으로 사용.
도 1A: TNFα의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92A): Fc 융합 단백질의 중화.
도 1B: LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92A): Fc 융합 단백질의 중화.
도 2A: TNFα의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92H): Fc 융합 단백질의 중화.
도 2B: LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92H): Fc 융합 단백질의 중화.
도 3A: TNFα의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92N): Fc 융합 단백질의 중화.
도 3B: LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92N): Fc 융합 단백질의 중화.
도 4A: TNFα의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92N，W89Y): Fc 융합 단백질의 중화.
도 4B: LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92N，W89): Fc 융합 단백질의 중화.
도 5A: TNFα의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92S，W89Y): Fc 융합 단백질의 중화.
도 5B: LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92S，W89Y): Fc 융합 단백질의 중화.
도 6A: TNFα의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92N，W89F): Fc 융합 단백질의 중화.
도 6B: LT28 -171의 세포 독성에 대한 TNFRp75 (E92N，W89F): Fc 융합 단백질의 중화.
이하 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 실시예들은 주로 예시적인 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 의도가 아닌 것으로 이해되어야 한다. 구체적인 실험 조건을 기재하지 않은 하기 실시예에 대한 실험들은 통상적인 조건이나 제조사가 제시한 조건하에서 수행한다. 구체적으로 언급된 경우를 제외하고는, 비율 및 %는 중량 기준이다.
본원에서, 용어 "TNF 수용체 2", "TNFRp75" 및 "TNF p75 수용체"는 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 인간으로부터 유래된 TNF p75 수용체 뿐만 아니라 마우스(또는 랫), 돼지, 말 또는 소로부터 유래된 이의 상동체를 포함한다. 바람직하게는, 이는 인간 TNF p75 수용체이다. 천연 야생형 인간 TNFRp75 수용체는 서열번호 1로 기재되어 있다.
"가용성 TNF p75 수용체"는 본 발명의 내용에서, TNF p75 수용체의 세포외 영역, 즉, 야생형 인간 TNF p75 수용체의 N-말단 아미노산 잔기 1-257을 구성하는 리간드-결합 도메인을 의미하며, 이때 N-말단 아미노산 잔기 1-22는 신호 펩타이드이다.
"가용성 TNF p75 수용체" 또는 "본 발명에서 가용성 TNF p75 수용체 돌연변이"는 본 발명의 내용에서, TNF에 대해, 바람직하기로는 야생형 보다 2배 이상의 증가된 결합력을 가지고 있으며, 바람직하게는 10배 이상의 증가된 LT 결합력을 가진, TNF p75 수용체 돌연변이를 의미한다. 이러한 돌연변이는 아미노산 삽입, 결손 또는 치환, 바람직하기로는 아미노산 치환에 의해 만들 수 있다. 예컨대, E92H는, 야생형 서열에 따른 아미노산 번호에서, 돌연변이에서 야생형 서열의 92번 위치에 Glu가 His로 치환된 것을 의미한다.
"아미노산 치환"은 본 발명의 내용에서, 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질의 단편에서 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산으로 유전자 조작 또는 인공 합성 기법에 의해 실험적으로 유도된 치환을 의미한다.
본 발명에서 TNFRp75 돌연변이 단백질은 당해 기술 분야에 이미 공지되어 있는 인간 가용성 TNF p75 수용체 서열에 따라 프라이머를 합성한 다음 PCR 방법으로 가용성 TNF p75 수용체의 코딩 서열을 증폭함으로써, 제조할 수 있으며, 다른 예로, 가용성 TNF p75 수용체의 코딩 서열은 인공적으로 합성할 수 있다. 가용성 TNF p75 수용체의 코딩 서열에 대한 점 돌연변이유발 기법과 같은 유전자 변형 기법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예로, Mutagenesis: a Practial Approach", M.J.McPherson, Ed., (IRL press, Oxford, UK. (1991)를 참조하며, 이 문헌에는 부위 특이적인 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발 및 돌연변이성 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 예로 기술되어 있다.
가용성 TNF p75 수용체를 코딩하는 단편을 다른 아미노산 코딩 단편과 접합하는 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에겐 잘 알려져 있다. 예컨대, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을, 제한 효소 절단, 연결 또는 상보적인 코헤시브(cohesive) 말단 등의 방법에 의해 수득할 수 있다.
전술한 바와 같이 수득되는 본 발명에 따른 돌연변이 단백질을 코딩하는 부위 특이적인 돌연변이 DNA 서열을, 적합한 발현 벡터에 삽입한 다음 적합한 숙주 세포에 형질전환한다. 마지막으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하여, 분리 및 정제에 의해 융합 단백질을 수득한다.
본 발명에 사용가능한 발현 벡터는 시판 벡터와 같이 매우 다양한 범위에서 선택할 수 있다. 예로, 시판 벡터를 선택하고, 본 발명에 따른 돌연변이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현-조절 서열에 작동가능하게 연결시켜, 단백질 발현 벡터를 제작한다.
본 발명의 내용에서 "작동가능하게 연결된"은 선형 DNA 서열의 일부분들이 동일한 DNA 서열의 다른 부분들의 활성에 영향을 미칠 수 있는 그러한 상태를 의미한다. 예컨대, 만일 신호 펩타이드 DNA가 전구체로서 펩타이드의 분비에 참여한다면, 이것(분비용 리더 서열)은 폴리펩타이드-코딩 DNA에 작동가능하게 연결되어 있는 것이며, 만일 프로모터가 DNA 서열의 전사를 통제한다면, 이것은 상기 코딩 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있는 것이며, 만일 리보좀 결합부위가 이의 번역을 허용하는 위치에 있다면, 이는 상기 코딩 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있는 것이다. 일반적으로 "작동가능하게 연결되어"있다는 것은 인접해 있다는 것이지만, 분비를 위한 리더 서열의 경우에는 리딩 프레임 상에서 인접해 있음을 의미한다.
"숙주 세포"는 본 발명의 내용에서 진핵 세포와 원핵 세포를 포함한다. 통상적으로 사용되는 원핵 세포는 E. coli 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다. 통상적으로 사용되는 진핵 세포로는 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포가 있다.
본 발명의 예에서, 가용성 TNFRp75: Fc 융합 단백질을 제조하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
i. 야생형 가용성 TNF p75 수용체를 코딩하는 서열에 대해 92번 아미노산을 치환하는 변형을 실시한 다음, 변형된 서열을 Fc 단편을 코딩하는 서열과 접합하여, 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 수득하는 단계;
ii. 상기 단계에서 수득한 변형된 가용성 TNF p75 수용체: Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 플라스미드에 클로닝하는 단계;
iii. 숙주 세포에 상기 변형된 가용성 TNF p75 수용체: Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 발현 플라스미드를 형질전환하는 단계;
iv. 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계;
v. 상기 숙주 세포와 배양 배지를 수집하여, 가용성 TNF p75 수용체 :Fc 융합단백질을 분리 및 정제하는 단계.
본 발명에서 가용성 TNFRp75: Fc 융합 단백질은 TNF 과다 발현과 관련있는 질환의 치료에 유용하며, 상기 질환으로는 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 피부근염, 전신 홍반성 루푸스-유사 증후군 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에서, 상기 가용성 TNFRp75:Fc 융합 단백질은 화학치료제 등의 다른 약물과 조합하거나 또는 단독으로 사용할 수 있다.
본 발명은, 유효량의, 본 발명의 가용성 TNFRp75:Fc 융합 단백질 1종 이상 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물을 추가로 제공한다. 일반적으로, 상기 조성물은 활성 성분과 부형제를 혼합하거나, 활성 성분을 부형제로 희석하거나, 또는 활성 성분을 예컨대 캡슐 또는 사케트(sachet)의 형태로 담체 중에 캡슐화함으로써 제조할 수 있다. 희석제는 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다. 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 용액제, 시럽제 및 무균 주사용액제의 형태일 수 있다. 부형제의 적합한 예는, 락토스, 글루코스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 스타치, 미세결정 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질로 만들 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 희석제, 유화제, 보존제(예, 메틸 하이드록시벤조에이트 및 프로필 하이드록시벤조에이트) 및 감미제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 포함할 수도 있다.
가용성 TNFRp75:Fc 융합 단백질 및 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는, 구체적으로 한정되지 않으며, 경구 투여, 비경구 주사 또는 국소 투여, 예컨대 근육내, 정맥내 또는 피하 주사, 흡입 또는 분무에 적합한 형태일 수 있다. 경구 투여가 바람직하다.
정제나 캡슐제의 형태로 경구 투여하는 경우, 가용성 TNFRp75:Fc 융합 단백질은 평균 체중 60 - 70kg의 성인에 대해 1-1000 mg의 범위의 단위 용량으로 통상 투여되거나, 또는 가용성 TNFRp75:Fc 융합 단백질은 0.1-500 mg의 범위의 단위 용량으로 비경구 주사할 수 있다. 이는 1일 당 1회 또는 여러번 투여할 수 있다. 약학 조성물의 단위 용량은 통상적으로 활성 성분을 1-500mg, 전형적으로 1mg, 5mg, 10mg, 25mg, 50mg, 100mg, 200mg, 300mg, 400mg 또는 500mg 범위로 포함한다.
특정 상태의 치료에 있어서, 본 발명에 따른 활성 성분의 용량 및 투여 요법은 체중, 연령, 성별, 증상, 치료중인 질병의 중증도 및 특정한 투여 경로와 횟수 등의 다양한 인자에 의해 결정될 것이다. 따라서, 최적 용량은 임의의 특정 환자를 치료하는 전문가가 결정할 수 있다.
본 발명에 사용되는 야생형 가용성 인간 TNFRp75:Fc 융합 단백질은 AMGEN 사로부터 상품명 ENBREL로 입수가능하다. 본 발명에 사용되는 TNFα는 R&D 컴퍼니로부터 입수된다. 본 발명에 사용되는 LT28 -171은 중국 특허 출원번호 CN00111884.6에 기술된 방법에 따라 제조된다.
이하 본 발명을 실시예를 들어 설명한다. 실시예는 단지 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 의도는 아닌 것으로 이해되어야 한다. 실시예에서 구체적인 실험 조건이 언급되어 있지 않은 실험은 통상적인 조건, 예컨대 Sambrook, et al. Molecular clonging : a laboratory manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)에 언급된 방법 또는 제조사가 제시한 조건 하에서 수행한다.
실시예들
실시예 1. TNFRp75 ( E92H ): Fc 융합 단백질의 제조
(1) TNFRp75(E92H):Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 제조
가용성 TNF p75 수용체를 코딩하는 돌연변이 DNA를, 주형으로서 야생형 인간 수용성 TNFRp75: Fc 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이용한 SOE-PCR(Splicing by Overlapping Extension PCR) 기법으로 수득하였다. DNA 단편의 제1 절반은 가용성 TNF p75 수용체를 코딩하는 것으로서 돌연변이 부위를 포함하고 있는데, 이는 주형으로서 야생형 가용성 TNFRp75: Fc 융합 단백질의 코딩 DNA 및 하기 프라이머를 이용하여 증폭하였다:
TNFRp75p：aagcttatggctcccgtcgccgtctggg (서열번호 16)
E92HpF1：TGCTTGAGCTGTGGCTCCCG (서열번호 17)
그런 후, 가용성 TNF p75 수용체를 코딩하며 돌연변이 부위와 Fc 단편 둘다를 포함하는, DNA 단편의 제2 절반을, 하기 프라이머를 이용하여 증폭하였다:
Fcp：gaattcctatttacccggagacaggg (서열번호 18)
E92HpR1：CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgtgGGGAA (서열번호 19)
마지막으로, TNFRp75 (E92H): Fc 융합 단백질을 코딩하는 DNA 단편을, 전술한 2개의 PCR 산물(즉, DNA 단편의 제1 절반 및 제2 절반)을 주형으로 이용하고 프라이머 TNFRp75 및 Fcp를 이용하여 증폭하였다.
(2) 발현 벡터의 구축
전술한 바와 같이 수득한 PCR 산물을 서열분석으로 확인한 후, HindIII 및 EcoRI으로 절단하여, 시판되는 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)에 삽입하였다. 절단과 연결은 제조사의 설명서에 따라 수행하였다.
(3) 형질전환
가용성 TNFR p75: Fc 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 E. coli DH5α에 형질전환하였다. 양성 클론을 500ml LB 배양 플라스크에서 배양한 다음, DNA를 초순수 플라스미드 DNA 정제 키트(Qiagen)를 이용하고 제조사의 설명서에 따라 추출 및 정제하였다. 전술한 바와 같이 수득되는 플라스미드 DNA를 CHO-K1 세포(Chinese hamster ovary cells, obtained from ATCC)에 인비트로젠사의 리포펙타민 키트와 제조사의 설명서에 따라 형질전환하였다.
(4) 클론 스크리닝
형질전환한지 24-48 시간 후에, 배양 배지를 G418(Geneticin)을 함유하는 스크리닝 배지로 교체하였다. 스크리닝 배지는 세포 클론이 형성될 때까지 3-4일마다 교체하였다. 세포 클론이 1 내지 2 mm의 직경으로 자라면, 단일클론을 24-웰 플레이트로 옮겼다. 세포가 50 - 70% 컨플루언스가 된 후, 각 웰의 상층액을 ELISA 분석으로 테스트하여, TNFRp75 돌연변이: Fc 융합 단백질의 발현이 높은 클론을 약물 스크리닝을 위해 선별하였다. 각 클론에서 TNFRp75 돌연변이: Fc 융합 단백질의 발현 수준을, 약물의 최대 농도에서 측정하였고, 발현율이 높고 성장성이 양호한 2개의 단일클론 세포주를 시드 저장을 위해 선별하였다.
ELISA 분석은 하기와 같이 수행하였다:
항체(항-인간 TNFRp75-특이적인 단일클론 항체, R&D Company)를 코딩 완충액(CBS, pH9.6)에 1㎍/ml로 희석하고, 96웰 플레이트에 적용(100㎕/well)한 다음 밤새 5℃에 두었다. 웰내 액체를 제거하고, 웰을 PGST로 3번 헹구었다. 건조한 다음, 400 ㎕/well의 블록킹 용액(1% BSA PBST)을 플레이트에 넣고 실온에서 2시간 인큐베이션한 다음, PBST로 3번 헹군 후 공기 중에서 건조하였다. 표준 시료(Amgen, commercial name ENBREL)를 희석 용액으로 연속 희석하였다. 발현된 단백질이 있는 상층액을 1㎍/ml로 희석하여, 96웰 플레이트에 웰 2개씩 첨가(100㎕/well)하였다. 이 플레이트를 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후, 웰내 액체를 제거하고, 웰을 3번 헹군 후 건조하였다. 효소가 연결된 항체(HRP-항-인간 IgG Fc-특이 항체, PIERCE)를 희석 용액으로 특정 농도(1:20000)로 희석하여, 96웰 플레이트에 넣고(100㎕/well), 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 웰내 액체를 제거하고, 웰을 5번 헹군 후 건조하였다. 제조된 기질 믹스 용액을 96웰 플레이트에 첨가(100㎕/well)하고, 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 정지 용액(50㎕/well)을 웰에 첨가하여, 반응을 정지시켰다. 490 nm에서 OD 값을 측정하여, 표준 그래프로 시료내 단백질 양을 계산하였다.
(5) 세포 배양
500ml 배양 플라스크내에서 1 x 105/ml 세포를 3-4일간 37℃에서 배양하였다. 이동: 세포 밀도가 2 x 105/ml이 되면, 세포를 720 cm2 롤러 보틀에 옮겨 3-4일간 배양하였다. 이동: 4 x 107개의 세포를 1445cm2 롤러 보틀에 옮겨 6일간 배양하였다. 배양 배지의 교환: 세포 배양물이 플랫폼에 도달하면, 배양 배지를 혈청 무첨가 배지(SFM, Gibco Inc.)로 교체하였다. 배양 배지의 회수: SFM에서 배양한지 6일째에, 상층액을 모아 단백질-A 친화성 크로마토그래피로 정제하여, TNFRp75 (E92H): Fc 융합 단백질 8.7 mg을 수득하였다.
실시예 2-7. 다른 TNFRp75 돌연변이: Fc 융합 단백질의 제조
TNFRp75(E92A): Fc, TNFRp75(E92N) : Fc, TNFRp75(E92S) : Fc, TNFRp75(E92N, W89Y) : Fc, TNFRp75(E92S, W89Y) : Fc 및 TNFRp75(E92N, W89F) : Fc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제조하기 위한 공통된 프라이머는 하기와 같다:
TNFRp75F: aagcttatggctcccgtcgccgtctggg (서열번호 16)
Fcp: gaattcctatttacccggagacaggg (서열번호 18)
TNFRp75(E92A): Fc, TNFRp75(E92N): Fc, TNFRp75(E92S): Fc, TNFRp75(E92Q): Fc，TNFRp75(E92N, W89Y) : Fc, TNFRp75(E92S, W89Y) : Fc 및 TNFRp75(E92N, W89F) : Fc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제조하기 위한 특이 프라이머는 하기 표에 나타낸다.
돌연변이 특이 프라이머
TNFRp75(E92A) : Fc E92ApF1(서열번호 20): TGCTTGAGCTGTGGCTCCCG
E92ApR1(서열번호 21): CGGGAGCCACAGCTCAAGCAggcGGGAA
TNFRp75(E92N) : Fc E92NpF1(서열번호 22): TGCTTGAGCTGTGGCTCCCG
E92NpR1(서열번호 23): CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgttGGGAA
TNFRp75(E92S) : Fc E92SpF1(서열번호 24): TGCTTGAGCTGTGGCTCCCG
E92SpR1(서열번호 25): CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgctGGGAA
TNFRp75(E92N, W89Y) : Fc E92NW89YpF1(서열번호 26): GTTCCCGAGTGCTTGAG
E92NW89YpR1(서열번호 27): CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgttGGGAACgtaGTTCCAGAGCTGGGTGTATGT
TNFRp75(E92S, W89Y) : Fc E92SW89YpF1(서열번호 28): GTTCCCGAGTGCTTGAG
E92SW89YpR1(서열번호 29): CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgctGGGAACgtaGTTCCAGAGCTGGGTGTATGT
TNFRp75(E92N, W89F) : Fc E92NW89FpF1(서열번호 30): GTTCCCGAGTGCTTGAG
E92NW89FpR1(서열번호 31): CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgttGGGAACgaaGTTCCAGAGCTGGGTGTATGT
그외 과정들은 실시예 1과 동일하였다.
실시예 8. TNFRp75 돌연변이 : Fc 용합 단백질의 LT 28 -171 에 대한 중화 활성 분석
(1) 세포 접종
L929 세포를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 밀도 1.0 x 106 cells/well로 접종하였다. 액티노마이신 D, 1 ng/ml LT28 -171, 및 TNFRp75 (E92A):Fc를 구배 농도로 각 실험군의 세포에 첨가하였고, 액티노마이신 D, 1 ng/ml LT28 -171, 및 야생형 rhTNFRp75 :Fc를 구배 농도로 대조군 세포에 첨가하였다. 96웰 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 인큐베이션하였다.
(2) 종말점 측정
배양 배지를 96웰 플레이트에서 완전히 제거하였다. 염색 용액 40 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 10분 후, 염색 용액을 제거하고, 플레이트를 세정한 물이 무색이 될때까지 물로 3번 헹구었다.
남아있는 물은 가능한 건조시켰다. 탈색 용액 100㎕/well을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 잘 혼합하였다. 플레이트를 효소-표지 미터로 570 nm에서 판독하였다.
(3) 결과 분석:
결과를 PraphPad Prism4.0 데이타-프로세싱 소프트웨어에서 4 파라미터 등식에 의해 자동 분석하였다: x 축은 표준 시료의 농도의 대수이고, y 축은 OD570 값이다. 상기 소프트웨어로 최대 효과의 50%일 때의 농도(EC50)도 구하였으며, TNFRp75(E92A): Fc의 LT 중화 활성은 7.93 ng/ml이었고, 야생형 rhTNFRp75:Fc의 LT 중화 활성은 22.31 ng/ml이었다. 돌연변이의 LT 중화 활성은 291%로 증가하였다. 실험 결과에 따라 작성한 "S" 곡선을 도 1에 나타내었다.
LT28 -171 세포 독성에 대한 다른 TNFRp75: Fc 돌연변이들의 중화 활성 분석도 동일한 방식으로 수행하였다. 결과는 하기 표에 나타내었다. 실험 결과에 따라 작성한 "S" 곡선을 도 2-6에 나타내었다.
돌연변이 야생형 TNFRp75:Fc의 LT에 대한 중화 활성 EC50(ng/ml) / 돌연변이의 LT에 대한 중화 활성 EC50(ng/ml) LT에 대한 중화 활성 증가율(％)
TNFRp75(E92A):Fc 23.11/7.93 291%
TNFRp75(E92H):Fc 44.05/3.74 1177%
TNFRp75(E92N):Fc 21.99/7.94 277%
TNFRp75(E92N, W89Y):Fc 54.49/3.74 1457%
TNFRp75(E92S, W89Y):Fc 23.11/6.28 368%
TNFRp75(E92N, W89F):Fc 23.28/7.56 308%
실시예 9. TNFRp75 : Fc 돌연변이의 TNFα 세포독성에 대한 중화 활성 분석
L929 세포를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 밀도 1.0 x 106 cells/well로 접종하였다. 액티노마이신 D, 10 ng/ml TNFα, 및 TNFRp75:Fc 또는 돌연변이를 구배 농도로 각 플레이트의 세포에 첨가하였다. 96웰 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 인큐베이션하였다.
그외 과정과 데이타 처리는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
결과는 하기 표에 나타내었다. 도에서 x 축은 융합 단백질의 농도 대수(ng/ml)이고, y 축은 570 nm에서의 흡광도이다.
돌연변이 야생형 TNFRp75:Fc의 TNFα에 대한 중화 활성 EC50(ng/ml) / 돌연변이의 TNFα에 대한 중화 활성 EC50(ng/ml) TNFα에 대한 중화 활
성 증가율(％)
TNFRp75(E92A):Fc 8.25/6.34 130%
TNFRp75(E92H):Fc 11.63/9.03 129%
TNFRp75(E92N):Fc 7.43/5.68 131%
TNFRp75(E92N, W89Y):Fc 7.52 /5.04 149%
TNFRp75(E92S, W89Y):Fc 16.29/12.22 133%
TNFRp75(E92N, W89F):Fc 13.06/1020 128%
PraphPad Prism4.0 데이타-프로세싱 소프트웨어를 이용하여 실험 결과에 따라 "S" 곡선을 도 1-6에 나타낸 바와 같이 작성하였다.
실시예 10. TNFRp75 ( E92N ， W89Y ) : Fc 의 TNF α 및 LT 에 대한 결합 상수 측정.
(1) 재료 및 장치:
A. 리간드 TNF-α 및 LT, 수용체 rhTNFRp75: Fc 및 TNFRp75(E92N, W89Y) :Fc 3.8mg/mL
B. HBS-P 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% (v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4).
C. 활성화제 N-에틸-N'-디메틸아미노프로필 카르보디이미드(EDC), N-하이드록시숙신이미드(NHS), 에탄올아민 등, 모두 시그마사에서 구입.
D. 생물학적 거대 분자들 간의 상호작용을 측정하기 위한 장치: BIAcore3000, 카르복시메틸셀룰로스 센서 칩(CM5) (G.E. Inc.)은 GE 컴퍼니에서 구입함.
(2) 방법
A. rhTNFRp75: Fc의 접합
Biacore3000의 소프트웨어 위저드에서 제공하는 아미노 접합 방법을 이용하여, rhTNFRp75: Fc를 CM5 칩의 FC2 채널에 접합하였다. HBS-P를 런닝 완충액으로 사용하였고, 1mg/mL의 rhTNFRp75: Fc를 최종 농도 100 ㎍/mL로 NaAC 용액(10mM, pH4.0)에 희석하였다. EDC(0.2M) 및 NHS(50mM)를 1:1의 비율로 혼합한 다음, 7분간 유속 10 ㎕/min으로 칩의 표면에 적용하였다. 그런 후, 수용체의 용액을 적용한 다음, 에탄올아민(1M, pH8.5)을 적용하여 칩의 활성화된 표면을 차단하였다. TNFRp75의 최종 접합량은 7043.6 RU이었다.
B. TNFRp75 (E92N, W89Y): Fc의 접합
Biacore3000의 소프트웨어 위저드에서 제공하는 아미노 접합 방법을 이용하여, TNFRp75 (E92N, W89Y)를 CM5 칩의 FC4 채널에 접합하였다. HBS-P를 런닝 완충액으로 사용하였고, 3.8mg/mL의 TNFRp75(E92N, W89Y): Fc를 최종 농도 100 ㎍/mL로 NaAC 용액(10mM, pH4.0)에 희석하였다. EDC(0.2M) 및 NHS(50mM)를 1:1의 비율로 혼합한 다음, 7분간 유속 10 ㎕/min으로 칩의 표면에 적용하였다. 그런 후, 수용체의 용액을 적용한 다음, 에탄올아민(1M, pH8.5)을 적용하여 칩의 활성화된 표면을 차단하였다. TNFRp75 (E92N, W89Y)의 최종 접합량은 6275.0 RU이었다.
C. rhTNFRp75: Fc의 일차 스크리닝 및 동력학 분석
수용체 TNFRp75: Fc의 TNF 또는 LT 결합력을 SPR(surface plasma resonance)로 분석하였다. 리간드를 HBS-P 완충액에 농도 1 nM 또는 10 nM로 각각 희석한 다음, 원심분리하고, 자동 주입하여, 다양한 농도의 리가드에 대한 수용체 TNFRp75의 결합 활성을 측정하였다. 결합 활성을 보이는 리간드를 동력학 분석하였다.
농도 10 ㎍/ml(575nM)의 TNFα 스톡 용액을 HBS-P 완충액에 0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 nM로 연속 희석하였다.
농도 2.25 mg/ml(137μM)의 LT 스톡 용액을 HBS-P 완충액에 0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 nM로 연속 희석하였다.
수용체와 리간드의 상호작용은 Biacore3000의 마법사를 이용하여 동력학 분석으로 측정하였다. 리간드들은 모두 유속 40 ㎕/min의 유속으로 1분간 적용하였고, 2분간 해리한 후, 다음 50 mM NaOH 및 HBS-P 완충액을 15초 및 60초간 100 ㎕/min로 적용하여, 리간드를 재생하였다(50 mM NaOH 및 HBS-P 완충액을 10초 및 30초간 유속 100 ㎕/min으로 적용하여, 일차 스크리닝에서 재생시킴). 실험 데이타는 Biacore3000의 분석 소프트웨어에서 1:1 랭뮤어 조합 모델에 적용하여, 특이 역학 상수(specific kinetic constant)를 구하였다.
D. TNFRp75(E92N, W89Y): Fc의 일차 스크리닝 및 동력학 분석
수용체 TNFRp75(E92N, W89Y): Fc의 TNF 또는 LT 결합력을 SPR(surface plasma resonance)로 측정하였다. 리간드를 HBS-P 완충액에 농도 1 nM 또는 10 nM로 각각 희석한 다음, 원심분리하고, 자동 주입하여, 다양한 농도의 리가드에 대한 수용체 TNFRp75(E92N, W89Y)의 결합 활성을 측정하였다. 결합 활성을 보이는 리간드를 동력학 분석하였다.
농도 10 ㎍/ml(575nM)의 TNFα 스톡 용액을 HBS-P 완충액에 0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 nM로 연속 희석하였다.
농도 2.25 mg/ml(137μM)의 LT 스톡 용액을 HBS-P 완충액에 0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 nM로 연속 희석하였다.
수용체와 리간드의 상호작용은 Biacore3000의 마법사를 이용하여 동력학 분석으로 측정하였다. 리간드들은 모두 유속 40 ㎕/min의 유속으로 1분간 적용하였고, 2분간 해리한 후, 다음 50 mM NaOH 및 HBS-P 완충액을 15초 및 60초간 100 ㎕/min로 적용하여, 리간드를 재생하였다(50 mM NaOH 및 HBS-P 완충액을 10초 및 30초간 유속 100 ㎕/min으로 적용하여, 일차 스크리닝에서 재생시킴). 실험 데이타는 Biacore3000의 분석 소프트웨어에서 1:1 랭뮤어 조합 모델에 적용하여, 특이 역학 상수를 구하였다.
(3) 결과:
A. rhTNFRp75: Fc의 TNFα(약어 TNF) 및 LT에 대한 결합 동력학은 하기에 나타내었다.
리간드 K a (1/Ms) K d (1/s) KD(nM) Chi2
TNF 8.45 x 103 4.1 x 10-6 4.85 x 10-10 107
LT 5.23 x 103 6.99 x 10-7 1.34 x 10-10 8.86
B. TNFRp75(E92N, W89Y) :Fc의 TNFα(약어 TNF) 및 LT에 대한 결합 동력학은 하기에 나타내었다.
리간드 K a (1/Ms) K d (1/s) KD(nM) Chi2
TNF 9.72 x 103 1.29 x 10-6 1.33 x 10-10 26.6
LT 1.88 x 104 1.64 x 10-6 8.74 x 10-11 2.04
TNFRp75: Fc와 비교하여, TNFRp75(E92N, W89Y)의 TNFα 또는 LT에 대한 평형 해리 상수(KD)가 2 내지 3배 낮은 것으로 나타나, TNFRp75(E92N, W89Y)의 TNFα 또는 LT 결합 친화성이 증가된 것으로 보였다. 또한, TNFRp75(E92N, W89Y)의 TNFα에 대한 해리 상수(k d )는 TNFRp75: Fc 보다 훨씬 낮은 것으로 나타났는데, 이는 TNFRp75(E92N, W89Y) 및 TNFα의 복합체가 시험관내에서 훨씬 안정적이며, 생체내에서 TNFRp75(E92N, W89Y)의 반감기를 향상실 수 있음을 시사한다.
전술한 구체적인 구현예들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자하는 의도는 아니다. 또한, 본 발명은 기능적으로 등가의 방법 및 구성 성분을 포함할 것이다. 본원에 기술된 내용과 첨부된 도면을 기초로, 당업자라면 본 발명의 범위에 포함될, 다양한 변경 및 수정을 쉽게 가할 수 있을 것이다.
Sequence listing <110> Shanghai fudan-zhangjiang bio-pharmaceutical Co., Ltd. <120> A soluble tumor necrosis factor receptor mutant <160> 31 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly 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90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 260 265 270 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 275 280 285 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 290 295 300 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 305 310 315 320 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 325 330 335 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 340 345 350 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 355 360 365 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 370 375 380 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 385 390 395 400 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 405 410 415 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 420 425 430 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 435 440 445 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 450 455 460 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 465 470 475 480 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 14 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Fusion protein of the TNFRp75 mutant and the Fc fragment <400> 14 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Tyr Val Pro Ser Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 260 265 270 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 275 280 285 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 290 295 300 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 305 310 315 320 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 325 330 335 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 340 345 350 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 355 360 365 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 370 375 380 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 385 390 395 400 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 405 410 415 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 420 425 430 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 435 440 445 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 450 455 460 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 465 470 475 480 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 15 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial sequence <223> Fusion protein of the TNFRp75 mutant and the Fc fragment <400> 15 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Phe Val Pro Asn Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 260 265 270 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 275 280 285 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 290 295 300 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 305 310 315 320 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 325 330 335 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 340 345 350 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 355 360 365 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 370 375 380 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 385 390 395 400 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 405 410 415 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 420 425 430 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 435 440 445 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 450 455 460 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 465 470 475 480 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 16 aagcttatgg ctcccgtcgc cgtctggg 28 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 17 tgcttgagct gtggctcccg 20 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 18 gaattcctat ttacccggag acaggg 26 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 19 cgggagccac agctcaagca gtggggaa 28 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 20 tgcttgagct gtggctcccg 20 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 21 cgggagccac agctcaagca ggcgggaa 28 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 22 tgcttgagct gtggctcccg 20 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 23 cgggagccac agctcaagca gttgggaa 28 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 24 tgcttgagct gtggctcccg 20 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 25 cgggagccac agctcaagca gctgggaa 28 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 26 gttcccgagt gcttgag 17 <210> 27 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 27 cgggagccac agctcaagca gttgggaacg tagttccaga gctgggtgta tgt 53 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 28 gttcccgagt gcttgag 17 <210> 29 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 29 cgggagccac agctcaagca gctgggaacg tagttccaga gctgggtgta tgt 53 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> DNA primer <400> 30 gttcccgagt gcttgag 17 <210> 31 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA primer <400> 31 cgggagccac agctcaagca gttgggaacg aagttccaga gctgggtgta tgt 53

Claims (12)

  1. 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질로서,
    서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 TNFRp75의 N-말단 257개의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 돌연변이체 단백질에서 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 잔기 Glu92가 치환된 것을 특징으로 하는, 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 잔기 Glu92가 Asn, His, Ser, Ala, Lys 또는 Gln 중 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 잔기 Glu92가 치환된 아미노산 서열에서, N-말단 잔기 Trp89가 더 치환된 것을 특징으로 하는 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 잔기 Glu92가 Asn, His, Ser, Ala, Lys 또는 Gln 중 하나로 치환되고,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 잔기 Glu92가 치환된 아미노산 서열의 N-말단 잔기 Trp89가 Tyr, Phe, His, Lys, Met, 또는 Leu 중 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질과 부가적인 아미노산 단편 간에 형성된 융합 단백질로서,
    상기 부가적인 아미노산 단편은 인간 면역글로불린 불변 영역 및 알부민의 5개의 기능성 영역들 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 부가적인 아미노산 단편은 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질의 C-말단에 존재하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 단편은 인간 면역글로불린 불변 영역의 232개의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 따른 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제5항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환 치료용 약물 제조에 사용되며,
    상기 TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환은 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직성 척수염, 홍반성 루푸스, 피부근염 및 전신 홍반성 루푸스-유사 증후군으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는,
    가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질.
  10. 유효량의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 가용성 TNFRp75 돌연변이체 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며,
    TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환 치료용 약물 제조에 사용되고,
    상기 TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환은 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직성 척수염, 홍반성 루푸스, 피부근염 및 전신 홍반성 루푸스-유사 증후군으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  11. 제5항에 있어서,
    TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환 치료용 약물 제조에 사용되며,
    상기 TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환은 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직성 척수염, 홍반성 루푸스, 피부근염 및 전신 홍반성 루푸스-유사 증후군으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  12. 유효량의, 제5항에 따른 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며,
    TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환 치료용 약물 제조에 사용되고,
    상기 TNFα 및/또는 림포톡신 관련 질환은 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직성 척수염, 홍반성 루푸스, 피부근염 및 전신 홍반성 루푸스-유사 증후군으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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