CN101883787B - 一种可溶性tnf受体突变体 - Google Patents

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Abstract

一种可溶性肿瘤坏死因子受体2(TNFRII)突变体，它与野生型TNFRII相比，第92位Glu进行了氨基酸替换。该突变体提高了中和TNFα和淋巴毒素的细胞毒能力。该突变体及包含它的融合蛋白可用于TNFα或者淋巴毒素引起的相关疾病的治疗。

Description

一种可溶性TNF受体突变体
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及涉及肿瘤坏死因子(TNF)受体衍生物及其在医药方面的应用。
背景技术
肿瘤坏死因子α(TNFα)是肿瘤坏死因子超家族的成员，具有调节免疫反应、细胞凋亡和细胞分化等生物学活性。TNFα具有两个细胞内的受体，TNF受体1(TNFRp55)和TNF受体2(TNFRp75)。TNFα过量表达是引起自身免疫性疾病的重要因素，目前国际市场上治疗类风湿性关节炎最有效的主流蛋白质类药物是直接阻断TNF生物学功能的嵌合抗体(Infliximab)和可溶性TNFα受体TNFRp75：Fc融合蛋白(Etanercept)。两种药物均表现出明显的治疗效果。
Etanercept能够同时与TNFα和淋巴毒素(LT)结合，但是临床应用的剂量较大，约25-50mg，皮下注射容易产生红斑。因此研发与TNF和淋巴毒素高亲和力结合的TNFRp75，进而开发出抗体类药物TNFRp75：Fc融合蛋白就显得极具价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种对TNFα和/或淋巴毒素高强度中和的可溶性受体，以减少中和TNFα所需的可溶性受体剂量，提高抗自身免疫性疾病的治疗效果，同时降低药物生产成本。
本发明的另一目的是提供一种对TNFα和/或淋巴毒素具有更强中和作用的可溶性受体和其他氨基酸片段形成的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供一种编码上述可溶性受体或融合蛋白的DNA序列。
本发明的再一目的是提供对TNFα和/或淋巴毒素具有更强中和作用的可溶性受体及其融合蛋白在医药方面的应用。
本发明的再一目的是提供一种包含上述可溶性受体及其融合蛋白的药物组合物。
本发明的构思是这样的，通过分子模拟技术对TNF受体2与TNFα和LT的结构进行了深入的研究，发现TNF受体2天然序列的第92位氨基酸对其结合TNFα和LT非常重要，通过合理化的设计，对第92位氨基酸进行点突变，获得具有高强度中和TNFα和淋巴毒素作用的可溶性TNF受体2突变体。
本发明的第一方面，公开了一种可溶性TNFRp75突变体，在野生型序列(SEQ IDNO.1)第92位氨基酸进行氨基酸替换，使得与野生型相比，该突变体中和TNFα和淋巴毒素的细胞毒的能力提高30％以上。
在一个优选的方案中，第92位的谷氨酸(E)被Asn、His、Ser、Ala、Lys或Gln中的一种所替换。即如下SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列中的第92位氨基酸E分别由N、H、S、A、K或Q替换。如：
TNFRp75(E92H)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述，其中第92位为组氨酸(His)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
TNFRp75(E92A)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述，其中第92位为丙氨酸(Ala)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
TNFRp75(E92N)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述，其中第92位为天冬酰胺(Asn)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
TNFRp75(E92S)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5所述，其中第92位为丝氨酸(Ser)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
在一些优选的方案中，除了第92位的谷氨酸(E)被替换外，第89位氨基酸色氨酸(Trp)同时也被Tyr，Phe，His，Lys，Met或Leu替换，如：
TNFRp75(E92N，W89Y)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.6所述，其中第89位氨基酸为酪氨酸(Tyr)、第92位为天冬酰胺(Asn)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
TNFRp75(E92S，W89Y)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.7所述，其中第89位氨基酸为酪氨酸(Tyr)、第92位为丝氨酸(Ser)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
TNFRp75(E92N，W89F)突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.8所述，其中第89位氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、第92位为天冬酰胺(Asn)，N端1-22个氨基酸为信号肽。
本发明的第二方面，公开了一种可溶性TNFRp75的突变体和其它氨基酸片段形成的融合蛋白。其它氨基酸片段的目的是为了增加TNFRp75的突变体的稳定性，延长其生物半衰期。
所述的其他氨基酸片段选自人免疫球蛋白(IgG)的恒定区(Fc)或白蛋白的五个功能区中的一种。
所述的其他氨基酸片段位于TNFRp75突变体的C末端。
在一个优选的方案中，所述其他氨基酸片段为人免疫球蛋白(IgG)的恒定区(Fc)的232个氨基酸。可溶性TNFRp75突变体与人IgG的C末端的Fc片段的232个氨基酸片段形成融合蛋白，两者之间可包含或不包含其它连接片段，优选不包含连接片段。如：
TNFRp75(E92H)：Fc突变体序列氨基酸序列如SEQ ID NO.9所述；
TNFRp75(E92A)：Fc突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.10所述；
TNFRp75(E92N)：Fc突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.11所述；
TNFRp75(E92S)：Fc突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.12所述；
TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.13所述；
TNFRp75(E92S，W89Y)：Fc突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.14所述；
TNFRp75(E92N，W89F)：Fc突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.15所述。
本发明第三方面，公开了编码上述可溶性受体或融合蛋白的DNA序列。本发明的编码可溶性受体及其融合蛋白的DNA序列，可以根据密码子简并性和不同宿主细胞的密码子喜好作出改变，只要该等DNA序列翻译的氨基酸序列不发生变化，仍落入本发明的范围。这是本领域技术人员熟知的。
本发明第四方面，公开了上述可溶性TNFRp75突变体及其融合蛋白在医药领域中的应用，用于以TNFα和/或淋巴毒素过度表达相关疾病的治疗，包括但不限于：类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、干燥综合征、强直性脊柱炎、红斑狼疮、皮肌炎、系统性红斑狼疮样综合征等。
本发明的第五方面，公开了包含上述可溶性TNFRp75突变体及其融合蛋白的药物组合物。
本发明的可溶性TNFRp75突变体及其融合蛋白，结合TNF与淋巴毒素的结合能力都有一定幅度的提高。如可溶性TNFRp75(E92N)：Fc中和TNFα的能力是野生型可溶性TNFRp75：Fc(AMGEN公司的ENBREL)的1.33倍；而中和淋巴毒素的能力是野生型可溶性TNFRp75：Fc(AMGEN公司的ENBREL)的2.77倍。本发明的可溶性TNFRp75突变体及其融合蛋白用于治疗TNFα和淋巴毒素相关的疾病，由于活性的提高，可以减少药物的用量，从而降低引起注射红斑产生的几率；而结合TNFα的解离时间的增长，有利于延长药物有效作用的时间。
附图说明
图1-6：TNFRp75突变体：Fc融合蛋白对TNFα、LT28-171细胞杀伤的中和作用试验，每组试验都用野生型TNFRp75：Fc融合蛋白作为对照。
图1A：TNFRp75(E92A)：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用；
图1B：TNFRp75(E92A)：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用；
图2A：TNFRp75(E92H)：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用；
图2B：TNFRp75(E92H)：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用；
图3A：TNFRp75(E92N)：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用；
图3B：TNFRp75(E92N)：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用；
图4A：TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用；
图4B：TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用；
图5A：TNFRp75(E92S，W89Y)：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用；
图5B：TNFRp75(E92S，W89Y)：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用；
图6A：TNFRp75(E92N，W89F)：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用；
图6B：TNFRp75(E92N，W89F)：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
如本文所用，术语“TNF受体2”、“TNFRp75”、“TNF 75受体”可互换使用，包括来源于人的TNF p75受体以及鼠、猪、马或牛的同源物。较佳地，是人TNFp75受体。天然的野生型人TNF p75受体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
如本文所用，可溶性TNF p75受体指TNF p75受体的细胞外部分，即野生型人TNFp75受体氨基酸序列N端第1-257位氨基酸构成的与配体结合的结构域，N端1-22位氨基酸为信号肽。
如本文所用，术语“可溶性TNF p75受体”或“本发明的可溶性TNF p75受体突变体”指这样的TNF p75受体突变体，它与TNF的结合能力有所提高，更佳地提高2倍以上；结合淋巴毒素的能力提高，更佳的提高10倍以上。这种突变体可以通过氨基酸插入、缺失或替换得到，较佳地，通过氨基酸替换得到。例如，E92H指第92位的氨基酸从野生型的Glu(谷氨酸)替换为突变体的His(组氨酸)，氨基酸顺序编号基于野生型序列。
术语“氨基酸替换”是指通过基因工程技术或人工合成技术而使多肽或蛋白或蛋白片段中的一个或多个氨基酸替换为另一种或另几种氨基酸。
本发明的可溶性TNF p75受体突变蛋白可以这样进行制备：根据已公开的人可溶性TNF p75受体的序列来合成引物，通过PCR法扩增出可溶性TNF p75受体编码序列，也可以人工合成可溶性TNF p75受体的编码序列。对可溶性TNF p75受体的编码序列进行遗传修饰，例如点突变的技术是本领域中已知的，例如可参见“Mutagenesis：aPractical Approach”，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，其中例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。
可溶性TNF p75受体编码片段和其他氨基酸片段编码片段之间的拼接技术是本领域已知的，例如，可以通过限制性内切酶切割、连接或者通过末端互补补平等方法获得编码融合蛋白的DNA序列。
在获得了定点突变后的编码本发明新突变蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的融合蛋白。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新突变蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。
在本发明的一个实例中，制备本发明可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白的方法包括如下步骤：
i.修饰可溶性TNF p75受体的编码序列，使其在92位氨基酸发生替换，与编码Fc片段序列进行拼接，获得编码融合蛋白的基因；
ii.将上述改造的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白基因克隆到表达质粒；
iii.用上述携带可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白基因的表达质粒转化宿主细胞；
iv.培养被转化的宿主细胞；
v.收集宿主细胞及培养液，分离纯化可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白。
本发明的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白适用于治疗以TNF过度表达相关疾病的治疗，包括：类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、干燥综合征、强直性脊柱炎、红斑狼疮、皮肌炎、系统性红斑狼疮样综合征等。
本发明的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白可以单独使用，也可与化疗药物等其他药物联合使用。
本发明还提供了药物组合物，它包括有效量的一种或几种本发明的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白和药物组合物的给药方式没有特别显示，可以通过口服、局部、非肠道给药，例如肌肉、静脉、或皮下注射，或吸入喷雾等方式给药。优选方式是口服给药。
当本发明中的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白以片剂或胶囊形式口服时，剂量对于平均体重60-70公斤的成人而言在约1mg到1000mg范围内，或以注射剂方式非肠道给药，剂量约为0.1mg到500mg，可以每天一次或分几次给药。药物组合物的单元剂量通常包括范围为1mg-500mg的活性成分，典型地是1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg。
用本发明组合物治疗具体病症时所用的治疗活性成分的数量和给药方案，取决于多种因素，包括体重、年龄、性别、必然的医学症状、疾病轻重、给药途径及频率。这可以由医务人员确定。
本发明采用的编码野生型人可溶性TNF p75受体：Fc购于AMGEN(商品名ENBREL)。本发明TNFα购于R&D公司。本发明采用的LT28-171按中国专利CN00111884.6公开的方法制备。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1992)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、TNFR75(E92H)：Fc融合蛋白的制备
(1)制备TNFRp75(E92H)：Fc融合蛋白编码基因
以野生型人可溶性TNFRp75：Fc融合蛋白DNA片段为模板，采用SOE-PCR(Splicing by Overlapping Extension PCR)技术得到突变的可溶性TNF p75受体DNA编码序列。首先以野生型可溶性TNFRp75：Fc融合蛋白的编码DNA为模板，用引物
TNFRp75p：aagcttatggctcccgtcgccgtctggg(SEQ ID NO.16)
E92HpF1：TGCTTGAGCTGTGGCTCCCG(SEQ ID NO.17)
扩增可溶性TNF p75受体包含突变位点的前半段DNA片段；用引物
Fcp：gaattcctatttacccggagacaggg(SEQ ID NO.18)
E92HpR1：CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgtgGGGAA(SEQ ID NO.19)
扩增可溶性TNF p75受体包含突变位点及Fc片段的后半段DNA片段。最后以上述两PCR产物为模板，用引物TNFRp75p和引物Fcp进行PCR扩增，得到编码TNFRp75(E92H)：Fc融合蛋白的DNA片段。
(2)表达载体构建
经过测序验证构建正确后将该基因片段用HindIII+EcoRI双酶切的方式拼接入商业表达载体pcDNA3(购自Invitrogen公司)相同的酶切位点中。酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。
(3)转染
将上述构建好的突变的可溶性TNF p75受体：Fc融合蛋白表达载体转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)，按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述质粒DNA转染CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC)，操作方法按照生产商说明书进行。
(4)细胞株筛选
转染后24-48小时将细胞培养基更换为含G418药物的筛选培养基，每3-4天更换筛选培养基一次直至细胞克隆形成。待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中。单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，选取表达量高的细胞克隆进行药物加压扩增筛选。待筛选药物的浓度上升至最高时检测各克隆单细胞的表达量，选取表达量高且细胞生长状态良好的2株单克隆细胞作为种子保存。
细胞表达量的ELISA检测按如下方法进行：
将包板抗体(抗人TNFRp75特异性单克隆抗体购于R&D公司)用包被液(pH9.6CBS)稀释到1ug/ml后包被于96孔板上，100ul/孔，于5℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入400μl/孔的封闭液(1％BSA PBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液对标准品(Amgen公司，商品名ENBREL)倍比稀释，表达上清稀释1ug/ml，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液稀释酶联抗体(HRP-抗人IgG Fc特异性抗体PIERCE公司)至一定浓度(1∶20000)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板5次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育10min。加入终止液50μl/孔，终止反应。在490nm处读取吸收值OD，根据标准曲线计算样品的含量。
(5)扩增培养
以1×105/ml的细胞浓度扩增至500ml培养瓶中培养，37度培养3-4天。传代：以2×105/ml的细胞浓度扩增至720cm2滚瓶中培养，培养3-4天。传代：以4×107的细胞总数扩增至1445cm2滚瓶中培养，培养6天。换液：细胞达到平台期更换培养液为无血清培养基(SFM，购于Gibco公司)。收液：SFM培养6天，收集上清液，用Protein-A亲和层析纯化，共获得TNFRp75(E92H)：Fc融合蛋白8.7毫克。
实施例2-7、其它TNFRp75突变体：Fc融合蛋白的制备
制备突变体TNFRp75(E92A)：Fc、TNFRp75(E92N)：Fc、TNFRp75(E92S)：Fc、TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc、TNFRp75(E92S，W89Y)：Fc、TNFRp75(E92N，W89F)：Fc融合蛋白编码基因采用的共用引物如下：
TNFRp75F：aagcttatggctcccgtcgccgtctggg(SEQ ID NO.16)
Fcp：gaattcctatttacccggagacaggg(SEQ ID NO.18)
制备突变体TNFRp75(E92A)：Fc、TNFRp75(E92N)：Fc、TNFRp75(E92S)：Fc、TNFRp75(E92Q)：Fc，TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc、TNFRp75(E92S，W89Y)：Fc、TNFRp75(E92N，W89F)：Fc融合蛋白编码基因采用的特异引物见下表：
其它操作同实施例1。
实施例8、TNFRp75突变体：Fc融合蛋白对LT28-171的中和作用
(1)细胞种板：
L929细胞1×106细胞(1块96孔板)，试验组加入放线菌素D和1ng/ml的LT28-171和呈梯度的TNFRp75(E92A)：Fc；对照组加入放线菌素D和1ng/ml的LT28-171和呈梯度的野生型rhTNFRp75：Fc。将上述96孔板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24h。
(2)终点测定
将96孔板取出，弃去培养液并尽量拍干；然后在每孔加入40ul染色液，染色10分钟；自来水漂洗3次，直至自来水无色。
将96孔板尽量拍干，使板内没有存留水分；在96孔板加入脱色液，每孔100ul，混匀，酶标仪570nm处比色。
(3)结果分析：
采用PraphPad Prism4.0数据处理软件的四参数方程进行自动分析：标准品浓度的对数值为X轴，OD490值为Y轴，软件将给出样品和标准品的半数有效浓度(EC50)。测得TNFRp75(E92A)：Fc中和LT的EC50为7.93ng/ml，对照组野生型rhTNFRp75：Fc中和LT的EC50为22.31ng/ml，突变体阻抗LT的活性提高291/％。根据试验结果绘制“S”形曲线图见图1。
其它TNFRp75突变体：Fc融合蛋白对LT28-171(以下简写为LT)的中和作用测试采用同样方法，试验结果见下表，根据试验结果绘制“S”形曲线图见图2-6。
实施例9、TNFRp75突变体：Fc融合蛋白对TNFα的中和作用
L929细胞1×106细胞(1块96孔板)，加入放线菌素D和10ng/ml的TNFα和呈梯度的TNFRp75：Fc或其突变体。将上述96孔板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24h。
其他操作和数据处理同实施例8。
试验结果见下表，附图横坐标为融合蛋白浓度(ng/ml)的对数值，纵坐标为570nm的光吸收值。
根据试验结果用GraphPad Prism4.0绘制“S”形曲线图见图1-6。
实施例10、TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc结合TNFα与淋巴毒素的结合常数测定
(1)材料和仪器：
A.配体TNFα和LT、受体rhTNFRp75：Fc、TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc 3.8mg/mL
B.HBS-P缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％(v/v)surfactant P20，pH 7.4)。
C.活化试剂N-乙基二甲氨基丙基碳化二亚胺N-ethyl-N’-dimethylaminopropylcarbodiimide(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺N-hydroxysuccinimide(NHS)、乙醇胺(Ethanolamine)等，购自Sigma公司。
D.生物大分子相互作用仪：BIAcore3000，羧甲基纤维素芯片(CM5)购自GE公司。
(2)实验方法：
A.rhTNFRp75：Fc的偶联
用Biacore 3000控制软件Wizard中的氨基偶联方法将rhTNFRp75：Fc偶联到CM5芯片的FC2通道上。HBS-P作为工作缓冲液，1mg/mL的rhTNFp75：Fc用pH 4.0，10mMNaAC稀释至终浓度为100μg/mL。芯片表面用0.2M EDC和50mM NHS 1∶1混合以10μL/min的流速进样7分钟，然后注射受体溶液，以pH 8.5，1M ethanolamine进样7分钟，封闭活化的芯片表面。TNFRp75的最终偶联量为7043.6RU。
B.TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc的偶联
用Biacore 3000控制软件Wizard中的氨基偶联方法将TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc偶联到CM5芯片的FC4通道上。HBS-P作为工作缓冲液，3.8mg/mL的TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc用pH 4.0，10mM NaAC稀释至终浓度为100μg/mL。芯片表面用0.2M EDC和50mM NHS 1∶1混合以10μL/min的流速进样7分钟，然后注射受体溶液，以pH 8.5，1M ethanolamine进样7分钟，封闭活化的芯片表面。TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc的最终偶联量为6275.0RU。
C.配体对rhTNFRp75：Fc的初筛和动力学测试
用SPR(表面等离子共振)的方法测定TNF、LT和受体TNFRp75：Fc的结合活性。分别用HBS-P缓冲液稀释配体到浓度为1nM和10nM，离心后自动进样，检测不同浓度配体与受体TNFRp75的结合活性。对有结合活性的配体进行详细的动力学实验。
TNFα母液浓度为10μg/mL，摩尔浓度575nM，用HBS-P缓冲液按一定比例进行稀释，使其浓度分别为0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0nM；
LT母液浓度为2.25mg/mL，摩尔浓度为137μM，用HBS-P缓冲液按一定比例进行稀释，使其浓度分别为0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0nM；
配体与受体的相互作用分别用Biacore 3000控制软件中的动力学分析Wizard进行动力学实验。所有配体进样时，流速为40μL/min，进样1min，解离2min，然后分别用50mM NaOH和HBS-P缓冲液以100μL/min的流速进样15s、60s进行再生(初筛时，用50mM NaOH和HBS-P缓冲液以100μL/min的流速进样10s、30s进行再生)。得到的数据根据Biacore 3000分析软件中的1∶1 Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数。
D.配体对TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc的初筛和动力学测试用SPR(表面等离子共振)的方法测定TNF、LT和受体TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc的结合活性。分别用HBS-P缓冲液稀释配体到浓度为1nM和10nM，离心后自动进样，检测不同浓度配体与受体TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc的结合活性。对有结合活性的配体进行详细的动力学实验。
TNFα母液浓度为10μg/mL，摩尔浓度575nM，用HBS-P缓冲液按一定比例进行稀释，使其浓度分别为0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0nM；
LT母液浓度为2.25mg/mL，摩尔浓度为137μM，用HBS-P缓冲液按一定比例进行稀释，使其浓度分别为0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0nM；
配体与受体的相互作用分别用Biacore 3000控制软件中的动力学分析Wizard进行动力学实验。所有配体进样时，流速为40μL/min，进样1min，解离2min，然后分别用50mM NaOH和HBS-P缓冲液以100μL/min的流速进样15s、60s进行再生(初筛时，用50mM NaOH和HBS-P缓冲液以100μL/min的流速进样10s、30s进行再生)。得到的数据根据Biacore 3000分析软件中的1∶1 Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数。
(3)实验结果如下：
A rhTNFRp75：Fc与TNFα(简写为TNF)和LT结合常数如下表所示。
B TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc与TNFα和LT结合常数如下表所示
TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc结合TNFα和LT的结合解离常数(KD)相比TNFRp75：Fc都有2-3倍的变小，说明TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc具有更强的结合TNFα和LT的能力。TNFRp75(E92N，W89Y)：Fc结合TNFα后的解离常数kd远远小于TNFRp75：Fc结合TNFα的解离常数，说明此复合物的体外稳定性更强，半衰期更长，有利于提高药物的半衰期。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (10)

1.一种可溶性TNFRp75突变体，包含TNFRp75的N末端257个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，其特征在于，SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列N端第92位的谷氨酸被替换为A、N、S或H。
2.如权利要求1所述的可溶性TNFRp75突变体，其特征在于：SEQ IDNO.1所述的氨基酸序列N端第89位色氨酸被替换为Y或F。
3.一种如权利要求1-2中的任一项所述的可溶性TNFRp75的突变体和其它氨基酸片段形成的融合蛋白，所述的其它氨基酸片段为人免疫球蛋白的恒定区，位于可溶性TNFRp75的突变体的C末端。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的其它氨基酸片段为人免疫球蛋白的恒定区的第1-232位氨基酸。
5.一种DNA序列，其特征在于，编码如权利要求1-2中的任一项所述的可溶性TNFRp75的突变体。
6.一种DNA序列，其特征在于，编码如权利要求4所述的融合蛋白。
7.如权利要求1-2中任一项所述的可溶性TNFRp75突变体在制备治疗由TNFα和／或淋巴毒素引起的类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、干燥综合征、强直性脊柱炎、红斑狼疮、皮肌炎、系统性红斑狼疮样综合征的制剂中的用途。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的如权利要求1-2中的任一项所述的可溶性TNFRp75突变体以及医学上可接受的载体。
9.如权利要求4所述的融合蛋白在制备治疗由TNFα和／或淋巴毒素类引起的风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、干燥综合征、强直性脊柱炎、红斑狼疮、皮肌炎、系统性红斑狼疮样综合征的制剂中的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的如权利要求4所述的融合蛋白以及医学上可接受的载体。
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