JP2011511627A - Tnf受容体の可溶性変異体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
配列番号9に示すTNFRp75(E92H):Fc変異体アミノ酸配列、
配列番号10に示すTNFRp75(E92A):Fc変異体アミノ酸配列、
配列番号11に示すTNFRp75(E92N):Fc変異体アミノ酸配列、
配列番号12に示すTNFRp75(E92S):Fc変異体アミノ酸配列、
配列番号13に示すTNFRp75(E92N、W89Y):Fc変異体アミノ酸配列、
配列番号14に示すTNFRp75(E92S、W89Y):Fc変異体アミノ酸配列、
配列番号15に示すTNFRp75(E92N、W89F):Fc変異体アミノ酸配列。
i.野生型可溶性TNFp75受容体をコードする配列を改変して92位アミノ酸を置換し、改変した配列とFc断片をコードする断片とをコンジュゲートし、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子を得るステップと、
ii.上記で得た、改変した可溶性TNFp75受容体:Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現プラスミドにクローン化するステップと、
iii.改変した可溶性TNFp75受容体:Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を保有する発現プラスミドで宿主細胞を形質転換するステップと、
iv.形質転換した宿主細胞を培養するステップと、
v.宿主細胞及び培養液を採取し、次いで可溶性TNFp75受容体:Fc融合タンパク質を分離及び精製するステップとを含む。
(1)TNFRp75(E92H):Fc融合タンパク質をコードする遺伝子の調製
野生型ヒト可溶性TNFRp75:Fc融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を鋳型として用いて、SOE−PCR(Splicing by Overlapped Extension PCR)技術によって可溶性TNFp75受容体をコードする変異体DNA配列を得た。変異部位を含む、可溶性TNFp75受容体をコードするDNA断片の前半を、鋳型として野生型可溶性TNFRp75:Fc融合タンパク質のコードDNA、及び以下のプライマー:
TNFRp75p:aagcttatggctcccgtcgccgtctggg(配列番号16)
E92HpF1:TGCTTGAGCTGTGGCTCCCG(配列番号17)
を用いて増幅した。
Fcp:gaattcctatttacccggagacaggg(配列番号18)
E92HpR1:CGGGAGCCACAGCTCAAGCAgtgGGGAA(配列番号19)
を用いて増幅した。
配列決定により検証した後、上述のようにして得たPCR産物をHindIII及びEcoRIで消化し、次いで市販の発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)に挿入した。制限酵素による消化及びライゲーションは、製品説明書に従って行った。
可溶性TNFp75受容体:Fc融合タンパク質をコードする発現ベクターを大腸菌DH5αに形質転換した。陽性クローンを500mlのLB培養フラスコ中で増殖させ、次いで製品説明書に従ってQiagen社の超高純度プラスミドDNA精製キット(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)により、DNAを抽出及び精製した。上述のようにして得たプラスミドDNAを、製品説明書に従ってInvitrogen社から入手したリポフェクタミンキットを使用して、CHO−K1細胞(ATCCから入手したチャイニーズハムスター卵巣細胞)にトランスフェクトした。
トランスフェクションから24〜48時間後、培養液を、G418(Geneticin)を含む選別用培養液に交換した。細胞クローンが形成されるまで、選別用培養液を3〜4日毎に交換した。細胞クローンが直径1〜2mmに増殖したとき、モノクローンを24穴プレートに移した。細胞が集密度50〜70%に達した後、各穴中の上澄をELISAアッセイにより試験し、TNFRp75変異体:Fc融合タンパク質の高い発現を有するクローンを、薬物による選別のために選択した。薬物の濃度が最大値に達したとき、各クローンにおけるTNFRp75変異体:Fc融合タンパク質の発現濃度を測定し、高い発現濃度及び十分な増殖を有する2つのモノクローナル細胞株を播種用貯蔵のために選択した。
1×105個/mlの細胞を37℃で3〜4日間、500ml培養フラスコ中でぞ職させた。継代:細胞密度が2×105個/mlに達したとき、細胞を720cm2のローラーボトルに移し、3〜4日間培養した。継代:4×107個の細胞を1445cm2のローラーボトルに移し、6日間培養した。培養液の交換:細胞培養がプラットフォームに達したとき、培養液を無血清培地(SFM、Gibco社)に交換した。培養液の回収:SFM中での増殖から6日後、上澄液を採取し、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製して、8.7mgのTNFRp75(E92H):Fc融合タンパク質を精製した。
TNFRp75(E92A):Fc、TNFRp75(E92N):Fc、TNFRp75(E92S):Fc、TNFRp75(E92N、W89Y):Fc、TNFRp75(E92S、W89Y):Fc及びTNFRp75(E92N、W89F):Fcをコードするヌクレオチド配列を産生するための共通プライマーを以下に示す。
TNFRp75F:aagcttatggctcccgtcgccgtctggg(配列番号16)
Fcp:gaattcctatttacccggagacaggg(配列番号18)
(1)細胞播種
L929細胞を1.0×106個/穴の密度で96穴マイクロタイタープレートに播種した。アクチノマイシンD、1ng/mlのLT28−171、及び勾配濃度のTNFRp75(E92A):Fcを実験群の各細胞に添加し、アクチノマイシンD,1ng/mlのLT28−171、及び勾配濃度の野生型rhTNFRp75:Fcを対照群の各細胞に添加した。96穴プレートを37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
培養液を96穴プレートから完全に除去した。40μlの染色液を各穴に添加した。10分後、染色液を除去し、使用した水が無色になるまでプレートを水で3回洗浄した。
データ処理ソフトウェアのグラフパッドプリズム4.0(PraphPad Prism4.0)における4パラメータ式により、結果を自動的に解析した。x軸は標準試料濃度の対数であり、y軸はOD570値である。最大効果の50%に対する濃度(EC50)もこのソフトウェアで導かれ、LTに対するTNFRp75(E92A):Fcの中和活性については7.93ng/ml、LTに対する野生型rhTNFRp75:Fcの中和活性については22.31ng/mlであった。LTに対する変異体の中和活性は、291%に上昇した。実験結果に従ってプロットした「S」字曲線を図1に示した。
L929細胞を1.0×106個/穴の密度で96穴マイクロタイタープレートに播種した。アクチノマイシンD、10ng/mlのTNFα、及び勾配濃度のTNFRp75:Fc又はその変異体をプレートの各細胞に添加した。96穴プレートを37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
(1)材料及び器具
A.リガンドであるTNF−α及びLT、受容体であるrhTNFRp75:Fc、及びTNFRp75(E92N、W89Y):Fc3.8mg/mL
B.HBS−P緩衝液(10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%(v/v)の界面活性剤P20、pH7.4)
C.全てSigma社から購入した、活性化剤であるN−エチル―N’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)、N−ヒドロキシサクシンイミド(NHS)、エタノールアミンなど
D.生体高分子間の相互作用を測定するための装置:GE社から購入したビアコア3000(BIAcore3000)、カルボキシメチルセルロースセンサーチップ(CM5)(G.E.社)
A.rhTNFRp75:Fcのコンジュゲーション
ビアコア3000のソフトウェアウィザード(Wizard)で提供された、アミノ基コンジュゲーション法を用いて、rhTNFRp75:FcをCM5チップのFC2チャンネルにコンジュゲートさせた。HBS−Pをランニング緩衝液として使用し、1mg/mLのrhTNFRp75:FcをNaAC溶液(10mM、pH4.0)中で最終濃度100μg/mLに希釈した。EDC(0.2M)及びNHS(50mM)を1:1の比率で混合し、次いで10μL/分の流速で7分間、チップの表面上に加えた。その後、受容体の溶液を加え、次いでエタノールアミン(1M、pH8.5)を加えてチップの活性化表面を遮断した。TNFRp75の最終コンジュゲーション量は7043.6RUであった。
ビアコア3000のソフトウェアウィザード(Wizard)で提供された、アミノ基コンジュゲーション法を用いて、TNFRp75(E92N、W89Y):FcをCM5チップのFC4チャンネルにコンジュゲートさせた。HBS−Pをランニング緩衝液として使用し、3.8mg/mLのTNFRp75(E92N、W89Y):FcをNaAC溶液(10mM、pH4.0)中で最終濃度100μg/mLに希釈した。EDC(0.2M)及びNHS(50mM)を1:1の比率で混合し、次いで10μL/分の流速で7分間、チップの表面上に加えた。その後、受容体の溶液を加え、次いでエタノールアミン(1M、pH8.5)を加えてチップの活性化表面を遮断した。TNFRp75(E92N、W89Y):Fcの最終コンジュゲーション量は6275.0RUであった。
受容体TNFRp75:FcとTNF又はLTとの結合活性をSPR(表面プラズマ共鳴法)により測定した。リガンドをHBS−P緩衝液中で1nm又は10nmの濃度にそれぞれ希釈し、次いで遠心分離及び注入して、受容体TNFRp75と様々な濃度のリガンドとの結合活性を自動的に測定した。結合活性を示すリガンドに反応速度アッセイを行った。
受容体TNFRp75(E92N、W89Y):FcとTNF又はLTとの結合活性をSPR(表面プラズマ共鳴法)により測定した。リガンドをHBS−P緩衝液中で1nm又は10nmの濃度にそれぞれ希釈し、次いで遠心分離及び注入して、受容体TNFRp75(E92N、W89Y):Fcと様々な濃度のリガンドとの結合活性を自動的に測定した。結合活性を示すリガンドに反応速度アッセイを行った。
Claims (12)
- 配列番号1に示すTNFRp75のN末端の257個アミノ酸を含む可溶性TNFRp75変異体であって、配列番号1に示すアミノ酸配列のN末端92位のGluが置換されている、可溶性TNFRp75変異体。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列のN末端92位のGluが、Asn、His、Ser、Ala、Lys又はGlnのうちの1つによって置換されている、請求項1に記載の可溶性TNFRp75変異体。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列のN末端89位のTrpが置換されている、請求項1に記載の可溶性TNFRp75変異体。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列のN末端92位のGluが、Asn、His、Ser、Ala、Lys又はGlnのうちの1つによって置換されると同時に、配列番号1に示すアミノ酸配列のN末端89位のTrpが、Try、Phe、His、Lys、Met及びLeuのうちの1つによって置換されている、請求項3に記載の可溶性TNFRp75変異体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の可溶性TNFRp75変異体と、別のアミノ酸断片とが形成する融合タンパク質であって、前記別のアミノ酸断片が、ヒト免疫グロブリンの定常部、又はアルブミンの5つの機能領域のうち1つから選択され、かつ、可溶性TNFRp75変異体のC末端に位置する、融合タンパク質。
- 前記別のアミノ酸断片が、ヒト免疫グロブリンの定常部の232個アミノ酸である、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の可溶性TNFRp75変異体をコードするDNA配列。
- 請求項5又は6に記載の融合タンパク質をコードするDNA配列。
- 関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む、TNFα及び/又はリンホトキシン関連疾患の治療のための薬剤製造における、請求項1〜4のいずれか一項に記載の可溶性TNFRp75変異体の使用。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の可溶性TNFRp75変異体の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む、TNFα及び/又はリンホトキシン関連疾患の治療のための薬剤製造における、請求項5又は6に記載の融合タンパク質の使用。
- 請求項5又は6に記載の融合タンパク質の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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