BRPI0905752B1 - Muteína de lipocalina da lágrima humana (htlc), composição farmacêutica, método para a produção de uma muteína de lipocalina da lágrima humana e uso in vitro de uma muteína de lipocalina da lágrima humana - Google Patents

Abstract

MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA (HTLC), MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA OU DISTÚRBIO E USO DE UMA MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA. A presente invenção refere-se a novas muteínas derivadas da lipocalina da lágrima humana dotadas de afinidade pela quinase de tirosina de receptor c-Met humana (c-Met). A invenção também se refere a uma molécula de ácido nucléico que encodifica tal muteína, e a um método para a sua geração. A invenção também se refere a um método para a produção de tal muteína. Finalmente, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende tal muteína de lipocalina, bem como a vários usos da muteína.

Description

[001] O presente relatório descritivo reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório No U.S. 61/024.658, depositado no dia 30 de janeiro de 2008, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[002] A presente invenção refere-se a uma muteína de lipocalina de lágrima humana (hTLc), dotada de afinidade de ligação detectável ao receptor Met humana (c-Met) tirosina-quinase ou um domínio ou fragmentos da mesma. Tal muteína compreende substituições de aminoácido de pelo menos uma dentre a posição de sequência que corresponde às posições de sequência 26 a 34, 56 a 58, 80, 83, 104 a 106, e 108 de hTLC. A invenção também se refere às moléculas de ácido nucléico correspondentes que encodificam tal muteína e a um método para sua geração. A invenção se refere adicionalmente a um método para produzir tal muteína. Finalmente, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica que compreende tal muteína de lipocalina bem como vários usos da muteína.

[003] O receptor Met (RTK) tirosina-quinase foi primeiramente identificada como o produto de um oncogene humano, Tpr-Met (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci, utiliza, Vol. 84, páginas 6379 a 6383, 1987). O ligante para c-Met foi identificado como fator de crescimento do hepatócito (HGF). O HGF foi originalmente identificado como um mitógeno para hepatócitos em cultura. O HGF é idêntico ao fator de dispersão (SF), um fator derivado de fibroblastos que promove dispersão de folhas de células epiteliais, bem como tubulogênese de ramificação de crescimento epitelial em culturas tridimensionais. O HGF/SF é, então, um fator de crescimento único que extrai respostas celulares múltiplas que incluem mitogênese, motilidade celular e morfogênese.

[004] O HGF/SF e c-Met são expressos e muitos tecidos no adulto. A proteína c-Met é expressa principalmente em células epiteliais, porém também nas células endoteliais, células neurais, hepatócitos, células hematopoiéticas, melanócitos. O c-Met poderia ser muito bem um dentre os mais importantes receptores de membrana. Sua ativação desempenha um papel importante em psicologia celular: mitogênese, motogênese, morfogênese. O HGF/SF parece ser produzido essencialmente por células de origem mesenquimal.

[005] Quando o HGF/SF ativa o c-Met, as primeiras proteínas a serem ativadas a jusante são Grb2 (proteína de ligação do receptor do fator de crescimento 2) e Gab 1 (proteína de ligação do receptor do fator de crescimento 2 associada aglutinante 1). A Grb2, por sua vez, pode ativar inúmeras trajetórias de quinase, incluindo a trajetória de Ras a Raf a Mek e a MAPK (quinase de proteína ativada por mitógeno). A Gab 1 ativa PI3K (fosfoinositida 3 quinase), que ativa STAT3 (transdutor de sinal e ativador de transcrição). A ativação de c-Met também induz ativação de beta-catenina, um componente- chave da trajetória wnt que transloca para o núcleo e participa na regulação da transcrição.

[006] A trajetória de HGF/c-Met desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer. Primeiramente através da ativação de trajetórias oncogênicas chave (Ras, PI3K/STAT3, beta-catenina), em segundo lugar, través da proliferação de células endoteliais (neoangio gênese), em terceiro lugar, através da produção de protease aprimorada e, portanto, dissociação celular que induz à metástase.

[007] Várias novas abordagens terapêuticas, algumas das mesmas na fase I ou II dos ensaios clínicos são destinadas na Trajetória de HGF/c-Met. Estas abordagens incluem anticorpos monoclonais anti HGF como a forma humanizada AV299 de AVEO ou um anticorpo completamente humano denominado AMB 102 de Amgen (AMGl 02). Outra abordagem é o uso de variantes truncadas de c-Met que agem como engodos. Tal exemplo é a versão truncada denominada CGEN241 junto à COMPUGEN. Além disso, inibidores de proteína quinase (pequenas moléculas) que bloqueiam trajetórias de c-Met induzido são utilizados para fins terapêuticos. Os exemplos de tais inibidores de proteína quinase de pequena molécula incluem ARQl 97 junto à ARQULE, XL880 junto à EXELIXIS, SGX523 junto à SGX Pharmaceuticals, MP470 junto à SUPERGEN ou PF2341066 junto à PFIZER.

[008] No entanto, é desejável que se tenha compostos adicionais disponíveis que ligam c-Met e que possam, por exemplo, ser utilizados para fins terapêuticos.

[009] Consequentemente, um objetivo da invenção consiste na apresentação de muteínas de lipocalina de lágrima humana dotadas de alta afinidade de ligação para um determinado alvo.

[0010] Este objetivo é atingido, por exemplo, através de muteína de lipocalina de lágrima humana (hTlc) dotada de afinidade de ligação detectável para um receptor Met humano (c-Met) tirosina-quinase ou um domínio ou fragmentos do mesmo, sendo que tal muteína compreende uma substituição de aminoácido de pelo menos uma da posição de sequência que corresponde às posições de sequência 26-34, 56-58, 8O383, 104106, e 108 de hTLC.

[0011] Em um aspecto relacionado, a presente invenção apresenta um método para a geração de uma muteína de lipocalina de lágrima humana, em que a muteína liga c-Met com afinidade de ligação detectável. Este método inclui: (a) a sujeição de uma molécula de ácido nucléico que encodifica uma lipocalina de lágrima humana para mutagênese em pelo menos um códon de qualquer uma das posições de sequência de aminoácido 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 e 108 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura nativa, em que pelo menos um dentre os códons que encodificam resíduos de cisteína nas posições de sequência 61 e 153 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina de lágrima humana madura foi mutado para modificar qualquer outro resíduo de aminoácido, obtendo, deste modo, uma pluralidade de ácidos nucléicos que encodificam muteínas de lipocalina de lágrima humana, (b) a expressão de uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico de muteína obtidas em (a) em um sistema de expressão, obtendo, deste modo, uma ou mais muteína(s), e (c) o enriquecimento de uma ou mais muteína(s) obtidas na etapa (b) e a obtenção de afinidade de ligação detectável para Met através de meios de seleção e/ou isolação.

[0012] Neste contexto, verifica-se que os autores da presente invenção concluíram surpreendentemente que a remoção da ligação de disulfídeo estrutural (no nível de uma biblioteca de ácido nucléico nativo) de lipocalina de lágrima de tipo selvagem formada pelos resíduos de cisteína 61 e 153 (cf. Breustedt, et al. (2005), The 1.8-A crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J. Biol. Chem. 280, 484 a 493) resulta em muteínas de lipocalina de lágrima não apenas dobradas de forma estável, mas, além disso, capazes de se ligar a um determinado ligante não-natural com afinidade na baixa faixa de pico molar.

[0013] O termo "mutagênese", conforme utilizado no presente documento, significa que as condições experimentais são escolhidas de tal modo que o aminoácido de ocorrência natural em uma determinada posição de sequência de lipocalina de lágrima humana (banco de dados Swiss-Prot lançado sob no P31025) , pode ser substituído por pelo menos um aminoácido que não está presente nesta posição específica na sequência de polipeptídeo natural respectiva. O termo "mutagênese" também inclui a modificação (adicional) do comprimento dos segmentos de sequência através de deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos. Dessa maneira, situa-se no âmbito da invenção que, por exemplo, um aminoácido em uma posição de sequência escolhida é substituído por um trecho de três mutações aleatórias, que induz a uma inserção de dois resíduos de aminoácido comparado ao comprimento do segmento respectivo da proteína de tipo selvagem. Tal inserção de deleção pode ser introduzida independentemente um do outro em qualquer segmento de peptídeo que possa ser submetido à mutagênese na invenção. Em uma realização exemplificadora da invenção, uma inserção de várias mutações pode ser introduzida no laço AB da estrutura de lipocalina escolhida (cf. Pedido de Patente Internacional WO 2005/019256 que é incorporado ao presente documento a título de referência integralmente). O termo "mutagênese aleatória"significa que nenhum único aminoácido predeterminado (mutação) está presente em certa posição de sequência, mas que pelo menos dois aminoácidos podem ser incorporados com certa probabilidade em uma posição de sequência pré-definida durante mutagênese.

[0014] A sequência de lipocalina de lágrima humana codificadora (Redl, B. et al. (1992) J. Biol, Chem. 267, 20282 a 20287) é utilizada como ponto inicial para a mutagênese dos segmentos de peptídeo selecionados na presente invenção. Para a mutagênese das posições de aminoácido recitadas, o elemento versado na técnica tem a sua disposição vários métodos padrões estabelecidos para mutagênese direcionada a um local (Sambrook, J. et al. (1989), supra). Uma técnica comumente utilizada é a introdução de mutações através de meios de PCR (reação de cadeia de polimerase) com o uso de misturas de oligonucleotídeos sintéticos, que suportam uma composição base degenerada nas posições de sequência desejadas. Por exemplo, o uso do códon NNK ou NNS (em que N = adenina, guanina ou citosina ou timina; K = guanina ou timina; S = adenina ou citosina) permite a incorporação de todos os 20 aminoácidos mais o códon de terminação âmbar durante mutagênese, enquanto que o códon VVS limita o número de aminoácidos possivelmente incorporados aos 12, desde que o mesmo evite que os aminoácidos Cis, lie, Leu, Met, Fe, Trp, Tir, VaI sejam incorporados na posição selecionada na sequência de polipeptídeo; o uso do códon NMS (em que M = adenina ou citosina), por exemplo, restringe o número de aminoácidos a 11 em uma posição de sequência selecionada desde que o mesmo evite que os aminoácidos Arg, Cis, GIi, He, Leu, Met, Fe, Trp, VaI sejam incorporados em uma posição de sequência selecionada. A este respeito, registra-se que os códons para outros aminoácidos (bem como os 20 aminoácidos de ocorrência natural regulares) como selenocisteína ou pirrolisina também podem ser incorporados em um ácido nucléico de uma muteína. Também é possível, conforme descrito por Wang, L., et al. (2001) Science 292, 498 a 500, ou Wang, L., e Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1 a 11, utilizar códons "artificiais", como UAG, que são usualmente reconhecidos como códons de terminação a fim de inserir outros aminoácidos incomuns, por exemplo, o-metil-L- tirosina ou p- aminofenilalanina.

[0015] O uso de blocos de construção de nucleotídeos com especificidade de par base reduzida, tais como, por exemplo, inosina, 8-oxo-2'deoxiguanosina ou 6(2- deoxi-β-D-ribofuranosil)-3,4-diidro-8H- pirimindo-1,2- oxazina-7-um (Zaccolo et al. (1996) J. MoI. Biol. 255, 589 a 603), é outra opção para a introdução de mutações em um segmento de sequência escolhida.

[0016] Uma possibilidade adicional é a denominada mutagênese tripla. Este método utiliza a mistura de diferentes nucleotídeos triplos, em que cada um dos quais codifica um, para incorporação na sequência de codificação (Virnekas B, Ge L, Pluckthun A, Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide fosforamidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic acids Res 22, 5600 a 5607).

[0017] Uma estratégia possível para introduzir mutações nas regiões selecionadas dos polipeptídios respectivos é baseada no uso de quatro oligonucleotídeos, em que cada um dos quais é parcialmente derivado de um dos segmentos de sequência correspondente a ser transformado. Ao sintetizar estes oligonucleotídeos, um elemento versado na técnica pode empregar misturas de blocos de construção de ácido nucléico para a síntese daqueles nucleotídeos triplos que corresponde às posições do aminoácido a ser transformado de modo que os códons que codificam todos os aminoácidos naturais surjam aleatoriamente, o que resulta na geração de uma biblioteca de peptídeo de lipocalina. Por exemplo, o primeiro oligonucleotídeo corresponde em sua sequência - separado das posições transformadas - ao filamento de codificação para o segmento de peptídeo s ser transformado principalmente na posição N-terminal do polipeptídeo de lipocalina. Consequentemente, o segundo oligonucleotídeo corresponde ao filamento não-codificador para o segundo segmento de sequência seguinte na sequência de polipeptídeo. O terceiro oligonucleotídeo corresponde, às vezes, ao filamento de codificação para o terceiro segmento de sequência correspondente. Finalmente, o quarto oligonucleotídeo corresponde ao filamento não-codificador para o quarto segmento de sequência. Uma reação de cadeia de polimerase pode ser desempenhada em relação ao primeiro e ao segundo oligonucleotídeo e, separadamente, se necessário, em relação ao terceiro e quarto oligonucleotídeo.

[0018] Os produtos de amplificação de ambas as reações podem ser combinados através de vários métodos conhecidos em um único ácido nucléico que compreende a sequência do primeiro ao quarto segmento de sequência, nos quais as mutações foram introduzidas nas posições selecionadas. Para esse fim, ambos os produtos podem, por exemplo, ser submetidos a uma nova reação de cadeia de polimerase com o uso de oligonucleotídeos de acompanhamento bem como uma ou mais moléculas de ácido nucléico mediador, que contribuem com a sequência entre o segundo e o terceiro segmento de sequência. Na escolha do número e disposição na sequência dos oligonucleotídeos utilizados para a mutagênese, o elemento versado na técnica possui inúmeras alternativas à sua disposição.

[0019] As moléculas de ácido nucléico definidas acima podem estar conectadas através de ligação com as seqüências 5'- e 3' que não estão presentes de um ácido nucléico que encodifica um polipeptídeo de lipocalina e/ou o vetor, e podem ser clonadas em um organismo hospedeiro conhecido. Uma enormidade de procedimentos estabelecidos está disponível para ligação e clonagem (Sambrook, J. et al. (1989), supra). Por exemplo, as seqüências de recognição para endonuclease de restrição também presentes na sequência do vetor de clonagem podem ser modificadas na sequência dos oligonucleotídeos sintéticos. Dessa maneira, após a amplificação do produto de PCR respectivo e a clivagem enzimática do fragmento resultante pode ser facilmente clonada com o uso das seqüências de recognição correspondentes.

[0020] Os segmentos de sequência maiores no gene codificador para a proteína selecionada para mutagênese também podem ser submetidos à mutagênese aleatória através de métodos conhecidos, por exemplo, através do uso da reação de cadeia de polimerase sob condições de taxa de erro aumentada, através de mutagênese química ou através de uso de cepas mutadoras bacterianas. Tais métodos também podem ser utilizados para otimização adicional da especificidade ou afinidade de alvo de uma muteína de lipocalina. As mutações que possivelmente ocorrem do lado de fora dos segmentos de mutagênese experimental são frequentemente toleradas ou até podem provar serem vantajosas, por exemplo, se as mesmas contribuem para uma eficácia de dobramento aprimorada ou estabilidade de dobramento da muteína de lipocalina.

[0021] O termo "lipocalina de lágrima humana", conforme utilizado no presente documento para se referir a uma lipocalina de lágrima humana madura, que é depositado junto ao Banco de Dados da SWISS-PROT sob o Número de Acessão P31025 e a sequência de aminoácido da mesma é indicada na SEQ ID N°: 36 neste caso.

[0022] Em uma realização da invenção, o método para a geração de uma muteína de lipocalina de lágrima humana incluir transformar pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, ou 17 dentre os códons de qualquer uma das posições de sequência de aminoácido 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106, e 108 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura. Em outra realização, todas as 18 dentre as posições de sequência de códons de aminoácido 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106, e 108 da sequência de polipeptídeo linear de mature lipocalina de lágrima humana são transformados. Consequentemente, uma muteína de ligação Met da invenção pode compreender uma mutação de qualquer uma das 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 ou 18 das posições de sequência de aminoácido 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106, e 108 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura. No entanto, é evidente para o elemento versado na técnica que submeter uma posição de sequência à mutagênese não significa necessariamente que a possível substituição de aminoácido escolhida irá certamente ocorrer em uma muteína da invenção. Devido à relação de função- estrutura ou mutações de reforço, um resíduo de aminoácido da sequência de lipocalina de lágrima de tipo selvagem também pode ser retido em uma muteína da invenção.

[0023] Em outro aspecto, a presente invenção inclui um método para a geração de uma muteína de lipocalina de lágrima humana, em que a muteína liga c-Met com um determinado ligante não-natural de lipocalina de lágrima humana com afinidade de ligação detectável, que inclui: (a) a sujeição de uma molécula de ácido nucléico que encodifica uma lipocalina de lágrima humana a mutagênese em pelo menos um códon de qualquer uma dentre as posições de sequência de aminoácido 34, 80, e 104 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura, obtendo, deste modo, uma pluralidade de ácidos nucléicos que encodificam muteínas de lipocalina de lágrima humana, (b) a expressão de uma ou mais muteína(s) molécula de ácido nucléico obtidas em (a) em um sistema de expressão, obtendo, deste modo, uma ou mais muteína(s), e (c) o enriquecimento de uma ou mais muteína(s) obtidas na etapa (b) e a obtenção de afinidade de ligação detectável para c-Met como um determinado ligante não-natural de lipocalina de lágrima humana por meios de seleção e/ou isolação.

[0024] Em uma realização do método mencionado acima, adicionalmente pelo menos 2, 3 , 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, ou 15 dentre os códons de qualquer uma das posições de sequência de aminoácido 26-33, 56-58, 83, 105-106, e 108 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura são transformadas.

[0025] Em uma realização adicional da invenção, os métodos, de acordo com a invenção, incluem a mutação de ambos os códons que encodificam cisteína nas posições 61 e 153 na sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura. Ambas as posições podem, por exemplo, ser transformadas para encodificar um resíduo de serina.

[0026] Em outra realização da invenção, conforme descrito no presente documento, os códons que encodificam as posições de sequência de aminoácido 111 e/ou 114 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura são transformados para encodificar, por exemplo, uma prolina na posição 111 e um triptofano na posição 114.

[0027] Outra realização dos métodos da invenção envolve a mutagênese do códon que encodifica a cisteína na posição 101 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina de lágrima humana madura de modo que esse códon encodifique qualquer outro aminoácido. Em uma realização, a posição de encodificação do códon mutado 101 encodifica uma serina. Consequentemente, em algumas realizações, tanto dos quanto todos os três códons de cisteína na posição 61, 101 e 153 são substituídos por um códon de outro aminoácido.

[0028] De acordo com o método da invenção, uma muteína é obtida a partir do ácido nucléico que encodifica lipocalina de lágrima humana. Tal ácido nucléico é submetido à mutagênese e introduzido em um organismo hospedeiro eucariótico ou bacteriano adequado através de meios de tecnologia de DNA recombinante. A obtenção de uma biblioteca de ácido nucléico de lipocalina de lágrima pode ser realizada com o uso de qualquer técnica adequada conhecida na técnica para gerar muteínas de lipocalina com propriedades do tipo anticorpo, isto é, muteínas que têm afinidade em direção a um determinado alvo. Os exemplos de tais métodos combinatórios estão descritos detalhadamente nos pedidos de patente internacionais WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, WO 2006/56464, ou pedido de patente internacional PCT/EP2007/057971, em que as descrições das mesmas estão completamente incorporadas a título de referência ao presente documento, por exemplo. Após a expressão das seqüências de ácido nucléico que foram submetidas à mutagênese em um hospedeiro apropriado, os clones que carregam a informação genética para a pluralidade de muteínas de lipocalina respectivas, que ligam um determinado alvo, podem ser selecionados a partir da biblioteca obtida. As técnicas conhecidas podem ser empregadas para a seleção destes clones, tais como exibição de fago (revisado em Kay, B.K. et al. (1996) supra; Lowman, H.B. (1997) supra ou Rodi, D. J., e Makowski, L. (1999) supra), colony screening (revisado em Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5, 503 a 510), exibição de ribossomo (revisado em Amstutz, P. et al. (2001) Curr, Opin. Biotechnol. 12, 400 a 405) ou exibição de mRNA, conforme reportado em Wilson, D. S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. ScL utiliza 98, 3750-3755 ou nos métodos especificamente descritos em WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, WO 2006/56464 ou no pedido de patente internacional PCT/EP2007/057971, em que a descrição está incorporada ao presente documento a título de referência, por exemplo.

[0029] De acordo com esta descrição, a etapa (c) do método para obter muteína de lipocalina de lágrima de ligação c-Met compreende adicionalmente, em outra realização dos métodos acima: (i) a provisão de c-Met ou um domínio ou fragmentos do mesmo como um ligante determinado, (ii) a colocação da pluralidade de muteínas em contato com o dito ligante a fim de permitir a formação de complexos entre o dito ligante e as muteínas dotadas de afinidade de ligação para o dito ligante, e (iii) a remoção das muteínas que não têm nenhuma ou que têm afinidade substancial de ligação.

[0030] Para a geração de muteínas de lipocalina de lágrima de ligação c-Met, qualquer porção (por exemplo, um fragmento ou domínio único) dos domínios extracelulares do receptor Met humano (c-Met) tirosina-quinase ou de todos os domínios extracelulares (que compreendem os resíduos de aminoácido N-terminal 1 Metiona - Treonina 932 de todo o receptor maduro (SWISS Prot: PO8581)) pode ser colocada em contato com (a pluralidade) de muteínas que foram obtidas para a expressão da biblioteca de ácido nucléico nativo que encodifica estas muteínas. É possível utilizar os domínios extracelulares comercialmente disponíveis que, por exemplo, são fornecidos como resíduos 1 -932 submetidos à fusão em uma região Fc de um IgG humano através de um ligar polipeptídeo, por exemplo (R & D Systems, utiliza, número de catalogo 358-MT). Os exemplos adicionais de fragmentos de c-Met que podem ser utilizados para obter muteínas descritos no presente documento incluem, mas não se limitam a, fragmentos que consistem nos resíduos 25 a 567 de Met, conforme descrito em Stamos et al., The EMBO Journal Vol. 23, N° 12, 2004, páginas 2325 a 2335, que contêm os sete Domínios Sema, ou fragmentos maiores que compreendem os resíduos 25 a 567. Os fragmentos que ligam o domínio SEMA podem ser utilizados, se as muteínas da invenção têm a pretensão de competir com a ligação de HGF dos domínios Sema. Tais muteínas podem ter (mas não têm necessariamente, vide os exemplos) antagonistas de HGF. Também é possível utilizar fragmentos como o que compreende os resíduos 568 a 932, se é para ser evitada a ligação aos Domínios Sema. A exibição também pode ser executada com o uso de fragmentos ou outros domínios como o domínio PSI ou os domínios do tipo IgG de c-Met. Também é possível utilizar para fins de exibição, por exemplo, o homólogo dos chimpanzés comuns (pan trogloditas, 99 % de identificação ao c-Met humano), o homólogo de macaca (macaca mulatta, 98 % de identificação), o ortólogo canino (canis familiaris, 88 %) de identificação), o ortólogo de camundongo (SWISS Prot: Al A597, 87 % de identificação) ou o ortólogo de rato (rattus norvegicus, 86 % de identificação) ao invés dos (domínios extracelulares) c-Met humano. Tal abordagem poderia, por exemplo, ser adotada se as muteínas dotadas de reatividade transversal entre os ortólogos humanos, de camundongo e de rato (ou domínios extracelulares, por exemplo) fossem desejadas. Como é evidente acima, é possível gerar na presente invenção muteínas de lipocalina de lágrima que podem ter uma ação antagonista em relação ao HGF. Alternativamente, as muteínas podem ter um modo de ligação não-antagonístico respectivo (vide exemplo a este respeito).

[0031] Em uma realização do método da invenção, a seleção na etapa (c) é executada sob condições competitivas. As condições competitivas, conforme utilizado no presente documento, significa que aquela seleção de muteínas pode abranger pelo menos uma etapa na qual as muteínas e o ligante de lipocalina de lágrima humana não-natural em questão (alvo) são colocados em contato na presença de um ligante adicional, como HGF, que compete com a ligação das muteínas ao alvo. Este ligante adicional pode ser um ligante fisiológico de c-Met, como HGF, ou qualquer outro ligante não-fisiológico do c-Met, como um anticorpo anti-c-Met ou um inibidor da proteína tirosina-quinase de pequena molécula que liga pelo menos um epítopo sobreposto ou parcialmente sobreposto ao epítopo reconhecido pelas muteínas da invenção e, dessa maneira, interfere na ligação alvo das muteínas. Alternativamente, este ligante adicional pode competir com a ligação das muteínas através da complexação de um epítopo distinto do local de ligação das muteínas ao c-Met através de efeitos alostéricos.

[0032] Uma realização da técnica de exibição de fago (revisada em Kay, B, K. et al. (1996), supra; Lowman, H. B. (1997) supra ou Rodi, D, J., e Makowski, L. (999), supra) com o uso de fago M13 temperado é fornecida como um exemplo de um método de seleção que pode ser empregado na presente invenção. Outra realização da tecnologia de exibição de fago que pode ser utilizada para seleção de muteínas da invenção (vide Seção Experimental) é a tecnologia de fago hiperfago, conforme descrito por Broders et al. (Broders et al. (2003) "Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display." Methods MoL Biol, 205:295 a 302). Outro fago temperado, como fago fl ou lítico, como T7, também pode ser empregado. Para o método de seleção exemplificador, os fagomídeos M13 são produzidos, o que permite a expressão da sequência de ácido nucléico de lipocalina mutada como uma proteína de fusão com uma sequência de sinal no N-terminus, de preferência, a sequência de sinal OmpA, e com a pílula de proteína de capsídeo do fago M13 ou fragmentos do mesmo capazes de serem incorporados no capsídeo de fago no C-terminus. O fragmento ΔpIII de C-terminal da proteína de capsídeo de fago que compreende os aminoácidos 217 a 406 da sequência de tipo selvagem é, de preferência, utilizado para produzir as proteínas de fusão. Especialmente preferencial em uma realização é um fragmento de C-terminal de pílula, em que está faltando o resíduo de cisteína na posição 201 ou é substituído por outro aminoácido.

[0033] Consequentemente, uma realização adicional dos métodos da invenção envolve a fusão de modo operável de um ácido nucléico codificador para a pluralidade de muteínas de lipocalina de lágrima humana e resultante da mutagênese na terminação 3' com um gene que codifica para a pílula de proteína de envoltório de um bacteriófago filamentoso da família M13 ou para um fragmento desta proteína de envoltório, a fim de selecionar pelo menos uma muteína para a ligação de c-Met.

[0034] A proteína de fusão pode compreender componentes adicionais como uma etiqueta de afinidade, que permite a imobilização, detecção e/ou purificação da proteína de fusão ou suas partes. Mais adicionalmente, um códon de terminação pode ser colocado entre as regiões de sequência que encodificam a lipocalina ou suas muteínas e o gene ou fragmentos de capsídeo de fago do mesmo, em que o códon de terminação, de preferência um códon de terminação âmbar, é pelo menos parcialmente traduzido em um aminoácido durante tradução em uma cepa supressora adequada.

[0035] Por exemplo, o vetor de plasmídeo pTLPC27, agora denominado pTlc27, que está descrito no Pedido de Publicação Internacional PCT/EP2007/057971, pode ser utilizado para a preparação de uma biblioteca de fagomídeo que encodifica muteínas de lipocalina de lágrima humana. As moléculas de ácido nucléico inventivas que codificam para as muteínas de lipocalina de lágrima podem ser inseridas no vetor com o uso de dois sítios de restrição BstXI. Após a ligação, uma cepa hospedeira adequada, como E. coli XLl -Blue, é transformada com a mistura de ácido nucléico resultante para render um número amplo de clones independentes. Um vetor respectivo pode ser gerado para a preparação de biblioteca de hiperfagomídeo, se desejado. Alternativamente, qualquer outro vetor de fagomídeo, como, por exemplo, o vetor pTLPC59 utilizado nos Exemplos do presente relatório (vide o Exemplo 1 e a Figura 1) também pode ser utilizado para a preparação da biblioteca de fagomídeo. O vetor pTLPC59 é idêntico ao vetor pTLc27 com a exceção que o gene de biblioteca contrai para a exibição de fago é colocado sob controle de um lac p/o ao invés de um tet p/o e é geneticamente submetido à fusão ao gene III de comprimento completo do fago VCSMl 3.

[0036] A biblioteca resultante pode ser super infectada de maneira subseqüente em cultura líquida com um hiperfago ou fago helper M13 apropriado com a finalidade de produzir fagomídeos funcionais. O fagomídeo recombinante exibe a muteína de lipocalina em sua superfície como uma fusão com a pílula de proteína de envoltório ou um fragmento da mesma, enquanto a sequência de sinal de N-terminal da proteína de fusão é normalmente clivada. Por outro lado, também produz uma ou mais cópias da pílula de proteína capsidial nativa fornecida pelo fago helper e é, dessa maneira, capaz de infectar um recipiente, em geral uma cepa de bactéria que transporta um plasmídeo -F’ ou -F. Em caso de exibição de hiperfago, os hiperfagomídeos exibem as muteínas de lipocalina em sua superfície como uma fusão com a pílula de proteína de envoltório infectada, mas não com a proteína capsidial nativa. Durante ou após a infecção com hiperfago ou fago helper, a expressão de gene da proteína de fusão entre a muteína de lipocalina e a pílula de proteína capsidial pode ser induzida, por exemplo, através da adição de anidrotetraciclina. As condições de indução são escolhidas tal que uma fração substancial dos fagomídeos obtidos exibe pelo menos uma muteína de lipocalina em sua superfície. Em caso de condições de indução de exibição de hiperfago resultam em uma população de hiperfagomídeos que transportam entre três a cinco proteínas de fusão que consistem na muteína de lipocalina e na pílula de proteína capsidial. Vários métodos são conhecidos para isolar os fagomídeos, como precipitação com polietileno glicol. O isolamento ocorre tipicamente após um período de incubação de seis a oito horas.

[0037] Os plasmídeos isolados podem, então, ser submetidos à seleção através da incubação com o alvo desejado (isto é, os domínios extracelulares de c-Met ou porções ou fragmentos dos mesmos), em que o alvo é apresentado em uma forma que permite pelo menos uma imobilização temporária daqueles fagomídeos que transportam muteínas com a atividade de ligação desejada como proteínas de fusão em seu envoltório. Dentre as várias realizações conhecidas do elemento versado na técnica, o alvo pode, por exemplo, ser conjugado com uma proteína carreadora como albumina sérica e pode ser ligado através dessa proteína carreadora a uma superfície de ligação de proteína, por exemplo, poliestireno. As placas de microtitulação adequadas para técnicas de ELISA ou denominadas "imuno-bastonetes" podem ser preferencialmente utilizadas para tal imobilização do alvo. Alternativamente, os conjugados do alvo com outros grupos de ligação, tal como biotina, podem ser utilizados. O alvo pode, então, ser imobilizado em uma superfície que liga de maneira seletiva esse grupo, por exemplo, placas de microtitulação ou partículas paramagnéticas revestidas com estreptavidina, neutravidina ou avidina. Se o alvo for fundido a uma porção de Fc de uma imunoglobina, a imobilização também poderá ser atingida com superfícies, por exemplo, placas de microtitulação ou partículas paramagnéticas, que são revestidas com proteína A ou proteína G.

[0038] Os sítios de ligação de fagomídeo não específicos presentes nas superfícies podem ser saturados com soluções de bloqueio, como são conhecidos para métodos de ELISA. Os fagomídeos são, então, tipicamente colocados em contato com o alvo imobilizado na superfície na presença de um tampão fisiológico. Os fagomídeos não ligados são removidos por múltiplas lavagens. As partículas de fagomídeo restantes na superfície são, então, eluídas. Para a eluição, diversos métodos são possíveis. Por exemplo, os fagomídeos podem ser eluídos através da adição de proteases ou na presença de ácidos, bases, detergentes ou sais caotrópicos ou mediante condições de desnaturação moderadas. Um método preferencial é a elução com o uso de tampões de pH 2,2, em que o eluato é neutralizado subsequentemente. De forma alternativa, uma solução do alvo livre (isto é, os domínios extracelulares de c-Met ou porções ou fragmentos dos mesmos), pode ser adicionada com a finalidade de competir com o alvo imobilizado para se ligar aos fagomídeos ou os fagomídeos de alvo específico podem ser eluídos através da competição com imunoglobinas ou proteínas de ligação natural que se ligam especificamente ao alvo de interesse.

[0039] Mais tarde, as células de E. colisão infectadas com fagomídeos eluídos. Alternativamente, os ácidos nucléicos podem ser extraídos dos fagomídeos eluídos e utilizados para análise seqüencial, amplificação ou transformação de células em outro modo. Partindo dos clones de E. coli obtidos dessa forma, hiperfagomídeos ou fagomídeos frescos são novamente produzidos por super infecção com hiperfagos ou fagos helper M13, de acordo com o método descrito acima, e os fagomídeos amplificados nesse modo são mais uma vez submetidos a uma seleção no alvo imobilizado. Múltiplos ciclos de seleção são frequentemente necessários a fim de obter os fagomídeos com as muteínas da invenção em uma forma suficientemente enriquecida. O número de ciclos de seleção é preferencialmente escolhido tal que na análise funcional subseqüente pelo menos 0,1 % dos clones estudados produzam muteínas com uma afinidade detectável para o alvo em questão. Dependendo do tamanho, isto é, da complexidade da biblioteca empregada, dois a oito ciclos são tipicamente exigidos para esse fim.

[0040] Para a análise funcional das muteínas selecionadas, uma cepa de E. coli pode, então, ser infectada com os fagomídeos obtidos dos ciclos de seleção e o DNA de plasmídeo de filamento duplo correspondente é isolado. Partindo desse DNA de plasmídeo ou também do DNA de filamento único extraído dos fagomídeos, as seqüências de ácido nucléico das muteínas selecionadas da invenção podem ser determinadas pelos métodos conhecidos na técnica e a sequência de aminoácido pode ser deduzida dos mesmos. A região mutada ou a sequência de toda a muteína de lipocalina de lágrima pode ser subclonada em outro vetor de expressão e expressa em um organismo hospedeiro adequado. Por exemplo, o vetor pTlc26 descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2007/057971 pode ser utilizado para a expressão em cepas de E. coli como TG1 de E.coli. As muteínas de lipocalina de lágrima assim produzidas podem ser purificadas através de vários métodos bioquímicos. As muteínas de lipocalina de lágrima produzidas, por exemplo, com pTlc26, transportam o peptídeo de afinidade a Strep-tag® II (Schmidt et al., supra) em suas terminações C e podem, por meio disso, ser preferencialmente purificadas por cromatografia de afinidade de estreptavidina.

[0041] A seleção também pode ser realizada por meio de outros métodos. Muitas realizações correspondentes são conhecidas dos elementos versados na técnica ou são descritos na literatura. Além disso, uma combinação de métodos pode ser aplicada. Por exemplo, os clones selecionados ou pelo menos enriquecidos por "exibição de fago" podem adicionalmente se submetidos à "triagem de colônia". Esse procedimento tem a vantagem de que clones individuais podem ser diretamente isolados em relação à produção de uma muteína de lipocalina de lágrima com afinidade de ligação detectável para c-Met ou, por exemplo, um domínio extracelular de c-Met.

[0042] Em adição ao uso de E. coli como organismo hospedeiro na técnica "exibição de fago" ou no método "triagem de colônia", outras cepas bacterianas, levedura ou também células de insetos ou de mamíferos podem ser utilizadas para esse propósito. Em adição à seleção de uma muteína de lipocalina de lágrima de uma biblioteca (virgem) aleatória conforme descrita acima, métodos evolutivos incluindo mutagênese limitada também podem ser aplicados a fim de otimizar uma muteína que já possua alguma atividade de ligação para o alvo em relação à afinidade ou especificidade para o alvo após ciclos de triagem repetidos.

[0043] Uma vez escolhida uma muteína com afinidade para c-Met ou um domínio ou um fragmento da mesma, é adicionalmente possível submeter tal muteína a outra mutagênese a fim de selecionar subsequentemente variantes de variantes ou afinidade até mesmo mais elevada com propriedades aperfeiçoadas como maior termo estabilidade, estabilidade sérica aperfeiçoada, estabilidade termodinâmica, solubilidade aperfeiçoada, comportamento monomélico aperfeiçoado, resistência aperfeiçoada à desnaturação térmica, desnaturação química, proteólise ou detergentes etc. Essa mutagênese adicional, que no caso de visar uma afinidade maior pode ser considerada como "maturação de afinidade"in vitro, pode ser atingida por mutação específica de sítio com base em um projeto racional ou em uma mutação aleatória. Outra abordagem possível para obter uma afinidade maior ou propriedades aperfeiçoadas é o uso de PCR sujeita a erro, que resulta em mutações de ponto sobre uma faixa selecionada de posições de sequência da muteína de lipocalina. A PCR sujeita a erro pode ser executada de acordo com qualquer protocolo conhecido como um descrito por Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589 a 603. Outros métodos de mutagênese aleatória que são adequados para tais propósitos incluem mutagênese de deleção/inserção aleatória (RID) conforme descrita por Murakami, H et al. (2002) Nat.Biotechnol. 20, 76 a 81 ou recombinação aleatória não homóloga (NRR) conforme descrita por Bittker, J. A et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20,1024 a 1029. Se desejado, a maturação de afinidade também pode ser executada de acordo com o procedimento descrito em WO00/75308 ou Schlehuber, S. et al., (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105 a 1120, onde as muteínas da proteína recombinante que têm alta afinidade para digoxigenina foram obtidas. Uma abordagem adicional para incrementar a afinidade é executar mutagênese de saturação posicional. Nessa abordagem, "pequenas" bibliotecas de ácido nucléico podem ser criadas, nas quais mutações/trocas de aminoácido são somente introduzidas em posições únicas dentro de qualquer dentre os quatro segmentos de laço aqui definidos (vide o Exemplo 21). Essas bibliotecas são, então, diretamente submetidas a uma etapa de seleção (triagem de afinidade) sem voltas adicionais de bateia. Essa abordagem permite a identificação de resíduos que contribuem para incrementar a ligação do alvo desejado e permite a identificação de "pontos de quentes" que são importantes para a ligação. Com tal abordagem, a identificação de resíduos-chave dentro dos primeiros dois segmentos (posições de sequência 24 a 36 ou 56 a 58) é possível, por exemplo.

[0044] Em um aspecto adicional, a presente invenção é direcionada a uma muteína de lipocalina de lágrima humana que tem afinidade de ligação detectável para c-Met ou um domínio ou porção da mesma, que é obtida passível de obtenção ou obtida através dos métodos detalhados acima da invenção.

[0045] Em uma realização, a muteína de lipocalina de lágrima humana obtida de acordo com os métodos acima inclui a substituição de pelo menos um ou de ambos os resíduos de cisteína que ocorre em cada das posições de sequência 61 a 153 por outro aminoácido e a mutação de pelo menos um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições de sequência 26 a 34, 56 a 58, 80, 83, 104 a 106 e 108 da sequência polipeptídica linear de lipocalina de lágrima humana madura. As posições 24 a 36 estão compreendidas no laço AB, as posições 53 a 66 estão compreendidas no laço CD, as posições 69 a 77 estão compreendidas no laço EF e as posições 103 a 110 estão compreendidas no laço GH no sítio de ligação na extremidade aberta da estrutura de cilindro β da lipocalina de lágrima. A definição desses quatro laços é utilizada nesse documento de acordo com Flower (Flower, D.R. (1996), supra e Flower, D.R. et al. (2000), supra). Usualmente, tal muteína compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 ou 18 resíduos de aminoácido mutados nas posições de sequência 26 a 34, 56 a 58, 80, 83, 104 a 106 e 108 da sequência polipeptídica linear de lipocalina de lágrima humana madura. Em uma realização específica, a muteína compreende as substituições de aminoácido Cis 61 ^ Ala, Fe, Lis, Arg, Thr, Asn, Tir, Met, Ser, Pro ou Trp e Cis 153 ^ Ser ou Ala. Tal substituição foi comprovada útil para evitar a formação de ocorrência natural de ligação em ponte de dissulfeto Cis 61 e Cis 153 e, dessa maneira, facilitar o manejo da muteína.

[0046] Em ainda outra realização, a muteína compreende pelo menos uma substituição adicional de aminoácido adicional selecionado de Arg 111 ^ Pro e Lis 114 ^ Trp. Uma muteína da invenção pode compreender adicionalmente a cisteína na posição 101 da sequência de lipocalina de lágrima humana madura nativa substituída por outro aminoácido. Essa substituição pode, por exemplo, ser a mutação Cis 101 ^ Ser ou Cis 101 ^ Thr.

[0047] A muteína de lipocalinas da invenção pode compreender a sequência de aminoácido (natural) de tipo selvagem fora das posições de sequência de aminoácido mutado. Por outro lado, a muteína de lipocalinas revelada no presente documento também pode conter mutações de aminoácido fora das posições de sequência submetidas à mutagênese enquanto aquelas mutações não interferem com a atividade de ligação e a duplicação da muteína. Tais mutações podem ser facilmente realizadas em nível de DNA com o uso de métodos padrões estabelecidos (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA). As alterações possíveis da sequência de aminoácido são inserções ou deleções assim como substituições de aminoácido. Tais substituições podem ser conservadoras, isto é, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido quimicamente similar. Exemplos de substituições conservadoras são as reposições dentro dos membros dos seguintes grupos: 1) alanina, serina e treonina; 2) ácido aspártico e ácido glutâmico; 3) asparagina e glutamina; 4) arginina e lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina e valina; e 6) fenilalanina, tirosina e triptofano. Por outro lado, também é possível introduzir alterações não conservadoras na sequência de aminoácido. Em adição, ao invés de substituir resíduos de aminoácido único, também é possível tanto inserir quanto deletar um ou mais aminoácidos contínuos da estrutura primária de lipocalina de lágrima enquanto essas deleções ou inserções resultam em uma muteína funcional/dobrada estável (vide, por exemplo, a seção experimental na qual muteínas com terminações -N e -C truncadas são geradas).

[0048] Tais modificações da sequência de aminoácido incluem mutagênese direcionada de posições de aminoácido único a fim de simplificar a sub-clonagem do gene de lipocalina mutado ou suas partes através da incorporação de sítios de clivagem para certas enzimas de restrição. Em adição, essas mutações também podem ser incorporadas para incrementar adicionalmente a afinidade de uma muteína de lipocalina para um determinado alvo. Adicionalmente, as mutações podem ser introduzidas a fim de modular determinadas características da muteína tais como o aumento da estabilidade da duplicação, a estabilidade sérica, a resistência da proteína ou a solubilidade em água ou para reduzir a tendência à aglutinação, caso necessário. Por exemplo, a ocorrência natural de resíduos de cisteína pode ser mutada para outros aminoácidos a fim de evitar a formação em ponte de dissulfeto. Todavia, também é possível mutar deliberadamente outra posição de sequência de aminoácido para cisteína a fim de introduzir novos grupos de reação, por exemplo, para a conjugação para outros compostos, como polietileno glicol (PEG), amido de hidroxietil (HES), biotina, peptídeos ou proteínas ou para a formação de ocorrência não natural de ligações de dissulfeto. As possibilidades exemplificadoras de tal mutação para introduzir um resíduo de cisteína na sequência de aminoácido de uma muteína de lipocalina de lágrima humana incluem as substituições Thr 40 ^ Cis, GIu 73 ^ Cis, Arg 90 ^ Cis, Asp 95 ^ Cis, Lis 121 ^ Cis, Asn 123 ^ Cis e GIu 131 ^ Cis. A porção de tiol gerada no lado de qualquer das posições de aminoácido 40, 73, 90, 95, 121, 123 e/ou 131 pode ser utilizada para PEGilar ou HESilar a muteína, por exemplo, a fim de aumentar a meia-vida sérica de uma muteína de lipocalina de lágrima respectiva. A muteína S244,2-H08 na qual uma cisteína é introduzida em qualquer dessas posições de sequência (consultar Exemplo 9) é um exemplo ilustrativo de tais muteínas da invenção. A cadeia lateral de qualquer dos resíduos de cisteína pode, logicamente, ser utilizada não somente para a conjugação de compostos que aumentam a meio-vida sérica, mas assim como para a conjugação de qualquer parceiro de conjugação desejado como uma molécula orgânica, um marcador de enzima, uma toxina, um cistostástico, um marcador radioativo farmaceuticamente adequado, um marcador fluorescente, um marcador cromogênico, um marcador luminescente, um hapteno, digoxigenina, biotina, um complexo metálico, um metal ou ouro coloidal, para citar apenas alguns exemplos lembrados. A conjugação pode ser executada com o uso de qualquer método de acoplamento convencional conhecido na técnica (vide, por exemplo, o Exemplo 18, no qual o resíduo de cisteína pode ser ativado por um reagente como Tris[2-carboxietil] fosfina (TCEP) ou ditiotreitol (DTT) e, então, adicionalmente reagido com um reagente como hidrocloreto de 3-N-maleimido-6- hidraziniopiridina (HYNIC).

[0049] A presente invenção também engloba muteínas truncadas (isto é, fragmentos) conforme definido acima, nas quais, por exemplo, os primeiros quatro resíduos de aminoácido N-terminal da sequência de lipocalina de lágrima humana madura (His-His-Leu-Leu; posições 1 a 4) e/ou os últimos dois resíduos de aminoácido C-terminal (Ser-Asp; posições 157 a 158) da sequência de lipocalina de lágrima humana madura foram deletados (cf. também os Exemplos e as Listagens de Sequência em anexo).

[0050] As muteínas de lipocalina da invenção são capazes de se ligar ao alvo desejado, isto é, do receptor c- Met tirosina-quinase ou um domínio ou fragmento do mesmo com afinidade detectável, isto é, com uma constante disassociação de pelo menos 200 nM. Presentemente preferenciais em algumas realizações são as muteínas de lipocalina, que ligam o alvo desejado a uma constante disassociação para um determinado alvo de pelo menos 100, 20, 1 nM ou até menos. A afinidade de ligação de uma muteína ao alvo desejado pode ser medida por uma grande quantidade métodos como titulação fluorescente, ELISA de competição ou ressonância de plasma de superfície (BIAcore).

[0051] É imediatamente aparente para o elemento versado que a formação complexa é dependente de muitos fatores como concentração dos parceiros de ligação, a presença de competidores, força iônica do sistema tampão etc. A seleção e enriquecimento são geralmente executados mediante as condições que permitem o isolamento de muteínas de lipocalina que têm, juntamente com o alvo desejado (c-Met ou um domínio ou fragmento do mesmo), uma constante disassociação de pelo menos 200 nM. Entretanto, as etapas de lavagem e elução podem ser executadas sob a variação de severidade. Uma seleção em relação às características cinéticas também é possível. Por exemplo, a seleção pode ser realizada sob condições que favorecem a formação do complexo do alvo com muteínas que mostram uma lenta disassociação do alvo ou, em outras palavras, uma baixa taxa koff. Alternativamente, a seleção pode ser realizada sob condições que favorecem a rápida formação do complexo entre a muteína e o alvo ou, em outras palavras, uma alta taxa kon. Como uma alternativa ilustrativa adicional, a triagem pode ser realizada sob condições que selecionam para um termo estabilidade aperfeiçoada das muteínas (comparada tanto à lipocalina de lágrima de tipo selvagem quanto a uma muteína que já tem afinidade em direção a um alvo pré-selecionado) ou para uma estabilidade de pH da muteína.

[0052] Uma muteína de lipocalina de lágrima da invenção existe tipicamente como proteína monomélica. Todavia, também é possível que uma muteína de lipocalina inventiva seja capaz de formar ou dímeroizar espontaneamente oligômeros mais elevados. Embora o uso de muteínas de lipocalina que formam monômeros estáveis possa ser preferencial para algumas aplicações, por exemplo, devido à difusão mais rápida e melhor penetração de tecido, o uso de muteínas de lipocalina que formam espontaneamente multímeros ou homodímeros estáveis pode ser vantajoso em outros casos, desde que os multímeros possam forneçam uma avidez e/ou afinidade aumentada (adicional) para um determinado alvo. Adicionalmente, as formas oligoméricas da muteína de lipocalina podem ter taxas disassociação mais lentas ou meia-vida sérica prolongada. Se a dimerização ou multimerização de muteínas que formam monômeros estáveis for desejada, isso pode, por exemplo, ser alcançado através da fusão dos respectivos domínios de oligomerização como domínios jun-fos ou zíper de leucina para as muteínas da invenção ou através do uso de "Duocalins" (consultar também abaixo).

[0053] Uma muteína de lipocalina de lágrima da invenção pode ser utilizada para a formação complexa com c-Met ou um domínio ou fragmento do mesmo, por exemplo, in vitro, para propósitos de diagnóstico ex vivo ou in vivo, para propósitos terapêuticos.

[0054] Em geral, o termo "fragmento", conforme utilizado nesse documento em relação ao c-Met, se refere à proteína encurtada com terminação -C e/ou terminação -N ou a ligantes de peptídeo, que retém a capacidade do ligante de comprimento inteiro de ser reconhecido e/ou ligado por uma muteína de acordo com a invenção. O termo "domínio"em relação a c-Met deve ser compreendido de acordo com o significado regular utilizado na técnica. Por exemplo, o termo "domínio"compreende os domínios Sema conforme definidos estruturalmente por Stamos et al., The EMBO Journal, Vol. 23, páginas 2325 a 2335, 2004 (vide, por exemplo, a Figura 3a ou a Figura 4 de Stamos et al.), o domínio PSI, os domínios como IgG, o domínio transmembrana ou também o domínio tirocinada tirosina-quinase, conforme definidos estruturalmente por Schiering et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 100, N°. 22, páginas 12654 a 12659, 2003). O termo "domínio" também compreende qualquer porção extracelular de c-Met formada por resíduos Met1 a Thr 932 da proteína de receptor de comprimento inteiro ou fragmentos truncados formados, por exemplo, por resíduos 2, 3, 4, 5, 6 para resíduos 920, 925, 930 ou 931 do receptor de comprimento inteiro. Conforme mencionado acima, através do uso, por exemplo, de todos os domínios extracelulares ou de apenas alguns dos domínios extracelulares, por exemplo, os domínios sema, é possível gerar tanto muteínas que se ligam ao sítio de ligação HGF (e, então, têm possivelmente um modo de ligação antagonista em relação à HGF) ou também muteínas que têm um modo de ligação não antagonista em relação à ligação HGF.

[0055] Nesse contexto também é observado que a formação de complexo entre a muteína respectiva e c-Met ou um domínio ou fragmento do mesmo é influenciada por muitos fatores diferentes como as concentrações dos parceiros de ligação respectivos, a presença de competidores, pH e a força iônica do sistema tampão utilizado e o método experimental utilizado para a determinação do KD de constante disassociação (por exemplo, titulação fluorescente, ELISA de competição ou ressonância de plasmon de superfície, apenas para citar alguns) ou até o algoritmo matemático que é utilizado para a avaliação dos dados experimentais.

[0056] Para isso, também é evidente para o elemento versado que os valores de KD (constante disassociação do complexo formado entre a muteína respectiva e seu ligante) fornecidos no presente documento podem variar dentro de uma determinada faixa experimental, dependendo do método e configuração experimental que são utilizados para determinar a afinidade de uma muteína de lipocalina particular para um determinado ligante. Isso significa que pode existir um pequeno desvio nos valores de KD medidos ou uma faixa de tolerância dependendo, por exemplo, se o valor de KD foi determinado pela ressonância de plasmon de superfície (Biacore) ou por ELISA de competição.

[0057] Em uma realização específica da invenção, uma muteína de lipocalina de lágrima compreende, em relação à sequência de aminoácido de lipocalina de lágrima humana madura, pelo menos 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 17 substituições de aminoácido em relação à sequência de aminoácido de lipocalina de lágrima humana madura, que são selecionados do grupo que consiste em Arg 26 ^ Thr, Val, Pro, Ser, Gli; Glu 27 ^ Gln5 Gli, Val, Ser; Fe 28 ^ Met, Asp; Pro 29 ^ Leu, Lie, Ala, Trp; Glu 30 ^ Leu, Gli, Arg, Fe; Met 31 ^ Ser; Asn 32 ^ Leu, Arg, Val, Gln; Leu 33 ^ Tyr3 Val, He, Thr, Fe; Glu 34 ^ Val, Arg, Ala; Leu 56 ^ Asn; He 57 ^ Gln; Ser 58 ^ He, Val; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli.

[0058] Em uma realização mais específica, uma muteína da invenção compreende adicionalmente pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em Thr 37 -> Ser; Met 39 - > He, Leu; Asn 48 -> Ser; Lis 52 - > Thr, Met; Met 55 -> Leu; Lis 65 -> Arg, Leu; Ala 79 -> Leu, Ser; Ala 86 -> Thr; e Lie 89 -> Ser, Gln, Thr, His.

[0059] Em outra realização mais específica, uma compreende as substituições de aminoácido: Arg 26 -> Thr; Glu 27 --> Gln; Glu 30 -> Leu; Met 31 -> Ser; Asn 32-> Leu; Leu 33 -> Tir; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; He 57 -> Gln; Asp 80 -> Tir; Lis 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 - -> Tip; e Lis 108 -> Gli.

[0060] Em ainda outra realização mais específica da invenção, uma muteína da invenção compreende as substituições de aminoácido: Met 31 ^ Ser; Leu 56 ^ Asn; Ile 57 ^ Gln; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli.

[0061] Em outras realizações, uma muteína da invenção pode compreender um dos conjuntos a seguir de substituições de aminoácido: (1) Arg 26 ^ Thr; Glu 27. Gln; Fe 28 ^ Met; Glu 30 ^ Leu; Met 31 ^ Ser; Asn 32 ^ Leu; Leu 33 ^ Tir; Glu 34 ^ Val; Leu 56 ^ Asn; Ile 57 ^ Gln; Ser 58 ^ Ile; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; (2) Arg 26 ^ Thr; Glu 27 ^ Gln; Fe 28 ^ Asp; Glu 30 ^ Leu; Met 31 ^ Ser; Asn 32 ^ Leu; Leu 33 ^ Tir; Glu 34 ^ Val; Leu 56 ^ Asn; 57 ^ Gln; Ser 58 ^ Val; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; (3) Arg 26 ^ Thr; Glu 27 ^ Gln; Fe 28 ^ Asp; Glu 30 ^ Leu; Met 31 ^ Ser; Asn 32^ Leu; Leu 33 ^ Tir; Glu 34 ^ Val; Leu 56 ^ Asn; lie 57 ^ Gln; Ser 58 ^ He; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; (4) Arg 26 ^ Val; Glu 27 ^ Gli; Fe 28 ^ Asp; Pro 29 ^ Leu; Glu 30 ^ Gli; Met 31 ^ Ser; Asn 32^ Arg; Leu 33 ^ Val; Glu 34 ^ Val; Leu 56 ^ Asn; He 57 ^ Gln; Ser 58 ^ He; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; (5) Arg 26 ^ Pro; GIu 27 ^ Gli; Fe 28 ^ Asp; Pro 29 ^ Ile; Glu 30 ^ Arg; Met 31 ^ Ser; Asn 32^ Leu; Leu 33 -^ Ile; Glu 34 ^ Val; Leu 56 ^ Asn; He 57 ^ Gln; Ser 58 ^ Ile; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; (6) Arg 26 ^ Ser; Fe 28 ^ Asp; Pro 29 ^ Ala; Glu 30 ^ Fe; Met 31 ^ Ser; Asn 32^ Val; Leu 33 ^ Thr; Glu 34 ^ Val; Leu 56 ^ Asn; He 57 ^ Gln; Ser 58 ^ He; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; (7) Arg 26 ^ Val; Glu 27 ^ Val; Fe 28 ^ Asp; Pro 29 ^ Trp; Glu 30 ^ Arg; Met 31 ^ Ser; Asn 32^ Gln; Leu 33 ^ Val; Glu 34 ^ Arg; Leu 56 ^ Asn; He 57 ^ Gln; Ser 58 -^ He; Asp 80 ^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli; e (8) Arg 26 ^ Gli; Glu 27 ^ Ser; Fe 28 ^ Asp; Pro 29 ^ Trp; Met 31 ^ Ser; Asn 32^ Val; Leu 33 ^ Fe; Glu 34 ^ Ala; Leu 56 ^ Asn; He 57 ^ Gln; Ser 58 ^ He; Asp 80 -^ Tir; Lis 83 ^ Ala; Glu 104 ^ Asp; Leu 105 ^ Thr; His 106 ^ Trp; e Lis 108 ^ Gli.

[0062] A muteína de lipocalina da lágrima de ser humano que se liga a c-Met ou a um domínio ou fragmento do mesmo pode compreender, consistir essencialmente de, ou consistir de qualquer uma das seqüências de aminoácido apresentadas em qualquer uma dentre SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 4 a 9, SEQ ID N°: 22 a 26, ou SEQ ID N°: 32 a 35 e 37 a 49, ou de um fragmento ou variante das mesmas. Em uma realização, a muteína, de acordo com a invenção, compreende, consiste essencialmente de, ou consiste da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22 a 26, 32 a 35, ou 42 a 49, ou um fragmento ou variante da mesma. Sobre esse assunto, observa-se que todas as muteínas reveladas na presente invenção podem ser ligadas, um terminal N ou C a uma etiqueta de afinidade como uma etiqueta de penta-histidina, uma etiqueta de hexahistidina ou um Streptag® (consultar a SEQ ID N°: 37 a 41, por exemplo, em que uma etiqueta de hexahistidina é fusionada à terminação C das muteínas). Dessa forma, o presente pedido também engloba todas as muteínas descritas genérica e explicitamente equipadas com essas etiquetas.

[0063] O termo "fragmento" conforme utilizado na presente invenção em conexão com as muteínas da invenção refere-se às proteínas ou peptídeos derivados do comprimento total da lipocalina da lágrima de um ser humano maduro que tem a terminação N e/ou a terminação C encurtadas, isto é, faltando pelo menos um dos aminoácidos do terminal N e/ou terminal C. Esses fragmentos compreendem, preferencialmente, pelo menos 10, mais preferencialmente 20, e com a máxima preferência, 30 ou mais aminoácidos consecutivos da sequência primária da lipocalina da lágrima de um ser humano maduro, e são, geralmente, detectáveis em um imunoensaio de lipocalina da lágrima de um ser humano maduro.

[0064] O termo "variante" conforme utilizado na presente invenção se refere a derivados de uma proteína ou peptídeo que compreendem modificações da sequência de aminoácido, por exemplo, mediante a substituição, deleção, inserção ou modificação química. Preferencialmente, essas modificações não reduzem a funcionalidade da proteína ou peptídeo. Essas variantes incluem proteínas, em que um ou mais aminoácidos foram substituídos por seus respectivos estereoisômeros D ou por seus aminoácidos além dos aminoácidos 20 que ocorrem naturalmente tal como, por exemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. Entretanto, essas substituições também podem ser conservativas, isto é, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido quimicamente similar. Os exemplos de substituições conservativas são as substituições entre os membros dos grupos a seguir: 1) alanina, serina e treonina; 2) ácido aspártico e ácido glutâmico; 3) asparagina e glutamina; 4) arginina e lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina, e valina; e 6) fenilalanina, tirosina, e triptofano.

[0065] Nesse contexto, observa-se que as muteínas da invenção foram verificadas como sendo estáveis dentro de uma ampla faixa de pH de aproximadamente 2,5 de pH a aproximadamente 9,5 de pH, por exemplo, em um pH na faixa de aproximadamente 3,0 de pH a aproximadamente 9,2 de pH.

[0066] Também estão incluídas no âmbito da presente invenção as muteínas acima, as quais foram alteradas com relação à sua imunogenicidade potencial.

[0067] As células T citotóxicas reconhecem antígenos de peptídeo sobre a superfície celular de uma célula que apresenta um antígeno em associação com uma molécula (MHC) do complexo de histocompatibilidade principal de classe 1. A capacidade dos peptídeos de se ligarem às moléculas de MHC é alelo-específica e se correlaciona com a sua imunogenicidade. A fim de reduzir a imunogenicidade de uma determinada proteína, a capacidade de prever quais peptídeos em uma proteína têm o potencial de se ligarem a uma determinada molécula de MHC é de grande valor. As abordagens que empregam uma abordagem encadeamento computacional para identificar epítopos de célula T em potencial foram descritas previamente para prever a ligação de uma determinada sequência de peptídeo a moléculas de MHC de classe 1 (Altuvia et al. (1995) J. MoL Biol. 249: 244 a 250).

[0068] Essa abordagem também pode ser utilizada para identificar epítopos de célula T em potencial nas muteínas da invenção, e para realizar, dependendo de seu uso pretendido, uma seleção de uma muteína específica com base em sua imunogenicidade prevista. Além disso, pode ser possível submeter regiões de peptídeo que foram previstas como contendo epítopos de célula T a mutagênese adicional para reduzir ou eliminar esses epítopos de célula T e, dessa forma, minimizar a imunogenicidade. A remoção de epítopos anfipáticos dos anticorpos geneticamente elaborados foi descrita (Mateo et al. (2000) Hybridoma 19(6):463 a 471) e, talvez, adaptada às muteínas da presente invenção. As muteínas obtidas dessa forma podem possuir uma imunogenicidade minimizada que é desejável para seu uso em aplicações terapêuticas e de diagnóstico, tais como aquelas descritas abaixo.

[0069] Para algumas aplicações, também é útil empregar as muteínas da invenção de uma forma conjugada. Consequentemente, a invenção também se refere às muteínas de lipocalina que são conjugadas a um parceiro de conjugação que pode ser selecionado do grupo consistindo em um marcador enzimático, um marcador colorido, um agente citostático, um marcador que pode ser foto-ativada e que é adequada para uso em uma terapia fotodinâmica, haptenos, digoxigenina, biotina, um metal químio terapêutico, ou um metal quimioterapêutico, e ouro coloidal. A muteína também pode ser conjugada a uma molécula orgânica de droga. O termo "molécula orgânica"conforme utilizado na presente invenção denota preferencialmente uma molécula orgânica que compreende pelo menos dois átomos de carbono, mas preferencialmente não mais que 7 ou 12 ligações de carbono giratório, com um peso molecular na faixa entre 100 e 2.000 Daltons, preferencialmente entre 100 e 1.000 Daltons, e incluindo opcionalmente um ou dois átomos de metal.

[0070] Em geral, é possível marcar uma muteína de lipocalina de lágrima descrita na presente invenção com qualquer enzima ou substância química adequada que gere direta ou indiretamente um composto ou sinal detectável em uma reação química, física, óptica ou enzimática. Um exemplo de uma reação física e, ao mesmo tempo, identificador/reação óptica é a emissão de fluorescência mediante irradiação. A fosfatase alcalina, a peroxidase de rábano silvestre ou a β-galactosidase são exemplos de marcadores enzimáticos (e, ao mesmo tempo, marcadores ópticos) que catalisam a formação de produtos de reação cromogênica. Em geral, todos os marcadores comumente utilizados em anticorpos (exceto aqueles utilizados exclusivamente com a porção de açúcar na parte Fc das imunoglobulinas) também podem ser utilizados na conjugação às muteínas da presente invenção. As muteínas da invenção também podem ser conjugadas com qualquer agente ativo terapeuticamente adequado, por exemplo, para a aplicação precisa desses agentes em uma determinada célula, tecido ou órgão, ou para o direcionamento seletivo de células, por exemplo, de células de tumor sem afetar as células circundantes normais. Os exemplos desses agentes terapeuticamente ativos incluem radionuclídeos, toxinas, moléculas orgânicas pequenas, e peptídeos terapêuticos (tais como os peptídeos que atuam como agonistas/antagonistas de um receptor ou peptídeos de superfície celular que concorrem por um sítio de ligação de proteína em um determinado alvo celular). Os exemplos de toxinas adequadas incluem, mas não se limitam a toxina pertussis, toxina diftérica, ricina, saporina, exotoxina de pseudomonas, calicheamicina ou um derivado dos mesmos, um taxóide, um maitansinoide, uma tubulisina ou um análogo de dolastatina. O análogo de dolastatina pode ser auristatina E, monometilauristatina E, auristatina PYE e auristatina PHE. Exemplos de um agente citostático incluem, mas não se limitam a, Cisplatina, Carboplatina, Oxaliplatina, 5-Fluorouracila, Taxotere (Docetaxel), Paclitaxel, Antraciclina (Doxorrubicina), Metotrexato, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, Dacarbazina, Ciclofosfamida, Etoposídeo, Adriamicina, Camptotecina, compostos relacionados à Combretatastina A-4, sulfonamidas, oxadiazolinas, piranos espinocetais benzo[b]tiofenossintéticos, compostos de monotetraidrofurano, curacina e derivados de curacina, derivados de metóxiestradiol e Leucovorina. A muteína de lipocalinas da invenção também pode ser conjugada com ácidos nucléicos terapeuticamente ativos como as moléculas de ácido nucléico anti-sentido, pequenos RNAs de interferência, micro RNAs ou ribozimas. Esses conjugados podem ser produzidos por meio de métodos bem conhecidos no estado da técnica.

[0071] Em uma realização, as muteínas da invenção também podem ser acopladas a uma porção de direcionamento que direciona uma região de corpo específica a fim de aplicar as muteínas da presente invenção em uma região ou área desejada dentro do corpo. Um exemplo em que essa modificação pode ser desejável é o atravessamento da barreira hematoencefálica. A fim de atravessar a barreira hematoencefálica, as muteínas da invenção podem ser acopladas às porções que facilitam o transporte ativo através dessa barreira (vide Gaillard PJ, e al., Diphtheria-toxin receptor-targeted brain drug delivery. International Congress Series. 2005 1277; 185 a 198 ou Gaillard P J, et al. Targeted delivery across the blood- brain barrier. Expert Opin Drug Deliv. 2005 2(2): 299 a 309. Essas porções estão, por exemplo, disponíveis sob o nome comercial 2B-Trans™ (to-BBB technologies BV5 Leiden, NL).

[0072] Conforme indicado acima, uma muteína da invenção, em algumas realizações, pode ser conjugada a uma porção que estende a meia vida do soro da muteína (nesse sentido, vide também o Pedido de Patente Internacional PCT/EP2007/057971 ou também a publicação PCT WO 2006/56464 em que essas estratégias de conjugação são descritas com referências a muteínas de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano com uma afinidade de ligação com CTLA-4). A porção que estende a meia vida do soro pode ser uma molécula de polialquileno glicol, amido de hidroxietil, moléculas de ácido graxo, tal como o ácido palmítico (Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol Rev. 52, 1 a 9), uma parte Fc de imunoglobulina, um domínio CH3 de imunoglobulina, um domínio CH4 de imunoglobulina, albumina ou um fragmento dos mesmos, um peptídeo de ligação de albumina, uma proteína de ligação de albumina, uma proteína de ligação de IgG-Fc, ou uma transferrina para nomear apenas algumas. A proteína de ligação de albumina pode ser uma proteína de ligação de albumina bacteriana, um anticorpo, um fragmento de anticorpo que incluem anticorpos de domínio (vide a patente norte-americana 6.696.245, por exemplo), uma muteína de lipocalina ou outra proteína ou domínio de proteína com uma atividade de ligação para albumina. Consequentemente, parceiros de conjugação adequados para a extensão da meia vida de uma muteína de lipocalina da invenção incluem albumina (Osborn, B. L. et al. (2002) Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys J. Pharmacol. Exp. Ther, 303, 540 a 548), ou uma proteína de ligação de albumina, por exemplo, um domínio de ligação de albumina bacteriana, como uma proteína estreptococal G (Konig, T. e Skerra, A. (1998) Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J. Immunol. Methods 218, 73 a 83). Outros exemplos de peptídeos de ligação de albumina que podem ser utilizados como parceiro de conjugação, por exemplo, são aqueles que têm uma sequência consensual Cis-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cis, em que Xaa1 é Asp, Asn, Ser, Thr, ou Trp; Xaa2 é Asn, Gln, His, He, Leu, ou Lis; Xaa3 é Ala, Asp, Fe, Trp, ou Tir; e XaO4 é Asp, Gli, Leu, Fe, Ser, ou Thr conforme descrito no pedido de patente norte-americana 2003/0069395 ou Dennis et al. (Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002). " Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. " J Biol Chem 277, 35035 a 35043).

[0073] Em outras realizações, a própria albumina ou um fragmento ativo biológico de albumina pode ser utilizado como um parceiro de conjugação de uma muteína de lipocalina da invenção. O termo "albumina" compreende todas as albuminas de seres mamíferos como a albumina de soro humano ou a albumina de soro bovino ou a albumina de rato. A albumina ou um fragmento da mesma podem ser recombinantemente produzidos conforme descrito na patente norte-americana 5.728.553 ou nos pedidos de patente Européia EP 0 330 451 e EP 0 361 991. A albumina de ser humano recombinante (Recombumin®) Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK) pode ser conjugada ou fusionada a uma muteína de lipocalina a fim de estender a meia vida da muteína.

[0074] Se a proteína de ligação de albumina for um fragmento de anticorpo, ela poderá ser um anticorpo de domínio. Os anticorpos de domínio (dAbs) são elaborados para permitir um controle preciso sobre propriedades biofísicas e a meia vida in vivo para criar um perfil de produto com segurança e eficácia ótimas. Os anticorpos de domínio, por exemplo, estão disponíveis comercialmente junto à Domantis Ltd. (Cambridge, UK e MA, EUA).

[0075] Com o uso da transferrina como uma porção para estender a meia vida do soro das muteínas da invenção, as muteínas podem ser fusionadas geneticamente à terminação N ou C, ou ambas, de transferrina não glicosilada. A transferrina não glicosilada tem uma meia vida de 14 a 17 dias, e uma proteína de fusão de transferrina terá similarmente uma meia vida estendida. O carreador de transferrina também proporciona uma alta biodisponibilidade, biodistribuição e estabilidade de circulação. Esta tecnologia está comercialmente disponível junto à BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, EUA). A transferrina de ser humano recombinante (DeltaFerrin™) para uso como um parceiro de extensão de meia vida/ estabilizador de proteína também está comercialmente disponível junto à Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK).

[0076] Se uma parte Fc de imunoglobulina for utilizada com o propósito de prolongar a meia vida do soro das muteínas da invenção, a tecnologia SynFusionTM, disponível comercialmente junto à Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, EUA), poderá ser utilizada. O uso dessa tecnologia de fusão de Fc permite a criação de elementos biofarmacêuticos de atuação mais longa e pode, por exemplo, consistir de duas cópias da muteína ligada à região de Fc de um anticorpo para incrementar a farmacocinética, a solubilidade, e a eficiência de produção.

[0077] Ainda outra alternativa para prolongar a meia vida de uma muteína da invenção é a de fundi-la à terminação de N ou C de uma muteína da invenção sequências ricas em glicina flexíveis, longas e não construídas (por exemplo, poli-glicina com aproximadamente 20 a 80 resíduos de glicina consecutivos). Esta abordagem revelada no documento WO2007/038619, por exemplo, também foi chamada de "rPEG" (PEG recombinante).

[0078] Se o polialquileno glicol for utilizado como parceiro de conjugação, o polialquileno glicol poderá ser substituído, não-substituído, linear ou ramificado. Ele também poderá ser um derivado de polialquileno ativado. Os exemplos de compostos adequados são as moléculas de polietileno glicol (PEG) conforme descrito no documento WO 99/64016, na Patente norte-americana 6.177.074 ou na Patente norte-americana 6.403.564 em relação ao interferon, ou conforme descrito com relação a outras proteínas como a asparaginase modificada por PEG, adenosina deaminase PEG (PEG- ADA) ou dismutase superóxida PEG (veja, por exemplo, Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139 a 148). O peso molecular desse polímero, preferencialmente polietileno glicol, pode situar- se na faixa de aproximadamente 300 a aproximadamente 70.000 Daltons, incluindo, por exemplo, polietileno glicol com um peso molecular de aproximadamente 10.000, de aproximadamente 20.000, de aproximadamente 30.000 ou de aproximadamente 40.000 Daltons. Adicionalmente, conforme descrito, por exemplo, nas patentes norte-americanas 6.500.930 ou 6.620.413, oligo carboidrato e polímeros como amido ou hidróxietil amido (HES) podem ser conjugados a uma muteína da invenção com o propósito de estender a meia vida do soro.

[0079] Se uma das porções acima for conjugada à muteína de lipocalina de lágrima de ser humano da invenção, a conjugação a uma cadeia lateral de aminoácido pode ser vantajosa. A cadeia lateral de aminoácidos adequada pode ocorrer naturalmente na sequência de aminoácido da lipocalina de lágrima de ser humano, ou pode ser introduzida por mutagênese. No caso de um sítio de ligação adequada ser introduzido por meio de mutagênese, uma possibilidade é a substituição de um aminoácido na posição adequada por meio de um resíduo de cisteína. Em uma realização, essa mutação inclui pelo menos um dentre a substituição de Thr 40 ^ Cis, GLu 73 ^ Cis, Arg 90 ^ Cis, Asp 95 ^ Cis, Lis 121 ^ Cis, Asn 123 ^ Cis ou GLu 131^ Cis. O resíduo de cisteína criado recentemente em qualquer uma dessas posições pode, a seguir, ser utilizado para conjugar a muteína à porção prolongando a meia vida do soro da muteína, tal como PEG ou um derivado ativado do mesmo.

[0080] Em outra realização, a fim de fornecer uma cadeia lateral de aminoácidos adequada para conjugar uma das porções acima às muteínas da invenção, os aminoácidos artificiais podem ser introduzidos por mutagênese. Em geral, esses aminoácidos artificiais são determinados para serem mais reativos e, dessa forma, facilitarem a conjugação à porção desejada. Um exemplo desse aminoácido artificial que pode ser introduzido por meio de um tRNA artificial é a para-acetil fenilalanina.

[0081] Para várias aplicações das muteínas reveladas na presente invenção, pode ser vantajoso o usá-los sob a forma de proteínas de fusão. Em algumas realizações, a muteína de lipocalina de lágrima de ser humano da invenção é fusionada em sua terminação N ou sua terminação C a uma proteína, um domínio de proteína ou um peptídeo como uma sequência de sinal e/ou uma etiqueta de afinidade.

[0082] Em aplicações farmacêuticas, uma muteína da invenção pode ser fusionada a um parceiro de fusão que estenda a meia vida do soro in vivo da muteína (veja novamente a publicação PCT WO 2006/56464 em que um parceiro de fusão adequado é descrito com referências a muteínas de lipocalina associada à gelatinase e neutrófilo de ser humano com uma afinidade de ligação em relação a CTLA-4). Similarmente aos conjugados descritos acima, o parceiro de fusão pode ser uma parte Fc de imunoglobulina, um domínio CH3 de imunoglobulina, um domínio CH4 de imunoglobulina, albumina, um peptídeo de ligação de albumina ou uma proteína de ligação de albumina, para nomear apenas alguns. Novamente, a proteína de ligação de albumina pode ser uma proteína de ligação de albumina bacteriana ou uma muteína de lipocalina com uma atividade de ligação à albumina. Consequentemente, parceiros de fusão adequados para estender a meia vida de uma muteína de lipocalina da invenção incluem albumina (Osborn, B. L. et al. (2002) supra J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540 a 548), ou uma proteína de ligação de albumina, por exemplo, um domínio de ligação de albumina bacteriana, como o um da proteína estreptococal G (Konig, T. e Skerra, A. (1998) supra J. Immunol. Methods 218, 73 a 83). Os peptídeos de ligação de albumina descritos em Dennis et al., supra (2002) ou no pedido de patente norte-americana 2003/0069395 tendo uma sequência consensual Cis-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cis, em que Xaa1 é Asp, Asn, Ser, Thr ou Trp; Xaa2 é Asn, GLn, His, Ile, Leu, ou Lis; Xaa3 é Ala, Asp, Fe, Trp, ou Tir; e Xaa4 é Asp, Gli, Leu, Fe, Ser, ou Thr também podem ser utilizados como parceiro de fusão. Também é possível o uso da própria albumina ou de um fragmento ativo biológico de albumina como um parceiro de fusão de uma muteína de lipocalina da invenção. O termo "albumina" compreende todas as albuminas de mamífero como a albumina de soro de ser humano ou a albumina de soro bovino, ou a albumina de soro de camundongo. A produção recombinante de albumina ou fragmentos do mesmo é bem conhecida na técnica e está descrita, por exemplo, na patente norte-americana 5.728.553, no pedido de patente Européia EP 0 330 451 ou EP 0 361 991.

[0083] O parceiro de fusão pode conferir novas características à muteína de lipocalina da invenção como a atividade enzimática ou afinidade de ligação a outras moléculas. Os exemplos de proteínas de fusão adequadas são fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, glutationa-S-transferase, o domínio de ligação de albumina de proteína G, proteína A, fragmentos de anticorpo, domínios de oligomerização, muteínas de lipocalina com a mesma, ou com uma especificidade de ligação diferente (que resulta na formação de "Duocalins", consulte Schlehuber, S., e Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold Biol, Chem, 382, 1335 a 1342) ou toxinas.

[0084] Em particular, pode ser possível fusionar a muteína de lipocalina da invenção com um sítio ativo de enzima separado de modo que ambos os "componentes" da proteína de fusão resultante atuem juntos em um determinado alvo terapêutico. O domínio de ligação da muteína de lipocalina se liga ao alvo causador de doença, permitindo que o domínio de enzima suprima a função biológica do alvo.

[0085] As etiquetas de afinidade como a Strep- tag® ou Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. MoL. Biol. 255, 753 a 766), a etiqueta myc-tag, a etiqueta FLAGtag, a etiqueta His6-tag ou a etiqueta HA-tag ou proteínas como glutationa-S-transferase também permite uma fácil detecção e/ou purificação de proteínas recombinantes são exemplos adicionais de parceiros de fusão preferenciais. Finalmente, as proteínas com propriedades cromogênicas ou fluorescentes como a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína florescente amarela (YFP) são parceiros de fusão adequados também para a muteína de lipocalina da invenção.

[0086] O termo "proteína de fusão", conforme utilizado na presente invenção, também compreende muteínas de lipocalina de acordo com a invenção contendo uma sequência de sinal. As sequências de sinal na terminação N de um polipeptídeo direcionam esse polipeptídeo para um compartimento celular específico, por exemplo, para o periplasma de E. coli ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas. Um amplo número de sequências de sinal é conhecido na técnica. Uma sequência de sinal preferencial para a secreção de um polipeptídeo no periplasma de E. colié a sequência de sinal OmpA.

[0087] A presente invenção também se refere a moléculas de ácido nucléico (DNA e RNA) que compreendem uma codificação de sequências de nucleotídeo para muteínas conforme descrito na presente invenção. Uma vez que a degeneração do código genético permite substituições de determinados códons através de outros códons especificando o mesmo aminoácido, sendo que a invenção não se limita a uma molécula de ácido nucléico específica que encodifica uma muteína da invenção, mas inclui todas as moléculas de ácido nucléico que compreendem sequências de nucleotídeo que encodificam uma muteína funcional.

[0088] Portanto, a presente invenção também inclui uma sequência de ácido nucléico que encodifica uma muteína de acordo com a invenção compreendendo a mutação de pelo menos um códon de qualquer uma das posições de sequência de aminoácido 26 a 34, 56 a 58, 80, 83, 104 a 106 e 108 da sequência de polipeptídeo linear de lipocalina da lágrima nativa de um ser humano maduro, em que os códons que encodificam pelo menos um dos resíduos de cisteína nas posições de sequência 61 e 153 da sequência de polipeptídeo linear da lipocalina da lágrima de um ser humano maduro sofreram mutação para encodificarem qualquer outro resíduo de aminoácido.

[0089] A invenção, conforme revelado na presente invenção, inclui, adicionalmente, moléculas de ácido nucléico que encodificam muteína de lipocalina de lágrimas, as quais compreendem mutações adicionais no exterior das posições de sequência indicadas de mutagênese experimental. Essas mutações, frequentemente, são toleradas, ou podem, ainda, provar que são vantajosas, por exemplo, se elas contribuírem com uma eficiência de duplicação aperfeiçoada, estabilidade de soro, estabilidade térmica ou afinidade de ligação de ligantes da muteína.

[0090] Uma molécula de ácido nucléico revelada nesse pedido pode ser "ligada de maneira funcional" a uma sequência reguladora (ou sequências reguladoras) para permitir a expressão dessa molécula de ácido nucléico.

[0091] Uma molécula de ácido nucléico, tal como o DNA, é referida como "capaz de expressar uma molécula de ácido nucléico"ou capaz de "permitir a expressão de uma sequência de nucleotídeo"se ela compreender elementos de sequência que contêm informações referentes à regulação transcricional e/ou translacional, e se essas sequências forem "ligadas de maneira funcional"à sequência de nucleotídeo encodificando o polipeptídeo. Uma ligação operável é uma ligação em que os elementos de sequência reguladora e a sequência a ser expressa são conectadas de uma maneira que permite a expressão genética. A natureza exata das regiões reguladoras necessária para a expressão genética pode variar entre as espéciesmas, em geral, essas regiões compreendem um promotor que, em procariotas, contém tanto o promotor por si mesmo, isto é, elementos de DNA que direcionam a iniciação da transcrição, quanto como os elementos de DNA que, quando transcritos em RNA, irão sinalizar o início da tradução. Essas regiões promotoras incluem, normalmente, 5'sequências não codificadoras envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, como as caixas -35/10 e o elemento da sequência de Shine-Dalgarno em procariotas, ou a caixa TATA, sequências CAAT, e 5' elementos de cobertura em eucariotas. Essas regiões também podem incluir elementos intensificadores ou repressores bem como um sinal traduzido e sequências de iniciação para direcionar o polipeptídeo nativo a um compartimento específico de uma célula hospedeira.

[0092] Além disso, as sequências sem codificação 3’ podem conter elementos reguladores envolvidos em terminação transcricional, poliadenilação ou similares. Se, entretanto, essas sequências de terminação não são satisfatoriamente funcionais em uma célula hospedeira particular, então elas podem ser substituídas por sinais funcionais nesta célula.

[0093] Portanto, uma molécula de ácido nucléico da invenção pode incluir uma sequência reguladora, de preferência uma sequência promotora. Em outra realização preferencial, uma molécula de ácido nucléico da invenção compreende uma sequência promotora e uma sequência de terminação transcricional. Os promotores procarióticos adequados são, por exemplo, o promotor tet, o promotor lacUV5 ou o Promotor T7. Os exemplos de promotores úteis para expressão em células eucarióticas são o promotor SV40 ou o promotor CMV.

[0094] As moléculas de ácido nucléico da invenção também podem ser parte de um vetor ou de qualquer outro tipo de veículo de clonagem, tais como um plasmídeo, um fagomídeo, um fago, um baculovírus, um cosmídeo ou um cromossomo artificial.

[0095] Em uma realização, a molécula de ácido nucléico é composta de um fagomídeo. Um vetor de fagomídeo denota um vetor que codifica a região intergênica de um fago temperado, como M13 ou fl, ou uma parte funcional dos mesmos fundidas ao cDNA de interesse. Após a superinfecção das células hospedeiras bacterianas com tal fagomídeo vetor e com um fago helper apropriado (por exemplo, M13K07, VCS-M 13 ou R408), as partículas de fago intactas são produzidas, através disso, possibilitando o acoplamento físico do cDNA heterólogo codificado aos seus polipetídeos correspondentes exibidos sobre a superfície do fago (examinado, por exemplo, em Kay, B. K. et al. (1996) Phago Display of Peptides e Proteins - A Laboratory Manual, 1a edição, Academic Press, Nova York NY; EUA, Lowman, H. B. (1997) Annu, Rev. Biophys, Biomol. Struct. 26, 401 a 424, ou Rodi, DJ., e Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87 a 93).

[0096] Tais veículos de clonagem podem incluir, além das sequências reguladoras descritas acima e da sequência de ácido nucléico que codifica uma muteína de lipocaína da invenção, sequências de controle e replicação derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira que é utilizada para a expressão, assim como os identificadores de seleção concedendo um fenótipo selecionável em células transformadas e transfeccionadas. Grandes números de vetores de clonagem adequados são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis.

[0097] A molécula de DNA que codifica a muteína de lipocalinas da invenção, e em particular, o vetor de clonagem que contém a sequência de codificação de tal muteína de lipocaína pode ser transformada em uma célula hospedeira capaz de expressar o gene. A transformação pode ser executada com o uso de técnicas padrões (Sambrook, J. et al. (1989), supra). Dessa maneira, a invenção também é direcionada a uma célula hospedeira que contém uma molécula de ácido nucléico, conforme aqui mostrado.

[0098] As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições adequadas para a expressão da sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da invenção. As células hospedeiras adequadas podem ser procarióticas, como Escherichia coli (E. coli) ou Bacillus subtilis, ou eucarióticas, como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 ou células de inseto High5, linhagens de células de mamíferos imortalizadas (por exemplo, células HeLa ou células CHO) ou células de mamíferos primárias

[0099] A invenção tem relação, também, com um método para a produção de uma muteína da invenção, em que a muteína, um fragmento da muteína ou uma proteína de fusão da muteína e outro polipetídeo são produzidos a partir da codificação de ácido nucléico para a muteína por meios de métodos de engenharia genética. O método pode ser executado in vivo, a muteína pode, por exemplo, ser produzida em um organismo hospedeiro eucariótico ou bacteriano e, então, isolado do organismo hospedeiro ou em sua cultura. Também é possível produzir uma proteína in vitro, por exemplo, através do uso de um sistema de tradução in vitro.

[00100] Ao produzir uma muteína in vivo, um ácido nucléico que codifica uma muteína da invenção é introduzido em um organismo hospedeiro adequado bacteriano ou eucariótico por meio da tecnologia de DNA recombinante (conforme já explicitado acima). Com esse propósito, a célula hospedeira é transformada, primeiramente, com um vetor de clonagem que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica uma muteína da invenção, com o uso de métodos padrões estabelecidos (Sambrook, J. et al. (1989), supra). A célula hospedeira é, então, cultivada sob condições que permitem a expressão do DNA heterólogo e, dessa forma, da síntese de polipetídeos correspondentes. Subsequentemente, o polipetídeo é recuperado tanto da célula quanto do meio de cultivo.

[00101] Em algumas muteínas de lipocalina de lágrima da invenção, a ligação de dissulfeto que ocorre naturalmente entre Cis 61 e Cis 153 é removida. Consequentemente, tais muteínas (ou qualquer outra muteína de lipocaína de lágrima que não compreende uma ligação intramolecular de dissulfeto) podem ser produzidas em um compartimento da célula que tem um meio de redox de redução, por exemplo, no citoplasma de bactéria gram-negativa. Caso uma muteína de lipocaína da invenção compreenda a ligação intramolecular de dissulfetos, a mesma pode ser preferencial para direcionar os polipetídeos nascentes para um compartimento de célula que tem um meio redox de oxidação com o uso de uma sequência de sinal apropriada. Tal ambiente de oxidação pode ser fornecido pelo periplasma de bactéria gram- negativa, como E. coli, no meio extracelular de bactéria gram- positiva ou no lúmen do retículo endoplasmático de células eucarióticas e, normalmente, favorece a formação de ligação estrutural de dissulfetos. Também é possível, entretanto, produzir uma muteína da invenção no citosol de uma célula hospedeira, de preferência, E. coli. Neste caso, o polipetídeo pode tanto ser obtido diretamente em um estado solúvel e revestido quanto recuperado sob a forma de corpos de inclusão, seguido pela renaturação in vitro. Uma opção adicional é o uso de cepas hospedeiras específicas que têm um meio intracelular oxidante, que pode permitir a formação de ligação de dissulfetos no citosol (Venturi M, Seifert C, Hunte C. (2002) "High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm." / MoI Biol. 315, 1 a 8.).

[00102] Entretanto, uma muteína da invenção pode não ser gerada ou produzida, necessariamente, apenas através do uso de engenharia genética. De preferência, uma muteína de lipocaína também pode ser obtida através de síntese química, como síntese de polipetídeos de fase sólida Merrifield ou por transcrição e tradução in vitro. É possível, por exemplo, que mutações potenciais sejam identificadas com o uso de modelação molecular e, então, para sintetizar os polipetídeos desejados (designados) in vitro e investigar a atividade de ligação para um determinado alvo. Os métodos para a síntese de fase sólida e/ou fase de solução de proteínas também são bem conhecidos na técnica (avaliados, por exemplo, em Lloyd-Williams, P. et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides e Proteins. CRC Press, Boca Raton, Fields, G.B., e Colowick, S.P. (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego, ou Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29 a 43).

[00103] Em outra realização, as muteínas da invenção podem ser produzidas por transcrição/tradução in vitro com o emprego de métodos bem estabelecidos conhecidos pelos elementos versados na técnica.

[00104] A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende, pelo menos, uma muteína inovadora de lipocalina de lágrima humana ou uma proteína de fusão ou conjugados dos mesmos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00105] A muteína de lipocalinas de acordo com a invenção pode ser administrada através de qualquer via parenteral ou não parenteral (enteral) que é terapeuticamente eficaz para drogas proteináceas. Os métodos de aplicação parenteral compreendem, por exemplo, técnicas de injeção e infusão intracutânea, subcutânea, intramuscular, intratraqueal, intranasal, intravítreo ou intravenosa, por exemplo, sob a forma de soluções de injeções, soluções de infusão ou essências, assim como inalação e instalação aerossol, por exemplo, sob a forma de misturas, aspersão ou pós em aerossol. Uma visão geral sobre a aplicação de drogas pulmonárias, isto é, tanto através da inalação de aerossóis (que também podem ser utilizados em administração intranasal) quanto em instalação intraqueal é fornecida por J. S. Patton et al. The lungs as aportal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 páginas 338 a 344, por exemplo). Os modos de aplicação não parenterais são, por exemplo, oralmente, por exemplo, sob a forma de pílulas, tabletes, cápsulas, soluções ou suspensões, ou de forma retal, por exemplo, sob a forma de supositórios. As muteínas da invenção podem ser administradas de forma sistêmica ou tópica, em formulações que contêm excipientes ou carreadores convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, aditivos e veículos conforme desejado.

[00106] Em uma realização da presente invenção, o produto farmacêutico é administrado de forma parenteral a um mamífero e, em particular, em seres humanos. Os métodos de administração correspondentes incluem, mas nãos e limitam a, por exemplo, técnicas de infusão e de injeção intracutânea, subcutânea, intramuscular, intratraqueal ou intravenosa, por exemplo, sob a forma de soluções de injeções, soluções de infusão ou essências, assim como inalação e instalação de aerossol, por exemplo, sob a forma de misturas, aspersores ou pós de aerossol. Uma combinação de infusão e/ou injeção intravenosa e subcutânea pode ser mais conveniente no caso de compostos com uma meia-vida sérica relativamente curta. A composição farmacêutica pode ser uma solução aquosa, uma emulsão água/óleo ou uma emulsão óleo/água.

[00107] Neste aspecto, percebe-se que as tecnologias de aplicação transdermais, por exemplo, aplicação acentuada por micro agulhas, iontoforese ou sonoforese, conforme descrito em Meidan VM e Michniak BB 2004 Am. J. Ther. 11(4): 312-316, também podem ser utilizadas em aplicação transdermal das muteínas aqui descritas. Os Modos de aplicação não parenterais são, por exemplo, orais, por exemplo, sob a forma de pílulas, tabletes, cápsulas, soluções ou suspensões, ou administração retal, por exemplo, sob a forma de supositórios. As muteínas da invenção podem ser administradas de forma sistêmica ou tópica em formulações que contêm uma variedade de excipientes ou carreadores convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, aditivos e veículos.

[00108] A dosagem da muteína aplicada pode variar dentro dos limites amplos para alcançar a resposta terapêutica ou efeito preventivo desejados. Ela irá depender, por exemplo, da afinidade do composto em um ligante escolhido, assim como da meia-vida do complexo entre a muteína e o ligante in vivo. Adicionalmente, a dosagem mais adequada irá depender da biodistribuição da muteína ou da proteína de fusão da mesma ou seus conjugados, do modo de administração, da gravidade da doença/distúrbio sendo tratado, assim como da condição médica do paciente. Por exemplo, quando utilizada em pomada para aplicações tópicas, uma concentração alta da muteína de lipocaína de lágrima pode ser utilizada. Entretanto, caso desejável, a muteína também pode ser aplicada em uma formulação de liberação prolongada, por exemplo, dispersões lipossomais ou microesferas de polímero com base em hidrogel, como PolyActiveTM ou OctoDEXTM (cf. Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003 : 1 a 6). Outras formulações de liberação prolongada disponíveis são, por exemplo, polímeros com base em PLGA (PR pharmaceuticals), hidrogéis com base em PLA-PEG (Medincell) e polímeros com base em PEA (Medivas).

[00109] Consequentemente, as muteínas da presente invenção podem ser formuladas em composições com o uso de ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, assim como métodos de preparação estabelecidos (Gennaro, A.L. e Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 20a Edição., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Para preparar a composição farmacêutica, os excipientes farmaceuticamente inertes inorgânicos ou orgânicos podem ser utilizados. Para preparar, por exemplo, pílulas, pós, cápsulas de gelatina ou supositórios, por exemplo, lactose, talco, ácido esteárico e seus sais, gorduras, ceras, polióis líquidos ou sólidos, óleos naturais e endurecidos podem ser utilizados. Os excipientes adequados para a produção de soluções, suspensões, emulsões, misturas de aerossol ou pós para reconstituição em soluções ou misturas de aerossol anterior ao uso incluem água, alcoóis, glicerol, polióis e misturas adequadas dos mesmos, assim como óleos vegetais.

[00110] A composição farmacêutica pode conter, ainda, aditivos tais como, por exemplo, agentes de carga, ligação, e umidificantes, glidantes, estabilizantes, conservantes, emulsificantes e, adicionalmente, solventes ou solubilizantes ou agentes para alcançar um efeito de depósito. O citado é que a proteína de fusões pode ser incorporada em liberação contínua ou devagar ou sistemas de aplicação direcionados, como lipossomas e microcápsulas.

[00111] As formulações podem ser esterilizadas por diversos meios, incluindo filtração através de um filtro que retém bactérias ou através da incorporação de agentes esterilizantes, sob a forma de composições sólidas esterilizantes que podem ser dissolvidas ou dispersas em água esterilizada ou outro meio estéril, um pouco antes do uso. Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo que necessite do mesmo. Esta doença pode ou não envolver a ligação/interação do receptor c- Met tirosina-quinase. A doença pode ser uma doença cujo desenvolvimento é envolvido pelo caminho de HGF/c-Met. Tal doença ou distúrbio pode ser um distúrbio de proliferação celular. Um exemplo de uma doença de proliferação celular é o câncer. Os exemplos de câncer a serem tratados incluem, mas nãos e limitam a, câncer de fígado, câncer de cólon (por exemplo, câncer de cólon primário, consulte, por exemplo, Clin. Cancer Res. 2003, 9(4), páginas 1480 a 1488) câncer colorretal (cf. Zeng et al., Clin. Exp. Metastasis, 200004, 21 (5), páginas 409 a 417), carcinoma hepatocelular, carcinoma renalpapilar, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSC), metástase de linfonodos de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço, por exemplo (consulte, Schiering et al., PNAS, Vol. 100, No. 22, páginas 12.654 a 12.559, 2003, por exemplo, ou as análises de Trusolino & Comoglio, (2002), Nat. Rev. Cancer, 289 a 300 ou Maulik et al. (2002) Cytokine Growth FaktorRev. 13, 41 a 59). Para tais muteínas de lipocalina de lágrima com propósitos terapêuticos que antagonizam o caminho de HGF/c-Met e/ou fusões de toxinas ou conjugados de uma muteína de lipocaína de lágrima ou conjugados de uma muteína de lipocaína de lágrima com um agente citostático, conforme descrito acima, podem ser utilizados.

[00112] O indivíduo com necessidade de tal tratamento pode ser um mamífero, como um ser humano, um cachorro, um camundongo, um rato, um porco, um macaco como cynomolgus, para citar apenas poucos exemplos ilustrativos.

[00113] Conforme fica evidente a partir da apresentação acima, uma muteína da presente invenção ou uma proteína de fusão ou um conjugado dos mesmos pode ser empregado em diversas aplicações. Em geral, tal muteína pode ser utilizada em todos os anticorpos de aplicações que são utilizados, exceto aqueles com se apóiam especificamente na glicosilação da parte de Fc.

[00114] Portanto, em outro aspecto da invenção, as muteínas inventadas de lipocalina de lágrima humana podem ser utilizadas para a detecção in vitro do ligante em questão, isto é, receptor de c-Met ou um domínio ou fragmento dos mesmos. Tal uso pode compreender as etapas de submeter a muteína ao contato com uma amostra suspeita de conter o ligante em questão sob condições adequadas, permitindo, dessa maneira, a formação de um complexo entre a muteína e o ligante em questão, e a detecção da muteína complexada por um sinal adequado.

[00115] O sinal detectável pode ser causado por um marcador, conforme explicado acima, ou por uma mudança das propriedades físicas devido à ligação, isto é, a formação do próprio complexo. Um exemplo é a ressonância da superfície de plásmon, cujo valor é mudado durante a ligação dos parceiros de interação dentre os quais um deles é imobilizado sobre uma superfície como uma folha de ouro.

[00116] As muteínas de lipocalina de lágrima humana apresentadas na presente invenção também podem ser utilizadas para a separação in vitro de um determinado ligante de lipocalina de lágrima humana. Tal uso pode compreender as etapas de submeter a muteína ao contato com uma amostra que supostamente contém o dito ligante sob condições favoráveis, permitindo, através disto, a formação de um complexo entre a muteína e o ligante em questão, e a separação do complexo de muteína/ligante da amostra.

[00117] Tanto no uso da muteína para a detecção de um determinado ligante, assim como na separação de um determinado ligante, a muteína e/ou o alvo podem ser imobilizados em uma fase sólida adequada.

[00118] As muteínas de lipocalina de lágrima humanas da invenção também podem ser utilizadas para direcionar um composto para um sítio pré-selecionado. Em tal realização, uma muteína de lipocalina de lágrima humana é utilizada para o direcionamento de um composto farmaceuticamente ativo para um sítio pré-selecionado em um organismo ou tecido, sendo que a mesma compreende: a) a conjugação da muteína com o dito composto, e b) a aplicação do complexo de muteína/composto ao sítio pré-selecionado.

[00119] O composto farmaceuticamente ativo pode ser selecionado do grupo que consistem em uma toxina, um agente citostático ou um antagonista de c-Met. Os exemplos de antagonistas de c-Met incluem um anticorpo monoclonal (que se liga, tipicamente, aos domínios extracelulares de c-Met), ou inibidores que direcionam os domínios intracelulares (em particular, o domínio tirosina-quinase). Os exemplos de inibidores moleculares pequenos incluem, mas não se limitam a, um derivativo 1,3,5, triazina-2,4-diamina conforme descrito em WO 2004/031184, um derivativo 2-(2-,6-diclorofenil-imidazol, um nitrogênio contendo derivativo bicíclico, um 5- benzilsulfonila e pirrol indolina substituída por sulfonamida (por exemplo, o composto PHA-665752 desenvolvido por Sugen e descrito por Christenson J.G. AACR, Abst. 4963 e 6200, 2003 ou Sattler M. et al., AACR, Abst 1005, 2003).

[00120] Para tal propósito, a muteína é colocada em contato com o receptor c-Met tirosina-quinase ou um domínio a fim de permitir a formação de complexo. Então, o complexo que compreende a muteína e o composto de interesse são entregues para o sítio pré-selecionado. Esse uso é, em particular, adequado, mas não é restrito para entregar uma droga (seletivamente) para um sítio pré-selecionado em um organismo, como uma parte de corpo infectada, tecido ou órgão que supostamente deve ser tratado com a droga. Além da formação de um complexo entre a muteína e o composto de interesse, a muteína também pode ser reagida com o composto em questão para se obter um conjugado de muteína e um composto. Similarmente ao complexo acima, tal conjugado pode ser adequado para entregar o composto para o sítio alvo pré-selecionado. Tal conjugado de muteína e composto também podem incluir um ligador que liga de maneira covalente a muteína e o composto entre si. Opcionalmente, tal ligador é estável na circulação sanguínea, mas é clivável em um ambiente celular.

[00121] As muteínas apresentadas neste documento e seus derivados podem, então, ser utilizados em muitos campos similares a anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Em adição ao seu uso para se ligarem a um suporte, permitindo que o alvo de uma determinada muteína ou um conjugado ou uma proteína de fusão desse alvo seja imobilizado ou separado, as muteínas podem ser utilizadas para marcar com uma enzima, um anticorpo, uma substância radioativa ou qualquer outro grupo que tenha atividade bioquímica ou características de ligação definidas. Por meio de tal realização, seus alvos ou conjugados ou proteínas de fusão respectivos podem ser detectados ou colocados em contato com eles. Por exemplo, as muteínas da invenção podem servir para detectar estruturas químicas por intermédio de métodos analíticos estabelecidos (por exemplo, ELISA ou Western Blot) ou por microscopia ou imunossensores. Aqui, o sinal de detecção tanto pode ser gerado diretamente através do uso de um conjugado de muteína ou proteína de fusão adequada quanto indiretamente através de detecção imunoquímica da muteína ligada por meio de um anticorpo.

[00122] Numerosas aplicações possíveis para as muteínas inventivas também existem na medicina. Em adição ao seu uso em diagnósticos in vitro e distribuição de droga, um polipeptídeo mutante da invenção, que se liga, por exemplo, a moléculas de superfície celular específicas de tumor ou tecido, pode ser gerado.

[00123] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes Exemplos não limitadores e pelos desenhos em anexo nos quais:

[00124] A Figura 1 mostra um mapa de vetor plasmídeo pTLPC59, em que a Figura 1a mostra uma apresentação esquemática dos elementos regulatórios do vetor e a Figura 1b representa uma ampliação esquemática da construção do gene das muteínas de lipocalina de lágrima que é utilizado para expressar a biblioteca virgem,

[00125] A Figura 2 mostra um mapa do vetor de expressão pTLPC 10,

[00126] A Figura 3 mostra as sequências de polipeptídeo das muteínas de lipocalina de lágrima S225.4-K24 (SEQ ID N°: 1 ) em alinhamento com as sequências de polipeptídeo de lipocalina de lágrima de tipo selvagem,

[00127] A Figura 4 mostra o método de triagem de afinidade através de ELISA e os resultados obtidos para muteínas com afinidade para c-Met,

[00128] A Figura 5 mostra um alinhamento das sequências de polipeptídeo das muteínas de lipocalina de lágrima S225.4-K24 (SEQ ID No; 1) e S244.2-H08, S244.2-L01, S244.4-N05, S244.5-J05, S244.8-I20, S244.8-I07 (SEQ ID Nos.: 4 a 9),

[00129] A Figura 6 mostra medidas de BIAcore da ligação de uma muteína de lipocalina de lágrima humana da invenção (S244.2-H08; SEQ ID No:4) para c-Met,

[00130] A Figura 7 mostra o resultado de uma avaliação de afinidade das muteínas de ligação de c-Met S244.2- H08, S244.2-L01, S244.4-N05, S244.5-J05, S244.8-I20, S244.8- I07 (SEQ ID Nos.: 4 a 9) em um contexto celular em células HT- 29,

[00131] A Figura 8 mostra o método de triagem de afinidade através de ELISA e os resultados obtidos para muteínas com afinidade para c-Met,

[00132] A Figura 9 mostra um alinhamento das sequências de polipeptídeo das muteínas de lipocalina de lágrima S225.4-K24 (SEQ ID No: 1), S244.2-H08 (SEQ ID NO: 4), S261.1-L12, S261.1-J01 e S261.1-L17 (SEQ ID Nos.: 32 a 34).

[00133] A Figura 10 mostra um mapa do vetor de expressão pTLPC 47,

[00134] A Figura 11 mostra o resultado de uma avaliação de afinidade das muteínas de ligação de c-Met S261.1- L12, S261.1-J01 e S261.1-L17 (SEQ ID Nos.:32 a 34) em um contexto celular em células HT-29,

[00135] A Figura 12 mostra medições de ELISA de competição da ligação de uma muteína de lipocalina de lágrima humana da invenção (S261.1-L17; SEQ ID No:34) para c-Met,

[00136] A Figura 13 mostra o resultado de uma avaliação de afinidade da muteína de ligação de c-Met S261.1 - L12_C123 (SEQ ID No:35) em um contexto celular em células HT-29,

[00137] A Figura 14 mostra os resultados do teste de estabilidade de pH da muteína de lipocalina de lágrima S261.1-JOl (SEQ ID No:33),

[00138] A Figura 15 mostra um alinhamento das sequências de polipeptídeo de muteínas de lipocalina de lágrima adicionais da invenção (na qual mutações únicas adicionais foram introduzidas) junto com seus valores de KD para a ligação com c-Met,

[00139] A Figura 16 mostra o resultado de uma avaliação de afinidade das muteínas de ligação de c-Met S318.1- C10, S318.1-L13, S318.1-A16, S318.2-I24 e S318.1-O12 (SEQ ID No: 42, 44, 45, 46 e 49) em um contexto celular em células HT- 29,

Exemplos

[00140] Exceto onde indicação em contrário, métodos estabelecidos de tecnologia de gene recombinante foram utilizados, por exemplo, conforme descrito em Sambrook et al. (supra).

Exemplo 1: Geração de uma biblioteca com 1,6 x 1010 muteínas TIc independentes

[00141] Uma biblioteca aleatória de lipocalina de lágrima (Tic) com alta complexidade foi preparada essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 do pedido PCT PCT/EP2007/057971, a revelação deste é totalmente incorporada a título de referência no presente documento com a exceção de que o contrato de gene de biblioteca para exibição de fago pTLPC59 (Figuras 1a e 1b) é posicionada mediante o controle de um lac p/o ao invés de um tet p/o e é geneticamente fundido ao gene de comprimento inteiro III do fago VCSM 13.

[00142] A produção de fago de muteína de lipocalina de lágrima em um formato de exibição de fago multivalente foi realizada com o uso de Hiperfago M13K07 (Progen) para infecção de E. coli mediante métodos padrões conforme descritos na literatura (M. Kirsch et al. / Journal of Immunological Methods 301 (2005) 173 a 185).

Exemplo 2: Apresentação de fagomídeo e seleção de muteínas Tie com afinidade para receptor c-Met

[00143] A seleção e exibição de fagomídeo foi realizada com o emprego dos fagomídeos obtidos do Exemplo 1 essencialmente conforme descrito em WO 2005/019256, Exemplo 3 com as seguintes modificações: A proteína alvo (receptor-Fc c- Met, sistemas R&D) foi empregada em uma concentração de 200 nM e foi apresentada para biblioteca como proteína de fusão Fc com captura subsequente do complexo de alvo-fago com o uso de gotas G de proteína (Dynal). A fim de selecionar aglutinantes que agem como não antagonistas em relação ao ligante natural HGF, uma etapa de lavagem adicional foi introduzida com o uso de 200 nM de HGF solúvel (sistemas R&D), antes de c-Met se ligar aos fagos de biblioteca, foram eluídos sob condições básicas. Quatro ciclos de seleção foram executados.

Exemplo 3: Identificação de muteínas específicas de receptor c-Met com o uso de triagem de ELISA de alto rendimento

[00144] A triagem das muteínas selecionadas de acordo com o Exemplo 2 foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 3 de WO2006/56464. As modificações do protocolo são descritas a seguir: O vetor de expressão foi pTLPC 10 (Figura 2). A proteína de alvo utilizada foi receptor- Fc c-Met (sistemas R&D) a 1 μg/ml e 3% de leite foram utilizados como alvo de controle não relacionado ao invés de albumina sérica humana.

[00145] A triagem de 2880 clones, selecionados conforme descrito no Exemplo 2, levou à identificação de 342 acertos primários indicando que o isolamento bem sucedido de muteínas da biblioteca havia ocorrido. Com o uso dessa abordagem, o clone S225.4-K24 (SEQ ID No: 1) foi identificado. A sequência de S225.4-K24 também é descrita na Figura 3.

Exemplo 4: maturação de afinidade da muteína S225.4- K24 com a utilização de PCR suscetível a erro

[00146] A geração de uma biblioteca de variantes com base na muteína S225.4-K24 (SEQ ID N°: 1) foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 5 do WO 2006/56464 com a utilização de oligonucleotídeos TL50bio: TATCTGAAGGCCATGACGGTGGAC (SEQ ID N°: 2) e TL51bio: TGCCCACGAGCCACACCCCTGGGA (SEQ ID N°: 3) resultando em uma biblioteca com 5 substituições por gene estrutural em média.

[00147] A seleção de fagomídeo foi executada conforme descrito no Exemplo 2, mas empregando-se a concentração-alvo limitada (2 nM, 0,5 nM e 0,1 nM) de receptor c-Met-Fc e a captura de complexo de fagomídeo e alvo através de anti-humano IgC-Fc especifico mAb imobilizado em uma placa de poliestirol. As seleções adicionais foram realizadas sob condições idênticas, mas com limitação-alvo (1 nM) e tempo curto de incubação (cinco minutos) combinados ou limitação- alvo (5 nM, 0,5 nM e 0,1 nM) combinada com incubação de fagomídeos em pH 3, 60°C durante quinze minutos ou pH 10, TA, durante trinta minutos. Quatro ciclos de seleção foram realizados.

Exemplo 5: triagem de afinidade de muteínas que se ligam ao receptor c-Met com a utilização de triagem do método ELISA de alto desempenho

[00148] A triagem foi realizada conforme descrito no Exemplo 3 com a modificação de que as concentrações de 2,5 μg/ml ou 0,6 μg/ml de receptor c-Met-Fc (Sistemas R&D) foram utilizadas. No total, 2.880 clones foram triados resultando em 1.510 acertos que indicam que ocorreu o enriquecimento bem sucedido de muteínas maturadas da biblioteca. Adicionalmente, em uma configuração de triagem alternativa o anticorpo anti- T7 monoclonal foi aplicado como revestimento sobre uma placa de poliestirol e as muteínas expressas foram capturadas através de etiqueta T7 antes da incubação com concentrações limitadas de receptor c-Met-Fc (60 nM, 15 nM e 2,5 nM). A ligação de receptor c-Met-Fc foi detectada com a utilização de anticorpo policlonal conjugado em HRP contra o domínio humano IgG (Fc).

[00149] Um resultado de tal triagem é mostrado na figura 4. Um grande número de muteínas selecionadas conforme descrito no Exemplo 4 e 5 foi identificado como tendo afinidade aprimorada para o receptor c-Met quando comparado à muteína S225.4-K24 (SEQ ID N°: 1) que serviu como a base para a maturação de afinidade. Com a utilização desta abordagem as muteínas S244.2-H08, S244.2-L01, S244.4-N05, S244.5-J05, S244.8-I20, S244.8-I07 (SEQ ID NOS: 4 a 9) foram identificadas. As sequências de S244.2-H08, S244.2-L01, S244.4-N05, S244.5- J05, S244.8-I20, S244.8-I07 também foram mostradas na figura 5.

Exemplo 6: produção do muteínas que se ligam ao receptor c-Met

[00150] Para a produção preparatória das muteínas específicas de receptor c-Met, a cepa E. coli K12 JM83 que abriga a respectiva muteína codificada no vetor de expressão pTLPCl0 (figura 2) foi cultivada em uma cultura de frasco agitado de 2 litros em meio LB-ampicilina de acordo com o protocolo descrito em Schlehuber, S. et al. (J MoL Biol. (2000), 297, 1105 a 1120). Quando quantidades maiores de proteínas foram necessárias, a cepa de E. coli W3110 que abriga o respectivo vetor de expressão foi utilizada para a produção periplasmática através de cultivo em fermentador de bancada em um vaso de 1 litro ou 10 litros com base no protocolo descrito em Schiweck, W., e Skerra, A, Proteínas (1995) 23, 561 a 565).

[00151] As muteínas foram purificadas a partir da fração periplasmática em uma única etapa através de cromatografia de afinidade de estreptavidina com a utilização de uma a coluna de volume de leito adequado de acordo com o procedimento descrito por Skerra, A. & Schmidt, T. G. M. (2000) (Utilização de etiqueta Strep e estreptavidina para a detecção e a purificação de proteínas recombinantes. Methods Enzymol. 326A, 271 a 304). Para alcançar a maior pureza e para remover qualquer proteína recombinante agregada, uma filtração em gel das muteínas foi finalmente executada em uma coluna Superdex 75 HR 10/30 (volume de leito de 24 mL, Amersham Pharmacia Biotech) na presença de tampão PBS. As frações de proteína monomérica foram unidas, verificadas quanto à pureza por SDS- Page e utilizadas para a caracterização bioquímica adicional.

Exemplo 7: medição de afinidade com a utilização de espectroscopia de ressonância de superfície por plasma (SPR)

[00152] As medições de afinidade foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 9 do WO 2006/56464 com as modificações de que aproximadamente 9000 RU do receptor c-Met-Fc (Sistemas R&D) foram diretamente imobilizados sobre a superfície do chip CM5 chip (ao invés de 2000 RU de CTLA-4 humano ou CTLA-4-Fc de murino utilizados como alvo no WO 2006/56464) e 80 μl de muteína foram injetados a uma concentração de 0,2 a 0,5 μM (ao invés de 40 μl de muteínas de lipocalina purificadas de amostra em concentrações de 5 a 0,3 μM tal como utilizado em WO 2006/56464). A superfície do chip foi regenerada entre as medições mediante a injeção de 5 a 10 μl de NaOH a 50 mM, pH 10, NaCl a 2,5 M. A vazão foi mantida constante em 10 μl/min.

[00153] Os resultados das medições de afinidade que empregam S244.2-H08, S244.2-L01, S244.4-N05, S244.5-J05, S244.8-I20, S244.8-I07 são resumidas na Tabela I e a avaliação de exemplares de sensor-gramas para S244.2-H08 é mostrada na figura 6.

Tabela I. Afinidades de muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pela SPR. A média dos valores é calculada a partir de pelo menos três medições independentes.

Exemplo 8: classificação de afinidade de muteínas de lipocalina em células intactas mediante a citometria de fluxo

[00154] As muteínas de lipocalina foram tituladas em células HT-29 (ATCC) que mostram expressão endógena de HGFR/c-Met. As muteínas de lipocalina foram testadas em 24 diluições 1:2 a partir de uma concentração a 10 μM em um volume total de 30 μl. Para cada reação de ligação, 100.000 células foram incubadas em PBS que contém 2% de soro fetal de bezerro (FCS) durante 2 horas a 4°C. As células foram lavadas duas vezes com PBS, 2% de FCS e incubadas com 375 ng de antissoro de antilágrima da lipocalina de cabra purificado de afinidade e biotinilado por reação durante 30 minutos. Após a lavagem, a detecção foi alcançada depois de trinta minutos adicionais de incubação com estreptavidina-ficoeritrina. As células foram lavadas e a fluorescência foi analisada em um citômetro de fluxo FACS Calibur. A média intensidade de fluorescência (MFI) foi plotada em função da concentração da muteína de lipocalina e ajustada a uma curva sigmoidal de resposta à dosagem e os valores de EC50 foram determinados com a utilização do software GraphPad Prism.

[00155] As curvas de titulação a partir das quais os valores de EC50 para S244.2-H08, S244.2-L01, S244.4-N05, S244.5- J05, S244.8-I20, S244.8-I07 foram determinados são mostradas na figura 7 e os valores de EC50 calculados são resumidos na Tabela II.

Tabela II. Valores de EC50 e os desvios-padrão das muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pela titulação de FACS em células HT-29.

Exemplo 9: triagem de variantes Cis da muteína de lipocalina

[00156] Para fornecer um grupo reativo para o acoplamento sítio-dirigido com, por exemplo, PEG ativado ou um marcador farmaceuticamente relevante, um resíduo de cisteína não unida foi introduzido pela mutagênese sítio-dirigida. A muteína recombinante que transporta o resíduo Cis livre foi subsequentemente produzida em E. coli conforme descrito no Exemplo 6, o rendimento de expressão determinado e a afinidade medida por SPR essencialmente conforme descrito no Exemplo 7.

[00157] A cisteína foi introduzida no lugar dos aminoácidos Thr 40, Asp 95, Arg 90, Lis 121, Asn 123 ou Val 93 que empregam os pares dos oligonucleotídeos H08 T40C de avanço CGTCTCGGTAACACCCATATGCCTCACGACC CTGGAAGGG (SEQ ID N°: 10) e H08 T40C reverso CCCTTCCAGGGTCGTGAGGCATATGGGTGTTAC CGA GACG (SEQ ID N°: 11), ou H08 D95C de avanço CAGGTCGCACGTGAAGTGCCACTACA TCTTTTACTCTGAGGG (SEQ ID N°: 12) e H08_D95C reverso CCCTCAGAGTAAAAGATGTAGTGGCACTTCACGT GCGACCTG (SEQ ID N°: 13), ou H08 R90C de avanço CGTGGCATACATCAGCTGCTCGCACGTGAAGG ATCAC (SEQ ID N°: 14) e H08_ R90C GTGATCCTTCACGTGCGAGCAGCTGATGTATGCCACG (SEQ ID NO): 15, ou A22JC121C de avanço GGCAGAGACCCCTGCAACAACCTGGAAGC CTTG (SEQ ID N°: 16) e A22JC121C reverso CAAGGCTTCCAGGTTGTTGCAGGGGTCTCTGCC (SEQ ID N°: 17), ou A22_N123C de avanço GGCAGAGACCCCAAGAACTGCCTGGAAGC CTTGGAG (SEQ ID N°: 18) e A22_N123C de avanço GGCAGAGACCCCAAGAACTGCCTGGAAGCC TTGGAG (SEQ ID N°: 19), ou H08_V93C de avanço CATCAGCAGGTCGCACTGCAAGGATCACT ACATCTTTTAC (SEQ ID N°: 20) e H08_V93C reverso GTAAAAGATGTAGTGATCCTTGCAGTGCGACC TGCTGATG (SEQ ID N°: 21), respectivamente.

[00158] De maneira exemplar, os resultados da triagem de Cis da muteína específica de receptor c-Met S244.2- H08 (SEQ ID N°: 4) são fornecidos na Tabela III abaixo.

Tabela III. Afinidades de SPR para o receptor c-Met da muteína S244.2-H08 e os mutantes da mesma que compreendem trocas de aminoácido Thr 40 -> Cis (SEQ ID N°: 22), Asn 123 - > Cis (SEQ ID N°: 23), Asp 95 -> Cis (SEQ ID N°: 24), Arg 90 -> Cis (SEQ ID N°: 25) e Lis 121 -> Cis (SEQ ID N°: 26).

Exemplo 10: maturação de afinidade da muteína S225.4-K24 com a utilização de uma abordagem aleatória sítio- dirigida

[00159] Uma biblioteca de variantes com base na muteína S225.4-K24 (SEQ ID N°: 1) foi designada pela escolha aleatória das posições de resíduo 28, 39, 52, 5, 58, 65 e 89 para permitir todos os vinte aminoácidos nestas posições. A biblioteca foi construída essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 com a modificação em que os três fragmentos de PCR aleatória foram gerados empregando-se pares de deoxinucleotídeos K24_1: GCCATGACGGTGGACACGCAGNNSCCGCTGAGCCTCTAC (SEQ N°: 27) (posição de cobertura 28) e K24_2: CAGGGTCGTGAGGGTSNNGGGTGTCACCGAGAC (SEQ N°: 28) (posição de cobertura 39), K24_3: GGGGGCAACCTGGAAGCCNNSGTCACCNNSAACCAGNNSGGCCG GTCCCAGGAG GTG, (SEQ N°: 29) (posições de cobertura 52, 55 e 58) e K24_4: GTATTTTCCCGGCTCATCAGTTTTCTCCAGGACGGCSNNCACC TCCTGGGACCGGCC (SEQ N°: 30) (posição de cobertura 65), K24_5: GTGCTCACGTGGCATACATCNNSAGGTCGCACGTGAAGGAC (SEQ N°: 31) (posição de cobertura 89) e TL51bio (SEQ N°: 3) ao invés de TL46, TL47, TL48 e TL49, respectivamente. A exibição e a seleção de fagomídeo foram executadas empregando- se os fagomídeos essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 com as modificações a seguir: a proteína-alvo era o receptor c-Met monomérico sem a porção Fc (Sistemas R&D) em uma forma biotinilada que permite a captura do alvo: o complexo de fagomídeo através de neutravidina (Pierce) imobilizada em uma placa de poliestirol. A seleção foi realizada com a utilização ou de concentração-alvo limitada (1,5 nM e 0,5 nM e 0,1 nM de receptor c-Met biotinilado) ou concentração-alvo limitada (3 μg/ml, 1 μg/ml e 0,3 μg/ml) combinada com tempo de incubação mais curto (10 minutos) ou uma abordagem competitiva com a utilização de grande excesso (10 μM) de muteína específica de c-Met purificada S244.2-H08 (SEQ N°: 4) derivada da maturação propensa a erro conforme descrito no Exemplo 5. Três ciclos de seleção foram realizados.

Exemplo 11: triagem de afinidade de muteínas que se ligam ao receptor c-Met com a utilização de triagem do método ELISA de alto desempenho

[00160] A triagem foi essencialmente realizada conforme descrito no Exemplo 5 em configurações de triagem alternativas com as modificações a seguir: i) anticorpo anti-T7 monoclonal foi aplicado como revestimento sobre uma placa de poliestirol e as muteínas expressas foram capturadas através de etiqueta T7 antes da incubação com as concentrações limitadas de receptor c-Met-bio monomérico (50 nM, 10 nM e 2,5 nM). A ligação do alvo foi detectada com a utilização de uma extravidina conjugada a HRP (peroxidase de raiz-forte). ii) o receptor c-Met biotinilado (1 μg/ml) foi capturado em placas de neutravidina. A ligação de muteínas específicas expressas de c-Met foi detectada através de anti- T7 mAb conjugado a HRP (Novagen) ou antes do tempo de incubação não limitado (60 minutos) ou limitado (5 minutos). iii) o extrato que contém as muteínas que se ligam ao c-Met foi aquecido a 70 °C durante uma hora. iv) o receptor c-Met biotinilado (Sistemas R&D, 2,5 μg/ml) foi capturado em placas de neutravidina. Os extratos de muteína foram pré-incubados com alto excesso (1 μM) de muteína específica de c-Met purificada S244.2-H08 (SEQ N°: 4) do

Exemplo 5 como um competidor para a ligação-alvo. A ligação de muteínas específicas expressas de c-Met foi detectada através de anti-T7 mAb conjugado a HRP (Novagen).

[00161] Um resultado de tal triagem é mostrado na figura 8. Um grande número de muteínas selecionadas, conforme descrito no Exemplo 12 e 13, foi identificado como tendo afinidade aprimorada para o receptor c-Met quando comparado à muteína S225.4-K24 (SEQ ID N°: 1) que serviu como a base para a maturação de afinidade. Com a utilização desta abordagem as muteínas S261.1-L12, S261.1-J01, S261.1-L17 (SEQ ID NOS: 32 a 34) foram identificadas. As sequências de S261.1-L12, S261.1- J01, S261.1-L17 também são mostradas na figura 9 junto com a sequência de S225.4-K24 (SEQ N°: 1) e S244.2-H08 (SEQ N°: 4) que é uma muteína derivada da maturação propensa a erro conforme descrito no Exemplo 5.

Exemplo 12: produção das muteínas que se ligam ao receptor c-Met em um formato etiquetado His

[00162] A produção periplasmática através de cultivo em fermentador em um biorreator de 0,75 L foi essencialmente realizada de acordo com o Exemplo 6 com a modificação de que a respectiva muteína é codificada no vetor de expressão pTLPC47 (figura 10) ao invés de pTLPC1O. Os elementos vetoriais de pTLPC47 são idênticos ao pTLPC10 com a modificação de que os códigos pTLPC47 para a muteína Tlc que é C-terminalmente fundida à etiqueta Hexa-His e a etiqueta T7 N-terminalmente fundida é removida.

[00163] A muteína foi purificada a partir da função periplásmica em um protocolo cromatográfico de etapa única com sefarose Ni-NTA (GE) com a utilização de uma coluna de volume de leito adequado e equipamento adequado de acordo com as recomendações do fabricante.

[00164] Para alcançar a maior pureza e para remover qualquer proteína recombinante agregada, uma filtração em gel das muteínas foi finalmente executada em uma coluna Superdex 75 HR 10/30 (volume de leito de 24 mL, Amersham Pharmacia Biotech) na presença de tampão PBS. As frações de proteína monomérica foram unidas, verificadas quanto à pureza por SDS- Page e utilizadas para a caracterização bioquímica adicional.

Exemplo 13: medição de afinidade com a utilização de espectroscopia de ressonância de superfície por plasma (SPR)

[00165] As medições de afinidade foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 7.

[00166] Os resultados das medições de afinidade empregando S261.1-L12, S261.1-J01, S261.1-L17 (SEQ ID NOS: 32 a 34) e S244.2-H08 (SEQ N°: 4) que é uma muteína derivada da maturação propensa a erro descrita no Exemplo 4 e 5 são resumidos na Tabela IV.

Tabela IV. Aprimoramento de afinidade das muteínas selecionadas a partir da segunda maturação de afinidade conforme descrito nos Exemplos 10 e 11 comparado à muteína S244.2-H08 do primeiro ciclo de maturação de afinidade determinado por SPR.

Exemplo 14: classificação de afinidade de muteínas de lipocalina em células intactas mediante a citometria de fluxo

[00167] As muteínas de lipocalina foram tituladas em células HT-29 (ATCC) essencialmente conforme descrito no Exemplo 8.

[00168] As curvas de titulação a partir das quais os valores de EC50 para S261.1-L12, S261.1-J01, S261.1-L17 (SEQ ID NOS: 32 a 34) foram determinados são mostradas na figura 11 e os valores de EC50 calculado são resumidos na Tabela V.

Tabela V. Valores de EC50 das muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pela titulação de FACS em células HT-29.

Exemplo 15: identificação de modo de ligação não antagonístico da muteína específica do receptor c-Met com a utilização de um HGF de método ELISA de competição

[00169] O modo da interação entre HGF (fator de crescimento hepatócito, Sistemas R&D) e o receptor c-Met mediante as muteínas específicas selecionadas de c-Met foi avaliado no método ELISA de competição. Portanto, uma concentração constante de 2,5 μg/ml do receptor c-Met-Fc (Sistemas R&D) foi capturada através do anti-humano IgC-Fc especifico mAb (Jackson Immuno Research) que foi imobilizado sobre a superfície de uma placa de poliestirol antes. A seguir, o alvo foi incubado durante uma hora à temperatura ambiente com uma série de diluição de muteína específica de c-Met a partir de 100 nM em uma série de diluição de duas etapas e a ligação ocorre tanto na ausência quando na presença de HGF a 300 nM como competidor. A muteína específica do receptor c-Met ligada foi detectada com a utilização de anticorpo antilipocalina 1 biotinilado policlonal (Sistemas R&D) e o HGF ligado foi detectado com a utilização de anticorpo anti-HGF- bio policlonal (Sistemas R&D). Em ambos os casos a extravidina conjugada a HRP (Sigma) foi empregada como reagente de detecção secundário.

[00170] O resultado da medição que emprega a muteína S261.1-L7 (SEQ N°: 34) serve como um exemplo e é mostrado na figura 12. Os valores KD determinados a partir das curvas de titulação da muteína são resumidas na Tabela VI.

Tabela VI. Capacidade e afinidades não antagonísticas para o receptor c-Met da muteína de lipocalina da lágrima selecionada S261.1-L17 da invenção como determinado pelo método ELISA de competição.

Exemplo 16: determinação de desnaturação térmica para as muteínas que se ligam ao c-Met mediante a utilização de espectroscopia CD

[00171] As medições de dicroísmo circular foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 14 do pedido de patente internacional WO2006/056464, com a modificação de que o comprimento de onda utilizado foi 230 nM e a concentração de muteína foi 250 μg/ml. As temperaturas de fusão Tm das muteínas de lipocalina da lágrima S261.1-L12, S261.1-J01, S261.1-L17 (SEQ ID NOS: 32 a 34) e S244.2-H08 (SEQ ID N°: 4) são resumidas na Tabela VI.

Tabela VI. Temperaturas de fusão das muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pelas medições de dicroísmo circular.

Exemplo 17: produção de muteína específica de c-Met S261.1-L12 C123 com cisteína não unida na posição 123

[00172] A produção preparatória de muteína específica de c-Met S261.1-L12_C123 (SEQ N°: 35) foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 6 com a modificação de que o aminoácido Asn 123 foi alterado para cisteína de modo a introduzir uma cisteína não unida para as subsequentes conjugações dirigidas a sítios. A cisteína 123 foi selecionada de acordo com a transferência dos resultados da triagem de cisteína descrita no Exemplo 9 que demonstra boa expressão de rendimento e afinidade comparada à muteína original S261.1-L12 (SEQ N°: 32) sem a cisteína não unida.

Exemplo 18: conjugação sítio-dirigida de HYNIC para muteína específica de c-Met S261.1-L12 C123

[00173] A muteína purificada S262.1-112_C123 (SEQ N°: 35) do Exemplo 17 foi utilizada em uma concentração de 0,8 mg/ml em tampão PBS em pH 7,4 e a cisteína não unida foi ativada mediante a adição de TCEP a 100 mM (Sigma) em uma concentração final de 1 mM. Após 2 horas de incubação à temperatura ambiente, o TCEP em excesso não-reagido foi removido mediante filtração em gel empregando-se uma coluna NAP-5 (GE) de acordo com as recomendações do fabricante. O excesso de 10 mols de HYNIC (cloridrato de 3-N-maleimido-6- hidrazina-piridina adquirido de SoluLink) foi adicionado e incubado durante duas horas à temperatura ambiente. Para remover o HYNIC não reagido da muteína conjugada, a mistura de reação foi concentrada em Ultracentricon (Amicon) e lavada pelo menos cinco vezes com a utilização de volumes adequados de tampão PBS.

Exemplo 19: medições de afinidade de muteína específica de c-Met com HYNIC conjugado S261.1-L12 C123 em células intactas mediante a citometria de fluxo

[00174] A muteína específica de c-Met S261.1- L12_C123 (SEQ N°: 35) com e sem HYNIC conjugado foi titulado em células HT-29 (ATCC) essencialmente conforme descrito no Exemplo 8.

[00175] As curvas de titulação a partir das quais os valores de EC50 foram determinados são mostradas na figura 13 e os valores de EC50 calculados são resumidos na Tabela VII.

Tabela VII. Valores de EC50 e os desvios-padrão das muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pela titulação de FACS em células HT-29.

Exemplo 20: estabilidade do pH de muteínas específicas de c-Met

[00176] A muteína purificada S261.1-J01 do Exemplo 12 foi incubada durante 60 minutos em pH diferente na faixa de entre pH 3 e pH 9,2. Após a neutralização para o pH 7,4 a muteína foi analisada através de cromatografia de exclusão de tamanho mediante o emprego de uma coluna analítica Superdex 75 (GE) de acordo com as recomendações do fabricante.

[00177] Nenhuma alteração da muteína pode ser detectada durante o período de incubação como julgado por HPLC- SEC, exceto para o pH 5 a 6 que está na faixa de aproximadamente pI da muteína algum grau de dímeroização ocorreu tal como mostrado na figura 14.

Exemplo 21: mutagênese de saturação de posição

[00178] A mutagênese sítio-dirigida foi executada nas posições de sequência 26, 27 e 29 das muteínas de lipocalina da lágrima de afinidade maturada L17, 024, M02, K22, A22, K15, L03, 007 e K06 para avaliar se a afinidade de ligação pode ser influenciada de maneira significativa. Tal como mostrado na figura 15, todas as mutações criadas mostram essencialmente a mesma afinidade.

Exemplo 22: maturação de afinidade da muteína 5261.1- L17 com a utilização de uma abordagem aleatória sítio- dirigida

[00179] A biblioteca de 8 x 108 variantes com base na muteína S261.1 -L17 (SEQ ID N°: 34) foi desenvolvida mediante a escolha aleatória das posições 26, 27, 29, 30, 32, 33, 34, e 79 para permitir todos os vinte aminoácidos nestas posições. A biblioteca foi construída essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 do pedido de patente internacional PCT/EP2007/057971 publicado como WO2008/015239, com a modificação de que para a escolha aleatória os deoxinucleotídeos L12-1: GAAGGCCATGACGGTGGACNNKNNKGACNNKNNK AGCNNKNNKNNKTCGGTGACACCCATCACC (SEQ ID N°: 50); L12-2: CACGTGAGCACCTCCGTAMNNCGTGTATTTTCCCGGCTC (SEQ ID N°: 51); e Ll2-3: ACGGAGGTGCTCACGTGGCATACATCCAGAGG (SEQ ID N°: 52) foram utilizados ao invés daqueles descritos no PCT/EP2007/057971. A exibição e a seleção de fagomídeo foram realizadas empregando-se os fagomídeos essencialmente conforme descrito no Exemplo 3 da publicação de patente internacional WO 2005/019256 com as modificações a seguir: a proteína-alvo (receptor c-Met-Fc, Sistemas R&D) foi empregada em concentração limitada (40 pM e 6 pM e 1 pM) e ou foi apresentada à biblioteca como proteína de fusão Fc com subsequente captura dos fagos do complexo-alvo com a utilização de microesferas de proteína G (Dynal) ou o alvo foi capturado em concentrações limitadas (50 ng/ml e 10 ng/ml e 1 ng/ml) às microesferas de proteína G primeiro antes de apresentar o complexo de microesfera alvo aos fagomídeos da biblioteca. Os fagos da biblioteca ligados ao c-Met foram eluídos mediante ácido e subsequentemente mediante as condições básicas. Três ciclos de seleção foram realizados.

Exemplo 23: triagem de afinidade de muteínas que se ligam ao receptor c-Met com a utilização de triagem do método ELISA de alto desempenho

[00180] A triagem foi essencialmente realizada conforme descrito no Exemplo 5 em configurações de triagem alternativas com as modificações a seguir: i) o anticorpo anti-T7 monoclonal foi aplicado como revestimento a uma concentração de 5 μg/ml sobre uma placa de poliestirol e as muteínas expressas foram capturadas através de etiqueta T7 antes da incubação com as concentrações limitadas de receptor c-Met-Fc (1 nM, 0,2 nM e 0,1 nM). A ligação alvo foi detectada com a utilização de um anticorpo anti-humano IgC-Fc especifico de cabra conjugado a HRP (peroxidase de raiz-forte). ii) o extrato que contém as muteínas que se ligam ao c-Met foi aquecido a 70 °C durante uma hora antes da formação do complexo com o receptor c-Met-Fc alvo. Nesta configuração, o receptor c-Met-Fc foi capturado através de anticorpo monoclonal anti-humano IgC-Fc especifico de rato, que é imobilizado sobre as placas de poliestirol a uma concentração de 5 μg/ml.

[00181] Inúmeras muteínas selecionas, conforme descrito acima, foram identificadas como tendo afinidade aprimorada para o receptor c-Met quando comparado à muteína S261.1-L17 (SEQ ID N°: 34) que serviu como base para a maturação de afinidade. Com a utilização desta abordagem, as muteínas S318.1-C10, S318.1-N21, S318.1-L13, S318.1-A16, S318.2-I24, S318.4-M11, S318.1-G18 e S318.1-O12 (SEQ ID NOS:42 a 49) foram identificadas.

Exemplo 24: medições de afinidade das muteínas específicas de c-Met em células intactas mediante a citometria de fluxo

[00182] Após a expressão e a purificação das muteínas através da cromatografia de afinidade com a utilização da etiqueta Strep fundida ao terminal C da respectiva muteína (cf. Exemplo 6), as muteínas específicas de c-Met S318.1-C10, S318.1-L13, S318.1-A16, S318.2-I24 e S318.1-O12 (SEQ ID N°: 42, 44, 45 46 e 49) foram tituladas em células HT-29 (ATCC) essencialmente conforme descrito no Exemplo 8 e sua afinidade de ligação foi comparada à afinidade de muteína S261.1-L17 (SEQ ID N°: 34) transportando uma etiqueta His6 no seu terminal C.

[00183] As curvas de titulação a partir das quais os valores de EC50 foram determinados são mostradas na figura 13 e os valores de EC50 calculados são resumidos na Tabela VIII.

Tabela VIII. Valores de EC50 e os desvios-padrão das muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pela titulação de FACS em células HT-29.

Exemplo 25: determinação de desnaturação térmica para as muteínas que se ligam ao c-Met mediante a utilização de espectroscopia CD

[00184] As medições de dicroísmo circular foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 14 do pedido de patente internacional WO2006/056464, com a modificação de que o comprimento de onda utilizado foi 230 nM e a concentração de muteína foi de 250 μg/ml. As temperaturas de fusão Tm das muteínas de lipocalina da lágrima S318.1-C10 (SEQ ID N°: 42) e S318.1-012 (SEQ ID N°: 49) são resumidas na Tabela IX e comparadas à temperatura de fusão da muteína S261.1 -L17 (SEQ ID N°: 34) (equipado com uma etiqueta His6) da qual elas derivam.

Tabela IX. Temperaturas de fusão das muteínas selecionadas da invenção para o receptor c-Met como determinado pelas medições de dicroísmo circular.

[00185] Os resultados dos Exemplos 24 e 25 mostraram que a muteína S318.1-C10 tem substancialmente a mesma afinidade de ligação da muteína S261.1-L17 que serviu como uma base para sua geração, mas ao mesmo tempo a muteína S138.1-C10 tem uma estabilidade maior que a muteína S261.1-L17.

[00186] As invenções aqui descritas de maneira ilustrativa podem ser praticadas de forma adequada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações não especificamente apresentadas neste documento. Dessa maneira, por exemplo, os termos "que compreende", "que inclui", "que contém", etc., devem ser lidos de forma abrangente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e as expressões aqui empregados têm sido utilizados como termos de descrição e não de limitação e não há intenção na utilização de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes das mesmas, mas sim reconhecer que diversas modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção reivindicada. Dessa maneira, deve ser compreendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente apresentada pelas realizações preferenciais e características opcionais, a modificação e variação das invenções realizadas e descritas aqui podem ser recorridas pelos elementos versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas como enquadradas dentro do âmbito desta invenção. A invenção tem sido aqui descrita de maneira ampla e geral. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos que estão dentro da descrição geral também formam parte da invenção. Isto inclui a descrição geral da invenção com uma limitação ressalva ou negativa que remove qualquer assunto do gênero, independente de se o material cortado é ou não especificamente citado aqui. Além disso, onde as características ou os aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, os elementos versados na técnica irão reconhecer que a invenção também é assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush. As realizações adicionais da invenção tornar- se-ão evidentes a partir das reivindicações a seguir.

Claims (34)

1. MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA (HTLC), caracterizada pela muteína ligar uma região extracelular ou um domínio da de receptor Met tirosina-quinase (c-Met) com um KD de 200 nM ou menos e em que a dita muteína compreende pelo menos 10, 12, 14, 16 ou 17 substituições de aminoácido nas posições de sequência de aminoácidos de lipocalina da lágrima humana madura (ENTRADA DO BANCO DE DADOS SWISSPROT 31025; SEQ ID NO:36), selecionados do grupo que consiste em Arg 26 -> Thr, Val, Pro, Ser, ou Gly; Glu 27 -> Gln, Gly, Val, ou Ser; Phe 28 -> Met ou Asp; Pro 29 -> Leu, Ile, Ala ou Trp; Glu 30 -> Leu, Gly, Arg, ou Phe; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Leu, Arg, Val, ou Gln; Leu 33 -> Tyr, Val, Ile, ou Thr, Phe; Glu 34 -> Val, Arg, ou Ala; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile, ou Val; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly.

2. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela muteína compreender adicionalmente pelo menos uma das substituições de aminoácido Cys 61 -> Ser, Cys 101 -> Ser e Cys 153 -> Ser.

3. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela muteína compreender pelo menos uma substituição de aminoácido adicional selecionada dentre Arg 111 -> Pro e Lys 114 -> Trp.

4. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela muteína estar, em seu N-terminal ou em seu C-terminal, fundida de maneira operável a uma enzima, uma proteína ou um domínio da proteína, um peptídeo, uma sequência sinal e/ou uma Tag de afinidade.

5. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela muteína ser conjugada a um parceiro de conjugação selecionado do grupo que consistem em uma molécula de droga orgânica, um rótulo de enzima, uma toxina, um agente citostático, um rótulo que pode ser fotoativado e que é apropriado na terapia fotodinâmica, um rótulo radioativo farmaceuticamente apropriado, um hapteno, digoxigenina, biotina, um complexo de metal ou um metal quimioterápico, ouro coloidal e uma porção que estende a vida média do soro da muteína.

6. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela porção que estende a vida média do soro ser selecionada do grupo que consiste em uma molécula de polialquileno glicol, hidróxi etil amido, um ácido palmítico ou outra molécula de ácido graxo, uma parte de Fc de uma imunoglobulina, um domínio CH3 de uma imunoglobulina, um domínio CH4 de uma imunoglobulina, albumina ou um fragmento de albumina, um peptídeo de ligação da albumina, uma proteína de ligação da albumina e transferrina.

7. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pela proteína de ligação da albumina ser uma proteína de ligação da albumina bacteriana, um anticorpo ou fragmento de anticorpo dirigido contra a albumina ou uma muteína de lipocalina com atividade de ligação para a albumina.

8. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo domínio bacteriano da albumina ser um domínio de ligação da albumina da proteína estreptocócica G.

9. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo peptídeo de ligação da albumina tem a fórmula Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, em que Xaa1 é Asp, Asn, Ser, Thr ou Trp; Xaa2 é Asn, Gln, His, Ile, Leu ou Lys; Xaa3 é Ala, Asp, Phe, Trp ou Tyr; e Xaa4 é Asp, Gly, Leu, Phe, Ser ou Thr.

10. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo polialquileno glicol ser o polietilenoglicol (PEG) ou um derivado ativado do mesmo.

11. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela toxina ser selecionada do grupo que consiste em toxina da coqueluche, toxina da difteria, ricina, saporina, exotoxina de Pseudomonas, calicheamicina ou um derivado desta, um taxóide, um matansinóide, uma tubulisina e um análogo de dolastatina.

12. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo análogo de dolastatina ser selecionado do grupo que consiste em auristatina E, monometilauristatina E, auristatina PYE e auristatina PHE.

13. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo agente citostático ser selecionado do grupo que consiste em Cisplatina, Carboplatina, Oxaliplatina, 5- Fluorouracila, Taxotere (Docetaxel), Paclitaxel, Antraciclina (Doxorubicina), Metotrexato, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, Dacarbazina, Ciclofosfamida, Etoposídeo, Adriamicina, Camptotecina, Combretatastina, compostos relacionados A-4, Sulfonamidas, Oxadiazolinas, benzo[b]tiofenos, piranos espiroquetais sintéticos, compostos de monotetraidrofurano, curacina e derivados de curacina, derivados de metoxiestradiol e Leucovorina.

14. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pela muteína não agir como um antagonista do fator do crescimento de hepatócitos humanos (HGF) ou do fator de difusão humano (SF).

15. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pela muteína ligar uma região extracelular ou um domínio do receptor de Met com um KD de 100 nM ou menos.

16. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela muteína ligar uma região extracelular ou um domínio do receptor de Met com um KD de 20 nM ou menos.

17. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pela muteína ligar uma região extracelular ou um domínio do receptor de Met com um KD de 1 nM ou menos.

18. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos uma substituição do aminoácido selecionada do grupo que consiste em Thr 37 -> Ser; Met 39 -> Ile, ou Leu; Asn 48 -> Ser; Lys 52 -> Thr ou Met; Met 55 -> Leu; Lys 65 -> Arg ou Leu; Ala 79 -> Leu ou Ser; Ala 86 -> Thr; e Ile 89 -> Ser, Gln, Thr ou His.

19. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pela muteína compreender as substituições de aminoácido: Arg 26 -> Thr; Glu 27 -> Gln; Glu 30 -> Leu; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Leu; Leu 33 -> Tyr; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly.

20. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pela muteína compreender as substituições de aminoácido: Met 31 -> Ser; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly.

21. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pela muteína compreender as substituições de aminoácido: Cys 61 -> Ser; Cys 101 -> Ser; Arg 111 -> Pro; Lys 114 -> Trp; e Cys 153 -> Ser.

22. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pela muteína compreender um dos seguintes conjuntos de substituições de aminoácido: (1) Arg 26 -> Thr; Glu 27 -> Gln; Phe 28 -> Met; Glu 30 -> Leu; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Leu; Leu 33 -> Tyr; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; (2) Arg 26 -> Thr; Glu 27 -> Gln; Phe 28 -> Asp; Glu 30 -> Leu; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Leu; Leu 33 -> Tyr; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Val; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; (3) Arg 26 -> Thr; Glu 27 -> Gln; Phe 28 -> Asp; Glu 30 -> Leu; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Leu; Leu 33 -> Tyr; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; (4) Arg 26 -> Val; Glu 27 -> Gly; Phe 28 -> Asp; Pro 29 -> Leu; Glu 30 -> Gly; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Arg; Leu 33 -> Val; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; (5) Arg 26 -> Pro; Glu 27 -> Gly; Phe 28 -> Asp; Pro 29 -> Ile; Glu 30 -> Arg; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Leu; Leu 33 -> Ile; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; (6) Arg 26 -> Ser; Phe 28 -> Asp; Pro 29 -> Ala; Glu 30 -> Phe; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Val; Leu 33 -> Thr; Glu 34 -> Val; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; (7) Arg 26 -> Val; Glu 27 -> Val; Phe 28 -> Asp; Pro 29 -> Trp; Glu 30 -> Arg; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Gln; Leu 33 -> Val; Glu 34 -> Arg; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly; ou (8) Arg 26 -> Gly; Glu 27 -> Ser; Phe 28 -> Asp; Pro 29 -> Trp; Met 31 -> Ser; Asn 32 -> Val; Leu 33 -> Phe; Glu 34 -> Ala; Leu 56 -> Asn; Ile 57 -> Gln; Ser 58 -> Ile; Asp 80 -> Tyr; Lys 83 -> Ala; Glu 104 -> Asp; Leu 105 -> Thr; His 106 -> Trp; e Lys 108 -> Gly.

23. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos uma das mutações relativas à sequência da lipocalina da lágrima humana madura selecionada do grupo que consiste em Thr 40 -> Cys, Glu 73 -> Cys, Arg 90 -> Cys, Asp 95 -> Cys, Lys 121 -> Cys, Asn 123 -> Cys e Glu 131 -> Cys.

24. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender adicionalmente um parceiro de conjugação acoplado à muteína através de qualquer um dos resíduos de Cys na posição de sequência 40, 73, 90, 95, 121, 123 ou 131.

25. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo parceiro de conjugação ser selecionado do grupo que consiste em uma molécula orgânica, um rótulo de enzima, uma toxina, um agente citostático, um rótulo radioativo farmaceuticamente apropriado, um rótulo fluorescente, um rótulo cromogênico, um rótulo luminescente, um hapteno, digoxigenina, biotina, um complexo de metal, um metal, ouro coloidal e uma porção que estende a vida média do soro da muteína.

26. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pela muteína ter uma sequência de aminoácido como determinado em qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4 a 9, SEQ ID NO:22 a 26, SEQ ID NO:32 a 35 ou SEQ ID NO:37 a 49.

27. MUTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada por ser estável dentro de um pH na faixa de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 9,5.

28. MUTEÍNA, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por ser estável dentro de um pH na faixa de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,3.

29. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma muteína de lipocalina da lágrima humana, tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

30. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pela muteína ser produzida a partir do ácido nucléico que codifica a muteína por meio dos métodos de engenharia genética em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico e é isolada deste organismo hospedeiro ou de sua cultura.

31. USO IN VITRO DE UMA MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, o qual serve para a detecção in vitro do receptor Met humano (Met) tirosina-quinase ou um domínio ou um fragmento desta, caracterizado por compreender as etapas de: a) colocação da muteína em contato com uma amostra suspeita de conter a quinase de tirosina do receptor de Met humano (Met) ou um domínio ou um fragmento desta sob condições apropriadas, permitindo desse modo a formação de um complexo entre a muteína e a quinase de tirosina do receptor de Met humano (Met) ou um domínio ou fragmento desta, e b) detecção da muteína complexada por um sinal apropriado.

32. USO IN VITRO DE UMA MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, para a separação in vitro do receptor Met humano (Met) tirosina-quinase ou um domínio ou um fragmento desta, caracterizado por compreender: a) a colocação da muteína em contato com uma amostra suposta de conter a quinase de tirosina do receptor de Met humano (Met) ou um domínio ou fragmento desta sob condições apropriadas, permitindo desse modo a formação de um complexo entre a muteína e a quinase de tirosina do receptor de Met humano (Met) ou um domínio ou fragmento desta, e b) a separação do complexo de muteína/Met da amostra.

33. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 ou 32, caracterizado pelo complexo de muteína/c-Met ser ligado a um suporte sólido.

34. USO IN VITRO DE UMA MUTEÍNA DE LIPOCALINA DA LÁGRIMA HUMANA, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, para o diagnóstico in vitro de uma doença ou de um distúrbio relacionado à função (c-Met) do receptor c-Met tirosina-quinase, caracterizado por compreender as etapas de: a) colocação da muteína em contato com uma amostra suspeita de conter a quinase de tirosina do receptor de Met humano (c-Met) ou um domínio ou um fragmento desta sob condições apropriadas, permitindo desse modo a formação de um complexo entre a muteína e a quinase de tirosina do receptor de Met humano (c-Met) ou um domínio ou fragmento desta; e b) detecção da muteína complexada por um sinal apropriado.

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