KR20150023957A - 혈소판-유래 성장인자에 결합하는 설계된 안키린 반복 단백질 - Google Patents

Abstract

PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 신규 설계된 안키린 반복 단백질이 기술되어 있을 뿐만 아니라 이러한 PDGF 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 단백질을 포함하는 약학적 조성물 및 질환에 치료에 있어서 상기 단백질의 용도도 함께 기술되어 있다.

Description

혈소판-유래 성장인자에 결합하는 설계된 안키린 반복 단백질{Designed ankyrin repeat proteins binding to platelet-derived growth factor}

본 발명은 혈소판-유래 성장인자(PDGF)에 대한 결합 특이성을 가진 설계된 안키린 반복 단백질(designed ankyrin repeat proteins)에 관한 것으로, 이에 더하여, 상기 PDGF 결합 단백질, 상기 단백질을 포함하는 약학적 조성물, 질환의 치료에 있어서의 상기 단백질의 용도에 관한 것이다.

혈소판-유래 성장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF)는 30년 이상 전에 섬유아세포, 평활근세포 및 신경교세포에 대한 혈청 성장 인자로서 규명되어졌다. 생리학 및 의약에서의 이의 역할은 최근 연구에서 광범위하게 기술되어있다 (Andrae, J., Gallini, R. and Betsholtz, C., Genes Dev., 22, 1276-1312, 2008). 인간 PDGF는 원래 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬의 이황화-결합된 이합체, A (PDGF-A; 인간 PDGF-A는 UniProtKB/Swiss-Prot number P04085를 가짐) 및 B (PDGF-B; 인간 PDGF-B는 UniProtKB/Swiss-Prot number P01127를 가짐)로서 알려져있다. 이에 의해, 3개 단백질 이합체가 형성될 수 있다: PDGF-AA, PDGF-AB 및 PDGF-BB. 최근에, 2개의 부가적인 PDGF 폴리펩티드 사슬, PDGF-C 및 PDGF-D이 규명되었다. 현재 알려진 PDGF 유전자 및 폴리펩티드는 혈관 내피 성장 인자(VEGFs)를 포함하는, 구조적으로 그리고 기능적으로 관련된 성장인자에 속한다. PDGF/VEGF 성장 인자는 동물 왕국에 걸쳐서 보존되어 있다 .

PDGFs는, 5개의 세포외 면역글로불린 (Ig) 루프 및 스플릿트 세포내 티로신 키나아제 도메인을 포함하는, 공통의 도메인 구조를 가지는 2개의 수용체 티로신 키나아제 (RTKs), PDGF 수용체 (PDGFR) 알파 (PDGFRalpha) 및 베타 (PDGFRbeta)를 통해 작용한다. 상기 VEGFs는 별개지만 구조적으로 관련되는 RTKs 서브패밀리를 통해 작용한다. 리간드 결합은 신호전달을 개시하는 수용체 이합체화반응을 촉진한다. 리간드 배치형태(configuration) 및 수용체 발현의 패턴에 의존하여 상이한 수용체 이합체가 형성될 수 있다. 그러나, 오직 몇몇의 상호작용이 생체 내에서 관련되는 것 같고, 즉, PDGFRalpha를 통한 PDGF-AA 및 PDGF-CC, 그리고 PDGFRbeta를 통한 PDGF-BB의 경우이다.

상기 PDGFs는 발달동안 결정적인 역할을 가지지만 성인에서 정상적 병리학적 기능에 대한 제한적 증거가 있다. 동물 발달에서 PDGFs 및 PDGFRs의 연구는 장배형성(gastrulation) 및 두개와 심장 신경관, 생식샘, 폐, 장, 피부, CNS, 및 골격의 발달에서 에서 PDGFRalpha 신호전달에 대한 역할을 밝혀냈다. 유사하게, PDGFRbeta 신호전달의 역할은 혈관 형성 및 초기 혈액생성에서 구축되어져왔다. PDGF 신호전달은 질병의 범위에 연루되어진다. PDGF 신호전달 경로의 자가분비 활성화가 임의의 신경교종, 육종 및 백혈병에 관여한다. 측분비(Paracrine) PDGF 신호전달은 일반적으로 상피 암에서 관찰되는데, 기질 리쿠르먼트를 촉발하고 상피-간엽성 전이에 관여될 수 있고, 이에 의해 종양 성장, 혈관 신생, 침윤 및 전이에 영향을 미친다. PDGFs는 죽상동맥경화증, 재발협착증, 폐고혈압, 망막 질환과 같은 혈관성 질환에서, 뿐만 아니라 섬유증이고, 폐경화증, 간경화증, 피부경화증, 사구체경화증 및 심장 섬유증을 포함하는 섬유성 질환에서 병리학적 간엽성 반응을 유도한다.

따라서, 증가된 PDGF 활성은 여러 질환 및 병리학적 상태와 관련되어 있다. PDGFs의 일반적인 병원성 역할이 일부 질환에 대해 구축되어 왔고 PDGF 특이적 항체와 같은 PDGF 길항체를 이용하는 치료요법을 위한 가능성을 제공해왔다. 게다가, 항- VEGF 및 항-PDGF 물질의 조합이 임의의 안구 혈과신생 질환의 치료를 위해 치료 효과를 제공하는 것이 제안되어져 왔다(WO 2005/020972; Jo, N., Mailhos, C., Ju, M., Cheung, E., Bradley, J., Nishijima, K., Robinson, G.S., Adamis, A.P. and Shima, D.T., Am. J. Pathol., 168(6), 2036-2053, 2006).

항체 이외에, 표적 분자를 특이적으로 결합하고 이에 의해 길항물질로서 작용하기 위해 사용될 수 있는 신규 결합 단백질 또는 결합 도메인이 존재한다(예를 들어 Binz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Fc를 가지지 않는 결합 도메인 또는 결합 단백질의 하나의 신규 클래스는 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인에 기초하고 있다 (WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008). WO 2002/020565는 반복 단백질의 얼마나 큰 라이브러리가 구축될 수 있는지 및 이들의 일반적인 적용을 개시하고 있다. 그럼에도 불구하고, WO 2002/020565는 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 반복 도메인의 선별이나 PDGF-BB 에 특이적으로 결합하는 반복 도메인의 구체적인 반복 모듈 또는 반복 서열 모티프도 개시하고 있지 않다. 또한, WO 2002/020565는 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 반복 도메인이 PDGF-BB-매개된 신호 경로를 조절하여 질병을 성공적으로 치료하기 위해 사용될 수 있음을 시사하지는 않는다. 이러한 설계된 반복 도메인은 반복 단백질의 분자적 성질을 활용하고 도메인의 소수성 코어를 차폐(shielding)함으로써 설계된 반복 도메인이 응집되는 것을 방지하기 위해 N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈을 가질 수 있다(Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. and Pluckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003).

본 발명의 기저를 이루는 기술적 과제는, 임의의 암, 망막 질환, 섬유성 질환과 같은 혈관성 질환 및 다른 병리학적 상태의 개선된 치료를 위한 PDGF-BB 매개하는 신호 경로를 조절하기 위해 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 단백질 또는 도메인과 같은 신규 결합 단백질의 규명에 있다.

상기 기술 과제의 해결은 특허청구범위에 특징화된 실시양태를 제공하는 것에 의해 달성된다.

본 발명은 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것 으로, 이 때 상기 안키린 반복 도메인은 10^-7M이하의 Kd로 PBS 중 PDGF- BB에 결합한다.

더 구체적으로, 본 발명은 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 안키린 반복 도메인과 PDGF-BB에 결합하기 위해 경쟁하고, 또는 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고, 상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환된다

추가의 구체예에서, 본 발명은, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19 및 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 안키린 반복 모듈을 포함하고, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19에서 9 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되는, 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 PDGF-BB 결합 단백질에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 서열번호: 12 내지 19 및 23 내지 61 서열의 임의의 하나의 펩타이드를 포함하는 재조합 PDGF-BB 결합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이고, 상기 언급한 결합 단백질 또는 핵산 분자의 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 발명의 결합 단백질을 이용하는 병리학적 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다

본 발명은 임의의 암, 망막 질환, 섬유성 질환과 같은 혈관성 질환 및 다른 병리학적 상태의 개선된 치료를 위한 PDGF-BB 매개하는 신호 경로를 조절하는, PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 단백질 또는 도메인과 같은 신규 결합 단백질 및 이의 용도를 제공한다.

도 1은 NHI-3T3 섬유아세포 세포증식의 저해효과에 관한 것이다.
PDGF-BB에 특이적인 DARPin(DARPin #49에 의해 증폭됨) 의 다양한 농도에 따른 NIH-3T3 섬유아세포의 세포증식 저해능 및 상응하는 저해 곡선을 도시하고 있다. IC₅₀ 값을 저해 곡선으로부터 계산하여DARPin#49에 대해 1.9 nM가 된다.
[450 nm에서 OD(optical density); C, DARPin #49의 농도(nM); D1, DARPin #49. X 축은 로그축(logarithmic scale)으로 나타냄. DARPin #49의 정의에 대한 하기를 참조]
도 2는 PDGFRbeta 경쟁 분석에 관한 것이다.
PDGF-BB 특이성을 가지는 DARPins의 다양한 농도에 의한 PDGFRbeta에의 PDGF-BB 결합 억제 및 개별적 단일 실험에서 보여주는 상응하는 저해 커브이다. DARPins #50 (D1) 및 #28 (D2)에 대하여 각각 IC₅₀ 값을 약 20 및 18 pM로 계산하였다.
[450 nm에서 OD(optical density); C, DARPin #49의 농도(nM); D1, DARPin #49. X 축은 로그축(logarithmic scale)으로 나타난다. DARPin #50 및 28 정의에 대한 하기를 참조]
도 3은 맥락막 혈관신생의 발달에서 항-PDGF-BB DARPin vs 비히클의 영향에 관한 것이다.
비히클 또는 DARPin #61-PEG20 (즉, 표준 수단에 의해 C-말단 Cys 잔기를 거쳐 PEG20에 결합되는 DARPin #61 (예: WO 2011/135067에 기재된 바와 같이))를 0일부터 14일까지 매일 복강내 주입한 마우스. 2일 째, 레이저 번즈(burns)를 눈에 적용하여 맥락막 혈관신생(CNV)을 유도하고 14일 째, CNV의 정도를 측정하여, 기호로 개별적인 눈을 나타내고 3개의 유도된 CNV 스팟의 평균값을 나타내었다. 바는 개별 그룹의 중간값을 나타낸다.
[A, CNV 영역(mm²); V, 비히클(즉, PBS); D1, 투여한 용량당 10 mg/kg에서 PBS 중 DARPin #61-PEG20; D2, 투여한 용량당 1mg/kg에서 PBS 중 DARPin #61-PEG20]

본 발명에 따른 재조합 결합 단백질 또는 도메인은 포유류의 PDGF-BB에 특이적이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 재조합 결합 도메인은 마우스, 랫트, 개, 토끼, 원숭이 또는 인간 유래 PDGF-BB에 특이적이다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 재조합 결합 도메인은 인간 유래 PDGF-BB에 특이적이다.

용어 “단백질”는 폴리펩티드를 말하고, 이 때 상기 폴리펩티드의 적어도 일 부분은 폴리펩티드 사슬 간 및/또는 사슬 내에서 2차, 3차 또는 4차 구조를 형성함으로써 규정된 3차원 배열을 가지거나 획득할 수 있다. 단백질이 2 이상의 폴리펩티드를 포함하면, 상기 개별적인 폴리펩티드 사슬은 비공유결합 또는 공유결합적으로, 예를 들어, 두 폴리펩티드 간 이황화결합에 의해 연결될 수 있다. 개별적으로 2차 또는 3차 구조를 형성함으로써 소정의 3차원 배열을 가지거나 가질 수 있는 단백질의 일 부분은 “단백질 도메인”이라고 할한다. 이러한 단백질 도메인은 당업자들에게 잘 알려져 있다.

재조합 단백질, 재조합 단백질 도메인, 재조합 결합 단백질 등에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 상기 폴리펩티드가 당업자에게 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하는 것에 의해 제조될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자(예를 들어 유전자 합성에 의해 제조됨)드는 세균성 발현 플라스미드(예를 들어 pQE30, Qiagen), 효모 발현 플라스미드 또는 포유류 발현 플라스미드에 클로닝(cloned)될 수 있다. 예컨대, 이러한 작성된 재조합 세균성 발현 플라스미드가 적절한 세균(예를 들어 대장균(Escherichia coli))에 삽입되면, 상기 세균은 상기 재조합 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 상응하게 제조된 폴리펩티드를 재조합 폴리펩티드라 칭한다.

본 발명의 내용에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통하여 결합된 다수의, 즉 2 이상의 아미노산의 하나 이상의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통하여 결합된 8개 이상의 아미노산으로 이루어진다.

용어 "폴리펩티드 태그"는 폴리펩티드/단백질에 부착된 아미노산 서열을 지칭하며, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출, 또는 표적화에 유용하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 이화학적 거동을 향상시키거나, 또는 상기 아미노산 서열은 이팩터(effector) 기능을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그, 부분 및/또는 도메인은 서로 직접적으로 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 연결될 수 있다. 이들 폴리펩티드 태그는 모두 당해 분야에 공지되어 있고 또 당업자에 의해 충분히 입수될 수 있다. 폴리펩티드 태그의 예는 소형 폴리펩티드 서열, 예컨대, His(예를 들어 서열번호:15의 His-태그), myc, FLAG, 또는 Strep-tags 또는 상기 폴리펩티드/단백질의 검출을 허용하는 효소(예컨대 효소 유사 알칼리성 포스파타제)의 부 분, 또는 표적화(면역글로불린 또는 그의 단편과 같은) 및/또는 이팩터 분자에 대해 사용될 수 있는 부분이다.

용어 "폴리펩티드 링커"는 폴리에틸렌 글리콜 또는 2개의 서열 태그와 같은 예컨대, 2개의 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및 단백질 도메인, 단백질 도메인 및 비-폴리펩티드 부분(moiety)에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 부가적 도메인, 태그, 비-폴리펩티드 부분 및 링커는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 그 예는 특허 출원 WO 2002/020565호의 상세한 설명에 제공되어 있다. 이러한 링커의 특별한 예는 다양한 길이의 글리신-세린-링커 및 프롤린-쓰레오닌-링커이다; 바람직하게는, 상기 링커는 2 내지 24개 아미노산 사이의 길이를 갖고; 더욱 바람직하게는, 상기 링커는 2 내지 16개 아미노산 사이의 길이를 갖는다. 글리신-세린-링커의 예는 서열번호:10에 제공되고 프롤린-쓰레오닌-링커의 예는 서열번호:11에 제공된다. 바람직하게는, 서열번호:11의 프롤린-쓰레오닌-링커는 GS 앞에 있고/있거나 GS 뒤에 따라온다..

용어 “폴리머 부분(polymer moiety)”는 단백질성 폴리머 부분 또는 비단백질성 폴리머 부분 중 어느 하나를 지칭한다. “단백질성 폴리머 부분”는 바람직하게는 안정한 4차 구조를 형성하지 않는 폴리펩티드이다. 단백질성 폴리머 부분의 예는 XTEN® (Amunix의 등록 상표; WO 2007/103515) 폴리펩티드, 또는 WO 2008/155134에 기재된 프롤린, 알라닌 및 세린 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 이러한 단백질성 폴리머 부분들은, 예를 들어, 표준 DNA 클로닝 기술, 이어서 이들의 표준 발현 및 정제를 이용한 유전적 융합 폴리펩티드의 생성에 따라 본 발명의 결합 도메인에 공유결합으로 결합될 수 있다. “비단백질성 폴리머 부분”는 폴리펩티드로부터 제조되지 않는 폴리머 부분이다. 비단백질성 폴리머 부분의 예는 하이드록시에틸 녹말(hydroxyethyl starch, HES), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌이다. 용어 “페길화된(PEGylated)”은 PEG 부분이 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 공유결합적으로 부착되는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리머 부분은 분자량에서 폭넓게 다양화될 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리머 부분은 결합 도메인에 폴리펩티드 링커에 의해 결합된다.

구체예에서, PEG 부분 또는 임의의 다른 비단백질성 폴리머는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 결합 도메인의 N- 또는 C-말단에 펩티드 링커를 통해 결합되어 있는 시스테인으로 말레이미드 링커를 통해 시스테인 티올에 결합될 수 있다.

용어 "결합 단백질"은 이하에 상세하게 설명되는 바와 같이 하나 이상의 결합 도메인, 하나 이상의 생활성 화합물 및 하나 이상의 중합체 부분을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 4개 이하의 결합 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 2개 이하의 결합 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 오직 하나의 결합 도메인을 포함한다. 또한, 이러한 결합 단백질은 결합 도메인이 아닌 부가적 단백질 도메인, 다량화 부분(multimerization moieties), 폴리펩티드 태그, 폴리펩티드 링커 및/또는 단일 Cys 잔기를 포함할 수 있다. 다량화 부분의 예는 짝을 이루어 기능적 면역글로불린 Fc 도메인을 제공하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 및 류신 지퍼 또는 2개의 폴리펩티드 사이에 분자간 이황화 결합을 형성하는 자유 티올을 포함하는 폴리펩티드이다. 상기 단일 Cys 잔기는 예컨대, 당업자에게 잘 공지된 말레이미드 화학을 이용함으로써 다른 부분을 폴리펩티드에 결합시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 또한 바람직하게는, 결합 단백질의 결합 도메인은 상이한 표적 특이성을 보유한다.

용어 "생활성 화합물"은 질병을 갖는 포유류에 적용될 때 질병을 변형하는 화합물을 지칭한다. 생활성 화합물은 길항특성(antagonistic) 또는 작용물질 특성(agonisti)을 가질 수 있고, 단백질성 생활성 화합물 또는 비단백질성 생활성 화합물일 수 있다. 이러한 단백질성 생활성 화합물은, 예를 들어, 표준 DNA 클로닝 기술, 이어서 이들의 표준 발현 및 정제를 이용한 유전적 융합 폴리펩티드의 생성에 따라 본 발명의 결합 도메인에 공유결합으로 결합될 수 있다. 상기 비단백질성 생활성 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 화학적 수단에 의해, 예를 들어, 결합 도메인의 N- 또는 C-말단에 펩티드 링커를 통해 결합되어 있는 시스테인으로 말레이미드 링커를 통해 시스테인 티올에 결합함으로써 예를 들어, 본 발명의 결합 도메인에 공유결합적으로 부착될 수 있다. 단백질성 생활성 화합물의 예는 별개의 표적 특이성(예: 결합에 의한 성장인자의 중화)을 가지는 결합 도메인, 사이토카인(예: 인터루킨), 성장인자(예: 인간 성장 호르몬), 항체 및 이의 프래그먼트, 호르몬(예: GLP-1) 및 임의의 가능한 단백질성 약물이다. 비단백질성 생활성 화합물의 예는 독소(예: 임뮤노젠으로부터 DM11), 작은 분자 타겟팅 GPCRs, 항체 및 임의의 비단백질성 약물이다.

용어 "결합 도메인"은 이하에 정의된 바와 같이, 단백질 스캐폴드와 같이 동일한 “폴딩(folding)”을 보여주고 소정의 특성을 갖는 단백질 도메인을 의미한다. 이러한 결합 도메인은 당업자에게 공지된 수법인 이성적인, 또는 가장 흔히, 조합적 단백질 엔지니어링 수법에 의해 얻을 수 있다(Binz et al., 2005, loc. cit.). 예컨대, 소정 특성을 갖는 결합 도메인은 (a) 단백질 스캐폴드와 같은 동일한 폴딩을 보여주는 단백질 도메인의 다양한 콜렉션을 제공하는 단계; (b) 상기 다양한 콜렉션을 스크리닝하고 및/또는 상기 다양한 콜렉션을 선택하여 소정 특성을 갖는 적어도 하나의 단백질 도메인을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 단백질 도메인의 다양한 콜렉션은 이용된 스크리닝 및/또는 선택 시스템에 따른 여러 방법에 의해 제공될 수 있고 또 파아지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 당업자에게 잘 공지된 방법을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다

용어 “단백질 스캐폴드”는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실이 꽤 상당한 노출된 표면 영역을 가지는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 결합 도메인을 생성하는데 사용될 수 있는 단백질 스캐폴드의 예는, 항체들 또는 이들의 단일 사슬 Fv나 Fab 프래그먼트와 같은 이들의 프래그먼트, Staphylococcus aureu로부터 단백질 A, Pieris brassicae 또는 다른 리포칼린으로부터 빌린 결합 단백질, 안키린 반복 단백질 또는 다른 반복 단백질, 및 인간 피브로넥틴을 들 수 있다. 단백질 스캐폴드는 당업자에게 잘 알려져 있다 (Binz et al., 2005, loc. cit.; Binz et al., 2004, loc. cit.)

용어 "표적"은 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 개별 분자, 탄수화물, 또는 이러한 개별 분자의 일부를 포함하는 기타 천연 산출 분자 또는 이러한 분자의 2 이상의 복합체를 지칭한다. 상기 표적은 전체 세포 또는 조직 샘플일 수 있거나, 또는 표적은 비천연 분자 또는 부분일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표적은 천연 산출 또는 비천연 산출 폴리펩티드이거나 또는 예컨대 천연 또는 비천연 인산화, 아세틸화 또는 메틸화에 의해 변형된 화학적 변형을 함유하는 폴리펩티드이다. 특히 본 발명의 적용에서 상기 표적은 PDGF-BB이다.

용어 "소정 특성"은 표적에 대한 결합, 표적의 차단, 표적-매개된 반응의 활성화, 효소 활성, 및 관련된 추가의 특성과 같은 특성을 지칭한다. 목적하는 특성의 타입에 따라서, 당업자는 목적하는 특성을 갖는 결합 도메인을 스크리닝 및/또는 선택을 실시하기 위한 포맷과 필요한 단계를 확인할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 소정 특성은 표적에 대한 결합이다.

반복 단백질에 대한 이후의 정의는 특허 출원 WO 2002/020565호의 내용을 기본으로 한다. 특허 출원 WO 2002/020565호는 또한 반복 단백질 특징, 수법 및 적용의 일반적 설명도 함유한다.

용어 "반복 단백질"은 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 단백 질 각각은 4개 이하의 반복 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 반복 단백질 각각은 2개 이하의 반복 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 반복 단백질 각각은 오직 하나의 반복 도메인을 포함한다. 또한, 상기 반복 단백질은 부가적인 비-반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드 링커를 포함할 수 있다

용어 "반복 도메인"은 2 이상의 연속 반복 단위(모듈)를 구조 단위로 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 상기 구조 단위는 동일한 폴딩을 갖고, 또 긴밀하게 스택(stack)하여 조인트 소수성 코어를 갖는 예컨대 초나선(superhelical) 구조를 생성한다. 바람직하게는, 반복 도메인은 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 단위(또는 모듈)를 더 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, 상기 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 단위(또는 모듈)는 캡핑 반복서열이다.

용어 "설계된 반복 단백질" 및 "설계된 반복 도메인"은 특허 출원 WO 2002/020565호에 설명된 발명의 과정의 결과로서 각각 얻어지는 반복 단백질 또는 반복 도메인을 지칭한다. 설계된 반복 단백질 및 설계된 반복 도메인은 합성이고 또 천연으로부터 생긴 것이 아니다. 이들은 상응하게 설계된 핵산을 발현시켜 얻은 각각 인간이 만든 단백질 또는 도메인이다. 바람직하게는, 발현은 세균성 세포와 같은 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 실시되거나, 또는 무세포(cell-free) 시험관내(in vitro ) 발현 시스템을 이용하는 것에 의해 실시된다. 따라서, 설계된 안키린 반복 단백질(즉 DARPin)은 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질에 상응한다.

용어 "구조 단위"는 폴리펩티드 사슬을 따라 서로 가까이 있는 2차 구조의 2 이상의 절편 사이의 3차원 상호작용에 의해 형성된 폴리펩티드의 국소적으로 정돈된 부분(locally ordered part)을 지칭한다. 이러한 구조 단위는 구조적 모티프를 나타낸다. 용어 "구조적 모티프"는 적어도 하나의 구조 단위에 존재하는 2차 구조 요소의 3차원 배열을 지칭한다. 구조적 모티프는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 구조 단위 단독으로는 정의된 3차원 배열을 얻을 수 없다; 그러나, 예컨대 반복 도메인 중의 반복 모듈과 같은 이들의 연속 배열은 이웃하는 단위의 상호 안정화를 유도하여 결과적으로 초나선 구조를 초래한다.

용어 "반복 단위"는 하나 이상의 천연 산출 반복 단백질의 반복 서열 모티프를 포함하는 아미노산을 지칭하며, 상기 "반복 단위"는 다수의 카피(copies)로 발견되며, 또 단백질의 폴딩을 결정하는 모든 상기 모티프와 공통되는 정의된 폴딩 기하학을 나타낸다. 이러한 반복 단위는 Forrer et al., 2003, loc. cit 에 의해 기재된 바와 같은 반복 단백질의 “반복 구조 단위(반복서열)” 또는 Binz et al, 2004, loc. cit.에 의해 기재된 바와 같은 반복 단백질의 “연속적 상동 구조 단위(반복서열)”에 상응한다. 이러한 반복 단위는 프레임워크(framework) 단위, 류신-풍부 반복 단위, 안키린 반복 단위, 테트라트리코펩티드 반복 단위, HEAT 반복 단위, 및 류신-풍부 변이체 반복 단위이다. 2 이상의 이러한 반복 단위를 함유하는 천연 산출 단백질을 "천연 산출 반복 단백질"이라 칭한다. 반복 단백질의 개별적 반복 단위의 아미노산 서열은 서로에 비교할 때 현저한 갯수의 돌연변이, 치환, 부가 및/또는 결실을 가질 수 있는 한편, 여전히 실질적으로 상기 반복 단위의 일반적 패턴 또는 모티프, 반복 단위를 유지할 수 있다.

용어 "안키린 반복 단위"는 예컨대, Forrer et al., 2003, loc. cit.에 의해 기재된 바와 같이 안키린 반복서열(repeats)인 반복 단위를 의미할 것이다. 안키린 반복서열은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 용어 "안키린 반복 도메인" 은 구조적 단위로서, 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 단위(모듈)로서 2 이상의 연속적인 안키린 반복 단위(모듈)을 포함하는 반복 도메인을 지칭한다.

용어 "프레임워크 잔기"는 폴딩 위상기하학에 기여하는, 즉 반복 단위(또는 모듈)의 폴딩에 기여하는 또는 인접단위(또는 모듈)와의 상호작용에 기여하는 반복 단위의 아미노산 잔기 또는 반복 모듈의 상응하는 아미노산 잔기에 관한 것이다. 이러한 기여는 반복 단위(또는 모듈) 중의 다른 잔기와의 상호작용, 또는 α-헬릭스 또는 β-시트에서 발견되는 것과 같은 폴리펩티드 백본 구조, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치에 영향을 준다.

용어 "표적 상호작용 잔기"는 반복 단위의 아미노산 잔기, 또는 반복 모듈의 상응하는 아미노산 잔기를 지칭하며, 이들은 표적 물질과의 상호작용에 기여한다. 이러한 기여는 표적 물질과의 직접적 상호작용이거나, 또는 다른 직접적으로 작용하는 잔기에 영향을 주어, 예를 들어 반복 단위(또는 모듈)의 폴리펩티드의 구조를 안정화하는 것에 의해 직접 작용성 잔기와 상기 표적과의 상호작용을 허용하거나 또는 강화시킨다. 이러한 프레임워크 및 표적 상호작용 잔기는 X-선 결정학, NMR 및/도는 CD 스펙트럼과 같은 이화학적 방법에 의해, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보학의 당업자에게 잘 공지된 관련된 구조적 정보와 대조에 의해 수득된 구조적 데이터의 분석에 의해 확인될 수 있다.

바람직하게는, 반복 서열 모티프의 유도를 위해 사용된 반복 단위는 상동 반복 단위이며, 상기 반복 단위는 동 일한 구조적 모티프를 포함하고 또 상기 반복 단위의 프레임워크 잔기의 70% 이상은 서로 상동이다. 바람직하게는, 상기 반복 단위의 프레임워크 잔기의 80% 이상이 상동이다. 가장 바람직하게는, 상기 반복 단위의 프레임워크 잔기의 90% 이상이 상동이다. Fasta, Blast 또는 Gap 과 같은, 폴리펩티드 사이의 상동성 %를 결정하는 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 공지되어 있다. 또한 바람직하게는, 반복 서열 모티프의 유도를 위해 사용된 반복 단위는 표적 상의 선택된 반복 도메인으로부터 얻고 동일 표적 특이성을 갖는 상동 반복 단위이다.

용어 "반복 서열 모티프"는 하나 이상의 반복 단위 또는 반복 모듈로부터 유도되는 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 단위 또는 반복 모듈은 동일 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인으로부터 얻는다. 이러한 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임 워크 잔기 위치는 반복 단위(또는 모듈)의 프레임워크 잔기의 위치에 상응한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 단위(또는 모듈)의 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 반복 서열 모티프는 고정된 위치 및 임의위치를 포함한다. 용어 "고정된 위치"는 반복 서열 모티프 중의 아미노산 위치를 지칭하며, 상기 위치는 특정 아미노산에 설정된다. 가장 흔히, 이러한 고정된 위치는 특정 표적에 대하여 특이적인 프레임워크 잔기의 위치 및/또는 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 용어 "임의 위치"는 반복 서열 모티프 중의 아미노산 위치를 지칭하며, 2 이상의 아미노산은 상기 아미노산 위치에서 허용되며, 예컨대 보통의 20개 천연 산출 아미노산이 허용되거나, 또는 시스테인을 제외한 아미노산, 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린을 제외한 아미노산과 같이 20개 천연 산출 아미노산의 대부분이 허용된다. 가장 흔히, 이러한 임의 위치는 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 그러나, 프레임워크 잔기의 일부 위치는 임의적일 수 있다.

용어 "폴딩 위상기하학(folding topology)"은 상기 반복 단위 또는 반복 모듈의 3차 구조를 지칭한다. 폴딩 위상기하학은 α-헬릭스 또는 β-시트의 적어도 일부를 형성하는 아미노산의 스트레치(stretches)에 의해, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치에 의해, 또는 α-헬릭스 또는 β-시트 및/또는 선형 폴리펩티드/루프의 조합에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 안키린 반복 단위/모티프는 β-회전(β-turn)에 이어서 2개의 역평행(antiparallel) α-헬릭스 및 다음 반복 단위/모티프의 회전(turn)에 이르는 루프로 구성되어 있다.

용어 "연속"은 반복 단위 또는 반복 모듈이 나란히 연계해서(in tandem) 배열된 배열을 지칭한다. 설계된 반복 단백질에는, 적어도 2개, 보통 약 2 내지 6개, 특히 적어도 약 6개, 흔히 20개 이상의 반복 단위(또는 모듈)가 존재한다. 대부분의 경우에서, 반복 도메인의 반복 단위(또는 모듈)는 고도의 서열 동일성(상응하는 위치에서 동일 아미노산 잔기) 또는 서열 유사성(아미노산 잔기가 상이하지만, 유사한 이화학적 특성을 가짐)을 나타낼 것이고 또 상기 아미노산 잔기의 일부는 강하게 보존되는 주요 잔기일 수 있다. 그러나, 반복 도메인의 상이 한 반복 단위(모듈) 사이에서 아미노산 삽입 및/또는 결실, 및/또는 치환에 의한 고도의 서열 다양성도 반복 단위(또는 모듈)의 일반적 폴딩 위상기하학이 유지되는 한 가능할 수 있다.

X-선 결정학, NMR 또는 CD 분광학과 같은 이화학적 수단에 의해 반복 단백질의 폴딩 위상기하학을 직접적으로 결정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 반복 단위 또는 반복 서열 모티프를 확인하고 결정하는 방법 또는 반복 단위 또는 모티프와 같은 것을 포함하는 관련 단백질의 패밀리를 확인하는 상동성 확인 방법(BLAST 등)같은 방법은 생명정보학 분야에서 잘 확립되어 있고, 당업자에게 잘 공지되어 있다. 초기 반복 서열 모티프를 정제하는 단계는 반복적 공정을 포함할 수 있다.

용어 "반복 모듈"은 천연 산출 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래한 설계된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열을 지칭한다. 반복 도메인에 포함된 각 반복 모듈은 천연 산출 반복 단백질의 패밀리 또는 서브패밀리(subfamily), 예를 들어 아르마딜로 반복 단백질 또는 안키린 반복 단백질의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유도된다. 더욱 바람직하게는, 반복 도메인에 포함된 각 반복 모듈이, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같이 표적 상 선택된, 동일한 표적 특이성을 가지는 반복 도메인으로부터 수득되는 상동성 반복 단위로부터 유도되는 반복 서열 모티프를 포함한다.

따라서, 용어 “안키린 반복 모듈”은 원래 천연적으로 산출된 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래되는 반복 모듈을 의미하게 될 것이다. 안키린 반복 단백질은 당업자들에게 잘 알려져 있다

"반복 모듈"은 상응하는 반복 모듈("고정된 위치")의 모든 카피에 존재하는 아미노산 잔기를 갖는 위치 및 상이한 아미노산 잔기 또는 "임의의" 아미노산 잔기를 갖는 위치("임의 위치")를 포함할 수 있다.

용어 "캡핑 모듈"은 반복 도메인의 N- 또는 C-말단 반복 모듈에 융합된 폴리펩티드를 지칭하며, 상기 캡핑 모듈은 상기 반복 모듈과 함께 고도의 삼차원 상호작용(즉, 삼차원 구조 상호작용)을 형성함으로써, 용매로부터 연속 반복 모듈과 접촉하지 않는 측에서 상기 반복 모듈의 소수성 코어를 차단하는 캡을 제공한다. 상기 N- 및/또는 C-말단 캡핑 모듈은 반복 단위 근처의 천연 산출 반복 단백질에서 찾을 수 있는 캡핑 단위 또는 기타 구조 단위이거나, 또는 그로부터 유도될 수 있다. 용어 "캡핑 단위"는 천연 산출 폴딩된 폴리펩티드를 지칭하며, 상기 폴리펩티드는 반복 단위에 N- 또는 C-말단적으로 융합된 특정 구조 단위를 정의하며, 상기 폴리펩티드는 상기 반복 단위와의 삼차 구조 상호작용을 형성함으로써, 상기 반복 단위의 소수성 코어를 일 측면에서 용매로부터 차단하는 캡을 제공한다. 바람직하게는, 캡핑 모듈 또는 캡핑 단위는 캡핑 반복서열이다. 용어 "캡핑 반복서열"는 상기 인접하는 반복 단위(또는 모듈)와 유사 또는 동일한 폴딩을 갖거나 및/또는 상기 인접하는 반복 단위(또는 모듈)와 서열 유사성을 갖는 캡핑 모듈 또는 캡핑 단위를 지칭한다. 캡핑 모듈 및 캡핑 반복서열은 WO 2002/020565호 및 Interlandi et al., 2008(loc. cit.)에 기재되어 있다. N-말단 안키린 캡핑 모듈 (즉, N-말단 캡핑 반복서열) 의 예는 서열번호:1 내지 3이고, 안키린 C- 말단 캡핑 모듈(즉, C- 말단 캡핑 반복서열)의 예는 서열번호:4 내지 8, 13 및 16이다. 예를 들어, 상기 서열번호:49의 N-말단 안키린 캡핑 모듈은 위치 1 내지 32로부터 아미노산에 의해 코딩되고 서열번호:49의 C-말단 캡핑 모듈은 위치 132 내지159로부터 아미노산에 의해 코딩된다.

본 발명에 따른 재조합 결합 단백질은 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 포유류 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가진다.

용어 "표적에 대한 결합 특이성을 갖는", "표적에 대하여 특이적으로 결합하는" 또는 "표적 특이성" 등은 결합 단백질 또는 결합 도메인이 PBS 중에서 표적에 대장균(E. coli) 말토오스 결합 단백질(MBP)과 같은 비관련 단백질에 비하여 더 낮은 해리 상수로 결합하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 표적에 대한 PBS 중에서의 해리상수는, MBP에 대한 상응하는 해리 상수에 비하여, 적어도 10배, 더욱 바람직하게는 10²배, 더 더욱 바람직하게는 10³배, 또는 가장 바람직하게는 10⁴배 더 낮다.

PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질들이 실시예에 나타나있다.

특히, 본 발명은 10^-6M 이하 해리 상수(Kd)를 가지는 PBS 중 PDGF-BB와 결합하는, PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인을 포함하는, 본 명세서에서 정의되는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중 10^-7M 이하, 더 바람직하게는 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M, 또는 가장 바람직하게는 10^-11M 이하의 해리상수 (Kd)로 PDGF-BB와 결합한다.

표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)을 기본한 기술(예를 들어 SPR 평형 분석) 또는 등온적 적정 열량측정계(isothermal titration calorimeter: ITC)와 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 Kd 값은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 다양할 수 있다. 따라서, Kd 값의 측정은 표준화된 단백질 용액 및 PBS와 같은 표준화된 완충액을 사용하여 바람직하게 실시된다.

10^-6M 이하 PBS 중 Kd를 가지는 안키린 반복 도메인 결합 PDGF-BB을 포함하는 재조합 결합 단백질이 실시예 2에 나타나 있다.

바람직하게는 인간 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다.

추가의 바람직한 예는 70 및 300 아미노산 사이를, 특히 90 및 200 아미노산 사이를 포함하는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다.

본 발명의 결합 도메인은 안키린 반복 도메인 또는 설계된 안키린 반복 도메인이고, 바람직하게는 WO 2002/020565에 기술되어 있는 바와 같다. PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 설계된 안키린 반복 도메인의 예들은 실시예에 나타나 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 포유동물 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 적어도 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 10^-7M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M 이하, 가장 바람직하게는 10^-11M 이하의 IC₅₀ 값으로 PBS 중 PDGFRbeta에 PDGF-BB의 결합을 저해한다.

반-최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)는 생물학적, 생화학적 또는 생물물리적 기능을 저해함에 있어서 본 발명의 결합 도메인과 같은 화합물의 유효성(effectiveness)의 측정값이다. 경쟁 ELISAs 와 같은 단백질-단백질 상호작용 의 억제의 IC₅₀를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 단백질-단백질 상호작용 의 특정 저해제의 측정된 IC₅₀값은 상이한 조건(예를 들어 염 농도, pH) 하에서 측정하면 변할 수 있다. 그러므로, IC₅₀값의 측정은 바람직하게는 단백질의 표준화된 용액 및 PBS와 같은 표준화된 버퍼로 이루어진다.

10^-7M 이하의 IC₅₀값으로 PBS 중 PDGFRbeta에 PDGF-BB의 결합을 억제하는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질은 실시예 4에 나타나있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 10^-6M 이하의 IC₅₀값으로 NIH-3T3 섬유아세포 (ATCC, cat number: CRL-1658) 의 PDGF-BB 자극된 세포증식을 저해하는, PDGF-BB에 대해 결합 특이성을 가지는 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 반복 도메인은 10-7M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M, 또는 가장 바람직하게는 10^-11M의 IC₅₀값으로 NIH-3T3 섬유아세포의 PDGF-BB 자극된 세포증식을 저해한다.

NIH-3T3세포는 성장을 위해 반응하고, 이로써 본 발명의 화합물의 기능적 저해 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. NIH-3T3 세포들을 배양 배지에서 성장시킨 후 PDGF-BB의 첨가 및 항-PDGF-BB DARPin의 적정 전에 7시간 동안 영양분으로부터 굶긴다. PDGF-BB 를 저해하는 본 발명의 화합물의 능력 평가는 당업자에게 잘 알려진 표준 측정에 의해 측정됨으로써 NIH-3T3 세포의 세포증식능에 의해 결정될 수 있다. 10^-6M 이하의 IC₅₀값으로 NIH-3T3 섬유아세포의 PDGF-BB 자극된 세포증식을 저해하는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질은 실시예 3에 나타나 있다.

본 발명은 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 적어도 하나 이상의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 결합 단백질 및/또는 안키린 반복 도메인은 37°C 하 1일 동안 PBS에서 배양될 때, 10 g/L까지의 농도에서 5% (w/w) 이하 불용성 응집체를 형성하고, PBS 중 열적 풀림(thermal unfolding) 상에서 40°C 이상의 중점 변성 온도(T m)를 가진다.

용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10　mM 포스페이트 및 2.7 mM KCl를 함유하고 pH 7.4를 갖는 포스페이트 완충 수용액을 의미한다.

바람직하게는 상기 재조합 결합 단백질 및/또는 결합 도메인은 pH 7.4에서 PBS 중 열적 풀림(thermal unfolding) 상에서 45°C 이상, 더욱 바람직하게는 50°C이상, 더욱 바람직하게는 55°C이상, 그리고 가장 바람직하게는 60°C 이상의 Tm(midpoint denaturation temperature)을 가진다. 본 발명의 결합 단백질 또는 결합 도메인은 생리적 조건 하에서 소정의 2차 및 3차 구조를 가진다.

상기 폴리펩티드의 열적 풀림은 이의 3차 및 2차 구조의 소실을 초래하고, 예를 들어 원편광 이색성(circular dichroism, CD) 측정에 의해 분석될 수 있다. 열적 풀림 상 결합 단백질 또는 결합 도메인의 중점 변성 온도는, 10°C에서 약 100°C까지 온도가 천천히 증가함으로써 상기 단백질 또는 도메인의 열 변성에 있어서 생리적 버퍼 중 협력적 전이(cooperative transition)의 중점에서 상기 온도에 상응한다. 열적 풀림에서 중점 변성 온도의 결정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 열적 풀림에서 결합 단백질 또는 결합 도메인의 이러한 중점 변성 온도는 상기 폴리펩티드의 열적 안정성을 나타낸다.

또한 바람직한 예는 37°C 하 PBS 중 5일, 바람직하게는 10일, 더 바람직하게는 20일, 더욱 바람직하게는 40일, 및 가장 바람직하게는 100일에 걸쳐서 배양할 때, 20 g/L까지, 바람직하게는 40 g/L까지, 더 바람직하게는60 g/L까지, 더더욱 바람직하게는 80 g/L까지, 그리고 가장 바람직하게는 100 g/L까지의 농도에서 5% (w/w)이하의 불용성 응집체(insoluble aggregates)를 형성하는 재조합 결합 단백질 및/또는 안키린 반복 도메인이다. 불용성 응집체의 형성은, 상기 불용성 응집체의 형성에 의존하여 강하게 증가하는 가시적 침전(visual precipitations), 겔 여과 또는 동적 광산란에 의해 검출될 수 있다. 불용성 응집체는 단백질 샘플로부터 10 분 동안 10,000 x g에서의 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 바람직하게는 상기 언급한 배양 조건 하에서 37°C 하 PBS 중 2%이하, 더욱 바람직하게는1%, 0.5%, 0.2%, 0.1% 이하 또는 가장 바람직하게는 0.05% (w/w) 이하의 불용성 응집체를 형성하는 조합 결합 단백질 및/또는 안키린 반복 도메인이다. 불용성 응집체의 퍼센트는 수용성 단백질로부터 불용성 응집체의 분리, 이어서 표준 정량화 방법에 의해 수용성 및 불용성 프랙션에서의 단백질 양의 결정에 의해 결정될 수 있다.

또한, 바람직한 예는 100 mM DTT(dithiothreitol)을 함유하는 PBS에서 1 또는 10 시간 동안 37°C하에서 배양함에 있어서 고유의 3차원 구조를 상실하지 않는 재조합 결합 단백질 및/또는 안키린 반복 도메인이다.

일 특정 구체예에서, 본 발명은 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 특히 PDGF-BB에 결합하고, 구별되거나 바람직한 중점 변성 온도 및 위에서 정의한 대로 비-응집 특성을 가지는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 포유류 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 포유류 PDGF-BB에의 결합을 위해 서열번호: 23 내지 60;바람직하게는 서열번호: 24, 45 및 50, 특히 서열번호:24 및 50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 안키린 반복 도메인과 경쟁한다.

또한 바람직하게는 상기 안키린 반복 도메인은 DARPins #23 내지 60의 군으로부터 선택되는 결합 단백질과 포유류 PDGF-BB에의 결합을 위해 경쟁한다. 바람직하게는 상기 반복 도메인은 DARPins #24, 45 및 50의 군으로부터의 결합 단백질과 포유류 PDGF-BB에의 결합을 위해 경쟁한다. 더욱 바람직하게는 상기 반복 도메인은 결합 단백질 DARPin #24 또는 50와 포유류 PDGF-BB에의 결합을 위해 경쟁한다.

용어 “결합을 위한 경쟁”은 양자 모두 개별적으로는 동일한 표적에 결합할 수 있지만 , 동일한 표적에 대해 동시에 결합하기 위해 본 발명의 2개의 상이한 결합 도메인의 무능력(inability)을 의미한다. 그러므로, 일한 2개의 결합 도메인은 상기 표적에 대해 결합하기 위해 경쟁한다. 바람직하게는 상기 2개의 경쟁 결합 도메인은 표적 상 동일한 결합 에피토프 또는 오버랩핑에 결합한다. 2개의 결합 도메인이 표적에 결합하기 위하여 경쟁하는지 결정하기 위해, 경쟁 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 또는 경쟁 SPR 측정(예를 들어, BioRad로부터 단백질 기구를 이용하여)과 같은 방법은 당업계에에 실무자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 서열번호: #49 또는 서열번호: #58의 안키린 반복 도메인은 서열번호: #50의 안키린 반복 도메인과 인간 PDGF에 결합하기 위하여 경쟁한다.

용어 “에피토프”는 안키린 반복 도메인과 같은 본 발명의 결합 도메인에 대해 그 자체로 착하는, PDGF-BB와 같은 표적 단백질의 표면에서의 특이적 부위를 의미한다. 상기 용어는 항체의 에피토프와 유사체로 정의하고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 만약 본 발명의 2개의 결합 도메인이 동일한 에피토프에 결합하면, 이들은 PDGF-BB에 대해 결합하기 위해 경쟁할 것이다. 에피토프의 정확한 분자적 배열은 예를 들어, PDGF-BB와의 복합체에서 본 발명의 결합 도메인의 단백질 X-ray 결정학 (당업자에게 잘 알려진 방법)에 의해 규명될 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 포유류 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 안키린 반복 도메인으로 적어도 70% 동일성의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열을 포함한다: 여기서

상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고,

상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환된다.

바람직하게는 본 발명의 재조합 결합 단백질에서 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 24, 45 및 50; 더욱 바람직하게는 24 및50으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 안키린 반복 도메인으로 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. .

바람직하게는 본 발명의 재조합 결합 단백질에서 상기 안키린 반복 도메인은, 서열번호: 23 내지 60로 구성된 군으로부터 선택되는 안키린 반복 도메인의 N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 1, 2, 또는 3개의 안키린 반복 모듈과 함께, 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 포함한다.

바람직하게는 70% 아미노산 동일성 대신, 안키린 반복 도메인 또는 이러한 1,2, 또는 3개의 반복 모듈이, 적어도 75% 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 적어도 76%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질 중 안키린 반복 도메인에서 N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재한다. 바람직하게는 상기 언급된 아미노산 서열 동일성 퍼센트는 프레임워크 위치에 있다.

바람직하게는, 30 아미노산까지, 예를 들어, 반복 도메인 서열번호:23 내지 60에서 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 아미노산이 치환되거나 또는 아무런 아미노산도 치환되지 않는다. 특히, 서열번호: 23 내지 60 중 25 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 20 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 15 아미노산 까지, 더더욱 바람직하게는 11 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 8 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 5 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 2아미노산까지, 치환되고 그리고 가장 바람직하게는 어느 아미노산도 치환되지 않는다.

바람직하게는 서열번호:13 또는 16의 캡핑 모듈에서, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19의 반복 모듈에서 또는 서열번호:23 내지 60의 반복 도메인에서, 아미노산들이 치환될 때, 이러한 아미노산들은 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 구성되는 군으로부터; 더욱 바람직하게는 A, D, E, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, 및 Y로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또한 바람직하게는 아미노산은 상동 아미노산에 의해 치환되고, 즉, 아미노산은 유사한 생리학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산 D는 음으로 하전된 아미노산 E에 의해 치환될 수 있거나, 또는 L과 같은 소수성 아미노산은 A, I 또는 V에 의해 치환될 수 있다. 폴리펩티드에서 다른 아미노산에 의해 아미노산을 치환하는 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 포유동물 PDGF-BB에 대해 결합 특이성을 가지는 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서

상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고,

상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환된다.

바람직하게는, 이러한 안키린 반복 도메인은 서열번호: 24, 45 및 50; 더욱 바람직하게는 24 및 50로 이루어지는 군으로부터 선택된다. .

추가의 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 안키린 반복 도메인으로서 동일한 에피토프에 부착한다. 바람직하게는 이러한 안키린 반복 도메인은 서열번호: 24, 45 및 50; 더욱 바람직하게는 24 및 50로 구성되는 군으로부터 선택된다. .

추가의 구체예에서, 본 발명은 포유동물 PDGF-BB에 대해 결합 특이성을 가지는 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19 및 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 안키린 반복 모듈을 포함하고, 여기서 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19에서 9 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다.

바람직하게는 상기 안키린 반복 도메인의 이러한 안키린 반복 모듈은 서열번호: 12, 14 및 17로; 더욱 바람직하게는 12 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19의 반복 모듈에서 8 아미노산까지 다른 아미노산으로 치환되고, 더욱 바람직하게는 7 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 6 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 5 아미노산까지, 더더욱 바람직하게는 4 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 3 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 2 아미노산까지, 가장 바람직하게는 1 아미노산까지 치환된다. 바람직하게는 아미노산의 상기 언급된 치환은 프레임워크 위치에 존재한다. 따라서, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19의 프레임워크 위치에서 8 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되고, 바람직하게는 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 아미노산까지, 가장 바람직하게는 1 아미노산까지 치환된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 KDEEGTTPLHYAAVWGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:12) 및 서열들을 가지는 반복 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 11에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 3에서 E는 선택적으로 D, W, Q, I 및 Y 로 이루어진 군, 바람직하게는 D 및 W 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;

위치 4에서 E는 선택적으로 T, D, Y, 및 S 로 이루어진 군, 바람직하게는 T 및 D 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;

위치 6에서 T는 선택적으로 S 및 F 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산, 바람직하게는 S에 의해 치환되고;

위치 11에서 Y는 선택적으로 F에 의해 치환되고;

위치 14에서 V는 선택적으로 A, Y 및 T 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산, 바람직하게는 A에 의해 치환되고;그리고

위치 15에서 W는 선택적으로 F, K, V, 및 Y 로 이루어진 군, 바람직하게는 F 및 Y 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환된다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 포유동물 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 이 때, 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:13 및 16 및 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 가지는 캡핑 모듈을 포함하고, 여기서 서열번호:13 및 16에서 9 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다.

바람직하게는 상기 안키린 반복 도메인에 포함된 서열번호:13 및 16의 캡핑 모듈에서 8 아미노산까지 다른 아미노산에 의해 치환되고, 더욱 바람직하게는 7 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 6 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 5 아미노산까지, 더더욱 바람직하게는 4 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 3 아미노산까지, 더욱 바람직하게는 2 아미노산까지 , 더욱 바람직하게는 1 아미노산까지 치환되고, 가장 바람직하게는 서열번호:13 및 16에서 아무런 아미노산도 치환되지 않는다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 QDIYGATPADLAALVGHEDIAEVLQKLN (서열번호:13) 및 서열들을 가지는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 13에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 3에서 I는 선택적으로 K, L, A 및 V로 이루어진 군, 바람직하게는 L, A 및 V 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;

위치 4에서 Y는 선택적으로 W. F 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 W 및 F 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;

위치 6에서 A는 선택적으로 K에 의해 치환되고;

위치 14에서 L은 선택적으로 F, Y 및 D로 이루어진 군, 바람직하게는 F 및 Y 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;

위치 15에서 V는 선택적으로 L, I, A 및 N로 이루어진 군, 바람직하게는 L 및 I 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고; 그리고

위치 23에서 V는 선택적으로 I 및 L로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환된다.

바람직하게는 상기 안키린 반복 도메인이 서열번호:12의 안키린 반복 모듈 및 서열번호:13의 C-말단 캡핑 모듈을 포함하는, 재조합 결합 단백질이다. 바람직하게는 상기 C-말단 캡핑 모듈은 상기 안키린 반복 도메인에서 안키린 반복 모듈을 직접적으로 따른다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 KDQEGTTPLHFAASVGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:15) 및 서열들을 가지는 반복 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 15에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 3에서 Q는 선택적으로 A로 치환되고;

위치 4에서 E는 선택적으로 D로 치환되고;

위치 6에서 T는 선택적으로 E로 치환되고;

위치 11에서 F는 선택적으로 Y로 치환되고;

위치 14에서 S는 선택적으로 V로 치환되고; 및

위치 15에서 V는 선택적으로W로 치환된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 QDHYGATPADLAALIGHEDIAEVLQKLN (서열번호:16) 및 서열들을 가지는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 15에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 3에서 H는 선택적으로 I로 치환되고; 및

위치 4에서 Y는선택적으로 W로 치환된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 KDLNGQTPLHLAADIGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:17) 및 서열들을 가지는 반복 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 17에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 1에서 K는 선택적으로 Q 또는 I로 치환되고;

위치 3에서 L은 선택적으로 N으로 치환되고; 및

위치 27에서 A는 선택적으로 H로 치환된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 KDYAGSTPLRLAAWAGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:18) 및 서열들을 가지는 반복 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 18에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 1에서 K는 선택적으로 Q로 치환되고;

위치 14에서 W는 선택적으로 H로 치환되고;

위치 15에서 A는 선택적으로 V로 치환되고; 및

위치 27에서 A는 선택적으로 N 또는 Y로 치환된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 이 때, 상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 KDYFGYTPLHLAAYFGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:19) 및 서열들을 가지는 반복 모듈을 포함하고, 이 때 서열번호: 19에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환된다: 여기서

위치 1에서 K는 선택적으로 N으로 치환되고;

위치 12에서 A는 선택적으로 T로 치환되고;

위치 13에서 A는 선택적으로 T로 치환되고

위치 22에서 E는 선택적으로 D로 치환되고;

위치 27에서 A는 선택적으로 H 또는 Y로 치환된다.

바람직하게는 N-말단 또는 C-말단 안키린 캡핑 반복서열을 각각 포함하는 N-말단 또는 C-말단 안키린 캡핑 모듈이고, 이 때, 상기 캡핑 반복서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기는 상응하는 안키린 캡핑 유닛 또는 안키린 반복 유닛의 정렬 상 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산 잔기에 의해 치환된다.

아미노산의 치환은 임의의 20개의 가장 흔한 천연 산출 아미노산에 의해, 바람직하게는 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해, 더욱 바람직하게는 A, D, E, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된다. 또한 바람직하게는, 아미노산의 치환은 상동 아미노산에 의해 실시되며, 즉 아미노산은 유사한 생리학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산 D는 음으로 하전된 아미노산 E에 의해 치환될 수 있거나, 또는 L과 같은 소수성 아미노산은 A, I 또는 V에 의해 치환될 수 있다. 상동 아미노산에 의한 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

또한 바람직하게는 서열번호:4 내지 8, 13 및16 상에 기초하는 임의의 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치 27 및 28에서 아미노산 A를 포함하는 상기 C-말단 안키린 캡핑 모듈이다.

또한, 바람직하게는 서열번호:4 내지 8, 13 및 16 상에 기초하는 임의의 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치 1 내지 26 또는 위치 1 내지 27로부터 아미노산을 포함하는 C-말단 캡핑 모듈이다.

서열번호:1 내지 3의 위치 1에서 아미노산 G 및/또는 위치 2에서 S 는 물성 상 뚜렷한 영향없이 N-말단 안키린 캡핑 모듈로부터 제거될 수 있다. 이러한 2개의 아미노산이 링커로서 제공되어 안키린 반복 도메인을 추가의 아미노산 및 단백질에 연결한다. 본 발명은 또한 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S가 제거된 N-말단 안키린 캡핑 모듈을 포함하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 정의하는 안키린 반복 도메인에서 상기 아미노산 위치(예: 위치 33)는 조정되어 따라서 결과적으로 숫자 이동, 예를 들어 만약 하나의 아미노산이 결실되면 “위치 33”은 “위치 32”가 되고, 두개의 아미노산이 결실되면 “위치 33”은 “위치 31”이 되어지는 것으로 이해된다.

본 발명의 안키린 반복 도메인의 안키린 캡핑 모듈은, 당업자에게 알려져 있는 아미노산 서열의 정렬, 돌연변이 및 유전자 합성과 같은 조합 기술에 의해 안키린 캡핑 모듈에 의해 교체될 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호:49의 C-말단 캡핑 반복서열은 서열번호:8의 C-말단 캡핑 반복서열에 의해 대체될 수 있다: (i) 서열번호:8로 서열 정렬(sequence alignment)에 의해 서열번호:49 (즉, 서열위치 132 ~ 159)의 C-말단 캡핑 반복서열의 결정, (ii) 서열번호:49 의 결정된 C-말단 캡핑 반복서열을 서열번호:8의 서열로 대체, (iii) 교체된 C-말단 캡핑 모듈을 코딩하는 반복 도메인을 코딩하는 유전자 생성, (iv) E. coli 의 세포질에서 변형된 반복 도메인의 발현 (v) 표준 방법에 의해 변형된 반복 도메인의 정제.

추가의 예로서는, 서열번호:2의 N-말단 캡핑 반복서열에 의해 서열번호 49의 N-말단 캡핑 반복서열이 대체될 수 있다: (i) 서열번호:2로 서열 정렬에 의해 서열번호:49 (즉, 서열 위치 1 ~ 32)의 N-말단 캡핑 반복서열 결정 , (ii) 서열번호:49 의 결정된 N-말단 캡핑 반복서열을 서열번호:2의 서열로 대체, (iii) 교체된 N-말단 캡핑 모듈을 코딩하는 반복 도메인을 코딩하는 유전자 생성, (iv) E. coli 의 세포질에서 변형된 반복 도메인의 발현, 및 (v) 표준 방법에 의해 변형된 반복 도메인의 정제.

또한, 본 발명의 안키린 반복 도메인은, 유전적 합성수단에 의해 하나 이상의 반복 모듈(예: 서열번호:49의 위치 33~131로부터 아미노산 잔기를 포함하는 3개의 안키린 반복 모듈) 및 C-말단 캡핑 모듈 (예: 서열번호:8의 C-말단 캡핑 반복서열)에 이어서 N-말단 안키린 캡핑 모듈 (예: 서열번호:2의 N-말단 캡핑 반복서열)을 조립함으로써 유전적으로 구축할 수 있다. 그 후, 상기 유전적으로 조립된 반복 도메인 유전자는 상술한 바와 같이 E. coli에서 발현될 수 있다.

추가의 바람직한 예는 아미노산 C, M 또는 N이 없는 아미노산 서열을 가지는 C-말단 캡핑 모듈, 또는 N-말단 캡핑 모듈, 반복 모듈, 반복 도메인, 재조합 결합 단백질이다.

추가의 바람직한 예는 아미노산 G에 이어서 N이 없는 아미노산 서열을 가지는 가지는 C-말단 캡핑 모듈, 또는 N-말단 캡핑 모듈, 반복 모듈, 반복 도메인, 재조합 결합 단백질이다.

추가의 바람직한 예는 N-말단 또는 C-말단 캡핑 모듈과 같은 것들을 포함하는 재조합 결합 단백질 또는 반복 도메인이다.

본 발명에 따른 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 반복 도메인의 N-말단 캡핑 모듈의 하나 이상의 아미노산 잔기는 N-말단 캡핑 유닛의 정렬 상에서 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산에 의해 교체된다. 바람직하게는 아미노산 잔기의 30%까지 교체되고, 더욱 바람직하게는 아미노산 잔기의 20%까지, 더더욱 바람직하게는 10%까지 교체된다. 가장 바람직하게는 이러한 N-말단 캡핑 유닛이 천연적으로 산출되는 N-말단 캡핑 유닛이다.

본 발명에 따른 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 반복 도메인의 C-말단 캡핑 모듈의 하나 이상의 아미노산 잔기는 C-말단 캡핑 유닛의 정렬 상에서 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산에 의해 교체된다. 바람직하게는 아미노산 잔기의 30%까지 교체되고, 더욱 바람직하게는 아미노산 잔기의 20%까지, 더더욱 바람직하게는 10%까지 교체된다. 가장 바람직하게는 이러한 C-말단 캡핑 유닛이 천연적으로 산출되는 C-말단 캡핑 유닛이다.

다른 특정 구체예에서, 아미노산 잔기의 30%까지, 더욱 바람직하게는 20%까지, 더더욱 바람직하게는 10%까지 반복 유닛, N-말단 캡핑 유닛 또는 C-말단 캡핑 유닛의 상응하는 위치에서 발견되지 않는 아미노산으로 교체된다.

용어 “공통 서열(consensus sequence)”은 상기 공통 서열이 다중 반복 유닛의 구조적 및/또는 서열 정렬에 의해 수득되는 아미노산 서열이다. 2이상의 반복 단위로 정렬된 구조 및/또는 서열을 이용, 및 정렬에서 갭을 허용하여 각 위치에서 가장 흔한 아미노산 잔기를 결정하는 것이 가능하다. 상기 공통 서열은 각 위치에서 가장 자주 나타나는 아미노산을 포함하는 서열이다. 2이상의 아미노산이 단일 위치에서 평균 이상으로 나타나는 경우에, 상기 공통 서열은 이러한 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 2이상의 반복 유닛은 단일 반복 단백질 에 포함된 반복 유닛 또는 2이상의 상이한 반복 단백질로부터 취해질 수 있다.

공통 서열 및 이들을 결정하는 방법은 당업자들에게 잘 알여져 있다.

“공통된 아미노산 잔기”는 공통 서열에서 임의의 위치에서 발견된 아미노산이다. 2이상, 예를 들어, 3, 4, 또는 5 아미노산 잔기가 상기 2이상의 반복 유닛에 유사한 확률로 발견되면, 상기 공통된 아미노산은 가장 자주 발견되는 아미노산 중 하나이거나 또는 상기 2이상의 아미노산 잔기의 조합일 수 있다.

추가의 바람직한 경우는 비-천연 산출되는 캡핑 모듈, 반복 모듈, 반복 단백질 또는 반복 도메인이다.

용어 "비-천연 산출"은 합성이거나 또는 천연으로부터 얻은 것이 아니라는 것을 의미하며, 더욱 자세하게는, 상기 용어는 인간의 손으로 제조된 것을 의미한다. 용어 "비-천연 산출 결합 단백질" 또는 "비-천연 산출 결합 도메인"은 상기 결합 단백질 또는 상기 결합 도메인이 합성(즉 아미노산으로부터 화학 합성에 의해 생성) 이거나 또는 재조합이고 또 천연으로부터 얻은 것이 아닌 것을 의미한다. "비-천연 산출 결합 단백질" 또는 "비-천연 산출 결합 도메인"은 상응하게 설계된 핵산의 발현에 의해 얻은 인간이 제조한 단백질 또는 도메인이다. 바람직하게는, 상기 발현은 진핵생물 또는 세균성 세포 중에서 실시되거나, 또는 무세포 시험관내 발현 계를 이용하여 실시된다. 또한 상기 용어는 상기 결합 단백질 또는 상기 결합 도메인의 서열이 예컨대 GenBank, EMBLBank 또는 Swiss-Prot에 등록된 서열 데이터베이스 중의 비-인공 서열 엔트리로서 존재하지 않는 것을 의미한다. 이들 데이터베이스 및 다른 유사한 서열 데이터베이스는 당업자에게 잘 공지되어 있다

본 발명의 일 특별한 구체예는 PDGF-BB에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함하고, (VEGF-A(vascular endothelial growth factors A)에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. PDGF-BB에 대한 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인의 예는 본 명세서에 기재되어 있고, VEGF-A에 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인의 예는 WO 2010/060748 (US 2011/0207668) 및 WO 2011/135067 (US 2013/0116197)에 기재되어 있고, 이들 전체 기재는 여기에 참조로 통합된다. 상기 2개의 반복 도메인은 당업자들에게 알려진 방법에 의해 유전적 수단으로 폴리펩티드 링커에 의해 결합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, PDGF-BB를 특이적으로 결하하는 안키린 반복 도메인 및 VEGF-A를 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질은 삼출성 연령-관련 황반 변성(exudative age-related macular degeneration), 폴립모양의 맥락막 혈관 신생(polypoidal choroidal neovascularization) 및 병적 근시(pathological myopia)와 같은 망막 질환 및 맥락막 혈관 신생 질환의 치료에 사용될 수 있다.

다른 바람직한 구체예는 PDGF-BB에 결합하는 것에 참여하게 될 하나, 두개 , 3개 또는 그 이상의 내부 반복 모듈을 포함하는, PDGF-BB에 대해 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인을 포함하는 제조합 결합 단백질이다. 바람직하게는 이러한 안키린 반복 도메인은 N-말단 캡핑 모듈, 2~4 내부 반복 모듈 및, C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 바람직하게는 상기 캡핑 모듈은 캡핑 반복서열이다. 또한 바람직하게는 상기 캡핑 모듈은 PDGF-BB에 결합함에 참여하게 될 것이다.

추가의 바람직한 예는 PDGF-BB에 대해 결합 특이성을 가지는 2개 이상의 안키린 반복 도메인의을 포함하는 재조합 결합 단백질이다. 바람직하게는 상기 결합 단백질은 2 또는 3의 상기 반복 도메인을 포함한다. 상기 2이상의 반복 도메인은 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가진다.

본 발명에 따른 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 안키린 반복 도메인의 반복 모듈의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 반복 유닛의 배열 상 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산에 의해 교체된다. 바람직하게는 아미노산 잔기의 30%까지, 더욱 바람직하게는 20%까지, 더더욱 바람직하게는 10%까지 교체된다. 가장 바람직하게는 이러한 반복 유닛이 천연적으로 발생하는 반복 유닛이다.

다른 특별 구체예에서는, 아미노산 잔기의 30%까지, 예를 들어, 아미노산 잔기의 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%가 반복 유닛의 상응하는 위치에서 발견되지 않는 아미노산으로 교체된다. 보다 바람직하게는 아미노산 잔기의 20%까지, 더더욱 바람직하게는 10%까지 반복 유닛의 상응하는 위치에서 발견되지 않는 아미노산으로 교체된다.

추가의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 PDGF-BB 단백질 또는 도메인 은, 예컨대, 상이한 표적에 결합하여 이중 특이성 결합제를 생성하는 부분(moiety), 생활성 화합물, 라벨링 부분(예를 들어 플루오레세인과 같은 형광 라벨, 또는 방사능활성 트레이서), 단백질 정제를 용이하게 하는 부분(예를 들어 His- 또는 strep-태그와 같은 소 펩티드 태그), 개선된 치료 효능을 위해 이팩터 기능을 제공하는 부분(예를 들어 항체-의존적 세포-매개된 세포독성을 제공하기 위한 항체의 Fc 부분, 슈도모나스 아에루기노사 외독소(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A(ETA))와 같은 독성 단백질 부분 또는 메이탄시노이드(maytansinoid) 또는 DNA 알킬화제와 같은 소분자 독성제 또는 개선된 약동학을 제공하는 부분을 비롯한 하나 또는 그 이상의 부가적 부분에 공유적으로 결합될 수 있다. 개선된 약동학은 인지된 치료 필요에 따라서 평가될 수 있다. 흔히 복용 후 단백질이 혈청 중 유용하게 남았는 시간을 증가시키는 것에 의해, 생체이용율(bioavailability)을 증가 및/또는 복용 사이의 시간을 증가시키는 것이 바람직하다. 일부 예에서, 시간 경과에 따라 단백질의 혈청 농도의 연속성을 향상시키는 것이 바람직하다(예를 들어, 투여 직후의 농도와 다음 투여 직전의 농도 사이의 단백질의 혈청 농도에서 차이를 감소시킴). 혈액으로부터 단백질의 클리어런스를 둔화시키는 경향이 있는 부분들은 HES(hydroxyethyl starch), PEG(polyethylene glycol), 설탕 (예: 시알산), 내성 좋은(well-tolerated) 단백질 부분들 (예를 들어, Fc 프래그먼트 또는 혈청 알부민) 및, 항체 Fc 프래그먼트 또는 혈청 알부민과 같은 풍부한 혈청 단백질에 대한 특이성 및 친화도를 가지는 결합 도메인 또는 펩티드를 포함한다. 혈청 알부민에 대해 친화성을 가지는 이러한 결합 도메인의 예는 WO 2012/069654에서 제공된다. 본 발명의 재조합 결합 단백질은 변형되지 않은 폴리펩티드에 상대적으로 3 배 이상 커짐에 의해 포유동물(예: 마우스, 랫트, 또는 인간)에서 폴리펩티드의 클리어런스 속도를 감소시키는 부분에 부착될 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 상기 특별한 재조합 결합 단백질, 상기 특별한 안키린 반복 도메인, 상기 특별한 안키린 반복 모듈 및 상기 특별한 캡핑 모듈을 코딩하는 핵산 분자들에 관한 것이다. 또한, 상기 핵산 분자들을 포함하는 벡터가 고려된다.

또한, 하나 또는 그 이상의 상기 언급한 재조합 결합 단밸질, 특히 반복 도메인, 또는 상기 특별한 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석체를 포함하는 약학적 조성물이 고려된다. 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 공지되어 있고 하기에 더 상세히 설명된다. 더 추가로, 하나 또는 그 이상의 상기 언급한 재조합 결합 단백질, 특히 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질을 포함하는 진단용 조성물이 고려된다.

약학적 조성물은 상술한 바와 같은 결합 단백질 및 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 당업자에게 공지된 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 생리적 염수, 링거액, 덱스트로오스 용액, 행크 용액, 고정 오일, 에틸 올레에이트, 식염수 중의 5% 덱스트로오스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충액 및 보존제이다. 다른 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같이, 조성물을 수용하는 개인에게 유해한 항체 생산을 유도하지 않는 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 또한 항암제 또는 항혈관신생제와 같은 부가적 활성제를 포함하는 조합 제제(combination formulation) 일 수 있다

생체내(in vivo) 투여에 사용될 제제는 무균 또는 멸균이어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통하여 여과하는 것에 의해 용이하게 달성될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당업자의 지식 내에서 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다.

또한, 임의의 상기 언급한 약학적 조성물은 질병의 치료를 위해 고려될 수 있다.

본 발명은 또한 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 필요한 환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 재조합 결합 단백질, 즉 환자에게 바람직한 효과를 생성하는데 충분한 양을 투여하는 것을 포함한다.

또한, 사람을 포함하는 포유동물에서 병리학적 상태를 치료하는 방법은 상기 언급한 약학적 조성물의 유효한 양을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것이 고려된다.

이러한 병리학적 상태의 예는 죽상동맥경화증, 재발협착증, 폐고혈압, 눈 및 망막 질환 및 섬유증이고, 폐경화증, 간경화증, 피부경화증, 사구체경화증 및 심장 섬유증을 포함한다. 게다가, 항-PDGF-BB 치료 요법은 신경교종, 육종, 백혈병, 림프종 및 상피암과 같은 종양성 병리학적 상태에 유용한다.

본 발명에 따른 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인은 박테리오파지(WO　1990/002809호, WO 2007/006665호) 또는 세균성 세포(WO1993/010214호)의 표면 상에서의 디스플레이, 리보솜 디스플레이(WO　1998/048008호), 플라스미드 상에서의 디스플레이(WO 1993/008278호)와 같은 몇 가지 방법에 의해 또는 공유결합 RNA-반복 단백질 하이브리드 작제물(WO 2000/032823), 또는 단백질 상보성 분석(WO 1998/341120호)에 의한 것과 같은 세포간 발현 및 선별/스크리닝을 이용하는 것에 의해 수득될 수 있거나 및/또는 더욱 발전될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 결합 단백질의 선택/스크리닝을 위해 사용된 안키린 반복 단백질의 라이브러리는 당업자에게 공지된 수순에 따라서 얻을 수 있다(WO 2002/020565호, Binz, H.K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003, and Binz et al., 2004, loc. cit). PDGF-BB에 대한 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인의 선별을 위한 상기 라이브러리의 사용은 실시예 1에 예시되어 있다. 또한, 본 발명의 안키린 반복 도메인은 본 발명 및 적절한 캡핑 모듈 또는 캡핑 반복서열 (Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003)에 따른 안키린 반복 모듈로부터 표준 재조합 DNA 기술(예를 들어 WO　2002/020565호, Binz et al., 2003, loc. cit. 및 Binz et al., 2004, loc. cit)을 이용하여 모듈방식(modularly)으로 조립될 수 있다.

본 발명은 실시예에 기재된 특정 실시양태에 한정되지 않는다. 다른 공급원도 사용될 수 있고 또 이하에 개략적으로 기재한 방식에 따라 처리될 수 있다.

실시예

이하에 기재된 모든 출발 물질 및 시약은 당업자에게 공지되어 있고 또 상업적으로 구입가능하거나, 또는 공지 수법을 이용하여 제조될 수 있다.

재료

화학물질은 Fluka(스위스)로부터 입수하였다. 올리고뉴클레오티드는 Microsynth(스위스)로부터 입수하였다. 특별히 다르게 언급하지 않는 한, DNA 중합효소, 제한효소 및 완충액은 뉴잉글랜드 바이오랩(USA) 또는 Fermentas(리투아니아)로부터 구입하였다. 클로닝 및 단백질 생산 균주는 대장균(E.coli) XL1-블루 (스트라타진, USA) 또는 BL21 (노바젠, USA)이었다. 재조합 인간 및 쥐 PDGF-BB를 Reliatech (독일; 상품번호 각각 200-055및 M10-125)로부터 구입하였다. 표준 비오틴화 시약 및 방법(Pierce, USA)을 이용하여 단백질의 일차 아민에 비오틴 부분을 커플링시킴으로써 비오틴화한 PDGF-BB를 화학적으로 수득하였다.

분자 생물학

따로 언급하지 않는 한, 기술하는 프로토콜에 따라 실험방법들을 수행하였다 (Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York).

DARPin ( designed ankyrin repeat proteins ) 라이브러리

설계된 안키린 반복서열 단백질 라이브러리를 생성하는 방법이 기술되어 있다(WO 2002/020565; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit.).. 이러한 방법에 의해 임의의 안키린 반복 모듈 및/또는 임의의 캡핑모듈을 가지는 DARPin 라이브러리를 구축할 수 있다. 예를 들어, 상기 라이브러리는, 고정된 N-말단 캡핑 모듈(예를 들어, 서열번호 2의 N-말단 캡핑모듈) 또는 서열번호 64에 따른 임의의 N-말단 캡핑 모듈, 서열번호 20,62 또는 63의 서열 모티프에 따른 하나 또는 그 이상의 임의의 반복 모듈, 및 고정된 C-말단 캡핑모듈(예를 들어, 서열번호 8의 C-말단 캡핑모듈) 또는 서열번호 65에 따른 임의의 C-말단 캡핑 모듈에 기반하여 상황에 맞추어 조립될 수 있다. 바람직하게는 이러한 라이브러리는 반복 또는 캡핑 모듈의 임의의 위치에서 아미노산 C, G, M, N(G 잔기 앞에서) 또는 P를 가지지 않도록 조립된다. 게다가, 서열번호 20, 62, 또는 63의 서열 모티프에 따른 임의의 반복 모듈은 위치 10 및/또는 위치 17에서 추가로 임의로 정해질 수 있고; 서열번호 64의 서열 모티프에 따른 상기 임의의 N-말단 캡핑모듈은 위치7 및/또는 위치 9에서 추가로 임의로 정해질 수 있으며; 서열번호 65의 서열 모티프에 따른 상기 임의의 C-말단 캡핑모듈은 위치 10, 11 및/또는 17에서 추가로 임의로 정해질 수 있다.

또한, 이러한 라이브러리에서 상기 임의의 모듈은 임의의 아미노산 위치를 가지는 추가적인 폴리펩티드 루프 삽입체를 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 루프 삽입체의 예는 항체의 상보성 결정 영역(complement determining region, CDR) 루프 라이브러리 또는 새로(de novo) 생성된 펩티드 라이브러리이다. 예를 들어, 이러한 루프 삽입체는 인간 리보뉴클레아제 L의 N-말단 안키린 반복 도메인의 구조를 이용하여 가이드로서 설계될 수 있다(Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929-3938, 2004). 10개 아미노산이 2개의 안키린 반복의 경계에 근접하여 존재하는 베타-회전(beta-turn)에 삽입된 이러한 안키린 반복 도메인과 유사하게, 안키린 반복 단백질 라이브러리는, 하나 또는 그 이상의 베타-회전의 안키린 반복 도메인에 삽입된 다양한 길이(예를 들어 1~20 아미노산)의 임의의 루프(고정 및 임의의 위치를 가지는)를 함유할 수 있다.

안키린 반복 단밸질 라이브러리의 임의의 N-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 RILLAA 모티프(예: 서열번호 64에서 위치 21 내지 26으로부터 존재함) 대신 RELLKA 또는 RILKAA 모티프를 가지고, 안키린 반복 단밸질 라이브러리의 임의의 C-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 KLN 모티프(예: 서열번호 65에서 마지막 3개의 아미노산) 대신 KAA 또는 KLA 모티프를 가진다.

상기 안키린 반복 단백질 라이브러리의 설계는 표적과 상호작용하는 안키린 반복 도메인의 공지 구조를 참고할 수 있다. 단백질 데이터 은행(Protein Data Bank, PDB)의 고유 어세션 또는 식별의 코드(PDB-IDs )에 의해 정의되는 이러한 구조들의 예들은 1WDY, 3V31, 3V30, 3V2X, 3V2O, 3UXG, 3TWQ-3TWX, 1N11, 1S70 및 2ZGD이다.

N2C 및 N3C DARPin 라이브러리와 같은 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin) 라이브러리의 예들이 기재되어 있다(WO 2002/020565; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit.). N2C 및 N3C 중의 디지트(digit)는 N-말단과 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 임의의 반복 모듈의 갯수를 기재한다.

반복 유닛 및 모듈 내부 위치를 정의하기 위해 사용된 명명법은 Binz et al. 2004, loc. cit.를 기본으로 하며, 안키린 반복 모듈 및 안키린 반복 단위의 경계가 1개 아미노산 위치만큼 이동한 변형을 갖는다. 예컨대, Binz et al. 2004(loc. cit.)의 안키린 반복 모듈의 위치 1은 본 발명의 안키린 반복 모듈의 위치 2에 상응하며, 또 따라서 Binz et al. 2004, loc. cit.의 안키린 반복 모듈의 위치 33은 본 발명의 하기 안키린 반복 모듈의 위치 1에 상응한다.

모든 DNA 서열은 시퀀싱에 의해 확인하였고 또 모든 기재된 단백질의 계산된 분자량은 질량 분광분석법에 의해 확인하였다.

실시예 1: PDGF - BB 에 대한 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인을 함유하는 결합 단백질의 선별

리보좀 디스플레이를 이용하여(Hanes, J. and Pluckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997), many (DARPins) with binding specificity for PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 다수의 DARPins(designed ankyrin repeat proteins)를 Binz et al. 2004 (loc. cit.)에 의해 기재된 바대로 DARPins 라이브러리로부터 선별하였다. 특이적(PDGF-BB) 및 비특이적(MBP, E. coli maltose binding protein) 표적에 대한 선별된 클론의 결합은 조 추출물 ELISA에 의해 평가되어 수백개의 PDGF-BB 결합 단백질이 성공적으로 선별되었음을 확인하였다. 예를 들어, 상기 서열번호: 23 내지 61의 안키린 반복 도메인은 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선별된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성하고 있다. PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 이러한 안키린 반복 도메인으로부터 개별적인 안키린 반복 모듈이 서열번호: 12, 14, 15, 17, 18 및 19에 제공된다. PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 상기 안키린 반복 도메인의 개별적 캡핑 모듈이 서열번호: 13 및 16에 제공된다.

리보솜 디스플레이에 의한 PDGF - BB 특이적 안키린 반복 단백질의 선별

PDGF-BB 특이적 안키린 반복 단백질의 선별은, 표적 단백질로서 인간 및 마우스PDGF-BB, 상기 기술된 설계된 안키린 반복단백질의 라이브러리 및 구축된 프로토콜(Zahnd, C., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007)를 이용하여 리보솜 디스플레이(Hanes and Pluckthun, loc. cit.)에 의해 수행하였다. 각 선별 라운드 후 역전사(RT)-PCR 사이클 횟수는 40에서 30으로 계속해서 감소시키고 바인더의 농축으로 인해 수율을 조절하였다. 첫번째 4 라운드의 선별은, 라운드 1에서 4까지 선별 압력을 증가시키기 위해서 감소하는 표적 농도 및 증가하는 세척 강도를 이용하여 (Binz et al. 2004, loc. cit.), 표준 리보솜 디스플레이 선별을 적용하였다. 고 친화성 항- PDGF-BB DARPins를 풍부하게 하기 위해, 네 번째 표준 리보솜 디스플레이 선별(상술함)로부터의 결과물을 증가된 선별 강도(stringency)를 가지는 오프-레이트(off-rate) 선별 대상으로 하였다(Zahnd, 2007, loc. cit.). 최종 표준 선별 라운드를 수행하여 오프-레이트 선별된 결합 단백질을 증폭하고 회수하였다.

조추출물 ELISA 에 의해 보여준 바와 같이 선별된 클론들의 PDGF - BB 에의 특이적 결합

특이적으로 PDGF-BB 결합하는, 개별적으로 선별된DARPins을 표준 프로토콜을 이용하여 DARPin 발현 세포의 조(crude) Escherichia coli 추출물의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 규명하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 선별된 DARPins을 pQE30 (Qiagen) 발현 벡터 내로 클로닝하고 E. coli XL1-Blue (Stratagene) 내로 형질전환한 후, 1 ml 성장 배지(1% 글루코오스 및 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 2YT)를 함유하는 96-깊은 웰 플레이트(싱글 웰에 각 클론)에서 37°C 하 밤새 성장시켰다. 신선한 96-깊은 웰 플레이트에서 100 μl의 밤샘 배양물에 50 μg/ml 암피실린을 함유하는 1 ml의 신선한2YT를 접종하였다. 37°C 하 2시간 동안 접종 후, IPTG (1 mM 최종 농도)로 발현을 유도하고 3 h 동안 계속하였다. 세포들을 수확한 후, 100 μl B-PERII (Pierce)에 재현탁하고 실온에서 흔들면서 15분 동안 배양하였다. 그 후, 900 μl PBS-TC (0.25% 카세인 가수분해물, 0.1% Tween 20®이 보완된 PBS, pH 7.4)를 첨가하고 세포 데브리스를 원심분리에 의해 제거하였다. 100 μl의 각 용해된 클론을, 비오틴 부분을 통해 고정된 unrelated MBP 또는 PDGF-BB 중 어느 하나를 함유하는 뉴트라비딘(Neutravidin) 코팅된 MaxiSorp 플레이트의 웰에 적용시키고 1시간 동안 실온에서 배양하였다.

PBS-T (0.1% Tween 20® 보완된 PBS, pH 7.4)로 광범위 세척 후, 상기 플레이트를 단클론 HR(horse-radish)-표지된 항-RGS(His)4 항체 (34650, Qiagen)를 이용하여 표준 ELISA 공정을 사용하여 발달시켰다. 그 후 결합을 POD 기질 (Roche)에 의해 검출하였다. 상기 색깔 발생을 405 nm에서 측정하였다. 상기 조 세포 추출물 ELISA에 의한 수백개 클론의 스크리닝은 PDGF-BB에 대한 특이성을 가지는 수백개 이상의 상이한 DARPins 을 드러내었다. 이러한 결합 단백질을 추가의 분석을 위해 선택하였다. PDGF-BB에 특이적으로 결합하는 선별된 안키린 반복 도메인의 아미노산 서열의 예는 서열번호: 23 내지 61에 제공된다.

PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 이러한 안키린 반복 도메인 및 PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지지 않는 음성 대조군 DARPins(예: DARPin #21 및 #22)을, 하기 기술한 바대로 단순 단백질 정제를 촉진하기 위해 N-말단 His-tag를 제공하는 a pQE (QIAgen, Germany) 기반의 발현 벡터 내로 클로닝하였다.

따라서, 다음의 DARPins를 코딩하는 발현 벡터들을 구축하였다:

DARPin#21(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:21);

DARPin#22(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:22);

DARPin#23(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:23);

DARPin#24(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:24);

DARPin#25(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:25);

DARPin#26(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:26);

DARPin#27(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:27);

DARPin#28(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:28);

DARPin#29(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:29);

DARPin#30(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:30);

DARPin#31(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:31);

DARPin#32(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:32);

DARPin#33(그의 N-말단에 융합된 His-tag(서열번호:9)를 갖는 서열번호:33);

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DARPins 의 고수준 및 수용성 발현

추가 분석을 위해, 상술한 조 세포 추출물 ELISA에서 특이적 PDGF-BB 결합을 보여주는 선별된 클론이 E. coli BL21 또는 XL1-Blue 세포에서 발현되었고 표준 프로토콜을 이용하여 His-tag를 이용하여 정제하였다.

50 ml의 정체 밤샘 배양물(TB, 1% 글루코오스, 100 mg/l 암페실린; 37°C)을 이용하여 1 l 배양물(글루코오스 없는 동일 배지)에 접종하였다. 600 nm상 흡광도 0.7(BL21에 대해 1)에서 , 상기 배양은 0.5 mM IPTG로 유도되었고 37°C 하 4-5 h 동안 배양되었다. 상기 배양물을 원심분리하고 결과물로 수득한 펠렛들을 40 ml TBS500 (50 mM Tris?HCl, 500 mM NaCl, pH 8)에 재현탁하고 초음파처리하였다. 용해물(lysate)들을 다시 원심분리하고 글리세롤 (10% (v/v) 최종 농도) 및 이미다졸(20 mM 최종 농도)을 결과물 상청액에 첨가하였다. Ni-니트릴로트리아세트산 칼럼 (2.5 ml 컬럼 볼륨)에 걸쳐 제조업자(QIAgen, Germany)의 설명서대로 단백질을 정제하였다. 선택적으로, 또는 6xHis-tag가 없는 선별된 반복 도메인 또는 DARPins을 당업자에게 공지된 표준 수지 및 프로토콜에 따라 음이온 교환 크로마토그래피, 이어서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. PDGF-BB에 대한 결합 특이성을 가지는 200 mg의 까지의 고 수용성 DARPins는 1 리터의 E. coli 배양으로부터 SDS-15% PAGE로 평가되는 바와 같이 95% 이상의 순도로 정제될 수 있다. 이렇게 정제된 DARPins을 추가의 특성 분석을 위해 사용하였다.

실시예 2: 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 PDGF - BB 에 대한결합 특이성을 가지는 DARPins 의 특성분석

인간 및 마우스로부터 비오틴화된 PDGF-BB 분자들을 코팅된 스트렙타비딘에의 결합을 통해 유세포 중 고정화시키고 다양한 선별된 DARPins과 상호작용을 분석하였다.

표면 플라스몬 공명( Surface Plasmon Resonance , SPR ) 분석

ProteOn 기구(BioRad)를 이용하여 SPR을 측정하고, 상기 측정은 당업자에게 알려진 표준 공정에 따라 수행하였다. 러닝 버퍼는 0.005% Tween 20®을 함유하는 PBS, pH 7.4이다. 뉴트라비딘이 약 8000 공명 단위(resonance units,RU)의 수준까지 GLC 칩 (BioRad) 상에 공유결합적으로 고정되었다. 그 후 뉴트라비딘 코팅된 칩 상에서 PDGF-BB의 고정화가 수행되었다. 다음으로 DARPin PDGF-BB의 상호작용을 12.5, 6.26, 3.13 및 1.67 nM 농도(온-레이트 측정)의 DARPins의 연속적 희석을 함유하는100 μl 러닝 버퍼 (0.005% Tween®을 함유하는 PBS)를 주입함으로써 측정하고, 이어서 10 분간 동안 러닝 버퍼 흐름 및 일정 유속30 μl/min (오프-레이트 측정)에서 및 3시간까지 측정하였다. 코팅되지 않은 참조 세포 및 참조 주입(즉, 러닝 버퍼만의 주입)의 신호들(즉: 공명 단위(RU) 값)을 PDGF-BB 주입 후 수득된 RU 흔적으로부터 제하였다(이중-참조). 온-레이트 및 오프-레이트 측정으로부터 수득한 상기 SRP 흔적으로부터, DARPin PDGF-BB 상호작용에 상응하는 온- 및 오프-레이트가 결정될 수 있다.

상기 결과들을 표 1에 요약하였다. 해리 상수(Kd)를 평가된 온- 및 오프-레이트로부터 당업자들에게 알려진 표준 공정을 이용하여 계산하였다

[표 1]

실시예 3: PDGF - BB 에 대한 결합 특이성을 가지는 DARPins 에 의한 섬유아세포 세포증식의 억제

NIH-3T3 섬유아세포들은 PDGF-BB을 이용하는 분석에 사용되는 표준 세포주이다. 70%-80% 컨플루언스에서 1일째에, 상기 세포들을 수확하여 성장 배지에 5000 cells/well 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 씨딩하고, 약 7-8 시간 세포들을 굶긴 후 배지를 교체함으로써 배지를 분석하고 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양 조건은 5% CO₂ 흐름 및 37°C 였다. 세포를 굶긴 다음, 2일 째에 배지를 성장 인자 인간 PDGF-BB의 연속 희석물 또는 저해 분석을 위해 DARPins (200 nM ~ 0.05 nM)의 2.5-배 희석물과 20 ng/mL 인간 PDGF-BB의 억제 혼합물을 포함하는 신선한 분석 배지로 교환하였다 (세포증식 분석을 위함). 상기 세포들을 이러한 조건에서 20 μL of WST-1 시약 (Roche product no. 11644807001)의 첨가에 따라 다른 48시간 동안 배양하였다. 이러한 시약은 살아있는 세포들의 수를 분석하는 비색 분석을 가능하게 한다. 신호의 판독은 WST-1의 첨가 후 2,4, 및 6 시간의 여러 시간 포인트에서 A600 nm 상 바탕 보정과 함께 A450 nm에서 이루어졌다.

예시들 결과들을 표 2에 요약하였다. IC₅₀ 값들을 GraphPad Prism software 및 당업자에게 알려진 표준 공정을 이용하여 상술한 바와 같이 수득한 적정 커브로부터 계산하였다. 예시 적정 커브는 도 1에서 DARPin #49 에 대해 주어져 있다.

[표 2]

실시예 4: 수용체 경쟁 분석( receptor competition assay )에 따른 PDGF - BB 에 대한 결합 특이성을 가지는 DARPins 의 특성 분석

수용체 PDGFRbeta에 대한 인간 PDGF-BB의 결합을 저해하는 PEG화된 항-PDGF-BB DARPins의 능력을 수용체 경쟁 ELISA(PDGF-BB Quantikine 기반, R&D Systems)에서 측정하였다. PDGFRbeta/Fc 키메라는 마이크로플레이트 상에서 미리-코팅되어(pre-coated)왔었다.

상기 DARPins 는 PDGF-BB Quantikine kit (R&D Systems)로부터 소정의 PDGF-BB 양으로 분석 희석물에 전배양 (preincubated)되고, 750 rpm에서 쉐이킹하면서 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 이러한 전배양 혼합물을 미리코팅된 웰 내로 옮기고 DARPins 에 의해 블로킹되지 않은 임의의 PDGF-BB를 고정된 수용체에 의해 결합시켰다. 임의의 결합되지 않은 물질들을 세척으로 제거한 후, PDGF-BB 에 특이적인 HRP(horse radish peroxidase)-결합된 다클론 항체를 웰에 첨가하였다. 미결합된 항체-효소 시약을 제거하기 위해 세척하고, 기질 용액을 웰에 첨가하여 PDGF-BB 결합 양의 비율에 따라 색깔을 발현시켰다. 상기 색깔 발생을 중지시키고 색깔의 강도를 405 nm에서 측정하였다. 이 분석에서, 테스트된 DARPin는 표 3에 요약한 바와 같이 높은 PDGF-BB 억제 능력을 보였다. 예시 적정 커브는 도 2에 한 세트의 DARPins에 대해 주어졌다. IC₅₀ 값들을 Graph Pad Prism software 및 당업자에게 알려진 표준 공정을 이용하여 상술한 바와 같이 수득한 상기 적정 커브로부터 계산하였다.

[표 3]

실시예 5: PDGF - BB 에 대한 결합 특이성을 가지는 DARPins 에 의한, 마우스에서 레이저-유도된 맥락막 혈관 신생의 억제

신혈관의 성장에서의 효과를 생체내(in vivo)에서 테스트하였다. 마우스 레이저 맥락막 혈관 신생 모델을 골라 공지된 바대로 수행하였다(Takahashi, K., Saishin, Y., Saishin, Y., King, A.G., Levin, R. and Campochiaro, P.A., Arch. Ophthalmol. 127(4), 494 - 499, 2009).

맥락막 혈관신생(Choroidal neovascularization, CNV)은 브루쉬막(Bruch’s membrane )의 레이저-광응고화-유도된 파열에 의해 유도된다. 2일 째에, 성인 C57BL/6 마우스를 케타민 하이드로클로라이드(100 mg/kg 체중)로 마취시키고 1% 트로피카마이드(tropicamide)로 동공을 확장시켰다. 망막을 관찰하기 위한 접촉 렌즈로서 소형 커버 슬릿을 이용하여 OcuLight GL 다이오드 레이저의 슬릿 램프 전달 시스템(slit lamp delivery system)으로 각 망막에 532 nm 다이오드 레이저 광응고(75 μm 스팟 사이즈, 0.1 초 기간, 120 mW)의 3차례 번즈(burns)를 전달하였다. 망막의 뒤쪽 극 (posterior pole)의 9, 12, 및 3시 정각 위치에서 번즈(burns)를 수행하였다. 브루쉬막(Bruch’s membrane)의 파열을 나타내는, 레이저의 시간에서 버블의 생성은 맥락막 혈관신생을 수득함에 있이서 중요한 요소이므로, 오직 버블이 생성되는 번즈를 본 실험에 포함시켰다. 도 3에 나타낸 바와 같이, DARPin #61-PEG20를 각각 10 또는 1 mg/kg 농도로 매일 투여하였다. 14일 째, 마우스는 플루오로세인-표지된 덱스트란으로 심장을 관류시켰고, 공지방법으로 (Takahashi et al., loc cit) 망막 플랫-마운팅(retinal flat-mounts)을 준비하여 혈관 신 영역을 이미지 분석으로 정량화하였다. 1-way ANOVA 및 Dunnett post-test를 이용하여 통계학적 분석을 수행하여 모든 DARPin 그룹들을 비히클 그룹들과 비교하였다. 이러한 기술들은 당업자들에게 모두 알려져 있다. 그 결과들을 도 3에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> Molecular Partners AG Baumann, Michael <120> Designed ankyrin repeat proteins binding to platelet-derived growth factor <130> P2414 <150> EP12174020 <151> 2012-06-28 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence 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can be any naturally occurring amino acid <400> 20 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 21 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Thr Asp Asn Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Asn Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Ser Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Tyr Asp Asn Asp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala 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Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Tyr Ala Gly Ser Thr Pro Leu Arg Leu Ala Ala Trp Ala 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 59 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 59 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Gly Asp Glu Val His Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Gln Asp Leu Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Gln Asp Tyr Ala Gly Ser Thr Pro Leu Arg Leu Ala Ala Trp Ala 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Asn Asp Tyr Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 60 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 60 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val His Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ile Asp Asn Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Gln Asp Tyr Ala Gly Ser Thr Pro Leu Arg Leu Ala Ala His Val 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Asn Asp Tyr Phe Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Thr Thr Tyr 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 61 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 61 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Gln Asp Leu Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Gln Asp Tyr Ala Gly Ser Thr Pro Leu Arg Leu Ala Ala Trp Ala 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Asn Asp Tyr Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Asp Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Cys 165 <210> 62 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 62 Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 63 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 63 Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 64 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 64 Gly Ser Asp Leu Gly Xaa Lys Leu Leu Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 65 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 65 Gln Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 20 25

Claims (26)

1. 적어도 하나의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 상기 안키린 반복 도메인은 10^-7M이하의 Kd로 PBS 중 PDGF-BB에 결합하는 재조합 결합 단백질.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 10^-7M이하의 IC₅₀값으로 PBS 중 PDGFRbeta에 PDGF-BB의 결합을 억제하는 것인 결합 단백질.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 10^-7M이하의 IC₅₀값으로 3T3 섬유아세포의 PDGF-BB-자극된 세포증식을 억제하는 것인 결합 단백질
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 안키린 반복 도메인과 PDGF-BB에 결합하기 위해 경쟁하는 것인 결합 단백질.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 안키린 반복 도메인과 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고,
   상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 안키린 반복 도메인과 적어도 76% 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고,
   상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 안키린 반복 도메인과 프레임워크 위치에서 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고,
   상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되고,
   이 때, 상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 결실되고; 그리고,
   상기 안키린 반복 도메인의 두번째 마지막 위치에서 L 및/또는 마지막 위치에서 N은 선택적으로 A에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 23 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 안키린 반복 도메인으로서 동일한 에피토프에 부착되는 것인 결합 단백질.
   
10. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항 또는 제9항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19 및 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 안키린 반복 모듈을 포함하고, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19에서 9 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19 및 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 안키린 반복 모듈을 포함하고, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19에서 2 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19 및 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 안키린 반복 모듈을 포함하고, 서열번호:12, 14, 15, 17, 18 및 19의 프레임워크 위치에서 8 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되는 것인 결합 단백질.
    
13. 제10항에 있어서,
    상기 안키린 반복 모듈은 아미노산 서열 KDEEGTTPLHYAAVWGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:12) 및 서열들을 가지고, 이 때, 서열번호: 12에서 9 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되고, 여기서
    위치 3에서 E는 선택적으로 D, W, Q, I 및 Y 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 4에서 E는 선택적으로 T, D, Y, 및 S 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 6에서 T는 선택적으로 S 및 F 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 11에서 Y는 선택적으로 F에 의해 치환되고;
    위치 14에서 V는 선택적으로 A, Y 및 T 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;그리고
    위치 15에서 W는 선택적으로 F, K, V, 및 Y 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
14. 제13항에 있어서,
    상기 안키린 반복 모듈은 아미노산 서열 KDEEGTTPLHYAAVWGHLEIVEVLLKAGADVNA (서열번호:12) 및 서열들을 가지고, 이 때, 서열번호: 12의 프레임워크 위치에서 8 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되고, 여기서
    위치 3에서 E는 선택적으로 D, W, Q, I 및 Y 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 4에서 E는 선택적으로 T, D, Y, 및 S 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 6에서 T는 선택적으로 S 및 F 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 11에서 Y는 선택적으로 F에 의해 치환되고;
    위치 14에서 V는 선택적으로 A, Y 및 T 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;그리고
    위치 15에서 W는 선택적으로 F, K, V, 및 Y 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:13 및 16 및 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 가지는 캡핑 모듈을 포함하고, 여기서 서열번호:13 및 16에서 8 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
16. 제15항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은 서열번호:13 및 16 및 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 가지는 캡핑 모듈을 포함하고, 여기서 서열번호:13 및 16의 프레임워크 위치에서 7 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
17. 제15항에 있어서,
    상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 QDIYGATPADLAALVGHEDIAEVLQKLN (서열번호:13) 및 서열들을 가지는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 이 때, 서열번호: 13에서 9개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되고, 여기서
    위치 3에서 I는 선택적으로 K, L, A 및 V 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 4에서 Y는 선택적으로 W. F 및 S 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 6에서 A는 선택적으로 K에 의해 치환되고;
    위치 14에서 L은 선택적으로 F, Y 및 D 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 15에서 V는 선택적으로 L, I, A 및 N 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고; 그리고
    위치 23에서 V는 선택적으로 I 및 L로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
18. 제15항에 있어서,
    상기 PDGF-BB에 결합 특이성을 가지는 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 QDIYGATPADLAALVGHEDIAEVLQKLN (서열번호:13) 을 가지는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 이 때, 서열번호: 13의 프레임워크 위치에서 7개의 아미노산까지 임의의 아미노산에 의해 치환되고, 여기서
    위치 3에서 I는 선택적으로 K, L, A 및 V 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 4에서 Y는 선택적으로 W. F 및 S 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 6에서 A는 선택적으로 K에 의해 치환되고;
    위치 14에서 L은 선택적으로 F, Y 및 D 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고;
    위치 15에서 V는 선택적으로 L, I, A 및 N 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되고; 그리고
    위치 23에서 V는 선택적으로 I 및 L로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은 제13항의 안키린 반복 모듈 및 제17항의 C-말단 캡핑 모듈을 포함하는 결합 단백질.
    
20. 제19항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인은, 서열번호 13의 C-말단 캡핑 모듈이 직접적으로 이어서 따라오는 서열번호 12의 안키린 반복 모듈을 포함하는 결합 단백질.
    
21. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항 중 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안키린 반복 도메인의 안키린 반복 모듈의 하나 이상의 아미노산 잔기가 안키린 반복 유닛의 정렬 상에서 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산에 의해 치환되는 결합 단백질.
    
22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호:12 내지 19 및 23 내지 61 서열 중 임의의 하나의 펩타이드를 포함하는 결합 단백질.
    
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 코딩하는 핵산.
    
24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제23항의 핵산, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
    
25. 삼출성 연령-관련 황반 변성, 폴립모양의 맥락막 혈관 신생 및 병적 근시로부터 선택되는 상태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 결합 단백질의 약학적으로 유효한 양을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
    
26. 삼출성 연령-관련 황반 변성, 폴립모양의 맥락막 혈관 신생 및 병적 근시로부터 선택되는 상태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 PDGF-BB를 특이적으로 결하하는 안키린 반복 도메인 및 VEGF-A를 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 약학적으로 유효한 양을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

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