CN113621075A - SIRP-α变体构建体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含SIRP‑α多肽(包括SIRP‑α变体)的构建体的组合物和方法。该构建体可以通过多种方式工程化以对环境因子如pH、缺氧和/或肿瘤相关酶或肿瘤相关抗原的存在做出反应。本发明的构建体可以用于治疗各种疾病如癌症，优选实体肿瘤或血液癌症。

Description

SIRP-α变体构建体及其用途
本申请是申请日为2015年8月10和发明名称为“SIRP-α变体构建体及其用途”的201580029698.2号中国发明专利申请的分案申请。
交叉引用
本申请要求2014年8月08日提交的美国临时申请No.62/035,057的利益，该申请通过引用为所有目的全文并入本文中。
背景技术
信号调节蛋白(signal-regulatory protein)α(SIRP-α)是在髓系细胞的膜上广泛表达的蛋白质。SIRP-α与CD47(一种在身体内的许多细胞类型上广泛表达的蛋白质)相互作用。SIRP-α与CD47的相互作用防止可能被免疫系统另外地识别的“自身”细胞的吞噬。SIRP-α首先作为SHP-2(一种含SH-2结构域的酪氨酸磷酸酶)的结合剂被发现。CD47早期表征为卵巢癌细胞上过度表达的抗原。
在2000年，Oldenborg等证明在小鼠模型中施用CD47-缺陷红细胞(RBC)导致该RBC从系统中快速清除，表明CD47是一些“自身”细胞亚群上的“保护性”信号。随后，进一步研究了SIRP-α和癌症之间的潜在关联。据发现，肿瘤细胞上的高CD47表达在急性髓性白血病(AML)和几种实体肿瘤癌症中作为存活的负面预后因子发挥作用。聚焦于破坏CD47和SIRP-α之间的相互作用的策略(例如，施用屏蔽CD47或SIRP-α的药剂)已经作为潜在的抗癌疗法进行了研究。
但是，在考虑这些治疗策略时，所关心的问题是SIRP-α可以结合人体中许多不同细胞类型上的CD47。因此，存在着对SIRP-α进行工程化以优先结合仅患病细胞上的或患病部位处的细胞上的CD47。
发明内容
本发明特征在于信号调节蛋白α(SIRP-α)构建体，其是指包含与例如封闭肽、Fc域单体、HSA、白蛋白结合肽、聚合物、抗体结合肽、抗体连接的SIRP-α多肽的多肽。SIRP-α多肽可以是野生型SIRP-α或SIRP-α变体。SIRP-α变体构建体包括SIRP-α变体。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体在患病部位处具有优先活性(例如，在肿瘤部位相对于非患病部位具有优先活性)。在某些实施方式中，SIRP-α变体构建体对于患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的CD47具有较高结合亲和力。在一些实施方式中，与在生理条件下相比，SIRP-α变体在酸性pH(例如，低于约pH 7)下和/或在缺氧条件下以较高亲和力结合CD47。在一些实施方式中，SIRP-α变体包含用组氨酸残基或允许SIRP-α变体构建体在患病部位处优先结合的其它氨基酸置换的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体通过封闭肽防止与非患病部位的CD47结合。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体通过靶向部分(例如，针对肿瘤相关抗原或抗体结合肽的抗体)靶向于患病部位(例如，肿瘤)。本发明还特征在于包含SIRP-α变体构建体以治疗各种疾病如癌症(优选实体肿瘤癌症和血液癌症)的方法和药物组合物。
在一个方面，本发明特征在于信号调节蛋白α(SIRP-α)变体构建体，其中与非患病细胞上的CD47相比，该SIRP-α变体构建体优先结合患病细胞上或患病部位处的CD47。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体与其结合非患病细胞上的CD47相比以更高的亲和力结合患病细胞上或患病部位处的CD47。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括连接于封闭肽的SIRP-α变体。在一些实施方式中，封闭肽以比对于SIRP-α变体更高的亲和力结合野生型SIRP-α。在一些实施方式中，SIRP-α变体以比对于封闭肽更高的亲和力结合野生型CD47。
在一些实施方式中，封闭肽是基于CD47的封闭肽。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽包括与CD47的野生型IgSF结构域(SEQ ID NO:35)或其片段具有至少80％的氨基酸序列同一性的部分。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽具有SEQ ID NO:38或40的序列。
本文提供了包含本文所述的SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体，其中所述SIRP-α变体通过使用至少一个接头(例如，可切割接头)连接于本文所述的封闭肽。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以包含与野生型SIRP-α相同的CD47结合位点。在一些实施方式中，SIRP-α变体与野生型SIRP-α相比可以包含一个或多个突变或插入。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以是野生型SIRP-α的截短形式。在一些实施方式中，封闭肽可以是本文所述的CD47模拟物、变体或片段。在一些实施方式中，与SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体相比，封闭肽对于野生型SIRP-α可以表现出较高亲和力。在一些实施方式中，封闭肽可以是与野生型CD47相比对于SIRP-α变体显示出较低亲和力的CD47变体多肽。在一些实施方式中，SIRP-α变体和封闭肽之间的接头可以是任选地可通过一种或多种蛋白酶切割的至少一个接头。在一些实施方式中，接头任选地还包含一个或多个间隔体。
在一些实施方式中，SIRP-α变体经由可切割接头和任选地一个或多个间隔体连接于封闭肽。在一些实施方式中，可切割接头在酸性pH和/或缺氧条件下切割。在一些实施方式中，可切割接头通过肿瘤相关酶切割。在一些实施方式中，肿瘤相关酶是蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶选自蛋白裂解酶(MTSP1)、尿型纤溶酶原激活剂(uPA)、豆荚蛋白、PSA(也称为KLK3，激肽释放酶相关肽酶-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)和蛋白酶3(Pr3)。在一些实施方式中，蛋白酶是蛋白裂解酶。在一些实施方式中，可切割接头具有LSGRSDNH(SEQ ID NO:47)的序列或表7中所列的任何一个序列。在一些实施方式中，可切割接头包括以下序列(参见，例如，表7)之一或组合：PRFKIIGG、PRFRIIGG、SSRHRRALD、RKSSIIIRMRDVVL、SSSFDKGKYKKGDDA、SSSFDKGKYKRGDDA、IEGR、IDGR、GGSIDGR、PLGLWA、GPLGIAGI、GPEGLRVG、YGAGLGVV、AGLGVVER、AGLGISST、DVAQFVLT、VAQFVLTE、AQFVLTEG、PVQPIGPQ、L/S/G-/R-/S-/D/N/H、-/s/gs/Rk-/rv/-/-/-、SGR-SA、r/-/-/Rk-/v-/-/g/-、RQAR-VV、r/-/-/Rk/v/-/g、/Kr/RKQ/gAS/RK/A、-/-/-/N/-/-/-、AAN-L、ATN-L、si/sq/-/yqrs/s/-/-、S/S/K/L/Q、-/p/-/-/li/-/-/-、g/pa/-/gl/-/g/-、G/P/L/G/I/A/G/Q、P/V/G/L/I/G、H/P/V/G/L/L/A/R、-/-/-/viat-/-/-/-和-/y/y/vta-/-/-/-，其中“-“意思是任何氨基酸(即，任何天然存在的氨基酸)，大写字母表示对该氨基酸的强偏好，小写字母表示对该氨基酸的较低偏好，和“/”分隔在其中邻接于“/”的位置处超过一个氨基酸可能的情况的氨基酸位置。
在一些实施方式中，SIRP-α变体连接于抗体结合肽。在一些实施方式中，抗体结合肽可逆地或不可逆地结合抗体的恒定区。在一些实施方式中，抗体结合肽可逆地或不可逆地结合抗体的抗原结合片段(fragment antigen-binding)(Fab)区。在一些实施方式中，抗体结合肽可逆地或不可逆地结合抗体的可变区。在一些实施方式中，抗体是西妥昔单抗。在一些实施方式中，抗体结合肽与疾病定位肽(disease localization peptide)(DLP)的序列(CQFDLSTRRLKC(SEQ ID NO:64)或CQYNLSSRALKC(SEQ ID NO:65))或其片段具有至少75％的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，抗体结合肽具有SEQ ID NO:64的序列。
在一些实施方式中，SIRP-α变体连接于Fc域单体。在一些实施方式中，SIRP-α变体连接于人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方式中，HSA相对于SEQ ID NO:67包括氨基酸置换C34S和/或K573P。在一些实施方式中，HSA具有以下序列：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO:68)。
在一些实施方式中，SIRP-α变体连接于白蛋白结合肽。在一些实施方式中，白蛋白结合肽具有SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方式中，SIRP-α变体连接于聚合物，其中聚合物是聚乙二醇(PEG)链或聚唾液酸链。
在一些实施方式中，SIRP-α变体连接于抗体。在一些实施方式中，抗体是肿瘤特异性抗体。在一些实施方式中，抗体(例如，肿瘤特异性抗体)选自西妥昔单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab、MEDI0680、MEDI6469、Ipilimumab(伊匹单抗)、tremelimumab(替西木单抗)、urelumab、vantictumab、varlilumab、mogamalizumab、抗-CD20抗体、抗-CD19抗体、抗-CS1抗体、赫塞汀、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。在一些实施方式中，抗体(例如，肿瘤特异性抗体)可以结合以下一种或多种：5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、纤连蛋白、FR-α、GCC、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GPNMB、HER-2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、间皮素、MUC16、MUC1、NaPi2b、结合素-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R和/或MSB0010718C。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与SEQ ID NO:3-12和24-34任一的序列具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:13)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:16)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:17)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:18)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:21)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:14)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:15)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRGKPS(SEQ ID NO:19)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:22)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:20)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有以下序列：EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS(SEQ IDNO:23)，其中X1是E或G，X2是L、I或V，X3是V、L或I，X4是S或F，X5是L或S，X6是S或T，X7是A或V，X8是I或T，X9是H或R，X10是A、V、I或L，X11是I、T、S或F，X12是A或G，X13是E、V或L，X14是K或R，X15是E或Q，X16是H、P或R，X17是D或E，X18是S、L、T或G，X19是K或R，X20是E或N，X21是S或P，X22是S或R，X23是S或G，X24是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X25是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X26是V或I，X27是F、L、V，X28是D或不存在，X29是T或V，X30是F或V，和X31是A或G。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与SEQ ID NO:13-23任一的序列具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体不包括SEQ ID NO:3-12和24-34任一的序列。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体包括用组氨酸残基置换的一个或多个氨基酸残基的置换。在一些实施方式中，用组氨酸残基置换的一个或多个氨基酸残基的置换相对于SEQ ID NO:3-12任一的序列位于一个或多个以下氨基酸位置处：29、30、31、32、33、34、35、52、53、54、66、67、68、69、74、93、96、97、98、100、4、6、27、36、39、47、48、49、50、57、60、72、74、76、92、94、103。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体相对于非患病细胞的CD47以至少两倍、至少四倍或至少六倍高的亲和力结合患病细胞上或患病部位处的CD47。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体相对于中性pH在酸性pH下以至少两倍、至少四倍或至少六倍高的亲和力结合CD47。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体相对于生理条件在缺氧条件下以至少两倍、至少四倍或至少六倍高的亲和力结合CD47。
在一些实施方式中，患病细胞是癌症疾病的癌细胞。
在一些实施方式中，酸性pH是约4-约7之间的pH。
在另一个方面，本发明特征在于包含编码本文所述的SIRP-α变体构建体的核酸分子。
在另一个方面，本发明特征在于包含编码本文所述的SIRP-α变体构建体的核酸分子的载体。
在另一个方面，本发明特征在于表达本文所述的SIRP-α变体构建体的宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码本文所述的SIRP-α变体构建体的核酸分子或包括该核酸分子的载体，其中该核酸分子或载体在宿主细胞中表达。
在另一个方面，本发明特征在于制备本文所述的SIRP-α变体构建体的方法，其中该方法包括：a)提供包含编码本文所述的SIRP-α变体构建体的核酸分子或包括该核酸分子的载体的宿主细胞；b)在允许形成SIRP-α变体构建体的条件下在宿主细胞中表达该核酸分子或载体；和c)回收SIRP-α变体构建体。
在另一个方面，本发明特征在于包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂.
在另一个方面，本发明特征在于提高受试者中靶细胞的吞噬的方法，包括向受试者施用本文所述的SIRP-α变体构建体或包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。
在另一个方面，本发明特征在于消除受试者中的调节性T细胞的方法，包括向受试者施用本文所述的SIRP-α变体构建体或包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物。
在另一个方面，本发明特征在于杀死癌细胞的方法，所述方法包括将癌细胞与本文所述的SIRP-α变体构建体或包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物接触。
在另一个方面，本发明特征在于治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体或包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物。
在另一个方面，本发明特征在于治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括：(a)测定受试者的SIRP-α的氨基酸序列；和(b)向受试者施用治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体；其中SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有与受试者的SIRP-α相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明特征在于治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括：(a)测定受试者的SIRP-α的氨基酸序列；和(b)向受试者施用治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体；其中SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体在受试者中具有最低的免疫原性。
在另一个方面，本发明特征在于治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用本文所述的SIRP-α变体构建体，其中SIRP-α变体构建体相对于非患病细胞上的CD47优先结合患病细胞上或患病部位处的CD47。
在一些实施方式中，所述疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症选自实体肿瘤癌症、血液癌症、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、支气管癌、肝癌、卵巢癌、结肠和直肠癌、胃癌、胃部的癌、胆囊癌、胃肠道基质肿瘤癌、甲状腺癌、头颈癌、口咽癌、食管癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、Merkel细胞癌、病毒诱导的癌症、成神经细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤和癌瘤(carcinoma)。在一些实施方式中，癌症是实体肿瘤癌症。在一些实施方式中，癌症是血液癌症。
在一些实施方式中，所述疾病是免疫性疾病。在一些实施方式中，免疫性疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病。在一些实施方式中，自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化、类风湿性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎症或自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、脓毒症、糖尿病、银屑病、动脉粥样硬化、舍格伦综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、子宫内膜异位、肾小球性肾炎、重症肌无力、特发性肺纤维化、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脉管炎或炎症性自身免疫性肌炎。
在另一个方面，本发明特征在于增加受试者中的造血干细胞植入的方法，包括通过向受试者施用本文所述的SIRP-α变体或包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体的药物组合物来调节受试者中SIRP-α和CD47之间的相互作用。
在另一个方面，本发明特征在于改变受试者中的免疫反应的方法，包括向受试者施用本文所述的SIRP-α变体构建体包含治疗有效量的本文所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物，从而改变受试者中的免疫反应。
在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，优选所述哺乳动物是人。
定义
如本文中所用的，术语“患病细胞”和“患病组织”是指，例如，癌细胞和组织。特别地，癌症可以是实体肿瘤癌症或血液癌症。例如，如果癌症是实体肿瘤癌症，患病细胞是实体肿瘤的细胞。患病细胞通常在患病部位特有的条件(例如，酸性pH和缺氧)下存活。“患病细胞”和“患病组织”也可以与其它疾病(包括，但不限于癌症)相关。“患病细胞”和“患病组织”也可以与免疫性疾病或障碍、心血管疾病或障碍、代谢疾病或障碍或者增殖性疾病或障碍相关。免疫性障碍包括炎症性疾病或障碍和自身免疫性疾病或障碍。
如本文中所用的，术语“非患病细胞”是指身体的正常、健康细胞。非患病细胞通常在维持细胞的正常代谢和调控功能的生理条件(例如中性pH和足够的氧浓度)下生存。
如本文中所用的，术语“患病部位”是指身体中靠近疾病位置的位置或区域。例如，如果疾病是位于肝中的实体肿瘤癌症，则患病部位是肝中的肿瘤部位和接近于肝中肿瘤的区域。患病部位的细胞可以包括患病细胞以及支持患病部位处的疾病的细胞。例如，如果患病部位是肿瘤部位，肿瘤部位处的细胞包括患病细胞(例如，肿瘤细胞)和支持肿瘤部位处的肿瘤生长的细胞两者。类似地，术语“癌症部位”是指身体中的癌症位置。
如本文中所用的，术语“SIRP-αD1结构域”或“D1结构域”是指SIRP-α的膜远端的细胞外结构域。SIRP-αD1结构域位于全长野生型SIRP-α的N-末端并介导与CD47的结合。D1结构域的氨基酸序列显示于表1中。
如本文中所用的，术语“SIRP-αD2结构域”或“D2结构域”是指SIRP-α的第二细胞外结构域。SIRP-αD2结构域包括全长野生型SIRP-α的大致氨基酸119-220。
如本文中所用的，术语“SIRP-αD3结构域”或“D3结构域”是指SIRP-α的第三细胞外结构域。SIRP-αD3结构域包括全长野生型SIRP-α的大致氨基酸221-320。
如本文中所用的，术语“SIRP-α多肽”是指野生型SIRP-α以及SIRP-α变体，如各术语在本文中定义和描述的。
如本文中所用的，术语“SIRP-α变体”是指包含全长SIRP-α的SIRP-αD1结构域或CD47-结合部分的多肽。在一些实施方式中，SIRP-α变体与SEQ ID NO:3-12和24-34任一的序列具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施方式中，SIRP-α变体与野生型SIRP-α相比具有对于CD47的更高亲和力。在一些实施方式中，SIRP-α变体包含野生型人SIRP-α的一部分(优选野生型SIRP-α的CD47-结合部分)和/或具有一个或多个氨基酸置换。例如，SIRP-α变体相对于野生型SIRP-α可以包含一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)氨基酸残基的置换。例如，SIRP-α变体包含的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)氨基酸残基可以被组氨酸残基置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体的一部分与野生型人SIRP-α或本文所述的任一SIRP-α变体的序列(例如，与野生型人SIRP-α的CD47-结合部分的序列)具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列同一性。野生型SIRP-α的CD47-结合部分包括野生型SIRP-α的D1结构域(SEQ ID NO:3-12任一的序列)。
如本文中所用的，术语“SIRP-α变体构建体”是指包含连接于，例如，封闭肽、Fc域单体、HSA、白蛋白结合肽、聚合物、抗体结合肽、抗体的SIRP-α多肽的多肽。SIRP-α可以是野生型SIRP-α或SIRP-α变体。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体在患病部位处具有优先活性。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体在患病部位处具有优先活性且包括其一部分与野生型人SIRP-α或本文所述的任一SIRP-α变体的序列(例如，与野生型人SIRP-α的CD47-结合部分的序列)具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性的SIRP-α变体。
如本文中所用的，术语“百分(％)同一性”是指，在序列对准并引入空位(如果必要)以获得最大百分同一性(即，空位可以引入候选序列和参考序列之一或两者中以获得最佳比对且非同源序列可以放弃用于比较目的)后，候选序列(例如，SIRP-α变体)中与参考序列(例如，野生型人SIRP-α或其CD47-结合部分)的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。用于确定百分同一性的目的的比对可以以本领域技能内的各种方式实现，例如，使用公众可得的计算机软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适宜参数，包括在比较的序列全长上获得最大比对需要的任何算法。在一些实施方式中，给定候选序列与、对于或针对给定参考序列的百分氨基酸(或核酸)序列同一性(其可选地可以表述为具有或包括与、对于或针对给定参考序列的特定百分氨基酸(或核酸)序列同一性的给定候选序列)计算如下：
100x(A/B的分数)
其中A是在候选序列和参考序列的比对中评分为相同的氨基酸(或核酸)残基的数目，且其中B是参考序列中氨基酸(或核酸)残基的总数。在其中候选序列的长度不等于参考序列的长度的一些实施方式中，候选序列对于参考序列的百分氨基酸(或核酸)序列同一性不等于参考序列对于候选序列的百分氨基酸(或核酸)序列同一性。
在特定的实施方式中，用于与候选序列比较而比对的参考序列可以显示，候选序列在候选序列的全长或候选序列的选择部分的连续氨基酸(或核酸)残基上表现出50％-100％的同一性。用于比较目的而比对的候选序列的长度是参考序列长度的至少30％，例如，至少40％，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。当候选序列中的位置被参考序列中相应位置相同的氨基酸(或核酸)残基占据时，则分子在该位置处相同。
如本文中所用的，术语“肿瘤相关蛋白酶”或“肿瘤酶”是指以提高的水平存在于癌症(例如，实体肿瘤癌症)中的酶，例如，蛋白酶。在一些实施方式中，肿瘤相关蛋白酶可以切割可切割接头。
如本文中所用的，术语“封闭肽”是指可以结合SIRP-α变体并阻断或“屏蔽”SIRP-α变体的CD47-结合部分的肽。在SIRP-α变体构建体中，封闭肽可以通过任选可切割的接头和任选地一个或多个间隔体连接于SIRP-α变体。封闭肽可以经由非共价键与SIRP-α变体偶联和在患病部位或患病细胞处被切割。在一些实施方式中，封闭肽可以结合患病部位或患病细胞处的野生型SIRP-α。封闭肽可以用于在正常生理条件下或在非患病部位处减少或最小化SIRP-α变体与野生型CD47的结合。在一些实施方式中，封闭肽对于野生型SIRP-α具有比对于SIRP-α变体更高的结合亲和力。封闭肽可以在例如，患病部位处或在非生理条件下与SIRP-α变体解离以结合于野生型SIRP-α。封闭肽的实例是基于CD47的封闭肽，其是源自CD47或其片段的肽。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽是CD47的细胞外SIRP-α结合部分(即，CD47的IgSF结构域)。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽相对于野生型CD47包括一个或多个氨基酸置换、添加和/或删除。
如本文中所用的，术语“可切割接头”是指SIRP-α变体构建体的两个部分之间的接头。在一些实施方式中，可切割接头可以将封闭肽共价连接于SIRP-α变体以在生理条件下阻断SIRP-α变体与CD47的结合。在一些实施方式中，可切割接头可以安装在封闭肽内，该封闭肽可以与SIRP-α变体非共价缔合以在生理条件下阻断SIRP-α变体与CD47的结合。可切割接头可以在某些条件下切割。如果可切割接头在封闭肽内，接头的切割将灭活封闭肽。可切割接头包含在患病部位如癌症部位(例如，在实体肿瘤内)特有的条件下起到切割接头或诱导接头的切割的作用的部分。可切割接头在健康的生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下是稳定的。该部分可以是能够在酸性pH.下水解的pH-敏感的化学官能团(例如，缩醛、缩酮、硫代马来酰胺酸酯(thiomaleamates)、腙类、二硫键)。该部分也可以是能够在缺氧条件下还原的缺氧-敏感的化学官能团(例如，醌类、N-氧化物和杂芳族硝基基团)或氨基酸。可切割接头中的部分也可以是能够被肿瘤相关蛋白酶、酶或肽酶识别和切割的蛋白质底物。
如本文中所用的，术语“间隔体”是指SIRP-α变体构建体的两个部分(如接头(例如，可切割接头)和SIRP-α变体或者抗体结合肽和SIRP-α变体)之间的共价或非共价连接。优选地，间隔体是共价连接。间隔体可以是简单化学键(例如，酰胺键)或氨基酸序列(例如，3-200个氨基酸的序列)。氨基酸间隔体是多肽一级序列的部分(例如，通过多肽骨架与间隔的多肽或多肽结构域接合)。间隔体提供两个部分之间的间隔和/或灵活性。间隔体在生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下以及在患病部位特有的条件(例如，酸性pH和缺氧)下是稳定的。间隔体在患病部位如癌症部位处，例如，在肿瘤内，是稳定的。间隔体的描述进一步详细提供在本文中。
如本文中所用的，术语“抗体”是指完整抗体、抗体片段(条件是它们表现出所需的生物活性)、单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体和由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。优选地，抗体对于患病细胞(例如，肿瘤细胞)是特异性的。例如，抗体可以特异性地结合患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白。
如本文中所用的，术语“白蛋白结合肽”是指12-16个氨基酸的氨基酸序列，其具有对于血清白蛋白的亲和力并发挥结合血清白蛋白的功能。白蛋白结合肽可以具有不同来源，例如，人、小鼠或大鼠。在本发明的一些实施方式中，SIRP-α变体构建体可以包括与SIRP-α变体的C-末端融合的白蛋白结合肽以增加SIRP-α变体的血清半衰期。白蛋白结合肽可以直接地或通过间隔体与SIRP-α变体融合。
如本文中所用的，术语“人血清白蛋白(HSA)”是指人血浆中存在的白蛋白。人血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白质。其占到血清蛋白质的大约一半。在一些实施方式中，人血清白蛋白具有UniProt ID NO:P02768的氨基酸25-609的序列(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，人血清白蛋白相对于SEQ ID NO:67的序列进一步包含C34S。
如本文中所用的，术语“Fc域单体”是指包括第二和第三抗体恒定域(CH2和CH3)的多肽链。在一些实施方式中，Fc域单体还包括铰链结构域。Fc域单体可以是任何免疫球蛋白抗体同种型，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。另外，Fc域单体可以是IgG亚型的(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。Fc域单体不包括免疫球蛋白的能够作为抗原识别区(例如，可变域或互补决定区(CDR))发挥作用的任何部分。Fc域单体可以包括相对于野生型Fc域单体序列的多达十个变化(例如，1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸置换、添加或删除)，其改变Fc域和Fc受体之间的相互作用。合适的变化的实例是本领域已知的。
如本文中所用的，术语“Fc域”是指两个Fc域单体的二聚体。在野生型Fc域中，两个Fc域单体通过两个CH3抗体恒定域之间的相互作用以及在两个二聚化的Fc域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键二聚化。在一些实施方式中，Fc域可以突变以缺失效应子功能，这是“死亡Fc域”典型的。在某些实施方式中，Fc域中的各Fc域单体包括CH2抗体恒定域中的氨基酸置换以减少Fc域和Fcγ受体之间的相互作用或结合。
如本文中所用的，术语“亲和力”或“结合亲和力”是指两个分子之间的结合相互作用的强度。一般地，结合亲和力是指分子与其结合伴体(如SIRP-α变体和CD47)之间非共价相互作用的总和。除非另外说明，结合亲和力是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员之间的1:1相互作用。两个分子之间的结合亲和力一般通过解离常数(KD)或亲和常数(KA)描述。彼此具有低的结合亲和力的两个分子一般缓慢结合、倾向于容易解离和表现出大的KD。彼此具有高亲和力的两个分子一般容易结合，倾向于保持较长时间结合和表现出小的KD。两个相互作用分子的KD可以使用本领域公知的方法的技术测定，例如，表面等离子体共振。KD计算为koff/kon的比率。
如本文中所用的，术语“宿主细胞”是指包括从相应的核酸表达蛋白质所需的必要细胞组分(例如，细胞器)的媒介物。核酸通常包括在可以通过本领域已知的常规技术(例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接注射等)引入宿主细胞中的核酸载体中。宿主细胞可以是原核细胞，例如，细菌细胞，或真核细胞，例如，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。如本文所述的，宿主细胞用于表达一种或多种SIRP-α变体构建体。
如本文中所用的，术语“药物组合物”是指包含活性成分以及使得活性成分能够适合于施用方法的赋形剂和稀释剂的药用或药物制剂。本发明的药物组合物包括与SIRP-α变体构建体相容的药学上可接受的成分。药物组合物可以为用于口服施用的片剂或胶囊形式或者用于静脉内或皮下施用的水性形式。
如本文中所用的，术语“与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病”是指由SIRP-α和/或CD47活性引起和/或与SIRP-α和/或CD47活性相关的任何疾病或障碍，例如，由SIRP-α和/或CD47活性的提高或降低引起和/或与SIRP-α和/或CD47活性的提高或降低相关的任何疾病或障碍。与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的实例包括，但不限于癌症和免疫性疾病(例如，自身免疫性疾病和炎症性疾病)。
如本文中所用的，术语“治疗有效量”是指本发明的SIRP-α变体构建体或包含本发明的SIRP-α变体构建体的药物组合物在患有如癌症(例如，实体肿瘤或血液癌症)的疾病的患者中有效地实现所需治疗效果的量。特别地，SIRP-α变体构建体的治疗有效量避免不良副作用。
如本文中所用的，术语“优化的亲和力”或“优化的结合亲和力”是指优化的SIRP-α变体和CD47之间结合相互作用的强度。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体主要地或以较高亲和力与患病部位的细胞(即，癌细胞)上的CD47结合且不显著结合或以较低亲和力结合非患病部位的细胞(即，非癌细胞)上的CD47。SIRP-α变体和CD47之间的结合亲和力经优化以使得该相互作用不引起临床相关的毒性。在一些实施方式中，为了获得SIRP-α变体和CD47之间优化的结合亲和力，SIRP-α变体可以开发为对于CD47具有比可获得的最大结合亲和力低的结合亲和力。
如本文中所用的，术语“免疫原性”是指蛋白质(例如，治疗性蛋白质)在宿主体内如作为外源抗原一样引起免疫反应的性质。蛋白质的免疫原性可以在体外通过多种不同方式测定，特别是通过体外T-细胞增殖分析(参见，例如，Jawa等,Clinical Immunology 149:534-555,2013)，其中一些是商购可得的(参见，例如，由Proimmune提供的免疫原性分析服务)。
如本文中所用的，术语“最低免疫原性”是指已经进行修饰(即，通过氨基酸置换)以使其免疫原性与引入氨基酸置换之前可能具有的免疫原性相比降低(例如，低至少10％、25％、50％或100％)的蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的免疫原性。蛋白质(例如，治疗性蛋白质)进行修饰以具有最低免疫原性意味着它不引起或引起非常少的宿主免疫反应，即便它是外源抗原。
如本文中所用的，术语“优化的药代动力学”是指一般与蛋白质的药代动力学相关的参数被改善或改变以产生用于体外和/或体内应用的优化的蛋白质。与蛋白质的药代动力学相关的参数是本领域技术人员熟知的，包括例如KD、效价和半衰期。在本发明中，本发明的SIRP-α变体构建体的药代动力学针对其与CD47的相互作用进行优化以用于治疗环境中。
具体地，本发明涉及以下各项：
1.一种包含SIRP-α多肽的构建体，其中与来自非患病细胞的或非患病部位的CD47相比，所述构建体优先结合患病细胞上或患病部位处的CD47。
2.第1项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽是野生型SIRP-α或SIRP-α变体。
3.第1项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽通过至少一个接头连接于封闭肽。
4.第3项所述的构建体，其中与SIRP-α变体相比，所述封闭肽以较高亲和力结合于野生型SIRP-α。
5.第4项所述的构建体，其中与所述封闭肽相比，所述SIRP-α多肽以较高亲和力结合于野生型CD47。
6.第3项所述的构建体，其中所述封闭肽是基于CD47的封闭肽。
7.第6项所述的构建体，其中所述基于CD47的封闭肽与CD47的野生型IgSF结构域(SEQ ID NO:35)或其片段具有至少80％的氨基酸序列同一性。
8.第7项所述的构建体，其中所述基于CD47的封闭肽具有SEQ ID NO:38或40的序列。
9.第3项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽经由可切割接头和任选地一个或多个间隔体与封闭肽连接。
10.第9项所述的构建体，其中所述可切割接头在酸性pH和/或缺氧条件下切割。
11.第9项所述的构建体，其中所述可切割接头通过肿瘤相关酶切割。
12.第11项所述的构建体，其中所述肿瘤相关酶是蛋白酶。
13.第12项所述的构建体，其中所述蛋白酶选自蛋白裂解酶(MTSP1)、尿型纤溶酶原激活剂(uPA)、豆荚蛋白、PSA(也称为KLK3，激肽释放酶相关肽酶-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP9、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)和蛋白酶3(Pr3)。
14.第13项所述的构建体，其中所述蛋白酶是蛋白裂解酶。
15.第9项所述的构建体，其中所述可切割接头具有LSGRSDNH(SEQ ID NO:47)的序列或表7中所列的任何序列。
16.第1-15项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α变体连接于抗体结合肽。
17.第16项所述的构建体，其中所述抗体结合肽可逆地或不可逆地结合抗体的恒定区。
18.第16项所述的构建体，其中所述抗体结合肽可逆地或不可逆地结合抗体的抗原结合片段(Fab)区。
19.第16项所述的构建体，其中所述抗体结合肽可逆地或不可逆地结合抗体的可变区。
20.第16项所述的构建体，其中所述抗体是西妥昔单抗。
21.第16项所述的构建体，其中所述抗体结合肽与疾病定位肽(DLP)(SEQ ID NO:64或65)或其片段的序列具有至少75％的氨基酸序列同一性。
22.第21项所述的构建体，其中所述抗体结合肽具有SEQ ID NO:64的序列。
23.第1-22项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α变体连接于Fc域单体。
24.第1-22项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α变体连接于人血清白蛋白(HSA)。
25.第24项所述的构建体，其中所述HSA相对于以下的序列包含氨基酸置换C34S和/或K573P：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO:67)。
26.第25项所述的构建体，其中所述HSA具有以下序列：DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO:68)。
27.第1-22项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α变体连接于白蛋白结合肽。
28.第27项所述的构建体，其中所述白蛋白结合肽具有SEQ ID NO:64的序列。
29.第1-22项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α变体连接于聚合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)链或聚唾液酸链。
30.第1-22项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α变体连接于抗体。
31.第30项所述的构建体，其中所述抗体任选地是肿瘤特异性抗体和/或所述抗体任选地选自西妥昔单抗、派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab、MEDI0680、MEDI6469、伊匹单抗、替西木单抗、urelumab、vantictumab、varlilumab、mogamalizumab、抗-CD20抗体、抗-CD19抗体、抗-CS1抗体、赫塞汀、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
32.第30项所述的构建体，其中所述抗体结合以下一种或多种：5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、纤连蛋白、FR-α、GCC、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GPNMB、HER-2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF-1R、IL-3R、LIV-1、间皮素、MUC16、MUC1、NaPi2b、结合素-4、Notch2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1、CSF-1R和/或MSB0010718C。
33.第1-32项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽与SEQ ID NO:3-12和24-34中任一项的序列具有至少80％的序列同一性。
34.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:13),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
35.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:16),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
36.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:17),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
37.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:18),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
38.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:21),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
39.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:14),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
40.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:15),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
41.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRGKPS(SEQ ID NO:19),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
42.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:22),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是V、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
43.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:20),
其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是S、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V。
44.第1-33项任一项所述的构建体，其中所述SIRP-α多肽具有以下序列：
EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS(SEQ ID NO:23),
其中X1是E或G，X2是L、I或V，X3是V、L或I，X4是S或F，X5是L或S，X6是S或T，X7是A或V，X8是I或T，X9是H或R，X10是A、V、I或L，X11是I、T、S或F，X12是A或G，X13是E、V或L，X14是K或R，X15是E或Q，X16是H、P或R，X17是D或E，X18是S、L、T或G，X19是K或R，X20是E或N，X21是S或P，X22是S或R，X23是S或G，X24是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X25是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X26是V或I，X27是F、L、V，X28是D或不存在，X29是T或V，X30是F或V，和X31是A或G。
45.第1-33项任一项所述的SIRP-α变体构建体，其中所述SIRP-α变体包含用组氨酸残基置换的一个或多个氨基酸残基置换。
46.第45项所述的SIRP-α变体构建体，其中所述用组氨酸残基置换的一个或多个氨基酸残基置换相对于SEQ ID NO:3-12任一的序列位于一个或多个以下氨基酸位置处：29、30、31、32、33、34、35、52、53、54、66、67、68、69、74、93、96、97、98、100、4、6、27、36、39、47、48、49、50、57、60、72、74、76、92、94、103。
47.第1-46项任一项所述的SIRP-α变体构建体，其中与非患病细胞上的CD47相比，所述SIRP-α变体构建体以至少两倍、至少四倍或至少六倍高的亲和力结合患病细胞上或患病部位处的CD47。
48.第1-47项任一项所述的SIRP-α变体构建体，其中与在中性pH下相比，所述SIRP-α变体构建体在酸性pH下以至少两倍、至少四倍或至少六倍高的亲和力结合CD47。
49.第1-47项任一项所述的SIRP-α变体构建体，其中与在生理条件下相比，所述SIRP-α变体构建体在缺氧条件下以至少两倍、至少四倍或至少六倍高的亲和力结合CD47。
50.第1、2或47项所述的SIRP-α变体构建体，其中所述患病细胞是癌症疾病的癌细胞。
51.第10或48项所述的SIRP-α变体构建体，其中所述酸性pH是在约4和约7之间的pH。
52.一种编码第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体的核酸分子。
53.一种包含第52项所述的核酸分子的载体。
54.一种表达第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含第52项所述的核酸分子或第53项所述的载体，其中所述核酸分子或载体在所述宿主细胞中表达。
55.一种制备第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体的方法，其中所述方法包括：
a)提供包含第52项所述的核酸分子或第53项所述的载体的宿主细胞；
b)在允许形成所述SIRP-α变体构建体的条件下在所述宿主细胞中表达所述核酸分子或载体；和
c)回收所述SIRP-α变体构建体。
56.一种包含治疗有效量的第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体的药物组合物。
57.第56项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
58.一种提高受试者中靶细胞的吞噬的方法，包括向所述受试者施用第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体或者第56或57项所述的药物组合物。
59.第58项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
60.一种消除受试者中的调节性T细胞的方法，包括向所述受试者施用第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体或者第56或57项所述的药物组合物。
61.一种杀死癌细胞的方法，所述方法包括将所述癌细胞与第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体或者第56或57项所述的药物组合物接触。
62.一种治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体或者第56或57项所述的药物组合物。
63.一种治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括：
(a)测定所述受试者的SIRP-α的氨基酸序列；和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体；
其中所述SIRP-α变体构建体中的所述SIRP-α变体具有与所述受试者的SIRP-α相同的氨基酸序列。
64.一种治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括：
(a)测定所述受试者的SIRP-α的氨基酸序列；和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体；
其中所述SIRP-α变体构建体中的所述SIRP-α变体在所述受试者中具有最低的免疫原性。
65.一种治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体，其中所述SIRP-α变体构建体相对于非患病细胞上的CD47优先结合患病细胞上或患病部位处的CD47。
66.第62-65项任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
67.第66项所述的方法，其中所述癌症选自实体肿瘤癌症、血液癌症、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、支气管癌、肝癌、卵巢癌、结肠和直肠癌、胃癌、胃部的癌、胆囊癌、胃肠道基质肿瘤癌、甲状腺癌、头颈癌、口咽癌、食管癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、Merkel细胞癌、病毒诱导的癌症、成神经细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤和癌瘤。
68.第67项所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤癌症。
69.第67项所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。
70.第62-65项任一项所述的方法，其中所述疾病是免疫性疾病。
71.第70项所述的方法，其中所述免疫性疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病。
72.第71项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化、类风湿性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎症或自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、脓毒症、糖尿病、银屑病、动脉粥样硬化、舍格伦综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、子宫内膜异位、肾小球性肾炎、重症肌无力、特发性肺纤维化、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脉管炎或炎症性自身免疫性肌炎。
73.一种增加受试者中的造血干细胞植入的方法，包括通过向所述受试者施用第1-51项任一项所述的SIRP-α变体或者第56或57项所述的药物组合物来调节所述受试者中SIRP-α和CD47之间的相互作用。
74.一种改变受试者中的免疫反应的方法，包括向所述受试者施用第1-51项任一项所述的SIRP-α变体构建体或者第56或57项所述的药物组合物，从而改变所述受试者中的免疫反应。
75.第74项所述的方法，其中改变所述免疫反应包括抑制所述免疫反应。
76.第58-75项任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，优选所述哺乳动物是人。
附图说明
图1显示CD47:SIRP-α的共结晶结构(PDB:4KJY,4CMM)的一部分，CD47的N-末端作为焦谷氨酸存在并与SIRP-α变体的Thr66或野生型SIRP-α的Leu66形成氢键相互作用。
图2显示具有T102Q的CD47与具有A27的野生型SIRP-α之间的相互作用位点(左)和具有T102Q的CD47与具有I27的SIRP-α变体之间的相互作用位点的计算模型。
图3显示SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:48-56)的SDS-PAGE。
图4A显示用uPA和蛋白裂解酶体外切割后SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:54)的SDS-PAGE。
图4B显示用不同量的蛋白裂解酶体外切割后SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:54)的SDS-PAGE。
图4C显示用蛋白裂解酶体外切割后各种SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:57-63)的SDS-PAGE。
图5A显示证明在用蛋白裂解酶体外切割之前和之后各种SIRP-α变体构建体(SEQID NO:48-55)与CD47的不同结合亲和力的柱状图。
图5B显示证明在用蛋白裂解酶体外切割之前和之后各种SIRP-α变体构建体(SEQID NO:52-63)和SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)与CD47的不同结合亲和力的柱状图。
图6显示证明SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)可以同时结合西妥昔单抗和CD47的传感图。
图7A显示包含EGFR、西妥昔单抗、SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)和CD47的四元复合物的示意图。
图7B显示证明图7A中所示的四元复合物的形成的传感图。
图7C是图7B中所示的传感图的图像。
图8是显示由SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)和SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)诱导的吞噬的散点图。
具体实施方式
本发明特征在于在患病部位具有优先活性(例如，肿瘤部位相对于非患病部位)的信号调节蛋白α(SIRP-α)多肽构建体，包括SIRP-α变体构建体。在某些实施方式中，SIRP-α变体构建体对于患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的CD47具有更高的结合亲和力。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以包含一个或多个氨基酸置换。在一些实施方式中，氨基酸可以用组氨酸残基置换。在一些实施方式中，氨基酸可以用其它非组氨酸氨基酸残基置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体对于患病细胞上或患病部位处的CD47(相对于非患病细胞上的CD47)且在患病部位如癌症部位(例如，在肿瘤部位或在肿瘤内)特有的条件下具有更高的亲和力。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体在酸性pH(例如，低于约pH 7)和/或在缺氧条件对于CD47具有比在生理条件下更高的亲和力。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括SIRP-α变体和封闭肽；SIRP-α变体通过封闭肽防止与CD47结合，除非在患病部位特有的条件下。在一些实施方式中，SIRP-α变体与Fc域单体、人血清白蛋白(HSA)、白蛋白结合肽或聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)融合。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体的免疫原性、亲和力和/或药代动力学对于在治疗环境中使用进行优化。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体借助于靶向部分例如，靶标特异性抗体，优先靶向于患病部位，例如，肿瘤。本发明特征在于治疗各种疾病如癌症(优选实体肿瘤或血液癌症)的包含SIRP-α变体构建体的方法和药物组合物，以及杀死癌细胞的方法和制备SIRP-α变体构建体和包含这样的SIRP-α变体构建体的药物组合物的方法。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括连接于封闭肽的SIRP-α变体。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与患病细胞上或患病部位处的CD47的优先结合可以通过使用可切割接头(其在患病细胞或患病部位处切割)将封闭肽连接于SIRP-α变体而获得。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与患病细胞或患病部位上的CD47的优先结合可以通过将封闭肽连接于SIRP-α变体而获得，其中封闭肽可以在患病细胞或患病部位处与SIRP-α变体脱离或简单地解离。
I.SIRP-α变体
存在野生型人SIRP-α的至少十个天然变体。十个野生型人SIRP-α变体的D1结构域的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:3-12中(参见表1)。在一些实施方式中，SIRP-α变体与SEQID NO:3-12任一的序列具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。表2列出了各D1结构域变体(SEQ ID NO:13-23)中可能的氨基酸置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体以优化的结合亲和力结合CD47。在一些实施方式中，包括SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体主要地或以较高亲和力结合癌细胞上的CD47且基本上不结合或者以较低亲和力结合非癌细胞上的CD47。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体和CD47之间的结合亲和力被优化以使得该相互作用不导致临床相关的毒性。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体具有最低免疫原性。在一些实施方式中，SIRP-α变体具有与受试者的生物样品中的SIRP-α多肽相同的氨基酸，除了被引入以提高SIRP-α变体的亲和力的氨基酸变化。用于生成SIRP-α变体和测定其对CD47的结合亲和力的技术和方法在本文中更详细地描述。
表2列出了SIRP-α变体中相对于各D1结构域变体序列的特定氨基酸置换。SIRP-α变体可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个)表2中列出的置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体相对于野生型D1结构域包括至多十个氨基酸置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体相对于野生型D1结构域包括至多七个氨基酸置换。
在一些实施方式中，SIRP-α变体是包括两个或更多个野生型D1结构域变体的一部分(例如，一个野生型D1结构域变体的一部分和另一个野生型D1结构域变体的一部分)的嵌合SIRP-α变体。在一些实施方式中，嵌合SIRP-α变体包括野生型D1结构域变体的至少两个部分(例如，三个、四个、五个等)，其中各个部分来自不同的野生型D1结构域变体。在一些实施方式中，嵌合SIRP-α变体进一步包括一个或多个表2中列出的氨基酸置换。在一些实施方式中，SIRP-α变体与表3中的SEQ ID NO:24-34任一的序列具有至少80％(例如，至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。
表1.野生型SIRP-αD1结构域的序列
Figure BDA0003213826850000361
Figure BDA0003213826850000371
Figure BDA0003213826850000381
表2.SIRP-α变体中相对于各D1域变体的氨基酸置换
Figure BDA0003213826850000382
Figure BDA0003213826850000391
Figure BDA0003213826850000401
Figure BDA0003213826850000411
Figure BDA0003213826850000421
表3.SEQ ID NO:24-34
Figure BDA0003213826850000431
Figure BDA0003213826850000441
理想地，本发明的SIRP-α变体构建体在患病部位如癌症部位(例如，在肿瘤内)特有的条件下以比生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下更高的亲和力结合CD47。患病部位如癌症部位(例如，在肿瘤内)特有的条件是例如，酸性pH和缺氧。在一些实施方式中，本发明的SIRP-α变体构建体可以工程化以相对于非患病细胞优先结合患病细胞。特别地，患病细胞可以是癌症疾病(例如，实体肿瘤或血液癌症)的癌细胞。优选地，SIRP-α变体构建体在酸性pH(例如，低于约pH 7)下以比在中性pH(例如，pH 7.4)下更高的亲和力结合CD47。优选地，SIRP-α变体构建体在缺氧条件下以比在具有足够氧浓度的条件下更高的亲和力结合CD47。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括连接于封闭肽的SIRP-α变体。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与患病细胞或患病部位上的CD47的优先结合可以通过使用可切割接头(其在患病细胞或患病部位处被切割)将封闭肽连接于SIRP-α变体而获得。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与患病细胞或患病部位上的CD47的优先结合可以通过将封闭肽连接于SIRP-α变体而获得，其中封闭肽可以在患病细胞或患病部位处与SIRP-α变体脱离或简单地解离。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括SIRP-α变体和封闭肽。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以通过接头(例如，可切割接头)连接于封闭肽。封闭肽用于封闭SIRP-α变体的CD47结合位点以在生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下阻止SIRP-α变体与CD47的结合。可切割接头是能够仅在患病部位(如癌症部位，例如，肿瘤内)特有的条件(例如，酸性pH和缺氧)下被切割的接头。在一些实施方式中，可切割接头通过患病部位处的肿瘤相关蛋白酶切割。在一些实施方式中，接头在患病部位处不被切割而是封闭肽简单地从SIRP-α变体解离，使得SIRP-α变体游离以与患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的邻近CD47结合。因此，仅当SIRP-α变体在患病部位处时，它从封闭肽释放且游离以与患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的邻近CD47结合。封闭肽和接头(例如，可切割接头)在本文中更详细地描述。
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括SIRP-α变体和靶向部分。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以连接于表现出对患病细胞的结合亲和力的靶向部分如抗体(例如，肿瘤特异性抗体)或另一蛋白质或肽(例如，抗体结合肽)。在施用后，肿瘤特异性抗体或抗体结合肽用作靶向部分以将SIRP-α变体带到患病部位如癌症部位(例如，实体肿瘤内)，在此处SIRP-α可以特异性地与患病细胞上的CD47相互作用。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以与能够结合抗体(例如，肿瘤特异性抗体)，即结合抗体的恒定区或可变区，的蛋白质或肽(例如，抗体结合肽)融合。能够结合一种或多种抗体的SIRP-α变体在本文中更详细地描述。在其它实施方式中，其它SIRP-α变体，如国际公开No.WO2013109752(由此通过引入并入)中描述的SIRP-α变体，可以连接于肿瘤特异性抗体或者能够结合肿瘤特异性抗体的蛋白质或肽，例如，抗体结合肽。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以在体外(在施用于人之前)或在体内(在施用后)连接于抗体。
在一些实施方式中，SIRP-α变体可以进一步包括野生型人SIRP-α的D2和/或D3结构域。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以连接于Fc域单体、人血清白蛋白(HSA)、血清结合蛋白或肽或者有机分子，例如，聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))，以改善SIRP-α变体的药代动力学性质，例如，延长血清半衰期。用于延长本发明SIRP-α变体的血清半衰期的Fc域单体、HSA蛋白质、血清结合蛋白或肽和有机分子如PEG在本文中更详细地描述。在一些实施方式中，SIRP-α变体不包括SEQ ID NO:3-12和24-34任一的序列。
II.SIRP-α变体中用组氨酸残基置换的氨基酸置换
在一些实施方式中，除了表2中列出的SIRP-α变体的氨基酸置换外，SIRP-α变体可以包括一个或多个用组氨酸残基置换的氨基酸置换。包括SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体以更高的亲和力结合在患病细胞上或患病部位处的CD47(相对于非患病细胞上的CD47)更高的亲和力结合CD47且在患病部位特有的条件(例如，酸性pH、缺氧)下比在生理条件下更高的亲和力结合CD47。用组氨酸残基置换的氨基酸残基可以使用组氨酸扫描诱变、蛋白质晶体结构及计算设计和建模方法鉴别。可以用于生成SIRP-α变体的技术和方法及用于测定其对患病和非患病细胞上的CD47的结合亲和力的方式在本文中更详细地描述。组氨酸残基置换可以位于SIRP-α变体和CD47的界面处或可以在SIRP-α变体的内部区域。优先地，组氨酸残基置换位于SIRP-α变体和CD47的界面处。表4列出了可以用组氨酸残基置换的特定SIRP-α氨基酸。表4中的氨基酸残基编号是相对于SEQ ID NO:3的序列；在SEQ ID NO:4-12的任何一个序列中相应位置处的一个或多个氨基酸也可以用组氨酸残基置换。接触残基是位于SIRP-α变体和CD47的界面处的氨基酸。核心残基是不直接参与SIRP-α变体和CD47之间的结合的内部氨基酸。SIRP-α变体可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，或所有)表4中列出的置换。SIRP-α变体可以包含最多20个组氨酸置换。
表4.SIRP-α氨基酸置换(氨基酸残基编号相对于SEQ ID NO:3的序列)
Figure BDA0003213826850000471
III.pH-依赖性的结合
研究已经证明，介导致癌代谢的肿瘤细胞产生大量的乳酸和质子，从而导致在肿瘤组织中细胞外pH值降低到低至6(Icard等,Biochim.Biophys.Acta.1826:423-433,2012)。在一些实施方式中，包括SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体被工程化以在酸性pH下相对于在中性pH(例如，大约pH 7.4)下以高亲和力结合CD47。因此，本发明的SIRP-α变体构建体被工程化以相对于非患病细胞上的CD47选择性地结合患病细胞(例如，肿瘤细胞)或者患病部位处的细胞(例如，支持肿瘤生长的肿瘤微环境中的细胞)上的CD47。
在一个实施方式中，为对本发明SIRP-α变体构建体的pH-依赖性结合进行工程化，可以在SIRP-α变体上进行组氨酸诱变，特别是在与CD47相互作用的SIRP-α区域上。SIRP-α和CD47复合体的晶体结构(参见，例如，PDB ID No.2JJS)及计算机建模可以用于SIRP-α和CD47的三维结合位点的可视化。可用于设计具有pH-敏感的结合特性的蛋白质的计算设计和建模方法是文献中已知的且描述于，例如，Strauch等,Proc Natl Acad Sci 111:675-80,2014中，其通过引用全文并入本文中。在一些实施方式中，计算建模可以用于鉴别SIRP-α和CD47的界面处的关键接触残基。鉴别的关键接触残基可以使用可得的蛋白质设计软件(例如，RosettaDesign)用组氨酸残基置换，该蛋白质设计软件可以产生可基于计算的结合能量和形状互补性进行优化、过滤和分级的各种蛋白质设计。因此，在某些氨基酸残基位置处能量有利的组氨酸置换可以使用计算设计方法鉴别。计算建模也可以用于预测SIRP-α的三维结构中的变化。可以避免在SIRP-α三维结构中产生显著变化的组氨酸置换。
一旦鉴别到能量和结构上最佳的氨基酸置换，氨基酸可以系统性地用组氨酸残基置换。在一些实施方式中，SIRP-α的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)氨基酸可以用组氨酸残基置换。特别地，位于SIRP-α和CD47的界面处的氨基酸，优选地，直接参与SIRP-α与CD47的结合的氨基酸，可以用组氨酸残基置换。SIRP-α变体可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)组氨酸残基置换。在其它实施方式中，SIRP-α的天然存在的组氨酸残基可以用其它氨基酸残基置换。在再其它的实施方式中，SIRP-α的一个或多个氨基酸可以用非组氨酸残基置换以影响天然存在的或置换的组氨酸残基与CD47的结合。例如，用其它氨基酸置换天然存在的组氨酸残基周围的氨基酸可以“包埋”天然存在的组氨酸残基。在一些实施方式中，不直接参与与CD47的结合的氨基酸，即，内部氨基酸(例如，位于SIRP-α的核心的氨基酸)也可以用组氨酸残基置换。表4列出了可以用组氨酸或非组氨酸残基置换的特定SIRP-α氨基酸。接触残基是位于SIRP-α和CD47的界面处的氨基酸。核心残基是不直接参与SIRP-α和CD47之间的结合的内部氨基酸。SIRP-α变体可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，或所有)表4中列出的置换。
包含一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)组氨酸残基置换的SIRP-α变体可以在不同pH条件(例如，pH 5、5.5、6、6.5、7、7.4、8)下测试其与CD47的结合。在一些实施方式中，纯化的CD47蛋白可以用于测试结合。本领域技术人员已知的各种技术可以用于在不同pH条件(例如，pH 5、5.5、6、6.5、7、7.4、8)下测量SIRP-α变体/CD47复合物的亲和常数(KA)或解离常数(KD)。在优选的实施方式中，SIRP-α变体对于CD47的结合亲和力可以使用表面等离子体共振(例如，Biacore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统，Biacore,INC,Piscataway N.J.)测定。在示例性的实施方式中，具有pH-依赖性结合的SIRP-α变体(其在pH 6下相对于pH 7.4下以更高亲和力特异性地结合CD47)在pH 6下相对于pH 7.4表现出更低的KD。
IV.缺氧-依赖性的结合
肿瘤缺氧是其中肿瘤细胞被剥夺氧的条件。随着肿瘤生长，其血液供应持续地重定向到肿瘤的最快生长的部分，使得肿瘤的多个部分具有显著低于健康组织的氧浓度。
在一些实施方式中，SIRP-α变体可以连接于缺氧-活化的前药，其可以发挥作用以提高SIRP-α变体对抗特定缺氧条件下的相关患病细胞的效力。缺氧-活化的前药是文献中已知的，例如Kling等(Nature Biotechnology,30:381,2012)描述的那些，该文献通过引用并入本文。
V.抗体结合
在患病部位处相对于非患病部位提供选择性SIRP-α活性的另一策略是将SIRP-α蛋白连接于可以结合抗体区域的蛋白质或肽。优选地，抗体对于患病细胞(例如，肿瘤细胞)是特异性的。例如，抗体可以特异性地结合患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白。SIRP-α蛋白可以可逆地或不可逆地结合抗体。
一般抗体结合
在一些实施方式中，为了对可以结合不同抗体(不论抗体特异性如何)的SIRP-α蛋白进行工程化，SIRP-α蛋白可以与识别抗体的恒定区，例如，抗体Fc域的CH2或CH3恒定域的蛋白质或肽融合。SIRP-α蛋白能够结合CD47并与野生型SIRP-α的序列(例如，变体1(SEQ IDNO:1，以下显示))或与野生型SIRP-α的CD47-结合部分的序列(例如，表1中列出的SEQ IDNO:3-12任一的序列)具有至少50％的氨基酸序列同一性。
SEQ ID NO:1
Figure BDA0003213826850000501
野生型SIRP-α的CD47-结合部分包括野生型SIRP-α的D1结构域(例如，表1中列出的SEQ ID NO:3-12任一的序列)。表现出与抗体的恒定区的一般结合的蛋白质和肽是本领域中已知的。例如，细菌抗体结合蛋白，例如，蛋白A、G和L，结合抗体的恒定区。蛋白A和G结合Fc域，而蛋白L结合轻链的恒定区。在示例性的实施方式中，蛋白A、G或L可以与SIRP-α蛋白的N-或C-末端融合。优先地，在这一实施方式中，蛋白A、G或L与SIRP-α蛋白的融合蛋白可以在施用之前与抗体连接(即，通过化学偶联)以防止融合蛋白结合血清中的各种其它抗体。蛋白A、G或L也可以使用该领域中的常规技术(即，定向演化和展示文库)演化并筛选对于抗体恒定区的更高结合亲和力。在一些实施方式中，SIRP-α蛋白可以使用本领域中的常规遗传或化学偶联技术直接连接于抗体。在其它实施方式中，SIRP-α蛋白也可以通过间隔体连接于抗体，其允许蛋白质的额外结构和空间灵活性。各种间隔体在本文中更详细地描述。在一些实施方式中，SIRP-α蛋白可以直接地或者通过抗体结合蛋白或肽可逆地或不可逆地结合抗体。进一步地，可以根据本文所述的本发明实施方式使用的修饰抗体的筛选可以如，例如，US专利公开No.US 20100189651中所述地完成。
能够结合抗体的恒定区的其它蛋白质或肽及筛选这样的蛋白质或肽的方法描述于US专利公开No.US20120283408中，其通过引用全文并入本文中。
特异性抗体结合
在一些实施方式中，为了提供SIRP-α变体在患病部位处的选择性靶向和对能够结合特定抗体(例如，肿瘤特异性抗体)的SIRP-α变体工程化，SIRP-α变体构建体可以包括SIRP-α变体和抗体特异性蛋白质或肽。SIRP-α变体可以与抗体特异性蛋白质或肽(例如，抗体结合肽)融合。优选地，蛋白质或肽特异性地结合肿瘤特异性抗体。在一些实施方式中，SIRP-α变体与抗体结合蛋白或肽的融合蛋白可以在联合治疗与肿瘤特异性抗体共同施用。在其它实施方式中，融合蛋白和肿瘤特异性抗体可以单独地施用，即，在彼此施用的数小时内，优选地，抗体首先施用。在再其它的实施方式中，在施用前，融合蛋白可以使用本领域中通常已知的遗传或化学方法共价连接于肿瘤特异性抗体。
抗体结合肽的实例包括疾病定位肽(DLP)(SEQ ID NO:64或65)，一种可以结合西妥昔单抗的抗原结合片段(Fab)区的核心的小肽(参见，例如，Donaldson等,Proc NatlAcad Sci U S A.110:17456-17461,2013)。西妥昔单抗是表皮生长因子受体(EGFR)IgG1抗体。可以与SIRP-α变体融合的抗体结合肽也包括，但不限于，与DLP(SEQ ID NO:64或65)或其片段的序列具有至少75％的氨基酸序列同一性的肽。在一些实施方式中，抗体结合肽具有SEQ ID NO:64的序列。
在最近的研究中，SIRP-α已证明与抗体西妥昔单抗结合增强DLD-1细胞的体外吞噬(Weiskopf等,Science 341:88-91,2013)。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以与特定抗体结合肽融合，例如，具有SEQ ID NO:64的序列的DLP。在这些实施方式中，包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体可以将其活性靶向于西妥昔单抗结合的、EGFR表达肿瘤中。这随之可以进一步改善包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体及西妥昔单抗递送至抗-EGFR反应性患者。包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体的实例显示在SEQ ID NO:66中，其中加单下划线的部分指示DLP而黑体部分指示SIRP-α变体。两个DLP为亲合力而遗传连接于SIRP-α变体的N-和C-末端并改善对西妥昔单抗的亲和力。SEQ ID NO:66中SIRP-α变体的序列(黑体部分)可以被本文所述的任何SIRP-α变体的序列替代。其它抗体结合肽也可以与SIRP-α变体融合。这样的抗体结合肽包括，但不限于可以特异性结合抗体如西妥昔单抗、派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab、MEDI0680、MEDI6469、伊匹单抗、替西木单抗、urelumab、vantictumab、varlilumab、mogamalizumab、抗-CD20抗体、抗-CD19抗体、抗-CS1抗体、赫塞汀、曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗的肽。
SEQ ID NO:66
Figure BDA0003213826850000521
在一些实施方式中，包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体可以进一步与本文所述的基于CD47的封闭肽结合以在构建体到达患病部位之前阻断构建体中SIRP-α变体的结合，在患病部位中可切割接头可以被切割。在这些实施方式中，由于包含SIRP-α变体、基于CD47的封闭肽和DLP的SIRP-α变体构建体在患病部位累积且仅在通过蛋白酶(例如，肿瘤特异性蛋白酶)或患病部位特有的其它特征(例如，酸性pH、缺氧)诱导的接头切割后在患病部位处是活性的，治疗窗可以扩大。
在一些实施方式中，能够结合肿瘤特异性抗体的蛋白质或肽可以使用本领域中常用的技术如定向演化和展示文库(例如，噬菌体展示文库)鉴别。涉及鉴别能够结合肿瘤特异性抗体的蛋白质和肽的方法和技术是本领域已知的，如Donaldson等(Proc Natl AcadSci110:17456-61,2013)描述的那些，其通过引用全文并入本文中。在噬菌体展示文库中，潜在抗体特异性蛋白质或肽通常共价连接于噬菌体外壳蛋白。该连接从编码与外壳蛋白融合的蛋白质或肽的核酸的翻译产生。展示肽的噬菌体可以生长和使用标准的噬菌体制备方法(例如，从生长培养基的PEG沉淀)收获。这些展示噬菌体然后可以针对其它蛋白质(例如，肿瘤特异性抗体)进行筛选，以检测展示的蛋白质和肿瘤特异性抗体之间的相互作用。一旦鉴别到肿瘤特异性蛋白质或肽，则编码选择的肿瘤特异性蛋白质或肽的核酸可以从用选择的噬菌体感染的细胞或从噬菌体本身(在扩增后)分离。可以挑取单个克隆或噬斑且核酸可以分离和测序。在鉴别和分离抗体特异性蛋白质或肽后，蛋白质或肽可以与SIRP-α变体的N-或C-末端融合。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以使用本领域中的常规遗传或化学偶联技术直接连接于肿瘤特异性抗体。在其它实施方式中，SIRP-α变体也可以通过间隔体连接于肿瘤特异性抗体，该间隔体允许蛋白质的额外结构和空间灵活性。各种间隔体在本文中更详细地描述。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以直接地或者通过抗体结合蛋白或肽可逆地或不可逆地结合抗体。
在其它实施方式中，野生型SIRP-α或野生型SIRP-α的细胞外D1结构域(例如，表1中列出的SEQ ID NO:3-12任一的序列)可以连接于肿瘤特异性抗体。优选地，SIRP-α的D1结构域连接于肿瘤特异性抗体。肿瘤特异性抗体用作靶向部分以将野生型SIRP-α或D1结构域带到患病部位(例如，癌症部位，例如，实体肿瘤内)，在此处野生型SIRP-α或D1结构域可以与患病细胞上的CD47相互作用。在一些实施方式中，野生型SIRP-α或野生型SIRP-α的细胞外D1结构域可以使用本领域中的常规遗传或化学偶联技术直接连接于肿瘤特异性抗体。在其它实施方式中，野生型SIRP-α或野生型SIRP-α的细胞外D1结构域也可以通过间隔体连接于肿瘤特异性抗体，其允许蛋白质的额外结构和空间灵活性。各种间隔体在本文中更详细地描述。在其它实施方式中，野生型SIRP-α或野生型SIRP-α的细胞外D1结构域可以与前述能够结合肿瘤特异性抗体的蛋白质或肽融合。在再其它的实施方式中，其它SIRP-α多肽，如国际公开No.WO2013109752(由此通过引入并入)中描述的SIRP-α多肽，可以连接于肿瘤特异性抗体或连接于能够结合肿瘤特异性抗体的蛋白质或肽。在一些实施方式中，野生型SIRP-α或D1结构域可以直接地或者通过抗体结合蛋白或肽可逆地或不可逆地结合抗体。
VI.封闭肽
封闭肽可以通过可切割接头连接于SIRP-α变体。在一些实施方式中，封闭肽也可以非共价地连接于SIRP-α变体。封闭肽起到封闭SIRP-α变体的CD47结合位点的作用，使得SIRP-α变体在生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下不能结合非患病细胞的细胞表面上的CD47。在患病部位(如癌症部位，例如，肿瘤内)的异常条件(即，酸性和/或缺氧环境或者具有提高的蛋白酶表达的环境)下，可切割接头可以被切割以从封闭肽释放SIRP-α变体。SIRP-α变体然后游离以结合附近肿瘤细胞上的CD47。可切割接头的实例在本文中更详细地描述。
在一些实施方式中，封闭肽对于野生型SIRP-α具有与对于工程化SIRP-α变体相比的更高亲和力。一旦接头被切割，封闭肽从SIRP-α变体解离且可以结合野生型SIRP-α。具有对于野生型SIRP-α和SIRP-α变体的不同结合亲和力的封闭肽可以使用本领域中通常已知的方法和技术来鉴别，例如，定向演化和展示文库(例如，噬菌体或酵母展示)。在一个示例性实施方式中，编码CD47的SIRP-α结合区的核苷酸或编码抗-SIRP-α抗体的可变区的核苷酸可以进行突变和/或随机地重组以使用如，例如，易错PCR和DNA改组的技术产生大的基因变体文库。一旦产生遗传文库，则由核苷酸编码的突变体肽可以使用，例如，噬菌体或酵母展示对其结合野生型SIRP-α和SIRP-α变体的能力进行筛选。鉴别的可结合野生型SIRP-α和SIRP-α变体两者的肽可以经历第二筛选过程以使得相对于SIRP-α变体以更高亲和力结合野生型SIRP-α的蛋白质可以被分离。鉴别的肽(一旦结合野生型SIRP-α或SIRP-α变体)应当防止CD47与野生型SIRP-α或SIRP-α变体的结合。本领域技术人员已知的各种技术可以用于测量SIRP-α变体/封闭肽复合物或野生型SIRP-α/封闭肽复合物的亲和常数(KA)或解离常数(KD)。封闭肽可以相对于SIRP-α变体以至少三倍高的亲和力结合野生型SIRP-α。
基于CD47的封闭肽
封闭肽可以是可结合本文所述的SIRP-α变体的CD47模拟多肽或CD47片段。一些封闭肽可以在不同于CD47结合位点的位点处结合SIRP-α变体。一些封闭肽可以以不同于CD47的方式结合SIRP-α变体。在一些情况中，封闭肽可以包含至少一个稳定二硫键。封闭肽可以包含CERVIGTGWVRC的多肽序列或者其片段或变体。变体封闭肽可以含有一个或多个保守或非保守修饰。在一些情况中，变体封闭肽可以含有半胱氨酸至丝氨酸的修饰和/或一个或多个天冬酰胺至谷氨酰胺的修饰。封闭肽可以在与包含CERVIGTGWVRC的多肽序列或者其片段或变体的肽相同的位点处结合SIRP-α变体。封闭肽可以包含GNYTCEVTELTREGETIIELK的多肽序列或者其片段或变体。封闭肽可以在与包含GNYTCEVTELTREGETIIELK的多肽序列或者其片段或变体的肽相同的位点处结合SIRP-α变体。在一些情况中，封闭肽可以包含EVTELTREGE的多肽序列或者其片段或变体。封闭肽可以在与包含EVTELTREGE的多肽序列或者其片段或变体的肽相同的位点处结合SIRP-α变体。在一些情况中，封闭肽可以包含CEVTELTREGEC的多肽序列或者其片段或变体。封闭肽可以在与包含CEVTELTREGEC的多肽序列或者其片段或变体的肽相同的位点处结合SIRP-α变体。
本文提供了包含SIRP-α变体和封闭肽的SIRP-α变体构建体，其中封闭肽可以包含SEVTELTREGET的多肽序列或者其片段或变体。封闭肽可以在与包含SEVTELTREGET的多肽序列或者其变体或片段的肽相同的位点处结合SIRP-α变体。在一些情况中，封闭肽可以包含GQYTSEVTELTREGETIIELK的多肽序列或者其片段或变体。封闭肽可以在与包含GQYTSEVTELTREGETIIELK的多肽序列或者其变体或片段的肽相同的位点处结合SIRP-α变体。
在一些情况中，封闭肽可以是与SIRP-α变体相比表现出对于野生型SIRP-α的更高亲和力的CD47变体多肽。如与野生型CD47相比的，封闭多肽可以包含以下突变中的至少一个：T102Q、T102H、L101Q、L101H和L101Y。如与野生型CD47相比的，封闭多肽可以包含在N-末端处或靠近N-末端引入另外的甘氨酸或任何其它氨基酸残基。另外的氨基酸可以邻接在CD47的N-末端处或靠近CD47的N-末端的谷氨酰胺和/或亮氨酸引入。在一些情况中，封闭肽可以是与野生型CD47相比对于SIRP-α变体显示出较低亲和力的CD47变体多肽。这样的CD47变体多肽使用本文所述的方法容易地鉴别和测试。
本文提供了包含本文所述的SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体，其中所述SIRP-α变体通过使用至少一个接头与本文所述的封闭肽连接。SIRP-α变体可以包含与野生型SIRP-α相同的CD47结合位点。SIRP-α变体与野生型SIRP-α相比可以包含一个或多个突变或插入。SIRP-α变体可以是截短形式的野生型SIRP-α。封闭肽可以是本文所述的CD47模拟物、变体或片段。与SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体相比，封闭肽对于野生型SIRP-α可以表现出较高亲和力。封闭肽可以是与野生型CD47相比对于SIRP-α变体显示较低亲和力的CD47变体多肽。接头可以是任选地可通过至少一种或多种蛋白酶切割的至少一个接头，且任选地也包含一个或多个间隔体。可切割接头可以包含序列LSGRSDNH。间隔体可以包含一个或多个甘氨酸-丝氨酸间隔体单元，其中各单元可以包含序列GGGGS。
在一些实施方式中，通过可切割接头连接于SIRP-α变体的封闭肽是源自CD47的SIRP-α-结合肽(即，基于CD47的封闭肽)。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽源自CD47的SIRP-α结合部分。CD47的SIRP-α结合部分通常称为CD47的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，其序列显示如下(SEQ ID NO:35；Ref.NP_0017681)。
SEQ ID NO:35：人CD47的野生型,IgSF结构域
Figure BDA0003213826850000571
在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽含有CD47的全长IgSF结构域(SEQ ID NO:35)或其片段。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽相对于CD47的野生型IgSF结构域(SEQID NO:35)或其片段含有一个或多个氨基酸置换、删除和/或添加。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽与CD47的野生型IgSF结构域(SEQ ID NO:35)或其片段的序列具有至少80％(例如，83％、86％、90％、93％、96％等)的氨基酸序列同一性。
在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽中的氨基酸置换、删除和/或添加导致对于SIRP-α变体具有低结合亲和力和对于野生型SIRP-α具有相对较高结合亲和力的基于CD47的封闭肽。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽中的氨基酸置换位于CD47和SIRP-α的界面处。例如，CD47 IgSF结构域中的氨基酸置换T102Q与SIRP-α变体中的氨基酸置换A27I空间冲突，而具有A27的野生型SIRP-α不与氨基酸置换T102Q空间冲突(参见图2)。因此，具有T102Q的基于CD47的封闭肽与对于具有A27I的SIRP-α变体相比以较高亲和力结合具有A27的野生型SIRP-α。基于CD47的封闭肽中可能产生与SIRP-α变体中的特定氨基酸的空间冲突的氨基酸置换的实例列于表5中。基于CD47的封闭肽中的这些氨基酸置换各自可以降低基于CD47的封闭肽与SIRP-α变体的结合亲和力，取决于在SIRP-α-CD47相互作用位点处SIRP-α变体中的特定氨基酸残基。
表5：基于CD47的封闭肽中可能产生与SIRP-α变体中的特定氨基酸的空间冲突的氨基酸置换的实例
Figure BDA0003213826850000581
除了在基于CD47的封闭肽和SIRP-α变体之间产生空间冲突外，氨基酸置换、添加和/或删除也可以用于破坏基于CD47的封闭肽和SIRP-α变体之间的特定非共价相互作用，因此，降低基于CD47的封闭肽与SIRP-α变体的结合亲和力。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽的N-末端通过添加一个或多个与N-末端直接连接的氨基酸和/或通过在N-末端的其它氨基酸之间插入一个或多个氨基酸而延长一个或多个氨基酸(例如，一个氨基酸)破坏基于CD47的封闭肽的N-末端和SIRP-α变体之间的非共价相互作用(例如，氢键相互作用)。例如，基于CD47的封闭肽的N-末端处的氨基酸添加，例如，甘氨酸添加，防止N-末端的谷氨酰胺环化为焦谷氨酸且也产生很可能破坏基于CD47的封闭肽的N-末端焦谷氨酸与野生型SIRP-α中的氨基酸残基L66或SIRP-α变体中的氨基酸置换L66T之间的氢键相互作用的不希望的接触和相互作用(也参见实施例5)。在一些实施方式中，氨基酸残基，例如，甘氨酸，在基于CD47的封闭肽的N-末端处添加以使得CD47的N-末端从QLLFNK变为GQLLFNK或QGLLFNK。基于CD47的封闭肽中氨基酸置换、删除和/或添加的选择取决于SIRP-α变体中的特定氨基酸置换。
此外，将基于CD47的封闭肽的N-末端与SIRP-α变体的C-末端通过可切割接头和任选地一个或多个间隔体融合也影响基于CD47的封闭肽和SIRP-α变体之间的结合相互作用并降低基于CD47的封闭肽对SIRP-α变体的结合亲和力。在一些实施方式中，在SIRP-α变体构建体中，基于CD47的封闭肽的N-末端通过可切割接头和任选地一个或多个间隔体与SIRP-α变体的C-末端融合。在一些实施方式中，在SIRP-α变体构建体中，基于CD47的封闭肽的C-末端通过可切割接头和任选地一个或多个间隔体与SIRP-α变体的N-末端融合。可切割接头和间隔体的实例在本文中更详细地描述。
示例性的基于CD47的封闭肽显示于表6中。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽具有或包括序列SEVTELTREGET(SEQ ID NO:38)。在一些实施方式中，基于CD47的封闭肽具有或包括序列GQYTSEVTELTREGETIIELK(SEQ ID NO:40)。
表6
Figure BDA0003213826850000591
Figure BDA0003213826850000601
Figure BDA0003213826850000611
VII.可切割接头
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括连接于封闭肽的SIRP-α变体。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体包括连接于封闭肽的野生型SIRP-α。用于将SIRP-α变体或野生型SIRP-α与封闭肽融合的接头可以是可切割接头或非可切割接头。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体与患病细胞或患病部位上的CD47的优先结合可以通过使用在患病细胞或患病部位处切割的可切割接头将封闭肽连接于SIRP-α变体而获得。
在一些实施方式中，可切割接头在SIRP-α变体和封闭肽之间使用。在一些实施方式中，可切割接头可以安装在封闭肽内，其可以与SIRP-α变体非共价缔合以在生理条件下阻断SIRP-α变体与CD47的结合。可切割接头可以在特定条件下切割。如果可切割接头在封闭肽内，接头的切割将灭活封闭肽。在患病部位如癌症部位(例如，肿瘤内)特有的条件下，接头被切割以从封闭肽释放SIRP-α变体，使得SIRP-α变体可以结合患病细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞表面上的邻近CD47。以这种方式，在包括SIRP-α变体和封闭肽的SIRP-α构建体中，SIRP-α变体可以仅结合患病细胞(例如，肿瘤细胞)或患病部位处的细胞(例如，支持肿瘤生长的肿瘤微环境中的细胞)上的CD47，且不能够结合在生理条件下的非患病细胞上的CD47，因为可切割接头在生理条件下保持稳定且SIRP-α变体的CD47-结合位点被封闭肽封闭。可切割接头可以包括在患病部位特有的条件(如酸性pH、缺氧和提高的蛋白酶表达)下切割或诱导接头的切割的氨基酸、有机小分子或氨基酸和有机小分子的组合。可切割接头在生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下是稳定的。在一些实施方式中，可切割接头可以不被切割且封闭肽可以在患病部位处简单地与SIRP-α变体解离，使得SIRP-α变体游离以结合患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的邻近CD47。在这些实施方式中，SIRP-α变体可以工程化以具有与CD47的pH-依赖性的结合，其细节在之前描述。SIRP-α变体可以工程化以在患病部位的酸性pH下相对于非患病部位的中性pH(例如，大约pH7.4)以高亲和力结合CD47。因此，封闭肽(例如，基于CD-47的封闭肽或CD47 IgSF结构域封闭蛋白)可以在患病部位的酸性pH下从SIRP-α变体解离。在一些实施方式中，为对SIRP-α变体与患病部位的CD47的pH-依赖性的结合进行工程化，组氨酸诱变可以在SIRP-α上进行，特别是在与CD47相互作用的SIRP-α区域上。
pH-依赖性的可切割接头
癌症部位(例如，肿瘤内)的特征之一是酸性pH。在一些实施方式中，接头可以在酸性pH(例如，低于约pH 7)下切割。酸-敏感的接头在生理pH(例如，大约pH 7.4)下是稳定的。酸性pH下的切割可以是通过酸水解或通过患病部位如癌症部位(例如，肿瘤内)的酸性pH下存在和活性的蛋白质。酸-敏感的接头可以包括能够在酸性pH下水解的部分，如化学官能团或化合物。酸-敏感的化学官能团和化合物包括，但不限于，例如，缩醛、缩酮、thiomaleamates、腙类和二硫键。酸-敏感的接头以及酸-敏感的化学基团和化合物(其可以用于构建酸-敏感的接头)是本领域中公知的且描述于US专利No.8,748,399、5,306,809和5,505,931，Laurent等(Bioconjugate Chem.21:5–13,2010)，Castaneda等(Chem.Commun.49:8187-8189,2013)和Ducry等(Bioconjug.Chem.21:5-13,2010)中，其各自通过引用全文并入本文中。在一个实施方式中，二硫键可以使用肽合成仪和/或常规化学合成技术安装到可切割接头中。在另一实施方式中，硫代马来酰胺酸(thiomaleamic acid)接头(Castaneda等Chem.Commun.49:8187-8189,2013)可以用作可切割接头。在这一实施方式中，为在SIRP-α变体和封闭肽之间插入硫代马来酰胺酸接头，硫代马来酰胺酸的两个硫醇基之一(参见，例如，方案2,Castaneda等)可以连接于SIRP-α变体的C-末端，而thiomalemic接头的酯基团可以连接于封闭肽的N-末端。所引用的公开文献的内容通过引用全文并入本文。
缺氧-依赖性的可切割接头
在一些实施方式中，接头可以在缺氧条件下切割，这是癌症部位(例如，肿瘤内)特征性的另一条件。通过缺氧-敏感的接头连接于封闭肽的SIRP-α变体防止与非患病细胞上的CD47结合，而接头在生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下保持稳定。一旦融合蛋白处于癌症部位(例如，肿瘤内)(其中氧浓度显著低于健康组织中)，接头被切割以从封闭肽释放SIRP-α变体，其然后可以结合肿瘤细胞上的细胞表面CD47。缺氧-敏感的接头可以包括能够在缺氧条件下切割的部分，例如，氨基酸或化学官能团。可以在缺氧条件下切割(即，通过还原切割)的化学部分的一些实例包括，但不限于醌类、N-氧化物和杂芳族硝基基团。这些化学部分可以使用常规化学和肽合成技术安装在可切割接头中。缺氧-敏感的氨基酸的实例也是本领域已知的，如由Shigenaga等(European Journal of Chemical Biology 13:968–971,2012)描述的那些，其通过引用全文并入本文。
在优选的实施方式中，Shigenaga等(European J.Chem,Biol.13:968–971,2012)描述的缺氧-敏感的氨基酸可以插入SIRP-α变体和封闭肽之间。例如，缺氧-敏感的氨基酸的氨基可以通过肽键连接于SIRP-α变体的C-末端，且类似地，缺氧-敏感的氨基酸的羧酸基团可以通过肽键连接于封闭肽的N-末端。在缺氧条件下，硝基的还原诱导缺氧-敏感的氨基酸和封闭肽的N-末端之间肽键的切割，因此，成功地从封闭肽释放SIRP-α变体。SIRP-α变体然后可以结合肿瘤细胞上的CD47。
在另一实施方式中，Duan等(J.Med.Chem.51:2412–2420,2008)描述的缺氧-敏感的2-硝基咪唑基团可以插入SIRP-α变体和封闭肽之间或插入在SIRP-α变体和封闭肽之间插入的可切割接头中。在缺氧条件下，硝基的还原诱导进一步的还原，其最终导致2-硝基咪唑基团从其附着物(例如，SIRP-g变体、封闭肽或可切割接头)消除。
肿瘤相关酶-依赖性的可切割接头
在其它实施方式中，SIRP-α变体构建体可以包括通过接头(例如，可切割接头)和任选地一个或多个间隔体(间隔体的实例在本文中更详细地描述)连接于封闭肽的SIRP-α变体。在一些实施方式中，接头(例如，可切割接头)可以通过肿瘤相关酶切割。在一些实施方式中，可以通过肿瘤相关酶切割的接头可以包含在封闭肽(其可以非共价地连接于SIRP-α变体)内。一旦融合蛋白处于癌症部位(例如，肿瘤内)，接头通过肿瘤相关酶切割以从封闭肽释放SIRP-α变体，其然后可以结合肿瘤细胞上的细胞表面CD47。对肿瘤相关酶敏感的接头可以包含能够被仅存在于癌症部位(例如，肿瘤内)的酶(例如，蛋白酶)特异性切割的部分(例如，蛋白质底物)。该部分可以基于癌症部位(例如，肿瘤内)存在的酶(例如，蛋白酶)的类型选择。可以通过肿瘤相关酶切割的示例性的可切割接头是LSGRSDNH(SEQ ID NO:47)，其可以通过多种蛋白酶切割，例如，蛋白裂解酶(MTSP1)、尿型纤溶酶原激活剂(uPA)、豆荚蛋白、PSA(也称为KLK3、激肽释放酶相关肽酶-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP9、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)和蛋白酶3(Pr3)。易被酶(例如，蛋白酶)切割的其它可切割接头也是可得的。除了前述蛋白酶外，可以切割可切割接头的其它酶(例如，蛋白酶)包括，但不限于尿激酶、组织纤溶酶原激活物、胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶家族和具有蛋白水解活性的另一种酶。按照本发明的一些实施方式，SIRP-α变体或野生型SIRP-α通过易被具有蛋白水解活性的酶(如尿激酶、组织纤溶酶原激活物、血纤维蛋白溶酶或胰蛋白酶)切割的接头(例如，可切割接头)连接于封闭肽。
在一些实施方式中，可切割接头的序列可以通过基于不同酶偏好将几个序列放置在一起而得出和选择。几种潜在蛋白酶及其相应蛋白酶位点的非限制性实例显示于表7中。在表7中，“-“意思是任何氨基酸(即，任何天然存在的氨基酸)，大写字母表示对于该氨基酸的强偏好，小写字母表示对于该氨基酸的较低偏好，且“/”分隔在其中邻近“/”的位置处超过一种氨基酸可能的情况中的氨基酸位置。其它可切割序列包括，但不限于来自人肝胶原蛋白的序列(α1(III)链(例如，GPLGIAGI(SEQ ID NO:100)))、来自人PZP的序列(例如，YGAGLGVV(SEQ ID NO:101),AGLGVVER(SEQ ID NO:102)或AGLGISST(SEQ ID NO:103))和自溶的其它序列(例如，VAQFVLTE(SEQ ID NO:104),AQFVLTEG(SEQ ID NO:105)或PVQPIGPQ(SEQ ID NO:106))。
表7
Figure BDA0003213826850000651
Figure BDA0003213826850000661
文献中报告了具有已知底物的酶在各种癌症类型(例如，实体肿瘤)中提高的水平。参见，例如，La Rocca等,Brit.J.Cancer 90:1414-1421和Ducry等,Bioconjug.Chem.21:5-13,2010，其各自通过引用全文并入本文中。肿瘤相关酶也可以使用本领域中已知的常规技术鉴别，例如，肿瘤细胞的免疫组织化学。在一个示例性实施方式中，接头中的酶敏感的部分可以是基质金属蛋白酶(MMP)底物，其可以通过癌症部位(例如，肿瘤内)存在的MMP切割。在另一示例性实施方式中，接头中的酶敏感的部分可以是含马来酰亚胺基的二肽接头(参见，例如，Ducry等中的表1)，其可以通过在某些肿瘤中以升高的水平存在的蛋白酶(例如，组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶)经蛋白水解切割(Koblinski等,Chim.Acta 291:113-135,2000)。在这一实施方式中，含马来酰亚胺基的二肽接头的马来酰亚胺基团可以与SIRP-α变体的半胱氨酸残基偶联且含马来酰亚胺基的二肽接头的C-末端处的羧酸基团可以与封闭肽的N-末端处的氨基偶联。类似地，含马来酰亚胺基的二肽接头的马来酰亚胺基团可以与封闭肽的半胱氨酸残基偶联且含马来酰亚胺基的二肽接头的C-末端处的羧酸基团可以与SIRP-α变体的N-末端处的氨基偶联。质谱和蛋白质组学领域中的其它可用技术可以用于确认肿瘤相关酶-依赖性可切割接头的切割。其它酶-敏感的部分描述于US专利No.8,399,219中，其通过引用全文并入本文中。在一些实施方式中，对肿瘤相关酶敏感的部分，例如，蛋白质底物，可以使用本领域公知的常规分子细胞生物学和化学偶联技术插入SIRP-α变体和封闭肽之间。
易被补体系统的酶(例如，但不限于尿激酶、组织纤溶酶原激活物、胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或具有蛋白水解活性的另一种酶)切割的肽接头可以在本文中使用。按照本发明的一种方法，多肽通过易被具有蛋白水解活性的酶(例如尿激酶、组织纤溶酶原激活物、血纤维蛋白溶酶或胰蛋白酶)切割的接头连接于屏蔽肽。
VIII.血清白蛋白
与血清白蛋白融合可以改善蛋白质药物的药代动力学，且特别地，本文描述的SIRP-α变体可以与血清白蛋白接合。血清白蛋白是作为哺乳动物中最丰富的血液蛋白质的球状蛋白质。血清白蛋白在肝中产生并构成血清蛋白质的大约一半，其在血液中是单体的和可溶的。血清白蛋白的一些最关键的功能包括转运激素、脂肪酸和身体中的其它蛋白质，缓冲pH及维持血管和身体组织之间体液的适当分配所需的渗透压。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以与血清白蛋白融合。在优选的实施方式中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在本发明的一些实施方式中，HSA的N-末端与SIRP-α变体的C-末端接合以增加SIRP-α变体的血清半衰期。HSA可以直接地或通过接头与SIRP-α变体的C-末端接合。HSA的N-末端与SIRP-α变体的C-末端的接合保持SIRP-α变体的N-末端游离以与CD47相互作用且HSA的C-末端的近端与FcRn相互作用。可以用于本文描述的方法和组合物中的HSA一般是本领域中已知的。在一些实施方式中，HSA包括UniProt ID NO:P02768的序列的氨基酸25-609(SEQID NO:67)。在一些实施方式中，HSA相对于SEQ ID NO:67包括一个或多个氨基酸置换(例如，C34S和/或K573P)。在一些实施方式中，HSA具有SEQ ID NO:68的序列。
IX.白蛋白结合肽
与血清蛋白结合可以改善蛋白质药物的药代动力学，且特别地本文描述的SIRP-α变体可以与血清蛋白结合肽或蛋白质融合。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以与表现出对血清白蛋白的结合活性的白蛋白结合肽融合以增加SIRP-α变体的半衰期。可以用于本文描述的方法和组合物中的白蛋白结合肽一般是本领域中已知的。参见，例如，Dennis等,J.Biol.Chem.277:35035-35043,2002和Miyakawa等,J.Pharm.Sci.102:3110-3118,2013。在一个实施方式中，白蛋白结合肽包括序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:2)。白蛋白结合肽可以遗传地与SIRP-α变体融合或通过化学手段(例如，化学偶联)连接于SIRP-α变体。如果需要的话，间隔体可以插入SIRP-α变体和白蛋白结合肽之间以允许融合蛋白的额外结构和空间灵活性。特定间隔体及其氨基酸序列在本文中更详细地描述。在一些实施方式中，白蛋白结合肽可以与SIRP-α变体的N-和C-末端融合。在一个实例中，白蛋白结合肽的C-末端可以通过肽键直接与SIRP-α变体的N-末端融合。在另一实例中，白蛋白结合肽的N-末端可以通过肽键直接与SIRP-α变体的C-末端融合。在又一实例中，白蛋白结合肽的C-末端的羧酸可以使用常规化学偶联技术与SIRP-α变体的内部氨基酸残基(即，赖氨酸残基的侧链氨基)融合。非限制于理论，预期白蛋白结合肽与SIRP-α变体的融合可以通过其与血清白蛋白的结合导致治疗性蛋白延长的保留。
X.Fc域
在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体可以包括SIRP-α变体和Fc域单体。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以与免疫球蛋白的Fc域单体或Fc域单体的片段融合。如本领域中通常已知的，Fc域是在免疫球蛋白的C-末端处存在的蛋白质结构。Fc域包括通过CH3抗体恒定域之间的相互作用二聚化的两个Fc域单体。野生型Fc域形成与Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIV)结合的最小结构。在本发明中，与SIRP-α变体融合以增加SIRP-α变体的血清半衰期的Fc域单体或Fc域的片段可以包括两个Fc域单体的二聚体或Fc域单体，条件是Fc域单体可以结合Fc受体(例如，FcRn受体)。此外，与SIRP-α变体融合以增加SIRP-α变体的血清半衰期的Fc域或Fc域的片段不诱导任何免疫系统相关的反应。在一些实施方式中，Fc域可以进行突变以缺乏效应子功能，这是“死亡”Fc域典型的。例如，Fc域可以包括已知最小化Fc域和Fcγ受体之间的相互作用的特定氨基酸置换。在一些实施方式中，Fc域单体或Fc域的片段可以通过常规遗传或化学手段(例如，化学偶联)与SIRP-α变体的N-或C-末端融合。如果需要，接头(例如，间隔体)可以插入SIRP-α变体和Fc域单体之间。
Fc域单体的异二聚化
在一些实施方式中，Fc域中的两个Fc域单体各自包括促进两个单体的异二聚化的氨基酸置换。Fc域单体的异二聚化可以通过在两个Fc域单体中引入不同的但相容的置换而促进，例如“杵-臼(knob-into-hole)”残基对和带电残基对。“杵-臼”残基对的使用由Carter和同事(Ridgway等,Protein Eng.9:617-612,1996；Atwell等,J Mol Biol.270:26-35,1997；Merchant等,Nat Biotechnol.16:677-681,1998)描述。杵和臼相互作用有利于异二聚体形成，而杵-杵和臼-臼相互作用由于空间冲突和有利相互作用的缺失而阻碍同型二聚体形成。“杵-臼”技术也公开于U.S.专利申请公开No.8,216,805,Merchant等,NatureBiotechnology 16:677-681,1998和Merchant等,Proc Natl Acad Sci U S A.110:E2987-E2996,2013中，其各自通过引用全文并入本文。臼是在蛋白质中的原始氨基酸残基被具有较小侧链体积的不同氨基酸替换时形成的空隙。杵是在蛋白质中的原始氨基酸被具有较大侧链体积的不同氨基酸替换时形成的突起。具体地，待替换的氨基酸是在Fc域单体的CH3抗体恒定域中并参与两个Fc域单体的二聚化。在一些实施方式中，一个CH3抗体恒定域中的臼产生以容纳另一CH3抗体恒定域中的杵，使得杵和臼氨基酸发挥作用以促进或有利于两个Fc域单体的异二聚化。在一些实施方式中，一个CH3抗体恒定域中的臼产生以更好地容纳另一CH3抗体恒定域中的原始氨基酸。在一些实施方式中，一个CH3抗体恒定域的杵产生以与另一CH3抗体恒定域中的原始氨基酸形成额外的相互作用。
臼可以通过用具有较小侧链的氨基酸如丙氨酸、缬氨酸或苏氨酸替换具有较大侧链的氨基酸如酪氨酸或色氨酸构建，如CH3抗体恒定域中的Y407V突变。类似地，杵可以通过用具有较大侧链的氨基酸替换具有较小侧链的氨基酸构建，如CH3抗体恒定域中的T366W突变。在优选的实施方式中，一个Fc域单体包括杵突变T366W和另一Fc域单体包括臼突变T366S、L358A和Y407V。本发明的SIRP-αD1变体可以与包括杵突变T366W的Fc域单体融合以限制不希望的杵-杵同型二聚体形成。杵-臼氨基酸残基对的实例包括在表8中，但不限于此。
表8
Figure BDA0003213826850000701
Figure BDA0003213826850000711
除了杵-臼策略外，静电操纵策略也可以用于控制Fc域单体的二聚化。静电操纵是在肽、蛋白质结构域和蛋白质中利用相反带电的氨基酸之间的有利静电相互作用以控制更高有序蛋白质分子的形成。特别地，为使用静电操纵控制Fc域单体的二聚化，构成CH3-CH3界面的一个或多个氨基酸残基用带正电或带负电的氨基酸残基替换以使得相互作用根据引入的特定带电氨基酸而变成静电有利的或不利的。在一些实施方式中，界面中的带正电的氨基酸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸用带负电的氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸替换。在一些实施方式中，界面中的带负电的氨基酸用带正电的氨基酸替换。带电氨基酸可以引入相互作用的CH3抗体恒定域之一或两者。将带电氨基酸引入两个Fc域单体的相互作用CH3抗体恒定域可以促进Fc域单体的异二聚体的选择性形成，如通过由带电氨基酸之间的相互作用产生的静电操纵效应控制的。静电操纵技术也公开于U.S.专利申请公开No.20140024111,Gunasekaran等,J Biol Chem.285:19637-46,2010和Martens等,Clin Cancer Res.12:6144-52,2006中，其各自通过引用全文并入本文。静电操纵氨基酸对的实例包括在表9中，但不限于此。
表9
Figure BDA0003213826850000712
XI.聚乙二醇(PEG)聚合物
在一些实施方式中，SIRP-α变体也可以与聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))融合。聚合物与蛋白质药物的连接可以对于宿主的免疫系统“屏蔽”蛋白质药物(Milla等,CurrDrug Metab.13:105-119,2012)。另外，某些聚合物，例如，疏水性聚合物，也可以提供对疏水性蛋白质和药物的水溶性(Gregoriadis等,Cell Mol.Life Sci.57:1964-1969,2000；Constantinou等,Bioconjug.Chem.19:643-650,2008)。各种聚合物如PEG、聚唾液酸链(Constantinou等,Bioconjug.Chem.19:643-650,2008)和PAS链(Schlapschy等,ProteinEng.Des.Sel.26:489-501,2013)是本领域已知的且可以用于本发明中。在一些实施方式中，聚合物(例如，PEG)可以使用常规化学方法(例如，化学偶联)在N-或C-末端或者在内部位置共价连接于SIRP-α变体。在一些实施方式中，聚合物(例如，PEG)可以共价连接于SIRP-α变体中的半胱氨酸置换或添加。SIRP-α变体中的半胱氨酸置换可以是相对于SEQ ID NO:13-23任一的序列的I7C、A16C、S20C、T20C、A45C、G45C、G79C、S79C或A84C。SIRP-α变体中半胱氨酸残基的添加可以使用本领域中的常规技术引入，例如，肽合成、遗传修饰和/或分子克隆。聚合物(例如，PEG)可以使用本领域技术人员公知的半胱氨酸-马来酰亚胺偶联连接于半胱氨酸残基。提及的公开文献的内容通过引用全文并入本文。
除上述实施方式外，其它半衰期延长技术也是可得的并可用于本发明中以增加SIRP-α变体的血清半衰期。半衰期延长技术包括，但不限于，和EXTEN(Schellenberger等,Nat.Biotechnol.27:1186-1192,2009)和Albu标签(Trussel等,Bioconjug Chem.20:2286-2292,2009)。提及的公开文献的内容通过引用全文并入本文。
XII.间隔体
在一些实施方式中，间隔体可以用于SIRP-α变体构建体中。例如，SIRP-α变体构建体可以包括通过接头(例如，可切割接头)连接于封闭肽的SIRP-α变体。在这样的SIRP-α构建体中，间隔体可以插入SIRP-α变体和接头(例如，可切割接头)之间和/或接头(例如，可切割接头)和封闭肽之间。为优化SIRP-α变体和接头之间的间距和/或接头和封闭肽之间的间距，可以使用以下所描述的间隔体中的任何一个或多个。
在包括通过接头(例如，可切割接头)连接于封闭肽的SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体的一些实施方式中，间隔体用于将可切割接头远离SIRP-α变体和封闭肽的核心定位，以使得可切割接头更易被负责切割的酶达到。应理解，SIRP-α变体构建体中的两个元件，例如，包括(例如，以这一顺序)SIRP-α变体、接头和封闭肽的SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体和接头(例如，可切割接头)，的连接不需要是特别的连接模式或通过特别的反应。提供具有合适的稳定性和生物相容性的SIRP-α变体构建体的任何反应是可接受的。
间隔体是指SIRP-α变体构建体中的两个元件(例如，包括(例如，以这一顺序)SIRP-α变体、接头和封闭肽的SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体和接头(例如，可切割接头)，包括(例如，以这一顺序)SIRP-α变体、接头和封闭肽的SIRP-α变体构建体中的接头(例如，可切割接头)和封闭肽，及SIRP-α变体和血清蛋白结合肽或蛋白(例如，白蛋白结合肽))之间的连接体。间隔体也可以指可以插入SIRP-α变体或野生型SIRP-α与抗体(例如，肿瘤特异性抗体或抗体结合肽)之间的连接体。间隔体可以提供SIRP-α变体构建体的额外结构和/或空间灵活性。间隔体可以是简单化学键(例如，酰胺键)、小有机分子(例如，烃链)、氨基酸序列(例如，3-200个氨基酸的序列)或者小有机分子(例如，烃链)和氨基酸序列(例如，3-200个氨基酸的序列)的组合。间隔体在生理条件(例如，中性pH和足够氧浓度)下以及在患病部位特有的条件(例如，酸性pH和缺氧)下是稳定的。间隔体在患病部位如癌症部位(例如，肿瘤内)是稳定的。
间隔体可以包括3-200个氨基酸。合适的肽间隔体是本领域中已知的，且包括，例如，包含柔性氨基酸残基如甘氨酸和丝氨酸的接头。在某些实施方式中，间隔体可以包含GS、GGS、GGGGS、GGSG或SGGG的基序，例如，多个或重复基序。在某些实施方式中，间隔体可以包含包括GS的基序的2-12个氨基酸，例如，GS、GSGS、GSGSGS、GSGSGSGS、GSGSGSGSGS或GSGSGSGSGSGS。在其它某些实施方式中，间隔体可以包含包括GGS的基序的3-12个氨基酸，例如，GGS、GGSGGS、GGSGGSGGS和GGSGGSGGSGGS。在再其它的实施方式中，间隔体可以包含包括GGSG的基序的4-12个氨基酸，例如，GGSG、GGSGGGSG或GGSGGGSGGGSG。在其它实施方式中，间隔体可以包含(GGGGS)n的基序，其中n是1-10的整数。在其它实施方式中，间隔体也可以包含甘氨酸和丝氨酸以外的氨基酸，例如，GENLYFQSGG、SACYCELS、RSIAT、RPACKIPNDLKQKVMNH、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG、AAANSSIDLISVPVDSR或GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS。在本发明的一些实施方式中，一个或多个12-或20-氨基酸残基肽间隔体可以用于SIRP-α变体构建体中。12-和20-氨基酸残基肽间隔体可以分别包含序列GGGSGGGSGGGS和SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG。在一些实施方式中，包含序列GGSGGGSGGGSGGGSGGS的一个或多个18-氨基酸残基肽间隔体可以用于SIRP-α变体构建体中。
在一些实施方式中，间隔体也可以具有一般结构：
Figure BDA0003213826850000741
其中W是NH或CH2，Q是氨基酸残基或肽，且n是0-20的整数。
XIII.封闭肽与SIRP-α变体的融合
封闭肽(例如，具有表6中的SEQ ID NO:36-46任一序列的基于CD47的封闭肽)可以通过接头(例如，可切割接头(例如，LSGRSDNH(SEQ ID NO:47))和任选地一个或多个间隔体(例如，与接头的N-或C-末端遗传融合的(GGGGS)n，其中n是1-10的整数))与SIRP-α变体的N-或C-末端融合。包括通过可切割接头和一个或多个间隔体与SIRP-α变体融合的基于CD47的封闭肽的SIRP-α变体构建体的示例性序列显示于SEQ ID NO:48-63的序列中。间隔体的长度可以改变以实现基于CD47的封闭肽和SIRP-α变体之间最优化的结合。
XIV.产生SIRP-α变体构建体的方法
本发明的SIRP-α变体构建体可以从宿主细胞产生。宿主细胞是指包括从其相应的核酸表达本文所述的多肽和构建体所需的必要细胞组分(例如，细胞器)的媒介物。核酸可以包括在可以通过本领域中已知的常规技术(例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接微注射等)引入宿主细胞中的核酸载体中。核酸载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。一般地，优选的宿主细胞是原核来源的(例如，细胞)或真核来源的(例如，哺乳动物)。
核酸载体构建和宿主细胞
编码SIRP-α变体构建体的氨基酸序列的多核苷酸序列可以通过本领域已知的多种方法制备。这些包括，但不限于寡核苷酸介导的(或定点的)诱变和PCR诱变。编码本发明的SIRP-α变体构建体的多核苷酸分子可以使用标准技术获得，例如，基因合成。或者，编码野生型SIRP-α的多核苷酸分子可以使用本领域中的标准技术(例如，QuikChangeTM诱变)进行突变以包含特定组氨酸置换。多核苷酸可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成。
编码SIRP-α变体构建体的多核苷酸序列可以插入能够在原核或真核宿主细胞中复制和表达多核苷酸的载体中。许多载体是本领域中可得的且可以用于本发明的目的。各载体可以包含可以针对与特定宿主细胞的相容性进行调节和优化的各种组件。例如，载体组件可以包括，但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点、信号序列、编码本发明的SIRP-α变体构建体的多核苷酸序列和转录终止序列。在一些实施方式中，载体可以包括允许表达多种SIRP-α变体构建体的内部核糖体进入位点(IRES)。细菌表达载体的一些实例包括，但不限于pGEX系列载体(例如，pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P)、pET系列载体(例如，pET-21、pET-21a、pET-21b、pET-23、pET-24)、pACYC系列载体(例如，pACYDuet-1)、pDEST系列载体(例如，pDEST14、pDEST15、pDEST24、pDEST42)及pBR322和其衍生物(参见，例如，U.S.专利No.5,648,237)。哺乳动物表达载体的一些实例包括，但不限于pCDNA3、pCDNA4、pNICE、pSELECT和pFLAG-CMV。其它类型的核酸载体包括用于在细胞(例如，受试者的细胞)中表达蛋白质的病毒载体。这样的病毒载体包括，但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，如改良安卡拉痘苗病毒(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体。
在一些实施方式中，大肠杆菌细胞用作本发明的宿主细胞。大肠杆菌菌株的实例包括，但不限于大肠杆菌294(
Figure BDA0003213826850000761
31,446)、大肠杆菌λ1776(
Figure BDA0003213826850000762
31,537)、大肠杆菌BL21(DE3)(
Figure BDA0003213826850000763
BAA-1025)和大肠杆菌RV308(
Figure BDA0003213826850000764
31,608)。在其它实施方式中，哺乳动物细胞用作本发明的宿主细胞。哺乳动物细胞类型的实例包括，但不限于人胚肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、PC3细胞、Vero细胞和MC3T3细胞。不同宿主细胞具有用于蛋白质产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的蛋白质的正确修饰和加工。上述表达载体可以使用本领域中的常规技术引入合适的宿主细胞中，例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀和直接微注射。一旦载体引入用于产生蛋白质的宿主细胞中，宿主细胞在对于适宜诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因而改进的常规营养培养基中培养。
蛋白质产生、回收和纯化
用于产生本发明的SIRP-α变体构建体的宿主细胞可以在本领域中已知的且适合于培养选择的宿主细胞的培养基中生长。用于细菌宿主细胞的合适培养基的实例包括Luria肉汤(LB)加必要补充剂如选择剂(例如，氨苄青霉素)。用于哺乳动物宿主细胞的合适培养基的实例包括最小必需培养基(MEM)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、补充胎牛血清(FBS)的DMEM和RPMI-1640。
宿主细胞在合适的温度(如约20℃-约39℃，例如，25℃-约37℃)下培养。培养基的pH一般为约6.8-7.4，例如，7.0，主要取决于宿主生物体。如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，蛋白质表达在适合于激活启动子的条件下诱导。
蛋白质回收通常包括破坏宿主细胞，一般是通过如渗透压冲击、超声或裂解的方式。一旦细胞被破坏，细胞碎片可以通过离心或过滤除去。蛋白质可以例如，通过亲和树脂色谱进一步纯化。本领域中已知的标准蛋白质纯化方法可以使用。以下过程是合适纯化程序的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶或阳离子交换树脂上的色谱、SDS-PAGE和凝胶过滤。
或者，SIRP-α变体构建体可以通过受试者(例如，人)的细胞产生，例如，在治疗的情况中，通过施用包含编码SIRP-α变体构建体的核酸分子的载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，如改良安卡拉痘苗病毒(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体)。载体一旦在受试者的细胞内(例如，通过转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接微注射、注射等)，将促进SIRP-α变体构建体的表达，其随后从细胞分泌。
XV.药物组合物和制剂
在一些实施方式中，本发明的药物组合物可以包含一个或多个本发明的SIRP-α变体构建体作为治疗蛋白质。除了治疗量的蛋白质，药物组合物可以包含药学上可接受的载体或赋形剂，其可以通过本领域技术人员已知的方法配制。在其它实施方式中，本发明的药物组合物可以包含编码本发明的一个或多个SIRP-α变体构建体的核酸分子(例如，在载体中，如病毒载体)。编码SIRP-α变体构建体的核酸分子可以克隆到适宜的表达载体中，其可以通过基因治疗中公知的方法递送。
药物组合物中可接受的载体和赋形剂是在所使用的剂量和浓度下对于接受者无毒的。可接受的载体和赋形剂可以包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和TAE，抗氧化剂如抗坏血酸和甲硫氨酸，防腐剂如六甲基氯化铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵，蛋白质如人血清白蛋白、明胶、萄聚糖和免疫球蛋白，疏水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，及碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨醇。本发明的药物组合物可以可注射制剂的形式肠胃外施用。用于注射的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介配制。药学上可接受的媒介包括，但不限于无菌水、生理盐水和细胞培养基(例如，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、α-Modified Eagles Medium(α-MEM)、F-12培养基)。
本发明的药物组合物可以在微胶囊中制备，如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊。本发明的药物组合物也可以在其它药物递送系统中制备，如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊。这类技术描述于Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 20th版(2000)中。用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这容易通过无菌过滤膜的过滤完成。
本发明的药物组合物也可以制备为持续释放制剂。持续释放制备物的合适例子包括包含本发明的SIRP-α变体构建体的固体疏水性聚合物的半渗透基质。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶、聚交酯(polyactides)(U.S.专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解乙烯乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。一些持续释放制剂使得能够在数月(例如，一至六个月)内释放分子，而其它制剂在较短时间内(例如，数天至数周)释放分子。
药物组合物可以按照需要形成单位剂型。包括在药物制剂中的活性成分(例如，本发明的SIRP-α变体构建体)的量使得提供指定范围内的合适剂量(例如，0.01-100mg/kg体重范围内的剂量)。
用于基因治疗的药物组合物可以在合适的稀释剂中，或可以包含基因递送媒介嵌入其中的缓释基质。可以用作体内基因递送媒介的载体包括，但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，如改良安卡拉痘苗病毒(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体。在一些实施方式中，载体可以包括允许表达多种SIRP-α变体构建体的内部核糖体进入位点(IRES)。用于基因递送的其它媒介和方法描述于U.S.专利No.5,972,707,5,697,901和6,261,554中，其各自通过引用全文并入本文中。
产生药物组合物的其它方法描述于，例如，U.S.专利No.5,478,925,8,603,778,7,662,367和7,892,558中，其全部通过引用全文并入本文中。
XVI.施用途径、剂量和时机
包含一个或多个SIRP-α变体构建体作为治疗蛋白质的本发明的药物组合物可以配制用于肠胃外施用、皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、鞘内施用或腹膜内施用。药物组合物也可以配制用于鼻腔、喷雾、口腔、气溶胶、直肠或阴道施用或者通过鼻腔、喷雾、口腔、气溶胶、直肠或阴道施用方式施用。施用治疗蛋白质的方法是本领域中已知的。参见，例如，U.S.专利No.6,174,529,6,613,332,8,518,869,7,402,155和6,591,129及U.S.专利申请公开No.US20140051634,WO1993000077和US20110184145，其公开内容通过引用全文并入本文。这些方法中的一种或多种可以用于施用包含本发明的一个或多个SIRP-α变体构建体的本发明的药物组合物。对于可注射制剂，各种有效药用载体是本领域中已知的。参见，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,Pa.,Banker和Chalmers,eds.,238-250页(1982)及ASHP Handbook onInjectable Drugs,Toissel,4th ed.,622-630页(1986)。
本发明的药物组合物的剂量取决于包括施用途径、待治疗疾病和受试者的身体特征(例如，年龄、体重、一般健康)的因素。通常，单一剂量中包含的本发明的SIRP-α变体构建体的量可以是有效地治疗疾病而不引起显著毒性的量。本发明的药物组合物可以包括范围为0.001-500mg(例如，0.05、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、50mg、100mg、250mg或500mg)的SIRP-α变体构建体的剂量，且在更具体的实施方式中，约0.1-约100mg和在更具体的实施方式中，约0.2-约20mg。剂量可以由医生按照常规因素如受试者的疾病程度和不同参数进行调整。
本发明的药物组合物可以以约0.001mg至最高约500mg/kg/天(例如，0.05、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、50mg、100mg、250mg或500mg/kg/天)的量施用。包含SIRP-α变体构建体的本发明的药物组合物可以每天、每周、每月、每半年、每年或按照医疗需要，例如，一次或多次(例如，1-10次或更多)施用于需要有受试者。剂量可以按照单一或多剂量方案提供。例如，在一些实施方式中，有效量是约0.1-约100mg/kg/天范围的剂量，每天约0.2mg-约20mg的SIRP-α变体构建体，每天约1mg-约10mg的SIRP-α变体构建体，每周约0.7mg-约210mg的SIRP-α变体构建体，每周1.4mg-约140mg的SIRP-α变体构建体，每三天约0.3mg-约300mg的SIRP-α变体构建体，每隔一天约0.4mg-约40mg的SIRP-α变体构建体，和每隔一天约2mg-约20mg的SIRP-α变体构建体。施用之间的时间设定随着医疗状况改善而减少或随着患者健康的下降而增加。
XVII.治疗方法
本发明提供可以用于治疗患有与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病和障碍(如癌症和免疫性疾病)的患者的药物组合物和治疗方法。在一些实施方式中，本文所述的SIRP-α变体构建体可以在增加受试者的靶细胞(例如，癌细胞)的吞噬的方法中施用于受试者。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体可以在消除受试者的调节性T细胞的方法中施用于受试者。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体可以在杀死受试者的癌细胞的方法中施用于受试者。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体可以在治疗受试者的与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的方法中施用于受试者，其中SIRP-α变体构建体相对于非患病细胞上的CD47优先结合患病细胞上或患病部位处的CD47。在一些实施方式中，SIRP-α变体可以在提高受试者的造血干细胞植入的方法中施用于受试者，其中该方法包括调节受试者中的SIRP-α和CD47之间的相互作用。在一些实施方式中，SIRP-α变体构建体可以在改变受试者的免疫反应(即，抑制免疫反应)的方法中施用于受试者。
在一些实施方式中，在治疗受试者的疾病(例如，癌症)之前，受试者中的SIRP-α氨基酸序列被测定，例如，来自编码SIRP-α基因的两个等位基因中的每一个。在本发明的这一方法中，该方法测定来自受试者的生物样品中SIRP-α多肽的氨基酸序列，并随后向受试者施用治疗有效量的SIRP-α变体构建体。在这一方法中，SIRP-α变体构建体中的SIRP-α变体具有与受试者的生物样品中SIRP-α多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列，除了引入以提高SIRP-α变体的亲和力的氨基酸变化。SIRP-α变体构建体在施用后在受试者体内具有最低免疫原性。
本发明的SIRP-α变体构建体和药物组合物可以用于各种癌症治疗中。适合于按照本发明治疗的癌症包括，但不限于实体肿瘤癌症、血液癌症、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、支气管癌、肝癌、卵巢癌、结肠和直肠癌、胃癌、胃部的癌、胆囊癌、胃肠道基质肿瘤癌、甲状腺癌、头颈癌、口咽癌、食管癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、Merkel细胞癌、病毒诱导的癌症、成神经细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤和癌瘤。在一些实施方式中，适合于按照本发明治疗的癌症病症包括转移性癌症。在一些实施方式中，适合于按照本发明治疗的癌症是实体肿瘤或血液癌症。
本发明的SIRP-α变体构建体和药物组合物可以用于各种疗法中以治疗免疫性疾病。在一些实施方式中，免疫性疾病是自身免疫性疾病或炎症性疾病，如多发性硬化、类风湿性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎症或自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、脓毒症、糖尿病、银屑病、动脉粥样硬化、舍格伦综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、子宫内膜异位、肾小球性肾炎、重症肌无力、特发性肺纤维化、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脉管炎或炎症性自身免疫性肌炎。
实施例
实施例1–方法
SIRP-α变体构建体的产生
所有基因构建体使用基因合成产生并针对在哺乳动物细胞中表达进行密码子优化(DNA2.0)。基因克隆到哺乳动物表达载体中并使用CMVa-内含子启动子表达。前导序列在构建体的N-末端工程化以确保对于分泌的适当信号传导和加工。SIRP-α融合蛋白的表达使用Expi293FTM细胞(Life Technologies)进行。这一细胞系适应于在Expi293FTMExpression Medium中的高密度、无血清悬浮培养且能够产生高水平的重组蛋白。转染过程按照制造商的指南进行。上清液通常在转染后5-7天收获。蛋白构建体设计为携带6x组氨酸亲和标签且这允许通过亲和色谱的纯化。柱首先用5mM咪唑、20mM Tris HCl(pH 7.4)、500mM NaCl平衡。表达各种SIRP-α变体构建体的澄清培养基在Avant 25(GE Healthcare)上加载到Hi-Trap Ni Sepharose excel亲和树脂上。进行另一平衡步骤。之后，柱用40mM咪唑、20mM Tris HCl、500mM NaCl洗涤，并随后用250mM咪唑、20mM Tris HCl、500mM NaCl洗脱。包含SIRP-α变体构建体的洗脱的级分合并且随后缓冲液交换到1X PBS中。
SIRP-α蛋白的体外切割
重组人uPA和蛋白裂解酶购自R&D systems。3μM的SIRP-α蛋白如所述的添加到50mM Tris HCl(pH 8.5),0.01％Tween中的相应量uPA和蛋白裂解酶(0.1-44ng)中。消化反应通常在37℃下孵育18-24小时。为终止反应，SDS-PAGE上样染料添加到反应中并在95℃下加热3分钟。为评估切割，消化的样品在4-20％Tris-Glycine SDS-PAGE上分离。
实施例2–特别地在肿瘤组织中激活的SIRP-α变体构建体的设计
目标是设计保持惰性直到局部激活以结合肿瘤组织中的CD47的SIRP-α变体构建体。这将限制SIRP-α与非患病细胞细胞表面上的CD47并防止不希望的“中靶(on-target)”“脱组织(off tissue)”毒性。为生成这样的SIRP-α变体构建体，封闭肽(例如，基于CD47的封闭肽)通过可切割接头与SIRP-α变体遗传融合。探索的封闭肽是基于与SIRP-α的CD47相互作用位点且序列在以下描述((a)-(c)节)。包含GGGGS的重复单元的间隔体设计为侧邻可切割接头，其通常编码蛋白酶识别位点。在一些实施方式中，选择的蛋白酶切割位点是LSGRSDNH，但许多其它蛋白酶切割位点是可能的。蛋白酶切割位点LSGRSDNH由于其对在多种人癌症中上调的许多蛋白酶(例如，蛋白裂解酶(MTSP1)、尿型纤溶酶原激活剂(uPA)、豆荚蛋白、PSA(也称为KLK3,激肽释放酶相关肽酶-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP9、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)和蛋白酶3(Pr3))的敏感性而被选择(Ulisse等,Curr.CancerDrug Targets 9:32-71,2009；Uhland等,Cell.Mol.Life Sci.63:2968-2978,2006；LeBeau等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:93-98,2013；Liu等,Cancer Res.63:2957-2964,2003)。
(a)基于CD47的封闭肽封闭SIRP-α
基于CD47的封闭肽在之前描述。这些肽以不同亲和力结合SIRP-α并阻断其功能。CD47的N-末端对于与SIRP-α的相互作用是重要的，因此，结构分析预测SIRP-α与CD47的C-末端融合。为更好地理解该结果，用不同长度的间隔体对N-末端和C-末端融合进行研究。不同的基于CD-47的封闭肽(例如，表6中列出的肽)用可切割接头和一个或多个间隔体与SIRP-α变体的N-或C-末端融合。包含通过可切割接头和一个或多个间隔体与SIRP-α变体融合的基于CD47的封闭肽的融合蛋白的示例性序列显示于SEQ ID NO:48-56的序列中，其中单下划线部分表示基于CD47的封闭肽，双下划线部分表示可切割接头，和黑体部分表示SIRP-α变体。SEQ ID NO:48-51的序列包含基于CD47的封闭肽(其包括12或21个氨基酸)和2-3个GGGGS重复序列的间隔体。SEQ ID NO:52-56的序列包含基于CD47的封闭肽(其包括具有C15S置换的CD47 IgSF结构域(在VVS处截断))和2-5个GGGGS重复序列或3-6个GGS重复序列的间隔体。另外，在一些实施方式中，HSA可以与SEQ ID NO:48-56中任一序列的C-末端融合。此外，在一些实施方式中，Fc域单体或HSA(SEQ ID NO:68)可以与表10中所列融合蛋白任一的N-或C-末端融合。此外，在一些实施方式中，Fc域单体或HSA可以与表10中所列融合蛋白任一的N-或C-末端融合。
表10
Figure BDA0003213826850000841
Figure BDA0003213826850000851
Figure BDA0003213826850000861
(b)通过具有延长的N-末端的低亲和力CD47突变体封闭SIRP-α变体
由于SIRP-α变体对CD47的高亲和力，有可能在切割接头后，融合蛋白可能不解离且SIRP-α变体可能保持封闭。为解决这一问题，我们研究了SIRP-α-CD47复合物的结构并设计相对于对野生型SIRP-α的结合亲和力具有对于SIRP-α变体的降低的结合亲和力的CD47突变体。因此，在蛋白酶切割接头后，CD47突变体从SIRP-α变体解离。设计的具有延长N-末端的低亲和力CD47突变体在下面描述。进行初步实验将SIRP-α变体与野生型CD47融合。这些包括SIRP-α变体和野生型CD47或CD47突变体的SIRP-α变体构建体在体内切割，通过SDS-page进行分析以确保切割，和通过biacore测量以观察其与CD47结合的能力(即，在切割的CD47从SIRP-α变体解离后SIRP-α变体与野生型CD47的结合)。如果包含与野生型CD47融合的SIRP-α变体的初始SIRP-α变体构建体能够在蛋白酶切割之前阻断CD47结合且能够在蛋白酶切割之后结合CD47，则CD47突变体可能不是需要的。如果这些初始SIRP-α变体构建体是失活的(即，可以被切割但由于缺乏解离而在蛋白酶切割之后不结合CD47)，则测试包含与低亲和力CD47突变体融合的SIRP-α变体的其它融合蛋白。
CD47:SIRP-α(PDB:4KJY,4CMM)的共结晶结构中，CD47的N-末端作为焦谷氨酸存在并与SIRP-α变体的Thr66和野生型SIRP-α的Leu66形成氢键相互作用(图1)。假设的是通过添加氨基酸(例如，甘氨酸)延长CD47的N-末端阻止谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，且因此很可能破坏与Thr66或Leu66的氢键相互作用和扰乱CD47与SIPR-α的结合。包含低亲和力CD47IgSF结构域突变体和SIRP-α变体的融合蛋白的序列显示于表11的SEQ ID NO:57-59中，其中单下划线部分表示相对于表6中的SEQ ID NO:46包含氨基酸1-118和C15S的低亲和力CD47 IgSF结构域突变体，双下划线部分表示可切割接头，和黑体部分表示SIRP-α变体。SEQID NO:x10-x12也包括3-5个GGGGS重复序列的间隔体。可以设计并表达类似于SEQ ID NO:x10-x12的序列，其中低亲和力CD47 IgSF结构域突变体通过可切割接头和一个或多个间隔体与SIRP-α变体的C-末端融合。此外，在一些实施方式中，Fc域单体或HSA可以与表11中所列的任一融合蛋白的N-或C-末端融合。
表11
Figure BDA0003213826850000881
Figure BDA0003213826850000891
(c)通过具有氨基酸置换的低亲和力CD47 IgSF结构域突变体阻断SIRP-α
CD47结合于SIRP-α的深口袋(PDB代码:4KJY和4CMM)。已经进行计算机建模以鉴定CD47的口袋区中的氨基酸残基，其在突变时将降低CD47对SIRP-α变体的结合亲和力，但保持CD47对野生型SIPR-α的结合亲和力。鉴定的CD47残基是L101Q、L101H、L101Y、T102Q和T102H。假设包含这些置换之一的低亲和力CD47 IgSF结构域突变体能够有效地封闭SIRP-α变体在束缚模式(tethered mode)中。但是，在到达肿瘤部位并在接头处被蛋白酶局部切割时，低亲和力CD47 IgSF结构域突变体从SIRP-α变体解离以结合野生型SIRP-α，从而留下游离的SIRP-α变体以结合肿瘤细胞表面上的CD47。解离的低亲和力CD47 IgSF结构域突变体现在可以阻断野生型SIRP-α的活性。这将潜在地导致来自释放的低亲和力CD47 IgSF结构域突变体和SIRP-α变体的增强的双重阻断活性。为表明如何选择氨基酸残基及这可以如何产生野生型SIRP-α和SIRP-α变体的差异阻断的原理，实例使用野生型SIRP-α的Ala27显示(图2)。例如，野生型SIRP-α的Ala27是比SIRP-α变体中的Ile27小的残基。因此，通过将野生型CD47中的Thr102突变为较大氨基酸如Gln102，低亲和力CD47 IgSF结构域突变体中的Gln102可以在相应的相互作用位点处与SIRP-α变体体中的Ile27产生空间冲突。但是，具有Thr102Gln置换的CD47突变体与具有Ala27的野生型SIRP-α之间的相互作用被保持。因此，CD47突变体将具有对SIRP-α变体的低结合亲和力和对野生型SIRP-α的相对较高结合亲和力。一些示例性低亲和力CD47 IgSF结构域突变体的序列显示于表6中的SEQ ID NO:41-45中。包含具有氨基酸置换的低亲和力CD47 IgSF结构域和SIRP-α变体的SIRP-α变体构建体的序列显示于表12中的SEQ ID NO:60-63中，其中单下划线部分表示分别包含氨基酸置换L101Q、L101Y、T102Q和T102H的低亲和力CD47IgSF结构域突变体，双下划线部分表示可切割接头，和黑体部分表示SIRP-α变体。SEQ ID NO:60-63也包括3-5个GGGGS重复序列的间隔体。可以设计并表达类似于SEQ ID NO:60-63的序列，其中低亲和力CD47 IgSF结构域突变体通过可切割接头和一个或多个间隔体与SIRP-α变体的C-末端融合。
表12
Figure BDA0003213826850000901
Figure BDA0003213826850000911
实施例3–表达和产生SIRP-α变体构建体用于体外研究
包括SIRP-α变体和基于CD47的封闭肽的各种SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:48-56)在Expi293-F哺乳动物细胞中表达。所有构建体设计有使得它们能够作为分泌蛋白质表达到培养基中的前导序列。作为展现分离的SIRP-α变体构建体的蛋白质谱的实例，SEQ IDNO:48-56的SIRP-α变体构建体的SDS-PAGE分析显示于图3中。例如，图3A显示SEQ ID NO:48-56的SIRP-α变体构建体的还原的SDS-PAGE凝胶和图3B显示SIRP-α变体构建体的非还原SDS-PAGE凝胶。尺寸排阻数据表明SIRP-α变体构建体不聚集(数据未显示)。
实施例4–SIRP-α和CD47融合蛋白的体外切割
为确定SIRP-α变体构建体(例如，SEQ ID NO:48-63)是否特别地在肿瘤组织处体内切割，使用蛋白酶uPA和蛋白裂解酶(其通常已知在癌症中上调)进行体外实验以切割SIRP-α变体构建体。初步实验使用SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:54)进行以确定蛋白酶可切割性并优化切割条件。图4A显示测试uPA和蛋白裂解酶的可切割性的结果。3μM SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:54)在37℃下使用过量uPA或蛋白裂解酶孵育18hr。图4A的道1显示未添加蛋白酶的对照实验且道2和3显示SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:54)分别与uPA和蛋白裂解酶的孵育。如图4A中所示获得的数据清楚地证明SIRP-α变体构建体(SEQ ID No:54)可以通过在37℃下用过量uPA和蛋白裂解酶消化SIRP-α变体构建体18hr而体外切割和释放。切割的SIRP-α变体作为～17KDa分子量条带迁移。切割的CD47以大约36-40kDa的拖尾条带迁移，最可能由于糖基化。通过比较图4A的道2和3中未切割SIRP-α变体构建体的量，表现为与使用uPA相比使用蛋白裂解酶实现了更完全的切割。
因此，切割条件的进一步优化仅使用蛋白裂解酶进行且结果显示于图4B中。测试不同量的蛋白裂解酶且在37℃下进行切割18hr。图4B的道1显示不添加蛋白裂解酶的对照实验且道2-4各显示分别用44ng、0.44ng和0.167ng的蛋白裂解酶进行的切割。获得的数据表明0.44ng酶在当前条件下足够用于完全切割。接着，我们使用优化的切割条件测试其余SIRP-α变体构建体的切割。作为实例和显示于图4C中，相应SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:57-63)使用优化的切割条件在体外通过蛋白裂解酶成功地切割。图4C中的道1-7分别对应于SEQ ID NO:57-63的未切割融合蛋白。图4C的道8-14分别对应于用蛋白裂解酶切割的SEQID NO:57-63的融合蛋白。
实施例5–SIRP-α变体构建体的结合亲和力
人CD47-hFc(R&D Systems,目录号4670-CD)与SIRP-α变体构建体的结合使用补充有0.01％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)作为运行缓冲液在Biacore T100仪器(GEHealthcare)上进行分析。
370共振单位(RU)的CD47-hFc通过标准胺偶联固定在CM4传感芯片(GEHealthcare)的流动池2上。流动池1用EDC/NHS活化并封闭(用乙醇胺)以用作参比。所有SIRP-α变体构建体以30μL/min的流速在50nM或100nM下注射两分钟，且接着十分钟的解离时间。在各次注射后，表面使用Pierce IgG洗脱缓冲液(Life Technologies,目录号21004)和4M NaCl的2:1混合物再生。表面的完全再生通过在实验开始和结束时注射SIRP-α变体来确认。所有传感图使用流动池1和缓冲液注射双重参比。
对于所有样品，测定50秒的解离后100nM下的结合信号，通过SIRP-α变体构建体的分子量标准化，并表示为最大结合反应的百分比。100nM的SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)按照其MW标准化的结合用作最大结合反应。图5A中的结果显示SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:48-51)不阻断SIRP-α变体与芯片上的CD47结合。在接头切割后，结合活性适度地提高。SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:52-54)有效地阻断SIRP-α变体与芯片上的CD47的结合。但是，在接头切割后，SIRP-α变体与芯片上的CD47的结合活性仅适度地提高，表明SIRP-α变体和CD47的IgSF结构域之间相互作用的高亲和力将复合物保持在一起并因此CD47的IgSF结构域甚至在接头切割后继续封闭SIRP-α变体。令人惊异地，当CD47的IgSF结构域与SIRP-α(SEQ ID NO:55)的C-末端融合时，完整SIRP-α变体构建体有效地阻断与芯片上的CD47的结合(与SEQ ID NO:52-54的融合蛋白相同)，但接头的切割恢复SIRP-α变体与芯片上的CD47的100％结合，表明在接头切割后CD47的IgSF结构域与SIRP-α变体解离。因此，SIRP-α变体游离以结合芯片上的CD47。CD47与SIRP-α变体的C-末端融合的另一构建体随后测试(参见图5B)。这一构建体(SEQ ID NO:56)(其包含较长间隔体)也在切割后恢复活性，确认将基于CD47的封闭肽的N-末端与SIRP-α变体的C-末端连接的一般途径获得其中基于CD47的封闭肽有效地封闭SIRP-α变体并在切割可切割接头后解离的SIRP-α构建体。
为进一步检验SIRP-α变体构建体的结合亲和力，SEQ ID NO:52-63的SIRP-α变体构建体按照之前描述的相同方案在Biacore仪上分析。SEQ ID NO:52-54的SIRP-α变体构建体包含通过可切割接头LSGRSDNH和不同长度的多个间隔体与SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)的N-末端融合的相对于野生型CD47(SEQ ID NO:35)具有氨基酸1-117和C15S的CD47 IgSF结构域。SEQ ID NO:55和56的SIRP-α变体构建体包含通过可切割接头LSGRSDNH和不同长度的多个间隔体与SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)的C-末端融合的相对于野生型CD47(SEQ IDNO:35)具有氨基酸1-117和C15S的CD47 IgSF结构域。SEQ ID NO:57-59的SIRP-α变体构建体包含通过可切割接头LSGRSDNH和不同长度的多个间隔体与SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)的N-末端融合的相对于表6中的SEQ ID NO:46具有氨基酸1-118和C15S的CD47 IgSF结构域。SEQ ID NO:60-63的SIRP-α变体构建体包含通过可切割接头LSGRSDNH和不同长度的多个间隔体与SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)的N-末端融合的分别具有表6中的SEQ ID NO:41、42、44和45的氨基酸1-117的CD47 IgSF结构域。
图5B显示SEQ ID NO:55和56的SIRP-α变体构建体在接头切割之前有效地阻断与芯片上CD47的结合，但接头的切割恢复100％的结合活性。对于SEQ ID NO:57-63的SIRP-α变体构建体观察到相似的结果。我们观察到，通过对基于CD47的封闭肽的N-末端延长一个甘氨酸残基产生在接头被切割之前有效阻断CD47结合活性和随后在蛋白酶处理后恢复接近100％的CD47结合活性的SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:57-59)，证明在接头切割后基于CD47的封闭肽与SIRP-α变体解离。
这一结果表明通过可切割接头和间隔体与基于CD47的封闭肽的N-末端融合的SIRP-α变体良好地发挥作用。可切割接头稳定融合复合物并在切割时，基于CD47的封闭肽(其包括连接于基于CD47的封闭肽的N-末端的可切割接头的片段)的延长的N-末端阻止基于CD47的封闭肽与SIRP-α变体的结合。通过在CD47-封闭肽的N-末端处经由可切割接头和一个或多个间隔体将具有一个或多个氨基酸添加(例如，一个甘氨酸添加)的基于CD47的封闭肽(例如，表6中SEQ ID NO:46的序列)与SIRP-α变体的C-末端融合而获得相同的效应。这种相同的效应也通过经由可切割接头和一个或多个间隔体将具有一个或多个氨基酸置换(例如，L101Q、L101Y、L101H、T102Q或T102H)的基于CD47的封闭肽(例如，表6中SEQ ID NO:41-45的序列)与SIRP-α变体的C-末端融合观察到。我们证明基于CD47的封闭肽可以与SIRP-α变体的C-末端融合并可以在接头切割之前阻断SIRP-α变体与CD47结合并在接头切割后释放SIRP-α变体(参见，例如，图5A中的SEQ ID NO:55及图5B中的SEQ ID NO:55和56)。
基于这一信息，我们可以通过选择定向(例如，N-或C-末端融合)产生CD47-封闭的SIRP-α变体的融合蛋白，即，将Fc域单体或HSA与SIRP-α变体融合，其在产物的药代动力学、效力、安全性、产量和稳定性方面产生更好的结果。
实施例6-SIRP-α变体通过抗体结合肽的特异性靶向
首先，我们使用西妥昔单抗(Absolute Antibody,Ab00279-10.0)(其已知包含对于具有SEQ ID NO:64和65的序列的DLP的结合位点)以检验包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体是否能够在结合的抗体上集中。我们使用EDC/NHS化学作用将西妥昔单抗固定在CM4 biacore芯片(2000RU)上并使用PBS 0.01％P20作为运行和样品缓冲液以30μL/min将100nM和50nM的SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)流动到芯片(biacore T100)上。这一SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)设计为具有在N-和C-末端连接的两个DLP序列。图6显示SIRP-α变体构建体(而非单独的SIRP-α变体)结合到芯片上。我们然后注射CD47-ECD并在其中使用SIRP-α变体构建体的情况中看到CD47的结合，证明SIRP-α变体构建体可以同时结合EGFR和CD47(图6)。因此，注射于癌症患者的包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体在其中治疗性抗体(例如，西妥昔单抗)累积的位点集中，从而提高效力和降低毒性。
其次，我们证明包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体可以首先结合与EGFR结合的西妥昔单抗，且然后结合CD47。结合复合物的示意图显示于图7A中。我们使用EDC/NHS化学作用将3000RU的hrEGFR-Fc(R&D Systems)固定于CM4芯片。使用PBS 0.01％P20作为样品和运行缓冲液(biacore T100)，我们以30μL/min注射不同浓度(4、20和100nM)的西妥昔单抗。观察到西妥昔单抗与固定的hrEGFR-Fc的结合。我们然后注射100nM的SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)并观察结合。在变体单独注射时没有观察到结合。我们然后注射100nM的CD47-ECD并观察结合。数据显示于图7B和7C中。因此，我们证明四元复合物EGFR-西妥昔单抗-SEQ ID NO:66的SIRP-α变体构建体-CD47的形成是可能的。包括SIRP-α变体和DLP的SIRP-α变体构建体能够在构建体通过特异性地结合肿瘤特异性抗体(例如，西妥昔单抗)而在患病部位预浓缩时结合和抑制CD47。此外，按照相同的概念，包括SIRP-α变体、DLP和基于CD47的封闭肽的SIRP-α变体构建体也能够在构建体通过特异性地结合肿瘤特异性抗体(例如，西妥昔单抗)而在患病部位预浓缩时结合和抑制CD47。
实施例7–吞噬分析
SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)(其包括通过间隔体连接于DLP的SIRP-α变体)和SIRP-α变体(SEQ ID NO:31)在DLD1细胞的吞噬分析中测试(图8)。吞噬分析使用从Weiskofp等,Science341:88-91,2013中描述的方法改进的方法进行。
来自无名供体的血沉棕黄层从Stanford Blood Center获得，且外周血单核细胞通过在Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare)上的密度梯度离心富集。单核细胞使用Macs Miltenyi Biotec Monocyte Isolation Kit II按照制造商的说明进行纯化。这是用于从人PBMC分离单核细胞的间接磁性标记系统。分离的单核细胞通过在补充有10％热灭活的人AB血清及1％GlutaMax和1％青霉素和链霉素(GIBCO Life Technologies)的RPMI1640培养基中培养6-10天分化成巨噬细胞。对于吞噬分析，100,000GFP+DLD-1细胞接种到超低粘附U形底96孔板(Corning 7007)的孔上。50μL/孔的4μg/ml IgG1k同种型或4μg/ml西妥昔单抗(Absolute Antibody,Ab00279-10.0)添加到DLD-1肿瘤细胞并在室温下预孵育30分钟。之后，添加50μL/孔的SIRP-a变体且50μL/孔巨噬细胞(1x106/ml)(50,000巨噬细胞)也添加到各孔。抗体和SIRP-α构建体样品的最终稀释度是1:4。西妥昔单抗最终浓度是1μg/ml。巨噬细胞、肿瘤细胞、抗体和SIRP-a变体构建体的共培养在37℃下进行2小时。为了进行分析，细胞样品被固定、染色和通过BD FACS Canto分析。原代人巨噬细胞使用抗-CD14、抗-CD45或抗-CD206抗体(BioLegend)通过流式细胞术鉴定。死细胞通过用DAPI(Sigma)染色从分析排除。吞噬评估为GFP+巨噬细胞的百分比并针对各细胞系对于各单独供体的最大反应标准化。
吞噬试验的结果显示于图8中。如所示的，与西妥昔单抗组合的SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)在诱导DLD-1细胞的吞噬方面显示出比与西妥昔单抗组合的单独SIRP-α变体(SEQ ID NO:47)更高的效能。这推测通过我们已经概念化的机制发挥作用且这可能是由于SIRP-α变体构建体(SEQ ID NO:66)和西妥昔单抗在患病细胞上的更高累积。
实施例8–建模SIRP-α变体与CD47的pH依赖性的结合
为对本发明SIRP-α变体的pH-依赖性的结合工程化，可以对SIRP-α进行组氨酸诱变，特别是与CD47相互作用的SIRP-α的区域。SIRP-α和CD47复合体的晶体结构(参见，例如，PDB ID No.2JJS)和计算建模可以用于可视化SIRP-α和CD47的三维结合位点。可用于设计具有pH-敏感的结合特性的蛋白质的计算设计和建模方法是文献中已知的且描述于，例如，Strauch等，Proc Natl Acad Sci 111:675-80,2014，其通过引用全文并入本文中。在一些实施方式中，计算建模可以用于鉴别SIRP-α和CD47的界面处的关键接触残基。鉴别的关键接触残基可以使用可得的蛋白质设计软件(例如，RosettaDesign)以组氨酸残基进行置换，该蛋白质设计软件可以产生可基于计算的结合能量和形状互补性进行优化、过滤和分级的各种蛋白质设计。因此，在某些氨基酸残基位置处能量有利的组氨酸置换可以使用计算设计方法鉴别。计算建模也可以用于预测SIRP-α的三维结构中的变化。可以避免产生SIRP-α三维结构的显著变化的组氨酸置换。
一旦鉴别能量和结构上最佳的氨基酸置换，氨基酸可以系统性地用组氨酸残基置换。在一些实施方式中，SIRP-α的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20)氨基酸可以用组氨酸残基置换。特别地，位于SIRP-α和CD47的界面处的氨基酸，优选地，直接参与SIRP-α与CD47的结合的氨基酸，可以用组氨酸残基置换。本发明的SIRP-α变体可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)组氨酸残基置换。在其它实施方式中，SIRP-α的天然存在的组氨酸残基可以用其它氨基酸残基置换。在再其它的实施方式中，SIRP-α的一个或多个氨基酸可以用非组氨酸残基置换以影响天然存在的或置换的组氨酸残基与CD47的结合。例如，用其它氨基酸置换天然存在的组氨酸残基周围的氨基酸可以“包埋”天然存在的组氨酸残基。在一些实施方式中，不直接参与与CD47的结合的氨基酸，即，内部氨基酸(例如，位于SIRP-α的核心的氨基酸)也可以用组氨酸残基置换。表4列出了可以用组氨酸置换的特定SIRP-α氨基酸。接触残基是位于SIRP-α和CD47的界面处的氨基酸。核心残基是不直接参与SIRP-α和CD47之间的结合的内部氨基酸。本发明的SIRP-α变体可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，或所有)表4中列出的置换。
实施例9–生成和筛选具有与CD47的pH-依赖性的结合的SIRP-α变体
包含一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等，最多20个)用组氨酸残基置换的氨基酸置换的SIRP-α变体可以使用常规的分子克隆和蛋白质表达技术产生。编码本发明的SIRP-α变体的核酸分子可以使用公知的分子生物学技术克隆到对于在细菌中表达优化的载体中。然后载体可以转化到细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)中，该细胞可以在诱导蛋白质表达之前生长到最佳密度。在诱导蛋白质表达(即，使用IPTG)后，细菌细胞可以允许再生长24小时。可以收集细胞，且表达的SIRP-α变体蛋白可以使用，例如，亲和柱色谱从细胞培养上清液纯化。纯化的SIRP-α变体可以通过SDS-PAGE进行分析，接着进行考马斯亮蓝染色以确认预期大小的蛋白质条带的存在。
纯化的SIRP-α变体可以使用本领域中可得的技术，例如，噬菌体展示、酵母展示、表面等离子体共振、闪烁迫近分析法、ELISA,ORIGEN免疫分析(IGEN)、荧光猝灭和/或荧光转移，筛选与CD47的pH-依赖性的结合。结合也可以使用合适的生物测定进行筛选。所需的SIRP-α变体在酸性pH(例如，低于pH 7(例如，pH 6))相对于中性pH(例如，pH 7.4)以更高亲和力结合CD47。pH 6下SIRP-α/CD47复合体的KD低于pH 7.4下SIRP-α/CD47复合体的KD。
实施例10–小鼠中测试具有与CD47的pH-依赖性结合的SIRP-α变体
各种癌症(例如，实体肿瘤和血液癌症)的遗传工程化小鼠模型可以用于测试小鼠模型中本发明SIRP-α变体与患病部位处的CD47的pH-依赖性的结合。SIRP-α变体可以直接或间接地注射到小鼠中的患病部位，该小鼠可以随后解剖以检测SIRP-α变体与患病部位的CD47的复合物的存在。对于SIRP-α变体或CD47特异性的抗体可以用于检测中。
其它实施方式
以上说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请由此通过引用并入。所描述的本发明组合物和方法的各种改进和变化对于本领域技术人员是清楚的而不脱离本发明的范围和精神。虽然本发明结合特定实施方式进行描述，但应理解所要求保护的本发明不应过度限制于这样的特定实施方式。事实上，本领域技术人员显而易见的对于所描述的用于实施本发明的模式的各种改变想要在本发明的范围内。其它实施方式在以下权利要求内。

Claims (12)

1.一种包含连接于抗体结合肽的SIRP-α变体的构建体，其中
所述SIRP-α变体包含以下所示的氨基酸序列：EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:13)，其中X1是L、I或V，X2是V、L或I，X3是A或V，X4是A、I或L，X5是I、T、S或F，X6是E、V或L，X7是K或R，X8是E或Q，X9是H、P或R，X10是L、T或G，X11是K或R，X12是N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，X13是P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，X14是V或I，X15是F、L或V，和X16是F或V；或
其中所述SIRP-α变体与SEQ ID NO:3-12和24-34中任一项的序列具有至少80％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的构建体，其中所述抗体结合肽(a)可逆地或不可逆地结合抗体的恒定区；(b)可逆地或不可逆地结合抗体的抗原结合片段(Fab)区；或(c)可逆地或不可逆地结合抗体的可变区。
3.如权利要求1所述的构建体，其中所述抗体结合肽结合肿瘤特异性抗体。
4.如权利要求1-3任一项所述的构建体，其中所述抗体结合肽结合西妥昔单抗。
5.如权利要求1-4任一项所述的构建体，其中所述抗体结合肽与SEQ ID NO:64或SEQID NO:65具有至少75％的氨基酸序列同一性，任选地其中所述抗体结合肽包含SEQ ID NO:64。
6.一种编码权利要求1-5任一项所述的构建体的核酸。
7.一种包含权利要求6所述的核酸的载体。
8.一种包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的载体的宿主细胞。
9.一种制备权利要求1-6任一项所述的构建体的方法，包括：
a)在产生所述构建体的条件下培养权利要求8所述的宿主细胞；和
b)回收由所述宿主细胞产生的所述构建体。
10.一种药物组合物，其包含：a)治疗有效量的权利要求1-6任一项所述的SIRP-α变体构建体，和b)药学上可接受的赋形剂。
11.权利要求1-6任一项所述的SIRP-α变体构建体或权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中与SIRP-α和/或CD47活性相关的疾病的药物中的用途。
12.权利要求1-6任一项所述的SIRP-α变体构建体或权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，任选地所述癌症选自实体肿瘤癌症、血液癌症、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、支气管癌、肝癌、卵巢癌、结肠和直肠癌、胃癌、胃部的癌、胆囊癌、胃肠道基质肿瘤癌、甲状腺癌、头颈癌、口咽癌、食管癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、Merkel细胞癌、病毒诱导的癌症、成神经细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤和癌瘤。
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