KR20200133376A - 신호-조절 단백질 알파에 대한 항체 및 사용 방법 - Google Patents

신호-조절 단백질 알파에 대한 항체 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

특히, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 단리된, 인간화 항체가 본원에서 제공된다. 또한 이에 관련된 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및 생산 방법 그리고 용도가 제공된다.

Description

신호-조절 단백질 알파에 대한 항체 및 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 본원에 그의 전체가 참고로 포함된, 2018년 3월 21일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제62/646,210호의 우선권 이익을 주장한다.
ASCII 텍스트 파일에 대한 서열목록 제출
ASCII 텍스트 파일 상의 하기 제출 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 757972000640SEQLIST.txt, 기록일: 2019년 3월 19일, 크기: 230 KB).
기술분야
본 발명은 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인(예를 들면, D1 도메인)에 결합하는 단리된 인간화된 항체뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주세포 및 이에 관련된 방법에 관한 것이다.
신호-조절 단백질 알파(SIRP-α)는 면역계의 조절에 중요한 역할을 하는 세포-표면 수용체 계열의 일부이다(예를 들면, Barclay, A.N. 및 Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457-64 참고). SIRP-α는 백혈구, 예컨대 수지상 세포, 호산구, 중성구 및 대식세포를 포함하는 다양한 세포의 표면 상에서 발현된다. SIRP-α는 리간드와 같은 외부 자극과 상호작용하는 세포외 도메인 및 다양한 세포내 신호를 매개하는 세포내 도메인을 포함한다.
SIRP-α의 주요 역할 중 하나는 CD47과의 상호작용을 통한 면역 반응의 조절이다. CD47은 다양한 세포 유형의 표면 상에서 발현된다. CD47의 IgSF 도메인이 면역 세포(예를 들면, 대식세포) 상에 발현된 SIRP-α의 세포외 도메인(예를 들면, D1 도메인)에 결합하면, 면역 세포에서 SIRP-α-매개된 신호를 도입하여, CD47-발현 세포의 식균작용을 방해한다. 따라서, CD47은 건강한 세포의 식균작용을 방해하는 면역계에 대하여 일명 "나를 먹지 마시오(don't eat me)" 신호를 전달하는 역할을 한다(예를 들면, WO2015/138600 및 Weiskopf, K. 등 (2013) Science 341: 88-91 참고). 그러나, CD47은 다양한 암에 의해 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 측면에서 그의 SIRP-α와의 상호작용은 면역 감시, 및 종양이 대식세포에 의한 식균작용을 회피하기 위해 건강한 "나를 먹지 마시오" 신호를 모방할 수 있다고 생각한다(예를 들면, Majeti, R. 등 (2009) Cell 138:286-99; Zhao, X.W. 등 (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108:18342-7 참고). 이와 같이, 이러한 상호작용을 차단하는 항체가 매우 바람직하다.
SIRP-α는 인간, 원숭이 및 마우스에서 고도의 다형성 단백질로 알려져 있다. 예를 들면, NOD 및 C57BL/6 마우스 균주에서 SIRP-α 단백질 사이에 다형성 차이가 확인되었으며, 이러한 다형성은 CD47 결합 및 이들 마우스 균주에서 인간 조혈 줄기 세포의 생착과 관련된 기능적 결과를 초래한다. 인간에서, SIRPA 유전자의 2종의 주된 대립유전자가 보고되었다(Treffers, LW. 등 (2018), Eur. J. Immunol. 48:344-354, Zhao, X. 등 (2011), PNAS. 108:18342-47; van der Heijden, J. (2014). 인간 Fc 감마 수용체의 유전적 변형: 다형성 및 복제수 변형의 기능적 결과(박사 논문)).
정상 면역 기능 및 종양 형성에서의 SIRP-α-CD47 상호작용의 중요성으로 인해, 인간 SIRP-α을 결합시키는 항체의 확인은 임상 후보물질의 개발에서 큰 관심을 끈다.
특허 출원, 특허 공보, 비-특허 문헌 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은, 각각의 개별적인 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되도록 지시된 것처럼, 전체적으로 참고로 포함된다.
이들 및 다른 필요에 부합하기 위해, 특히, 인간 SIRP-α 변이체 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 단리된 항체가 본 명세서에 제공된다. 유리하게는, 이들 항체는 고친화도로의 여러 SIRP-α 폴리펩타이드에 대한 결합, 여러 포유류 SIRP-α 폴리펩타이드(예를 들면, 인간 v1, 인간 v2, 사이노몰구스, 및/또는 여러 쥣과 SIRP-α 단백질)에 대한 교차 반응성, 대식세포 식균작용을 강화시키는 능력, 수지상 세포 활성화를 강화시키는 능력, 및/또는 CD47을 발현하는 종양의 생체내 성장을 억제하는 능력과 같이 하나 이상의 여러 유용한 시험관내 및/또는 생체내 특성을 보유한다. 또한, 본 개시는 탈아미드화 또는 당화에 의해 변형될 수 있는 잔기와 같은, 잠재적인 책임을 제거하도록 조작된 변이체 경쇄를 갖는 항체를 제공하여, 제조, 보관, 및/또는 약물 개발을 위해 보다 바람직한 특징을 갖는 항체를 생성한다.
특정 양태에서, 본 개시는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 항체(예를 들면, 단리된 항체)를 제공하며, 여기서 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 중쇄; 및 식 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이고, 여기서 VL 도메인은 서열번호:25의 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 있어서, VL 도메인은 서열번호:39-41로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 식 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSX4X5KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호:72)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변(CL) 도메인 서열을 추가로 포함하며, 식 중 X4X5는 ND, DN, DS, 또는 SD이다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 서열번호:43-46으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 경쇄 불변(CL) 도메인 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 카파 경쇄 불변(CL) 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 람다 경쇄 불변(CL) 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 서열번호:37 또는 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 경쇄는 서열번호:48-57로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 항체는 scFv-Fc, 단일 도메인 항체, 단일 중쇄 항체, 또는 단일 경쇄 항체이다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 IgG1 Fc 영역, IgG2 Fc 영역, 및 IgG4 Fc 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 아미노산 위치 넘버링이 EU를 따르는, L234A, L235A, 및 G237A 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 아미노산 위치 넘버링이 EU를 따르는, A330S 및 P331S 치환을 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 아미노산 위치 넘버링이 EU를 따르는, N297A 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 아미노산 위치 넘버링이 EU를 따르는, N297A 치환을 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이며, 여기서 중쇄는 아미노산 위치 넘버링이 EU를 따르는, S228P 치환을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:31-35로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:33, 34, 및 137로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:132-139로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:58-62로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:60, 61, 및 129로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:124-131로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에 있어서, 본 개시는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 항체(예를 들면, 단리된 항체)를 제공하며, 여기서 중쇄는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에 있어서, 본 개시는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 항체(예를 들면, 단리된 항체)를 제공하며, 여기서 중쇄는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:129의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:124의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 중쇄는 서열번호:124의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현하는 대식세포에 의한 식균작용을 강화시킨다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현하는 수지상 세포의 활성화를 강화시킨다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 CD47을 발현하는 종양의 생체내 성장을 억제한다.
상기 구현예 중 임의의 일부 구현예에서, 항체는 제제, 예를 들면, 세포독성제, 표지, 또는 면역계를 조절하는 모이어티에 접합된다.
상기 구현예 중 임의의 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 본 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 암 세포에 의해 발현된 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 세포에 의해 발현된 항원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, 뮤신 1, 뮤신 16, PD-L1, PTK7, STEAP1, 엔도텔린 B 수용체, 메소텔린, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, 넥틴 4, NaPi2b, LIV-1A, 구아닐릴 사이클라제 C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나스신, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, 뮤신, CAIX, EPHA3, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, 및 NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, MAGE 계열 단백질, MAGE-A3, gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙한 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-카테닌, TGF-βRII, HPV E6, 또는 HPV E7로부터의 펩타이드를 포함하는 MHC/펩타이드 복합체. 일부 구현예에 있어서, 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 면역 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 면역 세포에 의해 발현되는 항원은 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-15, FGL-1, CD200, CD200R, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, 아르기나제, IDO, TDO,　AhR, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, TGF-βRI, TGF-βRII, c-Kit, CD244, L-셀렉틴 /CD62L, CD11b, CD11c, CD68, 41BB,　CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, TNFR2, PVRIG, DNAM, 및 ICOS로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 자연 살해(NK) 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, NK 세포에 의해 발현되는 항원은 NKR-P1A, CD94, KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DS1, CD94, NKG2D, CD160, CD16, NKp46, NKp30, NKp44, DNAM1, CRTAM, CD27, NTB-A, PSGL1, CD96, CD100, NKp80, SLAMF7, 및 CD244로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 측면에 있어서, 본 개시는 상기 구현예 중 임의의 하나에 따른 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 측면에 있어서, 본 개시는 상기 구현예 중 임의의 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 측면에 있어서, 본 개시는 상기 구현예 중 임의의 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 측면에 있어서, 본 개시는 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 구현예 중 임의의 하나에 따른 숙주 세포를 항체가 생산되도록 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시는 개체에서 암을 치료하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공하되, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 구현예 중 임의의 하나에 따른 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 암 세포에 의해 발현된 항원에 결합하는 제2 항체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 암에 의해 발현된 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, 뮤신 1, 뮤신 16, PTK7, STEAP1, 엔도텔린 B 수용체, 메소텔린, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, 넥틴 4, NaPi2b, LIV-1A, 구아닐릴 사이클라제 C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나스신, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, 뮤신, CAIX, EPHA3, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, 및 NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, MAGE 계열 단백질, MAGE-A3, gp100/pmel17, 멜란-A/MART-1, gp75/TRP1, 티로시나제, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, 미성숙한 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, 서바이빈, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-카테닌, TGF-βRII, HPV E6, 또는 HPV E7로부터의 펩타이드를 포함하는 MHC/펩타이드 복합체로 구성된 군으로부터 선택된다. . 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 개체에게 면역치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역치료제는 제2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항체는 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-15, FGL-1, CD200, CD200R, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, 아르기나제, IDO, TDO,　AhR, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, TGF-βRI, TGF-βRII, c-Kit, CD244, L-selectin/CD62L, CD11b, CD11c, CD68, 41BB,　CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, TNFR2, PVRIG, DNAM, 및 ICOS로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 제2 항체는 PD-1에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 제2 항체는 PD-L1에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 면역치료제는 백신, 종양용해 바이러스, 차용 세포 치료법, 사이토카인, 또는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 방법은 자연 살해(NK) 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, NK 세포에 의해 발현되는 항원은 NKR-P1A, CD94, KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DS1, CD94, NKG2D, CD160, CD16, NKp46, NKp30, NKp44, DNAM1, CRTAM, CD27, NTB-A, PSGL1, CD96, CD100, NKp80, SLAMF7, 및 CD244로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 방법은 화학치료제 또는 소분자 항암제의 유효량을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 방법은 표적화된 소분자 억제제의 유효량을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 표적화된 소분자 억제제는 VEGFR 및/또는 PDGFR 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, CDK4/6 억제제, PARP 억제제, mTOR 억제제, KRAS 억제제, TRK 억제제, BCL2 억제제, IDH 억제제, PI3K 억제제, DNA 손상 반응(DDR) 억제제, 또는 저메틸화제이다.
특정 측면에서, 본 개시는 개체에서 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공하되, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 구현예 중 임의의 하나에 따른 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 건선성 관절염, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 궤양성 대장염, 자궁내막증, 사구체신염, IgA 신병증, 다낭성 신장 질환, 중증 근무력증, 특발성 폐 섬유증, 섬유성 질환(예를 들면, 폐 섬유증, 간경변증, 심방 섬유증, 심내막 섬유증, 골수 섬유증 또는 후복막 섬유증), 천식, 아토피 피부염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 혈관염, 및 염증성 자가면역 근염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기술된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 양태는 당해 분야의 숙련가에게 분명해질 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구현예들은 이하의 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도 1은 단일 제제 활성을 평가하기 위한 생체내 동계 마우스 결장암종 모델의 결과를 나타낸다. MC38 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 삽입하고 군들로 무작위화하였다(8 마우스/군). 마우스를 비히클(PBS), CD47 차단 항-SIRP-α 항체 AB27b, CD47 차단 항-SIRP-α 항체 AB25b, 또는 CD47 차단 항-SIRP-α 항체 AB25c로 처리하였다. 처리는 종양이 삽입 7일 후 평균 60 mm3였을 때 개시했다. 마우스에 항-SIRPα 항체를 3주 동안 주 2회 10 mg/kg으로 복강내(IP) 투여하였다. 동물은 종양이 약 2000 mm3의 부피에 도달했을 때 희생시켰다.
도 2는 AB21 인간 중쇄 및 나타낸 인간화 경쇄를 갖는 항체의 발현 수율 및 결합 친화도를 비교한다. 상기 항체는 FreeStyle™ 293-FS 세포(Thermo Fisher)에서의 발현에 의해 생성되었다.
도 3a & 3b는 표적으로 EGFR(+) DLD-1 세포 및 식균 세포로서 M2 대식세포를 사용하는 시험관내 식균작용 검정 결과를 나타낸다. 항-SIRP-α 항체를 항-EGFR 항체 세툭시맙과 조합하여 나타낸 농도로 평가하였다. 식균작용을 CFSE+ 세포의 백분율로 측정하였다.
도 4a & 4b는 나타낸 항-SIRP-α 항체를 이용한 생체내 수지상 세포 활성화 검정의 결과를 나타낸다. 마우스에 나타낸 항체를 10 mg/kg으로 정맥내 주사하고, 비장을 주사 5시간 후 수확하였다. CD4+ 수지상 세포 상의 활성화 마커 CD86, MHCII 및 CCR7을 유세포 측정에 의해 측정하였다.
도 5는 항-SIRP-α 처리와 PD-L1/PD-1 경로 억제의 조합 활성을 평가하기 위한 생체내 동계 마우스 결장암종 모델의 결과를 나타낸다. CT26 세포를 BALBc 마우스에 피하 삽입하고 군들로 무작위화하였다(8 마우스/군). 마우스에 비히클(PBS), 항-PD-L1 항체, CD47 차단 항-SIRP-α 항체 AB25b, 또는 AB25b 및 PD-L1을 처리하였다. 처리는 종양이 삽입 7일 후 평균 60 mm3였을 때 개시했다. 마우스에 3주 동안 주 2회 10 mg/kg으로 복강내(IP) 투여하고 종양이 약 2000 mm3의 부피에 도달했을 때 희생시켰다.
도 6은 항-SIRP-α 처리와 PD-L1/PD-1 경로 억제의 조합의 활성을 평가하기 위한 생체내 동계 마우스 결장암종 모델의 결과를 나타낸다. MC38 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 삽입하고 군들로 무작위화하였다(8 마우스/군). 마우스에 비히클(PBS), 항-PD-1 항체, CD47 차단 항-SIRP-α 항체 AB25b, 또는 AB25b 및 항-PD-1을 처리하였다. 처리는 종양이 삽입 7일 후 평균 60 mm3였을 때 개시했다. 마우스에 3주 동안 주 2회 10 mg/kg으로 복강내(IP) 투여하고 종양이 약 2000 mm3의 부피에 도달했을 때 희생시켰다.
도 7은 질량 분광측정에 의해 분석된, 항체 PC336의 펩타이드의 당화 형태(검은색) 대 변형되지 않은 형태(회색)의 총 추출 이온 크로마토그래피, 곡선 하 면적(XIC, AUC)을 나타낸다. 나타낸 서열은 서열번호:64-66(왼쪽에서 오른쪽으로)이다.
도 8은 질량 분광측정에 의해 분석된, 항-SIRP-α 항체 PC301의 경쇄 및 중쇄의 나타낸 잔기에서의 탈아미드화에 의해 변형된 펩타이드의 백분율을 나타낸다. 아미노산 넘버링은 각각 서열번호:63 및 59의 경쇄 및 중쇄 서열에서 잔기의 순차적 넘버링에 기반한다(카밧 넘버링 아님).
도 9는 당화를 거친 K104 잔기를 갖는 Hum1 경쇄(서열번호:67; "오리지널")의 단편을 당화 부위를 제거하도록 조작된 3개 변이체(서열번호:68-70; 각각 변이체 1-3)와 함께 나타낸다. 당화 부위는 밑줄쳐있다.
도 10 & 11은 오리지널 Hum1 경쇄(Hum1 VL 및 IGCL1 불변 도메인을 가짐)와 6개 변이체의 정렬을 나타낸다. 변이체에는 각각 3개 당화 부위 변이체 (v1, v2, 및 v3) 중 하나 및 N171/N172 탈아미드화 부위를 대체하기 위한 DS 또는 SD 돌연변이가 포함된다. 위에서부터 아래로 각각 서열번호:47 및 52-57을 나타낸다. 별표는 서열 차이를 나타낸다. CDR은 상자로 표시된다(각각 서열번호:22, 23, 및 24를 나타냄). CDR 서술은 카밧을 따른다. 아미노산 넘버링은 잔기의 순차적 넘버링에 기반한다.
도 12는 표적으로 EGFR(+) DLD-1 세포 및 식균 세포로서 M2 대식세포를 사용하는 시험관내 식균작용 검정 결과를 나타낸다. 나타낸 Fc 영역을 갖는 항-SIRP-α 항체 또는 이소형 대조군을 항-EGFR 항체 세툭시맙과 조합하여 평가하였다. 식균작용을 CFSE+ 세포의 백분율로 측정하였다.
도 13a-13e는 나타낸 Fc 영역을 갖는 항-SIRP-α 항체를 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 다양한 세포 유형을 고갈시키는 능력에 대해 평가하는 고갈 검정 결과를 나타낸다. 도 13a & 13b는 lin- HLADR+ 수지상 세포(DC)의 고갈을 나타내며 상이한 공여체로부터 수득된 PBMC를 사용하여 수행된 실험 결과를 나타낸다. 도 13c는 항-SIRP-α 항체 및 이소형 대조군에 의한 CD3+ T 세포 고갈의 부재를 나타낸다. 도 13d는 항-SIRP-α 항체 및 이소형 대조군에 의한 CD14+ 단핵구 고갈의 부재를 나타낸다. 도 13e는 항-SIRP-α 항체 및 이소형 대조군에 의한 CD20+ B 세포 고갈의 부재를 나타낸다.
도 14a & 14b는 표적으로 EGFR(+) DLD-1 세포 및 식균 세포로서 M2 대식세포를 사용하는 시험관내 식균작용 검정 결과를 나타낸다. 나타낸 Fc 영역을 갖는 항-SIRP-α 항체를 항-EGFR 항체 세툭시맙과 조합하여 평가하였다. 식균작용을 CFSE+ 세포의 백분율로 측정하였다.
도 15a & 15b는 표적으로 EGFR(+) DLD-1 세포 및 식균 세포로서 M2 대식세포를 사용하는 시험관내 식균작용 검정 결과를 나타낸다. 나타낸 경쇄 불변 도메인(람다 또는 카파)을 갖는 항-SIRP-α 항체를 항-EGFR 항체 세툭시맙과 조합하여 평가하였다. 식균작용을 CFSE+ 세포의 백분율로 측정하였다.
본 개시는 하나 이상의 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인(예를 들면, D1 도메인)에 결합하고 잠재적인 관심의 다양한 SIRP-α 결합 프로파일을 갖는 항체를 기술한다. 또한, 본 발명은 높은 친화도로 다중 SIRP-α 폴리펩타이드에 결합하는 것과 대식세포 식균작용을 강화시키고, 수지상 세포 활성화를 강화시키고/거나 CD47을 발현하는 종양의 생체내 성장을 억제하는 능력과 같이 관심있는 하나 이상의 시험관내 및/또는 생체내 생물학적 특성을 갖는 항-SIRP-α 항체를 기술한다. 이들 항체는 닭으로부터 유래된 경쇄를 가지며, 이는 여러 포유류 SIRP-α 폴리펩타이드에 걸쳐 교차-반응하는 항체를 생성하는 독특한 기회를 제공한다. 실제로, 이들 항체는 인간 SIRP-α v1 및 v2, 사이노몰구스 SIRP-α, 및 여러 계통으로부터의 쥣과 SIRP-α과 교차-반응하는 것이 확인되어, 이들을 대규모 인간 집단에 걸친 전임상 평가 및 임상 적용 모두에 대해 매우 유리하게 만들었다. 중요하게는, 이들 항체는 또한 탈아미드화 또는 당화에 의해 변형될 수 있는 잔기와 같은 잠재적 책임을 제거하도록 조작되어, 제조, 보관, 및/또는 약물 개발을 위해 보다 바람직한 특징을 갖는 항체를 생성하였다.
일 측면에서, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합하는 단리된 항체가 본 명세서에 제공된다. 본 개시의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 벡터 뿐만 아니라 그와 관련된 항체의 생산 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 지연시키는 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 방법은 상기 개체에게 본 개시의 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 개체에서 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하거나 그 진행을 지연시키는 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 방법은 상기 개체에게 본 개시의 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
정의
개시된 구현예를 상세히 설명하기에 앞서, 본 개시는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 단지 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나", "하나의" 및 "상기"는 그 내용이 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 분자"에 대한 언급은 임의로 2개 이상의 상기 분자의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 이 기술 분야의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체로 지향되는 구현예를 포함한다(및 설명한다).
본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예의 "포함하는", "구성되는" 및 "로 본질적으로 구성된"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "SIRP-α 폴리펩타이드"는 인간, 원숭이, 설치류(예를 들면, 마우스 또는 랫트)와 같은 포유동물 및 닭과 같은 새를 포함하는 임의의 척추동물로부터의 게놈에 의해 인코딩된 임의의 내인성 또는 자연 발생 SIRP-α 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 이 용어는 또한 자연발생 변이체, 예를 들면 대안적으로 스플라이싱된 변이체, 대립유전자 변이체 또는 다형성(예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들)을 포함한다. 이 용어는 세포내 처리, 예를 들면 신호 서열의 제거 등으로부터 기인한 SIRP-α 폴리펩타이드 뿐만 아니라 전장, 미처리 SIRP-α 폴리펩타이드를 추가로 지칭할 수 있다. 예시적인 SIRP-α 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드는 예를 들면, NCBI 유전자 ID No. 140885에 기재된 바와 같이, 인간 SIRPA 유전자에 의해 인코딩된 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, SIRP-α 폴리펩타이드는 예를 들면, 세포외 도메인에 아미노산 다형성을 갖는 다수의 인간 변이체를 비롯하여 종내 및 종간에서 매우 다형성이다.
SIRP-α 폴리펩타이드는 리간드/파트너, 예를 들면, CD47에 결합하는 세포외 도메인을 포함한다. SIRP-α 폴리펩타이드는 3개의 매우 상동성인 면역글로불린(Ig)-유사 세포외 도메인-D1, D2 및 D3을 포함한다. SIRP-α D1 도메인("D1 도메인")은 SIRP-α의 막원위, 세포외 도메인을 지칭하며, CD47에 대한 SIRP-α의 결합을 매개한다(예를 들면, Hatherley, D. 등 (2008) Mol. Cell 31:266-77; Hatherley, D. 등 (2007) J. Biol. Chem. 282:14567-75; Hatherley, D. 등 (2009) J. Biol. Chem. 284:26613-9; 및 Lee, W. Y. 등 (2010) J. Biol. Chem. 285:37953-63 참고). 세포외 도메인은 일반적으로 예를 들면, 세포 표면에서 발현되는, SIRP-α의 전체 세포외 부분을 지칭하며, 구별되는 SIRP-α 도메인, 예컨대 D1 도메인을 포함할 수 있다. D1 도메인은 CD47 결합을 매개하는데 중요한 것으로 나타난 잔기를 함유한다(예를 들면, Lee, W.Y. 등 (2007) J. Immunol. 179:7741-50 참고). 일부 구현예에서, SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 결합하는 항체는 D1 도메인의 하나 이상의 잔기를 결합시킨다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "CD47"(인테그린 관련된 단백질(IAP), MER6 및 OA3으로도 공지되어 있음)은 다른 역할 중에서도 SIRP-α 폴리펩타이드에 대한 결합 파트너로서 작용하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, CD47은 인간 CD47 폴리펩타이드, 예를 들면, NCBI 참조 서열번호:961에 기재된 것과 같은 인간 CD47 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 지칭한다. 예시적인 인간 CD47 아미노산 서열이 공지되어 있다(예를 들면, NCBI 기준 서열 수탁 번호 NP_001768). 특히, CD47의 IgSF 도메인은 SIRP-α 결합에 중요한 것으로 알려진 CD47의 N-말단 세포외 도메인을 지칭한다(예를 들면, Barclay, A.N. 및 Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457-64 및 Hatherley, D. 등 (2009) J. Biol. Chem. 284:26613-9 참고). 용어 "CD47"은 또한 SIRP-α에 결합할 수 있는 변형된 CD47 폴리펩타이드, 예를 들면, 또 다른 폴리펩타이드 또는 다른 잔기, 예를 들면 Ig Fc 영역에 접합된 CD47의 IgSF 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "SIRP-α 신호전달 조절"은 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현하는 세포에서 SIRP-α 신호전달의 하나 이상의 양태를 길항하거나, 고통스럽게 하거나, 그렇지 않으면 방해하는 것을 지칭할 수 있다. SIRP-α 신호전달은 비제한적으로, SIRP-α의 세포내 영역의 티로신 인산화, 포스파타제(예를 들면, SHP1) 결합, 어댑터 단백질 결합(예를 들면, SCAP2, FYB 및/또는 GRB2), 사이토카인 생산(예를 들면, IL-10, IL-1β, IFN 또는 TNF) 및 산화 질소 생산을 포함하는 SIRP-α 폴리펩타이드의 활성화; 및/또는 비제한적으로 대식세포, 호산구, 중성구, 수지상 세포, 및 골수-유래된 억제 세포(MDSC)의 다른 활성화 또는 억제성 표현형 및 대식세포 식균작용을 포함하는 하나 이상의 세포간 표현형에 의해 매개되는 하나 이상의 세포내 신호전달 사건을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체; 원하는 생물학적 활성(예를 들면, 에피토프 결합)을 나타낸다면 (비제한적으로 Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv, 디아바디, scFv, scFv-Fc, 단일-도메인 항체, 단일 중쇄 항체, 및 단일 경쇄 항체를 포함하는) 항체 단편; 단클론성 항체; 다클론성 항체; 단일특이적 항체; 다중-특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체); 및 항체-유사 단백질을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 항체 단편과 관련하여 사용될 때 용어 "이중특이적"은 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 예를 들면, 각각의 결합 특이성은 상이한 항원을 인식할 수 있거나, 각각의 결합 특이성은 상이한 친화성 및/또는 정확한 에피토프로 동일한 항원을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상이한 결합 특이성은 이중특이적 항체 또는 항체 단편이 제1 결합 특이성을 갖는 적어도 제1 항원 결합 도메인 및 제2 결합 특이성을 갖는 제2 항원 도메인을 포함하도록, 하나 이상의 상이한 항체 항원 결합 도메인(예를 들면, 가변 도메인)을 포함한다. 다양한 예시적인 이중특이적 항체 포맷이 본 명세서에 기재되어 있고, 당 업계에 공지되어 있다.
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분, 예를 들면 숙주세포 또는 유기체로부터 분리 및/또는 회수된 항체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 중량기준 원하는 순도(예를 들면, 적어도 95%)로 정제되고; 및/또는 예를 들면은, 쿠마시 등에 의한 염색을 사용한 SDS-PAGE에 의해 균질화될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계 후에 수득된다.
당업계에 공지된 바와 같이, "천연" 항체는 전형적으로 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄를 포함하는 헤테로사량체 복합체를 지칭한다. 다양한 수의 디설파이드 결합이 2개의 중쇄를 연결하고, 하나는 사슬내 디설파이드 브릿지에 더해, 중쇄에 각각의 경쇄를 연결한다. 중쇄는 3개 또는 4개의 불변 도메인에 의해 뒤따르는 가변 도메인(VH)(N-말단에서 C-말단으로)을 포함한다. 경쇄는 가변 도메인(VL), 이어서 불변 도메인(CL)을 포함한다. 전형적으로, 포유동물 경쇄는 아미노산 서열: 카파(κ) 및 람다(λ)에 기초한 두 가지 카테고리 중 하나에 속한다.
"불변 도메인"은 항체 또는 단편의 더 보존된 부분, 예를 들면 가변 도메인 외부를 지칭할 수 있다. 상기 용어는 중쇄 힌지 영역과 함께 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3뿐만 아니라 CL 도메인을 포함할 수 있다. 선택적으로, 중쇄 불변 도메인은 CH4 중쇄 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
중쇄의 불변 도메인은 5가지 주요 유형: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 하나에 배정될 수 있다. 이러한 많은 주요 유형의 여러 가지 하위 유형이 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 배치형태는 잘 알려져 있으며, 예를 들면 Abbas 등 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)에 일반적으로 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 가변 도메인"은 상보적 결정 영역(CDR, 예를 들면, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 및 CDR H3) 및 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 항체의 경쇄 및 중쇄의 일부를 지칭한다.
용어 "가변성"은 가변 도메인의 하위 서열이 항체 사이에서 실질적으로 순차적으로 상이하고, 그의 항원에 대한 특정 항체의 결합 특이성에 중요하다는 사실을 지칭한다. 가변성은 VH 및 VL 도메인의 3개의 초가변성 영역(HVR)에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 보존된 부분은 HVR이 산재되어 있는 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프를 형성하는 3개의 HVR에 의해 연결된 4개의 FR 영역을 포함한다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD(1991)을 참고한다).
용어 "초가변성 영역(HVR)"은 향상된 서열 가변성 및/또는 정의된 루프의 형성을 특징으로 하는 VH 및 VL 도메인의 하위영역을 지칭할 수 있다. 이들은 VH 도메인의 3개의 HVR(H1, H2 및 H3) 및 VL 도메인의 3개의 HVR(L1, L2 및 L3)을 포함한다. H3는 미세 결합 특이성을 부여하는데 중요한 것으로 믿어지며, L3 및 H3은 가장 높은 수준의 다양성을 나타낸다. Johnson 및 Wu, Methods in Molecular Biology, 248:1-25(Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)을 참조한다.
다수의 HVR 윤곽이 공지되어 있다. 카밧 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기초를 두고 있으며, 가장 통상적으로 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. National Institute of Health, Bethesda, MD(1991)). 초티아는 대신 구조적 루프의 위치를 나타낸다(Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). AbM HVR은 카밧 HVR 및 초티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접점" HVR은 이용가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이 HVR 각각으로부터의 잔기는 하기에 기록되어 있다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
Figure pct00001
"연장된" HVR은 또한 VL의 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3), 및 VH의 26-35(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3)(카밧 넘버링)으로 공지되어 있다.
"카밧에 따른 넘버링"은 카밧 등의 항체 편집에서(상동) 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 시스템을 지칭할 수 있다. 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 삽입에 상응하는 더 적거나 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 전형적으로 카밧 넘버링은 가변 도메인의 잔기(대략적으로 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 때 사용되는 반면, EU 넘버링 시스템 또는 색인(예를 들면, 카밧에서와 같은 EU 색인, EU IgG1에 따른 넘버링)은 일반적으로 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급할 때 사용된다.
"전장" 또는 "온전한" 항체는 전형적으로 예를 들면, 항체 단편과 반대되는 Fc 영역을 갖는 중쇄를 포함한다. 단일 항원 결합 부위를 갖는 항원-결합 "Fab" 단편은 파파인 소화에 의해 잔존 Fc 단편으로부터 방출될 수 있다. F(ab')2 단편은 항체의 펩신 처리에 의해 생성된 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 그러나, 항체 단편은 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함할 것이다.
"Fv" 단편은 완전한 항원-결합 부위를 함유한다. 단일 사슬 Fv(scFv)는 HVR이 항원 결합 부위를 형성하도록, 예를 들면 항체 또는 Fab 단편과 같이 VH 및 VL 도메인이 결합하도록 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
Figure pct00002
, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315를 참고한다. 일부 구현예에서, scFv는 항체 Fc 도메인(예를 들면, scFv-Fc)에 융합된다. 6개의 HVR이 전형적으로 항원 결합 부위를 포함하는 반면, 3개의 HVR을 갖는 단일 가변 도메인은 여전히 낮은 친화성으로 항원에 결합할 수 있다. Hamers-Casterman 등, Nature 363:446-448 (1993); Sheriff 등, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참고한다. 단일-도메인 항체(예를 들면, 낙타과 항체)는 전형적으로 항원 결합을 위한 단일의 단량체성 가변 도메인을 포함한다. 단일 중쇄(VHH) 및 단일 경쇄 항체 또한 공지되어 있다. Fab' 단편은 전형적으로 Fab 단편보다 C-말단에 몇개의 잔기를 더 포함한다. Fab'-SH는 유리 티올을 갖는 시스테인 잔기를 포함한다. 항체 단편의 다양한 화학적 커플링이 당해 기술에 공지되어 있다.
"디아바디(diabody)"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 포함한다. 이들은 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 전형적으로 너무 짧아서 동일한 사슬에서 도메인의 페어링을 촉진시킬 수 없다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 트리바디 및 테트라바디, 또는 다른 수의 VH/VL 도메인이 공지되어 있다. Hudson 등, Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참고한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단클론성" 항체는 실질적으로 균질한, 예를 들면, 실질적으로 동일하지만 경미한 수준의 백그라운드 돌연변이 및/또는 변형을 허용하는 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산할 필요가 없다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 그의 HVR, VH 및/또는 VL 서열, 및/또는 클론 풀(예를 들면, 재조합, 하이브리도마 또는 파지-유래됨)로부터 선택된 결합 특성에 의해 선택된다. 단클론성 항체는 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록, 예를 들면 항체의 결합 친화도 또는 다른 특성에 영향을 미치고, 인간화된 또는 키메라성 항체를 생성하고, 항체 생산 및/또는 균질성을 개선하며, 다중특이적 항체를 조작하고, 여전히 본질적으로 단클론성으로 간주되는 항체를 수득하도록 조작될 수 있다. 단클론성 항체의 모집단은 모집단의 개별 단클론성 항체가 동일한 항원 부위를 인식함에 따라 다클론성 항체와 구별될 수 있다. 단클론성 항체의 생산을 위한 다양한 기술이 공지되어 있으며; 예를 들면, 하이브리도마 방법(예를 들면, Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridoma 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참고), 파아지-디스플레이 기술(예를 들면, Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu 등, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol. Method 284(1-2): 119-132 (2004) 참고), 및 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간 유사 항체를 생산하는 기술(예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits 등, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann 등, Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; Marks 등, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg 등, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild 등, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) 참고).
"키메라성" 항체는 특정 아이소타입, 부류 또는 유기체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄의 일 부분 및, 또 다른 아이소타입, 부류 또는 유기체로부터의 또 다른 부분을 갖는 항체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 가변 영역은 하나의 공급원 또는 유기체로부터 유래하고, 불변 영역은 또 다른 공급원 또는 유기체로부터 유래할 것이다.
"인간화된 항체"는 우세한 인간 서열 및 최소량의 비-인간(예를 들면, 마우스 또는 닭) 서열을 갖는 항체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 인간 수용체 항체 프레임워크(FR)에 이식된 비-인간(예를 들면, 마우스 또는 닭) 유기체 유래 항체로부터의 하나 이상의 HVR 서열(관심의 결합 특이성을 지니고 있음)을 갖는다. 일부 구현예에서, 비-인간 잔기는 예를 들면, 항체 특성을 개선시키기 위해 인간 프레임워크(공급원 또는 수용체 항체에 존재하지 않음) 상에 추가로 이식된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나의, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프가 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 또한, 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 예를 들면, Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참고한다.
"인간" 항체는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는, 및/또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭할 수 있다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리. Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner 등, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기재된 바와 같은 인간 단클론성 항체의 제조; 및 항원 자극에 반응하여 상기 항체를 생산하도록 변형되었지만, 고장난 내인성 유전자좌를 갖는, 형질전환 동물, 예를 들면, 면역화된 제노마우스 (예를 들면, XENOMOUSETM 기술 관련 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호를 참고한다) 또는 인간 면역글로불린 서열(들)을 갖는 닭(예를 들면, WO2012162422, WO2011019844, 및 WO2013059159를 참고한다)에게 항원을 투여하는 기술을 포함하여 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 요소, 예를 들면, 단백질 도메인 사이의 연결을 지칭한다. 일부 구현예에서, 링커는 공유결합 또는 스페이서일 수 있다. 용어 "스페이서"는 두 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인 사이의 공간 또는 가요성(또는 공간 및 가요성 모두)을 제공하기 위해 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인 사이에서 발생하는 모이어티(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체) 또는 아미노산 서열(예를 들면, 1 내지 200 아미노산 서열)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산 스페이서는 (예를 들면, 폴리펩타이드 백본을 통해, 이격된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인에 연결된) 폴리펩타이드의 일차 서열의 일부이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성 제제"는 세포 증식을 억제하거나 세포사멸을 유도하는 임의의 제제를 지칭할 수 있다. 세포독성 제제는 비제한적으로 화학치료제; 방사성 동위원소; 성장 억제성 제제; 및 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소(이들의 단편 및/또는 변이체를 포함함)를 포함한다. 예시적인 세포독성 제제는 비제한적으로, 대사 억제제, 항-미세소관 제제, 백금 함유 화합물, 알킬화제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 항-대사물질, 토포이소머라제 I 억제제, 신호 형질도입 경로 억제제, 비-수용체 티로신 키나제 혈관신생 억제제, 호르몬 및 호르몬 유사체, 세포자멸유도 제제, LDH-A의 억제제, 세포주기 억제제, HDAC 억제제 및 항생제를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표지"는 예를 들면 본 발명의 표지된 항체와 거대 분자 또는 세포 사이의 결합의, 검출제로서 작용하는 임의의 모이어티 포함할 수 있다. 예시적인 표지는 친화성 정제 태그 뿐만 아니라 형광(예를 들면, 화합물 또는 단백질), 방사성 또는 효소적 모이어티를 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체는 항원의 시험관내 및/또는 생체내 조작에 유용한 항체를 제공하기에 충분한 친화도로 항원을 "결합"한다고 할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원에 "결합하는" 항체는 25℃에서 1μM보다 작거나 같은, 항원에 대한 해리 상수(KD)를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화도" 또는 "결합 친화도"는 두 분자 사이의 결합 상호작용의 강도를 지칭한다. 일반적으로, 결합 친화도는 분자와 그의 결합 파트너, 예컨대 고친화도 SIRP-α D1 변이체 및 CD47 사이의 비-공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 결합 친화도는 결합 쌍의 구성원간에 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 두 분자 사이의 결합 친화도는 통상적으로 해리 상수(KD) 또는 결합 상수(KA)로 기재된다. 서로에 대한 낮은 결합 친화도를 갖는 2개의 분자는 일반적으로 천천히 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있으며, 큰 KD를 나타낸다. 서로에 대해 높은 친화도를 갖는 2개의 분자는 일반적으로 용이하게 결합하고, 더 오래 결합되는 경향이 있으며, 작은 KD를 나타낸다. 일부 구현예에서, 2개의 상호작용하는 분자의 KD는 공지된 방법 및 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 결정된다. KD는 koff/kon의 비율로 계산될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "KD 미만"은 인용된 KD 값에 비해 수치적으로 더 작은 KD 값 및 증가하는 결합 친화도를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "KD 초과"는 인용된 KD 값에 비해 수치적으로 더 큰 KD 값 및 감소하는 결합 친화도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포에서 하나 이상의 병리적 증상을 변경시키기 위해, 분자, 화합물, 제형, 조성물 등의 치료적 투여를 지칭할 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로, 질환 진행을 감속시키는 것, 병리적 증상 또는 질환 상태를 완화 또는 경감시키는 것, 예후를 개선시키는 것 및/또는 질환 차도를 달성하는 것 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 개체의 암은 암과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 폐지되면, 예컨대, 비제한적으로 암세포의 증식이 감소되거나, 암 세포 또는 종양 부담이 제거되거나, 암으로 인한 증상이 감소되거나 개인의 삶의 질이 높아지고, 다른 약물(들)의 용량이 감소되고, 및/또는 개인의 생존이 연장된다면, 성공적으로 "치료된다". 또 다른 예로서, 자가면역 또는 염증성 질환은 자가면역 또는 염증성 질환과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 폐지되면, 예컨대, 비제한적으로 자가반응성 면역 세포 및/또는 염증성 면역 세포 또는 사이토카인이 감소되고, 면역 활성화 및/또는 염증이 감소되고, 질환으로 인한 장기 손상이 늦춰지거나 경감되고, 질환으로 인한 증상이 감소되고, 개인의 삶의 질이 향상되고, 다른 약물(들)의 용량이 감소되고, 및/또는 개인의 생존이 연장된다면, 성공적으로 "치료될 수 있다".
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 질환의 "진행을 지연시키는"은 질환의 병리적 경과를 늦추거나, 지연시키거나, 연기시키거나, 보류시키거나, 안정화시키거나 또는 방해하는 것을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 용어는 예방, 예를 들면 개체가 질환 발병을 효과적으로 예방하기에 충분한 지연을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, 진행성 암에서, 진행을 지연시키는 것은 전이를 지연시키는 것을 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 지연의 정확한 길이가, 예를 들면, 특정 질환, 개체의 병태 등에 따라 달라질 수 있음을 인정할 것이다.
용어들 "암" 및 "암성"은 포유동물에서 세포 또는 세포들에 의한 이상조절된 또는 조절되지 않은 세포 성장/증식을 나타낼 수 있다. 당 업계에 공지된 임의의 암 유형, 예컨대 비제한적으로 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 림프종 및 모세포종이 포함될 수 있다. 상기 암의 보다 구체적인 예는 비제한적으로 폐암, 편평상피 세포 암, 뇌종양, 교모세포종, 두경부암, 간세포 암, 결장직장암(예를 들면, 결장암 또는 직장암), 간암, 방광암, 위암 또는 위장암, 췌장암, 자궁경부암, 난소 암, 요로 암, 유방암, 복막 암, 자궁암, 타액선 암, 신장 또는 신장 암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선암, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종(비-호지킨 림프종(NHL) 포함); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 골수성 백혈병(AML); 메켈 세포 암종; 모발 세포 백혈병; 만성 골수아세포 백혈병(CML); 및 관련된 전이를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 질환, 예컨대, 암, 예를 들면 고형 종양 또는 혈액 암을 갖는 환자의 치료 또는 진행 지연에 원하는 치료 효과를 달성하는데 충분하고 효과적인, 본 개시의 항체 또는 본 개시의 항체를 함유하는 약제학적 조성물의 양을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 유해한 부작용을 피할 것이고, 및/또는 이러한 부작용은 유익한 효과보다 더 중요할 것이다. 유효량은 치료되는 개체, 예를 들면, 원하는 반응을 생성하는 제제의 능력 뿐만 아니라 연령, 체중, 성별, 질환 상태에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여시에 투여될 수 있다. 임상적 상황에서와 같이, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물, 예컨대 또 다른 치료제와 공조하여 달성되거나, 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 또한 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있으며, 단일 제제는 하나 이상의 다른 제제와 함께 공조하여, 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성될 경우, 유효량으로 투여되는 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 부형제 또는 희석제(또는 부형제 및 희석제 모두)뿐만 아니라 활성 성분을 포함하고, 활성 성분이 적합한 투여방법에 의해 투여될 수 있도록 하는 약제 또는 약제학적 제형을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체와 양립가능한 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐 형태, 또는 예를 들면 주사에 의한 정맥내 또는 피하 투여용 수성 형태로 존재한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 예를 들면 포유동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 뮤린, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "와 공조하여" 또는 "와 조합하여"는 다른 치료제에 추가로(예를 들면, 전, 동안 및/또는 후에) 하나의 치료제의 투여를 지칭할 수 있다.
항체
본 개시의 특정 측면은 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인(예를 들면, D1 도메인)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체이다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 식
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 식
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이다. 상기 구현예 중 임의의 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호:25의 서열을 포함하지 않는다. 특정 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 식 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, VL 도메인은 서열번호:25의 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 표 1에 나타낸 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 표 1에 나타낸 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호:39-41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:77-111로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:77-111로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-51로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인 및 서열번호:33, 34, 및 137로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호: 60, 61, 및 129로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26, 81, 또는 83으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26, 81, 또는 83으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26, 81, 또는 83으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 VL 도메인 및 서열번호:36-38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 VL 도메인 및 서열번호:36-38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26, 81, 또는 83으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:43-46으로부터 선택되는 CL 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:43-46으로부터 선택되는 CL 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:119-123으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:119-123으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:119-123으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:120의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:122의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:123의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:132-139로 구성된 군으로부터 선택되는 불변 도메인 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호: 33, 34, 및 137로 구성된 군으로부터 선택되는 불변 도메인 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:132-139로 구성된 군으로부터 선택되는 불변 도메인 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:33, 34, 및 137로 구성된 군으로부터 선택되는 불변 도메인 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:124-131로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60, 61, 및 129로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:124-131로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60, 61, 및 129로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 중쇄는 서열번호:137의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 식 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 식
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이다. 상기 구현예 중 임의의 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호:25의 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 표 1에 나타낸 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:36-38로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58-62로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:43-46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:77-111로부터 선택되는 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:77-111로부터 선택되는 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:77-111로부터 선택되는 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:36-38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:77-111로부터 선택되는 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:43-46으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:114-123으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:47-63으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:124-131로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:47-63으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:114-131로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:47-63으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:114-118로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:119-123으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:48-57로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:114-123으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:114-123으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:39-41로부터 선택되는 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:36-38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:114-123으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:43-46으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 서열을 포함하는 VH 도메인으로부터의 3개의 CDR 및/또는 표 1에 나타낸 서열을 포함하는 VL 도메인으로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 VH 도메인과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VH 도메인 및 선택적으로 표 2에 나타낸 서열을 포함하는 VH 도메인으로부터의 3개의 CDR, 및/또는 표 1에 나타낸 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VL 도메인 및 선택적으로 서열표 1에 나타낸 서열을 포함하는 VL 도메인으로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 중쇄 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열 및 선택적으로 표 2에 나타낸 서열을 포함하는 VH 도메인으로부터의 3개의 CDR을 포함하는 중쇄, 및/또는 표 1에 나타낸 경쇄 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열 및 선택적으로 표 1에 나타낸 서열을 포함하는 VL 도메인으로부터의 3개의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
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상술된 바와 같이, 고가변 영역(HVR) 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 서술하는 다양한 기법이 당해 분야에 알려져 있으며 본원에 기재된 가변 도메인 서열에 적용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 초티아, 카밧, IMGT, 또는 이의 조합에 의해 정의되는 HVR(예를 들면, 하나의 서술에 의해 정의되는 하나 이상의 HVR 및 상이한 서술에 의해 정의되는 하나 이상의 HVR)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 특정되지 않는 한, HVR 또는 CDR 잔기의 넘버링은 카밧 넘버링에 의해 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:5)의 아미노산 서열을 포함하는 인간 SIRP-α v1 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는
EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:6)의 아미노산 서열을 포함하는 인간 SIRP-α v2 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:5)의 아미노산 서열을 포함하는 인간 SIRP-α v1 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인) 및 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:6)의 아미노산 서열을 포함하는 인간 SIRP-α v2 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 원숭이 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인) (예를 들면, 원숭이 SIRP-α 폴리펩타이드의 D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 (예를 들면, 유기체 마카카 파스시컬라리스에서 발견된) 사이노몰구스 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인) 에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 적어도 2개의 상이한 원숭이 SIRP-α 변이체 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 적어도 2개의 상이한 사이노몰구스 SIRP-α 변이체 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 항체는
EEELQVIQPEKSVSVAAGESATLNCTATSLIPVGPIQWFRGVGPGRELIYHQKEGHFPRVTPVSDPTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:11)의 아미노산 서열을 포함하는 사이노몰구스 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인),
EEELQVIQPEKSVSVAAGDSATLNCTVSSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNLKEGHFPRVTAVSDPTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:12)의 아미노산 서열을 포함하는 사이노몰구스 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인), 또는 둘 모두에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 쥣과 또는 마우스 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, 유기체 뮤스 무스큘러스에서 발견됨; 예를 들면, 쥣과 또는 마우스 SIRP-α 폴리펩타이드의 D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 2종 이상의 상이한 쥣과 SIRP-α 변이체 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 상이한 마우스 균주로부터의 다양한 쥣과 SIRP-α 변이체 폴리펩타이드는 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 쥣과 SIRP-α 변이체 폴리펩타이드는
KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIKWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRVTNVSDATKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQKGPSEPDTEIQSGGGTEVYVLAKPS (서열번호: 7; 129 마우스 균주로부터),
TEVKVIQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGQSRQLIYSFTTEHFPRVTNVSDATKRSNLDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSPDTEIQSGGGTEVYVLAK (서열번호:8; NOD 마우스 균주로부터),
KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGPSRLLIYSFAGEYVPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPADAGIYYCVKFQKGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK (서열번호:9; C57BL/6 마우스 균주로부터), 및
TEVKVTQPEKSVSVAAGDSTILNCTVTSLLPVGPIRWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK (서열번호:10; BALB/c 마우스 균주로부터)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP 계열 단백질의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-β 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 인간 SIRP-β 폴리펩타이드는 예를 들면, NCBI 레퍼런스 서열번호 10326에 의해 기재된 바와 같이 인간 SIRPB1 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 SIRP-β 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)는
EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVR AKPS (서열번호:13) 또는
EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELSVRAKPS (서열번호:14)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-γ 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 인간 SIRP-γ 폴리펩타이드는 예를 들면 NCBI 레퍼런스 서열번호 55423에 의해 기재된 바와 같이 인간 SIRPG 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 SIRP-γ 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)는
EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (서열번호:15)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 CD47(예를 들면, 인간 CD47)의 IgSF 도메인에 결합한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS(서열번호:16)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서 SIRP-α 신호전달을 조절한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서의 SIRP-α 신호전달을 길항시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서의 SIRP-α 신호전달을 방해한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서의 SIRP-α 신호전달을 작용시킨다. 일부 구현예에서, SIRP-α 신호전달은 SIRP-α의 세포내 영역의 티로신 인산화, 포스파타제 (예를 들면, SHP1) 결합, 어댑터 단백질 결합 (예를 들면, SCAP2, FYB, 및/또는 GRB2), 및 산화질소 생산을 비제한적으로 포함하는 SIRP-α 폴리펩타이드의 활성화에 의해 매개된 하나 이상의 세포내 신호전달 사건을 포함한다. 세포에서 SIRP-α 신호전달을 측정하기 위한 다양한 검정은 하기를 비제한적으로 포함한다: SIRP-α 인산화, SHP1 및 SHP2 공-면역침강, PI3-키나제 신호전달, 사이토카인 생산 (염증성 IL-12, IL-23, TNFα, IFN 및 억제성 사이토카인 IL-10, IL-4, IL-13 둘 모두, M1 및 M2 대식세포 마커에 대한 세포 표면 마커 수준) 또는 수지상 세포 활성화 및 기능; Kharitonenkov, A. 등 (1997) Nature 386: 181-6; Ochi, F. 등 (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:483-7; Kim, E.J. 등 (2013) Inflammation Research 62:377-86; Yi, T. 등 (2015) Immunity 43:764-75.
일부 구현예에서, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포는 백혈구이다. 일부 구현예에서, 세포는 대식세포, 수지상 세포, 중성구, 호산구, 또는 골수-유래된 억제 세포 (MDSC)이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는, 예를 들면, 본 명세서에 기재되어 있거나 달리 당업계에서 공지되어 있는 SIRP-α 신호전달 검정 중 하나 이상을 사용하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 까지 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서의 SIRP-α 신호전달을 감소시키거나 길항시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 예를 들면, 본 명세서에 기재되어 있거나 달리 당업계에서 공지되어 있는 SIRP-α 신호전달 검정 중 하나 이상을 사용하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 까지 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서의 SIRP-α 신호전달을 증가시키거나 작용시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 SIRP-α에 의해 매개된 세포간 표현형을 조절한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 대식세포에 의한 식균작용을 향상시킨다. 예를 들면, 본 개시의 항체에 의해 처리되거나 그것과 접촉된 대식세포의 식세포 활성은 항체로 처리되거나 그것과 접촉되지 않은 대식세포의 식세포 활성과 비교될 수 있거나, 또는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키고 본 개시의 항체로 처리되거나 그것과 접촉된 대식세포의 식세포 활성은 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키지 않고 항체로 처리되거나 그것과 접촉되지 않는 대식세포의 식세포 활성과 비교될 수 있다. 예시적인 식균작용 검정은, 예를 들면, Wieskopf, K. 등 (2013) Science 341: 88 및 Willingham, S.B. 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:6662-7에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는, 예를 들면, 본 명세서에 기재되어 있거나 달리 당업계에서 공지되어 있는 식균작용 검정 중 하나 이상을 사용하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 까지 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는 대식세포에 의한 식균작용을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드을 발현시키는 수지상 세포(들)의 활성화 (예를 들면, 개별 수지상 세포의 증가된 수준의 활성화, 또는 샘플 모집단 내에서 활성화된 수지상 세포의 증가된 부분)을 향상시킨다. 예를 들면, 본 개시의 항체로 처리되거나 또는 그것과 접촉된 수지상 세포(들)의 활성화는 항체로 처리되거나 그것과 접촉되지 않은 수지상 세포(들)의 활성화와 비교될 수 있거나, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키고 본 개시의 항체로 처리되거나 그것과 접촉된 수지상 세포(들)의 활성화은 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키지 않고 항체과 처리되거나 그것과 접촉되지 않은 수지상 세포(들)의 활성화와 비교될 수 있다. 예시적인 수지상 세포 활성화 검정는 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 예를 들면, 본 명세서에 기재되어 있거나 달리 당업계에서 공지되어 있는 수지상 세포 활성화 검정 중 하나 이상을 사용하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 (예를 들면, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현시키는) 수지상 세포 활성화를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 CD47를 발현시키는 종양의 생체내 성장을 억제한다. 예를 들면, CD47를 발현시키고 본 개시의 항체로 처리된 종양의 생체내 성장은 CD47를 발현시키는 종양의 생체내 성장에 대해 비교될 수 있고 본 개시의 항체로 처리되지 않는다. 예시적인 생체내 종양 성장 검정는 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 또는 달리 당업계에서 공지되어 있는 생체내 종양 성장 검정 중 하나 이상을 사용하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 까지 CD47를 발현시키는 종양의 생체내 성장을 억제한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인) 및 인간 CD47 폴리펩타이드의 IgSF 도메인 (예를 들면, "차단" 항체) 사이의 결합을 차단한다. 예를 들면, 항체 및 CD47 폴리펩타이드는 동일한 SIRP-α 에피토프에 대해 "경쟁"할 수 있고/거나 SIRP-α에 결합하는 항체는 SIRP-α에 결합하는 CD47와 상호 배타적일 수 있다. SIRP-α 및 CD47 사이의 결합 계면, 뿐만 아니라 결합에 참여하는 단백질 둘 모두의 잔기는 공지되어 있다; Hatherley, D. 등 (2007) J. Biol. Chem. 282:14567-75 및 Nakaishi, A. 등 (2008) J. Mol. Biol. 375:650-60를 참고한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 예를 들면, 정제된 SIRP-α 및/또는 CD47 폴리펩타이드를 사용하여 ELISA 또는 SPR 검정과 같은 시험관내 검정에서 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 (예를 들면, D1 도메인)과 인간 CD47 폴리펩타이드의 IgSF 도메인 사이의 결합을 차단한다.
항체 생산 및 다른 항체 특성
본 개시의 항체는 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 항체 생산을 위한 예시적인 기술은 하기에 기재되어 있으며; 그러나, 이들 예시적인 기술은 단지 설명하기 위한 목적으로 제공되며, 제한하고자 하는 의도는 아니다. 또한, 본 명세서에 기재된 항체와 함께 사용하기 위해 고려되는 예시적인 항체 특성이 추가로 기술된다.
일부 구현예에서, 항원에 "결합"하는 항체는 25℃에서 1μM 이하의 항원에 대한 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 25℃에서 1μM 이하, 25℃에서 500nM 이하, 25℃에서 400nM 이하, 25℃에서 300nM 이하, 25℃에서 250nM 이하, 25℃에서 200nM 이하, 25℃에서 200nM 이하, 25℃에서 100nM 이하, 또는 25℃에서 50nM 이하인, 인간 v1 및/또는 v2 SIRP-α 폴리펩타이드에 대한 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 구현예에서, 인간 SIRP-α 폴리펩타이드 및 하나 이상의 비-인간 SIRP-α 폴리펩타이드와 결합하는 항체는 비-인간 SIRP-α 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도(예를 들면, 10-배 또는 100-배 이상)로 인간 SIRP-α 폴리펩타이드와 결합하며, 그럼에도 여전히 두 폴리펩타이드 모두에 "결합"하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에 있어서, 비-인간 SIRP-α 폴리펩타이드 및 하나 이상의 인간 SIRP-α 폴리펩타이드와 결합하는 항체는 인간 SIRP-α 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도(예를 들면, 10-배 또는 100-배 이상)로 비-인간 SIRP-α 폴리펩타이드와 결합하며, 그럼에도 여전히 두 폴리펩타이드 모두에 "결합"하는 것으로 여겨진다. 결합 친화도를 측정하기 위한 검정은 당해 기술에 공지되어 있으며, 비제한적으로 예를 들면 본 명세서에 기재된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명(SPR); 예를 들면 항체 및 그의 항원의 Fab 버전을 사용하는 방사성 표지 항원 결합 검정(RIA); 등을 포함한다.
항원을 제조하기 위해, 상기 항원은 천연 공급원으로부터 정제되거나 또는 그렇지 않으면 수득될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 가용성 단백질로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 또 다른 폴리펩타이드 또는 다른 모이어티와 접합되어, 예를 들면 그의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 항원은 Fc 영역과 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 그의 세포 표면 상에 항원을 발현하는 세포가 항원으로서 사용될 수 있다.
다클론성 항체는 항원 및 아쥬반트의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물 내에서 키워질 수 있다. 예를 들면, 닭 면역화에 대한 설명이 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 항원은 이중작용성 또는 유도화제를 사용하여 면역원성 단백질, 예를 들면, 키홀 삿갓조개헤모시아닌, 혈청 알부민, 소과 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제와 접합된다. 닭의 면역화를 위한 예시적인 방법이 본 명세서에서 제공된다. 포유동물와 같은 다양한 다른 유기체에 적합한, 관련된 방법은 당해 기술에 공지되어 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 단클론성 항체는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 단클론성 항체는 Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)에 최초로 기술되고, Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995); Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); 및 Hammerling 등: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조된다. 인간 하이브리도마 기술(Trioma 기술)은 Vollmers 및 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers 및 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다. 하이브리도마 세포가 성장되는 배양 배지는 예를 들면, 시험관내 결합 검정, 면역침강, ELISA, RIA 등의 관심 항체의 존재에 대해 선별될 수 있으며; 및 결합 친화도는 예를 들면, Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다. 원하는 결합 특성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 배양 기술을 사용하여 서브클로닝되고 성장될 수 있으며, 동물 등에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
일부 구현예에서, 단클론성 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들면, Hoogenboom 등 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)을 참조한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 예를 들면, Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지에 대해 선별된다. 파아지는 전형적으로 항체 단편을 단일-사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 표시한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734(1993)에 기재된 바와 같이 임의의 면역화없이 광범위한 비-자체 항원 및 자기-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다(예를 들면, 인간으로부터). 마지막으로, 나이브 라이브러리는 Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재된 바와 같이, 줄기 세포에서 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 및 고도로 가변성인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 수행하는 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 합성으로 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 닭 항체이다. 닭 항체는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있으며; 예를 들면, 미국 특허 제6,143,559호; 제8,592,644호; 및 제9,380,769호를 참고한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 키메라성 항체이다. 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 및 Morrison 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)를 참고한다. 일부 구현예에서, 키메라성 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 닭, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라성 항체는 부류 또는 서브클래스가 모 항체의 부류 또는 서브클래스에서 변경된 "부류 스위칭된" 항체이다. 키메라성 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라성 항체는 인간화된 항체이다. 비-인간 항체는 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들면, CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체(예를 들면, 닭 항체)로부터 유래되고 FRs(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 또한, 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선시키기 위해, 비-인간 항체(예를 들면, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 인간화된 항체 및 이들의 제조 방법은 예를 들면, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 기재되어 있다. 닭 항체를 인간화하는 방법이 또한 예를 들면 WO2005014653에 기재되어 있다.
인간화에 유용한 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적화" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역; 인간 체세포적으로 돌연변이된 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역; 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역. 예를 들면, Sims 등 J. Immunol. 151:2296 (1993); Carter 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta 등 J. Immunol., 151:2623 (1993); Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008); 및 Baca 등, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)를 참고한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 비-인간 동물, 예컨대 유전자적으로 조작된 닭(예를 들면, 미국 특허 제8,592,644호 및 제9,380,769호 참고) 및/또는 본 명세서에 기재된 마우스에 의해 생산된다. 인간 항체는 일반적으로 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 닭에 의해 생성되거나 닭으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 비제한적으로 Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv 또는 scFv 단편, 또는 단일-도메인, 단일 중쇄, 또는 단일 경쇄 항체를 포함하는 항체 단편이다. 항체 단편은 예를 들면, 효소적 분해에 의해 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan 등, Science, 229:81 (1985)에 기재된 바와 같이, 항체 단편을 생성하기 위해, 온전한 항체의 단백질분해성 소화가 사용된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 재조합 숙주세포에 의해 생산된다. 예를 들면, Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 이.콜라이(E.coli)에 의해 발현되고 분비된다. 항체 단편은 대안적으로 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
Fab'-SH 단편은 이.콜라이로부터 직접 회수될 수 있고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다. Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)를 참고한다. F(ab')2 단편은 또한 재조합 숙주세포 배양으로부터 직접 단리될 수 있다. 회수 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참고한다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 생성하도록 구성될 수 있다. 항체 단편은 예를 들면, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이, 또한 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 다중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 1개 초과의 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다(예를 들면, 2개, 3개 또는 그 이상의 결합 특이성을 갖는다). 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원에 대해 2개의 상이한 결합 특이성을 포함한다(예를 들면, 동일한 항원의 상이한 결합 친화도 및/또는 특정 에피토프를 갖는다). 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 2개의 구별되는 항원에 대한 결합 특이성을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 전장 또는 온전한 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 본 개시의 항체 단편이다.
결합 특이성의 다양한 조합을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 SIRP-α 폴리펩타이드에 대한 제1 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 예를 들면 세포 표면 상에서 암세포에 의해 발현된 항원에 대한 제2 결합 특이성을 갖는다. 예시적인 상기 항원은 비제한적으로, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, 뮤신 1, 뮤신 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, 엔도텔린 B 수용체, 메소텔린, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, 넥틴 4, NaPi2b, LIV-1A, 구아닐릴 사이클라제 C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나스신, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, 뮤신, CAIX, EPHA3, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, 및 NY-ESO-1/LAGE로부터의 펩타이드를 포함하는 MHC/펩타이드 복합체, SSX-2, MAGE 계열 단백질, MAGE-A3,　gp100/pmel17,　멜란-A/MART-1,　gp75/TRP1,　티로시나제,　TRP2, CEA, PSA,　TAG-72,　미성숙한 라미닌 수용체,　 MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1,　BING-4,　EpCAM,　MUC1, PRAME, 서바이빈,　BRCA1, BRCA2, CDK4,　CML66,　MART-2, p53, Ras, β-카테닌, TGF-βRII, HPV E6, 또는 HPV E7을 포함한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 제1 결합 특이성을 갖는 종양 세포에 의해 발현된 임의의 CD47에 대한 백혈구에 의해 발현되는 SIRP-α의 반응성을 억제하면서, 제2 결합 특이성을 갖는 종양 세포를 표적화하도록 예를 들면, FcR-발현 백혈구를 지시하는데, 상기 결합 특이성을 SIRP-α에 대한 결합 특이성과 조합시키는 것이 특히 유리하다.
일부 구현예에 있어서, 이중특이적 항체는 면역 세포에 의해, 예를 들면, 세포 표면 상에서 발현되는 항원에 대해 제2 결합 특이성을 갖는다. 예시적인 이러한 항원에는 비제한적으로 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, IDO, TDO,　41BB,　CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, PVRIG, DNAM, 및 ICOS가 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 항원은 골수 세포 상에서 발현된다. 이러한 항원에는 비제한적으로 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, IDO, 및 TDO가 포함될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 항원은 T 세포 상에서 발현된다. 이러한 항원에는 비제한적으로 41BB,　CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, TNFR2, PVRIG, DNAM, 및 ICOS가 포함될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 이중특이적 항체는 NK 세포에 의해, 예를 들면, 세포 표면 상에서 발현되는 항원에 대해 제2 결합 특이성을 갖는다. 예시적인 이러한 항원에는 비제한적으로 NKR-P1A(KLRB1), CD94(NKG2A), KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DS1, CD94(NKG2C/E), NKG2D, CD160(BY55), CD16(FcγRIIIA), NKp46(NCR1), NKp30(NCR3), NKp44(NCR2), DNAM1(CD226), CRTAM, CD27, NTB-A(SLAMF6), PSGL1, CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), NKp80(KLRF1, CLEC5C), SLAMF7(CRACC, CS1, CD319), 및 CD244(2B4, SLAMF4)가 포함된다.
이중특이적 항체를 생성 및 정제하기 위한 다양한 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 수많은 접근법이 기재되어 있다. 하나의 접근법은 "노브-인투-홀" 또는 "돌출부-인투-공동" 접근법이다(예를 들면, 미국 특허 제5,731,168호 참고). 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체의 헤테로이량체화는 2개의 Fc 도메인 단량체, 예컨대 "노브-인투-홀" 잔기 쌍 및 전하 잔기 쌍에 상이하지만, 양립가능한 치환을 도입함으로써 촉진된다. 노브 및 홀의 상호작용은 헤테로이량체 형성을 선호하는 반면, 노브-노브 및 홀-홀 상호작용은 입체적 충돌 및 양호한 상호작용의 결실로 인해 동종이량체 형성을 방해한다. 홀은 단백질의 원래 아미노산이 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 공동을 지칭한다. 노브는 단백질의 원래 아미노산이 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 범프를 지칭한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 대체되는 아미노산은 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 존재하고 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화에 관여한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 홀이 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 노브를 수용하도록 생성되어, 노브 및 홀 아미노산이 2개의 Fc 도메인 단량체의 헤테로이량체화를 촉진 또는 쉽게 하도록 작용한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 홀은 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래 아미노산을 보다 잘 수용하도록 생성된다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 노브가 생성되어 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래 아미노산과 부가적인 상호작용을 형성한다.
일부 구현예에서, 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 티로신 또는 트립토판을 보다 작은 측쇄, 예를 들면 CH3 항체 불변 도메인내 Y407V 돌연변이를 갖는 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린 또는 트레오닌으로 대체함으로써 홀이 구축된다. 유사하게, 일부 구현예에서, 보다 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 보다 큰 측쇄, 예를 들면 CH3 항체 불변 도메인에서의 T366W 돌연변이를 갖는 아미노산으로 대체함으로써 노브가 구축된다. 일부 구현예에서, 하나의 Fc 도메인 단량체는 노브 돌연변이 T366W를 포함하고, 다른 Fc 도메인 단량체는 홀 돌연변이 T366S, L358A 및 Y407V를 포함한다. 일부 구현예에서, 고친화도 SIRP-α D1 변이체를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 노브 돌연변이 T366W를 포함하는 Fc 도메인 단량체에 융합되어 원치 않는 노브-노브 동종이량체 형성을 제한한다. 노브-인투-홀 아미노산 쌍의 예는 비제한적으로 표 3에 포함된다.
Figure pct00015
또 다른 접근법은 면역글로불린 불변 도메인 서열, 예를 들면 힌지, CH2 및 CH3의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 융합된 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 사용한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)을 갖는다. WO 94/04690을 참조한다. 또 다른 접근법은 가교결합을 사용하여(예를 들면, 미국 특허 제4,676,980호 참고), 헤테로콘주게이트 항체를 생산한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 디티올 착화제의 존재하에 환원되고, 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된 F(ab')2 단편으로 온전한 항체를 단백질분해적으로 쪼개는 화학적 결합을 사용하여 제조될 수 있으며(예를 들면, Brennan 등, Science, 229: 81 (1985) 참고), 이들 중 하나는 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 일부 구현예에서, Fab'-SH 단편은 화학적으로 커플링된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 단편은 Kostelny 등, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)에서와 같이 류신 지퍼를 사용하여 세포 배양에서 생산된다. 다른 이중특이적 항체 포맷에 대해서는, 예를 들면, Spiess, C. 등 (2015) Mol. Immunol. 67:95-106을 참고한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 디아바디이다. 예를 들면, Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참고한다. 디아바디에서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 페어링하여, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. Gruber 등, J. Immunol, 152:5368(1994)를 참고한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(예를 들면, 미국 특허 제6,248,516 B1 호를 참고한다). 일 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 낙타과(camelid) 항체도 공지되어 있다.
항체는 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산이 단리되고 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들면 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
본 개시의 항체는 이종성 폴리펩타이드, 예를 들면 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 숙주세포에 의해 인식되고 처리(예를 들면, 신호 펩티다아제에 의해 절단됨)되는 것일 수 있다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 처리하지 않는 원핵 숙주세포의 경우, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 장 독소 II 리더로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비를 위해, 천연 신호 서열은 예를 들면 효모 인버타제 리더, 인자 리더(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스 글루코아밀라아제 리더 등으로 치환될 수 있다. 포유동물에서, 바이러스성 분비 리더, 예를 들면 단순 포진 gD 신호뿐만 아니라 세포 발현, 포유동물 신호 서열이 이용가능하다.
발현 및 클로닝 벡터 둘 모두는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주세포에서 복제하여 예를 들면, 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이 서열은 복제의 기원 또는 자율적인 복제 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 일반적으로, 복제 성분의 기원은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기원은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선별 유전자 또는 선별 마커를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용불가능한 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다. 포유동물 세포에 대한 적합한 선별 마커의 또 다른 예는 항체-코딩 핵산을 차지하는데 능숙한 세포의 확인을 가능하게 하는 것들, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 탈탄산효소 등이다. 예를 들면, DHFR 유전자로 전환된 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다.
대안적으로, 관심 항체, 야생형 DHFR 유전자, 및 또 다른 선별 마커, 에컨대 아미노글리코시드 3'-인산전달효소(APH)를 코딩하는 DNA 서열로 전환되거나 동시-전환된 숙주세포(특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별 마커 선택제, 예컨대 아미노 글리코시드 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선별될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터가 적합하다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대하여 공지되어 있다. 효모 프로모터는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 성장 조건에 의해 조절되는 유도성 프로모터/인핸서를 포함할 수 있다. 실제로 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위에서 약 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 그 예는 비제한적으로 포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포푸룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다. 포유동물 숙주세포에서 벡터로부터의 항체 전사는 예를 들면, 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해 조절될 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기원을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로 바이러스의 직접적인 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 대안적으로, 악성 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 사용될 수 있다.
고등 진핵생물에 의한 본 개시의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백 및 인슐린)로부터 많은 인핸서 서열이 공지되어 있다. 그러나 전형적으로, 하나는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다.
진핵생물 숙주세포(효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다중세포 유기체의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다.
본 발명의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키는데 적합한 숙주세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적을 위한 적합한 원핵생물은 진정박테리아, 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세아에 예컨대 에스케리치아, 예를 들면, 이.콜라이, 엔테로박터, 어위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면, 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아, 예를 들면, 세라티아 마르체칸스, 및 시겔라 등을 포함한다. 원핵 생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대 사상균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 베이커 효모는 저급 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 글리코실화 경로가 "인간화된" 특정 진균 및 효모 균주가 선택되어, 부분적으로 또는 완전히 인간의 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산시킬 수 있다. 예를 들면, Li 등, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)을 참고한다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 좀개구리밥(렌니나세아에(Leninaceae)), 알팔파(엠. 트룬카툴라(M. truncatula)) 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주세포는 또한 다중세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda)(유충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터의 상응하는 허용된 곤충 숙주세포가 확인되었다.
척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수 있고, 배양(조직 배양)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham 등, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주(Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포(Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268을 참고한다.
본 발명의 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형된 이글 배지((DMEM), Sigma)가 숙주세포를 배양하는데 적합하다. 또한, Ham 등, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes 등, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지가 숙주세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액(예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 겐타마이신TM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 어느 다른 필요한 보충물은 당해 분야의 숙련가에 알려진 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생성되거나, 또는 배지에 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되면, 제1 단계로서, 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의해 숙주세포 또는 용해된 단편의 미립자 잔해가 제거된다. Carter 등, Bio/Technology 10: 163-167(1992)은 이.콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 기술한다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들면 하이드록실인회석 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피는 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 식
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSX4X5KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호:72)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변(CL) 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 식 중 X4X5는 ND, DN, DS, 또는 SD이다. 특정 구현예에 있어서, CL 도메인은 서열번호:43-46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 비제한적으로
SYELTQPPSVSVSPGQTARITC(서열번호:27), WYQQKPGQAPVTLIY(서열번호:28), NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC(서열번호:29), 및 FGGGTKLTVL(서열번호:30)을 포함하는, 1, 2, 3, 또는 4개의 IGLV3 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 구조 FW1―HVR-L1―FW2―HVR-L2―FW3―HVR-L3―FW4를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하며, 여기서 FW1은 서열 SYELTQPPSVSVSPGQTARITC(서열번호:27)를 포함하고, FW2는 서열 WYQQKPGQAPVTLIY(서열번호:28)를 포함하고, FW3은 서열 NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC(서열번호:29)를 포함하고, FW4는 서열 FGGGTKLTVL(서열번호:30)을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변(CL) 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:36-38 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:43-46 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 1에 나타낸 경쇄 불변 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:36-38 및 43-46으로부터 선택되는 CL 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 . 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:25의 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열번호:43-46으로부터 선택되는 CL 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:48-51로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 서열번호:39-41로부터 선택되는 VL 도메인 및 서열번호:36-38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 임의의 상기 경쇄는 표 2에 나타낸 중쇄 또는 표 2에 나타낸 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄와 조합될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체에는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄가 포함된다. 예를 들면, 일부 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 Fc 영역, 예를 들면, IgG1, IgG2, 또는 IgG4 및 이의 서브타입이다. 예시적이고 비제한적인 Fc 영역은 표 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호:31-35 및 132-139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인 내에서 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 서열번호:31-35 및 132-139의 하나 이상의 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열 내의 Fc 영역은 본원, 예를 들면, 하기에서 기재되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표 2에 나타낸 중쇄 불변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
Figure pct00016
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Figure pct00018
일부 구현예에 있어서, Fc 영역에는 안정성, 당화 패턴 또는 다른 변형, 효과기 세포 기능, 약동력학 등과 같은 하나 이상의 항체 특성에 영향을 미치는 하나 이상의 돌연변이가 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 감소된 또는 최소 당화를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 제거되거나 감소된 효과기 기능을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 개선된 안정성(예를 들면, 힌지 도메인의 개선된 안정성 및/또는 S228P 돌연변이의 사용을 통한 IgG4 항체의 감소된 단량체 교환)을 갖는다.
예시적인 Fc 돌연변이(예를 들면, 상술된 하나 이상의 특성에 영향을 미치는 돌연변이)에는 비제한적으로 (i) 인간 IgG1 Fc 영역 돌연변이 L234A, L235A, G237A, 및 선택적으로 N297A; (ii) 인간 IgG2 Fc 영역 돌연변이 A330S, P331S 및 선택적으로 N297A; 및 (iii) 인간 IgG4 Fc 영역 돌연변이 S228P 및 선택적으로 E233P, F234V, L235A, delG236, 및 N297A(EU 넘버링)가 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역은 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역은 L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 인간 IgG2 Fc 영역은 A330S 및 P331S 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 인간 IgG2 Fc 영역은 A330S, P331S, 및 N297A 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 인간 IgG4 Fc 영역은 S288P 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 인간 IgG4 Fc 영역은 S288P 및 L235E 돌연변이를 포함한다.
세포 표면 항원을 표적으로 하는 항체는 면역 세포에서 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련된 면역자극 및 효과기 기능을 유발할 수 있다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함한 특정 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면의 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합은 항체-코팅된 입자의 식균작용(항체-의존성 세포-매개된 식균작용, 또는 ADCP), 면역 복합체의 제거, 살해 세포에 의한 항체-코팅된 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC) 및 염증성 매체의 방출, 태반 전이 및 면역글로불린 생산 조절을 포함하는 수많은 생물학적 반응을 유발할 수 있다. 또한, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 용해에 중요할 수 있다. 그러나, 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극할 수 있으며, 또한 자가면역 과민증 또는 다른 면역학적 장애에 관여될 수 있다. 특정 Fc 수용체에 결합하는 능력이 감소되거나 또는 제거된 변이체 Fc 영역은 국소 세포 또는 조직을 손상시키지 않거나 파괴시키지 않으면서 리간드 기능을 표적화, 활성화 또는 중화시킴으로써 작용하는 Fc-융합 폴리펩타이드 구조체 및 치료적 항체를 개발하는데 유용하다.
일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 제2 및 제3 항체 불변 도메인(예를 들면, CH2 및 CH3)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 또한 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 항체 아이소타입이다. 추가로, 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 임의의 IgG 하위유형(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, 및 IgG4)이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 변경시키는 야생형 Fc 도메인 단량체 서열로부터의 10가지만큼 많은 변화(예를 들면, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 아미노산 치환, 첨가 또는 삽입, 결실, 또는 이들의 조합)를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 단편은 또 다른 Fc 도메인 단량체와 함께 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 단편은 또 다른 Fc 도메인 단량체와 함께 Fc 도메인을 형성할 수 없다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인의 단편은 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 단편은 제2 Fc 도메인 단량체와 이량체화되어, Fc 수용체에 결합하는 Fc 도메인을 형성하거나, 또는 대안적으로 Fc 도메인 단량체가 Fc 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 폴리펩타이드에 융합된 Fc 도메인 또는 Fc 도메인의 단편은 임의의 면역계-관련된 반응을 유도하지 않는다. Fc 도메인은 CH3 항체 불변 도메인들 사이의 상호작용에 의해 이량체화되는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
야생형 Fc 도메인은 Fc 수용체, 예를 들면, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb 및 FcγRIV에 결합하는 최소 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체의 Fc 도메인은 감소된 효과기 기능, 예컨대 감소된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 보체-의존적 세포용해 (CDC), 감소된 항체-의존적 세포-매개된 식균작용 (ADCP), 또는 이들의 임의의 조합을 유도하는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들면, 본 개시의 항체는 인간 Fc 수용체에 대한 감소된 결합(예를 들면, 최소 결합 또는 결합 부재) 및 보체 단백질 C1q에 대한 감소된 결합(예를 들면, 최소 결합 또는 결합 부재); 인간 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, FcγRIIIB 또는 이들의 임의의 조합에 대한 감소된 결합(예를 들면, 최소 결합 또는 결합 부재) 및 C1q; 변경된 또는 감소된 항체-의존적 효과기 기능, 예컨대 ADCC, CDC, ADCP 또는 이들의 임의의 조합 등을 나타낼 수 있다. 예시적인 돌연변이는 비제한적으로, E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 또는 P329(카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 및 CD64 Fcγ 수용체에 대한 감소된 또는 제거된 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 Fc 영역을 갖는 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교하여 C1q 결합의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-천연 Fc 영역을 갖는 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교하여 CDC의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 감소를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 야생형 서열에 비해 최소로 글리코실화되거나 또는 감소된 글리코실화를 갖는다. 일부 구현예에서, 탈글리코실화는 N297A의 변이에 의해, 또는 N297을 N이 아닌 임의의 아미노산으로 변이시킴으로써 달성된다.
일부 구현예에서, 항체 IgG 불변 영역의 변이체(예를 들면, Fc 변이체)는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 능력이 감소되거나, 식균작용을 유도하는 능력이 감소된다. 일부 구현예에서, 항체 IgG 불변 영역의 변이체(예를 들면, Fc 변이체)는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 능력이 감소하고 식균작용을 유도하는 능력이 감소된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, Fc 도메인은 "사멸된" Fc 도메인의 전형적인 효과기 기능이 결핍되도록 돌연변이된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인과 Fcγ 수용체 사이의 상호작용을 최소화하는 것으로 알려진 특정 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 IgG1 항체로부터 유래된 것이며, 아미노산 치환 L234A, L235A, G237A 및 N297A(카밧 등, 1991의 EU 넘버링 시스템에 따라 지정된 아미노산 위치 넘버링) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 돌연변이가 상기 IgG1 Fc 변이체에 포함된다. 인간 IgG1 Fc 변이체에 대한 상기 추가 돌연변이의 비-제한적인 예는 E318A 및 K322A를 포함한다. 일부 사례에서, 인간 IgG1 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 최대 총 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 이하의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 결실이 상기 IgG1 Fc 변이체에 포함된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 예를 들면, 폴리펩타이드가 박테리아 또는 포유동물 세포에서 생산될 때 폴리펩타이드의 균질성을 증가시키기 위해 Fc IgG1 중쇄 불변 영역의 C-말단 라이신이 결실된다. 일부 사례에서, 인간 IgG1 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 최대 총 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 이하의 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 IgG2 항체로부터 유래된 것이며, 아미노산 치환 A330S, P331S 또는 A330S 및 P331S 모두를 포함한다. 상기 언급된 아미노산 위치는 카밧 등 (1991)에 따라 정의된다. 아미노산 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 변이체는 A330S, P331S 및 N297A 아미노산 치환(카밧 등, 1991의 EU 넘버링 시스템에 따라 지정됨) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG2 Fc 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 돌연변이는 상기 IgG2 Fc 변이체에 포함된다. 인간 IgG2 Fc 변이체에 대한 상기 추가 돌연변이의 비-제한적인 예는 V234A, G237A, P238S, V309L 및 H268A(카밧 등, 1991의 EU 넘버링 시스템에 따라 지정됨)를 포함한다. 일부 사례에서, 인간 IgG2 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG2 서열과 비교하여 최대 총 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 이하의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 결실이 상기 IgG2 Fc 변이체에 포함된다.
Fc 변이체가 IgG4 Fc 변이체인 경우, 일부 구현예에서, 상기 Fc 변이체는 (카밧, 등 (1991)에 따라 지정된 아미노산 위치 넘버링) S228P, E233P, F234V, L235A, L235E 또는 delG236 돌연변이를 포함한다. 일부 사례에서, 인간 IgG4 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG4 서열과 비교하여 최대 총 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 상기 대상체의 Fc 수용체에 대한 결합이 감소된 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 상기 대상체의 Fc 수용체에 대한 결합이 제거된 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 식균작용의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 제거된 식균작용을 나타낸다.
본 명세서에서 ADCC로도 지칭되는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성은 특정 세포독성 세포(예를 들면, 자연 살해(NK) 세포 및 중성구) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 Ig를 분비하여, 상기 세포독성 효과기 세포가 항원-담지 표적 세포에 특이적으로 결합하고 이어서 표적 세포를 죽일 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. 본 명세서에서 ADCP로도 지칭되는 항체-의존성 세포-매개된 식균작용은 특정 식세포(예를 들면, 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 Ig를 분비하여, 상기 식균작용 효과기 세포가 항원-담지 표적 세포에 특이적으로 결합하고 이어서 표적 세포를 삼키고 소화시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. 표적 세포의 표면으로 지향된 리간드-특이적 고친화도 IgG 항체는 세포독성 또는 식균작용성 세포를 자극할 수 있으며, 그러한 살해에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 감소된 ADCC 또는 ADCP를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 ADCC 또는 ADCP 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 제거된 ADCC 또는 ADCP를 나타낸다.
본 명세서에서 CDC로도 지칭되는 보체-지향된 세포독성은 보체 캐스케이드가 항체 Fc에 결합하는 보체 성분 C1q에 의해 활성화되는 세포독성의 형태를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 C1q 결합 감소를 나타낸다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 감소된 CDC를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 구조체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 CDC 감소를 나타낸다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 구조체와 비교하여 무시할 수 있는 CDC를 나타낸다.
본 발명의 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내는 것들을 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, Fc 변이체는 Fcγ 수용체에 대한 야생형 인간 IgG Fc 영역에 의해 나타나는 결합보다 적은 Fcγ 수용체에 대한 결합을 나타낸다. 일부 경우에, Fc 변이체는 Fcγ 수용체에 대한 결합을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(완전히 제거된 효과기 기능)의 인자까지 감소시켰다. 일부 구현예에서, 감소된 결합은 임의의 하나 이상의 Fcγ 수용체, 예를 들면 CD16a, CD32a, CD32b, CD32c 또는 CD64에 대한 것이다.
일부 사례에서, 본 명세서에 개시된 Fc 변이체는 그의 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 식균작용의 감소를 나타낸다. 이러한 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 식균작용의 감소를 나타내며, 여기서 식균작용 활성의 감소는 예를 들면 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 인자까지의 감소이다. 일부 사례에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 제거된 식균작용을 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 제제에 접합된다. 일부 구현예에 있어서, 제제는 비제한적으로 본원에서 기재되는 예시적 세포독성제가 포함되는 세포독성제이다. 일부 구현예에 있어서, 제제는 비제한적으로 본원에서 기재되는 예시적 표지가 포함되는 표지이다.
일부 구현예에 있어서, 제제는 면역계를 조절하는 모이어티이다. 예를 들면, SIRP-α를 발현하는 세포의 세포 신호전달 경로를 조절하는 소분자, 예를 들면, IDO/TDO 억제제, AhR 억제제, 아르기나제 억제제, A2a R 억제제, TLR 작용제, STING 작용제, 또는 Rig-1 작용제와 같은 모이어티는 그 표면 상에서 SIRP-α를 발현하는 세포의 기능을 표적화하고/하거나 조절할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 그 표면 상에서 SIRP-α를 발현하는 세포 인근으로 또 다른 거대분자 또는 세포를 모집할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 사이토카인, 예를 들면, IL2, IL7, IL-10, IL15, 또는 IFN을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티(예를 들면, 소분자)는 사이토카인, 예를 들면, IL2, IL7, IL-10, IL15, 또는 IFN의 활성을 조절한다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 암 백신(예를 들면, DNA, RNA, 펩타이드, 또는 다른 세포 성분(들)을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 아주반트를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 CpG 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 항체 정제, 스크리닝, 및/또는 디스플레이에 영향을 미친다. 일부 구현예에 있어서, 모이어티는 또한 Fc 수용체에 대한 결합 정도 또는 식균작용 감소 정도에 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 융합 파트너는 링커 서열을 통해 Fc 변이체 서열에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 일반적으로 적은 수의 아미노산, 예컨대 10개 미만의 아미노산을 포함하지만, 보다 긴 링커가 또한 이용된다. 일부 경우에, 링커의 길이는 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개의 아미노산 이하이다. 일부 경우에, 링커의 길이는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 또는 35개의 아미노산 이상이다. 선택적으로, 일부 구현예에서, 절단가능한 링커가 사용된다.
일부 구현예에서, 융합 파트너는 Fc 변이체 단백질 및 임의의 관련 융합 파트너를 원하는 세포 위치 또는 세포외 매체로 향하게 하는 표적화 또는 신호 서열이다. 일부 구현예에서, 특정 신호전달 서열은 단백질을 성장 배지 또는 세포의 내막과 외막 사이에 위치한 주변세포질 공간으로 분비하도록 표적화한다. 일부 구현예에서, 융합 파트너는 정제 또는 스크리닝을 가능하게 하는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열이다. 그와 같은 융합 파트너는 비제한적으로, 폴리히스티딘 태그(His-태그)(예를 들면 His6 및 His10) 또는 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 시스템(예를 들면, Ni+2 친화성 칼럼)과 함께 사용하기 위한 다른 태그, GST 융합, MBP 융합, Strep-태그, 박테리아 효소 BirA의 BSP 바이오티닐화 표적 서열, 및 항체에 의해 표적화되는 에피토프 태그(예를 들면, c-myc 태그, 플래그-태그 등)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 태그는 정제, 스크리닝, 또는 이 둘 모두에 유용하다. 예를 들면, 일부 구현예에서, Fc 변이체는 His-태그를 사용하여, 이를 Ni+2 친화성 칼럼에 고정시킴으로써 정제된 다음 정제 후 동일한 His-태그가 사용되어, 항체를 Ni+2 코팅된 플레이트에 고정시켜, ELISA 또는 다른 결합 검정을 수행한다.
다양한 선택 방법을 가능하게 하는 다양한 융합 파트너가 이용가능하다. 예를 들면, Fc 변이체 라이브러리의 구성원을 유전자 III 단백질에 융합시킴으로써, 파아지 디스플레이가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 파트너는 Fc 변이체를 표지할 수 있게 한다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 융합 파트너는 발현 벡터상의 특정 서열에 결합하여, 융합 파트너 및 관련 Fc 변이체를 이들을 코딩하는 핵산과 공유 또는 비공유 결합할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 융합 파트너가 치료적 모이어티인 경우, 치료적 모이어티는 예를 들면, 세포독성 제제, 펩타이드, 단백질, 항체, siRNA 또는 소분자이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 다양한 담체 또는 표지와 결합되어 특정 항원 발현 세포의 존재를 검출하는데 사용된다. 담체의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 가용성이거나 불용성일 수 있다. 다양한 상이한 라벨 및 라벨링 방법이 공지되어 있다. 라벨의 예는 효소, 방사선동위원소, 형광 화합물, 콜로이드성 금속, 화학발광 화합물, 및 생체-발광성 화합물을 포함한다. 본 명세서에 개시된 항체에 라벨을 결합시키기 위한 다양한 기술이 이용가능하다. 일부 구현예에서, 항체는 저분자량의 합텐에 커플링된다. 이들 합텐은 제2 반응에 의해 특이적으로 검출된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 합텐 바이오틴은 아비딘 또는 합텐과 함께 사용되고, 디니트로페놀, 피리독살, 또는 플루오레세인은 특이적 항-헵텐 항체(예를 들면, 항-디니트로페놀 항체, 항-피리독살 항체, 및 항-플루오레세인 항체 각각)에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체는 면역 검정과 같은 결합 검정을 위해 시험관내에서 이용된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 항체는 액상으로 이용되거나, 또는 고상 담체에 결합된다. 일부 구현예에서, 면역 검정을 위해 이용되는 항체는 다양한 방식으로 검출가능하게 표지된다.
치료 방법
본 발명의 특정 측면은 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 질환 또는 장애를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 상기 질환은 자가면역 또는 염증성 질환이다.
예를 들면, 유효량의 본 개시의 항체를 투여함으로써 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 본 명세서에 기재된 항체는 예를 들면, CD47:SIRP-α 신호전달 축을 통한 식균작용 및 면역 감시를 저해하는 암의 능력을 억제함으로써, 또는 그렇지 않으면 면역계의 활성화(예컨대 수지상 세포의 활성화)를 강화시킴으로써 암의 치료에 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 제2 항체, 예를 들면 암에 의해 발현되는 항원에 결합하는 항체(예컨대, 본 개시의 항-SIRP-α 항체를 투여하는 것과 관련하여 일부 구현예에서 상기 기재된 바와 같이 고려될 수 있는 제2 항체의 유효량)와 조합하여 투여된다. 암에 의해 발현되는 예시적인 항원은 당해 기술에 공지되어 있고, 및 비제한적으로 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, 뮤신 1, 뮤신 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, 엔도텔린 B 수용체, 메소텔린, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, 넥틴 4, NaPi2b, LIV-1A, 구아닐릴 사이클라제 C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나스신, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, 뮤신, CAIX, EPHA3, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, 및 NY-ESO-1/LAGE로부터의 펩타이드를 포함하는 MHC/펩타이드 복합체, SSX-2, MAGE 계열 단백질, MAGE-A3,　gp100/pmel17,　멜란-A/MART-1,　gp75/TRP1,　티로시나제,　TRP2, CEA, PSA,　TAG-72,　미성숙한 라미닌 수용체,　 MOK/RAGE-1, WT-1, 　SAP-1,　BING-4,　EpCAM,　MUC1, PRAME, 서바이빈,　BRCA1, BRCA2, CDK4,　CML66,　MART-2, p53, Ras, β카테닌, 　TGF-βRII, HPV E6, 또는 HPV E7을 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 탈라코투주맙(talacotuzumab)(CSL362 및 JNJ-56022473으로도 공지됨)과 같은 CD123(IL-3 수용체 알파로도 공지됨)에 결합하는 단클론성 항체와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 EGFR에 결합하는 단클론성 항체(예를 들면, 세툭시맙)와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 항체는 하나 이상의 효과기 기능, 예를 들면 ADCC 또는 ADCP, 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 비제한적으로 포함하는 면역 세포상의 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련된 효과기 기능을 포함한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 예를 들면, SIRP-α 항체로 종양 세포에 의해 발현된 임의의 CD47에 대한 백혈구에 의해 발현되는 SIRP-α의 반응성을 억제하면서 FcR-발현 백혈구가 제2 항체가 결합된 종양 세포를 표적으로 하도록 유도하기 위해서는, 그와 같은 항체를 본 개시의 항체와 배합시키는 것이 특히 유리하다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 NK 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항체와 조합되어 투여된다. NK 세포에 의해 발현되는 예시적인 항원에는 비제한적으로 NKR-P1A(KLRB1), CD94(NKG2A), KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DS1, CD94(NKG2C/E), NKG2D, CD160(BY55), CD16(FcγIIIA), NKp46(NCR1), NKp30(NCR3), NKp44(NCR2), DNAM1(CD226), CRTAM, CD27, NTB-A(SLAMF6), PSGL1, CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), NKp80(KLRF1, CLEC5C), SLAMF7(CRACC, CS1, CD319), 및 CD244(2B4, SLAMF4)가 포함된다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 면역치료제(예를 들면, 상술된 바와 같은, 일부 구현예에 있어서 본 개시의 항-SIRP-α 항체를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있는 면역치료제의 유효량)과 조합하여 투여된다. 면역치료제는 공동자극 경로의 조절제, 암 백신, 재조합적으로 변형된 면역 세포 등과 같이, 면역계를 표적화하며 면역계의 치료 재유도를 촉진하는 임의의 치료제를 나타낼 수 있다. 예시적이고 비제한적인 면역치료제가 후술된다. 이론에 구애받고자 하지 않고, 본 개시의 항체는, 예를 들면, 종양 세포를 표적화하기 위해 대식세포 및 T효과기 세포와 같은 다른 면역 세포 모두를 활성화하는 데 있어서, 상보적 작용 기전으로 인해 면역치료제와 사용하기 적합한 것으로 여겨진다.
일부 구현예에 있어서, 면역치료제는 항체를 포함한다. 면역치료 항체의 예시적인 항원은 당해 분야에 알려져 있으며 비제한적으로 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-15, FGL-1, CD200, CD200R, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, 아르기나제, IDO, TDO,　AhR, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, TGF-β RI, TGF-β RII, c-Kit, CD244, L-셀렉틴 /CD62L, CD11b, CD11c, CD68, 41BB,　CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, TNFR2, PVRIG, DNAM, 및 ICOS가 포함된다. 승인된 또는 후기 임상 평가 중인 면역치료제에는 비제한적으로 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 등이 포함된다. 특정 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 PD-L1/PD-1 경로의 억제제, 예를 들면, 항-PD-L1 또는 항-PD-1 항체와 조합하여 투여된다. 본원에서 실증된 바와 같이, 본 개시의 항-SIRP-α 항체 및 PD-L1/PD-1 경로의 억제제의 조합 투여는 상승적 항-종양 활성을 일으킬 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 면역치료제는 백신, 종양용해 바이러스, 차용 세포 치료법, 사이토카인, 또는 소분자 면역치료제를 포함한다. 이러한 면역치료제의 예는 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 차용 세포 치료법 및 치료제에는 비제한적으로 키메라 항원 수용체 T-세포 치료법(CAR-T), 종양 침윤 림프구(TIL), TCR 조작 NK 세포, 및 대식세포 세포 제품이 포함될 수 있다. 백신에는 비제한적으로 폴리뉴클레오타이드 백신, 폴리펩타이드 백신, 또는 세포-기반(예를 들면, 종양 또는 수지상 세포-기반) 백신이 포함될 수 있다. 암 치료에 유용한 다양한 사이토카인이 알려져 있고 비제한적으로 IL-2, IL-15, IL-7, IL-10, IL-12, IL21, TNFa, IFN, GM-CSF, 및 조작된 사이토카인 돌연변이체가 포함된다. 소분자 면역치료제에는 비제한적으로 IDO/TDO 억제제, AhR 억제제, 아르기나제 억제제, A2a R 억제제, TLR 작용제, STING 작용제, 및 Rig-1 작용제가 포함될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 화학치료제 또는 소분자 항암제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 면역치료제 및 화학치료제 또는 소분자 항암제와 조합하여 투여된다. 예를 들면, 신호전달 경로(예를 들면, PAK4, PI3K 등)의 키나제 억제제 또는 다른 억제제는 암 치료를 위해 면역계의 조절과 조합되어 유용할 수 있다고 여겨진다. 이와 같이, 본 개시의 항체는 암을 치료하기 위해 하나 이상의 화학치료제 및/또는 소분자(예를 들면, 키나제 억제제)와의 조합으로 용도를 찾을 수 있다. 본 개시의 항체와 조합하여 사용하기 위해 고려되는 화학치료제 및/또는 항암제의 비제한적 예가 아래에 제공된다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 비제한적으로 메토트렉세이트(RHEUMATREX®, 아메토프테린) 사이클로포스파미드(CYTOXAN®), 탈리도마이드(THALIDOMID®), 아크리딘 카복사미드, Actimid®, 액티노마이신, 17-N-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 아미노프테린, 암사크린, 안트라-사이클린, 안티네오플라스틱, 안티네오플라스톤, 5-아자시티딘, 아자티오프린, BL22, 벤다무스틴, 비리코다, 블레오마이신, 보르테조밉, 보스타틴, 부설판, 칼리쿨린, 캄프토테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈, 다카르바진, 다사티닙, 다우노루비신, 데시타빈, 디클로로아세트산, 디스코드 올리드, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에리불린, 에스트라무스틴, 에토포시드, 엑사테칸, 엑시설린드, 페루기놀, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 포스페스트롤, 포테무스틴, 갱시클로비어, 젬시타빈, 하이드록시우레아, IT-101, 이다루비신, 이포스파미드, 이미퀴모드, 이리노테칸, 이로풀벤, 익사베필론, 라니퀴다르, 라파티닙, 레날리도미드, 로무스틴, 루르토테칸, 마포스파미드, 마소프로콜, 메클로르에타민, 멜팔란, 메르캅토푸린, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 넬라라빈, 닐로티닙, 오블리메르센, 옥살리플라틴, PAC-1, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 펜토스타틴, 피포브로만, 픽산트론, 플리카마이신, 프로카르바진, 프로테아좀 억제제(예를 들면, 보르테조밉), 랄티트렉시드, 레베카마이신, Revlimid®, 루비테- 칸, SN-38, 살리노스포라미드 A, 사트라플라틴, 스트렙토조토신, 스와인소닌, 타리퀴다르, 탁산, 테가푸르-우라실, 테모졸로미드, 테스토락톤, 티오TEPA, 티오구아닌, 토포테칸, 트라벡테딘, 트레티노인, 트리플라틴 테트라니트레이트, 트리스(2-클로로에틸) 아민, 트록사시타빈, 우라실 머스타드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 보리노스타트, 조수퀴다르 등이 포함되는 치료제(예를 들면, 화학치료제/세포독성제)와 조합하여 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 표적화된 소분자 억제제와 조합하여 투여된다. 예를 들면, 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 VEGFR/PDGFR 억제제(예를 들면, 소라페닙, 수니티닙, 레바티닙, 반데타닙, 카보자티닙, 아파티닙, 파조파닙, 악시티닙, 또는 레고라페닙), EGFR 억제제(예를 들면, 에를로티닙, 게피티닙, 또는 오시메르티닙), MEK 억제제(예를 들면, 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 또는 셀루메티닙), ALK 억제제(예를 들면, 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙, 로를라티닙, 엔트렉티닙, TSR-011, CEP-37440, 또는 X-396), CDK4/6 억제제(예를 들면, 팔보시클립, 리보시클립, 또는 아베마시클립), PARP 억제제(예를 들면, 올라파립, 루카파립, 니라파립, 탈라조파립, 파미파립, 벨리파립, CEP 9722, 또는 E7016), mTOR 억제제, KRAS 억제제, TRK 억제제(예를 들면, 라로트렉티닙), BCL2 억제제(예를 들면, 베네토클락스), IDH 억제제(예를 들면, 이보시데닙 또는 에나시데닙), 저메틸화제(예를 들면, 데시타빈 또는 아자시티딘), PI3K 억제제, 또는 DDR(예를 들면, CHK, ATM, 또는 ATR) 억제제와 조합하여 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 비제한적으로 3F8, 8H9, 아바고보맙, 앱식지맙, 아비투주맙, 아브릴루맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD518, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 킨주맙(IMA-638), 아폴리주맙, 아르시투모맙, 아스크린바쿠맙, 아셀리주맙, 아테졸리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙(토실리주맙), 아토롤리무맙, 바피네우주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베겔로맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, 보코시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론틱투주맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데티드, 카를루맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, CC49, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코드리투주맙, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, 크레네주맙, CR6261, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 덱트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데노수맙, 데를로툭시맙 바이오틴, 데투모맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 두르발루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 엔구맙, 엘델루맙, 엘겜투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에미베투주맙, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑시비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 젬투주맙 오조가미신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, 이고보맙, IMAB362, 이말루맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 이닉시맙, 인테투무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌질루맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트락세탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키베트맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 룰리주맙 페골, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 마르빌리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 납투모맙 에스타페나톡스, 나마투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메엔탄, 오블리톡삭시맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오잔주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨브롤리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡삭시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡삭시맙, 세비루맙, 시브로투주맙, SGN-CD19A, SGN-CD33A, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 소투주맙 베도틴, 솔란주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술래소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, 테바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, TGN1412, 티실리무맙(트레멜리무맙), 틸드라키주맙, 티가투주맙, TNX650, 토실리주맙(아틀리주맙), 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바를릴루맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 보르세투주맙 메포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙, 또는 졸리모맙 아리톡스가 포함되는 치료제와 조합하여 투여된다.
본 개시의 항체 및 여러 추가 제제(예를 들면, 상술된 제제)를 포함하는 조합 치료가 고려된다. 예를 들면, 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 화학치료제/세포독성제 및 항체 또는 표적화된 소분자 억제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 화학치료제/세포독성제 및 면역치료제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체는 항체 또는 표적화된 소분자 억제제 및 면역치료제와 조합하여 투여된다.
당 업계에 공지된 임의의 암 유형, 예컨대 비제한적으로 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 림프종, 및 모세포종이 포함될 수 있다. 그러한 암의 보다 구체적인 예는 비제한적으로 폐암, 편평상피 세포 암, 뇌종양, 교모세포종, 두경부 암, 간세포 암, 결장직장암(예를 들면, 결장암 또는 직장암), 간암, 방광암, 위암 또는 위장암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 요로암, 유방암, 복막 암, 자궁암, 타액선 암, 신장 또는 신장암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종(비-호지킨 림프종(NHL) 포함); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 골수 백혈병(AML); 머켈 세포 암종; 모발 세포 백혈병; 만성 골수아세포 백혈병(CML); 및 관련된 전이를 포함한다.
암 요법에 추가하여, 본원에서 제공된 항체는, 예를 들면 고갈 면역 세포에 의한 염증성 질환의 치료에서 세포를 고갈시키는 목적으로 단클론성 항체를 투여하는 요법에 유용하다. 이러한 목적을 위해, 본원에서 제공된 항체는 제2 치료적 항체, 예를 들면 염증성 질환 및 자가면역 상태에서 B 세포의 고갈에 대한 리툭시맙; 다발성 경화증에 대한 알렘투주맙(alemtuzumab); 면역억제에 대한 OKT3; 골수 이식 컨디셔닝에 대한 다른 것들; 등과 조합하여 투여된다.
본 개시의 항체의 유효량을 투여함으로써 개체에서 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진행을 치료 또는 지연시키는 방법이 추가로 제공된다. 본 발명에 따른 치료가 가능한 자가면역 질환 및 염증성 질환은 비제한적으로 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐 섬유증, 섬유성 질환(예를 들면, 폐 섬유증, 간경변증, 심방 섬유증, 심내막 섬유증, 골수 섬유증 또는 후복막 섬유증), 천식, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 혈관염, 및 염증성 자가면역 근염을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 치료제, 예컨대 면역억제성, 항-염증성 또는 면역조절 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 자가면역 질환 또는 염증성 질환, 예를 들면 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선,　건선성 관절염, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 재관류, 크론병,　궤양성 대장염,　자궁내막증, 사구체신염,　IgA 신병증, 다낭성 신장 질환, 중증 근무력증, 특발성 폐 섬유증, 섬유성 질환(예를 들면, 폐 섬유증, 간경변증, 심방 섬유증, 심내막 섬유증, 골수 섬유증 또는 후복막 섬유증), 천식,　아토피 피부염, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 혈관염, 또는 염증성 자가면역 근염의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 약제학적 제형, 예를 들면 항체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형의 일부이다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 제형은 원하는 순도를 갖는 활성 성분(예컨대 항체 또는 폴리펩타이드)을 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태의 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed(1980)). 약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투약량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는, 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 동결건조된다.
일부 구현예에 있어서, 개체에는 상기 개체의 체중에 대해 정상화된 용량이 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 개체에는 본 개시의 항체 약 10 ㎍/kg, 약 50 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 200 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 400 ㎍/kg, 약 500 ㎍/kg, 약 600 ㎍/kg, 약 700 ㎍/kg, 약 800 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg, 약 1,000 ㎍/kg, 약 1,100 ㎍/kg, 1,200 ㎍/kg, 1,300 ㎍/kg, 1,400 ㎍/kg, 1,500 ㎍/kg, 1,600 ㎍/kg, 1,700 ㎍/kg, 1,800 ㎍/kg, 1,900 ㎍/kg, 약 2,000 ㎍/kg, 약 3000 ㎍/kg, 약 4000 ㎍/kg, 약 5000 ㎍/kg, 약 6000 ㎍/kg, 약 7000 ㎍/kg, 약 8000 ㎍/kg, 약 9000 ㎍/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg 약 90 mg/kg, 약 100 mg/kg, 약 200 mg/kg, 약 300 mg/kg, 약 400 mg/kg, 약 500 mg/kg, 약 600 mg/kg, 약 700 mg/kg, 약 800 mg/kg, 약 900 mg/kg, 또는 약 1000 mg/kg의 용량이 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 본 개시의 항체가 개체에 투여되는 시기는 질환 단계, 환자의 병력 및 주치의의 판단에 의해 결정되는 임의의 적합한 기간이다. 이러한 적합한 기간의 예에는 비제한적으로 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 7개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 11개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 13개월, 적어도 약 14개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 16개월, 적어도 약 17개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 19개월, 적어도 약 20개월, 적어도 약 21개월, 적어도 약 22개월, 적어도 약 23개월, 또는 적어도 약 24개월 이상이 포함된다. 특정 측면에 있어서, 치료 기간은 요망되는 경우 24개월보다 길게, 예컨대 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 36개월, 또는 36개월보다 긴 기간 동안 계속된다. 일부 구현예에 있어서, 기간은 6개월, 1년 또는 2년이다. 또 다른 구현예에 있어서, 본원에서 기재되는 임의의 방법에 대한 투여 시기는 적어도 약 2주, 적어도 약 4주, 적어도 약 8주, 적어도 약 16주, 적어도 약 17주, 적어도 약 18주, 적어도 약 19주, 적어도 약 20주, 적어도 약 24주, 적어도 약 28주, 적어도 약 32주, 적어도 약 36주, 적어도 약 40주, 적어도 약 44주, 적어도 약 48주, 적어도 약 52주, 적어도 약 60주, 적어도 약 68주, 적어도 약 72주, 적어도 약 80주, 적어도 약 88주, 적어도 약 96주, 또는 적어도 약 104주 동안이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 설명을 위한 것이며, 그에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당해 분야의 숙련가에게 제안될 것이며, 및 본원의 사상 및 영역 및 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 제안될 것이다.
실시예 1: SIRP-α 단백질에 대한 신규한 결합 특이성을 가진 항체의 동정
방법
항체 생산
면역화를 위해 하기의 단백질을 사용하였다. 각각은 증가된 면역원성을 위해 변형된 Fc 영역(S228P 돌변변이를 함유하는 힌지 영역을 갖는 인간 IgG4 Fc 또는 IgG1_AAA_N297A로 명명된 L234A/L235A/G237A/N297A 인간 IgG1 Fc)에 융합된 인간 또는 마우스 SIRP-α 펩타이드를 포함한다.
Figure pct00019
상기 단백질은 야생형 닭, 인간으로부터의 VH 및 닭으로부터의 VL을 함유하는 유전자도입 닭인 SynVH 닭, 또는 완전 인간 "HuMAB" 면역글로불린 유전자좌를 갖는 닭을 면역화하는데 사용되었다(Crystal Bioscience; 예를 들면, WO2012162422, WO2011019844 및 WO2013059159를 참고한다). 닭은 항원을 교대 용량의 항원을 갖는 다양한 스케줄로 면역화시켰다. 예시적인 면역화 스케쥴은 하기와 같다: 1주째에 서열번호: 1의 서열을 갖는 100μg 용량의 항원으로 초기 면역화, 3주째에 서열번호: 2의 서열을 갖는 100μg 항원의 부스트, 4주째에 드로잉, 5주째에 서열번호: 1의 서열을 갖는 50μg 용량의 항원으로 부스트, 6주째에 드로잉, 7주째에 서열번호: 2의 서열을 갖는 50μg의 항원으로 부스트, 및 8주째에 드로잉. 닭 면역화에 대한 추가의 설명은 예를 들면, Mettler Izquierdo, S. 등 (2016) Microscopy (Oxf) 1-16에서 찾아볼 수 있다.
포유류 SIRP-α 서열과 비교할 때, 닭 SIPRα의 서열은 유의하게 더 발산성인 것으로 확인되었다. 이론에 구애받고자 하지 않고, 포유류 및 닭 SIRP-α 서열 간 발산성은 여러 포유류 SIRP-α 단백질에 걸쳐 교차 반응하는 항체를 생성할 독특한 기회를 제공할 것으로 여겨졌다. 예를 들면, 면역 관용성으로 인해 마우스 숙주로부터 쥣과 서열과 교차 반응하는 항-SIRP-α 항체를 생성하기 어려울 수 있다. 또한, 닭 및 포유류 면역계 간 발산성이 클수록 항체 생산에서 더 큰 다양성을 야기할 수 있다.
이론에 구애받고자 하지 않고, 인간, 사이노몰로구스, 및/또는 쥣과 단백질 간 교차 반응성 결합을 갖는 항체는 동물 모델 및 임상 평가 모두에서 항체의 특성규명을 허용할 수 있다고 여겨진다. 이소형- 및/또는 변이체-특이적 결합을 갖는 항체는 특정 인간 집단에 대한 맞춤화된 의약 접근 및/또는 특정 관심 변이체에 대한 연구를 위해 유용할 수 있다.
K off 의 결정
다양한 SIRP 단백질에 대한 항체 클론의 결합은 작동 완충제로서 0.01% Tween-20(PBST)을 보충한 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4)를 사용하여 ProteOn XPR36 기기(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검출을 사용하여 결정하였다. 분비된 항체를 함유하는 사전-여과된 배지를 검정에 직접 사용하였다. 먼저, 항-인간 IgG Fc(BR-1008-39, GE Healthcare)를 GLC 센서 칩에 아민-커플링시켜 항체의 포획 표면을 생성시켰다. 고정화된 항-인간 IgG Fc의 유동 세포 당 약 4000 RU가 달성된다. 하기와 동일한 방법을 사용하여 각각의 클론을 스크리닝한다. 스크린에 사용된 SIRP 피분석물은 다양한 종 (인간 v1, 인간 v2, 사이노몰거스, 마우스 129, BL6, BALBc, NOD), 인간 SIRP-β, 및 인간 SIRP-γ, 서열번호 5, 6, 11, 7, 9, 10, 8, 13 및 15 각각으로부터의 SIRP-α이었다.
약 5-10 uL의 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.5) 중 사전-여과된 배지를 30 uL/분으로 2분 동안 주입한 후 100 uL/분으로 1분 동안 완충액을 흘렸다. SIRP 피분석물(100 nM)을 100 uL/분으로 1분 동안 주입한 후 10분 동안 해리 사이클을 거쳤다. 두 방향으로 모두 25 uL/분으로 1분 동안 3 M 마그네슘 클로라이드를 흘린 후 100 uL/분으로 1분 동안 완충액을 흘려 칩 표면 재생을 달성하였다. 반응 스팟 데이터(고정화된 항-인간 IgG Fc)로부터 스팟간 데이터(고정화되지 않은 항-인간 IgG Fc 함유)를 뺀 후 피분석물 주입 반응으로부터 완충액 “블랭크” 피분석물 주입 반응을 빼서 바이오센서 데이터를 이중 참조하였다. 1:1 랭뮤어(랭뮤어) 및 계산된 Koff(1/S) 값을 사용하여 결합을 피팅시켰다. 모든 SPR 검정은 25℃에서 수행하였다.
K D 의 결정
다양한 종(인간 v1, 인간 v2, 사이노몰구스, 마우스 129, BL6, BALBc, NOD), SIRPβ 및 SIRPγ로부터의 SIPRα와의 항-SIRPα 항체의 상호작용을 하기 프로토콜에 따라 항체의 (GLC 칩을 통한) 직접적인 고정화 또는 (NLC 칩을 통한) 바이오티닐화된 단백질 A를 통한 포획의 2가지 방법을 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 GLC 또는 NLC 센서 칩이 구비된 SPR-기반 ProteOn XPR36 바이오센서(BioRad, Inc, Hercules, CA)를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 항체는 FreeStyleTM 293-FS 세포(Thermo Fisher)를 사용하여 발현되었다. 정제는 표준 단백질 A 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 용출된 항체는 PBS 완충액에 저장하였다.
러닝 완충액은 0.01% Tween-20(PBST+)을 갖는 PBS pH 7.4이었다. 모든 피분석물은 A280 흡광도에 의해 결정된 그들의 명목 농도로 사용하였으며, 그의 몰 계산된 소광 계수를 사용하였다. 피분석물은 다른 곳에서 기재된 바와 같이 "원-샷(one-shot)" 동력학 방식으로 주사하였다(예를 들면, Bravman, T. 등 (2006) Anal. Biochem. 358:281-288를 참고한다).
GLC 칩을 사용하는 방법의 경우, 피분석물을 주사하고 Proteon 아민 커플링 키트를 사용하여 GLC 칩 상에 고정된 항-SIRPα 항체(약 1000 RU) 상에 유동시켰다. 고정화 단계를 위해, 1/100 희석된 EDAC/Sulpho-NHS 1:1(Biorad)을 사용하여 25μL/분으로 300초 동안 GLC 칩을 활성화시켰다. 항-SIRPα 항체를 10 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)에서 80 nM 농도로 희석하고, 30 μL/분으로 50초 동안 칩에 고정시켰다. 칩을 에탄올아민으로 25 μL/분으로 300초 동안 불활성화시켰다. 피분석물(예를 들면, 상이한 종으로부터의 SIRP-α, SIRP-β, SIRP-γ)을 100, 33, 11, 3.7, 1.2 및 0 nM의 명목 농도에서 "원-샷" 동력학 방식으로 주사하였다. 회합시간은 100μL/분에서 90초 동안 모니터링하고, 해리시간은 1200초 동안 모니터링하였다. Pierce IgG 용출 완충액/4M NaCl의 2:1 v/v 블렌드로 표면을 재생시켰다.
대안적으로, KD 결정은 NLC 칩을 통한 항체 포획을 사용하여 수행하였다. 이 경우, 15ug/mL 바이오티닐화된 단백질 A(Thermofisher)를 NLC 칩 위에 120초 동안 30uL/분으로 주사하여, 약 1000 내지 1200RU의 고정화 반응을 얻었다. 다음으로, 항-SIRPα 항체(약 160nM)를 30uL/분으로 80초 동안 주사하였다. 피분석물(다른 종으로부터의 SIRPα, SIRP-β 및 SIRP-γ)을 명목 농도 100, 33, 11, 3.7, 1.2 및 0 nM에서 "원-샷" 동역학 방식으로 주사하였다. 25 μL/분으로 60초 동안 회합시간을 모니터링하고, 120초 동안 해리시간을 모니터링하였다. Pierce IgG 용출 완충액/4M NaCl의 2:1 v/v 블렌드로 표면을 재생시켰다.
반응 스폿 데이터(고정화된 단백질)로부터 스폿간(interspot) 데이터(고정화화되지 않은 단백질을 포함함)를 차감하고, 이어서 피분석물 주사로부터 완충액 "블랭크" 피분석물 주사의 반응을 차감함으로써 바이오센서 데이터를 이중-참조하였다. 이중-참조된 데이터는 단순 랑뮤어(랭뮤어) 모델에 전반적으로 적합하였고, KD 값은 겉보기 동력학 속도 상수의 비율(KD = kd/ka)로부터 계산되었다.
결과
선택된 마우스 SIRP-α 단백질에 대한 다양한 항체 클론의 결합 동력학을 결정하였다. 시험된 마우스 단백질은 BALBc(서열번호: 10), BL6(서열번호: 9), NOD(서열번호: 8) 및 m129(서열번호: 7) SIRP-α 단백질을 포함한다. 결과는 하기 표 B-E에 요약되어 있다. AB21 및 AB25에 대한 가변 도메인 서열이 표 J1에 도시되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체 클론은 클론 ID 번호로 언급된다. 또한, 기재 "S[클론 번호]"는 sc-Fv-Fc 포맷을 나타내며; 기재 "AB[클론 번호]"는 전체 IgG 항체 포맷을 나타내고; 기재 "AB[클론 번호]b"는 마우스 IgG1 N297A 포맷을 나타내고; "AB[클론 번호]c"는 마우스 IgG2a 포맷을 나타낸다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
이들 결과는 AB21 및 AB25 항체 클론이 4개의 모든 마우스 SIRP-α 단백질에 결합하여 이들 항체를 생체내 마우스 모델에서의 특성규명에 적합하게 만든다는 것을 입증한다.
실시예 2: 항-SIRP-α 항체의 기능적 특성
앞 실시예는 항-SIRP-α 항체의 동정 및 특성규명을 설명한다. 다음으로 이들 항체를 동물 모델에서 조사하여 종양 성장에 대한 SIRP-α의 생물학적 효과를 탐색하였다.
상기 주지된 바와 같이, “b”로 표지된 항체 클론은 N297A 돌연변이를 갖는 전장 마우스 IgG1 항체로 평가하였다. “c”로 표지된 항체 클론은 전장 마우스 IgG2a 항체로 평가하였다.
방법
생체내 항-종양 활성
MC38 동종 마우스 결장 암종 모델에 대해, MC38 세포를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하고 그룹으로 무작위화하였다(8-10마리의 마우스/그룹). 처리 그룹은 비히클(PBS), AB25b, AB25c 및 AB27b를 포함하였다. 모든 항-SIRPα 항체는 마우스 IgG2a를 갖는 AB25c를 제외하고 N297A 돌연변이를 포함하는 마우스 IgG1 Fc 영역을 가졌다. 종양이 이식 후 7일째에 평균 60-65mm3일 때 치료를 개시하였다. 마우스에게 항-SIRPα를 3주 동안 매주 2회 복강내(IP)로 10 mg/kg을 투여하였다. 종양이 약 2000mm3에 도달했을때 동물을 희생시켰다.
결과
다양한 항-SIRP-α 항체의 생체내 항-종양 효과를 동종 마우스 결장 암종 모델에서 분석하였다. 차단 항-SIRP-α 항체 AB25b, AB25c 및 AB27b의 항-종양 활성을 MC38 동종 마우스 결장 암종 모델에서 검사하여 그것의 단일 제제 활성을 평가하였다. MC38 동종 마우스 모델에서 비히클 단독(도 1)과 비교하여 차단(항-항-SIRP-α 항체 AB25b, AB25c 및 AB27b)는 10 mg/kg에서 종양 형성을 지연시켰다. 25일째, 항-SIRPα 항체로 처리된 그룹은 AB25b에 대해 600mm3 미만의 3마리 마우스를 가졌고, AB25c에 대해서는 600mm3 미만의 4마리 마우스를 가졌고, AB27b에 대해서는 600mm3 미만의 3마리 마우스를 가진 반면, 비히클-처리된 그룹은 600mm3 이하의 2마리 마우스만 가졌다.
이들 결과는 생체내 종양 성장의 억제에서 항-SIRP-α 항체 처리의 유효성을 실증한다. 차단 항-SIRP-α 항체는 생체내 종양 성장을 차단하는 것으로 확인되었다.
실시예 3: 항-SIRP-α 항체의 인간화
상기 기재된 실시예는 완전 인간 중쇄 및 닭 경쇄를 갖는 항-SIRP-α 항체의 생성 및 특징을 기술한다. 닭-유래된 경쇄를 인간화하기 위해, 이들 항체의 닭 HVR을 다양한 인간 λ 경쇄 프레임워크 상에에 그래프트하였다.
방법
인간화
항체를 표준 기술을 사용하여 인간화시켰다. 생산 수득율을 측정하기 위해, 항-SIRPα 항체를 발현하는 Expi293 배양액의 동등 용적을 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. PBS로의 완충액 교환 후, 단백질 농도를 A280에 의해 측정하고, mg/mL로 표시하였다.
결과
인간화 경쇄를 디자인하기 위하여, 각각의 닭 경쇄 서열을 IgBLAST(NCBI)에 의해 가장 가까운 인간 생식계열 프레임워크에 정렬시켰다. 이 분석을 사용하여, 닭 λ 경쇄 프레임워크에 가장 가까운 일치는 인간 IGLV3이다(서열번호: 27-30 참고).
또 다른 접근법에서, 인간 VH3 서열(이들 항체에 사용된 인간 중쇄)과 페어링하기 위한 최적의 인간 람다 경쇄 프레임워크 서열을 결정하기 위하여 문헌 조사를 수행하였다. 이러한 분석에 기초하여, 인간 VH3은 인간 IGLV1 및 IGLV2와 잘 페어링할 것이라고 생각되었다. Glanville, J. 등 (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106:20216-20221; Lloyd, C. 등 (2009) Protein Eng. Des. Sel. 22:159-168; 및 Jayaram, N. 등 (2012) Protein Eng. Des. Sel. 25:523-529를 참고한다.
따라서, 6개의 인간화된 경쇄가 형성되었다: Hum1(AB25 HVR + 인간 IGLV3 프레임워크; 서열번호: 25), Hum2(AB25 HVR + 인간 IGLV1 프레임워크), Hum3(AB66 HVR + 인간 IGLV3 프레임워크), Hum4(AB66 HVR + 인간 IGLV1 프레임워크), Hum5(AB25 HVR + 인간 IGLV2 프레임워크), 및 Hum6(AB21 HVR + 인간 IGLV1 프레임워크).
각각의 6개의 인간화된 경쇄는 AB21 중쇄와 페어링되어, 24개의 특유의 항체를 생성하였다. 항체는 상기 기재된 바와 같이 발현되었다. 놀랍게도, 인간 IGLV1 프레임워크 서열은 중쇄에 관계없이 항체 발현을 감소시켰다. 이것은 Hum2, Hum4 및 Hum6과의 중쇄 페어링을 지칭한다. 그 결과를 도 2에 "단백질 수득율"(1행)로 요약하였다. 대조적으로, 인간 IGLV2 및 IGLV3 프레임워크(Hum1, Hum3, Hum5)를 갖는 항체는 더 높은 수준의 발현을 나타냈다.
선택된 항체는 또한 다양한 SIRP 단백질(예를 들면, 인간 SIRP-α v1 (서열번호: 5), 인간 SIRP-α v2 (서열번호: 6), 사이노몰구스 SIRP-α (서열번호: 11), 마우스 BALB/c SIRP-α (서열번호: 10), 및 인간 SIRP-γ(서열번호: 15))에 대한 결합에 대하여 특성규명하였다. 이들 데이터는 또한 도 2에 요약되어 있다. 선택된 인간화된 경쇄는 하나 이상의 항원에 대한 결합을 감소시켰다. 예를 들면, 인간 IGLV3 프레임워크(Hum1 및 Hum3으로 표시됨)는 결합 친화도를 혼란시키지 않으면서 우수한 수준의 항체 생산을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, IGLV3 프레임워크 및 항체 25 또는 항체 66 HVR 서열(각각 Hum1 및 Hum3으로 표시됨)을 갖는 경쇄 가변 도메인은 AN21 중쇄와 잘 조합하고, 상이한 SIRP-α 및 SIRP-γ 단백질에 대한 유사한 결합을 나타냈다. 대조적으로, IGLV1 및 IGLV2 프레임워크(Hum2, Hum4, Hum5 및 Hum6으로 표시됨)는 AN21 중쇄와 페어링하면 SIRP의 발현을 감소시키고 및/또는 SIRP에 대한 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 실험으로부터 추가의 결합 데이터가 하기 표 L에 제공된다. 인간 IGLV3 프레임워크가 추가 테스트를 위해 선택되었다.
추가의 VL 도메인 Hum9 및 Hum8은 Hum1 VL 도메인을 기초로 생성되었다. Hum1과 비교하여, Hum9는 인간 경쇄 서열과 85% 이상의 동일성까지 경쇄의 인간화도(humanness)를 증가시키는 HVR-L1 및 -L2에서 또는 부근에서 4개의 아미노산 치환을 함유한다. Hum1과 비교하여, Hum8은 인간 경쇄 서열과 85% 이상의 동일성까지 경쇄의 인간화도를 증가시키는 HVR-L1 및 -L2에서 또는 부근에서 각각 5개의 아미노산 치환을 함유한다. Hum1, Hum8 및 Hum9 VL이 중쇄 VH 도메인 all_mut_AB21(생식계열 돌연변이; 서열번호: 26를 지니고 있음)과 페어링될 때 10pM 이상의 친화도로 인간 SIRP-α v1에 결합하는 항-SIRP-α 항체를 생성하였다 (표 M).
실시예 4: 항-SIRP-α 항체에 의한 식균작용 및 수지상 세포 활성화의 유도
다양한 항-SIRP-α 항체를 식균작용 검정 및 수지상 세포 활성화 검정에서 연구되었다.
방법
종양 세포주 배양
DLD-1(인간 결장직장 샘암종) 세포를 10% 열-불활성화 우태 혈청(Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco), 및 1% 글루타맥스(Gibco)가 보충된 RPMI(Gibco)로 이루어진 성장 배지에서 유지하였다.
인간 단핵구-유래 대식세포의 유도 및 배양
태평양 혈액 센터(Blood Centers of the Pacific)에서 트리마(Trima) 잔여물을 받아 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)로 1:4 희석하였다. 희석된 혈액을 4개 튜브로 분할하고 20 ml Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)의 밑에 깔았다. 튜브를 400 x g에서 30분 동안 원심분리하였다. PBMC를 계면으로부터 수집하고 FACS 완충액(0.5% 소 혈청 알부민(Gibco) 함유 PBS) 중에 재현탁하였다. CD14+ 단핵구를 제조업체의 프로토콜에 따라 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec) 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용해서 음성 선택에 의해 정제하였다.
분극화되지 않은 대식세포에 있어서, CD14+ 단핵구를 10% 인간 AB 혈청(Corning), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 1% 글루타맥스가 보충된 25 ml IMDM(Gibco) 중에 디쉬 당 천만 개 세포로 15 cm 조직 배양 플레이트(Corning) 내로 접종하였다. 세포를 7일 내지 10일 동안 배양하였다.
M2 분극화된 대식세포에 있어서, CD14+ 단핵구를 10% 우태 혈청(Thermo Fisher), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 1% 글루타맥스, 및 50 ng/ml M-CSF(Miltenyi)가 보충된 25 ml RPMI(Gibco) 중에 디쉬 당 6백만 개 세포로 15 cm 조직 배양 플레이트(Corning) 내로 접종하였다. 세포를 7일 내지 10일 동안 배양하였다.
시험관내 식균작용 검정
20 ml PBS로 2회 세척하고 37℃에서 10분 동안 10 ml TrypLE Select(Gibco) 중에 인큐베이션하여 DLD-1 세포를 배양 플레이트로부터 탈착시켰다. 세포를 원심분리하고, PBS 중에 세척하고, 배지 중에 재현탁하였다. 세포를 제조업체의 지침에 따라 Celltrace CFSE 세포 증식 키트(Thermo Fisher)로 표지하고, IMDM 중에 재현탁하였다. 20 ml PBS로 2회 세척하고 37℃에서 20분 동안 10 ml TrypLE Select 중에 인큐베이션하여 대식세포를 배양 플레이트로부터 탈착시켰다. 세포를 세포 스크레이퍼(Corning)로 제거하고, PBS 중에 세척하고, IMDM 중에 재현탁하였다.
100,000 DLD-1 세포, 50,000 대식세포, 100 nM부터 6.4 pM까지 항-SIRP-α 항체의 5배 연속 희석물, 및 1 또는 0.01 ㎍/ml의 세툭시맙(절대 항체) 또는 동일한 이소형의 대조군 항체(Southern Biotech)를 함유하는 초-저부착 u형-바닥 96웰 플레이트(Corning)에서 식균작용 검정을 조립하였다. 5% 이산화탄소를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 플레이트를 인큐베이션하였다. 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고 250 μl FACS 완충액 중에 세척하였다. 10 μl 인간 FcR 차단 시약(Miltenyi Biotec), 0.5 μl 항-CD33 BV421(Biolegend), 및 0.5 μl 항-CD206 APC-Cy7(Biolegend)을 함유하는 50 μl FACS 완충액 중 15분 동안 얼음 상에서 대식세포를 염색하였다. 세포를 200 μl FACS 완충액 중에 세척하고, 250 μl PBS 중에 세척하고, PBS 중 1:1000 희석된 50 μl 고정형 생활성 염료 eFluor 506(ebioscience) 중 30분 동안 얼음 상에서 염색하였다. 세포를 250 μl FACS 완충액 중에 2회 세척하고 75 μl Cytofix(BD Biosciences) 중 얼음 상에서 30분 동안 고정하였다. 세포를 175 μl FACS 완충액 중에 세척하고, 75 μl FACS 완충액 중에 재현탁하였다. 세포를 FACS Canto II(BD Biosciences) 상에서 분석하고, Flowjo 10.7(Treestar)에 의해 후속 데이터를 분석하였다. e506-음성 집단 상에서 관문화에 의해 죽은 세포를 제외하였다. 종양 세포를 식균한 대식세포를 CD33, CD206, 및 CFSE에 대해 양성 세포로서 확인하였다.
수지상 세포 활성화 검정
Balb/c 마우스(n = 3/그룹)에 인간 IgG1 대조군, 다양한 항-SIRP-α 항체, 마우스 IgG 대조군, 또는 비히클(PBS)을 10 mg/kg로 정맥내 주사하였다. 주사 5시간 후, 비장을 수확하고, 기계적 해리에 의해 단일 세포 현탁액으로 가공하였다. CD4+ 비장 수지상 세포의 활성화 마커 CD86, MHCII 및 CCR7 수준을 유세포측정법으로 측정하였다.
결과
상기 기재된 인간화된 항체를 항-EGFR 항체 세툭시맙과 조합된 M2 대식세포에 의한 EGFR(+) DLD-1 세포의 식균작용에 대한 그의 영향에 대해 시험하였다(도 3a). 모든 인간화된 항체는 세툭시맙-유도된 식균작용을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 상기 기재된 인간화된 항체(Hum1 또는 Hum9 경쇄와 조합된 항체 25 중쇄 변이체 및 Hum1 경쇄와 조합된 항체 27 중쇄 변이체)를 항-EGFR 항체 세툭시맙과 조합된 M2 대식세포에 의한 EGFR(+) DLD-1 세포의 식균작용에 대한 그의 효과에 대해 시험하였다(도 3b). 모든 인간화된 항체는 세툭시맙-유도된 식균작용을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 시험된 항체 모두는 L234A, L235A, G237A 및 N297A 돌연변이를 갖는 전장 인간 IgG1 항체로 생성되었다.
다음으로, 다양한 항-SIRP-α 항체를 공지된 항-SIRP-α 항체 p84를 포함하는 생체내 수지상 세포 활성화에 대한 그의 효과(도 4a-4b)에 대해 시험하였다. CD47 결합을 통해 비장 수지상 세포 상에 마우스 SIRP-α 수용체를 관여시키지 않으면, 비장 수지상 세포가 활성화된다. 항-SIRP-α 항체 Hum1/AB21mutall, Hum8/AB21mutall 및 Hum9/AB21mutall를 생체내에서 시험하여 수지상 세포 활성화를 유발시켰는지 여부를 결정하였다. CD86 및 MHCII 발현에 의해 결정된 바와 같이, 이들 항-SIRP-α 차단 항체는 수지상 세포의 활성화를 유도할 수 있었다.
실시예 5: 항-SIRP-α 항체를 PD-L1/PD-1 경로의 억제와 조합하여 상승 작용하는 항-종양 효과
방법
생체내 항-종양 활성
CT26 동종 마우스 결장 암종 모델에 대하여, CT26 세포를 BALB/c 마우스의 피하에 이식하고, 그룹으로 무작위화하였다(8-9마리의 마우스/그룹). 처리 그룹은 비히클(PBS), AB25b, 항-PD-L1 및 AB25b/항-PD-L1을 포함하였다. 항-PD-L1은 아테졸리주맙의 VH 및 VL 도메인을 N297A 돌연변이를 갖는 마우스 IgG1 Fc 영역과 융합시킴으로써 생성된다. 모든 항-SIRP-α 항체는 또한 N297A 돌연변이를 갖는 마우스 IgG1 Fc 영역을 갖는다. 이식 후 7 또는 8일후 종양이 평균 75-80mm3일 때 치료가 시작되었다. 마우스에게 항-SIRPα 항체에 대해 3주간 매주 2회 3 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 복강내(IP) 투여하고, 항-PD-L1에 대해 5일 간격으로 3 mg/kg 용량으로 3회 투여하였다. 종양이 약 2000mm3의 용적에 도달하면 동물을 희생시켰다.
MC38 동종 마우스 결장 암종 모델에 있어서, MC38 세포를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하고, 그룹(8-10 마우스/그룹)으로 무작위화하였다. 치료 그룹은 비히클(PBS), AB25b, 항-PD1(클론 RMP1-14, BioXCell), 및 AB25b/항-PD1을 포함한다. 모든 항-SIRPα 항체는 AB25c를 제외하고는 N297A 돌연변이를 갖는 뮤린 IgG1 Fc 영역을 가졌다. 이식 후 7일째 종양이 평균 60-65mm3일 때 치료가 시작되었다. 마우스에게 항-SIRPα에 대해 3주 동안 매주 2회 10 ㎎/㎏으로, 항-PD1에 대해 2 mg/kg의 용량으로 3회 복강내(IP)로 투여하였다. 종양이 약 2000mm3에 도달하면 동물을 희생시켰다.
결과
차단 AB25b 항-SIRP-α 항체의 항-종양 활성을 단독으로, 및 CT26 동종 마우스 결장 암종 모델에서 항-PD-L1 항체와 조합하여 시험하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 3mg/kg의 항-PD-L1과 조합하여 10mg/kg에서의 AB25b의 투여는 각 단일 제제 또는 비히클 대조군에 의한 처리와 비교할 때 종양 형성을 지연시켰다. 이 연구의 27일째에, 각각 비히클, 항-PD-L1 단일 제제 및 항-SIRP-α 단일 제제 처리 그룹에서 크기 600mm3 이하의 종양을 가진 2마리, 2마리 및 2마리의 마우스와 비교하여, 복합 치료 그룹은 크기 600mm3 이하의 종양을 가진 6마리의 마우스를 가지고 있었다.
다음으로, AB25b 항-SIRP-α 항체의 항-종양 활성을 단독으로 및 MC38 동종 마우스 결장 암종 모델의 항-PD-1 항체와 조합하여 시험하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, AB25b (10mg/kg)와 5mg/kg의 항-PD-1을 조합하면, 각각의 단일 제제 또는 비히클 대조군에 의한 치료와 비교하여 종양 형성이 지연되었다. 이 연구의 27일째에 각각 비히클, 항-PD-1 단일 제제, AB25b 단일 제제 및 AB136b 단일 제제 처리 그룹에서 크기 600mm3 이하의 종양을 가진 1마리, 5마리, 및 2마리의 마우스와 비교하여, AB25b/PD-1 병용 치료 그룹에는 크기 600mm3 이하의 종양을 가진 7마리의 마우스가 있었다.
본 명세서에 기재된 항체 및 그 특성의 요약은 표 K에 제공된다. 추가의 결합 데이터는 표 L 및 N에 제공된다.
실시예 6: 잠재적 책임 핫 스팟을 제거하도록 조작된 신규한 항-SIRP-α 항체 경쇄
상술된 차단 항-SIRP-α 항체 AB21 및 AB25의 특성으로 인해, 변이체 AB21 VH 도메인(서열번호:26) 및 인간화 Hum1 VL 도메인(서열번호:25)을 포함하는 항체를 분석을 위해 선택하였다. 상술된 Hum1 인간화 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체 경쇄의 서열을 잠재적 책임 핫 스팟, 예를 들면, 탈아미드화 또는 당화 부위에 대해 분석하였다.
단백질 탈아미드화는 글루타민 또는 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드가 산성 카복실레이트기로 전환되는 번역-후 변형이다. 아스파라긴의 비-효소적 탈아미드화는 글루타민에서보다 더 빠르고, 이에 따라 폴리펩타이드-기재 치료제의 더 큰 생리적 중요성 그리고 제조 및 보관에서의 더 큰 잠재적 책임 위험을 제시한다.
당화는 단백질의 비-효소적 당화 또는 말라드(Mallard) 반응을 나타내며, 이는 라이신의 ε-아미노기, 또는 자유 아미노기에서 주로 일어난다. 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 및 시스테인 잔기의 측쇄는 추가적인 잠재적 당화 부위를 제공한다. 아마도리(Amadori)-변형 단백질은 초기 당화 산물이며 추가 반응을 거쳐 상급 당화 최종 산물을 생성한다(AGE).
Hum1-함유 경쇄의 분석으로, 예를 들면, 항-SIRP-α 항체의 제조, 보관, 및/또는 약물 개발 동안 일어날 수 있는 변형으로 인한, 위험을 제한하기 위해 조작이 요망될 수 있는 부위를 동정하였다. 본 실시예는 이들 잠재적 책임을 제거하는 Hum1 변이체의 평가 및 작제를 기재한다.
방법
펩타이드 맵핑 분석
트립신 소화를 위해, 샘플을 6 M 구아니딘 HCl 및 1 mM EDTA 중에 희석하였다. 10 mM DTT 및 10 mM 요오도아세트아미드를 사용하여 샘플을 각각 환원시키고 알킬화하였다. 이어서 완충액을 0.1 M 트리스-HCl로 교환하고 샘플을 소화를 위해 4시간 동안 인큐베이션하였다. 키모트립신 소화를 위해, 샘플을 100 mM 암모늄 바이카보네이트 중에 희석하였다. 1% 프로젠타(progenta) 음이온성 산 취약성 계면활성제를 첨가하였다. 다시, 10 mM DTT 및 10 mM 요오도아세트아미드를 사용하여 샘플을 각각 환원시키고 알킬화하였다. 샘플을 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.
질량 스펙트럼을 Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap(Thermo Scientific, San Jose CA)과 연결된 Waters Acuity UHPLC에 의해 획득하였다. 사용된 칼럼은 Agilent AdvanceBio Peptide Mapping(C18, 1x150 mm ID)이다. 역상 용매를 사용하였고 사용된 구배는 41분에 걸쳐 2% 내지 40% 완충액이었다. 전체 MS 스캔 범위는 250-2000 m/z였다. 펩타이드 검색 및 상대 존재비를 Byonic and Byologic(Protein Metrics)을 사용하여 분석하였다. 전구체 질량 정확도 10 ppm 및 단편 질량 정확도 20 ppm을 차용하였다.
K D 의 결정
항-SIRPa 항체와 다양한 종(인간 v1, 인간 v2, 사이노몰구스, 마우스 129, BL6, BALBc, NOD)로부터의 SIPRa, SIRPb 및 SIRPg의 상호작용을 항체의 직접적 고정화를 사용해서 분석하였다. 모든 실험은 GLC 센서 칩이 장착된 SPR-기반 ProteOn XPR36 바이오센서(BioRad, Inc, Hercules, CA)를 사용해서 25℃에서 수행하였다. 항체를 FreeStyle™ 293-FS 세포(Thermo Fisher)를 사용해서 발현하였다. 표준 단백질 A 친화도 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제를 수행하고 용출된 항체를 PBS 완충액 중에 보관하였다.
러닝 완충액은 0.01% Tween-20(PBST+)를 함유한 PBS pH 7.4였다. 모든 피분석물은 A280 흡광도에 의해 이의 몰 계산된 소멸 계수를 사용해서 결정되는 이의 공칭 농도로 사용하였다. 피분석물은 다른 곳에 기재된 바와 같이 “원-샷” 동력학 모드로 주입하였다(예를 들면, Bravman, T. 등 (2006) Anal. Biochem. 358:281-288를 참고한다).
GLC 칩을 사용하는 고정화를 위해, 피분석물을 주입하고 Proteon 아민 커플링 키트를 사용해서 GLC 칩 상에 고정화된 항-SIRP-α 항체(약 1000 RU) 상에 흘렸다. 고정화 단계를 위해, GLC 칩을 25 μL/분으로 300 초 동안 1/100로 희석된 EDAC/Sulpho-NHS 1:1(Biorad)로 활성화하였다. 항-SIRP-α 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 4.5 중에 80 nM 농도로 희석하고 50 초 동안 30 μL/분으로 칩에 고정화하였다. 칩을 25 μL/분으로 300 초 동안 에탄올아민으로 불활성화하였다. 피분석물(예를 들면, 상이한 종으로부터 SIRP-α, SIRP-β, SIRP-γ)을 100, 33, 11, 3.7, 1.2 및 0 nM의 공칭 농도로 “원-샷” 동력학 모드로 주입하였다. 100 uL/분으로 90 초 동안 연합 시간을 모니터링하고, 1200 초 동안 해리 시간을 모니터링하였다. 표현을 Pierce IgG 용출 완충액/4 M NaCl의 2:1 v/v 배합물로 재생시켰다.
반응 스팟 데이터(고정화된 단백질)로부터 스팟간 데이터(고정화되지 않은 단백질 함유)를 차감한 후 피분석물 주입 반응으로부터 완충액 “블랭크” 피분석물 주입 반응을 빼서 바이오센서 데이터를 이중 참조하였다. 이중 참조된 데이터를 단순 랭뮤어 모델에 전체적으로 적합화시키고 KD 값을 겉보기 동력학 속도 상수의 비(KD = kd/ka)로부터 계산하였다.
결과
Hum1 VL 도메인(서열번호:25) 및 인간 IGLC1 람다 불변 도메인(서열번호:37)을 갖는 경쇄(서열번호:47), 및 AB21 MutAll VH 도메인(서열번호:26) 및 인간 IgG2Da Fc 영역(넘버링이 EU를 따르는 아미노산 위치 A330S 및 P331S 돌연변이 포함)을 포함하는 불변 영역(서열번호:34)을 갖는 중쇄(서열번호:61)를 포함하는 항-SIRP-α 항체(항체 PC336)를 상술된 바와 같이 트립신 및 키모트립신 소화에 의해 수행하였다. 중쇄의 전체 서열 커버율은 100%였고(444개 아미노산 중 444개), 및 경쇄는 98.6%였다(214개 아미노산 중 211개). 모든 항체에 대한 가변 도메인 및 전체 사슬 서열을 표 J1 및 J2에 제공한다.
이들 분석은 당화에 의해 변형된 3개의 경쇄 잔기를 드러내었다. 표 F는 경쇄에서 관찰된 당화를 나타낸다. 총 3개의 당화된 펩타이드가 단리되었다. 이들 중, 서열번호:65의 서열을 갖는 펩타이드의 약 48%가 당화됨이 관찰되었다. 당화 변형은 K104로 부여되었다(카밧이 아닌, 경쇄에 대한 아미노산의 순차적 넘버링에 기반한 넘버링). 도 7은 항체 PC336 펩타이드의 당화된 형태 대 변형되지 않은 형태의 총 추출된 이온 크로마토그래피, 곡선 하 면적(XIC, AUC)을 나타낸다.
Figure pct00024
동일한 경쇄(서열번호:47) 및 AB21 MutAll VH 도메인(서열번호:26) 및 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 불변 영역(서열번호:31)을 갖는 중쇄(서열번호:58)를 포함하는 제2 항-SIRP-α 항체(항체 PC333)의 펩타이드 맵핑을 또한 수행하였다. 항체 336에 대해 관찰된 것과 유사하게, 경쇄의 위치 104에서의 라이신 잔기도 상기 항체에서 당화된 것으로 관찰되었다(펩타이드의 약 34%; 표 G 참고).
Figure pct00025
펩타이드 맵핑은 또한 항체 PC301의 Hum1-함유 경쇄에서의 탈아미드화된 잔기의 존재를 드러내었고, 이는 Hum1 VL 도메인(서열번호:25) 및 인간 IGLC2 람다 불변 도메인(서열번호:38)을 갖는 경쇄(서열번호:63) 및 AB21 MutAll VH 도메인(서열번호:26) 및 인간 IgG1 AAA N297A Fc 영역(아미노산 위치 넘버링이 EU를 따르는, L234A, L235A, G237A, 및 N297A 돌연변이 포함)을 포함하는 불변 영역(서열번호:32)을 갖는 중쇄(서열번호:59)를 포함하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 항체 PC301의 경쇄 및 중쇄에서의 다양한 부위가 탈아미드화된 것으로 관찰되었다. 특히, 경쇄 불변 도메인의 N171 및 N172 잔기를 함유하는 펩타이드의 대략 50%가 탈아미드화에 의해 변형된 것으로 확인되었다. 펩타이드 맵핑으로부터 N171, N172, 또는 두 잔기가 모두 탈아미드화되는지 여부는, 이들 두 잔기가 서로 인접하고 동일한 펩타이드에서 단리되어 있으므로 결정할 수 없었다.
탈아미드화 및 당화와 같은 번역 후 변형은 약물 개발을 위해 바람직하지 않다. 이는 약물 제조 동안 산물 이종성의 잠재적 문제 때문이다. 따라서, 이들 변형이 항-SIRP-α 항체의 결합 친화도에 영향을 주지 않는 것으로 드러났음에도 변형을 제한하는 것이 바람직하다.
잠재적으로 탈아미드화된 잔기(N171/N172)를 제거하기 위해, 4개의 탈아미드화 부위 변이체를 먼저 평가하였다. 항체 PC334는 오리지널 Hum1 VL+IGLC1 경쇄(서열번호:47)를 함유했다. 항체 PC338은 오리지널 Hum1 VL 도메인 및 N172D 변이체 불변 도메인을 갖는 경쇄(서열번호:48)를 함유했다. 항체 PC339는 오리지널 Hum1 VL 도메인 및 N171D 변이체 불변 도메인을 갖는 경쇄(서열번호:49)를 함유했다. 항체 PC340은 오리지널 Hum1 VL 도메인 및 N171D, N172S 탈아미드화 부위 변이체 불변 도메인을 갖는 경쇄(서열번호:50)를 함유했다. 항체 PC341은 오리지널 Hum1 VL 도메인 및 N171S, N172D 탈아미드화 부위 변이체 불변 도메인을 갖는 경쇄(서열번호:51)를 함유했다. 모든 항체는 AB21HC mut all VH 도메인(서열번호:26) 및 인간 IgG1 AAA N297A Fc 영역을 포함하는 불변 영역(서열번호:32)을 포함하는 중쇄(전체 중쇄 서열은 서열번호:59에 나타낸 바와 같음)를 가졌다. 결합 검정의 결과를 표 H에 나타낸다. 4개의 돌연변이체는 모두 야생형 항체에 비해, 인간 SIRP-α v1에 동등한 친화도로 결합하였다.
Figure pct00026
다음으로, 당화 부위 변이체를 평가하였다. 당화 부위를 갖는 Hum1 VL 도메인 영역을 도 9에 나타낸다. 상기 당화 부위를 제거하기 위해, 상기 VL 도메인의 3개 변이체를 생성하여, 버전 1, 2, 및 3으로 표지하였다(v1, v2, 및 v3이 또한 본원에서 상호 교환적으로 사용된다). 이들 변이체는 K104 당화 부위 내 및 주변 잔기를 돌연변이시킨다. 버전 1 및 2는 각각 원상태 인간 IGLJ1 및 IGLJ7 서열과 동일한 서열을 사용한다. 버전 3은 라이신을 아르기닌으로 대체하여 양전하 및 잔기의 크기를 유지한다. 당화 부위 변이체를 N171S, N172D 탈아미드화 변이체의 맥락에서 평가하였다.
항체 PC334는 오리지널 Hum1 VL+IGLC1 경쇄(서열번호:47)를 함유하였다. 항체 PC341은 오리지널 Hum1 VL 도메인 및 N171S, N172D(”SD”로 약칭됨) 탈아미드화 부위 변이체 불변 도메인을 갖는 경쇄(서열번호:51)를 함유하였다. 항체 PC345, PC346, 및 PC347도 SD 탈아미드화 부위 변이체 불변 도메인을 함유했으나, 각각 Hum1 변이체 1, 2, 및 3 VL 도메인을 포함하였다(각각 서열번호:53, 55, 및 57). 모든 항체는 AB21HC mut all VH 도메인(서열번호:26) 및 인간 IgG1 AAA N297A Fc 영역을 포함하는 불변 영역(서열번호:32)을 포함하는 중쇄(전체 중쇄 서열은 서열번호:59에 나타낸 바와 같음)를 가졌다. 결합 검정의 결과를 표 I1에 나타낸다.
Figure pct00027
표 H 및 I1에 나타낸 바와 같이, 모든 항체는 인간 SIRP-α v1에 야생형 항체와 비교할 때 동등한 친화도로 결합하였다. 이들 결과는 탈아미드화 및 당화 책임 핫 스팟을 제거하도록 조작된 변이체가 SIRP-α에 대한 결합에 영향을 갖지 않았음을 실증한다.
상기 결과에 기반하여, 6개의 바람직한 경쇄 변이체를 생성하였고, 각 서열(서열번호:52-57)의 정렬을 도 10 & 11에 나타낸다. 이들은 2개의 바람직한 탈아미드화 부위 변이체(N171D/N172S 및 N171S/N172D, 각각 "DS" 및 "SD"로 약칭됨) 및 3개의 당화 변이체(v1, v2, v3)를 포함하였다. 오리지널 hum1 VL 도메인 및 인간 IGLC1 람다 불변 영역(서열번호:47)도 정렬에 나타낸다.
실시예 7: 항-SIRP-α 항체의 생물학적 활성에 대한 불변 도메인 서열의 효과
상이한 Fc 영역 및 경쇄 불변 도메인을 갖는 항-SIRP-α 항체를 이들 서열이 항-SIRP-α 항체의 생물학적 특성에 어?째? 영향을 미치는지 이해하기 위해 식균작용에 대한 이의 효과에 대해 평가하였다.
방법
수지상 세포의 기능적 고갈을 위해, 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque Plus로 건강한 개체의 트리마 잔여물로부터 단리하였다. 500,000개 PBMC를 37℃에서 48 시간 동안 10 ug/mL 농도의 항-SIRP와 함께 u형-바닥 96웰 플레이트(corning)에서 인큐베이션하였다. 유세포 측정을 위해, 세포를 인간 FcR 차단 시약 중에 인큐베이션하고 lin-(CD3, CD14, CD16, CD19, CD56) 및 HLADR에 대한 형광단 표지 항체 칵테일로 염색하였다. 고정형 생활성 염료를 사용하여 살아있는 세포를 동정하였다. 염색 후, 세포를 세척하고 PBS 중 0.5% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 획득 전에, 절대 계수 비드를 첨가하고, 샘플을 Canto II 유세포 측정기로 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 사용해서 분석하였다.
식균작용을 실시예 4에 기재된 시험관내 검정을 사용하여 측정하였다.
결과
상이한 Fc 영역을 갖는 인간화 항-SIRP-α 항체를 항-EGFR 항체 세툭시맙과의 조합으로 M2 대식세포에 의한 EGFR(+) DLD-1 세포의 식균작용 상에서의 이의 효과에 대해 평가하였다(도 12). 모든 항체는 서열번호:55의 경쇄 서열 및 서열번호:26의 VH 도메인 서열을 가졌다. 평가된 Fc 영역에는 IgG2 야생형(서열번호:33의 불변 도메인 서열에 나타낸 바와 같음), IgG2Da Fc 영역(EU를 따르는 아미노산 위치 넘버링 A330S 및 P331S 돌연변이 포함; 서열번호:34의 불변 도메인 서열에 나타낸 바와 같음), N297A 돌연변이를 포함하는 IgG2 Fc 영역(아미노산 위치 넘버링이 EU를 따름; 서열번호:137의 불변 도메인 서열에 나타낸 바와 같음), 및 N297A, L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 영역(아미노산 위치 넘버링이 EU를 따름; 서열번호:32의 불변 도메인 서열에 나타낸 바와 같음)이 포함되었다. 모든 항체는 세툭시맙-유도 식균작용의 강화에서 대략 동등한 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
다음으로, 상이한 Fc 영역을 갖는 항-SIRP-α 항체(또는 대응하는 이소형 대조군)를 공여체 PBMC로부터 상이한 세포 유형을 고갈시키는 이의 능력에 대해 평가하였다. 모든 항체는 서열번호:55의 경쇄 서열 및 서열번호:26의 VH 도메인 서열을 가졌다. 도 13a & 13b에 나타낸 바와 같이, 야생형 IgG1, 야생형 IgG4, 야생형 IgG2, 또는 IgG2Da Fc 영역을 갖는 항-SIRP-α 항체는 2명의 상이한 공여체로부터 수득된 PBMC로부터 DC를 고갈시킬 수 있었다. 이는 이들 Fc 영역이 PBMC 검정의 맥락에서 일부 DC 고갈을 증강시키는 능력을 가짐을 시사한다(DC는 SIRP-α를 발현하는 것으로 알려져 있다). 대조적으로, L234A/L235A/G237A/N297A IgG1 및 IgG2 N297A Fc 영역만으로는 DC 고갈을 나타내지 않았다. 평가된 항체 중 어느 것도 T 세포, 단핵구, 또는 B 세포의 유의미한 고갈을 야기하지 않았다(도 13c-13e). 유리하게는, IgG2 N297A Fc 영역은 L234A/L235A/G237A/N297A IgG1 Fc 영역과 동일한 고갈의 부재를 제공하지만 더 적은 돌연변이를 갖는다(따라서 면역원성이 더 적을 수 있다).
항-SIRP-α 항체를 또한 인간 SIRP-α v1; NOD, C57BL/6, 및 BALBc 마우스 SIRP-α; 인간 SIRP-β; 및 인간 SIRP-γ에 대한 결합 친화도에 대해 평가하였다. 평가된 항체에는 하기 중쇄 및 경쇄가 포함되었다: PC301: 서열번호:63의 경쇄 및 서열번호:59의 중쇄; PC334: 서열번호:47의 경쇄 및 서열번호:59의 중쇄; 및 PC367: 서열번호:55의 경쇄 및 서열번호:129의 중쇄.
Figure pct00028
인간 IgG2 항체는 디설파이드-기반 이소형(A, B, 및 AB)으로 존재한다고 여겨지며, 인간 IgG2 불변 영역 내로의 C232S 또는 C233S 돌연변이의 도입은 디설파이드 셔플링에 의해 유도되는 이종성을 감소시키는 것으로 보고되었다(Lightle, S. 등 (2010) Protein Sci. 19:753-762). 각각의 이들 돌연변이는 IgG2 항체를 이소형 A로 유도하는 것으로 여겨진다. 또한, 람다 경쇄도 이소형 A 존재비를 촉진하는 것으로 여겨진다. 야생형 IgG2(도 14a) 또는 C232S 또는 C233S 돌연변이를 갖는 IgG2 N297A(도 14b) Fc 영역을 갖는 항-SIRP-α 항체를 항-EGFR 항체 세툭시맙과의 조합으로 M2 대식세포에 의한 EGFR(+) DLD-1 세포의 식균작용 상의 효과에 대해 평가하였다. 모든 항체는 서열번호:55의 경쇄 서열 및 서열번호:26의 VH 도메인 서열을 가졌다. 야생형 및 N297A Fc 영역을 이소형 A 우세를 유도하는 람다 경쇄를 갖는 항체를 사용하여 평가하였다. C232S 또는 C233S 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함하는 IgG2 항-SIRP-α 항체는 야생형 IgG2 또는 IgG2 N297A Fc 영역을 갖는 항체 대비 식균작용의 유사한 강화를 나타내었다.
항-SIRP-α 항체가 식균작용을 강화시키는 능력에 대한 경쇄 불변 도메인의 효과를 또한 조사하였다. 모든 항체는 서열번호:26의 VH 도메인 서열 및 서열번호:18의 VL 도메인 서열을 가졌다. 람다 및 카파 경쇄를 갖는 항-SIRP-α 항체는 야생형 IgG2 Fc-(도 15a) 또는 IgG2da Fc-(도 15b)함유 중쇄의 맥락에서 모두 식균작용의 유사한 강화를 나타내었다.
상기 기술이 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예로서 일부 상세히 기재되었으나, 설명 및 실시예가 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시는 이의 전문이 참조로 명시적으로 포함된다.
Figure pct00029
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SEQUENCE LISTING <110> ALX Oncology Inc. <120> ANTIBODIES AGAINST SIGNAL-REGULATORY PROTEIN ALPHA AND METHODS OF USE <130> 75797-20006.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/646,210 <151> 2018-03-21 <160> 140 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 134 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 134 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 135 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 135 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 136 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 136 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 137 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 137 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 138 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 139 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 139 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 140 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 140 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Ala Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Ser 35 40 45 Asp Asp Lys Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Gln Ser Ser Tyr Thr Asn 85 90 95 Pro Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (60)

  1. 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 하기를 포함하는 항체:
    (a) 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 중쇄; 및
    (b) 식
    SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(서열번호:71)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하며, 식 중 X1은 G 또는 T이고; X2는 K, Q, 또는 R이고; X3은 L 또는 V이고, 상기 VL 도메인은 서열번호:25의 서열을 포함하지 않는 경쇄.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열번호:39-41로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄가 식
    GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSX4X5KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호:72)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변(CL) 도메인 서열을 추가로 포함하며, 식 중 X4X5는 ND, DN, DS, 또는 SD인, 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호:43-46으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변(CL) 도메인 서열을 추가로 포함하는, 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄가 카파 경쇄 불변(CL) 도메인을 추가로 포함하는, 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄가 람다(lambda) 경쇄 불변(CL) 도메인을 추가로 포함하는, 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호:37 또는 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 경쇄가 서열번호:48-57로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 scFv-Fc, 단일 도메인 항체, 단일 중쇄 항체, 또는 단일 경쇄 항체인, 항체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체인, 항체.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄가 Fc 영역을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1 Fc 영역, IgG2 Fc 영역, 및 IgG4 Fc 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 Fc 영역인, 항체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 Fc 영역이 인간 IgG1 Fc 영역인, 항체.
  15. 제12항에 있어서, 상기 Fc 영역이, EU에 따르는 아미노산 위치 넘버링으로 L234A, L235A, 및 G237A 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역인, 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 Fc 영역이, EU에 따르는 아미노산 위치 넘버링으로 N297A 치환을 포함하는, 항체.
  17. 제12항에 있어서, 상기 Fc 영역이 인간 IgG2 Fc 영역인, 항체.
  18. 제12항에 있어서, 상기 Fc 영역이, EU에 따르는 아미노산 위치 넘버링으로 A330S 및 P331S 치환을 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역인, 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 Fc 영역이, EU에 따르는 아미노산 위치 넘버링으로 N297A 치환을 추가로 포함하는, 항체.
  20. 제12항에 있어서, 상기 Fc 영역이 인간 IgG4 Fc 영역이며, 상기 중쇄는, EU에 따르는 아미노산 위치 넘버링으로 S228P 치환을 포함하는, 항체.
  21. 제12항에 있어서, 상기 중쇄 불변 도메인이 서열번호:31-35로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  22. 제12항에 있어서, 상기 중쇄 불변 도메인이 서열번호:33, 34, 및 137로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  23. 제12항에 있어서, 상기 중쇄 불변 도메인이 서열번호:132-139로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  24. 제1항에 있어서, 상기 중쇄가 서열번호:58-62로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  25. 제1항에 있어서, 상기 중쇄가 서열번호:60, 61, 및 129로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  26. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄가 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 중쇄가 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 중쇄가 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 중쇄가 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 중쇄가 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 상기 중쇄가 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  27. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄가 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 중쇄가 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 중쇄가 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) 상기 중쇄가 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (i) 상기 중쇄가 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) 상기 중쇄가 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (k) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (l) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (m) 상기 중쇄가 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (n) 상기 중쇄가 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (o) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (p) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (q) 상기 중쇄가 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (r) 상기 중쇄가 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (s) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (t) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (u) 상기 중쇄가 서열번호:58의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (v) 상기 중쇄가 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (w) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (x) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  28. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄가 서열번호:60의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 중쇄가 서열번호:61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 중쇄가 서열번호:129의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 중쇄가 서열번호:124의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 상기 중쇄가 서열번호:124의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호:55의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현하는 대식세포에 의한 식균작용을 강화시키는, 항체.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 SIRP-α 폴리펩타이드를 발현하는 수지상 세포의 활성화를 강화시키는, 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47을 발현하는 종양의 생체내 성장을 억제하는, 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 제제에 접합되는, 항체.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 항체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항체가 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 암 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 항체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 암 세포에 의해 발현되는 항원이 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, 뮤신 1, 뮤신 16, PD-L1, PTK7, STEAP1, 엔도텔린 B 수용체, 메소텔린, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, 넥틴 4, NaPi2b, LIV-1A, 구아닐릴 사이클라제 C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나스신, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, 뮤신, CAIX, EPHA3, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, 및 NY-ESO-1/LAGE로부터의 펩타이드를 포함하는 MHC/펩타이드, SSX-2, MAGE 계열 단백질, MAGE-A3,　gp100/pmel17,　멜란-A/MART-1,　gp75/TRP1,　티로시나제,　TRP2, CEA, PSA,　TAG-72,　미성숙한 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1,　BING-4,　EpCAM,　MUC1, PRAME, 서바이빈,　BRCA1, BRCA2, CDK4,　CML66,　MART-2, p53, Ras, β-카테닌, TGF-βII, HPV E6, 또는 HPV E7로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  36. 제33항에 있어서, 상기 항체가 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 면역 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 항체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 면역 세포에 의해 발현되는 항원이 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-15, FGL-1, CD200, CD200R, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, 아르기나제, IDO, TDO,　AhR, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, TGF-β RI, TGF-β RII, c-Kit, CD244, L-selectin/CD62L, CD11b, CD11c, CD68, 41BB,　CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, TNFR2, PVRIG, DNAM, 및 ICOS로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  38. 제33항에 있어서, 상기 항체가 인간 SIRP-α 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 자연 살해(NK) 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 항체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 NK 세포에 의해 발현되는 항원이 NKR-P1A, CD94, KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DS1, CD94, NKG2D, CD160, CD16, NKp46, NKp30, NKp44, DNAM1, CRTAM, CD27, NTB-A, PSGL1, CD96, CD100, NKp80, SLAMF7, 및 CD244로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  41. 제40항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  42. 제40항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제41항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  43. 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 항체가 생산되도록 제42항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 숙주 세포로부터 상기 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  45. 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 항체의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 암에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항체의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 암에 의해 발현되는 항원이 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, 뮤신 1, 뮤신 16, PTK7, STEAP1, 엔도텔린 B 수용체, 메소텔린, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, 넥틴 4, NaPi2b, LIV-1A, 구아닐릴 사이클라제 C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나스신, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, 뮤신, CAIX, EPHA3, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, 및 NY-ESO-1/LAGE로부터의 펩타이드를 포함하는 MHC/펩타이드 복합체, SSX-2, MAGE 계열 단백질, MAGE-A3,　gp100/pmel17,　멜란-A/MART-1,　gp75/TRP1,　티로시나제,　TRP2, CEA, PSA,　TAG-72,　미성숙한 라미닌 수용체, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1,　BING-4,　EpCAM,　MUC1, PRAME, 서바이빈,　BRCA1, BRCA2, CDK4,　CML66,　MART-2, p53, Ras, β-카테닌, TGF-βRII, HPV E6, 또는 HPV E7로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 면역치료제의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 면역치료제가 제2 항체를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 제2 항체가 BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-15, FGL-1, CD200, CD200R, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, 아르기나제, IDO, TDO,　AhR, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, TGF-β RI, TGF-β RII, c-Kit, CD244, L-셀렉틴/CD62L, CD11b, CD11c, CD68, 41BB,　CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, TNFR2, PVRIG, DNAM, 및 ICOS로 구성된 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제2 항체가 PD-1에 결합하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 제2 항체가 PD-L1에 결합하는, 방법.
  53. 제48항에 있어서, 상기 면역치료제가 백신, 종양용해 바이러스, 차용 세포 치료법, 사이토카인, 또는 소분자 제제를 포함하는, 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 자연 살해(NK) 세포에 의해 발현되는 항원에 결합하는 제2 항체의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 NK 세포에 의해 발현되는 항원이 NKR-P1A, CD94, KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DS1, CD94, NKG2D, CD160, CD16, NKp46, NKp30, NKp44, DNAM1, CRTAM, CD27, NTB-A, PSGL1, CD96, CD100, NKp80, SLAMF7, 및 CD244로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료제 또는 소분자 항암제의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 소분자 억제제의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 표적화된 소분자 억제제가 VEGFR 및/또는 PDGFR 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, CDK4/6 억제제, PARP 억제제, mTOR 억제제, KRAS 억제제, TRK 억제제, BCL2 억제제, IDH 억제제, PI3K 억제제, DNA 손상 반응(DDR) 억제제, 또는 저메틸화제인, 방법.
  59. 개체에서 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하거나 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 항체의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환이 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 항체-매개된 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 건선성 관절염, 죽상경화증, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 궤양성 장염, 자궁내막증, 사구체신염, IgA 신장병증, 다낭성 신장 질환, 중증 근무력증, 특발성 폐 섬유증, 폐 섬유증, 간경변증, 심방 섬유증, 심내막 섬유증, 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 천식, 아토피성 피부염, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 혈관염, 및 염증성 자가면역 근염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
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