CN112040979A - 针对信号调控蛋白α的抗体和使用方法 - Google Patents

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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本文尤其提供了结合人SIRP‑α多肽的胞外结构域的分离的人源化抗体。还提供了与所述人源化抗体相关的多核苷酸、载体、宿主细胞和生产方法及用途。

Description

针对信号调控蛋白α的抗体和使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年3月21日提交的美国临时申请序列号62/646,210的优先权权益，所述美国临时申请据此以引用的方式整体并入。
ASCII文本文件序列表的提交
以下提交的ASCII文本文件形式的内容以引用的方式整体并入本文：757972000640SEQLIST.txt，记录日期：2019年3月19日；大小：230KB)。
技术领域
本公开涉及结合人SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)的分离的人源化抗体，以及与所述人源化抗体相关的多核苷酸、载体、宿主细胞和方法。
背景技术
信号调控蛋白α(SIRP-α)是细胞表面受体家族的一部分，在免疫系统调控中起关键作用(参见例如，Barclay，A.N.和Brown，M.H.(2006)Nat.Rev.Immunol.6：457-64)。SIRP-α在各种细胞的表面上表达，所述细胞包括白细胞诸如树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。SIRP-α包括与外部刺激(诸如配体)相互作用的胞外结构域和介导多种细胞内信号的胞内结构域。
SIRP-α的主要作用之一是其通过与CD47的相互作用调控免疫应答。CD47在多种细胞类型的表面上表达。当CD47的IgSF结构域结合免疫细胞(例如巨噬细胞)上表达的SIRP-α的胞外结构域(例如，D1结构域)时，这在免疫细胞中转导了SIRP-α介导的信号，所述信号阻止CD47表达细胞的吞噬。因此，CD47用于向免疫系统传达所谓的“不要吃我”信号，以防止对健康细胞的吞噬(参见例如，WO2015/138600和Weiskopf，K.等人(2013)Science 341：88-91)。然而，CD47也显示出被多种癌症高度表达，在这种背景下它与SIRP-α的相互作用被认为可以让肿瘤模拟健康的“不要吃我”信号，以便逃避免疫监视和巨噬细胞的吞噬作用(参见例如，Majeti，R.等人(2009)Cell 138：286-99；Zhao，X.W.等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.108：18342-7)。因此，阻断这种相互作用的抗体是高度期望的。
已知SIRP-α是人、猴和小鼠中的高度多态性蛋白。例如，已经在NOD和C57BL/6小鼠品系中的SIRP-α蛋白之间鉴定了多态性差异，并且这些多态性导致与这些小鼠品系中的人造血干细胞的CD47结合和植入相关的功能性后果。在人类中，已报道了SIRPA基因的两种普遍的等位基因(Treffers,LW.等人(2018),Eur.J.Immunol.48:344-354；Zhao,X.等人(2011),PNAS.108:18342-47；van der Heijden,J.(2014).Genetic variation in humanFc gamma receptors:Functional consequences of polymorphisms and copy numbervariation(博士论文))。
由于SIRP-α-CD47相互作用在正常免疫功能和肿瘤发生中的重要性，鉴定结合人SIRP-α的抗体对于开发临床候选物具有重要意义。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开、非专利文献和UniProtKB/Swiss-Prot登录号均以引用的方式整体并入本文，如同指明每个单独的参考文献具体且单独地以引用的方式并入。
发明内容
为了满足这些和其他需要，本文尤其提供了结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的分离的抗体。有利地，这些抗体具有许多可用的体外和/或体内特性中的一种或多种，所述体外和/或体内特性诸如以高亲和力结合多种SIRP-α多肽、针对多种哺乳动物SIRP-α多肽(例如，人v1、人v2、食蟹猴和/或多种鼠类SIRP-α蛋白)的交叉反应性、增强巨噬细胞吞噬作用的能力、增强树突状细胞激活的能力、和/或抑制表达CD47的肿瘤的体内生长的能力。此外，本公开提供了具有变体轻链的抗体，所述变体轻链已经被工程改造以去除潜在的易感性(liability)，诸如可以通过脱酰胺化或糖化而被修饰的残基，从而产生具有更多对于制造、储存和/或药物开发所期望的特征的抗体。
在某些方面，本公开提供了结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的抗体(例如，分离的抗体)，其中所述抗体包含：重链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的重链可变(VH)结构域；和轻链，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(SEQ ID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V，并且其中所述VL结构域不包含序列SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，所述VL结构域包含选自由SEQ ID NO:39-41组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链进一步包含轻链恒定(CL)结构域序列，所述轻链恒定结构域序列包含根据下式的氨基酸序列：GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSX4X5KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:72)，其中X4X5是ND、DN、DS或SD。在一些实施方案中，所述轻链进一步包含轻链恒定(CL)结构域序列，所述轻链恒定结构域序列包含选自由SEQ ID NO:43-46组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链进一步包含κ轻链恒定(CL)结构域。在一些实施方案中，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。在一些实施方案中，所述轻链进一步包含λ轻链恒定(CL)结构域。在一些实施方案中，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，所述轻链包含选自由SEQ ID NO:48-57组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体为scFv-Fc、单结构域抗体、单重链抗体或单轻链抗体。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含重链，所述重链包含含有Fc区的重链恒定结构域。在一些实施方案中，所述Fc区为选自由IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG4 Fc区组成的组的人Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区为人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区为人IgG1 Fc区，所述人IgG1 Fc区包含L234A、L235A和G237A取代，氨基酸位置编号根据EU。在一些实施方案中，所述Fc区为人IgG2 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区为人IgG2 Fc区，所述人IgG2 Fc区包含A330S和P331S取代，氨基酸位置编号根据EU。在一些实施方案中，所述Fc区进一步包含N297A取代，氨基酸位置编号根据EU。在一些实施方案中，所述Fc区为人IgG2 Fc区，所述人IgG2 Fc区包含N297A取代，氨基酸位置编号根据EU。在一些实施方案中，所述Fc区为人IgG4 Fc区，并且其中所述重链包含S228P取代，氨基酸位置编号根据EU。在一些实施方案中，所述重链包含重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包含选自由SEQ ID NO:31-35组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包含选自由SEQ ID NO:33、34和137组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包含选自由SEQ ID NO:132-139组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链包含选自由SEQ ID NO:58-62组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含选自由SEQ ID NO:60、61和129组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含选自由SEQ ID NO:124-131组成的组的氨基酸序列。
在某些方面，本公开提供了结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的抗体(例如，分离的抗体)，其中：所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQID NO:52；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；或所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
在某些方面，本公开提供了结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的抗体(例如，分离的抗体)，其中：所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQID NO:52；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；所述重链包含氨基酸序列SEQ IDNO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:129，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:124，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52；或所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:124，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，所述抗体增强表达人SIRP-α多肽的巨噬细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，所述抗体增强表达人SIRP-α多肽的树突状细胞的激活。在一些实施方案中，所述抗体抑制表达CD47的肿瘤的体内生长。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述抗体缀合至剂，例如细胞毒性剂、标记或调节免疫系统的部分。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合由癌细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，由所述癌细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘蛋白1、粘蛋白16、PD-L1、PTK7、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、粘连蛋白4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自以下的肽的MHC/肽复合物：NY-ESO-1/LAGE、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、存活素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPV E7。在一些实施方案中，所述抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合由免疫细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，由所述免疫细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-15、FGL-1、CD200、CD200R、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、精氨酸酶、IDO、TDO、AhR、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、TGF-βRI、TGF-βRII、c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、TNFR2、PVRIG、DNAM和ICOS。在一些实施方案中，所述抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合由自然杀伤(NK)细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，由所述NK细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：NKR-P1A、CD94、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94、NKG2D、CD160、CD16、NKp46、NKp30、NKp44、DNAM1、CRTAM、CD27、NTB-A、PSGL1、CD96、CD100、NKp80、SLAMF7和CD244。
在某些方面，本公开提供了编码根据任一上述实施方案的抗体的多核苷酸。在某些方面，本公开提供了包含根据任一上述实施方案的多核苷酸的载体。在某些方面，本公开提供了包含根据任一上述实施方案的多核苷酸或载体的宿主细胞。在某些方面，本公开提供了产生抗体的方法，所述方法包括培养根据任一上述实施方案的宿主细胞，以使得抗体产生。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞中回收所述抗体。
在某些方面，本公开提供了治疗个体的癌症或延迟个体的癌症的进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据任一上述实施方案的所述抗体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的第二抗体，所述第二抗体结合由所述癌症表达的抗原。在一些实施方案中，由所述癌症表达的所述抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘蛋白1、粘蛋白16、PTK7、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、粘连蛋白4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自以下的肽的MHC/肽复合物：NY-ESO-1/LAGE、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、存活素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPV E7。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂包括第二抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体结合选自由以下组成的组的抗原：BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-15、FGL-1、CD200、CD200R、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、精氨酸酶、IDO、TDO、AhR、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、TGF-βRI、TGF-βRII、c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、TNFR2、PVRIG、DNAM和ICOS。在一些实施方案中，所述第二抗体结合PD-1。在一些实施方案中，所述第二抗体结合PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂包括疫苗、溶瘤病毒、过继细胞疗法、细胞因子或小分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的第二抗体，所述第二抗体结合由自然杀伤(NK)细胞表达的抗原。在一些实施方案中，由所述NK细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：NKR-P1A、CD94、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94、NKG2D、CD160、CD16、NKp46、NKp30、NKp44、DNAM1、CRTAM、CD27、NTB-A、PSGL1、CD96、CD100、NKp80、SLAMF7和CD244。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的化学治疗剂或小分子抗癌剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的靶向小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述靶向小分子抑制剂是VEGFR和/或PDGFR抑制剂、EGFR抑制剂、ALK抑制剂、CDK4/6抑制剂、PARP抑制剂、mTOR抑制剂、KRAS抑制剂、TRK抑制剂、BCL2抑制剂、IDH抑制剂、PI3K抑制剂、DNA损伤应答(DDR)抑制剂或低甲基化剂。
在某些方面，本公开提供了治疗个体的自身免疫疾病或炎性疾病或延迟个体的自身免疫疾病或炎性疾病的进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据任一上述实施方案的抗体。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病或炎性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎性或自身免疫疾病、移植物抗宿主病、败血症、糖尿病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠状动脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、子宫内膜异位症、肾小球肾炎、IgA肾病、多囊性肾病、重症肌无力、特发性肺纤维化、纤维化疾病(例如，肺纤维化、肝硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化或腹膜后纤维化)、哮喘、特应性皮炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管炎和炎性自身免疫性肌炎。
应理解，本文所述的各个实施方案的一种、一些或所有特性可组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得显而易见。通过下文的详细描述对本发明的这些和其他实施方案进一步描述。
附图说明
图1示出了用于评估单一剂活性的体内同系小鼠结肠癌模型的结果。将MC38细胞皮下植入C57BL/6小鼠中并随机分组(8只小鼠/组)。将小鼠用媒介物(PBS)、CD47阻断性抗SIRP-α抗体AB27b、CD47阻断性抗SIRP-α抗体AB25b或CD47阻断性抗SIRP-α抗体AB25c治疗。植入后第7天肿瘤平均为60mm3时开始治疗。以10mg/kg每周两次向小鼠腹膜内(IP)给予抗SIRPα抗体，持续三周。当肿瘤达到约2000mm3的体积时，处死动物。
图2将具有AB21人重链和所指示人源化轻链的抗体的表达产率和结合亲和力进行比较。通过在FreeStyleTM 293-FS细胞(Thermo Fisher)中的表达来产生抗体。
图3A和图3B示出了使用EGFR(+)DLD-1细胞作为靶标并且使用M2巨噬细胞作为吞噬细胞的体外吞噬作用测定的结果。以所指示浓度将抗SIRP-α抗体与抗EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)组合测试。通过CFSE+细胞的百分比测量吞噬作用。
图4A和图4B示出了用所指示抗SIRP-α抗体的体内树突状细胞激活测定的结果。给小鼠静脉内注射10mg/kg的所指示抗体，并且在注射后5小时收获脾。通过流式细胞术测量CD4+树突状细胞上的激活标志物CD86、MHCII和CCR7。
图5示出了体内同系小鼠结肠癌模型评估抗SIRP-α治疗与PD-L1/PD-1途径抑制的组合的活性的结果。将CT26细胞皮下植入BALBc小鼠中并随机分组(8只小鼠/组)。将小鼠用媒介物(PBS)、抗PD-L1抗体、CD47阻断性抗SIRP-α抗体AB25b、或AB25b和PD-L1治疗。植入后第7天肿瘤平均为60mm3时开始处理。以10mg/kg每周两次对小鼠腹膜内(IP)给药，持续三周，并且当肿瘤达到约2000mm3的体积时将所述小鼠处死。
图6示出了体内同系小鼠结肠癌模型评估抗SIRP-α治疗与PD-L1/PD-1途径抑制的组合的活性的结果。将MC38细胞皮下植入C57BL/6小鼠中并随机分组(8只小鼠/组)。将小鼠用媒介物(PBS)、抗PD-1抗体、CD47阻断性抗SIRP-α抗体AB25b、或AB25b和抗PD-1治疗。植入后第7天肿瘤平均为60mm3时开始处理。以10mg/kg每周两次对小鼠腹膜内(IP)给药，持续三周，并且当肿瘤达到约2000mm3的体积时将所述小鼠处死。
图7示出了抗体PC336的肽的糖化形式(黑色)相对于未修饰形式(灰色)的总提取离子色谱曲线下面积(XIC，AUC)，如通过质谱分析的。所示序列是SEQ ID NO：64-66(从左至右)。
图8示出了抗SIRP-α抗体PC301的通过在轻链和重链的所指示残基处进行脱酰胺化而被修饰的肽的百分比，如通过质谱分析的。氨基酸编号是分别基于轻链和重链序列SEQID NO：63和59中的残基的顺序编号(不是Kabat编号)。
图9示出了具有经受糖化的K104残基的Hum1轻链的片段(SEQ ID NO：67；“原始的”)，以及3种被工程改造以去除糖化位点的变体(分别为SEQ ID NO：68-70；形式1-3)。糖化位点加下划线。
图10和图11示出了原始的Hum1轻链(具有Hum1 VL和IGCL1恒定结构域)与6种变体的比对。变体各自包括3种糖化位点变体(v1、v2和v3)中的1种以及DS或SD突变以置换N171/N172脱酰胺化位点。从上至下分别示出了SEQ ID NO：47和52-57。星号指示序列差异。CDR以框绘示出(分别表示SEQ ID NO：22、23和24)。CDR描绘是根据Kabat的。氨基酸编号是基于残基的顺序编号的。
图12示出了使用EGFR(+)DLD-1细胞作为靶标并且使用M2巨噬细胞作为吞噬细胞的体外吞噬作用测定的结果。将具有所指示Fc区的抗SIRP-α抗体或同种型对照与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试。通过CFSE+细胞的百分比测量吞噬作用。
图13A至图13E示出了测试具有所指示Fc区的抗SIRP-α抗体的消耗来自外周血单核细胞(PBMC)的各种细胞类型的能力的消耗测定的结果。图13A和图13B示出了lin-HLADR+树突状细胞(DC)的消耗并且表示了使用从不同供体获得的PBMC进行的实验的结果。图13C示出了抗SIRP-α抗体和同种型对照对CD3+T细胞的消耗的缺乏。图13D示出了抗SIRP-α抗体和同种型对照对CD14+单核细胞的消耗的缺乏。图13E示出了抗SIRP-α抗体和同种型对照对CD20+B细胞的消耗的缺乏。
图14A和图14B示出了使用EGFR(+)DLD-1细胞作为靶标并且使用M2巨噬细胞作为吞噬细胞的体外吞噬作用测定的结果。将具有所指示Fc区的抗SIRP-α抗体与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试。通过CFSE+细胞的百分比测量吞噬作用。
图15A和图15B示出了使用EGFR(+)DLD-1细胞作为靶标并且使用M2巨噬细胞作为吞噬细胞的体外吞噬作用测定的结果。将具有所指示轻链恒定结构域(λ或κ)的抗SIRP-α抗体与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试。通过CFSE+细胞的百分比测量吞噬作用。
具体实施方式
本公开描述了抗体，其结合一种或多种人SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)并且具有潜在关注的多种SIRP-α结合特征(profile)。此外，本公开描述了抗SIRP-α抗体，其具有一种或多种关注的体外和/或体内生物学特性，诸如以高亲和力结合多种SIRP-α多肽和增强巨噬细胞吞噬作用、增强树突状细胞激活和/或抑制表达CD47的肿瘤的体内生长的能力。这些抗体具有来源于鸡的轻链，这为产生跨多种哺乳动物SIRP-α多肽发生交叉反应的抗体提供了独特的机会。实际上，已发现这些抗体与人SIRP-αv1和v2、食蟹猴SIRP-α和来自多种品系的鼠类SIRP-α发生交叉反应，从而使其对于临床前测试和在大型人群体中的临床应用均是非常有利的。重要的是，这些抗体也已经被工程改造以去除潜在的易感性，诸如可以通过脱酰胺化或糖化而被修饰的残基，从而产生具有更多对于制造、储存和/或药物开发所期望的特征的抗体。
在一个方面，本文提供了结合人SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)的分离的抗体。本文进一步提供了编码本公开的抗体的多核苷酸和载体，以及与其相关的抗体产生方法。
在另一个方面，本文提供了用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症的进展的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本公开的抗体。
在一个方面，本文提供了用于治疗个体的自身免疫疾病或炎性疾病或延迟个体的自身免疫疾病或炎性疾病的进展的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本公开的抗体。
定义
在详细描述所公开的实施方案之前，应理解本公开不限于特定的组合物或生物系统，其当然可以变化。还将理解，本文所使用的术语仅是用于描述特定实施方案的目的，并且不意图具限制性。
如在说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“一个分子”的提及任选地包括两个或更多个此类分子的组合等。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文中包括对“约”某一个值或参数的提及包括(并且描述)针对该值或参数本身的实施方案。
应理解，本公开的方面和实施方案包括了“包括方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。
如本文所用，“SIRP-α多肽”可以是指由来自任何脊椎动物的基因组编码的任何内源性或天然存在的SIRP-α多肽，所述脊椎动物包括哺乳动物，诸如人、猴、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)；和鸟类，诸如鸡。所述术语还包括天然存在的变体，例如，可变剪接变体、等位基因变体或多态性变体(例如，本文所述的那些)。所述术语可以进一步指全长未加工的SIRP-α多肽以及由细胞加工(例如去除信号序列等)产生的SIRP-α多肽。本文描述了示例性SIRP-α多肽序列。在一些实施方案中，人SIRP-α多肽为由人SIRPA基因编码的多肽，所述人SIRPA基因例如，如由NCBI基因ID号140885所述。如本文所述，SIRP-α多肽在物种内和物种之间是高度多态性的，包括例如在胞外结构域中具有氨基酸多态性的多种人变体。
SIRP-α多肽包括结合配体/配偶体例如CD47的胞外结构域。SIRP-α多肽包含3个高度同源的免疫球蛋白(Ig)样胞外结构域-D1、D2和D3。SIRP-αD1结构域(“D1结构域”)是指SIRP-α的膜远端胞外结构域，并且介导SIRP-α与CD47的结合(参见，例如Hatherley,D.等人(2008)Mol.Cell 31:266-77；Hatherley,D.等人(2007)J.Biol.Chem.282:14567-75；Hatherley,D.等人(2009)J.Biol.Chem.284:26613-9；以及Lee,W.Y.等人(2010)J.Biol.Chem.285:37953-63)。胞外结构域通常是指SIRP-α的整个细胞外部分，例如，如在细胞表面上表达的，并且可以包含不同的SIRP-α结构域，诸如D1结构域。D1结构域含有显示对介导CD47结合至关重要的残基(参见例如，Lee,W.Y.等人(2007)J.Immunol.179:7741-50)。在一些实施方案中，结合SIRP-α多肽的胞外结构域的抗体结合D1结构域的一个或多个残基。
如本文所用，“CD47”(也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)、MER6和OA3)是指除其他作用之外还充当SIRP-α多肽的结合配偶体的多肽。在一些实施方案中，CD47指人CD47多肽，例如由人CD47基因编码的多肽，例如由NCBI参考序列ID号961所述的多肽。示例性人CD47氨基酸序列是已知的(参见例如，NCBI参考序列登录号NP_001768)。特别地，CD47的IgSF结构域是指已知对SIRP-α结合关键的CD47的N末端胞外结构域(参见例如，Barclay,A.N.和Brown,M.H.(2006)Nat.Rev.Immunol.6:457-64和Hatherley,D.等人(2009)J.Biol.Chem.284:26613-9)。术语“CD47”还可以包括能够结合SIRP-α的修饰的CD47多肽，例如包含缀合至另一多肽或其他部分例如Ig Fc区的CD47的IgSF结构域的多肽。
如本文所用，“调节SIRP-α信号传导”可以是指在表达SIRP-α多肽的细胞中拮抗、激动或以其他方式干扰SIRP-α信号传导的一个或多个方面。SIRP-α信号传导可以是指由SIRP-α多肽的激活介导的一种或多种细胞内信号传导事件，包括但不限于SIRP-α的胞内区的酪氨酸磷酸化、磷酸酶(例如，SHP1)结合、衔接蛋白结合(例如，SCAP2、FYB和/或GRB2)、细胞因子产生(例如IL-10、IL-1β、IFN或TNF)和一氧化氮产生；和/或一种或多种细胞间表型，包括但不限于巨噬细胞吞噬作用和巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)的其他激活或抑制表型。
如本文所用，术语“抗体”可以是指完整抗体；抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、双体抗体、scFv、scFv-Fc、单结构域抗体、单重链抗体和单轻链抗体)，前提条件是它们表现出期望的生物活性(例如表位结合)；单克隆抗体；多克隆抗体；单特异性抗体；多特异性抗体(例如，双特异性抗体)；和抗体样蛋白质。
如本文所用，术语“双特异性”当用于提及抗体或抗体片段时包括具有两种不同结合特异性的抗体或抗体片段。例如，每种结合特异性可以识别不同的抗原，或者每种结合特异性可以识别具有不同亲和力和/或精确表位的相同抗原。在一些实施方案中，每种不同的结合特异性包含一种或多种不同的抗体抗原结合结构域(例如，可变结构域)，使得双特异性抗体或抗体片段至少包含具有第一结合特异性的第一抗原结合结构域和具有第二结合特异性的第二抗原结合结构域。本文描述了多种示例性双特异性抗体形式，并且其在本领域中是已知的。
“分离的”抗体可以是指已经从其天然环境(例如宿主细胞或生物体)的组分分离和/或回收的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至按重量计的所需纯度(例如，至少95％)；和/或通过例如利用银、考马斯等染色的SDS-PAGE达到的均质性。在一些实施方案中，在一个或多个纯化步骤后获得分离的抗体。
如本领域所知，“天然”抗体通常是指包括两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链的异四聚体复合物。除了链内二硫键之外，可变数目的二硫键连接两条重链，并且一条链将每条轻链连接至重链。重链包含可变结构域(VH)，随后是(N末端至C末端)三个或四个恒定结构域。轻链包含可变结构域(VL)，随后是恒定结构域(CL)。通常，哺乳动物轻链基于氨基酸序列属于以下两个类别之一：κ和λ。
“恒定结构域”可以是指抗体或片段的例如在可变结构域之外的更保守部分。所述术语可以包括CL结构域以及重链恒定结构域CH1、CH2和CH3连同重链铰链区。任选地，重链恒定结构域可以进一步包含CH4重链恒定结构域。
重链的恒定结构域可以指派为以下5种主要类型之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。对于许多这些主要类型存在若干种亚型。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的并且通常例如描述于Abbas等人Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)中。
如本文所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体的轻链和重链的包含互补决定区(CDR，例如CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2和CDR H3)和框架区(FR)的部分。
术语“可变”是指这样的事实，可变结构域的亚序列在抗体间的序列上基本上不同并且对于特定抗体对其抗原的结合特异性是关键的。可变性集中在VH和VL结构域两者中的三个高变区(HVR)中。可变结构域的更保守部分称为框架区(FR)，HVR散布在其中。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由形成环的三个HVR连接的四个FR区(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。
术语“高变区(HVR)”可以是指VH和VL结构域的特征在于增强的序列可变性和/或限定环的形成的亚区。这些高变区包括VH结构域中的三个HVR(H1、H2和H3)和VL结构域中的三个HVR(L1、L2和L3)。据信H3在赋予精细结合特异性方面是关键的，其中L3和H3显示出最高水平的多样性。参见Johnson和Wu,在Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编辑,Human Press,Totowa,N.J.,2003)中。
多种HVR描绘是已知的。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR表示KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷，并由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触(contact)”HVR是基于对可用的复合物晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基如下所述。“框架”或“FR”残基是除HVR残基之外的那些可变结构域残基。
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还已知“延伸的”HVR：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)(Kabat编号)。
“根据Kabat的编号”可以是指Kabat等人，同上中的用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。实际线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或向其中的插入的几个或另外氨基酸。通过在抗体序列同源性区域与“标准”Kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。通常，当提及可变结构域中的残基(轻链的大约残基1-107和重链的残基1-113)时使用Kabat编号，而EU编号系统或指数(例如，如Kabat中的EU指数，根据EU IgG1的编号)通常在提及重链恒定区中的残基时使用。
“全长”或“完整”抗体通常包括具有Fc区的重链，例如与抗体片段相对。具有单个抗原结合位点的抗原结合“Fab”片段可以通过木瓜蛋白酶消化从残余的Fc片段中释放。F(ab’)2片段包括通过胃蛋白酶处理抗体产生的两个抗原结合位点。然而，抗体片段将包括一个或多个抗体可变区。
“Fv”片段含有完整的抗原结合位点。单链Fv(scFv)可以包含通过肽接头连接的VH和VL结构域，使得VH和VL结构域例如在抗体或Fab片段中缔合，由此使得HVR形成抗原结合位点。参见Pluckthün,在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York,1994),第269-315页中。在一些实施方案中，scFv与抗体Fc结构域融合(例如，scFv-Fc)。虽然六个HVR通常包含抗原结合位点，但具有三个HVR的单个可变结构域仍然能够结合抗原，但是亲和力较低。参见Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。单结构域抗体(例如，骆驼科动物抗体)通常包含用于抗原结合的单个单体可变结构域。单重链(VHH)和单轻链抗体也是已知的。Fab'片段通常在C末端包含比Fab片段稍微更多的残基。Fab'-SH包括具有游离巯基的半胱氨酸残基。抗体片段的各种化学偶联在本领域中是已知的。
“双体抗体”包括具有两个抗原结合位点的抗体片段。这些包括通过接头连接的VH和VL结构域，所述接头通常太短而不有利于结构域在同一链中的配对。双体抗体可以是二价的或双特异性的。三体抗体和四体抗体或其他数量的VH/VL结构域是已知的。参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。
如本文所用，“单克隆”抗体是指从基本上同质的抗体(例如，其基本上相同但允许较低水平的背景突变和/或修饰)的群体获得的抗体。“单克隆”指示抗体的基本上同质的特征，且无需通过任何特定方法来生产抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体通过其HVR、VH和/或VL序列和/或结合特性进行选择，例如选自克隆(例如，重组、杂交瘤或噬菌体衍生的)的库。单克隆抗体可以被工程改造以包含一个或多个突变，例如，以影响抗体的结合亲和力或其他特性、产生人源化或嵌合抗体、改善抗体产生和/或同质性、工程改造多特异性抗体，此举的所得抗体仍被认为本质上是单克隆的。单克隆抗体群体可以与多克隆抗体区分开，因为群体的单个单克隆抗体识别相同的抗原位点。多种用于产生单克隆抗体的技术是已知的；参见例如，杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,在MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中)、重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如，WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
“嵌合”抗体可以指具有来自特定同种型、类别或生物体的重链和/或轻链的一部分和来自另一同种型、类别或生物体的另一部分的抗体。在一些实施方案中，可变区来自一个来源或生物体，而恒定区来自另一来源或生物体。
“人源化抗体”可以是指具有主要的人序列和最小量的非人(例如小鼠或鸡)序列的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体具有来自来源于非人(例如小鼠或鸡)生物体的抗体的一种或多种HVR序列(具有关注的结合特异性)，所述一种或多种HVR序列移植到人受体抗体框架(FR)上。在一些实施方案中，将非人残基进一步移植到人框架上(不存在于来源或受体抗体中)，例如以改善抗体特性。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环且全部或基本全部的FR为人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人”抗体可以是指具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体和/或使用用于制备本文所公开的人抗体的任何技术制备。人抗体可以使用本领域中已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)；人单克隆抗体的制备如描述于Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)；并且通过将抗原施用至转基因动物，所述转基因动物被修饰以响应于抗原激发产生此类抗体，但是其内源性基因座被失能，例如免疫的异种小鼠(xenomice)(关于XENOMOUSETM技术参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)或具有人免疫球蛋白序列的鸡(参见例如，WO2012162422、WO2011019844和WO2013059159)。
如本文所用，术语“接头”是指两个元件(例如蛋白质结构域)之间的连接。在一些实施方案中，接头可以是共价键或间隔区。术语“间隔区”是指在两个多肽或多肽结构域之间出现的部分(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)或氨基酸序列(例如，1-200个氨基酸序列)以提供两个多肽或多肽结构域之间的空间或灵活性(或空间和灵活性两者)。在一些实施方案中，氨基酸间隔区是多肽的一级序列的一部分(例如，通过多肽主链与间隔的多肽或多肽结构域连接)。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”可以是指抑制细胞增殖或诱导细胞死亡的任何剂。细胞毒性剂包括但不限于化学治疗剂；放射性同位素；生长抑制剂；和毒素，诸如小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。示例性细胞毒性剂包括但不限于代谢抑制剂、抗微管剂、含铂化合物、烷化剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物、拓扑异构酶I抑制剂、信号转导途径抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂、激素和激素类似物、促凋亡剂、LDH-A抑制剂、细胞周期抑制剂、HDAC抑制剂和抗生素剂。
如本文所用，“标记”可以包括充当例如本公开的标记抗体与大分子或细胞之间的结合的检测剂的任何部分。示例性标记包括但不限于荧光(例如化合物或蛋白质)、放射性或酶促部分，以及亲和纯化标签。
如本文所用，可以说抗体以足以使抗体可用于在体外和/或体内操纵抗原的亲和力“结合”抗原。在一些实施方案中，“结合”抗原的抗体具有在25℃下小于或等于1μM的对抗原的解离常数(KD)。
如本文所用，术语“亲和力”或“结合亲和力”是指两个分子之间的结合相互作用的强度。通常，结合亲和力是指分子与其结合配偶体(诸如高亲和力SIRP-αD1变体与CD47)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则结合亲和力是指反映结合对的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。两个分子之间的结合亲和力通常通过解离常数(KD)或缔合常数(KA)来描述。两个彼此具有低结合亲和力的分子通常缓慢结合，往往易于解离，并且表现出大的KD。两个彼此具有高亲和力的分子通常容易结合，往往保持更长的结合，并且表现出小的KD。在一些实施方案中，使用已知的方法和技术(例如表面等离子体共振(SPR))确定两个相互作用分子的KD。KD可以计算为koff/kon的比率。
如本文所用，术语“小于......的KD”是指数值上较小的KD值和相对于所述KD值的增加的结合亲和力。如本文所用，术语“大于......的KD”是指数值上较大的KD值和相对于所述KD值的降低的结合亲和力。
如本文所用，“治疗”可以是指治疗性施用分子、化合物、制剂、组合物等，以改变所治疗的个体或细胞中的一种或多种病理症状。治疗的期望效果可以包括但不限于减缓疾病进展、改善或缓和病理症状或疾病状态、改善预后和/或实现疾病缓解。例如，如果减轻或消除与癌症相关的一种或多种症状，诸如但不限于减少癌细胞的增殖、消除癌细胞或肿瘤负担、减少由癌症引起的症状、提高个体的生活质量、减少其他药物的剂量和/或延长个体的生存期，则成功“治疗”个体的癌症。作为另一个实例，如果减轻或消除与自身免疫疾病或炎性疾病相关的一种或多种症状，诸如但不限于减少自身反应性免疫细胞和/或炎性免疫细胞或细胞因子、减少免疫激活和/或炎症、减缓或减轻由疾病引起的器官损伤、减少由疾病引起的症状、提高个体的生活质量、减少其他药物的剂量和/或延长个人的生存期，则可以成功地“治疗”自身免疫疾病或炎性疾病。
如本文所用，“延迟疾病的进展”可以是指减缓、阻滞、推迟、延缓疾病的发展，稳定或以其他方式阻碍疾病的病理过程。在一些实施方案中，所述术语可以是指足以有效地包括预防，例如，预防个体发展疾病的延迟。在一些实施方案中，例如晚期癌症、延迟进展可以包括延迟转移。本领域技术人员将理解，延迟的精确长度可以取决于例如具体疾病、个体状况等。
术语“癌症”和“癌性”可以描述哺乳动物中一个或多个细胞的失调或不受调控的细胞生长/增殖。可以包括本领域中已知的任何癌症类型，诸如但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、淋巴瘤和胚细胞瘤。此类癌症的更具体的实例包括但不限于肺癌、鳞状细胞癌、脑肿瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、结肠直肠癌(例如结肠癌或直肠癌)、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、泌尿道癌、乳腺癌、腹膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性髓性白血病(AML)；梅克尔(Merkel)细胞癌；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病(CML)；和相关的转移。
如本文所用，术语“有效量”可以是指本公开的抗体或含有本公开的抗体的药物组合物的量，所述量足以并有效地在治疗患有疾病诸如癌症(例如实体瘤或血液癌症)的患者或延迟所述疾病的进展方面实现期望的治疗效果。在一些实施方案中，治疗有效量将避免不良副作用，并且/或者有益效果将超过此类副作用。有效量可以取决于所治疗的个体，例如年龄、体重、性别、疾病状态，以及所述剂产生所需应答的能力。有效量可以在一次或多次施用中施用。如在临床背景中，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物(诸如另一种治疗剂)联合实现。因此，在施用一种或多种另外的治疗剂的情况下也可以考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他剂联合，可以实现或实现了期望的结果，则可以认为单一剂以有效量施用。
如本文所用，术语“药物组合物”可以是指包含活性成分以及赋形剂或稀释剂(或赋形剂和稀释剂两者)的药用或药物制剂，并且能够通过合适的施用方法施用活性成分。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含与本公开的一种或多种抗体相容的药学上可接受的组分。在一些实施方案中，药物组合物呈用于口服施用的片剂或胶囊形式或呈例如通过注射用于静脉内或皮下施用的水性形式。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地用于指脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、人、农场动物、运动动物和宠物。
如本文所用，“与......结合”或“与......组合”可以是指除另一种治疗剂之外(例如，在其之前、期间和/或之后)施用一种治疗剂。
抗体
本公开的某些方面涉及结合人SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)的抗体。在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含表2中所示的VH结构域，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的VL结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(SEQ ID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含表2中所示的VH结构域，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的VL结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(SEQID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V。在任何上述实施方案的一些实施方案中，VL结构域不包含序列SEQ ID NO:25。在某些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的VL结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(SEQ ID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V。在一些实施方案中，VL结构域不包含序列SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，本公开的抗体包含含有表2中所示的VH结构域的重链和/或含有表1中所示的VL结构域的轻链。在一些实施方案中，本公开的抗体包含含有表2中所示的VH结构域的重链和含有表1中所示的VL结构域的轻链。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的氨基酸序列的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的氨基酸序列的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含表2中所示的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含表2中所示的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ IDNO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:81的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQ ID NO:77-111的氨基酸序列的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQ ID NO:77-111的氨基酸序列的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-51的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含表2中所示的VH结构域和含有选自由SEQ ID NO:33、34和137组成的组的氨基酸序列的恒定结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自由SEQ ID NO:60、61和129组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQID NO:26、81或83的氨基酸序列的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQ IDNO:26、81或83的氨基酸序列的VH结构域，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的氨基酸序列的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的氨基酸序列的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQID NO:26、81或83的氨基酸序列的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:39-41的VL结构域序列和含有选自SEQ ID NO:36-38的序列的CL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:39-41的VL结构域序列和含有选自SEQ ID NO:36-38的序列的CL结构域。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQID NO:26、81或83的氨基酸序列的VH结构域，所述轻链包含含有序列SEQ ID NO:25的VL结构域和选自SEQ ID NO:43-46的CL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域，所述轻链包含含有序列SEQ ID NO:25的VL结构域和选自SEQ ID NO:43-46的CL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的VH结构域，所述轻链包含选自SEQ ID NO:39-41的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的VH结构域，所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的VH结构域，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自由SEQ IDNO:119-123组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:39-41的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自由SEQ ID NO:119-123组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自由SEQ ID NO:119-123组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:119，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:120，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:121，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:122，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:123，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域和选自由SEQ ID NO:132-139组成的组的恒定结构域序列；所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域和选自由SEQ ID NO:33、34和137组成的组的恒定结构域序列；所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:40的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域和选自由SEQ ID NO:132-139组成的组的恒定结构域序列；所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VH结构域和选自由SEQ IDNO:33、34和137组成的组的恒定结构域序列；所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自由SEQID NO:124-131组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自由SEQID NO:60、61和129组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自由SEQID NO:124-131组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自由SEQ ID NO:60、61和129组成的组的氨基酸序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:137，并且轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自SEQ IDNO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的VL结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(SEQ ID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的VL结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGX1GTX2X3TVL(SEQ ID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V。在任何上述实施方案的一些实施方案中，VL结构域不包含序列SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ IDNO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含表1中所示的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的氨基酸序列的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的氨基酸序列的VL结构域和含有选自SEQ ID NO:36-38的氨基酸序列的CL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:58-62的氨基酸序列，所述轻链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的VL结构域和含有选自SEQ ID NO:43-46的氨基酸序列的CL结构域。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:62，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:62，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:62，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:60，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:60，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:60，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:60，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:60，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:58，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQID NO:60，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQID NO:77-111的序列的VH结构域，所述轻链包含含有序列SEQ ID NO:25的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQ ID NO:77-111的序列的VH结构域，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的序列的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQ ID NO:77-111的序列的VH结构域，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的序列的VL结构域和含有选自SEQID NO:36-38的序列的CL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含含有选自SEQ ID NO:77-111的序列的VH结构域，所述轻链包含含有序列SEQ IDNO:25的VL结构域和含有选自SEQ ID NO:43-46的序列的CL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:114-123的序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:47-63的序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:124-131的序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:47-63的序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:114-131的序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:47-63的序列。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ IDNO:114-118的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:119-123的氨基酸序列，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-57的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:114-123的氨基酸序列，所述轻链包含含有选自SEQ ID NO:39-41的序列的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:114-123的氨基酸序列，所述轻链包含含有选自SEQ IDNO:39-41的序列的VL结构域和含有选自SEQ ID NO:36-38的序列的CL结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO:114-123的氨基酸序列，所述轻链包含含有序列SEQ ID NO:25的VL结构域和含有选自SEQ ID NO:43-46的序列的CL结构域。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含来自VH结构域的三个CDR和/或来自VL结构域的三个CDR，所述VH结构域含有表2所示的序列，所述VL结构域含有表1所示的序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含这样的VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含与表2所示的VH结构域序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列和任选的来自含有表2所示的序列的VH结构域的三个CDR；所述VL结构域包含与表1所示的VL结构域序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列和任选的来自含有表1所示的序列的VL结构域的三个CDR。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含与表2所示的重链序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列和任选的来自含有表2所示的序列的VH结构域的三个CDR；所述轻链包含与表1所示的轻链序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列和任选的来自含有表1所示的序列的VL结构域的三个CDR。
表1.轻链抗体序列。
Figure BDA0002690047860000261
Figure BDA0002690047860000271
Figure BDA0002690047860000281
Figure BDA0002690047860000291
表2.重链抗体序列。
Figure BDA0002690047860000292
Figure BDA0002690047860000301
Figure BDA0002690047860000311
Figure BDA0002690047860000321
Figure BDA0002690047860000331
Figure BDA0002690047860000341
Figure BDA0002690047860000351
Figure BDA0002690047860000361
Figure BDA0002690047860000371
Figure BDA0002690047860000381
Figure BDA0002690047860000391
Figure BDA0002690047860000401
Figure BDA0002690047860000411
如上所述，用于描绘高变区(HVR)或互补决定区(CDR)的各种技术在本领域中是已知的，并且可以应用于本文所述的可变结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含如用Chothia、Kabat、IMGT或其组合定义的HVR(例如，用一种描绘定义的一个或多个HVR和由不同描绘定义的一个或多个HVR)。如本文所用，除非另外指明，否则HVR或CDR残基的编号用Kabat编号定义。
在一些实施方案中，本公开的抗体结合包含氨基酸序列EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:5)的人SIRP-αv1多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。在一些实施方案中，本公开的抗体结合包含氨基酸序列EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:6)的人SIRP-αv2多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。在一些实施方案中，本公开的抗体结合包含氨基酸序列EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:5)的人SIRP-αv1多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)并且结合包含氨基酸序列EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:6)的人SIRP-αv2多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。
在一些实施方案中，本公开的抗体结合猴SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)(例如，猴SIRP-α多肽的D1结构域)。在一些实施方案中，本公开的抗体结合食蟹猴SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)(例如，发现于生物体食蟹猕猴(Macacafascicularis)中)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少两种不同的猴SIRP-α变体多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。在一些实施方案中，所述抗体结合至少两种不同的食蟹猴SIRP-α变体多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。例如，在一些实施方案中，所述抗体结合包含氨基酸序列EEELQVIQPEKSVSVAAGESATLNCTATSLIPVGPIQWFRGVGPGRELIYHQKEGHFPRVTPVSDPTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:11)的食蟹猴SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)、包含氨基酸序列EEELQVIQPEKSVSVAAGDSATLNCTVSSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNLKEGHFPRVTAVSDPTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:12)的食蟹猴SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)或两者。
在一些实施方案中，本公开的抗体结合鼠类或小鼠SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，发现于生物体小家鼠(Mus musculus)中；例如，鼠类或小鼠SIRP-α多肽的D1结构域)。在一些实施方案中，所述抗体结合两种或更多种不同的鼠类SIRP-α变体多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。来自不同的小鼠品系的多种鼠类SIRP-α变体多肽是已知的。在一些实施方案中，鼠类SIRP-α变体多肽包含选自以下的氨基酸序列：KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIKWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRVTNVSDATKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQKGPSEPDTEIQSGGGTEVYVLAKPS(SEQ ID NO:7；来自129小鼠品系)、TEVKVIQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGQSRQLIYSFTTEHFPRVTNVSDATKRSNLDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSPDTEIQSGGGTEVYVLAK(SEQ ID NO:8；来自NOD小鼠品系)、KELKVTQPEKSVSVAAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRWYRGVGPSRLLIYSFAGEYVPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPADAGIYYCVKFQKGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK(SEQ ID NO:9；来自C57BL/6小鼠品系)和TEVKVTQPEKSVSVAAGDSTILNCTVTSLLPVGPIRWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYYCVKFQRGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK(SEQ ID NO:10；来自BALB/c小鼠品系)。
在一些实施方案中，本公开的抗体结合人SIRP家族蛋白的胞外结构域(例如，D1结构域)。在一些实施方案中，本公开的抗体结合人SIRP-β多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。在一些实施方案中，人SIRP-β多肽是指由人SIRPB1基因编码的多肽，所述SIRPB1基因例如，如由NCBI参考序列ID号10326所述。在一些实施方案中，人SIRP-β多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)包含氨基酸序列EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQID NO:13)或EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方案中，本公开的抗体结合人SIRP-γ多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)。在一些实施方案中，人SIRP-γ多肽是指由人SIRPG基因编码的多肽，所述人SIRPG基因例如，如由NCBI参考序列ID号55423所述。在一些实施方案中，人SIRP-γ多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)包含氨基酸序列EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，本公开的抗体结合CD47(例如，人CD47)的IgSF结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体结合包含氨基酸序列QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS(SEQ ID NO:16)的多肽。
在一些实施方案中，本公开的抗体调节表达人SIRP-α多肽的细胞中的SIRP-α信号传导。在一些实施方案中，本公开的抗体拮抗表达人SIRP-α多肽的细胞中的SIRP-α信号传导。在一些实施方案中，本公开的抗体干扰表达人SIRP-α多肽的细胞中的SIRP-α信号传导。在一些实施方案中，本公开的抗体激动表达人SIRP-α多肽的细胞中的SIRP-α信号传导。在一些实施方案中，SIRP-α信号传导包括由SIRP-α多肽的激活介导的一种或多种细胞内信号传导事件，包括但不限于SIRP-α的胞内区的酪氨酸磷酸化、磷酸酶(例如，SHP1)结合、衔接蛋白结合(例如，SCAP2、FYB和/或GRB2)和一氧化氮产生。用于测量细胞中SIRP-α信号传导的各种测定包括但不限于SIRP-α磷酸化、SHP1和SHP2共免疫沉淀、PI3-激酶信号传导、细胞因子产生(炎性IL-12、IL-23、TNFα、IFN和抑制性细胞因子IL-10、IL-4、IL-13、M1和M2巨噬细胞标志物的细胞表面标志物水平)或树突状细胞激活和功能；Kharitonenkov,A.等人(1997)Nature 386:181-6；Ochi,F.等人(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.239:483-7；Kim,E.J.等人(2013)Inflammation Research 62:377-86；Yi,T.等人(2015)Immunity 43:764-75。
在一些实施方案中，表达人SIRP-α多肽的细胞为白细胞。在一些实施方案中，所述细胞为巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或髓源性抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域中以其他方式已知的SIRP-α信号传导测定中的一种或多种，本公开的抗体将表达人SIRP-α多肽的细胞中的SIRP-α信号传导减少或拮抗至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域中以其他方式已知的SIRP-α信号传导测定中的一种或多种，本公开的抗体将表达人SIRP-α多肽的细胞中的SIRP-α信号传导增加或激动至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，本公开的抗体调节由SIRP-α介导的细胞内表型。在一些实施方案中，本公开的抗体增强表达人SIRP-α多肽的巨噬细胞的吞噬作用。例如，可以将用本公开的抗体处理或与本公开的抗体接触的巨噬细胞的吞噬活性与未用所述抗体处理或与所述抗体接触的巨噬细胞的吞噬活性进行比较，或者可以将表达人SIRP-α多肽并且用本公开的抗体处理或与本公开的抗体接触的巨噬细胞的吞噬活性与不表达人SIRP-α多肽并且用所述抗体处理或与所述抗体接触的巨噬细胞的吞噬活性进行比较。示例性吞噬作用测定可以见于例如Wieskopf,K.等人(2013)Science 341:88和Willingham,S.B.等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.109:6662-7中。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域中以其他方式已知的巨噬作用测定中的一种或多种，本公开的抗体将表达人SIRP-α多肽的巨噬细胞的巨噬作用增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，本公开的抗体增强表达人SIRP-α多肽的树突状细胞的激活(例如，单独的树突状细胞的激活水平增加，或者在样品群体内激活的树突状细胞的比例增加)。例如，可以将用本公开的抗体处理或与本公开的抗体接触的树突状细胞的激活与未用所述抗体处理或与所述抗体接触的树突状细胞的激活进行比较，或者可以将表达人SIRP-α多肽并且用本公开的抗体处理或与本公开的抗体接触的树突状细胞的激活与不表达人SIRP-α多肽并且用所述抗体处理或与所述抗体接触的树突状细胞的激活进行比较。本文描述了示例性树突状细胞激活测定。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域中以其他方式已知的树突状细胞激活测定中的一种或多种，本公开的抗体将树突状细胞(例如表达人SIRP-α多肽)激活增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，本公开的抗体抑制表达CD47的肿瘤的体内生长。例如，可以将表达CD47并且用本公开的抗体处理的肿瘤的体内生长与表达CD47并且未用本公开的抗体处理的肿瘤的体内生长进行比较。本文描述了示例性体内肿瘤生长测定。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域中以其他方式已知的体内肿瘤生长测定中的一种或多种，本公开的抗体将表达CD47的肿瘤的体内生长抑制至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，本公开的抗体阻断人SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)与人CD47多肽的IgSF结构域之间的结合(例如，“阻断性”抗体)。例如，所述抗体和CD47多肽可以“竞争”相同的SIRP-α表位，并且/或者抗体与SIRP-α的结合可以与CD47与SIRP-α的结合互相排斥。SIRP-α与CD47之间的结合界面，以及参与结合的两种蛋白质的残基是已知的；参见Hatherley,D.等人(2007)J.Biol.Chem.282:14567-75和Nakaishi,A.等人(2008)J.Mol.Biol.375:650-60。在一些实施方案中，在例如使用纯化的SIRP-α和/或CD47多肽的体外测定(诸如ELISA或SPR测定)中，本公开的抗体阻断人SIRP-α多肽的胞外结构域(例如，D1结构域)与人CD47多肽的IgSF结构域之间的结合。
抗体产生和其他抗体特性
可通过本领域中已知的任何手段产生本公开的抗体。用于抗体产生的示例性技术在下文描述；然而，提供这些示例性技术仅用于说明目的并不旨在是限制性的。此外，进一步描述了设想用于本文所述的抗体的示例性抗体特性。
在一些实施方案中，“结合”抗原的抗体具有在25℃下小于或等于1μM的对抗原的解离常数(KD)。在一些实施方案中，本公开的抗体具有在25℃下小于或等于1μM、在25℃下小于或等于500nM、在25℃下小于或等于400nM、在25℃下小于或等于300nM、在25℃下小于或等于250nM、在25℃下小于或等于200nM、在25℃下小于或等于200nM、在25℃下小于或等于100nM，或在25℃下小于或等于50nM的对人v1和/或v2 SIRP-α多肽的解离常数(KD)。在一些实施方案中，结合人SIRP-α多肽和一种或多种非人SIRP-α多肽的抗体以比非人SIRP-α多肽更高的亲和力(例如，高10倍或100倍)结合人SIRP-α多肽，但是它仍然被认为是“结合”两种多肽。在一些实施方案中，结合非人SIRP-α多肽和一种或多种人SIRP-α多肽的抗体以比人SIRP-α多肽更高的亲和力(例如，高10倍或100倍)结合非人SIRP-α多肽，但是它仍然被认为是“结合”两种多肽。用于确定结合亲和力的测定在本领域中是已知的并且包括但不限于例如如本文所述的表面等离子体共振(SPR)；放射性标记的抗原结合测定(RIA)，例如，使用抗体的Fab形式及其抗原；等等。
为了制备抗原，可以从天然来源纯化或以其他方式获得抗原，或者可以使用重组技术表达抗原。在一些实施方案中，抗原可以用作可溶性蛋白质。在一些实施方案中，可以将抗原缀合至另一多肽或其他部分，例如以增加其免疫原性。例如，本文所述的抗原可以与Fc区偶联。在一些实施方案中，在其细胞表面上表达抗原的细胞可以用作抗原。
可以通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射抗原和佐剂而在动物中产生多克隆抗体。例如，本文描述了对鸡免疫的说明。在一些实施方案中，使用双功能剂或衍生剂将抗原与免疫原性蛋白质，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合。本文提供了用于免疫鸡的示例性方法。适用于多种其他生物体(诸如哺乳动物)的相关方法是本领域熟知的。
如上所述，单克隆抗体可以通过多种方法产生。在一些实施方案中，使用杂交瘤方法制备本公开的单克隆抗体，所述杂交瘤方法首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述并且进一步描述于Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；和Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methodsand Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。可以筛选培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在所关注抗体，例如通过体外结合测定、免疫沉淀、ELISA，RIA等；并且可以例如通过Scatchard分析确定结合亲和力。产生具有所需结合特性的抗体的杂交瘤可以使用已知的培养技术进行亚克隆和培养，使其在动物中作为腹水肿瘤体内生长等。
在一些实施方案中，使用文库方法制备单克隆抗体，诸如噬菌体展示文库。参见例如，Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中。在一些实施方案中，通过聚合酶链式反应(PCR)克隆VH和VL基因的全部组成成分(repertoire)并且随机重组于噬菌体文库中，然后筛选所述文库中的抗原结合噬菌体，例如，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。可替代地，可以克隆(例如从人克隆)天然全部组成成分以提供单一来源的针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的抗体而不进行任何免疫，如由Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，天然文库也可通过以下方式合成制备：从干细胞克隆未重排的V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992).所述。
在一些实施方案中，本公开的抗体为鸡抗体。可以使用本领域中已知的各种技术产生鸡抗体；参见例如，美国专利号6,143,559；8,592,644；和9,380,769。
在一些实施方案中，本公开的抗体为嵌合抗体。参见例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如来源于鸡、小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。非人抗体可以被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来讲，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)来源于非人抗体(例如，鸡抗体)，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中。人源化鸡抗体的方法也例如描述于WO2005014653中。
用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区；人体细胞突变的框架区或人种系框架区；和来源于FR文库筛选的框架区。参见例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993)；Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993)；Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)；和Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)。
在一些实施方案中，本公开的抗体为人抗体。人抗体可以使用本领域中已知的各种技术来产生。在一些实施方案中，人抗体由非人动物，诸如遗传工程改造的鸡(参见例如，美国专利号8,592,644；和9,380,769)和/或本文所述小鼠来产生。人抗体大体描述于Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
在一些实施方案中，本公开的抗体例如使用本文所述的方法由鸡产生或来源于鸡。
在一些实施方案中，本公开的抗体为抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv或scFv片段，或单结构域、单重链或单轻链抗体。可以例如通过酶消化或通过重组技术产生抗体片段。在一些实施方案中，完整抗体的蛋白水解消化用于产生抗体片段，例如，如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等人,Science,229:81(1985)中所述。在一些实施方案中，抗体片段由重组宿主细胞产生。例如，Fab、Fv和ScFv抗体片段由大肠杆菌表达并且自大肠杆菌分泌。可替代地，抗体片段可以从抗体噬菌体文库中分离。
Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收并且化学偶联以形成F(ab')2片段。参见Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)。F(ab')2片段还可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。包含拯救受体结合表位残基、具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利号5,869,046中。
在一些实施方案中，抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185和美国专利号5,571,894和5,587,458。可以构建scFv融合蛋白以产生效应蛋白在scFv的氨基或羧基末端的融合物。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所述。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，本公开的抗体为多特异性抗体。多特异性抗体具有针对多于一种抗原的结合特异性(例如，具有两种、三种或更多种结合特异性)。在一些实施方案中，所述抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对相同抗原的两种不同结合特异性(例如，具有相同抗原的不同结合亲和力和/或特异性表位)。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对于两种不同抗原的结合特异性。在一些实施方案中，双特异性抗体为全长或完整抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体为本公开的抗体片段。
本文设想了具有结合特异性的多种组合的双特异性或多特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体对如本文所述的一种或多种SIRP-α多肽具有第一结合特异性。在一些实施方案中，双特异性抗体对由癌细胞例如表达在细胞表面上的抗原具有第二结合特异性。示例性此类抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘蛋白1、粘蛋白16、PTK7、PD-L1、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、粘连蛋白4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自以下的肽的MHC/肽复合物：NY-ESO-1/LAGE、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、存活素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPV E7。不希望受理论的束缚，据认为将这种结合特异性与针对SIRP-α的结合特异性组合例如对于用第二结合特异性指导表达FcR的白细胞靶向肿瘤细胞，同时也用第一结合特异性抑制由白细胞表达的SIRP-α对由肿瘤细胞表达的任何CD47的应答性是特别有利的。
在一些实施方案中，双特异性抗体对由免疫细胞例如表达在细胞表面上的抗原具有第二结合特异性。示例性此类抗原包括但不限于BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、IDO、TDO、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、PVRIG、DNAM和ICOS。在一些实施方案中，抗原表达在骨髓细胞上。此类抗原可以包括但不限于BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、IDO和TDO。在一些实施方案中，抗原表达在T细胞上。此类抗原可以包括但不限于41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、TNFR2、PVRIG、DNAM和ICOS。
在一些实施方案中，双特异性抗体对由NK细胞例如表达在细胞表面上的抗原具有第二结合特异性。示例性此类抗原包括但不限于NKR-P1A(KLRB1)、CD94(NKG2A)、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94(NKG2C/E)、NKG2D、CD160(BY55)、CD16(FcγRIIIA)、NKp46(NCR1)、NKp30(NCR3)、NKp44(NCR2)、DNAM1(CD226)、CRTAM、CD27、NTB-A(SLAMF6)、PSGL1、CD96(触觉的)、CD100(SEMA4D)、NKp80(KLRF1、CLEC5C)、SLAMF7(CRACC、CS1、CD319)和CD244(2B4、SLAMF4)。
本领域中已知用于产生和纯化双特异性抗体的各种方法。已经描述了许多方法。一种方法是“钮-入-孔(knobs-into-holes)”或“突起-入-腔(protuberance-into-cavity)”方法(参见例如，美国专利号5,731,168)。在一些实施方案中，通过在两个Fc结构域单体中引入不同但相容的取代(诸如“钮-入-孔”残基对和电荷残基对)来促进Fc结构域单体的异二聚化。钮与孔相互作用有利于异二聚体的形成，而钮-钮和孔-孔相互作用由于空间碰撞和有利相互作用的缺失而阻碍同型二聚体形成。孔是指当蛋白质中的原始氨基酸被具有较小侧链体积的不同氨基酸置换时产生的空隙。钮是指当蛋白质中的原始氨基酸被具有较大侧链体积的不同氨基酸置换时产生的隆起。例如，在一些实施方案中，被置换的氨基酸位于Fc结构域单体的CH3抗体恒定结构域中并参与两个Fc结构域单体的二聚化。在一些实施方案中，在一个CH3抗体恒定结构域中产生孔以容纳另一个CH3抗体恒定结构域中的钮，使得钮和孔氨基酸起促进或有利于两个Fc结构域单体的异二聚化的作用。在一些实施方案中，在一个CH3抗体恒定结构域中产生孔以更好地容纳另一个CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸。在一些实施方案中，在一个CH3抗体恒定结构域中产生钮以与另一个CH3抗体恒定结构域中的原始氨基酸形成另外的相互作用。
在一些实施方案中，通过用具有较小侧链的氨基酸(诸如丙氨酸、缬氨酸或苏氨酸)置换具有较大侧链的氨基酸(诸如酪氨酸或色氨酸)来构建孔，例如CH3抗体恒定结构域中的Y407V突变。类似地，在一些实施方案中，通过用具有较大侧链的氨基酸置换具有较小侧链的氨基酸来构建钮，例如CH3抗体恒定结构域中的T366W突变。在一些实施方案中，一个Fc结构域单体包含钮突变T366W，并且另一个Fc结构域单体包含孔突变T366S、L358A和Y407V。在一些实施方案中，将包括高亲和力SIRP-αD1变体的本公开的多肽与包含钮突变T366W的Fc结构域单体融合，以限制不需要的钮-钮同源二聚体形成。表3中包括但不限于钮-入-孔氨基酸对的实例。
表3.钮-入-孔氨基酸对。
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另一种方法使用具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合，例如与包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。在一些实施方案中，双特异性抗体具有在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。参见WO 94/04690。另一种方法使用交联(参见例如，美国专利号4,676,980)来产生异源缀合抗体。在一些实施方案中，可以通过以下方式制备双特异性抗体：使用化学连接(参见例如，Brennan等人,Science,229:81(1985))将完整抗体蛋白水解裂解成F(ab')2片段，所述片段在二硫醇络合剂存在下还原并转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物，其中一种通过还原被重新转化为Fab'-硫醇并且与另一种Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。在一些实施方案中，Fab'-SH片段是化学偶联的。在一些实施方案中，使用亮氨酸拉链在细胞培养物中产生双特异性抗体片段，如在Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)中。对于其他双特异性抗体形式，参见例如，Spiess,C.等人(2015)Mol.Immunol.67:95-106。
在一些实施方案中，本公开的抗体为双体抗体。参见例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。在双体抗体中，一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。也已报道通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等人,J.Immunol,152:5368(1994)。
在一些实施方案中，本公开的抗体为单结构域抗体。单结构域抗体是指包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的单条多肽链。在某些实施方案中，单结构域抗体为人单结构域抗体(参见例如，美国专利号6,248,516B1)。在一个实施方案中，单结构域抗体包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分。骆驼科动物抗体也是已知的。
可以使用重组方法产生抗体。对于重组产生抗抗原抗体，分离编码抗体的核酸并且将其插入可复制载体中以进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。编码抗体的DNA可以容易地分离并且使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来测序。可使用许多载体。载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本公开的抗体可以重组方式产生为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽例如为信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特定裂解位点的其他多肽。选择的异源信号序列可以为由宿主细胞识别且加工(例如，被信号肽酶裂解)的信号序列。对于不能识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核生物信号序列取代。对于酵母分泌，可以将天然信号序列取代为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列等。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒的分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒gD信号。
表达载体和克隆载体两者均含有能使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列，例如以能使载体独立于宿主染色体DNA而复制。该序列可以包括复制起点或自主复制序列。用于多种细菌、酵母和病毒的此类序列是熟知的。一般来讲，复制起点组分不为哺乳动物表达载体所需(可以使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。
表达载体和克隆载体可以含有选择基因或选择性标志物。典型的选择基因编码以下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷型不足，或(c)供应不可自复合培养基获得的关键营养物。显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适合于哺乳动物细胞的选择性标志物的另一实例为能够鉴定能摄取抗体编码核酸的细胞的那些，诸如DHFR、谷氨酰氨合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I型和-II型，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，用DHFR基因转化的内源性DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系通过将转化体培养在含有DHFR的竞争性拮抗剂的氨甲蝶呤(Mtx)的培养基中来鉴定。
可替代地，用编码所关注抗体的DNA序列、野生型DHFR基因，以及另一种选择性标志物诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过在含有针对选择性标志物的选择剂诸如氨基糖苷类抗生素(例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中进行细胞生长来进行选择。
表达载体和克隆载体通常含有由宿主生物体识别，并且可操作地连接至编码抗体的核酸的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统，和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子是合适的。用于真核生物的启动子序列是已知的。酵母启动子在本领域中是熟知的并且可以包括通过生长条件调控的可诱导启动子/增强子。事实上所有的真核基因均具有富含AT的区，所述区位于转录起始位点的上游大约25至30个碱基处。实例包括但不限于针对3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子，所述其他糖酵解酶诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。自哺乳动物宿主细胞中的载体的抗体转录可以例如通过从病毒基因组获得的启动子控制。SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段而方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为HindIII E限制性片段方便地获得。可替代地，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可以用作启动子。
高等真核生物对编码本公开的抗体的DNA的转录常常通过将增强子序列插入载体中来增加。目前已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体也将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。
用于在本文的载体中克隆或表达DNA的适当宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)等。除原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母为低等真核宿主微生物中最常用的。可以选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化途径已经被“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见例如，Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿、浮萍(Leninaceae)、苜蓿(蒺藜苜蓿(M.truncatula))和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多来自以下宿主的杆状病毒菌株和变体以及对应的容许昆虫宿主细胞：诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)以及家蚕(Bombyx mori)。
脊椎动物细胞可以用作宿主，并且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或被亚克隆来在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(HepG2)。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如NS0和Sp2/0。对于适于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的评述，参见例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第255-268页。
本公开的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基诸如Ham'sF10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。此外，Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再审专利30,985中所述的培养基中的任一种均可用作宿主细胞的培养基。必要时这些培养基中的任一种均可补充有激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以在微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能量来源。还可包含本领域技术人员所已知的适当浓度的任何其他必需补充剂。培养条件诸如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除微粒状碎片(宿主细胞或裂解的片段)。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。
从细胞制备的抗体组合物可以利用例如羟基磷灰石色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法纯化，其中亲和色谱法是典型优选的纯化步骤之一。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含含有轻链恒定(CL)结构域序列的轻链，所述轻链恒定结构域序列包含根据下式的氨基酸序列：GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSX4X5KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:72)，其中X4X5是ND、DN、DS或SD。在某些实施方案中，CL结构域包含选自SEQ IDNO:43-46的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含一个、两个、三个或四个IGLV3框架序列，包括但不限于SYELTQPPSVSVSPGQTARITC(SEQ ID NO:27)、WYQQKPGQAPVTLIY(SEQ ID NO:28)、NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC(SEQ ID NO:29)和FGGGTKLTVL(SEQ ID NO:30)。在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含结构FW1—HVR-L1—FW2—HVR-L2—FW3—HVR-L3—FW4，其中FW1包含序列SYELTQPPSVSVSPGQTARITC(SEQ ID NO:27)，FW2包含序列WYQQKPGQAPVTLIY(SEQ ID NO:28)，FW3包含序列NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC(SEQID NO:29)，并且FW4包含序列FGGGTKLTVL(SEQ ID NO:30)。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含含有k或λ轻链恒定(CL)结构域的轻链。在一些实施方案中，本公开的抗体包含含有轻链恒定结构域的轻链，所述轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:36-38中之一的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含含有轻链恒定结构域的轻链，所述轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:43-46中之一的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链，所述轻链包含表1中所示的轻链恒定结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链，所述轻链包含含有序列SEQ ID NO:25的VL结构域和选自SEQ ID NO:36-38和43-46的CL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链，所述轻链包含含有序列SEQ ID NO:25的VL结构域和选自SEQ ID NO:43-46的CL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:48-51的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含轻链，所述轻链包含选自SEQID NO:39-41的VL结构域序列和含有选自SEQ ID NO:36-38的序列的CL结构域。以上任何轻链可以与表2中所示的重链或包含表2中所述的VH结构域的抗体重链组合。
在一些实施方案中，本公开的抗体包括重链，所述重链包含含有Fc区的重链恒定结构域。例如，在一些实施方案中，Fc区为人Fc区，例如IgG1、IgG2或IgG4及其亚型。在包含如表4中所示的氨基酸序列SEQ ID NO:31-35和132-139的重链恒定结构域内提供了示例性且非限制性的Fc区。在一些实施方案中，重链恒定结构域氨基酸序列SEQ ID NO:31-35和132-139中的一种或多种内的Fc区包含一个或多个例如下文所述的突变。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链，所述重链包含表2中所示的重链恒定结构域序列。
表4.示例性恒定区序列
Figure BDA0002690047860000561
Figure BDA0002690047860000571
Figure BDA0002690047860000581
Figure BDA0002690047860000591
在一些实施方案中，Fc区包含影响一种或多种抗体特性，诸如稳定性、糖基化或其他修饰模式、效应细胞功能、药代动力学等的一个或多个突变。在一些实施方案中，本公开的抗体具有降低的或最小的糖基化。在一些实施方案中，本公开的抗体具有消除的或降低的效应功能。在一些实施方案中，本公开的抗体具有改善的稳定性(例如，通过使用S228P突变改善IgG4抗体的铰链结构域的稳定性和/或降低IgG4抗体的单体交换)。
示例性Fc突变(例如，其影响上文所述的一种或多种特性)包括但不限于(i)人IgG1 Fc区突变L234A、L235A、G237A和任选的N297A；(ii)人IgG2 Fc区突变A330S、P331S和任选的N297A；和(iii)人IgG4 Fc区突变S228P和任选的E233P、F234V、L235A、delG236和N297A(EU编号)。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区包含L234A、L235A和G237A突变。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A和N297A突变。在一些实施方案中，人IgG2Fc区包含A330S和P331S突变。在一些实施方案中，人IgG2 Fc区包含A330S、P331S和N297A突变。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区包含S288P突变。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区包含S288P和L235E突变。
靶向细胞表面抗原的抗体可以触发与免疫细胞上的Fc受体(FcR)结合相关的免疫刺激和效应功能。存在多种对于特定种类的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。Fc区与细胞表面上的Fc受体的结合可以触发多种生物应答，包括对抗体包被的颗粒的吞噬作用(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用或ADCP)、对免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的细胞的裂解(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎性介质的释放、胎盘转移以及对免疫球蛋白产生的控制。另外，补体的C1组分与抗体的结合可以激活补体系统。补体的激活可能对于细胞病原体的裂解是重要的。然而，补体的激活还可以刺激炎性应答并且还可以涉及自身免疫性超敏反应或其他免疫学病症。具有降低或消除的结合某些Fc受体的能力的变体Fc区可用于开发治疗性抗体和Fc融合多肽构建体，其通过靶向、激活或中和配体功能而不损害或破坏局部细胞或组织而起作用。
在一些实施方案中，Fc结构域单体是指包含第二和第三抗体恒定结构域(例如，CH2和CH3)的多肽链。在一些实施方案中，Fc结构域单体还包括铰链结构域。在一些实施方案中，Fc结构域单体具有任何免疫球蛋白抗体同种型，包括IgG、IgE、IgM、IgA和IgD。另外，在一些实施方案中，Fc结构域单体具有任何IgG亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3和IgG4)。在一些实施方案中，Fc结构域单体包含改变Fc结构域与Fc受体之间的相互作用的自野生型Fc结构域单体序列的多达十种变化(例如，1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸取代、添加或插入、缺失或其组合)。
在一些实施方案中，免疫球蛋白的Fc结构域单体或Fc结构域单体的片段能够与另一种Fc结构域单体形成Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白的Fc结构域单体或Fc结构域单体的片段不能够与另一种Fc结构域单体形成Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域单体或Fc结构域的片段与本公开的多肽融合以增加多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，与本公开的多肽融合的Fc结构域单体或Fc结构域单体的片段与第二Fc结构域单体二聚化以形成结合Fc受体的Fc结构域，或者，Fc结构域单体结合Fc受体。在一些实施方案中，与多肽融合以增加多肽的血清半衰期的Fc结构域或Fc结构域的片段不会诱导任何免疫系统相关应答。Fc结构域包含两个Fc结构域单体，所述单体通过CH3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化。
野生型Fc结构域形成结合Fc受体的最小结构，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb和FcγRIV。在一些实施方案中，本公开的抗体中的Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代、添加或插入、缺失或其任何组合，它们导致降低的效应功能，诸如降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、减少的补体依赖性细胞裂解(CDC)、减少的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，或其任何组合。例如，本公开的抗体可以表现出减少的与人Fc受体的结合(例如，结合最小或不存在结合)和减少的与补体蛋白C1q的结合(例如，结合最小或不存在结合)；减少的与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIB、FcγRIIIB或其任何组合，以及与C1q的结合(例如，结合最小或不存在结合)；改变或降低的抗体依赖性效应功能，诸如ADCC、CDC、ADCP或其任何组合；等等。示例性突变包括但不限于在E233、L234、L235、G236、G237、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331或P329(根据Kabat的EU指数编号)处的一个或多个氨基酸取代(Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。
在一些实施方案中，本公开的抗体具有降低或消除的与CD16a、CD32a、CD32b、CD32c和CD64 Fcγ受体的结合。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体相比，具有本文所述的非天然Fc区的抗体表现出C1q结合的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体相比，具有如本文所述的非天然Fc区的抗体表现出CDC的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。
在一些实施方案中，本文的Fc变体相对于野生型序列具有最小的糖基化或具有降低的糖基化。在一些实施方案中，通过突变N297A或通过将N297突变为任何非N的氨基酸来完成去糖基化。
在一些实施方案中，抗体IgG恒定区的变体(例如Fc变体)具有降低的特异性结合Fcγ受体的能力或具有降低的诱导吞噬作用的能力。在一些实施方案中，抗体IgG恒定区的变体(例如Fc变体)具有降低的特异性结合Fcγ受体的能力并且具有降低的诱导吞噬作用的能力。例如，在一些实施方案中，Fc结构域被突变以缺乏效应功能，典型地为“失效的(dead)”Fc结构域。例如，在一些实施方案中，Fc结构域包含已知使Fc结构域与Fcγ受体之间的相互作用最小化的特定氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG1抗体，并且包含氨基酸取代L234A、L235A、G237A和N297A(氨基酸位置编号如依据Kabat等人,1991根据EU编号系统命名的)中的一种或多种。在一些实施方案中，一个或多个另外的突变包含在这种IgG1 Fc变体中。人IgG1 Fc变体的此类另外突变的非限制性实例包括E318A和K322A。在一些情况下，与野生型人IgG1序列相比，人IgG1 Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5或4个或更少的突变。在一些实施方案中，一个或多个另外的缺失包含在这种IgG1 Fc变体中。例如，在一些实施方案中，Fc IgG1重链恒定区的C末端赖氨酸缺失，例如以当在细菌或哺乳动物细胞中产生多肽时增加多肽的同质性。在一些情况下，与野生型人IgG1序列相比，人IgG1 Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5或4个或更少的缺失。
在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG2抗体并且包含氨基酸取代A330S、P331S或A330S和P331S两者。上述氨基酸位置根据Kabat等人(1991)定义。可以通过将抗体序列的同源性区与“标准”Kabat编号序列比对来确定给定抗体中氨基酸残基的Kabat编号。在一些实施方案中，Fc变体包含人IgG2 Fc序列，其包含A330S、P331S和N297A氨基酸取代(氨基酸位置编号如依据Kabat等人(1991)根据EU编号系统命名的中的一种或多种。在一些实施方案中，一个或多个另外的突变包含在此类IgG2 Fc变体中。对于人IgG2 Fc变体的此类另外突变的非限制性实例包括V234A、G237A、P238S、V309L和H268A(如依据Kabat等人(1991)根据EU编号系统命名的)。在一些情况下，与野生型人IgG2序列相比，人IgG2 Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5、4、3个或更少的突变。在一些实施方案中，一个或多个另外的缺失包含在这种IgG2 Fc变体中。
当Fc变体为IgG4 Fc变体时，在一些实施方案中，这种Fc变体包含S228P、E233P、F234V、L235A、L235E或delG236突变(氨基酸位置编号如根据Kabat等人(1991)命名的)。在一些情况下，与野生型人IgG4序列相比，人IgG4 Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变。
在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出降低的与受试者的Fc受体的结合。在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出消除的与受试者的Fc受体的结合。在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出降低的吞噬作用。在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出消除的吞噬作用。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(在本文中也称为ADCC)是指一种形式的细胞毒性，其中结合于存在于某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并且随后杀死靶细胞。抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(在本文中也称为ADCP)是指一种形式的细胞毒性，其中结合于存在于某些吞噬细胞(例如巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些吞噬效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并且随后吞没并消化靶细胞。针对靶细胞表面的配体特异性高亲和力IgG抗体可以刺激细胞毒性或吞噬细胞并且可用于这种杀伤。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出降低的ADCC或ADCP。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的ADCC或ADCP降低。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的抗体表现出消除的ADCC或ADCP。
补体导向性细胞毒性(在本文中也称为CDC)是指一种形式的细胞毒性，其中补体级联通过补体组分C1q与抗体Fc的结合而激活。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的C1q结合降低。在一些情况下，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出降低的CDC。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的CDC降低。在一些情况下，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的抗体表现出可忽略的CDC。
与野生型人IgG Fc区相比，本文的Fc变体包括表现出降低的与Fcγ的结合的那些。例如，在一些实施方案中，Fc变体表现出的与Fcγ受体的结合小于由野生型人IgG Fc区表现出的与Fcγ受体的结合。在一些情况下，Fc变体与Fcγ受体的结合降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全消除的效应功能)的系数。在一些实施方案中，降低的结合是针对任何一种或多种Fcγ受体，例如CD16a、CD32a、CD32b、CD32c或CD64。
在一些情况下，与其野生型人IgG Fc区相比，本文所公开的Fc变体表现出降低的吞噬作用。与其野生型人IgG Fc区相比，此类Fc变体表现出吞噬作用的降低，其中吞噬作用活性的降低例如为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的系数。在一些情况下，与其野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出消除的吞噬作用。
在一些实施方案中，本公开的抗体缀合至剂。在一些实施方案中，所述剂是细胞毒性剂，包括但不限于本文所述的示例性细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述剂是标记，包括但不限于本文所述的示例性标记。
在一些实施方案中，所述剂是调节免疫系统的部分。例如，所述部分可以靶向和/或调节在其表面上表达SIRP-α的细胞的功能，诸如调节表达SIRP-α的细胞的细胞信号传导途径的小分子，例如IDO/TDO抑制剂、AhR抑制剂、精氨酸酶抑制剂、A2a R抑制剂、TLR激动剂、STING激动剂或Rig-1激动剂。在一些实施方案中，所述部分可以将另一大分子或细胞募集成与在其表面上表达SIRP-α的细胞接近。在一些实施方案中，所述部分包括细胞因子(例如，IL2、IL7、IL-10、IL15或IFN)。在一些实施方案中，所述部分(例如，小分子)调节细胞因子(例如，IL2、IL7、IL-10、IL15或IFN)的活性。在一些实施方案中，所述部分包括癌症疫苗(包含例如DNA、RNA、肽或其他细胞组分)。在一些实施方案中，所述部分包括佐剂。在一些实施方案中，所述部分包括CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，所述部分影响抗体纯化、筛选和/或展示。在一些实施方案中，所述部分还影响与Fc受体的结合程度或吞噬作用降低的程度。
在一些实施方案中，融合配偶体通过接头序列与Fc变体序列连接。在一些实施方案中，接头序列通常包含少量氨基酸，诸如小于10个氨基酸，但也使用更长的接头。在一些情况下，接头的长度小于10、9、8、7、6或5个氨基酸或更短。在一些情况下，接头的长度为至少10、11、12、13、14、15、20、25、30或35个氨基酸或更长。任选地，在一些实施方案中，采用可裂解的接头。
在一些实施方案中，融合配偶体是将Fc变体蛋白和任何相关融合配偶体引导至期望的细胞位置或细胞外介质的靶向或信号序列。在一些实施方案中，某些信号传导序列靶向泌到生长培养基中，或分泌到位于细胞内膜和外膜之间的周质空间中的蛋白质。在一些实施方案中，融合配偶体是编码能够纯化或筛选的肽或蛋白质的序列。此类融合配偶体包括但不限于多组氨酸标签(His标签)(例如His6和His10)或用于固定化金属亲和色谱(IMAC)系统(例如，Ni+2亲和柱)的其他标签、GST融合物、MBP融合物、Strep标签、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列，以及抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签等)。
在一些实施方案中，此类标签可用于纯化、筛选或两者。例如，在一些实施方案中，使用His标签通过将其固定至Ni+2亲和柱来纯化Fc变体，并且然后在纯化后使用相同的His标签将抗体固定至Ni+2包被的板以进行ELISA或其他结合测定。
可以获得能够实现多种选择方法的各种融合配偶体。例如，通过将Fc变体文库的成员与基因III蛋白融合，可以采用噬菌体展示。在一些实施方案中，融合配偶体使得Fc变体能够被标记。可替代地，在一些实施方案中，融合配偶体结合表达载体上的特定序列，使得融合配偶体和相关Fc变体能够与编码它们的核酸共价或非共价连接。
在一些实施方案中，当融合配偶体为治疗性部分时，治疗性部分为例如细胞毒性剂、肽、蛋白质、抗体、siRNA或小分子。
在一些实施方案中，本公开的抗体与各种载剂或标记结合并用于检测特异性抗原表达细胞的存在。载剂的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。载剂的性质可以是可溶的或不可溶的。各种不同的标签和标记方法是已知的。标记的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。可以获得用于将标记结合至本文所公开的抗体的各种技术。在一些实施方案中，抗体与低分子量半抗原偶联。然后通过第二反应特异性地检测这些半抗原。例如，在一些实施方案中，将半抗原生物素与抗生物素蛋白一起使用或者将半抗原二硝基苯酚、吡哆醛或荧光素用特异性抗半抗原抗体(例如，分别地抗二硝基酚抗体、抗吡哆醛抗体和抗荧光素抗体)检测。在一些实施方案中，本文所述的抗体在体外用于结合测定，诸如免疫测定。例如，在一些实施方案中，抗体以液相使用或与固相载剂结合。在一些实施方案中，用于免疫测定的抗体以各种方式可检测地标记。
治疗方法
本公开的某些方面涉及使用本文所述的抗体治疗疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病为癌症。在一些实施方案中，所述疾病为自身免疫疾病或炎性疾病。
例如，本文提供了通过施用有效量的本公开的抗体治疗个体的癌症或延迟个体的癌症的进展的方法。不希望受理论的束缚，据认为本文所述的抗体可用于治疗癌症，例如通过消除癌症的通过CD47:SIRP-α信号轴抑制吞噬作用和免疫监视的能力，或通过其他方式增强免疫系统的激活(诸如通过激活树突状细胞)。
在一些实施方案中，将本公开的抗体与第二抗体，例如结合由癌症表达的抗原的抗体(例如，有效量的第二抗体，其在如上所述的一些实施方案中可以在施用本公开的抗SIRP-α抗体的背景下考虑)组合施用。示例性的由癌症表达的抗原在本领域中是已知的并且包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘蛋白1、粘蛋白16、PTK7、PD-L1、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、粘连蛋白4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自以下的肽的MHC/肽复合物：NY-ESO-1/LAGE、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、存活素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPVE7。例如，在一些实施方案中，将本公开的抗体与结合CD123(也称为IL-3受体α)的单克隆抗体，诸如talacotuzumab(也称为CSL362和JNJ-56022473)组合施用。在一些实施方案中，将本公开的抗体与结合EGFR的单克隆抗体(诸如西妥昔单抗)组合施用。在一些实施方案中，第二抗体包括一种或多种效应功能，例如与免疫细胞上的Fc受体(FcR)接合相关的效应功能，包括但不限于ADCC或ADCP和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。不希望受理论的束缚，据认为将这种抗体与本公开的抗体组合是特别有利的，例如对于指导表达FcR的白细胞靶向与第二抗体结合的肿瘤细胞，同时也通过SIRP-α抗体抑制由白细胞表达的SIRP-α对由肿瘤细胞表达的任何CD47的应答性是特别有利的。
在一些实施方案中，将本公开的抗体与结合由NK细胞表达的抗原的第二抗体组合施用。示例性的由NK细胞表达的抗原包括但不限于NKR-P1A(KLRB1)、CD94(NKG2A)、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94(NKG2C/E)、NKG2D、CD160(BY55)、CD16(FcγRIIIA)、NKp46(NCR1)、NKp30(NCR3)、NKp44(NCR2)、DNAM1(CD226)、CRTAM、CD27、NTB-A(SLAMF6)、PSGL1、CD96(触觉的)、CD100(SEMA4D)、NKp80(KLRF1、CLEC5C)、SLAMF7(CRACC、CS1、CD319)和CD244(2B4、SLAMF4)。
在一些实施方案中，将本公开的抗体与免疫治疗剂(例如，有效量的免疫治疗剂，其在如上所述的一些实施方案中可以在施用本公开的抗SIRP-α抗体的背景下考虑)组合施用。免疫治疗剂可以是指任何靶向免疫系统并促进免疫系统的治疗性重定向的治疗剂，诸如共刺激途径的调节剂、癌症疫苗、重组修饰的免疫细胞等。下文描述了示例性且非限制性的免疫治疗剂。不希望受理论的束缚，据认为本公开的抗体由于互补作用机制而适于例如在激活巨噬细胞和其他免疫细胞(诸如T效应细胞)以靶向肿瘤细胞方面与免疫治疗剂一起使用。
在一些实施方案中，免疫治疗剂包括抗体。免疫治疗性抗体的示例性抗原在本领域中是已知的并且包括但不限于BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-15、FGL-1、CD200、CD200R、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、精氨酸酶、IDO、TDO、AhR、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、TGF-βRI、TGF-βRII、c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、TNFR2、PVRIG、DNAM和ICOS。经批准或在晚期临床试验中的免疫治疗剂包括但不限于伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、尼沃鲁单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)等。在某些实施方案中，将本公开的抗体与PD-L1/PD-1途径的抑制剂，例如抗PD-L1或抗PD-1抗体组合施用。如本文所证明的，将本公开的抗SIRP-α抗体和PD-L1/PD-1途径的抑制剂的组合施用可以产生协同的抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，免疫治疗剂包括疫苗、溶瘤病毒、过继细胞疗法、细胞因子或小分子免疫治疗剂。此类免疫治疗剂的实例在本领域中是已知的。例如，过继细胞疗法和治疗剂可包括但不限于嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR工程改造的NK细胞、和巨噬细胞产品。疫苗可包括但不限于多核苷酸疫苗、多肽疫苗或基于细胞的(例如基于肿瘤或树突状细胞的)疫苗。已知可用于治疗癌症的多种细胞因子并且其包括但不限于IL-2、IL-15、IL-7、IL-10、IL-12、IL21、TNFa、IFN、GM-CSF和工程改造的细胞因子突变体。小分子免疫治疗剂可包括但不限于IDO/TDO抑制剂、AhR抑制剂、精氨酸酶抑制剂、A2a R抑制剂、TLR激动剂、STING激动剂和Rig-1激动剂。
在一些实施方案中，将本公开的抗体与化学治疗剂或小分子抗癌剂组合施用。在一些实施方案中，将本公开的抗体与免疫治疗剂和化学治疗剂或小分子抗癌剂组合施用。例如，据认为信号传导途径(例如，PAK4、PI3K等)的激酶抑制剂或其他抑制剂可与免疫系统的调节组合用于治疗癌症。因此，本公开的抗体可与一种或多种化学治疗剂和/或小分子(例如，激酶抑制剂)组合用于治疗癌症。下文提供了设想与本公开的抗体组合使用的化学治疗剂和/或抗癌剂的非限制性实例。
在一些实施方案中，将本公开的抗体与治疗剂(例如，化学治疗剂/细胞毒性剂)组合施用，所述治疗剂包括但不限于甲氨蝶呤(
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氨甲蝶呤)环磷酰胺
Figure BDA0002690047860000672
萨力多胺
Figure BDA0002690047860000673
吖啶甲酰胺、
Figure BDA0002690047860000674
放线菌素、17-N-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素、氨蝶呤、安吖啶、蒽环霉素、抗肿瘤药、抗肿瘤物质、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、BL22、苯达莫司汀、比立考达(biricodar)、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、bostatin、白消安、花萼海绵诱癌素、喜树碱、卡培他滨、卡铂、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、二氯乙酸、discode olide、多西他赛、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、艾日布林(eribulin)、雌莫司汀、依托泊苷、依喜替康(exatecan)、依昔舒林(exisulind)、铁锈醇、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、磷雌酚、福莫司汀(fotemustine)、更昔洛韦、吉西他滨、羟基脲、IT-101、伊达比星、异环磷酰胺、咪喹莫特、伊立替康、伊洛富芬、依沙匹隆、拉尼喹达(laniquidar)、拉帕替尼、来那度胺、洛莫司汀(lomustine)、勒托替康(lurtotecan)、马磷酰胺、马索罗酚(masoprocol)、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯嘌呤、丝裂霉素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、奈拉滨、尼罗替尼、奥利默森(oblimersen)、奥沙利铂(oxaliplatin)、PAC-1、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、哌泊溴烷、匹杉琼(pixantrone)、普卡霉素、丙卡巴嗪、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、雷替曲塞、蝴蝶霉素(rebeccamycin)、
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鲁比替康(rubitecan)、SN-38、salinosporamide A、赛特铂(satraplatin)、链脲霉素、苦马豆素、他立喹达(tariquidar)、紫杉烷、替加氟(tegafur)-尿嘧啶、替莫唑胺、睾内酯、噻替派、硫鸟嘌呤、拓扑替康、曲贝替定(tra-bectedin)、维甲酸、四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)、三(2-氯乙基)胺、曲沙他滨、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、伏立诺他(vorinostat)、唑喹达等。
在一些实施方案中，将本公开的抗体与靶向小分子抑制剂组合施用。例如，在一些实施方案中，本公开的抗体与以下抑制剂组合施用：VEGFR/PDGFR抑制剂(例如，索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、凡德他尼(vandetanib)、卡博替尼(cabozatinib)、阿帕替尼(apatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、阿昔替尼(axitinib)或瑞格拉非尼(regorafenib))、EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)或奥斯替尼(osimertinib))、MEK抑制剂(例如，曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、比尼替尼(binimetinib)或司美替尼(selumetinib))、ALK抑制剂(例如，克唑替尼(crizotinib)、色瑞替尼(ceritinib)、艾乐替尼(alectinib)、布加替尼(brigatinib)、劳拉替尼(lorlatinib)、恩曲替尼(entrectinib)、TSR-011、CEP-37440或X-396)、CDK4/6抑制剂(例如，帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)或阿贝西尼(abemaciclib))、PARP抑制剂(例如，奥拉帕尼(olaparib)、卢卡帕尼(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)、他拉唑帕尼(talazoparib)、帕米帕利(pamiparib)、维利帕尼(veliparib)、CEP 9722或E7016)、mTOR抑制剂、KRAS抑制剂、TRK抑制剂(例如，拉罗替尼(larotrectinib))、BCL2抑制剂(例如，维奈托克(venetoclax))、IDH抑制剂(例如，艾伏尼布(ivosidenib)或伊那尼布(enasidenib))、低甲基化剂(例如，地西他滨或阿扎胞苷)、PI3K抑制剂或DDR(例如，CHK、ATM或ATR)抑制剂。
在一些实施方案中，本公开的抗体与治疗剂组合施用，所述治疗剂包括但不限于3F8、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿比妥珠单抗(Abituzumab)、阿利鲁单抗(Abrilumab)、阿克托舒单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿杜那单抗(Aducanumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)、培阿珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)、麻安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、阿奈妥单抗-拉夫坦辛(Anetumabravtansine)、阿尼福鲁单抗(Anifrolumab)、安卢珠单抗(kinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿斯万卡单抗(Ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿替奴单抗(Atinumab)、阿利珠单抗(Atlizumab)(托珠单抗(tocilizumab))、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴韦妥昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝戈洛单抗(Begelomab)、贝利木单抗(Belimumab)、贝那珠单抗(Benralizumab)、伯替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝兹罗图单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比麦芦单抗(Bimagrumab)、比美吉珠单抗(Bimekizumab)、比伐单抗-默坦辛(Bivatuzumabmertansine)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、布索珠单抗(Blosozumab)、伯考赛珠单抗(Bococizumab)、布妥昔单抗-维多汀(Brentuximab vedotin)、布雷奴单抗(Briakinumab)、布达鲁单抗(Brodalumab)、布罗鲁珠单抗(Brolucizumab)、布隆妥珠单抗(Brontictuzumab)、卡那单抗(Canaki-numab)、美坎珠单抗-默坦辛(Cantuzumabmertansine)、坎妥珠单抗-拉夫坦辛(Cantuzumab ravtansine)、卡普拉西珠单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗-喷地肽(Capromab pendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-多柔比星免疫缀合物、CC49、西利珠单抗(Cedelizumab)、培赛托珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗、Ch.14.18、泊西他妥珠单抗(Citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克拉扎珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、泰坦-可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)、考曲妥珠单抗(Codrituzumab)、考妥昔单抗-拉夫坦辛(Coltuximab ravtansine)、可那妥木单抗(Conatumumab)、康赛珠单抗(Concizumab)、克瑞奈珠单抗(Crenezumab)、CR6261、达西妥珠单抗(Dacetuzumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、达洛妥珠单抗(Dalotuzumab)、培达皮罗珠单抗(Dapi-rolizumab pegol)、达雷妥木单抗(Daratumumab)、德屈库单抗(Dectrekumab)、德美西珠单抗(Demcizumab)、玛汀-地宁妥珠单抗(Denintuzumab mafodotin)、地诺单抗(Denosumab)、地罗西单抗(Derlotuximab)生物素、地莫单抗、地努图希单抗(Dinutuximab)、地瑞伏单抗(Diridavumab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、卓齐妥单抗(Drozitumab)、度利戈妥单抗(Duligotumab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、杜斯吉妥单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依芬古单抗(Engumab)、依德鲁单抗(Eldelumab)、依格珠单抗(Elgemtumab)、依洛妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、依麻特珠单抗(Emactuzumab)、依米特珠单抗(Emibetuzumab)、依纳伐妥珠单抗(Enavatuzumab)、恩弗妥单抗-维多汀-(Enfortumab vedotin)、培恩莫单抗(Enlimomab pegol)、依诺妥珠单抗(Enoblituzumab)、依诺珠单抗(Enokizumab)、依诺替库单抗(Enoticumab)、恩西妥昔西单抗(Ensituximab)、西依匹妥莫单抗(Epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(Epratu-zumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、埃达珠单抗(Etaracizumab)、依托珠单抗(Etrolizumab)、依维苏单抗(Evinacumab)、依伏罗库单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法勒珠单抗(Farletuzumab)、法西奴单抗(Fasinumab)、FBTA05、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、非利伏单抗(Firivumab)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)、夫来库单抗(Fletikumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、佛拉鲁单抗(Foralumab)、佛拉韦芦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、弗拉奴单抗(Fulranumab)、弗妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、甘尼妥单抗(Ganitumab)、甘特芦单抗(Gantenerumab)、加韦莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗-奥佐米星(Gemtuzumabozogamicin)、吉沃珠单抗(Gevokizumab)、吉瑞妥昔单抗(Giren-tuximab)、格列姆巴妥木单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈米昔单抗(Gomiliximab)、谷瑟库单抗(Guselkumab)、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、替坦-伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、伊克芦库单抗(Icrucumab)、艾达赛珠单抗(Idarucizumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、伊玛鲁单抗(Imalumab)、英西单抗(Imciromab)、英加妥珠单抗(Imgatuzumab)、英克勒库单抗(Inclacumab)、英达妥昔单抗-拉夫坦辛(Indatuximabravtansine)、英杜斯妥单抗-维多汀(Indusatumab vedotin)、英夫利昔单抗(In iximab)、英特妥木单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊诺妥珠单抗-奥佐米星(Inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(Ipilimumab)、伊拉妥木单抗(Iratumumab)、伊撒西单抗(Isatuximab)、伊托珠单抗(Itolizumab)、伊克塞珠单抗(Ixekizumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)、兰波单抗(Lambrolizumab)、兰帕珠单抗(Lampalizumab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、仑兹鲁单抗(Lenzilumab)、乐地单抗(Lerdelimumab)、来沙妥木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、利法妥珠单抗-维多汀(Lifastuzumab vedotin)、利格珠单抗(Ligelizumab)、塞利洛托单抗(Lilotomab satetraxetan)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、利利单抗(Lirilumab)、罗戴西珠单抗(Lodelcizumab)、洛吉维单抗(Lokivetmab)、罗伏妥珠单抗-默坦辛(Lorvotuzumab mertansine)、鲁卡妥木单抗(Lucatumumab)、培鲁利珠单抗(Lulizumab pegol)、鲁米昔单抗(Lumiliximab)、鲁姆妥珠单抗(Lumretuzumab)、马帕妥木单抗(Mapatumumab)、马格西单抗(Margetuximab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马利木单抗(Mavrilimumab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、美特木单抗(Metelimumab)、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫加木珠单抗(Mogamulizumab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫他韦珠单抗(Motavizumab)、莫西妥莫单抗-假单胞菌外毒素(Moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗(Muromonab)-CD3、他那可单抗(Nacolomab tafenatox)、那米鲁单抗(Namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomab estafenatox)、纳那妥单抗(Namatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈昔妥木单抗(Necitumumab)、奈莫利珠单抗(Nemolizumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、耐斯伐库单抗(Nesvacumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗(Nofetumomab meentan)、奥托萨昔单抗(Obiltoxaximab)、奥卡拉妥珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法妥木单抗(Ofatumumab)、奥拉妥单抗(Olaratumab)、奥洛珠单抗(Olokizumab)、奥马佐单抗(Omalizumab)、奥纳妥珠单抗(Onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(Ontuxizumab)、奥匹努单抗(Opicinumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥替库单抗(Orticumab)、奥特利昔珠单抗(Otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(Otlertuzumab)、奥昔鲁单抗(Oxelumab)、奥扎尼珠单抗(Ozanezumab)、奥左拉珠单抗(Ozoralizumab)、帕吉巴昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕尼库单抗(Pankomab)、帕诺巴库单抗(Panobacumab)、巴萨妥珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕妥昔珠单抗(Pasotuxizumab)、帕特克珠单抗(Pateclizumab)、帕曲妥单抗(Patritumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、培妥莫单抗(Pemtumomab)、培拉珠单抗(Perakizumab)、培妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、皮地珠单抗(Pidilizumab)、皮那妥珠单抗-维多汀(Pinatuzumabvedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉库鲁单抗(Placulumab)、泊拉妥珠单抗-维多汀(Polatuzumab vedotin)、泊尼珠单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、普立托昔单抗(Pritoxaximab)、普立妥木单抗(Pritumumab)、PRO 140、奎利珠单抗(Quilizumab)、雷妥莫单抗(Racotumomab)、雷得妥单抗(Radretumab)、雷韦卢单抗(Ravirumab)、雷泮赛珠单抗(Ralpancizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷西库单抗(Raxibacumab)、瑞法奈珠单抗(Refanezumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利努苏单抗(Rinucumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗度单抗(Roledumab)、罗莫索珠单抗(Romosozumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利单抗(Ruplizumab)、沙马珠单抗(Samalizumab)、沙里鲁单抗(Sarilumab)、沙妥莫单抗-喷地肽(Satumomab pendetide)、司库奴单抗(Secukinumab)、司里班妥单抗(Seribantumab)、司托昔抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西法木单抗(Sifalimumab)、西妥昔单抗(Siltuximab)、西妥珠单抗(Simtuzumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、西芦库单抗(Sirukumab)、索妥珠单抗-维多汀(Sotuzumabvedotin)、索兰珠单抗(Solanezumab)、索利托单抗(Solitomab)、索耐珠单抗(Sonepcizumab)、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他木鲁单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、苏韦珠单抗(Suvizumab)、他巴鲁单抗(Tabalumab)、泰坦-他卡妥珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、他瑞妥单抗(Tarextumab)、替非珠单抗(Te bazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、特那妥莫单抗(Tenatumomab)、特奈利昔单抗(Teneliximab)、特普利珠单抗(Teplizumab)、特普妥木单抗(Teprotumumab)、特斯多鲁单抗(Tesidolumab)、TGN1412、替昔木单抗(Ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替拉珠单抗(Tildrakizumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、TNX650、托珠单抗(Tocilizumab)(阿利珠(atlizumab))、托拉珠单抗(Toralizumab)、托萨托舒单抗(Tosatoxumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、托维妥单抗(Tovetumab)、特拉罗奴单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、TRBS07、曲加珠单抗(Tregalizumab)、曲美木单抗、妥可妥珠单抗-西莫白介素(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、优利妥昔单抗(Ublituximab)、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、优瑞鲁单抗(Urelumab)、优托珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、万多妥珠单抗-维多汀(Vandortuzumabvedotin)、万替妥单抗(Vantictumab)、伐努赛珠单抗(Vanucizumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、伐立鲁单抗(Varlilumab)、伐特珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维森库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、马汀-伏司妥珠单抗(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥莫单抗(Votumumab)、扎鲁妥木单抗(Zalutumumab)、扎诺木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)或阿左莫单抗(Zolimomab aritox)。
设想了组合治疗，所述组合治疗包括本公开的抗体和多种另外的剂(例如，如上所述)。例如，在一些实施方案中，将本公开的抗体与化学治疗剂/细胞毒性剂和抗体或靶向小分子抑制剂组合施用。在一些实施方案中，将本公开的抗体与化学治疗剂/细胞毒性剂和免疫治疗剂组合施用。在一些实施方案中，将本公开的抗体与抗体或靶向小分子抑制剂和免疫治疗剂组合施用。
可以包括本领域中已知的任何癌症类型，诸如但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、淋巴瘤和胚细胞瘤。此类癌症的更具体的实例包括但不限于肺癌、鳞状细胞癌、脑肿瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、结肠直肠癌(例如结肠癌或直肠癌)、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、泌尿道癌、乳腺癌、腹膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性髓性白血病(AML)；梅克尔细胞癌；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病(CML)；和相关的转移。
除了癌症疗法之外，本文提供的抗体可用于其中施用单克隆抗体以消耗细胞的疗法中，例如可用于通过消耗免疫细胞治疗炎性疾病。为此目的，将本文提供的抗体与第二治疗性抗体，例如与用于消耗炎性疾病和自身免疫疾病中的B细胞的利妥昔单抗；用于多发性硬化症的阿仑珠单抗；用于免疫抑制的OKT3；用于骨髓移植调理的其他抗体等组合使用。
本文进一步提供了通过施用有效量的本公开的抗体治疗个体的自身免疫疾病或炎性疾病或延迟个体的自身免疫疾病或炎性疾病的进展的方法。适于根据本公开治疗的自身免疫疾病或炎性疾病包括但不限于多发性硬化症、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎性或自身免疫疾病、移植物抗宿主病、败血症、糖尿病、牛皮癣、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠状动脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、子宫内膜异位症、肾小球肾炎、重症肌无力、特发性肺纤维化、纤维化疾病(例如，肺纤维化、肝硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化或腹膜后纤维化)、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管炎和炎性自身免疫性肌炎。在一些实施方案中，本公开的抗体与治疗剂，诸如免疫抑制剂、抗炎剂或免疫调节剂组合施用。在一些实施方案中，本文提供的抗体用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎性或自身免疫疾病、移植物抗宿主病、败血症、糖尿病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠状动脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、子宫内膜异位症、肾小球肾炎、IgA肾病、多囊性肾病、重症肌无力、特发性肺纤维化、纤维化疾病(例如，肺纤维化、肝硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化或腹膜后纤维化)、哮喘、特应性皮炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管炎或炎性自身免疫性肌炎。
在一些实施方案中，本公开的抗体是药物制剂的一部分，例如所述药物制剂包含抗体和一种或多种药学上可接受的载剂。如本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(诸如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合以冻干制剂或水溶液形式来制备。药学上可接受的载剂通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，本公开的抗体是冻干的。
在一些实施方案中，向个体施用标准化至个体的体重的剂量。在一些实施方案中，向个体施用以下剂量：约10μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约300μg/kg、约400μg/kg、约500μg/kg、约600μg/kg、约700μg/kg、约800μg/kg、约900μg/kg、约1,000μg/kg、约1,100μg/kg、1,200μg/kg、1,300μg/kg、1,400μg/kg、1,500μg/kg、1,600μg/kg、1,700μg/kg、1,800μg/kg、1,900μg/kg、约2,000μg/kg、约3000μg/kg、约4000μg/kg、约5000μg/kg、约6000μg/kg、约7000μg/kg、约8000μg/kg、约9000μg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg约90mg/kg、约100mg/kg、约200mg/kg、约300mg/kg、约400mg/kg、约500mg/kg、约600mg/kg、约700mg/kg、约800mg/kg、约900mg/kg或约1000mg/kg的本公开的抗体。
在一些实施方案中，将本公开的抗体施用至个体的时间段是如由疾病的阶段、患者的病史和主治医生的判断决定的任何合适的时段。此类合适的时段的实例包括但不限于至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月或更长。在特定方面，如果需要，治疗期持续长于24个月，诸如持续30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月、36个月或长于36个月。在一些实施方案中，时段为6个月、1年或2年。在另一个实施方案中，本文所述的任何方法的给药时间段持续至少约2周、至少约4周、至少约8周、至少约16周、至少约17周、至少约18周、至少约19周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约60周、至少约68周、至少约72周、至少约80周、至少约88周、至少约96周或至少约104周。
实施例
通过参考以下实施例将更完全地理解本公开。然而，所述实施例不应视为限制本发明的范围。应理解本文所描述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且将建议本领域技术人员根据它们进行各种修改或变化，并且它们被包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范围之内。
实施例1:对具有针对SIRP-α蛋白的新结合特异性的抗体的鉴定
方法
抗体产生
将以下蛋白质用于免疫。每种蛋白质包含与修饰的Fc区(具有含有S228P突变的铰链区的人IgG4 Fc，或命名为IgG1_AAA_N297A的L234A/L235A/G237A/N297A人IgG1 Fc)融合以用于增强免疫原性的人或小鼠SIRP-α肽。
表A.免疫原序列。
Figure BDA0002690047860000751
Figure BDA0002690047860000761
将上述蛋白质用于免疫野生型鸡、为含有来自人的VH和来自鸡的VL的转基因鸡的SynVH鸡，或具有完全人“HuMAB”免疫球蛋白基因座的鸡(Crystal Bioscience；参见，例如，WO2012162422、WO2011019844和WO2013059159)。用具有交替剂量的抗原的不同方案免疫鸡。示例性免疫方案如下：在第1周用100μg剂量的具有SEQ ID NO:1序列的抗原进行初始免疫，在第3周用100μg具有SEQ ID NO:2序列的抗原加强免疫，在第4周抽取(draw)，在第5周用50μg剂量的具有SEQ ID NO:1序列的抗原加强免疫，在第6周抽取，在第7周用50μg具有SEQ ID NO:2序列的抗原加强免疫，并且在第8周抽取。鸡免疫的另外描述可以见于例如Mettler Izquierdo,S.等人(2016)Microscopy(Oxf)1-16中。
与哺乳动物SIRP-α序列相比，发现鸡SIPRα的序列明显更加趋异。不希望受理论的束缚，据认为哺乳动物与鸡SIRP-α序列之间的趋异性将提供产生跨多种哺乳动物SIRP-α蛋白交叉反应的抗体的独特机会。例如，由于免疫耐受性，可能难以产生与来自小鼠宿主的鼠类序列交叉反应的抗SIRP-α抗体。此外，鸡与哺乳动物免疫系统之间的较大趋异性可能导致抗体产生的更大多样性。
不希望受理论的束缚，据认为在人、食蟹猴和/或鼠类蛋白中具有交叉反应性结合的抗体可以允许在动物模型和临床测试中表征抗体。具有同种型和/或变体特异性结合的抗体可用于针对特定人类群体的个性化医学方法和/或对特定所关注变体的研究。
Koff的测定
使用补充有0.01％吐温20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)作为运行缓冲液，在ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad,Hercules,CA)上使用表面等离振子共振(SPR)检测来测定抗体克隆与各种SIRP蛋白的结合。将含有分泌的抗体的预过滤的培养基直接用于测定。首先，将抗人IgG Fc(BR-1008-39，GE Healthcare)胺偶联到GLC传感器芯片上以产生用于抗体的捕获表面。实现固定化抗人IgG Fc的约4000RU/流动池(flow cell)。使用与以下相同的方法筛选每个克隆。用于筛选的SIRP分析物是来多种物种(人v1、人v2、食蟹猴、小鼠129、BL6、BALBc、NOD)的SIRP-α、人SIRP-β和人SIRP-γ；分别为SEQ ID NO:5、6、11、7、9、10、8、13和15。
将约5-10uL的在10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的预过滤培养基以30ul/min注射2分钟，然后使缓冲液以100uL/min流动1分钟。将SIRP分析物(100nM)以100uL/min注射1分钟，然后进行10分钟的解离循环。通过在两个方向上以25uL/min使3M氯化镁流动1分钟来完成芯片表面的再生，然后使缓冲液以100uL/min流动1分钟。通过从反应点数据(固定的抗人IgG Fc)中减去点间数据(不含固定的抗人IgG Fc)，并且然后从分析物注射的响应中减去缓冲液“空白”分析物注射的响应来双重参考生物传感器数据。使用计算的1:1Langmuir和Koff(1/S)值拟合结合。所有SPR测定均在25℃下进行。
KD的测定
根据以下方案使用两种方法，即抗体的直接固定(通过GLC芯片)或通过生物素化的蛋白A捕获(通过NLC芯片)分析抗SIRPα抗体与来自多种物种(人v1、人v2、食蟹猴、小鼠129、BL6、BALBc、NOD)的SIPRα、SIRPβ和SIRPγ的相互作用。所有实验均在25℃下使用配备有GLC或NLC传感器芯片的基于SPR的ProteOn XPR36生物传感器(BioRad,Inc,Hercules,CA)进行。使用FreeStyleTM 293-FS细胞(Thermo Fisher)表达抗体。通过标准蛋白A亲和柱色谱法进行纯化，并且将洗脱的抗体储存在PBS缓冲液中。
运行缓冲液为具有0.01％吐温20(PBST+)的PBS(pH 7.4)。将所有分析物均以其标称浓度使用，所述标称浓度如通过A280吸光度和使用其摩尔计算的消光系数所确定。如在别处所述，以“一步法(one-shot)”动力学模式注入分析物(参见例如，Bravman,T.等人(2006)Anal.Biochem.358:281-288)。
对于使用GLC芯片的方法，将分析物注入并使其流过使用Proteon胺偶联试剂盒固定(约1000RU)在GLC芯片上的抗SIRPα抗体。对于固定步骤，用1/100稀释的EDAC/Sulpho-NHS 1:1(Biorad)以25μL/min激活GLC芯片300s。将抗SIRPα抗体在pH 4.5的10mM乙酸钠缓冲液中稀释至80nM浓度，并且以30μL/min固定至芯片，持续50s。用乙醇胺以25μL/min灭活芯片300s。将分析物(例如，来自不同物种的SIRP-α、SIRP-β、SIRP-γ)以标称浓度100、33、11、3.7、1.2和0nM在“一步法”动力学模式中注入。以100μL/min监测缔合时间持续90s，并监测解离时间持续1200s。用Pierce IgG洗脱缓冲液/4M NaCl的2:1v/v共混物再生表面。
可替代地，使用通过NLC芯片的抗体捕获进行KD测定。在这种情况下，将15ug/mL生物素化的蛋白A(Thermofisher)以30uL/min在NLC芯片上注入120s，以获得约1000-1200RU的固定化响应。接下来，将抗SIRPα抗体(约160nM)以30uL/min注入80s。随后将分析物(来自不同物种的SIRPα、SIRP-β和SIPR-γ)以标称浓度100、33、11、3.7、1.2和0nM在“一步法”动力学模式注入。以25μL/min监测缔合时间持续60s，并监测解离时间持续120s。用PierceIgG洗脱缓冲液/4M NaCl的2:1v/v共混物再生表面。
通过从反应点数据(固定的蛋白)中减去点间数据(不含固定的蛋白)，并且然后从分析物注射的响应中减去缓冲液“空白”分析物注射的响应来双重参考生物传感器数据。将双参考数据全局拟合至简单的Langmuir模型，并且KD值由表观动力学速率常数的比率计算(KD＝kd/ka)。
结果
测定了各种抗体克隆与选择的小鼠SIRP-α蛋白的结合动力学。测试的小鼠蛋白包括BALBc(SEQ ID NO:10)、BL6(SEQ ID NO:9)、NOD(SEQ ID NO：8)和m129(SEQ ID NO：7)SIRP-α蛋白。结果汇总在下表B-E中。AB21和AB25的可变结构域序列示出在表J1中。
如本文所用，抗体克隆由克隆ID号表示。此外，记号“S[克隆号]”是指sc-Fv-Fc形式；记号“AB[克隆号]”是指完全IgG抗体形式；记号“AB[克隆号]b”是指小鼠IgG1 N297A形式；并且“AB[克隆号]c”是指小鼠IgG2a形式。
表B.选择的抗体与BALBc小鼠SIRP-α蛋白(SEQ ID NO：10)结合的动力学汇总
抗体 K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
AB21c 4.62x10<sup>5</sup> 6.18x10<sup>-4</sup> 1.34x10<sup>-9</sup>
AB25c 3.03x10<sup>5</sup> 2.92x10<sup>-3</sup> 9.64x10<sup>-9</sup>
表C.选择的抗体与BL6小鼠SIRP-α蛋白(SEQ ID NO：9)结合的动力学汇总
抗体 K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
AB21c 2.76x10<sup>5</sup> 2.41x10<sup>-4</sup> 8.76x10<sup>-10</sup>
AB25c 1.42x10<sup>5</sup> 3.99x10<sup>-4</sup> 2.81x10<sup>-9</sup>
表D.选择的抗体与NOD小鼠SIRP-α蛋白(SEQ ID NO：8)结合的动力学汇总
抗体 K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
AB21c 7.49x10<sup>5</sup> 4.79x10<sup>-4</sup> 6.40x10<sup>-10</sup>
AB25c 3.66x10<sup>5</sup> 1.43x10<sup>-3</sup> 3.90x10<sup>-9</sup>
表E.选择的抗体与m129小鼠SIRP-α蛋白(SEQ ID NO：7)结合的动力学汇总
抗体 K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
AB21c 5.63x10<sup>5</sup> 3.31x10<sup>-5</sup> 5.88x10<sup>-11</sup>
AB25c 3.52x10<sup>5</sup> 2.07x10<sup>-5</sup> 5.87x10<sup>-11</sup>
这些结果证明AB21和AB25抗体克隆与所有四种小鼠SIRP-α蛋白结合，使得这些抗体适于在体内小鼠模型中表征。
实施例2：抗SIRP-α抗体的功能特性
先前的实施例描述了对抗SIRP-α抗体的鉴定和表征。接下来在动物模型中检查这些抗体以探究SIRP-α对肿瘤生长的生物学影响。
如上所述，标记为“b”的抗体克隆作为具有N297A突变的全长小鼠IgG1抗体进行测试。标记为“c”的抗体克隆作为全长小鼠IgG2a抗体进行测试。
方法
体内抗肿瘤活性
对于MC38同系小鼠结肠癌模型，将MC38细胞皮下植入C57BL/6小鼠中并且随机分组(8-10只小鼠/组)。治疗组包括媒介物(PBS)、AB25b、AB25c和AB27b。除了具有小鼠IgG2a的AB25c，所有抗SIRPα抗体均具有携带N297A突变的小鼠IgG1 Fc区。植入后第7天肿瘤平均为60-65mm3时开始治疗。以10mg/kg每周两次向小鼠腹膜内(IP)给予抗SIRPα，持续三周。当肿瘤达到约2000mm3的体积时，处死动物。
结果
在同系小鼠结肠癌模型中测定各种抗SIRP-α抗体的体内抗肿瘤作用。在MC38同系小鼠结肠癌模型中检查阻断性抗SIRP-α抗体AB25b、AB25c和AB27b的抗肿瘤活性，以评估它们的单一剂活性。在MC38同系小鼠模型中，与单独的媒介物相比，阻断性抗SIRP-α抗体AB25b、AB25c和AB27b在10mg/kg下均延迟肿瘤形成(图1)。在第25天，用抗SIRPα抗体治疗的组对于AB25b具有三只低于600mm3的小鼠，对于AB25c具有四只低于600mm3的小鼠，并且对于AB27b具有3只低于600mm3的小鼠，而媒介物治疗组仅具有两只低于600mm3的小鼠。
这些结果证明了抗SIRP-α抗体治疗抑制体内肿瘤生长的功效。发现阻断性抗SIRP-α抗体阻断体内肿瘤生长。
实施例3：抗SIRP-α抗体的人源化
上述实施例描述了具有完全人重链和鸡轻链的抗SIRP-α抗体的产生和表征。为了使来源于鸡的轻链人源化，将这些抗体的鸡HVR移植到各种人λ轻链框架上。
方法
人源化
使用标准技术将抗体人源化。为了测量产率，通过蛋白A亲和色谱法纯化等体积的表达抗SIRPα抗体的Expi293培养物。在缓冲液更换为PBS后，通过A280测定蛋白质浓度并且以mg/mL表示。
结果
为了设计人源化轻链，通过IgBLAST(NCBI)将每个鸡轻链序列与最接近的人种系框架比对。使用该分析，与鸡λ轻链框架最接近的匹配为人IGLV3(参见SEQ ID NO：27-30)。
在另一种方法中，进行文献检索以确定用于与人VH3序列(用于这些抗体的人重链)配对的最佳人λ轻链框架序列。基于这些分析，认为人VH3与人IGLV1和IGLV2良好配对。参见Glanville，J.等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.106：20216-20221；Lloyd，C.等人(2009)Protein Eng.Des.Sel.22：159-168；和Jayaram，N.等人(2012)ProteinEng.Des.Sel.25：523-529。
因此，创建了六条人源化轻链：Hum1(AB25 HVR+人IGLV3框架；SEQ ID NO：25)、Hum2(AB25 HVR+人IGLV1框架)、Hum3(AB66 HVR+人IGLV3框架)、Hum4(AB66 HVR+人IGLV1框架)、Hum5(AB25 HVR+人IGLV2框架)，和Hum6(AB21 HVR+人IGLV1框架)。
将6条人源化轻链中的每一条与AB21重链配对。如上所述那样表达抗体。令人惊讶的是，人IGLV1框架序列导致抗体表达降低，而与重链无关。这是指与Hum2、Hum4和Hum6的重链配对。将结果作为“蛋白质产率”(第1行)汇总在图2中。相比之下，在轻链中具有人IGLV2和IGLV3框架(Hum1、Hum3、Hum5)的抗体显示出更高水平的表达。
还针对与多种SIRP蛋白(例如，与人SIRP-α v1(SEQ ID NO：5)、人SIRP-α v2(SEQID NO：6)、食蟹猴SIRP-α(SEQ ID NO：11)、小鼠BALB/c SIRP-α(SEQ ID NO：10)和人SIRP-γ(SEQ ID NO：15))的结合表征选择的抗体。这些数据也汇总在图2中。选择的人源化轻链导致与一种或多种抗原的结合降低。例如，发现人IGLV3框架(由Hum1和Hum3代表)允许更高水平的抗体产生而不扰乱结合亲和力。例如，具有IGLV3框架的轻链可变结构域和抗体25或抗体66HVR序列(分别由Hum1和Hum3表示)与AB21重链良好组合并且显示出与不同SIRP-α和SIRP-γ蛋白的类似结合。相比之下，当与AB21重链配对时，发现IGLV1和IGLV2框架(由Hum2、Hum4、Hum5和Hum6表示)降低表达和/或减少与SIRP的结合。下表L中提供了来自这些实验的另外结合数据。选择人IGLV3框架用于进一步测试。
基于Hum1 VL结构域产生另外的VL结构域Hum9和Hum8。与Hum1相比，Hum9在HVR-L1和-L2附近或其中含有4个氨基酸取代，所述取代使轻链的人性增加至与人轻链序列大于或等于85％的同一性。与Hum1相比，Hum8在HVR-L1和-L2附近或其中分别含有5个氨基酸取代，所述取代使轻链的人性增加至与人轻链序列大于或等于85％的同一性。Hum1、Hum8和Hum9VL在与重链VH结构域all_mut_AB21(携带种系突变；SEQ ID NO：26)配对时产生以等于或优于10pM的亲和力结合人SIRP-α v1的抗SIRP-α抗体(表M)。
实施例4：抗SIRP-α抗体对吞噬作用和树突状细胞激活的诱导
接下来在吞噬作用和树突状细胞激活测定中检查各种抗SIRP-α抗体。
方法
肿瘤细胞系培养
将DLD-1(人结肠直肠腺癌)细胞维持在由补充有10％热灭活的胎牛血清(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Gibco)和1％Glutamax(Gibco)的RPMI(Gibco)组成的生长培养基中。
人单核细胞衍生的巨噬细胞的衍生和培养
从太平洋血液中心(Blood Centers of the Pacific)接收Trima残留物并且将其用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)以1:4稀释。将稀释的血液分离到四个管中并且置于20mlFicoll-Paque Plus(GE Healthcare)上。将管以400x g离心30分钟。从界面收集PBMC并重悬于FACS缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白(Gibco)的PBS)中。根据制造商的方案，使用单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)和LS柱(Miltenyi Biotec)通过阴性选择纯化CD14+单核细胞。
对于非极化巨噬细胞，将CD14+单核细胞接种到在25ml IMDM(Gibco)中的15cm组织培养板(Corning)中，每个培养皿1000万个细胞，所述IMDM补充有10％人AB血清(Corning)、1％青霉素/链霉素和1％Glutamax。将细胞培养7至10天。
对于M2极化巨噬细胞，将CD14+单核细胞接种到在25ml RPMI(Gibco)中的15cm组织培养板(Corning)中，每个培养皿600万个细胞，所述RPMI补充有10胎牛血清(ThermoFisher)、1％青霉素/链霉素和1％Glutamax以及50ng/ml M-CSF(Miltenyi)。将细胞培养7至10天。
体外吞噬作用测定
通过用20ml PBS洗涤两次并在10ml TrypLE Select(Gibco)中在37℃下温育10分钟，将DLD-1细胞从培养板上分离。将细胞离心，在PBS中洗涤，并重悬于培养基中。将细胞用Celltrace CFSE细胞增殖试剂盒(Thermo Fisher)根据制造商的说明书标记并且重悬于IMDM中。通过用20ml PBS洗涤两次并且在10ml TrypLE Select中在37℃下温育20分钟，将巨噬细胞从培养板上分离。将细胞用细胞刮刀(Corning)移除，在PBS中洗涤，并重悬于IMDM中。
将吞噬作用测定在超低附着U形底96孔板(Corning)中组装，所述板含有100,000个DLD-1细胞、50,000个巨噬细胞、抗SIRP-α抗体的100nM至6.4pM的5倍系列稀释液和1或0.01ug/ml的西妥昔单抗(Absolute Antibody)或相同同种型的对照抗体(SouthernBiotech)。将板在37℃下在含有5％二氧化碳的潮湿培养箱中温育2小时。将细胞通过以400x g离心5分钟沉淀，并且在250μl FACS缓冲液中洗涤。将巨噬细胞在冰上于含有10μl人FcR阻断试剂(Miltenyi Biotec)、0.5μl抗CD33 BV421(Biolegend)和0.5μl抗CD206 APC-Cy7(Biolegend)的50μl FACS缓冲液中染色15分钟。将细胞在200μl FACS缓冲液中洗涤，在250μl PBS中洗涤，并且在冰上于在PBS中1：1000稀释的50μl可固定活力染料eFluor 506(ebioscience)中染色30分钟。将细胞在250μl FACS缓冲液中洗涤两次，并且在冰上于75μlCytofix(BD Biosciences)中固定30分钟。将细胞在175μl FACS缓冲液中洗涤，并重悬于75μl FACS缓冲液中。在FACS Canto II(BD Biosciences)上分析细胞，随后通过Flowjo 10.7(Treestar)进行数据分析。通过针对e506阴性群设门排除死细胞。将已吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞鉴定为对CD33、CD206和CFSE呈阳性的细胞。
树突状细胞激活测定
以10mg/kg向Balb/c小鼠(n＝3/组)静脉内注射人IgG1对照、各种抗SIRP-α抗体、小鼠IgG对照或媒介物(PBS)。注射后5小时，收获脾脏并且通过机械解离而加工成单细胞悬浮液。通过流式细胞术测量CD4+脾树突状细胞上的激活标志物CD86、MHCII和CCR7水平。
结果
将上述的人源化抗体与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试了其对M2巨噬细胞对EGFR(+)DLD-1细胞的吞噬作用的影响(图3A)。发现所有人源化抗体均增强西妥昔单抗诱导的吞噬作用。将上述的人源化抗体(抗体25重链变体与Hum1或Hum9轻链的组合以及抗体27重链变体与Hum1轻链的组合)与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试了其对M2巨噬细胞对EGFR(+)DLD-1细胞的吞噬作用的影响(图3B)。发现所有人源化抗体均增强西妥昔单抗诱导的吞噬作用。将所测试的所有抗体作为具有L234A、L235A、G237A和N297A突变的全长人IgG1抗体产生。
接下来，检查各种抗SIRP-α抗体对体内树突状细胞激活的影响(图4A和图4B)。未能通过CD47结合使脾树突状细胞上的小鼠SIRP-α受体参加导致脾树突状细胞激活。在体内测试抗SIRP-α抗体Hum1/AB21mutall、Hum8/AB21mutall和Hum9/AB21mutall以确定其是否导致树突状细胞激活。如通过CD86和MHCII表达所确定的，这些抗SIRP-α阻断性抗体能够诱导树突状细胞的激活。
实施例5：抗SIRP-α抗体与对PD-L1/PD-1途径的抑制的组合的协同抗肿瘤作用
方法
体内抗肿瘤活性
对于CT26同系小鼠结肠癌模型，将CT26细胞皮下植入BALB/c小鼠中并且随机分组(8-9只小鼠/组)。治疗组包括媒介物(PBS)、AB25b、抗PD-L1和AB25b/抗PD-L1。通过将阿特珠单抗的VH和VL结构域与携带N297A突变的小鼠IgG1 Fc区融合来产生抗PD-L1。所有抗SIRP-α抗体还具有携带N297A突变的小鼠IgG1 Fc区。植入后第7或8天肿瘤平均为75-80mm3时开始治疗。对于抗SIRPα抗体，以3mg/kg或10mg/kg每周两次向小鼠腹膜内(IP)给药，持续三周，并且对于抗PD-L1，以3mg/kg给予3个剂量，间隔5天。当肿瘤达到约2000mm3的体积时，处死动物。
对于MC38同系小鼠结肠癌模型，将MC38细胞皮下植入C57BL/6小鼠中并且随机分组(8-10只小鼠/组)。治疗组包括媒介物(PBS)、AB25b、抗PD1(克隆RMP1-14，BioXCell)和AB25b/抗PD1。除了AB25c，所有抗SIRPα抗体均具有携带N297A突变的鼠类IgG1 Fc区。植入后第7天肿瘤平均为60-65mm3时开始治疗。对于抗SIRPα，以10mg/kg每周两次向小鼠腹膜内(IP)给药，持续三周，并且对于抗PD1，以2mg/kg给予3个剂量。当肿瘤达到约2000mm3的体积时，处死动物。
结果
在CT26同系小鼠结肠癌模型中单独和与抗PD-L1抗体组合测试了阻断性AB25b抗SIRP-α抗体的抗肿瘤活性。如图5所示，当与用每种单一剂或媒介物对照的治疗相比时，施用10mg/kg的AB25b与3mg/kg的抗PD-L1的组合延迟了肿瘤形成。在研究的第27天，组合治疗组有六只肿瘤尺寸低于600mm3的小鼠，而在媒介物、抗PD-L1单一剂和抗SIRP-α单一剂治疗组中分别有两只、两只和两只肿瘤尺寸低于600mm3的小鼠。
接下来，在MC38同系小鼠结肠癌模型中单独和与抗PD-1抗体组合测试了AB25b抗SIRP-α抗体的抗肿瘤活性。如图6所示，当与用每种单一剂或媒介物对照的治疗相比时，将AB25b(在10mg/kg下)与5mg/kg的抗PD-1组合延迟了肿瘤形成。在研究的第27天，AB25b/PD-1组合治疗组有七只肿瘤尺寸低于600mm3的小鼠，而在媒介物、抗PD-1单一剂和AB25b单一剂治疗组中分别有一只、五只和两只肿瘤尺寸低于600mm3的小鼠。
表K中提供了本文所述的抗体及其特性的汇总。表L和表N中提供了另外的结合数据。
实施例6：经工程改造以去除潜在的易感性热点的新的抗SIRP-α抗体轻链
由于上述阻断性抗SIRP-α抗体AB21和AB25的特性，选择了包含变体AB21VH结构域(SEQ ID NO：26)和人源化Hum1 VL结构域(SEQ ID NO：25)的抗体进行分析。分析了包含上述Hum1人源化可变轻链结构域的抗体轻链的序列的潜在易感性热点，例如脱酰胺化或糖化位点。
蛋白质脱酰胺化是翻译后修饰，其中谷氨酰胺或天冬酰胺残基的侧链酰胺被转化成酸性羧酸酯基团。天冬酰胺的非酶脱酰胺化比谷氨酰胺的非酶脱酰胺化更快，因此在基于多肽的治疗剂的制造和储存中呈现出更高的生理意义和更大的潜在易感性风险。
糖化是指蛋白质的非酶糖基化或Mallard反应，其主要发生在赖氨酸的ε-氨基基团、或游离氨基基团上。精氨酸、组氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基的侧链代表另外的潜在糖化位点。Amadori修饰的蛋白质是早期糖化产物并且经历产生高级糖化终产物(AGE)的进一步反应。
对含Hum1轻链的分析鉴定了例如由于在抗SIRP-α抗体的制造、储存和/或药物开发期间可能发生的修饰而可能需要工程改造来限制风险的位点。本实施例描述了去除这些潜在易感性的Hum1变体的测试和构建。
方法
肽图(Peptide mapping)分析
对于胰蛋白酶消化，将样品稀释在6M盐酸胍和1mM EDTA中。将10mM DTT和10mM碘乙酰胺分别用于还原和烷基化样品。然后将缓冲液更换为0.1M Tris-HCl，并且将样品孵育4小时以进行消化。对于胰凝乳蛋白酶消化，将样品稀释在100mM碳酸氢铵中。添加1％Progenta阴离子酸不稳定性表面活性剂。再次，将10mM DTT和10mM碘乙酰胺分别用于还原和烷基化样品。将样品孵育过夜。
质谱数据通过与Q Exactive杂合四极-Orbitrap(Thermo Scientific,San JoseCA)联用的Waters Acuity UHPLC采集。使用的柱是Agilent AdvanceBio肽图分析柱(C18，1x150 mm ID)。使用反相溶剂，并且使用的梯度是2％至40％缓冲液，经41分钟。MS全扫描范围为250-2000m/z。肽搜索和相对丰度使用来自Protein Metrics的Byonic和Byologic分析。采用了为10ppm的前体质量精度和为20ppm的碎片质量精度。
KD的测定
使用抗体的直接固定分析抗SIRPa抗体与来自多种物种(人v1、人v2、食蟹猴、小鼠129、BL6、BALBc、NOD)的SIPRa、SIRPb和SIRPg的相互作用。所有实验均在25℃下使用配备有GLC传感器芯片的基于SPR的ProteOn XPR36生物传感器(BioRad,Inc,Hercules,CA)进行。使用FreeStyleTM 293-FS细胞(Thermo Fisher)表达抗体。通过标准蛋白A亲和柱色谱法进行纯化，并且将洗脱的抗体储存在PBS缓冲液中。
运行缓冲液为具有0.01％吐温-20(PBST+)的PBS(pH 7.4)。将所有分析物均以其标称浓度使用，所述标称浓度如通过A280吸光度和使用其摩尔计算的消光系数所确定。如在别处所述，以“一步法”动力学模式注入分析物(参见例如，Bravman,T.等人(2006)Anal.Biochem.358:281-288)。
对于使用GLC芯片的固定化，将分析物注入并使其流过使用Proteon胺偶联试剂盒固定(约1000RU)在GLC芯片上的抗SIRP-α抗体。对于固定步骤，用1/100稀释的EDAC/Sulpho-NHS 1:1(Biorad)以25μL/min激活GLC芯片300s。将抗SIRP-α抗体在pH 4.5的10mM乙酸钠缓冲液中稀释至80nM浓度，并且以30μL/min固定至芯片，持续50s。用乙醇胺以25μL/min灭活芯片300s。将分析物(例如，来自不同物种的SIRP-α、SIRP-β、SIRP-γ)以标称浓度100、33、11、3.7、1.2和0nM在“一步法”动力学模式中注入。以100uL/min监测缔合时间持续90s，并监测解离时间持续1200s。用Pierce IgG洗脱缓冲液/4M NaCl的2:1v/v共混物再生表面。
通过从反应点数据(固定的蛋白)中减去点间数据(不含固定的蛋白)，并且然后从分析物注射的响应中减去缓冲液“空白”分析物注射的响应来双重参考生物传感器数据。将双参考数据全局拟合至简单的Langmuir模型，并且KD值由表观动力学速率常数的比率计算(KD＝kd/ka)。
结果
包含轻链(SEQ ID NO:47)(其具有Hum1 VL结构域(SEQ ID NO:25)和人IGLC1λ恒定结构域(SEQ ID NO:37))和重链(SEQ ID NO:61)(其具有AB21 MutAll VH结构域(SEQ IDNO:26)和包含人IgG2Da Fc区(包含A330S和P331S突变，氨基酸位置编号根据EU)的恒定区(SEQ ID NO:34))的抗SIRP-α抗体(抗体PC336)通过如上所述的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化进行。重链的总序列覆盖率为100％(444个氨基酸中有444个)，并且轻链的总序列覆盖率为98.6％(214个氨基酸中有211个)。表J1和J2中提供了所有抗体的可变结构域和完全链序列。
这些分析揭示出三个通过糖化而被修饰的轻链残基。表F示出了在轻链中观察到的糖化。总共分离出3种糖化肽。在这些中，观察到约48％的具有序列SEQ ID NO:65的肽被糖化。糖化修饰被分配至K104(编号基于轻链的氨基酸的顺序编号，而不是Kabat)。图7示出了抗体PC336的肽的糖化形式相对于未修饰形式的总提取离子色谱曲线下面积(XIC，AUC)。
表F.来自抗体PC336的含Hum1轻链的糖化肽。
Figure BDA0002690047860000871
还进行了包含相同轻链(SEQ ID NO:47)和重链(SEQ ID NO:58)(其具有AB21MutAll VH结构域(SEQ ID NO:26)和包含野生型人IgG1 Fc区的恒定区(SEQ ID NO:31))的第二抗SIRP-α抗体(抗体PC333)的肽图分析。与对抗体336观察到的相似，在该抗体中也观察到轻链104位的赖氨酸残基被糖化(约34％的肽；参见表G)。
表G.来自抗体PC333的含Hum1轻链的糖化肽。
Figure BDA0002690047860000872
肽图分析还揭示出在抗体PC301的含Hum1轻链中脱酰胺化残基的存在，所述抗体PC301包含轻链(SEQ ID NO:63)(其具有Hum1 VL结构域(SEQ ID NO:25)和人IGLC2λ恒定结构域(SEQ ID NO:38))和重链(SEQ ID NO:59)(其具有AB21 MutAll VH结构域(SEQ ID NO:26)和包含人IgG1 AAA N297A Fc区(包含L234A、L235A、G237A和N297A突变，氨基酸位置编号根据EU)的恒定区(SEQ ID NO:32))。如图8所示，观察到抗体PC301的轻链和重链中的不同位点被脱酰胺化。特别地，发现大约50％的含有轻链恒定结构域的N171和N172残基的肽通过脱酰胺化而被修饰。从肽图分析中，不可能确定N171、N172或两个残基是否被脱酰胺化，因为这两个残基彼此相邻并分离在同一肽中。
翻译后修饰(诸如脱酰胺化和糖化)对于药物开发是不希望的。这是由于关于药物制造过程中产品异质性的潜在问题。因此，即使修饰似乎不影响抗SIRP-α抗体的结合亲和力，也希望限制这些修饰。
为了去除潜在的脱酰胺化残基(N171/N172)，首先测试了4种脱酰胺化位点变体。抗体PC334含有原始的Hum1 VL+IGLC1轻链(SEQ ID NO:47)。抗体PC338含有具有原始的Hum1 VL结构域和N172D变体恒定结构域(SEQ ID NO:48)的轻链。抗体PC339含有具有原始的Hum1 VL结构域和N171D变体恒定结构域(SEQ ID NO:49)的轻链。抗体PC340含有具有原始的Hum1 VL结构域和N171D、N172S脱酰胺化位点变体恒定结构域(SEQ ID NO:50)的轻链。抗体PC341含有具有原始的Hum1 VL结构域和N171S、N172D脱酰胺化位点变体恒定结构域(SEQ ID NO:51)的轻链。所有抗体均具有包含AB21HC mut all VH结构域(SEQ ID NO:26)和包含人IgG1 AAA N297A Fc区的恒定区(SEQ ID NO:32)的重链(如SEQ ID NO:59中所示的完全重链序列)。结合测定的结果示出在表H中。与野生型抗体相比，所有四种突变体以等同的亲和力与人SIRP-αv1结合。
表H.具有脱酰胺化位点变体Hum1轻链的抗SIRP-α抗体与人SIRP-αv1的结合。
Figure BDA0002690047860000881
*IgG1_AAA_失效的是指具有L234A、L235A、G237A和N297A取代的人IgG1。
接下来，测试糖化位点变体。具有糖化位点的Hum1 VL结构域的区域示出在图9中。为了去除该糖化位点，产生了该VL结构域的三种变体，标记为形式1、2和3(v1、v2和v3在本文中也可互换使用)。这些变体使K104糖化位点中及其周围的残基突变。形式1和形式2使用分别与天然人IGLJ1和IGLJ7序列相同的序列。形式3用精氨酸置换赖氨酸，以维持残基的正电荷和大小。在N171S、N172D脱酰胺化变体的背景下测试了糖化位点变体。
抗体PC334含有原始的Hum1 VL+IGLC1轻链(SEQ ID NO:47)。抗体PC341含有具有原始的Hum1 VL结构域和N171S、N172D(缩写为“SD”)脱酰胺化位点变体恒定结构域(SEQ IDNO:51)的轻链。抗体PC345、PC346和PC347也含有SD脱酰胺化位点变体恒定结构域，但分别包含Hum1变体1、2和3VL结构域(分别为SEQ ID NO:53、55和57)。所有抗体均具有包含AB21HC mut all VH结构域(SEQ ID NO：26)和包含人IgG1 AAA N297A Fc区的恒定区(SEQID NO：32)的重链(如SEQ ID NO：59中所示的完全重链序列)。结合测定的结果示出在表I1中。
表I1.具有糖化位点变体Hum1轻链的抗SIRP-α抗体与人SIRP-α v1的结合。
Figure BDA0002690047860000891
*IgG1_AAA_失效的是指具有L234A、L235A、G237A和N297A取代的人IgG1。
如表H和I1所示，与野生型抗体相比，所有抗体以等同的亲和力与人SIRP-αv1结合。这些结果证明，经工程改造以去除脱酰胺化和糖化易感性热点的变体对结合SIRP-α没有影响。
基于以上结果，产生了6种优选的轻链变体，并且对应序列(SEQ ID NO：52-57)的比对示出在图10和图11中。它们包括将两种优选的脱酰胺化位点变体(N171D/N172S和N171S/N172D，分别缩写为“DS”和“SD”)和3种糖化变体(v1、v2、v3)组合。比对中还示出了原始的hum1 VL结构域和人IGLC1λ恒定区(SEQ ID NO：47)。
实施例7：恒定结构域序列对抗SIRP-α抗体的生物学活性的影响
对具有不同Fc区和轻链恒定结构域的抗SIRP-α抗体测试了其对吞噬作用的影响，以了解这些序列如何影响抗SIRP-α抗体的生物学特性。
方法
对于树突状细胞的功能消耗，使用Ficoll-Paque Plus从健康个体的Trima残留物中分离出外周血单核细胞(PBMC)。将500,000个PBMC以10ug/mL的浓度在具有抗SIRP的u型底部96孔板(coming)中在37C下孵育48小时。对于流式细胞术，将细胞在人FcR阻断剂中孵育并且用针对lin-(CD3、CD14、CD16、CD19、CD56)和HLADR的荧光染料标记的抗体的混合物染色。使用可固定活力染料来鉴定活细胞。染色后，将细胞洗涤并用0.5％多聚甲醛的PBS溶液固定。采集之前，添加绝对计数珠，并且使用Canto II流式细胞仪采集样品并使用FlowJo软件进行分析。
使用实施例4中所述的体外测定来测量吞噬作用。
结果
将具有不同Fc区的人源化抗SIRP-α抗体与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试了其对M2巨噬细胞对EGFR(+)DLD-1细胞的吞噬作用的影响(图12)。所有抗体具有轻链序列SEQID NO：55和VH结构域序列SEQ ID NO：26。所测试的Fc区包括IgG2野生型(如恒定结构域序列SEQ ID NO：33中所表示的)；IgG2Da Fc区(包含A330S和P331S突变，氨基酸位置编号根据EU；如恒定结构域序列SEQ ID NO：34中所表示的)；包含N297A突变的IgG2 Fc区(氨基酸位置编号根据EU；如恒定结构域序列SEQ ID NO：137中所表示的)；和包含N297A、L234A、L235A和G237A突变的IgG1 Fc区(氨基酸位置编号根据EU；如恒定结构域序列SEQ ID NO：32中所表示的)。发现所有抗体在增强西妥昔单抗诱导的吞噬作用方面具有大约等同的活性。
接下来，对具有不同Fc区的抗SIRP-α抗体(或相应的同种型对照)测试了其消耗来自供体PBMC的不同细胞类型的能力。所有抗体具有轻链序列SEQ ID NO：55和VH结构域序列SEQ ID NO：26。如图13A和图13B所示，具有野生型IgG1、野生型IgG4、野生型IgG2或IgG2DaFc区的抗SIRP-α抗体能够消耗来自从两个不同供体获得的PBMC的DC。这表明在PBMC测定的背景下，这些Fc区具有增强一些DC消耗的能力(已知DC表达SIRP-α)。相比之下，仅L234A/L235A/G237A/N297A IgG1和IgG2 N297A Fc区未显示出DC消耗。所测试的抗体均未导致T细胞、单核细胞或B细胞的显著消耗(图13C至图13E)。有利地，IgG2 N297A Fc区提供了与L234A/L235A/G237A/N297A IgG1 Fc区相同的消耗缺乏，但具有较少的突变(因此具有潜在地较低的免疫原性)。
还测试了抗SIRP-α抗体与人SIRP-α v1：NOD、C57BL/6和BALBc小鼠SIRP-α；人SIRP-β；和人SIRP-γ的结合亲和力。所测试的抗体包含以下重链和轻链：PC301：SEQ IDNO：63的轻链和SEQ ID NO：59的重链；PC334：SEQ ID NO：47的轻链和SEQ ID NO：59的重链；和PC367：SEQ ID NO：55的轻链和SEQ ID NO：129的重链。
表I2.抗SIRP-α抗体与SIRP蛋白的结合亲和力(KD，M)。
Figure BDA0002690047860000901
Figure BDA0002690047860000911
据认为人IgG2抗体存在于基于二硫化物的同种型(A、B和AB)中，并且据报道将C232S或C233S突变引入人IgG2恒定区中降低由二硫化物改组引起的异质性(Lightle，S.等人(2010)Protein Sci.19：753-762)。这些突变中的每一个被认为迫使IgG2抗体成为同种型A。此外，λ轻链也被认为促进同种型A丰度。将具有包含C232S或C233S突变的野生型IgG2(图14A)或IgG2 N297A(图14B)Fc区的抗SIRP-α抗体与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合测试了对M2巨噬细胞对EGFR(+)DLD-1细胞的吞噬作用的影响。所有抗体具有轻链序列SEQ ID NO：55和VH结构域序列SEQ ID NO：26。使用具有λ轻链以驱动同种型A优势的抗体测试了野生型和N297A Fc区域。与具有野生型IgG2或IgG2 N297A Fc区的抗体相比，包含具有C232S或C233S突变的Fc区的IgG2抗SIRP-α抗体显示出相似的吞噬作用增强。
还检查了轻链恒定结构域对抗SIRP-α抗体增强吞噬作用的能力的影响。所有抗体具有VH结构域序列SEQ ID NO：26和VL结构域序列SEQ ID NO：18。在含有野生型IgG2 Fc(图15A)或IgG2da Fc(图15B)的重链的背景下，具有λ和κ轻链的抗SIRP-α抗体显示出相似的吞噬作用增强。
尽管上述本公开已出于清楚理解的目的通过说明及实施例方式详细描述，但描述及实施例不应视为限制本公开的范围。本文引用的所有专利及科学文献的公开内容均整体以引用的方式明确并入本文中。
表J1.选择的抗体的可变结构域序列。
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表J2.选择的抗体的完全链序列。
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Claims (60)

1.一种结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链，所述重链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的重链可变(VH)结构域；以及
(b)轻链，所述轻链包含含有根据下式的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域：SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTL IYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNP FGX1GTX2X3TVL(SEQ ID NO:71)，其中X1是G或T；X2是K、Q或R；并且X3是L或V，并且其中所述VL结构域不包含序列SEQ ID NO:25。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述VL结构域包含选自由SEQ ID NO:39-41组成的组的氨基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述轻链进一步包含轻链恒定(CL)结构域序列，所述轻链恒定结构域序列包含根据下式的氨基酸序列：GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADG SPVKAGVETTKPSKQSX4X5KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:72)，其中X4X5是ND、DN、DS或SD。
4.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述轻链进一步包含轻链恒定(CL)结构域序列，所述轻链恒定结构域序列包含选自由SEQ ID NO:43-46组成的组的氨基酸序列。
5.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述轻链进一步包含κ轻链恒定(CL)结构域。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
7.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述轻链进一步包含λ轻链恒定(CL)结构域。
8.如权利要求7所述的抗体，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:38。
9.如权利要求1所述的抗体，其中所述轻链包含选自由SEQ ID NO:48-57组成的组的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体为scFv-Fc、单结构域抗体、单重链抗体或单轻链抗体。
11.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
12.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述重链包含含有Fc区的重链恒定结构域。
13.如权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区为选自由IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG4Fc区组成的组的人Fc区。
14.如权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区为人IgG1 Fc区。
15.如权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区为人IgG1 Fc区，所述人IgG1 Fc区包含L234A、L235A和G237A取代，氨基酸位置编号根据EU。
16.如权利要求15所述的抗体，其中所述Fc区进一步包含N297A取代，氨基酸位置编号根据EU。
17.如权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区为人IgG2 Fc区。
18.如权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区为人IgG2 Fc区，所述人IgG2 Fc区包含A330S和P331S取代，氨基酸位置编号根据EU。
19.如权利要求17或权利要求18所述的抗体，其中所述Fc区进一步包含N297A取代，氨基酸位置编号根据EU。
20.如权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区为人IgG4 Fc区，并且其中所述重链包含S228P取代，氨基酸位置编号根据EU。
21.如权利要求12所述的抗体，其中所述重链恒定结构域包含选自由SEQ ID NO:31-35组成的组的氨基酸序列。
22.如权利要求12所述的抗体，其中所述重链恒定结构域包含选自由SEQ ID NO:33、34和137组成的组的氨基酸序列。
23.如权利要求12所述的抗体，其中所述重链恒定结构域包含选自由SEQ ID NO:132-139组成的组的氨基酸序列。
24.如权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含选自由SEQ ID NO:58-62组成的组的氨基酸序列。
25.如权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含选自由SEQ ID NO:60、61和129组成的组的氨基酸序列。
26.如权利要求1所述的抗体，其中：
(a)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；
(b)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53；
(c)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54；
(d)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(e)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56；或者
(f)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。
27.如权利要求1所述的抗体，其中：
(a)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；
(b)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；
(c)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；
(d)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；
(e)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53；
(f)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53；
(g)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53；
(h)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:53；
(i)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54；
(j)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54；
(k)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54；
(l)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:54；
(m)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(n)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(o)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(p)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(q)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56；
(r)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56；
(s)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56；
(t)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:56；
(u)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57；
(v)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57；
(w)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57；或者
(x)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。
28.如权利要求1所述的抗体，其中：
(a)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(b)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(c)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:129，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；
(d)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:124，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；或者
(e)所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:124，并且所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:55。
29.如权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中所述抗体增强表达人SIRP-α多肽的巨噬细胞的吞噬作用。
30.如权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中所述抗体增强表达人SIRP-α多肽的树突状细胞的激活。
31.如权利要求1-30中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制表达CD47的肿瘤的体内生长。
32.如权利要求1-31中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至剂。
33.如权利要求1-31中任一项所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
34.如权利要求33所述的抗体，其中所述抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合由癌细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。
35.如权利要求34所述的抗体，其中由所述癌细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘蛋白1、粘蛋白16、PD-L1、PTK7、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、粘连蛋白4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自以下的肽的MHC/肽复合物：NY-ESO-1/LAGE、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、存活素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPVE7。
36.如权利要求33所述的抗体，其中所述抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合由免疫细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。
37.如权利要求36所述的抗体，其中由所述免疫细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-15、FGL-1、CD200、CD200R、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、精氨酸酶、IDO、TDO、AhR、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、TGF-βRI、TGF-βRII、c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、TNFR2、PVRIG、DNAM和ICOS。
38.如权利要求33所述的抗体，其中所述抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合由自然杀伤(NK)细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。
39.如权利要求38所述的抗体，其中由所述NK细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：NKR-P1A、CD94、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94、NKG2D、CD160、CD16、NKp46、NKp30、NKp44、DNAM1、CRTAM、CD27、NTB-A、PSGL1、CD96、CD100、NKp80、SLAMF7和CD244。
40.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-39中任一项所述的抗体。
41.一种载体，其包含如权利要求40所述的多核苷酸。
42.一种宿主细胞，其包含如权利要求40所述的多核苷酸或如权利要求41所述的载体。
43.一种产生抗体的方法，所述方法包括培养如权利要求42所述的宿主细胞以产生所述抗体。
44.如权利要求43所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞中回收所述抗体。
45.一种治疗个体的癌症或延迟个体的癌症的进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1-39中任一项所述的抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其进一步包括向所述个体施用有效量的第二抗体，所述第二抗体结合由所述癌症表达的抗原。
47.如权利要求46所述的方法，其中由所述癌症表达的所述抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘蛋白1、粘蛋白16、PTK7、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、粘连蛋白4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自以下的肽的MHC/肽复合物：NY-ESO-1/LAGE、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、存活素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPV E7。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用有效量的免疫治疗剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述免疫治疗剂包括第二抗体。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述第二抗体结合选自由以下组成的组的抗原：BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-15、FGL-1、CD200、CD200R、CSF-1R、CD40、CD40L、CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、精氨酸酶、IDO、TDO、AhR、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、TGF-βRI、TGF-βRII、c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、TNFR2、PVRIG、DNAM和ICOS。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述第二抗体结合PD-1。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述第二抗体结合PD-L1。
53.如权利要求48所述的方法，其中所述免疫治疗剂包括疫苗、溶瘤病毒、过继细胞疗法、细胞因子或小分子剂。
54.如权利要求45-53中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用有效量的第二抗体，所述第二抗体结合由自然杀伤(NK)细胞表达的抗原。
55.如权利要求54所述的方法，其中由所述NK细胞表达的所述抗原选自由以下组成的组：NKR-P1A、CD94、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94、NKG2D、CD160、CD16、NKp46、NKp30、NKp44、DNAM1、CRTAM、CD27、NTB-A、PSGL1、CD96、CD100、NKp80、SLAMF7和CD244。
56.如权利要求45-55中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用有效量的化学治疗剂或小分子抗癌剂。
57.如权利要求45-56中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用有效量的靶向小分子抑制剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述靶向小分子抑制剂是VEGFR和/或PDGFR抑制剂、EGFR抑制剂、ALK抑制剂、CDK4/6抑制剂、PARP抑制剂、mTOR抑制剂、KRAS抑制剂、TRK抑制剂、BCL2抑制剂、IDH抑制剂、PI3K抑制剂、DNA损伤应答(DDR)抑制剂或低甲基化剂。
59.一种治疗个体的自身免疫疾病或炎性疾病或延迟个体的自身免疫疾病或炎性疾病的进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1-39中任一项所述的抗体。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述自身免疫疾病或炎性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、抗体介导的炎性或自身免疫疾病、移植物抗宿主病、败血症、糖尿病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏综合征、进行性系统性硬化症、硬皮病、急性冠状动脉综合征、缺血再灌注、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、子宫内膜异位症、肾小球肾炎、IgA肾病、多囊性肾病、重症肌无力、特发性肺纤维化、肺纤维化、肝硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、哮喘、特应性皮炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管炎和炎性自身免疫性肌炎。
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