WO2020013170A1 - 抗ＳＩＲＰα抗体 - Google Patents

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真由美 須江
健介 中村
千草 吉村
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-SIRP ⁇ antibody useful for treating a tumor, and an antitumor agent containing the antibody.
  • SIRP ⁇ (SHPS-1) is a single transmembrane molecule of the Ig superfamily present in macrophages, dendritic cells, myeloid cells such as neutrophils, and glial cells (Non-Patent Document 1).
  • the extracellular region is composed of one IgV domain and two IgC domains, and 10 types of human IgV domains have been reported as binding sites for CD47 (Non-Patent Document 2).
  • the intracellular region contains immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs (ITIM), and its binding to CD47 induces the binding to tyrosine phosphatase SHP-1 and SHP-2, thereby transmitting an inhibitory signal.
  • ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs
  • Non-Patent Document 3 As a physiological phenomenon due to the SIRP ⁇ -CD47 interaction, it has been shown that CD47 on erythrocytes binds to SIRP ⁇ on macrophages and transmits a “Don't eat” me signal, thereby avoiding unnecessary phagocytosis of erythrocytes. (Non-Patent Document 3). On the other hand, even in a tumor microenvironment, it has been suggested that binding of CD47 highly expressed in tumor cells to SIRP ⁇ on macrophages and dendritic cells suppresses phagocytic activity on tumor cells. Suppression of phagocytosis is expected to lead to suppression of subsequent presentation of tumor antigens to T cells, and furthermore to suppression of tumor immune responses. Therefore, the immune phenomenon of tumor cell phagocytosis is considered to be a checkpoint for tumor antigen uptake (entry).
  • Non-Patent Document 4 It has been reported that inhibition of SIRP ⁇ -CD47 interaction with an antibody against CD47, which is a ligand of SIRP ⁇ , enhances the phagocytic activity on tumor cells. Even when is used, similar phenomena have been shown under conditions of combined use of anti-cancer antibodies that have an effector activity of attracting tumor cells to immune cells (Non-Patent Documents 5 and 6). In addition, it has been suggested that the allogeneic mouse tumor-bearing model using an anti-CD47 antibody induces not only an antitumor effect but also tumor immunity (Non-Patent Document 7). Under the conditions, a similar effect can be expected.
  • Non-patent Document 8 and 9 a plurality of antibodies against immunosuppressive molecules on T cells such as PD-1 / PD-L1 have been developed, and their effects have been demonstrated clinically (Non-patent Document 8 and 9).
  • SIRP ⁇ -CD47 is currently the only proven phagocytosis inhibitory molecule, and inhibitory antibodies against this molecule are expected to be potential new checkpoint inhibitors against targets other than T cells It has the potential to be widely effective in patients resistant to the drug.
  • Patent Document 1 shows not only the combination effect with the anticancer antibody having the effector activity expected conventionally but also the combination effect with the immune checkpoint inhibitor targeting T cells. Similar effects can be expected with the human SIRP ⁇ antibody.
  • Patent Documents 1, 2, and 3 patents on anti-SIRP ⁇ antibodies have been successively reported from various companies.
  • OSE-172 is an IgG4Pro-type antibody that shows binding to the SIRP ⁇ V1 type and SIRP ⁇ 1, but does not show binding to the SIRP ⁇ V2 type and SIRP ⁇ .
  • KWAR23 is an IgG1N279A type antibody, and has binding properties to 10 types of SIRP ⁇ variants and SIRP ⁇ 1 and SIRP ⁇ .
  • ADU-1805 is an IgG2 type antibody and exhibits binding properties to 10 types of SIRP ⁇ variants and SIRP ⁇ . It is unclear which antibody is most suitable as a medicine, and efforts are being made to obtain excellent antibodies.
  • Non-Patent Document 7 by preparing an environment that facilitates the uptake of tumor antigens by pre-administration of a chemotherapeutic agent, the antigen uptake ability (immunostimulation ability) by inhibiting the SIRP ⁇ -CD47 interaction is improved. It shows the possibility that the effect can be enhanced.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody is a drug that can induce a stronger tumor immune response when used in combination with various antitumor agents.
  • the object of the present invention is to provide an anti-SIRP ⁇ antibody that can be used as an antitumor agent, and an antitumor agent containing the antibody as an active ingredient.
  • the present inventors have inhibited the interaction between SIRP ⁇ expressed in phagocytic cells having phagocytic activity and CD47 expressed in tumor cells with an anti-SIRP ⁇ antibody, and converted “Don't- A method for inhibiting the transmission of the "eat-me” signal and enhancing the phagocytosis of tumor cells by phagocytic cells was examined.
  • the present inventors have attempted to produce an antibody having a higher affinity for SIRP ⁇ and a high inhibitory effect on the interaction between SIRP ⁇ and CD47, and when the anti-SIRP ⁇ antibody has an effector function such as ADCC or ADCP. Considering the possibility of attacking their own immune cells, the production of an anti-SIRP ⁇ antibody having no effector function was also studied.
  • the subclass of the antibody was set to IgG4, and a mutation that reduced the effector function was introduced into the Fc region of the antibody.
  • an anti-SIRP ⁇ antibody that strongly inhibits the interaction between SIRP ⁇ and CD47 but has a reduced effector function could be produced. Since this antibody does not bind to the Fc receptor of effector cells and does not exert effector functions, it has no sufficient antitumor effect by itself. Thus, when used in combination with another antibody drug having an effector function or another antibody drug having an immune checkpoint inhibitory effect, it was confirmed that a good antitumor effect was exhibited, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows. [1] (a) a light chain CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (B) a light chain CDRL2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (C) a light chain CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, (D) a heavy chain CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, (E) heavy chain CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and (f) heavy chain CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the antibody of [1], wherein the heavy chain constant region is a human IgG4 heavy chain constant region and contains a mutation that causes a reduction in ADCC and / or ADCP activity.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein phenylalanine at position 234 shown by the EU index by Kabat et al. Is substituted with alanine, leucine at position 235 is substituted with alanine, and The antibody of [1] or [2], wherein serine is replaced by proline.
  • the antibody of [3], wherein the amino acid sequence of the heavy chain constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 140 to 466 of SEQ ID NO: 25.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein phenylalanine at position 234 shown by the EU index by Kabat et al. Is substituted with alanine, leucine at position 235 is substituted with alanine, and 228 The antibody of [5], wherein serine is replaced by proline.
  • the antibody of [6], wherein the amino acid sequence of the heavy chain constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 140 to 466 of SEQ ID NO: 25.
  • the antibody of [8], wherein the heavy chain constant region is a human IgG4 heavy chain constant region, and the mutation comprises a mutation that causes a reduction in ADCC and / or ADCP activity.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein phenylalanine at position 234 shown by the EU index by Kabat et al. Is substituted with alanine, leucine at position 235 is substituted with alanine, and An antibody which specifically binds to human SIRP ⁇ of [8] or [9], wherein serine is substituted by proline, and inhibits binding of human SIRP ⁇ to CD47.
  • the antibody of [10], wherein the amino acid sequence of the heavy chain constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 139 to 465 of SEQ ID NO: 29.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein phenylalanine at position 234 indicated by the EU index by Kabat et al. Is substituted with alanine, leucine at position 235 is substituted with alanine, and 228 of position 228 is further substituted.
  • the antibody of [13], wherein the amino acid sequence of the heavy chain constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 139 to 465 of SEQ ID NO: 29.
  • the antibody of [15], wherein the heavy chain constant region is a heavy chain constant region of human IgG4 and contains a mutation that results in a decrease in ADCC and / or ADCP activity.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein the phenylalanine at position 234 indicated by the EU index by Kabat et al. Is substituted with alanine, the leucine at position 235 is substituted with alanine, and the position at position 228 is further substituted.
  • the antibody of [17], wherein the amino acid sequence of the heavy chain constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 144 to 470 of SEQ ID NO: 33.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein phenylalanine at position 234 indicated by the EU index by Kabat et al. Is substituted with alanine, leucine at position 235 is substituted with alanine, and 228 of position 228 is further substituted.
  • the antibody of [20], wherein the amino acid sequence of the heavy chain constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 144 to 470 of SEQ ID NO: 33.
  • human SIRP ⁇ which specifically binds to human SIRP ⁇ and binds to an epitope containing Gln at position 82, Lys at position 83, Glu at position 84, and Gly at position 85 of human SIRP ⁇ represented by SEQ ID NO: 57, An antibody that inhibits the binding of to CD47.
  • the antibody of [24] wherein the heavy chain constant region is a heavy chain constant region of human IgG4 and contains a mutation that results in a decrease in ADCC and / or ADCP activity.
  • the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG4, wherein phenylalanine at position 234 indicated by the EU index by Kabat et al.
  • the antigen-binding fragment of the antibody of [30] which is selected from the group consisting of Fab, F (ab ') 2, Fab', and scFv.
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, the antibody of any one of [1] to [29] or an antigen-binding fragment of the antibody of [30] or [31].
  • the pharmaceutical composition of [32] which is an antitumor agent.
  • [34] The pharmaceutical composition of [33], further comprising, as an active ingredient of the antitumor agent, an immune checkpoint inhibitor and / or an antibody drug having ADCC and / or ADCP activity specifically reacting with a cancer antigen.
  • an immune checkpoint inhibitor and / or a cancer antigen comprising an antibody of any one of [1] to [29] or an antigen-binding fragment of the antibody of [30] or [31] as an active ingredient
  • the pharmaceutical composition of [34] or [35] wherein the immune checkpoint inhibitor is a binding inhibitor of PD-L1 and PD-1, or a CTLA4 inhibitor.
  • An antibody drug having ADCC and / or ADCP activity specifically reacting with a cancer antigen is selected from the group consisting of an anti-CD20 antibody, an anti-HER2 antibody and an anti-EGFR antibody, [34] or [35]. ] A pharmaceutical composition.
  • the tumor is one or more selected from the group consisting of carcinoma, sarcoma, lymphoma, leukemia, myeloma, germinoma, brain tumor, carcinoid, neuroblastoma, retinoblastoma, and nephroblastoma
  • the pharmaceutical composition according to any one of [33] to [37], which is a tumor for: [39] If the tumor is renal, melanoma, squamous cell, basal cell, conjunctival, oral, laryngeal, pharyngeal, thyroid, lung, breast, esophageal cancer , Stomach, duodenum, small intestine, large intestine, rectum, appendix, anal, liver, gallbladder, bile duct, pancreatic, adrenal, bladder , Prostate cancer, uterine cancer, vaginal cancer, liposarcoma, hemangiosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomy
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy and light chains of the antibody of any of [1] to [29].
  • a vector comprising the polynucleotide of [40].
  • a host cell comprising the polynucleotide of [40] or the vector of [41].
  • the method for producing the antibody of any of [1] to [29] comprising culturing the host cell of [42] and purifying the antibody from the culture.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention strongly inhibits the interaction between SIRP ⁇ expressed in phagocytic cells and CD47 expressed in tumor cells, and transmits “Don't-eat-me” signal from tumor cells to phagocytic cells. Is safe because it has no effector function and does not attack its own immune cells.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention can exhibit an excellent antitumor effect when used in combination with another antibody drug having an effector function or another antibody drug having an immune checkpoint inhibitory action.
  • FIG. 7A is a diagram showing the structure of the SIRPA construct used for the epitope analysis of the anti-SIRPA antibody (A) and the reactivity of the rat anti-human SIRPA antibody to each construct (B).
  • Figures (i)-(iv) showing the reactivity of the humanized anti-human SIRPA antibody to the hmSIRPA construct used for the epitope analysis of the anti-SIRPA antibody, and the amino acid sequence (v) of the SIRPA construct used for the epitope analysis of the anti-SIRPA antibody
  • FIG. It is a figure which shows the ribbon model of the whole complex of Fab fragment of anti-SIRPA antibody and SIRPA_V2_IgV.
  • FIG. 1 shows the interaction of the antibody SIRPA antibody (antibody D13) with the region before beta5 (A) and after beta5 (B) of human SIRPA. It is a figure which shows the comparison of the amino acid sequence of each variant of the beta5-6 loop part of human SIRPA. It is a figure which shows ADCP activity with respect to a gastric cancer cell line in the case of using (A) and anti-SIRPA antibody and Trastuzumab in combination when used as an anti-SIRPA antibody alone. It is a figure which shows the result of the binding evaluation with respect to human SIRPA of a human chimerized anti-SIRPA antibody (cD13, cF44, cF63). FIG.
  • A shows the ADCP activity of cD13, cF44 and cF63 on PBMC
  • B shows the ADCP activity of cF44 antibodies having different constant regions
  • C shows the abundance ratio of macrophages. It is a figure which shows comparison of the amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody D13, the variable region of humanized antibody heavy chain hH1, and the variable region of humanized antibody heavy chain hH2. It is a figure which shows the comparison of the amino acid sequence of the light chain variable region of antibody D13, the variable region of humanized antibody light chain hL2, the variable region of humanized antibody heavy chain hL3, and the variable region of humanized antibody light chain hL4.
  • FIG. 4 shows the binding activities of humanized anti-SIRPA antibodies to human SIRPA variants ((i): V1, (ii): V2, (iii): V3 and (iv): V4).
  • FIG. 7 shows the binding activities of humanized anti-SIRPA antibodies to human SIRPA variants ((i): V5, (ii): V6, (iii): V7 and (iv): V8).
  • FIG. 3 shows the binding activities of humanized anti-SIRPA antibodies to human SIRPA variants ((i): V9, (ii): V10, (iii): monkey SIRPA and (iv): Mock).
  • FIG. 2 shows the binding activity of a humanized anti-SIRPA antibody to mouse SIRPA ((i): C57BL / 6, (ii): Balb / c, (iii): 129 sv).
  • FIG. 3 shows the binding activity of a humanized anti-SIRPA antibody to mouse SIRPA ((i): NOD, (ii): Mock). It is a figure which shows the result of human (A and B) or monkey SIRPA (C) binding
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence encoding the cD13 light chain and the amino acid sequence of the cD13 light chain.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence encoding the cD13 heavy chain and the amino acid sequence of the cD13 heavy chain.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence encoding the cF44 light chain and the amino acid sequence of the cF44 light chain.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence encoding the cF44 heavy chain and the amino acid sequence of the cF44 heavy chain.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence encoding the cF63 light chain and the amino acid sequence of the cF63 light chain.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence encoding the cF63 heavy chain and the amino acid sequence of the cF63 heavy chain. It is a figure which shows the nucleotide sequence which codes hL2, and the amino acid sequence of hL2. It is a figure which shows the nucleotide sequence which codes hL3, and the amino acid sequence of hL3.
  • FIG. 10 is a graph showing IC50 values of inhibition of / CD47 or SIRPA_V2 / CD47 binding activity. It is a figure which shows the result of the evaluation of the binding of various anti-human SIRPA antibodies to human SIRPB (A) and human SIRPG (B), and the result of a test as a negative control for A and B (C).
  • FIG. 7 shows the time-dependent (B), the concentration-dependent comparison results at a reaction time of 2 hours (C), and the self-ADCP activity (D) in which macrophages phagocytize each other by various anti-human SIRPA antibodies.
  • “Ab ⁇ ” indicates a negative control to which no antibody was added
  • “+ ⁇ Rmab” indicates that Rituximab was added simultaneously.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequences of the heavy chain (OSE-172_hG4Pro) and the light chain (OSE-172_hK) of the OSE-172 antibody. It is a figure which shows the amino acid sequence of KWAR23 antibody heavy chain (KWAR23_hG4Pro) and light chain (KWAR23_hK).
  • FIG. 4 shows the amino acid sequences of ADU-1805 antibody heavy chain (ADU-1805_hG2) and light chain (ADU-1805_hK).
  • the present invention is an anti-SIRP ⁇ antibody that recognizes and binds to the extracellular IgV domain of SIRP ⁇ protein.
  • SIRP ⁇ signal regulatory protein ⁇
  • SIRP ⁇ signal regulatory protein ⁇
  • the extracellular region is composed of one IgV domain and two IgC domains.
  • the extracellular IgV domain of the SIRP ⁇ protein is one of three extracellular Ig-like domains constituting the SIRP ⁇ protein.
  • V1 and V2 are major variants, and the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention binds to all variants including major variants V1 and V2.
  • SIRP ⁇ may be referred to as “SIRPA”.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is obtained by immunizing mammals such as mice, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, horses, monkeys, dogs, pigs, cows, goats, sheep and the like using SIRP ⁇ or a fragment thereof as an immunogen, spleen cells, etc. And a myeloma to produce a hybridoma, which can be obtained as an antibody produced and secreted by the hybridoma.
  • the hybridoma can be prepared by a known method.
  • SISIRP ⁇ as an immunogen can be chemically synthesized based on sequence information, or can be obtained as a recombinant protein by a known method based on DNA sequence information encoding a protein.
  • Antibody screening can be performed by any method.
  • screening may be performed by Cell-ELISA using animal cells transfected with DNA encoding SIRP ⁇ .
  • the amino acid sequence of the V1 protein of human SIRP ⁇ is shown in SEQ ID NO: 56 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the V2 protein of human SIRP ⁇ is shown in SEQ ID NO: 57 in the sequence listing.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention inhibits the binding between SIRP ⁇ and CD47.
  • Tumor cells express CD47 at a high level, and the "Don't-eat-me” signal is transmitted to phagocytic cells by binding and interacting with SIRP ⁇ expressed in phagocytic cells having phagocytic ability. Escaped from phagocytosis by phagocytic cells.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody inhibits the transmission of “Don't-eat-me” signal from tumor cells to phagocytic cells by inhibiting the binding of SIRP ⁇ to CD47, and inhibits the phagocytic activity of tumor cells by phagocytic cells. Strengthen.
  • Phagocytic cells having phagocytic activity include macrophages such as M1-type and M2-type macrophages and dendritic cells such as imDC (immature dendritic cells).
  • ADCC AntibodybDependent Cellular ⁇ Cytotoxicity: antibody-dependent
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • ADCP Antibody ⁇ Dependent ⁇ Cellular ⁇ Phagocytosis: antibody-dependent cell phagocytosis
  • the effector function of the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention is reduced in order to avoid attacks on its own cells.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention has only the effect of simply suppressing the binding between SIRP ⁇ and CD47, does not bind to the Fc receptor of effector cells, and does not exhibit effector functions.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention does not attack its own immune cells, it can be safely used as a medicine without side effects.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention alone does not exert a sufficient antitumor effect because the effector function is reduced. Therefore, it is used in combination with other antitumor agents as described below.
  • the subclass of the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention has been replaced with that derived from IgG4.
  • IgG4 is known as a subclass having a low effector function such as ADCC activity, CDC activity and / or ADCP activity (Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1351-1361). , 1987).
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention introduces a mutation into the heavy chain constant region that further reduces the effector function, that is, a mutation such as substitution of one or more amino acids that reduces ADCC and / or ADCP activity.
  • mutations include the substitution of phenylalanine at position 234 with alanine (F234A) at position 235, as indicated by the EU index by Kabat et al.
  • phenylalanine at position 234 indicated by the Kabat et al. EU index may be referred to as phenylalanine in EU numbering 234.
  • a mutation that promotes the formation of SS bonds between antibody heavy chains is introduced to enhance the stability.
  • Such mutations include the substitution of serine at position 228 by proline by Kabat et al. (S228P) (ANGAL et al., Molecular Immunology, 105-108, 1993). This antibody mutation is called a PRO mutation.
  • IgG4 heavy chain having both FALA and Pro mutations is also referred to as an “IgG4proFALA” type heavy chain, an “IgG4PFALA” type heavy chain, or an “IgG4pf” type heavy chain.
  • the constant region of the antibody heavy chain consists of the CH1, hinge, CH2 and CH3 regions.
  • CH1 has EU indexes 118 to 215, hinge has EU indexes 216 to 230, CH2 has EU indexes 231 to 340, and CH3 has EU indexes 341 to 446.
  • Alanine substituted by phenylalanine at position 234 shown by the EU index by Kabat et al. Is the 253rd alanine of SEQ ID NO: 25 showing the heavy chain amino acid sequence of antibody D13, and SEQ ID NO: 29 showing the heavy chain amino acid sequence of antibody F44.
  • amino acid sequence of the constant region of the “IgG4proFALA” type heavy chain is as follows: an amino acid sequence consisting of amino acid residues 140 to 466 of SEQ ID NO: 25; an amino acid sequence consisting of amino acid residues 139 to 465 of SEQ ID NO: 29; 33 is an amino acid sequence consisting of 33 amino acid residues 144 to 470.
  • human IgG1 has very strong effector functions such as CDC activity via complement fixation and antibody-dependent cytotoxicity activity (Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1351-1361). 1987), when targeting a molecule highly expressed in cancer with a therapeutic antibody, it is used as an IgG format that exhibits a therapeutic effect by promoting the induction of cell death of cancer cells due to cytotoxicity via effector functions ( trastuzumab, rituximab, etc.).
  • IgG1 When IgG1 is used as the isotype of the antibody of the present invention, the effector function can be adjusted by substituting a part of the amino acid residues in the constant region (WO88 / 007089, W094 / 28027, W094 / 29351). reference).
  • IgG1 mutants having reduced effector functions include IgG1 @ LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 @ LAGA (IgG1-L235A, G237A) and the like.
  • an IgG1 heavy chain constant region into which these mutations have been introduced can also be used.
  • human IgG2 has extremely weak effector functions such as CDC activity via complement fixation and antibody-dependent cytotoxicity (Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1351-1361). 1987), which is used as one of the IgG formats to avoid toxicity due to effector function-mediated cytotoxicity when targeting a molecule expressed in a normal organ with a therapeutic antibody (denosumab, evolocumab, brodalumab, etc.). ).
  • the constant region of the antibody of the present invention it is possible to use an IgG2 heavy chain constant region.
  • the anti-SIRP ⁇ antibodies of the present invention bind to human SIRP ⁇ and monkeys (Cynomolgus monkey), but not to mouse SIRP ⁇ .
  • the anti-SIRP ⁇ antibodies of the present invention also include human chimerized antibodies and humanized antibodies that have been modified to reduce their xenoantigenicity to humans. Humanized antibodies are also referred to as CDR-grafted antibodies.
  • Human chimerized antibody refers to an antibody composed of a light chain variable region and a heavy chain variable region of a non-human animal antibody, and a light chain constant region and a heavy chain constant region of a human antibody.
  • a human chimerized antibody is obtained by collecting a cDNA encoding a light chain variable region and a cDNA encoding a heavy chain variable region from a hybridoma producing an anti-SIRP ⁇ antibody, and cDNA encoding the light chain constant region and heavy chain constant region of a human antibody.
  • To construct a human chimerized antibody expression vector by inserting it into an expression vector having
  • the heavy chain constant region is comprised of three domains C H 1, C H 2 and C H 3.
  • the human heavy chain constant region of the chimeric antibody is a heavy chain constant region of the IgG4 subclass, which is a heavy chain constant region having a Pro mutation and a FALA mutation, IgG4proFALA.
  • the light chain constant region may belong to human Ig, and is a ⁇ or ⁇ constant region.
  • human chimeric antibody of the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention examples include a human chimeric antibody having the variable regions of rat anti-human SIRP ⁇ monoclonal antibodies D13, F44 and F63, antibody cD13, antibody cF44 and antibody cF63. These three antibodies have high binding properties to human SIRP ⁇ , and have high inhibitory activity on the binding between SIRP ⁇ and CD47. Among them, antibodies cD13 and cF63 having high activity are preferable.
  • Antibody cD13 The nucleotide sequence of the cDNA encoding the light chain variable region of antibody cD13 is a nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 378 of SEQ ID NO: 22 in the sequence listing (FIG. 17), and the amino acid sequence of the light chain variable region of antibody cD13 Is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing (FIG. 17).
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the heavy chain variable region of antibody cD13 is a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 of SEQ ID NO: 24 in the sequence listing (FIG. 18).
  • the amino acid sequence is an amino acid sequence consisting of the 20th to 139th amino acid residues of SEQ ID NO: 25 in the sequence listing (FIG. 18).
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention comprises a light chain variable region consisting of the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 and an amino acid sequence consisting of amino acid residue 20 to 139 of SEQ ID NO: 25
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 378 of SEQ ID NO: 22 or the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 of SEQ ID NO: 24 and CLUSTAL @ W (alignment tool) and the like has a sequence identity of at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • DNA encoding a protein having the activity of a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody that is, a protein having an activity of binding to human SIRP ⁇ . Included in the DNA encoding the chain variable region.
  • DNA encoding a protein having an activity of a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody may also contain the light chain variable region or the heavy chain variable region of the present invention. Included in the encoding DNA.
  • the above-mentioned light chain variable region or heavy chain variable region consists of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 or an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 of SEQ ID NO: 25. Not only the light chain variable region or heavy chain variable region but also one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2, and more preferably 1 in the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of which is deleted, substituted, or added, the activity of the heavy chain variable region or light chain variable region of the antibody that is, the light chain variable region or heavy chain variable region comprising a protein having an activity of binding to human SIRP ⁇ . Also includes the area.
  • amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 of SEQ ID NO: 25 one or several amino acids are deleted, substituted or added.
  • default parameters at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more. Those having sequence identity can be mentioned.
  • amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 of SEQ ID NO: 25 one or several amino acids are deleted, substituted or added.
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 is substantially the same as the protein having the amino acid sequence of amino acids 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 or the amino acid sequence of amino acids 20 to 139 of SEQ ID NO: 25. is there.
  • the antibody cD13 comprises, as CDRs (complementarity determining regions) of the light chain variable region, CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (GASKSVRTYMH) and amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (SASNLEA) CDRL2, which contains CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (QQSNEPPYT), and further comprises CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (GFTFSDYGMI) as the CDR of the heavy chain variable region; CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence (SISSSSSSYIY) and CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 6 (RYYGFNYPFDY) (FIG. 28).
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (GASKSVRTYMH) and amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (SASNLEA) CDRL
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention contains CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, CDRL2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. Furthermore, CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 as CDRs of the heavy chain variable region. Antibodies.
  • Each of the above-mentioned CDRs is obtained from an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several, preferably one or two, and more preferably one amino acid has been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by each. CDRs.
  • Chimeric or humanized D13 antibody binds to the SIRP ⁇ variant consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, but does not bind to the SIRP ⁇ variant consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74 or 75.
  • the NQKEG sequence (SEQ ID NO: 76) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 is replaced with the NQKEE sequence (SEQ ID NO: 77) in SEQ ID NO: 74, and the SFTEG sequence (SEQ ID NO: 80) in SEQ ID NO: 75, It turned out that the NQKEG sequence (SEQ ID NO: 76) was required for binding of the chimeric or humanized D13 antibody to SIRP ⁇ .
  • antibody cD13 shows that amino acid residues Gln82, Lys83, Glu84, Gly85, His86, and Phe87 of human SIRP ⁇ variant 2 represented by SEQ ID NO: 57 (the position of each amino acid residue is (Corresponding to SEQ ID NO: 57), and it is suggested to bind to SIRP ⁇ , and the sequence consisting of Gln82, Lys83, Glu84, and Gly85 corresponds to the QKEG portion in the NQKEG sequence. Therefore, the NQKEG sequence is an epitope essential for binding of the D13 antibody to human SIRP ⁇ .
  • An antibody that specifically recognizes the NQKEG sequence (SEQ ID NO: 76), that is, binds to, but does not have, a SIRP ⁇ mutant consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 having the NQKEG sequence (SEQ ID NO: 76)
  • SEQ ID NO: 76 an antibody that does not bind to the SIRP ⁇ variant consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74 or 75.
  • Antibody cF44 The nucleotide sequence of the cDNA encoding the light chain variable region of antibody cF44 is a nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 381 of SEQ ID NO: 26 in the sequence listing (FIG. 19), and the amino acid sequence of the light chain variable region of antibody cF44 Is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing (FIG. 19).
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the heavy chain variable region of antibody cF44 is a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 414 of SEQ ID NO: 28 in the sequence listing (FIG. 20).
  • the amino acid sequence is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 138 of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing (FIG. 20).
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 138 of SEQ ID NO: 29
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 381 of SEQ ID NO: 26 or a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 414 of SEQ ID NO: 28 and CLUSTAL @ W (alignment tool) and the like has a sequence identity of at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • DNA encoding a protein having the activity of a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody that is, a protein having an activity of binding to human SIRP ⁇ . Included in the DNA encoding the chain variable region.
  • DNA encoding a protein having an activity of a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody may also contain the light chain variable region or the heavy chain variable region of the present invention. Included in the encoding DNA.
  • the above light chain variable region or heavy chain variable region consists of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 or an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 138 of SEQ ID NO: 29. Not only the light chain variable region or heavy chain variable region but also one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2, and more preferably 1 in the amino acid sequence.
  • amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 138 of SEQ ID NO: 29 one or several amino acids are deleted, substituted or added.
  • default parameters at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more. Those having sequence identity can be mentioned.
  • amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 138 of SEQ ID NO: 29 one or several amino acids are deleted, substituted or added.
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 is substantially the same as the protein having the amino acid sequence of amino acids 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 or the amino acid sequence of amino acids 20 to 138 of SEQ ID NO: 29. is there.
  • the antibody cF44 comprises, as CDRs (complementarity determining regions) of the light chain variable region, CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (KASKSISKYLA) and amino acid sequence consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (SGSTLQS).
  • CDRL2 comprising CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (QQHNEYPPT), and CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (GFTFSNYYMA) as the CDR of the heavy chain variable region; CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence (YITTGGGSTY) represented by SEQ ID NO: 12 and CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (ANYGGSYFDY) (FIG. 29).
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention contains CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, CDRL2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9. Furthermore, CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 as CDRs of the heavy chain variable region. Antibodies.
  • Each of the above-mentioned CDRs is obtained from an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several, preferably one or two, and more preferably one amino acid has been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by each. CDRs.
  • Antibody cF63 The nucleotide sequence of the cDNA encoding the light chain variable region of antibody cF63 is a nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 390 of SEQ ID NO: 30 in the sequence listing (FIG. 21), and the amino acid sequence of the light chain variable region of antibody F63 Is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing (FIG. 21).
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the heavy chain variable region of antibody cF63 is a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 429 of SEQ ID NO: 32 in the sequence listing (FIG. 22).
  • the amino acid sequence is an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 143 of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing (FIG. 22).
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 143 of SEQ ID NO: 33
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 390 of SEQ ID NO: 30 or a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 429 of SEQ ID NO: 32 and CLUSTAL @ W (alignment tool) and the like has a sequence identity of at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • DNA encoding a protein having the activity of a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody that is, a protein having an activity of binding to human SIRP ⁇ . Included in the DNA encoding the chain variable region.
  • DNA encoding a protein having an activity of a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody may also contain the light chain variable region or the heavy chain variable region of the present invention. Included in the encoding DNA.
  • the above light chain variable region or heavy chain variable region comprises an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 or an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 143 of SEQ ID NO: 33.
  • the light chain variable region or heavy chain variable region not only the light chain variable region or heavy chain variable region but also one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2, and more preferably 1 in the amino acid sequence
  • amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 143 of SEQ ID NO: 33 one or several amino acids are deleted, substituted or added.
  • default parameters at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more. Those having sequence identity can be mentioned.
  • amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 143 of SEQ ID NO: 33 one or several amino acids are deleted, substituted or added. Is substantially the same as the protein having the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 or the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 143 of SEQ ID NO: 33. is there.
  • the antibody cF63 comprises, as CDRs (complementarity determining regions) of the light chain variable region, CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 (ERSSGDIGDSYVS) and amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (ADDQRPS).
  • CDRL2 which contains CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 (QSYDSKIDI), and further comprises CDRs of the heavy chain variable region, CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (GFSLASYSLS), SEQ ID NO: 17 CDRH2 consisting of the amino acid sequence (RMYYDGDTA) represented by CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (DRSMFGGTDYPHWYFDF) (FIG. 30).
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention contains CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, CDRL2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. Further, as CDRs of the heavy chain variable region, CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 Antibodies.
  • Each of the above-mentioned CDRs is obtained from an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several, preferably one or two, and more preferably one amino acid has been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by each. CDRs.
  • Humanized antibody The humanized antibody (CDR-grafted antibody) is obtained by converting the amino acid sequences of the CDRs of the light chain variable region and heavy chain variable region of an antibody of a non-human animal into the appropriate light chain variable region and heavy chain variable region of a human antibody. Refers to the antibody implanted at the location.
  • the humanized anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention binds to human SIRP ⁇ , and inhibits the binding of SIRP ⁇ to CD47, thereby increasing the phagocytic activity of macrophages.
  • Encodes the variable region obtained by grafting the amino acid sequences of the CDRs of the light chain variable region and the heavy chain variable region of the antibody in the framework (FR: frame @ work) region of the light chain variable region and the heavy chain variable region of any human antibody cDNA is constructed, inserted into an expression vector for animal cells having genes encoding the light chain constant region and heavy chain constant region of a human antibody, respectively, to construct a humanized antibody expression vector, and expressed by introducing into an animal cell And can be manufactured.
  • a DNA sequence designed to link the CDR of the antibody D13, F44 or F63 with the framework region of the human antibody may be synthesized.
  • the framework regions of the human antibody linked via the CDRs are selected so that the CDRs form a good antigen-binding site.
  • amino acids of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the CDRs of the humanized antibody form an appropriate antigen-binding site.
  • the preparation of a humanized antibody into which CDR has been grafted can be performed by a known CDR grafting technique.
  • the heavy chain of the humanized antibody having CDRs of the heavy chain variable region of the antibody D13 (six CDRs consisting of the amino acids shown in SEQ ID NOs: 1 to 6), wherein a part of the framework region of the variable region
  • the heavy chains in which the amino acids are substituted include humanized antibody heavy chain hH1 and humanized antibody heavy chain hH2.
  • the light chain of a humanized antibody having CDRs of the light chain variable region of the antibody D13, wherein the light chain in which some amino acids of the framework region of the variable region have been substituted is a humanized antibody light chain hL2, human Light chain hL3 and humanized antibody light chain hL4.
  • the full length nucleotide sequence of the humanized antibody heavy chain hH1 is shown in SEQ ID NO: 40, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 41.
  • the full length nucleotide sequence of the humanized antibody heavy chain hH2 is shown in SEQ ID NO: 42, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 43.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 is a signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 is a variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 418 to 1398 is a constant region.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 is a variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 140 to 466 is Is the amino acid sequence of the constant region.
  • FIG. 11 shows a comparison of the amino acid sequences (including the signal sequence) of the heavy chain variable region of the antibody D13, the variable region of the humanized antibody heavy chain hH1, and the variable region of the humanized antibody heavy chain hH2.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention includes an antibody having a heavy chain variable region consisting of amino acid residues 20 to 139 and a heavy chain constant region consisting of amino acid residues 140 to 466 of SEQ ID NO: 41 or 43.
  • the full length nucleotide sequence of the humanized antibody light chain hL2 is shown in SEQ ID NO: 34, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the full length nucleotide sequence of the humanized antibody light chain hL3 is shown in SEQ ID NO: 36, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 37.
  • the full length nucleotide sequence of the humanized antibody light chain hL4 is shown in SEQ ID NO: 38, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 39.
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 is a signal sequence
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 381 is a variable region
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 382 to 702 is Each constant region is encoded.
  • amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is a signal sequence
  • amino acid sequence consisting of the 21st to 127th amino acid residues is the variable region
  • the 128th to 234th amino acid residues are Is the amino acid sequence of the constant region.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention includes an antibody having a variable region consisting of amino acid residues 21 to 127 and a light chain constant region consisting of amino acid residues 128 to 234 of SEQ ID NOS: 35, 37 and 39.
  • the heavy chain constant region of the humanized antibody is a heavy chain constant region of the IgG4 subclass, which is a heavy chain constant region IgG4proFALA having a Pro mutation and a FALA mutation.
  • An antibody having a high binding activity to human SIRP ⁇ and having a high inhibitory activity on the binding between SIRP ⁇ and CD47 an antibody comprising a humanized antibody heavy chain hH1 and a humanized antibody light chain hL3 (hD13_H1L3 antibody), (HD13_H1L4 antibody), an antibody consisting of a humanized antibody heavy chain hH2 and a humanized antibody light chain hL2 (hD13_H2L2 antibody), and a humanized antibody heavy chain hH2 and a humanized antibody light chain
  • An antibody consisting of hL3 (hD13_H2L3 antibody) is included.
  • HD13_H1L3 antibody is an antibody having a heavy chain consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 41 and a light chain consisting of amino acid residues 21 to 234 of SEQ ID NO: 37.
  • HD13_H1L4 antibody is an antibody having a heavy chain consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 41 and a light chain consisting of amino acid residues 21 to 234 of SEQ ID NO: 39.
  • HD13_H2L2 antibody is an antibody having a heavy chain consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 43 and a light chain consisting of amino acid residues 21 to 234 of SEQ ID NO: 35.
  • HD13_H2L3 antibody is an antibody having a heavy chain consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 43 and a light chain consisting of amino acid residues 21 to 234 of SEQ ID NO: 37.
  • the present invention also includes antibodies in which the lysine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain has been deleted.
  • the antibody of the present invention may be an antigen-binding fragment of an antibody having an antigen-binding portion of the antibody or a modified product thereof.
  • a fragment of the antibody can be obtained by treating the antibody with a protease such as papain or pepsin, or by modifying the antibody gene by a genetic engineering technique and expressing it in a suitable cultured cell.
  • a fragment retaining all or a part of the functions of the full-length antibody molecule can be referred to as an antigen-binding fragment of the antibody.
  • the functions of antibodies generally include antigen-binding activity, activity to neutralize antigen activity, activity to enhance antigen activity, antibody-dependent cytotoxic activity, complement-dependent cytotoxic activity, and complement-dependent activity. Cellular cytotoxic activity can be mentioned.
  • the function retained by the antigen-binding fragment of the antibody in the present invention is the binding activity to SIRP ⁇ .
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, variable region (Fv), or single chain Fv (scFv) in which heavy and light chain Fvs are linked by an appropriate linker, and diabody (diabodies).
  • Fab which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F (ab') 2 under reducing conditions is also included in the antibody fragment.
  • the antibody of the present invention may be a multispecific antibody having specificity for at least two different antigens. Usually such molecules bind to two types of antigens (ie, bispecific antibodies), but "multispecific antibodies" in the present invention include more (e.g., three types). Antibodies having specificity for the above antigens.
  • a multispecific antibody of the invention may be a full-length antibody, or a fragment of such an antibody (eg, an F (ab ') 2 bispecific antibody).
  • a bispecific antibody can be prepared by combining the heavy chain and the light chain (HL pair) of two types of antibodies, or can be produced by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies. It can also be produced by producing cells (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539).
  • the antibody of the present invention may be a single-chain antibody (also referred to as scFv).
  • Single-chain antibodies are obtained by linking the heavy and light chain variable regions of the antibody with a polypeptide linker (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg and Moore, Ed., Springer, N.W. York, p. 269-315 (1994), Nature @ Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136)
  • a BiscFv fragment prepared by linking two scFvs with a polypeptide linker is used as a bispecific antibody. Can also be used.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked via a linker that does not form a conjugate, preferably a polypeptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1988), 85, p.5879-5883).
  • the heavy and light chain variable regions in an scFv may be derived from the same antibody or from different antibodies.
  • the polypeptide linker connecting the variable regions any single-chain peptide consisting of, for example, 12 to 19 residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the antibody heavy chain or heavy chain variable region, and a DNA encoding the light chain or light chain variable region.
  • amplification is performed by PCR using primer pairs defining both ends thereof, and then the DNA encoding the polypeptide linker portion, and both ends thereof are linked to the heavy and light chains, respectively. And amplification by combining the primer pairs specified in (1).
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • the scFv can be obtained according to the method.
  • These antibody fragments can be obtained and expressed in the same manner as described above, and can be produced by a host.
  • the antibodies of the present invention may be those that have been multiplied to increase the affinity for the antigen.
  • the antibody to be multimerized may be one kind of antibody or a plurality of antibodies recognizing a plurality of epitopes of the same antigen. Methods for multiplying the antibody include binding of the IgG CH3 domain to two scFvs, binding to streptavidin, introduction of a helix-turn-helix motif, and the like.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody that is a mixture of a plurality of types of anti-SIRP ⁇ antibodies having different amino acid sequences.
  • a mixture of a plurality of types of antibodies having different CDRs can be given.
  • an antibody purified from a culture of a mixture of cells producing different antibodies can be used (see WO 2004/061104).
  • an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the antibodies of the present invention may be those in which these antibodies and other drugs form a conjugate (Immunoconjugate).
  • examples of such an antibody include those in which the antibody is bound to a radioactive substance or a compound having a pharmacological action (Nature @ Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
  • a method is also known in which the full-length sequences of the heavy and light chains of an antibody are linked using an appropriate linker to obtain a single-chain immunoglobulin (Lee, HS, et. al., Molecular @ Immunology (1999) 36, pp. 61-71; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4).
  • a single-chain immunoglobulin Lee, HS, et. al., Molecular @ Immunology (1999) 36, pp. 61-71; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4.
  • the antibody of the present invention may be an antibody having a single heavy chain variable region and no light chain sequence.
  • Such an antibody is called a single domain antibody (sdAb) or a nanobody (nanobody), and is actually observed in camels or llamas and reported to have retained antigen-binding ability.
  • sdAb single domain antibody
  • nanobody nanobody
  • the above antibody can be interpreted as a kind of the antigen-binding fragment of the antibody in the present invention.
  • the antibody of the present invention is obtained by inserting a DNA encoding a heavy chain variable region or a DNA encoding a light chain variable region into an expression vector, transforming a host cell for expression using the vector, By culturing the cells, the cells can be produced as recombinant antibodies.
  • the DNA encoding the antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the heavy chain variable region and the DNA encoding the heavy chain constant region to obtain a DNA encoding the heavy chain, and further combining the DNA encoding the light chain variable region with the DNA encoding the light chain variable region.
  • the DNA encoding the light chain is obtained by ligating the DNA encoding the chain constant region.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention is produced by inserting the DNA encoding the heavy chain and the DNA encoding the light chain into an expression vector, transforming a host cell with the vector, and culturing the host cell. Can be done. At this time, the DNA encoding the heavy chain and the DNA encoding the light chain may be introduced into the same expression vector, and a host cell may be transformed using the vector, or the DNA encoding the heavy chain and the DNA encoding the light chain may be transformed. The DNAs encoding the strands may be inserted into separate vectors, and the two cells may be used to transform host cells.
  • the DNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region may be introduced into a vector into which the DNA encoding the heavy chain constant region and the DNA encoding the light chain constant region have been introduced in advance.
  • the vector may contain DNA encoding a signal peptide that promotes secretion of the antibody from the host cell.
  • the DNA encoding the signal peptide and the DNA encoding the antibody are ligated in frame. deep.
  • the antibody can be obtained as a mature protein by removing the signal peptide after the antibody has been produced.
  • DNA encoding the heavy chain variable region, the DNA encoding the light chain variable region, the DNA encoding the heavy chain variable region and the DNA encoding the heavy chain constant region, and the light chain variable region are encoded.
  • DNA obtained by linking DNA and DNA encoding the light chain constant region may be operatively linked to elements such as promoter, enhancer, and polyadenylation signal.
  • “functionally linked” means that elements are linked so as to perform their functions.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can be replicated in a host such as an animal cell, a bacterium, or a yeast, and examples thereof include known plasmids and phages.
  • Examples of the vector used for the construction of the expression vector include pcDNA (trademark) (ThermoFisher @ SCIENTIFIC), Flexi (registered trademark) vector (Promega), pUC19, pUEX2 (Amersham), pGEX-4T, pKK233-2 ( Pharmacia), pMAM-neo (Clontech) and the like.
  • Prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis and eukaryotic cells such as yeast and animal cells can be used as host cells, but eukaryotic cells are preferably used.
  • HEK293 cells Chinese hamster / ovary (CHO) cells, which are human embryonic kidney cell lines, may be used as animal cells.
  • the expression vector may be introduced into a host cell by a known method, and the host cell may be transformed. For example, electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like can be mentioned.
  • the produced antibody can be purified using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, affinity chromatography, other chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. may be appropriately selected and combined.
  • the present invention includes an antitumor agent containing the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the heavy chain constant region of the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention is a heavy chain constant region of the IgG4 subclass, which is a heavy chain constant region having a Pro mutation and a FALA mutation, IgG4proFALA, and has no effector function. It has only the function of inhibiting "Don't-eat-me" signal transmission by inhibiting the binding of CD47 to CD47. Therefore, tumor cells cannot be sufficiently damaged only by the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention.
  • the present invention is used in combination with another antitumor agent having an effector function and capable of attacking and damaging a tumor cell, or another antitumor agent inhibiting an immune checkpoint of an immune cell by a tumor cell.
  • Other antitumor agents used in combination can bind to tumor cells and contact the tumor cells with phagocytic cells such as macrophages.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention inhibits the binding of tumor cells to CD47 and phagocytic cells by SIRP ⁇ , thereby enhancing the phagocytic ability of phagocytic tumor cells, thereby damaging the tumor cells. That is, by using the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention in combination with another antitumor agent, a synergistic antitumor effect can be exhibited.
  • Examples of the antitumor agent used in combination with the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention include an immune checkpoint inhibitor and an antibody drug which specifically binds to a cancer antigen and has ADCC and / or ADCP activity.
  • Examples of the immune checkpoint inhibitor include a binding inhibitor of PD-1 and its ligand, PD-L1, or a CTLA4 inhibitor, and specifically, anti-PD-1 antibodies (nivolumab, pembrolizumab, cemiprimimab).
  • antibody drugs having ADCC and / or ADCP activity specifically reacting with cancer antigens include anti-CD20 antibody (rituximab), anti-HER2 antibody (trastuzumab), anti-EGFR antibody (cetuximab), and anti-CD52 antibody ( alemutuzumab) and the like.
  • ADCC is a cell in which non-specific cytotoxic cells (eg, NK cells, neutrophils, macrophages, etc.) expressing Fc ⁇ receptors recognize antibodies bound on target cells, and subsequently cause lysis of the target cells Refers to an intervening reaction.
  • NK cells which are the primary cells responsible for ADCC, express Fc ⁇ RIIC and Fc ⁇ RIIIA, and monocytes express Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIC, and Fc ⁇ RIIIA.
  • ADCP refers to a cell-mediated reaction in which phagocytic cells (for example, macrophages, neutrophils, etc.) expressing an Fc receptor recognize an antibody bound on a target cell, and then phagocytose the target cell into the cell.
  • Monocytes which are the primary cells bearing ADCP, express Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIC, and Fc ⁇ RIIIA.
  • the present invention includes an antitumor agent containing an anti-SIRP ⁇ antibody as an active ingredient, which is used in combination with the other antitumor agents described above.
  • the present invention further includes an antitumor agent or kit containing both an antitumor agent containing an anti-SIRP ⁇ antibody as an active ingredient and the above-mentioned other antitumor agent.
  • the antitumor agent containing the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention as an active ingredient and the above-mentioned other antitumor agent may be administered simultaneously or sequentially.
  • the order of administration is not limited, and another antitumor agent may be administered after administration of the antitumor agent containing the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention as an active ingredient.
  • An antitumor agent containing the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention as an active ingredient may be administered.
  • the antitumor agent of the present invention may be one or more selected from carcinoma, sarcoma, lymphoma, leukemia, myeloma, germinoma, brain tumor, carcinoid, neuroblastoma, retinoblastoma, and nephroblastoma.
  • carcinomas include renal, melanoma, squamous cell, basal cell, conjunctival, oral, laryngeal, pharyngeal, thyroid, lung, breast , Esophageal, gastric, duodenal, small intestine, colon, rectal, appendix, anal, liver, gallbladder, bile duct, pancreatic, adrenal , Sarcoma, liposarcoma, angiosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomyosarcoma, Ewing sarcoma, osteosarcoma, undifferentiated polymorphic sarcoma, Mucinous fibrosarcoma, malignant peripheral schwannoma, retroperitoneal sarcoma, synovial sarcoma, uterine sarcoma, gastrointestinal stromal tumor, leiomyosarcoma, epithelioid sarcoma, and the like; lymphomas include B
  • NK cell lymphoma NK cell lymphoma, Hodgkin's lymphoma, etc., and in leukemia, myeloid leukemia, lymphocytic leukemia, bone marrow augmentation Reproductive disease, myelodysplastic syndrome, etc.
  • myeloma includes multiple myeloma, etc.
  • germinoma includes testicular cancer, ovarian cancer, etc.
  • brain tumor includes glioma, Meningioma and the like.
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention enhances cell-mediated immunity when used in combination with other antitumor agents.
  • the present invention also includes a cellular immunity enhancer containing an anti-SIRP ⁇ antibody as an active ingredient.
  • the cell-mediated immunity enhancer enhances cell-mediated immunity accompanying enhancement of the function of natural killer cells and / or T cells.
  • the antitumor agent of the present invention can contain a therapeutically effective amount of an anti-SIRP ⁇ antibody and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, solubilizer, emulsifier, preservative, adjuvant, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier diluent, solubilizer, emulsifier, preservative, adjuvant, and the like.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” and the like can be appropriately selected from a wide range according to the type of target disease and the administration form of the drug.
  • the administration method of the antitumor agent of the present invention can be appropriately selected. For example, it can be administered by injection, and can be locally injected, intraperitoneally, selectively intravenously injected, intravenously injected, subcutaneously injected, injected into organ perfusion, and the like. Can be adopted.
  • the solution for injection can be formulated using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, a mixture of saline and a glucose solution, various buffers and the like.
  • the preparation may be prepared in powder form and mixed with the liquid carrier at the time of use to prepare an injection solution.
  • oral solutions powders, pills, capsules, tablets and the like can be applied.
  • oral liquid preparations such as suspensions and syrups include water, sucrose, sorbitol, saccharides such as fructose, glycols such as polyethylene glycol, sesame oil, soybean oil and the like. It can be produced using oils, preservatives such as alkyl parahydroxybenzoate, flavors such as strawberry flavor, peppermint and the like.
  • Powders, pills, capsules and tablets include lactose, glucose, sucrose, mannitol, etc., excipients such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol. And a binder such as hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin. Tablets and capsules are preferred unit dosage forms in the compositions of the present invention in that they are easy to administer. When manufacturing tablets and capsules, a solid manufacturing carrier is used.
  • the amount of antibody that is effective for treatment depends on the nature of the condition to be treated, the age and condition of the patient, and may be ultimately determined by a physician.
  • the dose is 0.0001 mg to 100 mg per kg of body weight at one time.
  • the predetermined dose may be administered once every 1 to 180 days, or may be administered at appropriate intervals in two, three, four or more divided doses per day.
  • Embodiment 1 Preparation of rat anti-SIRPA antibody 1) -1 Preparation of expression construct 1) -1-1 Construction of SIRPA_V1_ECD expression vector At the C-terminal side of amino acid sequence 1 to 373 of the amino acid sequence of human SIRPA_V1 (ACCESSION number: NP_001035111 in NCBI protein database) SIRPA_V____________________B Coupled using In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH) by combining DNA which codes the polypeptide which linked HHHHHH and the vector pcDNA3.3-TOPO / LaxZ (ThermoFisher SCIENTIFIC) digested with restriction enzymes XbaI and PmeI, and SIRCD_V_ An expression vector was prepared.
  • the amino acid sequence of SIRPA_V1_ECD is shown in SEQ ID NO: 45 in the sequence listing, and the nucleotide sequence encoding SIRPA_V1_ECD is shown in
  • SIRPA_V1_IgV Expression Vector SIRPA_V1 (ACCESSION No. NP_001035111 in the protein database of NCBI) using a DNA encoding a polypeptide having an HHHHHH linked to the C-terminal of the 1st to 149th amino acids of the amino acid sequence 1) -An SIRPA_V1_IgV expression vector was prepared in the same manner as in 1-1.
  • the amino acid sequence of SIRPA_V1_IgV is shown in SEQ ID NO: 47 in the sequence listing, and the nucleotide sequence encoding SIRPA_V1_IgV is shown in SEQ ID NO: 46 in the sequence listing.
  • SIRPA_V2_ECD Expression Vector Polypeptide having HHHHHH ligated to the C-terminal of the 1st to 372nd amino acid sequence of the amino acid sequence of SIRPA_V2 (modified from V1 sequence, JBC Vol. 289, No. 14, 10024 (2014))
  • An SIRPA_V2_ECD expression vector was prepared in the same manner as in 1) -1-1, using DNA encoding the peptide.
  • the amino acid sequence of SIRPA_V2_ECD is shown in SEQ ID NO: 49 in the sequence listing, and the nucleotide sequence encoding SIRPA_V2_ECD is shown in SEQ ID NO: 48 in the sequence listing.
  • SIRPA_V2_IgV was prepared in the same manner as in 1) -1-1 using a DNA encoding a polypeptide having HHHHHH linked to the C-terminal of positions 1 to 148 of the amino acid sequence of SIRPA_V2.
  • An expression vector was prepared.
  • the amino acid sequence of SIRPA_V2_IgV is shown in SEQ ID NO: 51 in the sequence listing, and the nucleotide sequence encoding SIRPA_V2_IgV is shown in SEQ ID NO: 50 in the sequence listing.
  • CSIRPA_ECD expression vector was prepared in the same manner as in 1-1.
  • the amino acid sequence of cSIRPA_ECD is shown in SEQ ID NO: 53 in the sequence listing, and the nucleotide sequence encoding cSIRPA_ECD is shown in SEQ ID NO: 52 in the sequence listing.
  • CD47-Fc Expression Vector Expression of CD47-Fc in the same manner as in 1) -1-1, using a DNA encoding the polypeptide of human CD47 (ACCESSION No. NP_001271679 in the NCBI protein database). The vector was made.
  • the amino acid sequence of CD47-Fc is shown in SEQ ID NO: 55 in the sequence listing, and the nucleotide sequence encoding SIRPA_V1_ECD is shown in SEQ ID NO: 54 in the sequence listing.
  • SIRPA_V1_ECD 1-1-1 was transiently transfected by expression in FreeStyle 293F cells (ThermoFisher SCIENTIFIC). . After adding the culture supernatant to HisTrap Excel (GE Healthcare Japan) equilibrated with 3 ⁇ PBS, the column was washed with 3 ⁇ PBS. Next, elution was carried out with 3 ⁇ PBS, 500 mM Imidazole, pH 7.5. From the collected SIRPA_V1_ECD fraction, SIRPA_V1_ECD was purified using HiLoad 26/600 Superdex 75 pg (GE Healthcare Japan).
  • SIRPA_V1_IgV The SIRPA_V1_IgV expression vector prepared in 1) -1-2 was transiently expressed by transfection into FreeStyle 293F cells (ThermoFisher SCIENTIFIC). After adding the culture supernatant to HisTrap Excel (GE Healthcare Japan) equilibrated with 3 ⁇ PBS, the column was washed with 3 ⁇ PBS. Next, elution was carried out with 3 ⁇ PBS, 500 mM Imidazole, pH 7.5. SIRPA_V1_IgV was purified from the collected SIRPA_V1_IgV fraction using HiLoad 26/600 Superdex 75 pg (GE Healthcare Japan).
  • CD47-Fc was transiently expressed by transfection into FreeStyle 293F cells (ThermoFisher SCIENTIFIC). After all the culture supernatant was put into MabSelectSuRe (GE Healthcare Japan) equilibrated with PBS, the column was washed with PBS. Next, elution was performed with a 2 M arginine hydrochloride solution (pH 4.0), and a fraction containing CD47-Fc was collected. CD47-Fc was purified from the collected CD47-Fc fraction using HiLoad 26/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare Japan).
  • Hybridoma Lymph node cells or spleen cells and mouse myeloma SP2 / 0-ag14 cells were subjected to electric cell fusion using LF301-Cell Fusion Unit (BEX) to produce Clona Cell-HY.
  • the cells were diluted and cultured in Selection Medium D (Stem Cell Technologies).
  • Selection Medium D Selection Medium D (Stem Cell Technologies).
  • the resulting hybridoma colonies were collected to prepare a monoclonal hybridoma. Each of the recovered hybridoma colonies was cultured, and the obtained hybridoma culture supernatant was used to screen for an anti-SIRPA antibody-producing hybridoma.
  • Example 1 After removing the culture supernatant of the expression vector-introduced 293 ⁇ cells prepared in -6-1, hybridoma culture was performed on each of pcDNA3.2 V5-DEST-SIRPA_V1, V2 or pcDNA3.2 V5-DEST-introduced 293 ⁇ cells. The supernatant was added and left at 4 ° C. for 1 hour. The cells in the wells were washed twice with PBS containing 5% FBS, and then added with Anti-Rat IgG-Peroxidase antioxidant induced in rabbit (SIGMA) diluted 500-fold with PBS containing 5% FBS, and added at 4 ° C.
  • SIGMA Anti-Rat IgG-Peroxidase antioxidant induced in rabbit
  • OPD color developing solution OPD dissolving solution (0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogen phosphate.12 water, pH 4.5)
  • OPD dissolving solution 0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogen phosphate.12 water, pH 4.5
  • H2O2 0.4 mg / mL and 0.6% (v / v), respectively
  • the cells in the wells are washed twice with PBS containing 5% FBS, and then washed with an OPD color developing solution (OPD dissolving solution (0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogen phosphate.12 water, pH 4.5)).
  • OPD dissolving solution 0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogen phosphate.12 water, pH 4.5
  • o-Phenylenediamine dihydrochloride manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • H2O2 0. mg / mL and 0.6% (v / v), respectively
  • the color reaction was performed with occasional stirring, and the color reaction was stopped by adding 100 ⁇ L / well of 1M HCl, and then the absorbance at 490 nm was measured using a plate reader (Spectramax: Molecular devices).
  • pcDNA3.2 V5-DEST-SIRPA_V1 or SIRPA_V2 expression was compared with a control medium addition group.
  • Hybridomas producing a culture supernatant exhibiting lower absorbance in the vector-transfected 293 ⁇ cells were selected as positive for production of anti-SIRPA antibody having ligand-binding inhibitory activity.
  • the rat anti-SIRPA monoclonal antibodies D13, F42, F60, and F86 had an isotype of IgG1 / ⁇ chain
  • F44 and F47 had an isotype of IgG2a / ⁇ chain
  • F63 had an isotype of IgG2a / ⁇ chain.
  • the antibody was purified from the culture supernatant of the hybridoma prepared in Example 1) -8-1 by Protein G affinity chromatography.
  • the antibody was adsorbed on a Protein G column (GE Healthcare Bioscience), and the column was washed with PBS and eluted with a 0.1 M glycine / hydrochloric acid aqueous solution (pH 2.7).
  • the buffer is replaced with PBS using Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (fraction molecular weight UF30K, Sartorius).
  • the antibody was concentrated, and the antibody concentration was adjusted to 2 mg / mL or more.
  • the solution was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
  • Embodiment 2 In vitro evaluation of rat anti-human SIRPA antibodies (7 types) 2) -1 Construction of expression vector for screening antigen-binding antibody 2) -1-1 FLAG-human SIRPA expression vector (pFLAG V5-DEST-SIRPA_V1-V10) Construction cDNAs encoding 10 kinds of human SIRPA variant proteins (excerpted from Nature Immunology 8, 1313-1323, 2007) were cloned into pFLAG V5-DEST vector, and vectors pFLAG V5-DEST-SIRPA_V1-V1-expressing each variant protein. V10 was constructed.
  • the amino acid sequence of human SIRPA_V3 is shown in SEQ ID NO: 63 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of human SIRPA_V4 is shown in SEQ ID NO. 64 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of human SIRPA_V5 is shown in SEQ ID NO.
  • the amino acid sequence of human SIRPA_V7 is shown in SEQ ID NO: 67 of the Sequence Listing
  • the amino acid sequence of human SIRPA_V8 is shown in SEQ ID NO: 68 in the Sequence Listing
  • the amino acid sequence of human SIRPA_V9 is shown in SEQ ID NO: 69 in the Sequence Listing
  • amino acid sequence of human SIRPA_V2_IgV is shown in SEQ ID NO: 71 in the sequence listing, and the amino acid of human SIRPA_V2_IgV_IgC1 is shown in SEQ ID NO: 72 in the sequence listing.
  • the SIRPA mutant in which the SFTGE sequence consisting of amino acid residues 81 to 85 of SEQ ID NO: 60 (SEQ ID NO: 78) was substituted with the NQKEE sequence (SEQ ID NO: 77) was named hmSIRPA_ ⁇ 1.
  • a SIRPA mutant in which the SFTGE sequence (SEQ ID NO: 78) consisting of amino acid residues 81 to 85 of mouse SIRPA described in SEQ ID NO: 60 was substituted with the SFTEG sequence (SEQ ID NO: 80) was named hmSIRPA_ ⁇ 2.
  • CDNAs encoding these SIRPA mutants were cloned into the pFLAG V5-DEST vector, and vectors expressing the respective SIRPA mutants were constructed.
  • the amino acid sequence of hmSIRPA_ ⁇ 0 is shown in SEQ ID NO: 73 of the sequence listing
  • the amino acid of hmSIRPA_ ⁇ 1 is shown in SEQ ID NO: 74 of the sequence listing
  • the amino acid of hmSIRPA_ ⁇ 2 is shown in SEQ ID NO: 75 of the sequence listing.
  • hD13_H1L3, hD13_H1L4h, hD13_H2L2, hD13_H2L3, or cD13 showed antibody concentration-dependent binding to hmSIRPA_ ⁇ 0 having an NQKEG sequence, but ⁇ 1 and ⁇ 2 No binding was shown at any concentration. From the above, it was suggested that the sequence of NQKEG was required for binding of hD13 and cD13.
  • the buffer was replaced with 10 mM Tris HCl (pH 8.2) by filtration and concentrated to 3 g / L.
  • the complex solution was crystallized by a vapor diffusion method.
  • a solution obtained by adding an equal volume of a precipitant solution (0.2 M Potassium phosphate dibasic, 20% (w / v) Polyethylene Glycol 3350, pH 9.2) to 0.5 ⁇ L of the protein solution is added to 0.05 mL of the precipitant solution.
  • the two solutions were placed in a sealed container so that they did not touch each other, and allowed to stand at 25 ° C. After one week, rod-like crystals of 0.2 mm ⁇ 0.2 mm ⁇ 0.05 mm were obtained.
  • the obtained crystals were immersed in a solution obtained by diluting the precipitant solution with Glycol by about 1.4 times, and subsequently frozen with liquid nitrogen.
  • X-ray diffraction data were collected at the beamline PF BL-17A at the synchrotron radiation facility Photon Factory (Tsukuba).
  • the diffraction intensity was quantified from the obtained diffraction image using software XDS (Max Plan Institute for Medical Research) to determine the crystal structure factor.
  • FIG. 2 shows the ribbon model and the surface of the whole complex
  • FIG. 3 shows the interaction between human SIRPA before and after beta5 (A) and after beta5 (B) and cD13.
  • PKH26 Linker As a labeling solution to 10 ⁇ M with Diluent C, an equal amount of the PKH26 Linker solution was mixed with the cell suspension and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. 25 mL of RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) was added, washed twice, and then resuspended to 2 ⁇ 10 6 cells / mL was used as target cells.
  • Example 2) -6-3 Preparation of effector cells
  • the PBMC cells prepared in Example 2) -6-2 were prepared at 5 ⁇ 10 7 cells / mL by RoboSep buffer (manufactured by STEMCELL). 50 ⁇ L of EasySep Human Monochrome enrichment cocktail attached to Human Monochrome Enrichment Kit With CD16 Depletion (manufactured by STEMCELL) was added per 1 mL of PBMC cell suspension. After the reaction at 4 ° C. for 10 minutes, 50 ⁇ L of EasySep Magnetic Particles was added per 1 mL of PBMC cell suspension. After reacting at 4 ° C.
  • the cells were cultured at 37 ° C. under the conditions of 5% CO 2 for 10 days. The culture supernatant was removed, and a 10% FBS-containing RPMI1640 medium (manufactured by Life Technology) containing 10 ng / mL IL-10 and 10 ng / mL M-CSF (manufactured by PEPROTEC) was added, followed by further culturing for 2 days. Twelve days later, TrypLE Express (manufactured by Life Technology) was added to the differentiation-induced macrophages, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 40 minutes, and then separated. A 10% FBS-containing RPMI1640 medium (manufactured by Life Technology) was added and washed twice. After washing twice, the cells were resuspended in a 10% FBS-containing RPMI1640 medium (manufactured by Life Technology) at 5 ⁇ 10 5 cells / mL. Used as cells.
  • e0137345 prepared based on US2015183874), TTI-621 (prepared based on human SIRPA-Fc: WO2014 / 094122) or 50 ⁇ L / well of various control IgG.
  • an RPMI1640 medium containing 10% FBS manufactured by Life Technology
  • the RPMI1640 medium containing 10% FBS manufactured by Life Technology
  • Trastuzumab (Roche) was added at 50 ⁇ L / well.
  • Example 2 After adding 1 ⁇ 10 6 cells / mL and 50 ⁇ L / well of the effector cells prepared in -6-3, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. and 5% CO 2 for 16 hours. After centrifugation at 1200 rpm for 4 minutes at 4 ° C. and removal of the supernatant, the plate was washed with 200 ⁇ L / well of PBS containing 5% FBS. To the cells, 45 ⁇ L / well of PBS containing 5% FBS and 5 ⁇ L / well of APC human CD11b (manufactured by Becton Dickison) were added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes.
  • Cells that became positive (B) in both APC and PE were defined as those in which the target cells were phagocytosed by macrophages.
  • the cell phagocytosis rate by ADCP activity was calculated by the following equation.
  • Cell phagocytosis rate (%) B / (A + B) ⁇ 100
  • the rat anti-human SIRPA antibody alone exhibited lower ADCP activity compared to Hu5F9G4 (anti-human CD47 antibody) and TTI-621 (human SIRPA-Fc) against the CD47-positive human gastric cancer cell line AGS. (FIG. 5A).
  • Embodiment 3 Analysis of nucleotide sequence and determination of amino acid sequence of variable region cDNA of rat anti-SIRPA antibody (D13, F44, F63) 3) -1 Analysis of nucleotide sequence of cDNA of variable region of D13 and determination of amino acid sequence 3) -1-1 D13 Preparation of Total RNA of Produced Hybridoma To amplify the cDNA encoding the variable region of D13, total RNA was prepared from the D13-produced hybridoma using TRIzol Reagent (Ambion).
  • Example 3 3) -1-2 Analysis of nucleotide sequence of amino acid sequence of cDNA of light chain variable region of D13 by 5′-RACE PCR and determination of amino acid sequence Amplification of cDNA encoding light chain variable region is described in Example 3) -1-1. Approximately 1 ⁇ g of the prepared total RNA and SMARTER RACE 5 ′ / 3 ′ Kit (Clontech) were used. UPM (Universal Primer A Mix: attached to SMARTer RACE 5 '/ 3' Kit) and a known rat light chain constant region were used as primers for amplifying the cDNA encoding the variable region of the D13 light chain gene by PCR. The primers designed from the above sequence were used.
  • the cDNA encoding the variable region of the light chain amplified by 5′-RACE PCR was cloned into a plasmid, and then the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain was sequenced.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain of D13 encoded by the determined nucleotide sequence of the cDNA corresponds to the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing.
  • the amino acid sequences of CD13, CDRL2, and CDRL3 of D13 are shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing.
  • the amino acids of these CDRs are also shown in FIG.
  • the amino chain sequence of each CDR is defined by the definition of AbM (Martin, ACR, Cheetham, JC and Rees, AR (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268- 9272).
  • Example 3 3) -1-3 Analysis of nucleotide sequence of cDNA of heavy chain variable region of D13 by 5'-RACE PCR and determination of amino acid sequence Amplification of cDNA encoding heavy chain variable region was performed in Example 3) -1-1. Approximately 1 ⁇ g of the prepared total RNA and SMARTER RACE 5 ′ / 3 ′ Kit (Clontech) were used. UPM (Universal Primer A Mix: attached to SMARTer RACE 5 '/ 3' Kit) and a known rat heavy chain constant region were used as primers for amplifying the cDNA encoding the variable region of the D13 heavy chain gene by PCR. The primers designed from the above sequence were used.
  • the cDNA encoding the variable region of the heavy chain amplified by 5'-RACE PCR was cloned into a plasmid, and then the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain was sequenced.
  • the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of D13 encoded by the determined nucleotide sequence of the cDNA corresponds to the amino acid sequence consisting of the 20th to 139th amino acid residues of SEQ ID NO: 25 in the sequence listing.
  • the amino acid sequences of CDRH1, CDRH2, and CDRH3 of D13 are shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 in the sequence listing. The amino acid sequences of these CDRs are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain of F44 encoded by the determined nucleotide sequence of the cDNA corresponds to the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of F44 encoded by the determined nucleotide sequence of the cDNA corresponds to the amino acid sequence consisting of the 20th to 138th amino acid residues of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing.
  • CD44, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, and CDRH3 of F44 are shown in SEQ ID NOs: 7 to 12 in the sequence listing. The amino acid sequences of these CDRs are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain of F63 encoded by the determined nucleotide sequence of the cDNA corresponds to the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of F63 encoded by the determined nucleotide sequence of the cDNA corresponds to the amino acid sequence consisting of the 20th to 143rd amino acid residues of SEQ ID NO: 33.
  • the amino acid sequences of F63 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, and CDRH3 are shown in SEQ ID NOs: 13 to 18 in the sequence listing. The amino acid sequences of these CDRs are also shown in FIG.
  • Embodiment 4 Preparation of human chimerized anti-SIRPA antibodies (cD13, cF44, cF63) 4) -1 Construction of human chimerized and humanized ⁇ -type light chain expression vector pCMA-LK And a DNA fragment containing a human light chain signal sequence shown in SEQ ID NO: 19 and a DNA sequence encoding a human kappa chain constant region represented by SEQ ID NO: 19, and an In-Fusion HD PCR cloning kit ( (Clontech) to produce pcDNA3.3 / LK.
  • pCMA-LK was constructed by removing the neomycin expression unit from pcDNA3.3 / LK.
  • the nucleotide sequence encoding the cD13 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 encodes a signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 encodes a variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 418 to 1398 encodes a constant region.
  • the amino acid sequence of cD13 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing.
  • amino acid sequence consisting of amino acids 1 to 19 is in the signal sequence
  • amino acid sequence consisting of amino acids 20 to 139 is in the variable region
  • amino acid sequence consisting of amino acids 140 to 466 is in the constant region.
  • sequences of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 are also shown in FIG.
  • cD13 Light Chain Expression Vector Using the cDNA encoding the variable region of D13 light chain obtained in Example 3) -1 as a template, PCR was performed with primers designed for In-fusion cloning. As a result, a DNA fragment containing cDNA encoding the variable region of the light chain was amplified.
  • a cD13 light chain expression vector was constructed by inserting an amplified DNA fragment into the site where pCMA-LK was cut with the restriction enzyme BsiWI, using an In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech). The nucleotide sequence encoding the cD13 light chain is shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 encodes a signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 378 encodes a variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 379 to 699 encodes a constant region, respectively.
  • the amino acid sequence of the cD13 light chain is shown in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 126 is in the variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 127 to 233 is in the constant region.
  • the sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 are also shown in FIG.
  • Example 4 -5 Construction of cF44 Expression Vector 4) -5-1 Construction of cF44 IgG4proFALA Type Heavy Chain Expression Vector Using the cDNA encoding the variable region of the F44 heavy chain obtained in Example 3) -2 as a template, Example 4) A cF44 heavy chain expression vector was constructed in the same manner as in 4-1. The nucleotide sequence encoding the cF44 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 encodes the signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 414 encodes the variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 415 to 1395 encodes the constant region, respectively.
  • the amino acid sequence of cF44 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acids 20 to 138 is in the variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acids 139 to 465 is in the constant region.
  • the sequences of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 are also shown in FIG.
  • cF44 light chain expression vector Using the cDNA encoding the variable region of the F44 light chain obtained in Example 3) -2 as a template, the same method as in Example 4) -4-2 Constructed a cF44 light chain expression vector.
  • the nucleotide sequence encoding the cF44 light chain is shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 encodes a signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 381 encodes a variable region
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 382 to 702 encodes a constant region. .
  • the amino acid sequence of cF44 light chain is represented by SEQ ID NO: 27 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 127 is in the variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 128 to 234 is in the constant region.
  • the sequences of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 are also shown in FIG.
  • Example 4 -6 Construction of Expression Vector for cF63 4) -6-1 Construction of IgG4proFALA-Type Heavy Chain Expression Vector for cF63 Using the cDNA encoding the variable region of the F63 heavy chain obtained in Example 3) -3 as a template, Example 4) A cF63 heavy chain expression vector was constructed in the same manner as in 4-1. The nucleotide sequence encoding the cF63 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 encodes the signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 429 encodes the variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 430 to 1410 encodes the constant region, respectively.
  • the amino acid sequence of cF63 heavy chain is represented by SEQ ID NO: 33 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acids 20 to 143 is in the variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acids 144 to 470 is in the constant region.
  • the sequences of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 are also shown in FIG.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 encodes the signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 390 encodes the variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 391 to 708 encodes the constant region, respectively.
  • the amino acid sequence of cF63 light chain is shown in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 130 is in the variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 131 to 236 is in the constant region.
  • the sequences of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 are also shown in FIG.
  • -7-2 Purification of cD13, cF44 and cF63 Antibodies were purified from the culture supernatant obtained in Example 4) -7-1 in one step of rProtein A affinity chromatography.
  • the culture supernatant was applied to a column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) packed with MabSelectSuRe equilibrated with PBS, and then the column was washed with twice or more the column volume of PBS. Next, elution was carried out with a 2M arginine hydrochloride solution (pH 4.0), and the fraction containing the antibody was collected.
  • the fraction was subjected to buffer replacement with PBS ( ⁇ ) by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette).
  • the antibody was concentrated with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (fraction molecular weight UF10K, Sartorius), and the IgG concentration was adjusted to 10 mg / mL or more.
  • the solution was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
  • Embodiment 5 In vitro evaluation of human chimerized anti-SIRPA antibodies (cD13, cF44, cF63) 5) -1 Evaluation of binding activity to human SIRPA 5) -1-1 Evaluation of binding activity to human SIRPA (Cell-ELISA) 293 ⁇ cells [described in Example 1) -6 were prepared at 5 ⁇ 10 5 cells / mL in DMEM medium containing 10% FBS.
  • pFLAG V5-DEST-SIRPA_V1, V2 or pFLAG V5-DEST was introduced using Lipofectamine LTX (manufactured by Invitrogen), and 100 ⁇ L was dispensed into a 96-well plate (manufactured by Corning), followed by 10 ⁇ L.
  • the cells were cultured in a DMEM medium containing 37% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2 overnight. The obtained transfected cells were used in Cell-ELISA while keeping the adhered state.
  • cD13 IgG2, IgG4pf
  • cF44 IgG1, IgG2
  • pFLAG V5-DEST-SIRPA_V1, V2 or pFLAG V5-DEST transfected cells, respectively.
  • IgG4p, IgG4pf) and cF63 (IgG2, IgG4pf) antibodies were added at a final concentration of 0 to 10000 ng / mL, 50 ⁇ L / well, and allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour.
  • OPD color developing solution OPD dissolving solution (0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogen phosphate / 12 water, pH 4.5)
  • OPD dissolving solution 0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogen phosphate / 12 water, pH 4.5
  • H 2 O 2 0.4 mg / mL and 0.6% (v / v) dissolved respectively
  • the color reaction was performed with occasional stirring, and the color reaction was stopped by adding 100 ⁇ L / well of 1M HCl, and then the absorbance at 490 nm was measured with a plate reader (ARVO: PerkinElmer).
  • ARVO PerkinElmer
  • the binding of the human chimeric anti-human SIRPA antibody to each construct was normalized based on the expression of the FLAG tag. As shown in FIG. 6, the cD13, cF44, and cF63 antibodies bound to both SIRPA_V1 and SIRPA_V2 (FIGS. 6A and B), and the binding was almost the same between each isotype (FIGS. 6C and D).
  • the binding activity to monkey SIRPA was evaluated in the same manner as the binding activity to human SIRPA. As shown in FIG. 7, the cD13, cF44 and cF63 antibodies showed binding to monkey SIRPA.
  • cD13 IgG2, IgG4pf
  • cF44 four constant regions of IgG1, IgG2, IgG4p, IgG4pf
  • cF63 IgG2, IgG4pf
  • an RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) was added in an amount of 50 ⁇ L / well, and in the combined group, the RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) was diluted to a final concentration of 400 ng / mL.
  • Rituximab (manufactured by Zenyaku Kogyo) was added at 50 ⁇ L / well.
  • ADCP activity was evaluated in the same manner as in 2-6-4. As shown in FIG.
  • PBMC prepared by the method of Example 5) -4-2 or macrophages (50 ⁇ L / well) were added to a 96-well ultra-low adhesion surface U-bottom microplate (Sumitomo Bakelite).
  • CD13 (IgG4pf) and cF44 (IgG1, IgG2, IgG4p, and IgG4pf constant regions) diluted with a 10% FBS-containing RPMI1640 medium (manufactured by Life Technology) to a final concentration of 0.64 to 10000 ng / mL.
  • CF63 IgG4pf
  • Hu5F9G4, TTI-621 or various control human IgG were added at 50 ⁇ L / well.
  • RPMI1640 medium containing 10% FBS manufactured by Life Technology
  • ADCP activity was evaluated in the same manner as in 2-6-4.
  • the ratio of ADCP activity to macrophages was calculated by dividing the number of macrophages counted when each antibody was added by the number counted when control antibodies were added.
  • FIG. 10A the ADCP activity of cD13, cF44 and cF63 on PBMC was almost equivalent to that of control IgG (FIG. 10A).
  • IgG1 type and IgG4p type exhibited ADCP activity depending on the concentration of the added antibody, whereas IgG2 type and IgG4pf type did not show ADCP activity (FIG. 10B).
  • IgG2 type and IgG4pf type did not show ADCP activity (FIG. 10B).
  • the IgG4pf type showed the lowest reduction rate of macrophages, indicating that the toxicity to SIRPA-positive cells induced by the antibody addition was low. The lowest probability was shown (FIG. 10C).
  • Example 6 Design of Humanized Anti-SIRPA Antibody 6) -1 Molecular Modeling of Variable Region of Chimeric Antibody cD13 Molecular modeling of the variable region of cD13 can be performed by a method known as homology modeling [Methods in Enzymology, 203, 121-153 ( 1991)]. Protein Data Bank [Nuc.] which has high sequence identity to the variable regions of the heavy and light chains of cD13. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)], using a commercially available protein three-dimensional structure analysis program BioLuminate (manufactured by Schrodinger) with the template (PDB ID: 3CSY) as a template.
  • BioLuminate manufactured by Schrodinger
  • hH1 and hH2 The full length amino acid sequence of hH1 heavy chain is described in SEQ ID NO: 41 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 is described in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing.
  • the full-length amino acid sequence of the heavy chain of hH2 is described in SEQ ID NO: 43 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 is described in SEQ ID NO: 42 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 is in the variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 140 to 466 is Amino acid sequences correspond to the constant regions, respectively.
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 is a signal sequence
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 is a variable region
  • the nucleotide sequence consisting of nucleotides 418 to 1398 is Each constant region is encoded.
  • FIG. 11 shows a comparison of the amino acid sequences of cD13_H, which is the heavy chain of the human chimeric anti-SIRPA antibody cD13, and the humanized antibody heavy chains hH1 and hH2.
  • cD13_H which is the heavy chain of the human chimeric anti-SIRPA antibody cD13
  • hH1 and hH2 the humanized antibody heavy chains
  • “•” indicates the same amino acid residue as c013_H, and the place where the amino acid residue is described indicates a substituted amino acid residue.
  • the three designed light chains were named hL2, hL3, and hL4.
  • the full length light chain amino acid sequence of hL2 is described in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 is described in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing.
  • the light chain full length amino acid sequence of hL3 is described in SEQ ID NO: 37 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is set forth in SEQ ID NO: 36.
  • the full length light chain amino acid sequence of hL4 is described in SEQ ID NO: 39 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 is set forth in SEQ ID NO: 38.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is in the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of the 21st to 127th amino acid residues is in the variable region
  • the 128th to 234th amino acid residues corresponds to the constant regions, respectively.
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 is a signal sequence
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 381 is a variable region
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides 382 to 702 is The sequences each encode a constant region.
  • the sequence of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 is also shown in FIG. 23
  • the sequence of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 is also shown in FIG. 24, and the sequence of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 are also shown in FIG. .
  • H1L3 antibody An antibody consisting of hH1 and hL3 is referred to as "H1L3 antibody” or “H1L3".
  • the antibody consisting of hH1 and hL4 is referred to as “H1L4 antibody” or "H1L4".
  • the antibody consisting of hH2 and hL2 is referred to as “H2L2 antibody” or “H2L2”.
  • the antibody consisting of hH2 and hL3 is referred to as "H2L3 antibody” or "H2L3”.
  • Embodiment 7 FIG. Preparation of humanized anti-SIRPA antibody 7) -1 Construction of humanized antibody heavy chain expression vector 7) -1-1 Construction of hH1 expression vector Nucleotide numbers 36 to 434 of the nucleotide sequence of hH1 shown in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing was synthesized (GENEART). Using an In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech), a hH1 expression vector was constructed by inserting the synthesized DNA fragment into the site where pCMA-G4proFALA was cut with the restriction enzyme BlpI.
  • hL2 Expression Vector The DNA fragment represented by nucleotide number 37 to 402 of the nucleotide sequence of hL2 shown in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing is synthesized. (GENEART). Using an In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech), a hL2 expression vector was constructed by inserting the synthesized DNA fragment into the site where pCMA-LK was cut with the restriction enzyme BsiWI.
  • Example 7 -3-2 Preparation of humanized antibody
  • the culture supernatant obtained in Example 7) -3-1 was purified in two steps of rProtein A affinity chromatography and ceramic hydroxyapatite. After the culture supernatant was applied to a column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) packed with MabSelectSuRe equilibrated with PBS, the column was washed with twice or more the column volume of PBS. Next, the antibody was eluted with a 2 M arginine hydrochloride solution (pH 4.0).
  • the fraction containing the antibody was buffer-substituted with PBS by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), and diluted 5-fold with a buffer of 5 mM sodium phosphate / 50 mM MES / pH 7.0.
  • the mixture was applied to a ceramic hydroxyapatite column (Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column, Japan Bio-Rad) equilibrated with a buffer of 5 mM NaPi / 50 mM MES / 30 mM NaCl / pH 7.0.
  • a linear concentration gradient elution with sodium chloride was performed, and the fractions containing the antibody were collected.
  • the fraction was subjected to buffer replacement with HBSor (25 mM histidine / 5% sorbitol, pH 6.0) by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette).
  • the antibody was concentrated with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (fraction molecular weight UF10K, Sartorius) to adjust the IgG concentration to 50 mg / mL.
  • the solution was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
  • Embodiment 8 FIG. In vitro evaluation of humanized anti-SIRPA antibody (hD13_H1L3, hD13_H1L4h, hD13_H2L2, hD13_H2L3) 8) -1 Binding activity of humanized anti-SIRPA antibody to human, monkey, mouse SIRPA 8) -1-1 Humanized anti-SIRPA antibody Activity for mouse, monkey and mouse SIRPA (Cell-ELISA) 293 ⁇ cells [described in Example 1-6] were prepared at 5 ⁇ 10 5 cells / mL in DMEM medium containing 10% FBS.
  • pFLAG V5-DEST-SIRPA_V1-V10 pFLAG V5-DEST-monkey SIRPA, pFLAG V5-DEST-mouse SIRPA or pFLAG V5-Destl were introduced using Lipofectamine LTX (manufactured by Invitrogen). After dispensing 100 ⁇ L each on a plate (manufactured by Corning), the mixture was cultured overnight in a DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2 . The obtained transfected cells were used in Cell-ELISA while keeping the adhered state.
  • hD13_H1L3, hD13_H1L4h, hD13_H2L2, hD13_H2L3, or cD13 prepared in Examples 6 and 7 and cD13 and a control antibody prepared in Examples 6 and 7 were used for each of the SIRPA gene-introduced cells. / Well and left at 4 ° C. for 1 hour.
  • the binding property to human SIRPA was evaluated in the same manner as in Example 5-1. As shown in FIGS.
  • the hD13_H1L3, hD13_H1L4h, hD13_H2L2, and hD13_H2L3 antibodies exhibited binding to SIRPA variants (V1-V10) and monkey SIRPA equivalent to or higher than that of the cD13 antibody.
  • SIRPA variants V1-V10
  • monkey SIRPA equivalent monkey SIRPA equivalent to or higher than that of the cD13 antibody.
  • FIGS. 14A and B neither humanized antibody nor human chimerized antibody showed binding property to mouse SIRPA.
  • HBS-EP + (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used as a running buffer
  • CM5 manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • a sensor chip After adding 1 ⁇ g / mL of the humanized antibody to the chip at 10 ⁇ L / min for 60 seconds, a dilution series solution of human SIRPA protein (0.5 to 8 ⁇ g / mL) or a dilution series solution of monkey SIRPA protein (1 to 16 ⁇ g / mL) was added at a flow rate of 30 ⁇ L / min for 120 seconds, followed by monitoring the dissociation phase for 600 seconds.
  • the hD13_H1L3, hD13_H1L4h, hD13_H2L2, and hD13_H2L3 antibodies exhibited binding inhibitory activity to SIRPA_V1 (FIG. 15A), SIRPA_V2 (FIG. 15B), and monkey SIRPA (FIG. 15C) equal to or higher than that of the cD13 antibody.
  • effector cells 2) Prepare effector cells in the same manner as in -6-3, wash twice with PBS, and resuspend in PBS to 1 ⁇ 10 6 cells / mL. It became cloudy. A 1 ⁇ L / 10 6 cells / mL CFSE solution (manufactured by ThermoFisher) was added as a labeling solution, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After adding 20 ml of RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) and washing twice, the cells were resuspended to 1 ⁇ 10 6 cells / mL and used as effector cells.
  • RPMI1640 medium 10% FBS
  • an RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) was added in an amount of 50 ⁇ L / well, and in the combined group, the RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) was diluted to a final concentration of 400 ng / mL.
  • Rituximab (manufactured by Zenyaku Kogyo) was added at 50 ⁇ L / well. After adding 1 ⁇ 10 6 cells / mL and 50 ⁇ L / well of the effector cells prepared in Example 8-3-3, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. and 5% CO 2 for 16 hours.
  • the plate was washed with 200 ⁇ L / well of PBS containing 5% FBS.
  • the cells were suspended in 100 ⁇ L / well of 1 ⁇ BD Stabilizing Fixative (manufactured by Becton Dickison) and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The next day, it was measured by flow cytometry (FACS CantoII: manufactured by Becton Dickison). Flowjo (manufactured by TreeStar) was used for data analysis.
  • the hD13_H1L3, hD13_H1L4h, hD13_H2L2, hD13_H2L3, or cD13 antibody-added group showed no ADCP activity against CD47-positive human Burkitt's lymphoma cell lines Raji and Ramos cells by a single agent, FIG. ), When combined with Rituximab, showed ADCP activity dependent on the added antibody concentration (FIGS. 16B, D).
  • the humanized antibody clone showed ADCP activity equal to or higher than that of the human chimerized antibody clone.
  • Embodiment 9 FIG. In vitro evaluation of various anti-SIRPA antibodies 9) -1 Evaluation of binding properties of various anti-SIRPA antibodies to SIRPA hD13_H1L3 antibody prepared in Example 7, and OSE-172 (prepared with reference to International Publication No. WO17 / 178655), Dissociation constants of KWAR23 (prepared with reference to International Publication No. WO18 / 026600) or ADU-1805 (prepared with reference to International Publication No. WO18 / 190719) for human SIRPA_V1_IgV and human SIRPA_V2_IgV prepared in Example 1. Was measured.
  • the amino acid sequence of the heavy chain of OSE-172 is shown in SEQ ID NO: 81 in the sequence listing, the amino acid sequence of the light chain of OSE-172 is shown in SEQ ID NO: 82, the amino acid sequence of the heavy chain of KWAR23 is shown in SEQ ID NO: 83, and the amino acid sequence of KWAR23 is shown in SEQ ID NO: 83.
  • the amino acid sequence of the light chain is shown in SEQ ID NO: 84, the amino acid sequence of the heavy chain of ADU-1805 is shown in SEQ ID NO: 85, and the amino acid sequence of the light chain of ADU-1805 is shown in SEQ ID NO: 86.
  • Biacore T200 (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used, and Human Antibody Capture Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used to immobilize each Anti-Human Cancer antibody to each antibody using GE Healthcare Bioscience (manufactured by GE Healthcare Bioscience). And the capture method of measuring the antigen as an analyte was performed.
  • HBS-EP + (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used as a running buffer
  • CM5 (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used as a sensor chip.
  • Peroxidase labeled CD47-Fc adjusted to 1 ⁇ g / mL with PBS containing 5% FBS was added at 50 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour.
  • SIRPA-CD47 binding inhibitory activity was evaluated in the same manner as in 1) -6-3.
  • the hD13_H1L3, OSE-172, KWAR23, and ADU-1805 antibodies exhibited binding inhibitory activity against SIRPA_V1-CD47.
  • FIG. 31A the hD13_H1L3, OSE-172, KWAR23, and ADU-1805 antibodies exhibited binding inhibitory activity against SIRPA_V1-CD47.
  • FIG. 31A the hD13_H1L3, OSE-172, KWAR23, and ADU-1805 antibodies exhibited binding inhibitory activity against SIRPA_V1-CD47.
  • FIG. 31A the hD13_H1L3, OSE-172, KWAR23
  • hD13_H1L3, KWAR23, and ADU-1805 showed binding to human SIRPA_V2-CD47, but OSE-172 did not show binding inhibitory activity. Also, as shown in FIG. 31C, hD13_H1L3 inhibited binding at the lowest concentration.
  • SIRP ⁇ 1 signal regulatory protein ⁇ 1: the amino acid sequence is published as RefSeq accession number NP_006056
  • SIRP ⁇ signal regulatory protein ⁇ : (The amino acid sequence has been published as Accession No. NP_061026) is a SIRPA family molecule.
  • SIRP ⁇ may be referred to as “SIRPA”
  • SIRP ⁇ 1 may be referred to as “SIRPB1”
  • SIRP ⁇ may be referred to as “SIRPG”.
  • CHO-K1 cells were prepared at 3.3 ⁇ 10 5 cells / mL in Ham's F-12K medium containing 10% FBS and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • pFLAG V5-DEST-human SIRPB, pFLAG V5-DEST-human SIRPG, or pFLAG V5-DEST or pFLAG V5-DEST was introduced using Lipofectamine LTX (manufactured by Invitrogen), and Ham's F-12K medium containing 10% FBS. And cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 . The obtained transduced cells were collected and seeded on a 96-well plate.
  • various anti-human SIRPA antibodies or various control human IgGs were added to each of the gene-introduced cells at a final concentration of 0 to 10000 ng / mL, 100 ⁇ L / well, and left at 4 ° C. for 25 minutes. .
  • the supernatant was removed and washed twice with PBS containing 5% FBS.
  • the supernatant was removed, 50 ⁇ L / well of a 1/400 diluted solution of PE Mouse anti-Human IgG antibody (manufactured by Bioleend) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 25 minutes.
  • effector cells 2) Prepare effector cells in the same manner as in -6-3, wash twice with PBS, and resuspend in PBS to 1 ⁇ 10 6 cells / mL. It became cloudy. A 1 ⁇ L / 10 6 cells / mL CFSE solution (manufactured by ThermoFisher) was added as a labeling solution, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After adding 20 ml of RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Life Technology) and washing twice, the cells were resuspended to 1 ⁇ 10 6 cells / mL and used as effector cells.
  • RPMI1640 medium 10% FBS
  • the cells were suspended in 50 ⁇ L / well of 1 ⁇ BD Stabilizing Fixative (manufactured by Becton Dickison) and measured by flow cytometry (FACS CantoII: manufactured by Becton Dickison).
  • Flowjo manufactured by TreeStar
  • FSC forward scattered light
  • SSC side scattered light
  • hD13_H1L3 showed the highest to highest activity, ADU-1805 and KWAR23 were almost equivalent, and OSE-172 was in that order. From the above results, hD13_H1L3 enhanced ADCP activity from the lowest concentration in a short time.
  • the plate was washed with 200 ⁇ L / well of PBS containing 5% FBS.
  • the cells were suspended in 100 ⁇ L / well of 1 ⁇ BD Stabilizing Fixative (manufactured by Becton Dickison) and measured by flow cytometry (FACS CantoII: manufactured by Becton Dickison).
  • Flowjo manufactured by TreeStar was used for data analysis. After developing with FSC (forward scattered light) / SSC (side scattered light), the number of FITC-positive cells in each well was calculated (A).
  • Self-ADCP activity was calculated by the following equation.
  • Self-ADCP (%) (A / B) ⁇ 100
  • the decreasing rates were OSE-172, KWAR23, ADU-1805, and hD13_H1L3 in this order.
  • the high reduction rate indicates that the Self-ADCP activity by the anti-SIRPA antibody is high. This phenomenon suggests that administration of each anti-SIRPA antibody may reduce or deplete SIRPA-positive cells such as macrophages and dendritic cells, and serve as an indicator of side effects on the immune system.
  • Embodiment 10 In vivo evaluation of various anti-SIRPA antibodies Since SIRPA is a target expressed in host immune cells, it is necessary to examine human SIRPA-expressing mice in order to evaluate the antitumor effect of human SIRPA antibody [Ring et al. PNAS, 2017 (114) 49, E10578-E10585]. On the other hand, in order to evaluate the contribution of the immune system to the antitumor effect, it is important to use immunocompetent mice instead of immunodeficient mice [Yanagita et al. JCI, 2017 (2) 1, 1-. 15].
  • mice When a mouse cancer cell line transfected with human CD47 was transplanted into a genetically modified mouse transfected with human SIRPA alone or both human SIRPA and human CD47 into a mouse with normal immunity, a group was formed when the tumor volume reached about 100 mm 3. Divide. To these mice, various anti-SIRPA antibodies, anti-CD47 antibodies or anti-CD47 biologics such as SIRPA-Fc fusion protein, or PBS or the like as a negative control group is administered about 1 to 3 times a week for 1 to 3 weeks. When examining the additional antitumor effect of the concomitant drug, a chemotherapeutic agent, an antibody drug, a molecular targeted drug, etc. are administered to each of these groups.
  • the tumor diameter (major axis / minor axis) in each administration group is measured every 2-3 days with an electronic caliper or the like, and the tumor volume is calculated.
  • the tumor volume and the tumor growth inhibition rate are shown by the following equations.
  • Tumor volume (mm 3 ) (major axis ⁇ minor axis ⁇ minor axis) / 2
  • Tumor growth inhibition rate (%) (1-tumor volume of each administration group / tumor volume of negative control group) ⁇ 100
  • the anti-SIRP ⁇ antibody of the present invention can be used as an antibody drug to be used in combination with another antibody drug having another effector function or another antibody drug having an immune checkpoint inhibitory action.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of D13 CDR-L1 SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of D13 CDR-L2 SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of D13 CDR-L3 SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of D13 CDR-H1 SEQ ID NO: 5: D13 CDR -Amino acid sequence of H2 SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of D13 CDR-H3 SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of F44 CDR-L1 SEQ ID NO: 8: amino acid sequence of F44 CDR-L2 SEQ ID NO: 9: amino acid sequence of F44 CDR-L3 No.
  • Nucleotide sequence SEQ ID NO: 47 amino acid sequence of IgV of human SIRPA variant 1 SEQ ID NO: 48: nucleotide sequence encoding ECD of human SIRPA variant 2 SEQ ID NO: 49: amino acid sequence of ECD of human SIRPA variant 2 SEQ ID NO: 50: human SIRPA variant SEQ ID NO: 51: nucleotide sequence encoding IgV of human SIRPA variant 2: SEQ ID NO: 52: nucleotide sequence encoding ECD of monkey SIRPA SEQ ID NO: 53: amino acid sequence of ECD of monkey SIRPA SEQ ID NO: 54: human Nucleotide sequence encoding CD47-Fc SEQ ID NO: 55: amino acid sequence of IgV of human CD47-Fc SEQ ID NO: 56: amino acid sequence of human SIRPA variant 1 SEQ ID NO: 57: human SIRPA variant Amino acid sequence of monkey SIRPA SEQ ID NO: 58: amino acid sequence of monkey SIRPA SEQ ID NO
  • SEQ ID NO. 62 amino acid sequence of NOD mouse SIRPA SEQ ID NO. 63: amino acid sequence of human SIRPA variant 3 SEQ ID NO. 64: amino acid sequence of human SIRPA variant 4 SEQ ID NO. 65: amino acid sequence of human SIRPA variant 5 SEQ ID NO.

Abstract

本発明は、腫瘍剤として用いることができる抗ＳＩＲＰα抗体、及び該抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤の提供を目的とする。　本発明は、（a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、 （b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、 （c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、 （d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、 （e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び （f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３ を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体である。

Description

抗ＳＩＲＰα抗体
　本発明は、腫瘍の治療に有用な抗ＳＩＲＰα抗体、及び該抗体を含む抗腫瘍剤に関する。
　ＳＩＲＰα（ＳＨＰＳ－１）は、マクロファージ、樹上細胞、好中球などのミエロイド細胞、及びグリア細胞に存在するＩｇスーパーファミリーの１回膜貫通型分子である（非特許文献１）。細胞外領域は１つのＩｇＶドメインと２つのＩｇＣドメインからなり、ＣＤ４７との結合部位であるＩｇＶドメインについては、ヒトでは１０種類のバリアントが報告されている（非特許文献２）。一方、細胞内領域はｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆｓ（ＩＴＩＭ）を含み、ＣＤ４７との結合によりチロシン脱リン酸化酵素であるＳＨＰ－１、及びＳＨＰ－２への結合が誘導され抑制性のシグナルが伝えられる。
　ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用による生理現象としては、マクロファージ上のＳＩＲＰαに赤血球上のＣＤ４７が結合し“Ｄｏｎ’ｔ　ｅａｔ　ｍｅ”シグナルを伝えることで、赤血球の不必要な貪食を回避することが示されている（非特許文献３）。一方、腫瘍微小環境下においても、マクロファージや樹上細胞上のＳＩＲＰαに腫瘍細胞に高発現するＣＤ４７が結合することで、腫瘍細胞に対する貪食能を抑制することが示唆されている。貪食能の抑制は、その後のＴ細胞への腫瘍抗原提示の抑制、更には腫瘍免疫応答の抑制に繋がることが予想される。よって、腫瘍細胞の貪食という免疫現象は、腫瘍抗原の取り込み（エントリー）に対するチェックポイントに当たると考えられる。
　これまでに、ＳＩＲＰαのリガンドであるＣＤ４７に対する抗体でＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用を阻害することにより、腫瘍細胞に対する貪食能を増強することが報告されており（非特許文献４）、これは抗ＳＩＲＰα抗体を用いた場合でも、腫瘍細胞を免疫細胞に引き寄せるエフェクター活性を持つような抗癌抗体併用条件下では同様の現象が示されている（非特許文献５及び６）。また、抗ＣＤ４７抗体を用いた同種マウス担癌モデルでは、抗腫瘍効果だけでなく、腫瘍免疫を誘導することが示唆されており（非特許文献７）、抗ＳＩＲＰα抗体についても、抗癌抗体併用条件下では同様の効果が期待できる。
　一方で、免疫チェックポイント阻害剤として、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などＴ細胞上の免疫抑制性分子に対する抗体が複数開発されており、臨床でもその効果が実証されている（非特許文献８及び９）。ＳＩＲＰα－ＣＤ４７は現在証明されている唯一の貪食抑制分子であり、この分子に対する阻害抗体は、Ｔ細胞以外の標的に対する新たなチェックポイント阻害剤としての可能性が予想され、従来の免疫チェックポイント阻害剤に抵抗性の患者に対しても、広く効果を示す可能性も持ち合わせている。
　これまでに、抗マウスＳＩＲＰα抗体（ＭＹ－１）を用いたヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ皮下移植モデルでの検討により、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとの併用で抗腫瘍効果が示されている。また、マウス大腸がんモデルではＰＤ－１抗体との併用で抗腫瘍効果が認められている（非特許文献５）。加えて、クローンの異なる抗ｍＳＩＲＰα抗体（Ｐ８４）を用いた検討では、マウス肝臓がんモデルで抗ＰＤ－Ｌ１抗体や抗４－１ＢＢ抗体との併用でも抗腫瘍効果及び延命効果が認められている。延命効果を示したマウスに同じ腫瘍細胞を再移植した際も、更なる抗腫瘍効果、延命効果が得られていることから、異なる免疫チェックポイントを阻害することで、強い腫瘍免疫応答を誘導できる可能性を示している（特許文献１）。これらの結果は、従来から予想されたエフェクター活性を持つ抗癌抗体との併用のみならず、Ｔ細胞を標的とした免疫チェックポイント阻害剤との併用においても併用効果を示した例であり、抗ヒトＳＩＲＰα抗体においても、同様の効果が期待できる。
　近年、各社から抗ＳＩＲＰα抗体に関する特許の報告が相次いでいる（特許文献１、２及び３）。例えば、ＯＳＥ－１７２はＩｇＧ４Ｐｒｏ型の抗体であり、ＳＩＲＰαのＶ１タイプとＳＩＲＰβ１に結合性を示すが、ＳＩＲＰαのＶ２タイプとＳＩＲＰγには結合性を示さない。ＫＷＡＲ２３はＩｇＧ１Ｎ２７９Ａ型の抗体であり、１０種類のＳＩＲＰαバリアント並びにＳＩＲＰβ１及びＳＩＲＰγに結合性を示す。ＡＤＵ－１８０５はＩｇＧ２型の抗体であり、１０種類のＳＩＲＰαバリアントとＳＩＲＰγへの結合性を示す。いずれの抗体が医薬として最も適切か未解明であり、優れた抗体を取得する努力が続けられている。
　更に、抗ＣＤ４７抗体を用いた検討では、前述のような抗体医薬以外に従来からＳＯＣ（標準療法：Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｏｆ　Ｃａｒｅ）として広く用いられている化学療法剤、放射線療法との併用でも、十分な抗腫瘍効果、延命効果を示すことが報告されている。特に、化学療法剤との併用事例では、化学療法剤を事前に投与し、続いて抗ＣＤ４７抗体を投与することで、化学療法剤と抗ＣＤ４７抗体の同時投与よりも強い抗腫瘍効果、延命効果を示すことから（非特許文献７）、化学療法剤の前投与により腫瘍抗原を取り込み易いような環境を準備することで、ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用の阻害による抗原取り込み能（免疫賦活化能）の効果を増強できる可能性を示している。
　以上のことから、抗ＳＩＲＰα抗体は種々の抗腫瘍剤との併用により、より強い腫瘍免疫応答を誘導しうる薬剤であると推測できる。
国際公開第WO2017/178653号 国際公開第WO2018/026600号 国際公開第WO2018/190719号
Matozaki et al. Trends in cell biol. 2009(19) 2, 72-80 Takenaka et al. Nat Immunol. 2007(8)12, 1313-1323 Matozaki et al. Trends in cell biol. 2009(19) 2, 72-80 Liu et al. Plos One, 2015 (10) 9 Yanagita et al. JCI Insight, 2017 (2) 1, 1-15 Ring et al. PNAS, 2017 (114) 49, E10578-E10585 Liu et al, Nat Med. 2015 (21) 10, 1209-1215 Lee et al. The Oncologist, 2017（22）11, 1392-1399 Weinstock et al. Clin Can Res. 2017（23）16, 4534-4539
　本発明は、抗腫瘍剤として用いることができる抗ＳＩＲＰα抗体、及び該抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤の提供を目的とする。
　本発明者らは、貪食能を有する貪食細胞に発現しているＳＩＲＰαと腫瘍細胞に発現しているＣＤ４７との相互作用を抗ＳＩＲＰα抗体により阻害し、腫瘍細胞から貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルが伝達されるのを阻害し、貪食細胞による腫瘍細胞の貪食作用を増強する方法について検討を行った。本発明者らは、ＳＩＲＰαに対する親和性がより高く、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用の阻害効果が高い抗体の作製を試みるとともに、抗ＳＩＲＰα抗体がＡＤＣＣ又はＡＤＣＰといったエフェクター機能を有している場合に、自己の免疫細胞を攻撃してしまう可能性があることを考え、エフェクター機能を有しない抗ＳＩＲＰα抗体の作製についても検討を行った。エフェクター機能を低減させるために、抗体のサブクラスをＩｇＧ４とし、さらに、エフェクター機能を低減させる変異を抗体のＦｃ領域に導入した。その結果、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用を強く阻害するが、エフェクター機能が低減されている抗ＳＩＲＰα抗体を作製することができた。この抗体は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合せずエフェクター機能を発揮しないので、単独では十分な抗腫瘍作用がない。そこで、エフェクター機能を有する他の抗体医薬や免疫チェックポイント阻害作用を有する他の抗体医薬と併用したところ、良好な抗腫瘍効果を発揮することが確認され、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]（a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[１]の抗体。
[３]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１]又は[２]の抗体。
[４]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[３]の抗体。
[５]　(ai)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[６]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[５]の抗体。
[７]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[６]の抗体。
[８]（a）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[９]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[８]の抗体。
[１０]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[８]又は[９]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１１]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[１０]の抗体。
[１２]　(ai)配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１３]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１２]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１４]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[１３]の抗体。
[１５]（a）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１６]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[１５]の抗体。
[１７]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１５]又は[１６]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１８]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[１７]の抗体。
[１９]　(ai)配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２０]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１９]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２１]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[２０]の抗体。
[２２]　以下の（１）～（８）のいずれかの、[１]～[４]のいずれかの抗体：
（１）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（２）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（３）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（４）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（５）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（６）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（７）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；及び
（８）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２３]　ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性が低減されている、[２２]の抗体。
[２４]　配列番号５７で表されるヒトＳＩＲＰαの８２番目のＧｌｎ、８３番目のＬｙｓ、８４番目のＧｌｕ、８５番目のＧｌｙを含むエピトープに結合する、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２５]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[２４]の抗体。
[２６]　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[２４]又は[２５]の抗体。
[２７]　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[２６]の抗体。
[２８]　マクロファージの貪食作用を増強する[１]～[２７]のいずれかの抗体。
[２９]　[１]～[２８]のいずれかの抗体であって、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体。
[３０]　[１]～[２９]のいずれかの抗体の抗原結合性断片。
[３１]　Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖからなる群から選択される、[３０]の抗体の抗原結合性断片。
[３２]　[１]～[２９]のいずれかの抗体又は[３０]若しくは[３１]の抗体の抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物。
[３３]　抗腫瘍剤である、[３２]の医薬組成物。
[３４]　抗腫瘍剤の有効成分として、さらに免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬を含む、[３３]の医薬組成物。
[３５]　[１]～[２９]のいずれかの抗体又は[３０]若しくは[３１]の抗体の抗原結合断片を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬と併用される医薬組成物。
[３６]　免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤である、[３４]又は[３５]の医薬組成物。
[３７]　がん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体からなる群から選択される、[３４]又は[３５]の医薬組成物。
[３８]　腫瘍が、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫及び腎芽腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、[３３]～[３７]のいずれかの医薬組成物。
[３９]　腫瘍が、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん、卵巣がん、神経膠腫及び髄膜腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、[３８]の医薬組成物。
[４０]　[１]～[２９]のいずれかの抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
[４１]　[４０]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[４２]　[４０]のポリヌクレオチド又は[４１]のベクターを含む宿主細胞。
[４３]　[４２]の宿主細胞を培養し、培養物から抗体を精製することを含む、[１]～[２９]のいずれかの抗体の製造方法。
[４４]　[４３]の方法によって製造された抗体。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-131116号の開示内容を包含する。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、貪食細胞に発現しているＳＩＲＰαと腫瘍細胞に発現しているＣＤ４７との相互作用を強く阻害し、腫瘍細胞から貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルが伝達されるのを阻害する一方で、エフェクター機能を有していないので自己の免疫細胞を攻撃することはないので安全である。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、エフェクター機能を有する他の抗体医薬や免疫チェックポイント阻害作用を有する他の抗体医薬と併用することにより、優れた抗腫瘍効果を発揮することができる。
抗ＳＩＲＰＡ抗体のエピトープ解析に用いたＳＩＲＰＡコンストラクトの構造（Ａ）及びラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の各コンストラクトに対する反応性を示す図（Ｂ）である。 抗ＳＩＲＰＡ抗体のエピトープ解析に用いたｈｍＳＩＲＰＡコンストラクトに対するヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の反応性を示す図（ｉ）-（ｉｖ）、及び抗ＳＩＲＰＡ抗体のエピトープ解析に用いたＳＩＲＰＡコンストラクトのアミノ酸配列（ｖ）を示す図である。 抗ＳＩＲＰＡ抗体のＦａｂ断片とＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶの複合体全体のリボンモデルを示す図である。 ヒトＳＩＲＰＡのｂｅｔａ５以前（Ａ）とｂｅｔａ５以降（Ｂ）の領域と抗体ＳＩＲＰＡ抗体（抗体Ｄ１３）との相互作用を示す図である。 ヒトＳＩＲＰＡのｂｅｔａ５‐６ループ部分の各バリアントのアミノ酸配列の比較を示す図である。 抗ＳＩＲＰＡ抗体単剤で用いた場合（Ａ）と抗ＳＩＲＰＡ抗体とＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを併用した場合（Ｂ）の胃癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性を示す図である。 ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価の結果を示す図である。 ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のサルＳＩＲＰＡに対する結合性評価の結果を示す図である。 ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のヒト又はサルＳＩＲＰＡとＣＤ４７の結合阻害活性評価の結果を示す図である（(i):ＳＩＲＰＡ_Ｖ１、(ii)：ＳＩＲＰＡ_Ｖ２、(iii)：サルＳＩＲＰＡ）。 ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＦ４４の各アイソタイプ）のヒト又はサルＳＩＲＰＡとＣＤ４７の結合阻害活性評価の結果を示す図である（(i):ＳＩＲＰＡ_Ｖ１、(ii)：ＳＩＲＰＡ_Ｖ２、(iii)：サルＳＩＲＰＡ）。 抗ＳＩＲＰＡ抗体単剤で用いた場合（Ａ）と抗ＳＩＲＰＡ抗体とＲｉｔｕｘｉｍａｂを併用した場合（Ｂ）のＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株に対するＡＤＣＰ活性を示す図である。 ヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のＰＢＭＣ及びマクロファージに対する毒性評価の結果を示す図である。ＡはｃＤ１３、ｃＦ４４及びｃＦ６３のＰＢＭＣに対するＡＤＣＰ活性を示し、Ｂは定常領域の異なるｃＦ４４抗体のＡＤＣＰ活性を示し、Ｃはマクロファージの存在比を示す。 抗体Ｄ１３の重鎖可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ１の可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ２の可変領域のアミノ酸配列の比較を示す図である。 抗体Ｄ１３の軽鎖可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ２の可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＬ３の可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ４の可変領域のアミノ酸配列の比較を示す図である。 ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡのバリアント((i)：Ｖ１、(ii)：Ｖ２、(iii)：Ｖ３及び(iv)：Ｖ４）に対する結合活性を示す図である。 ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡのバリアント((i)：Ｖ５、(ii)：Ｖ６、(iii)：Ｖ７及び(iv)：Ｖ８）に対する結合活性を示す図である。 ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡのバリアント((i)：Ｖ９、(ii)：Ｖ１０、(iii)：サルＳＩＲＰＡ及び(iv)：Ｍｏｃｋ）に対する結合活性を示す図である。 ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のマウスＳＩＲＰＡ（(i)：Ｃ５７ＢＬ／６、(ii)：Ｂａｌｂ／ｃ、(iii)：１２９ｓｖ）に対する結合活性を示す図である。 ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のマウスＳＩＲＰＡ（(i)：ＮＯＤ、(ii)：Ｍｏｃｋ）に対する結合活性を示す図である。 ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト（Ａ及びＢ）、又はサルＳＩＲＰＡ（Ｃ）とＣＤ４７の結合の阻害活性評価の結果を示す図である。 ヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体単剤で用いた場合（Ａ及びＣ）とヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体とＲｉｔｕｘｉｍａｂを併用した場合（Ｂ及びＤ）の癌細胞株（Ａ及びＢ：Ｒａｊｉ株、Ｃ及びＤ：Ｒａｍｏｓ株）に対するＡＤＣＰ活性を示す図である。 ｃＤ１３軽鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＤ１３軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ｃＤ１３重鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＤ１３重鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ｃＦ４４軽鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ４４軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ｃＦ４４重鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ４４重鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ｃＦ６３軽鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ６３軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ｃＦ６３重鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ６３重鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ｈＬ２をコードするヌクレオチド配列及びｈＬ２のアミノ酸配列を示す図である。 ｈＬ３をコードするヌクレオチド配列及びｈＬ３のアミノ酸配列を示す図である。 ｈＬ４をコードするヌクレオチド配列及びｈＬ４のアミノ酸配列を示す図である。 ｈＨ１をコードするヌクレオチド配列及びｈＨ１のアミノ酸配列を示す図である。 ｈＨ２をコードするヌクレオチド配列及びｈＨ２のアミノ酸配列を示す図である。 抗体Ｄ１３のＣＤＲ配列を示す図である。 抗体Ｆ４４のＣＤＲ配列を示す図である。 抗体Ｆ６３のＣＤＲ配列を示す図である。 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体によるヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１／ＣＤ４７結合阻害活性評価の結果（Ａ）、各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体によるヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２／ＣＤ４７結合阻害活性評価の結果（Ｂ）、並びに各種抗体によるヒトＳＩＲＰＡ抗体によるヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１／ＣＤ４７若しくはＳＩＲＰＡ＿Ｖ２／ＣＤ４７結合活性阻害のＩＣ５０値を示す図である。 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＢ（Ａ）、ヒトＳＩＲＰＧ（Ｂ）、に対する結合性評価の結果、並びにＡ及びＢの陰性対照となる試験の結果（Ｃ）を示す図である。 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体にＲｉｔｕｘｉｍａｂを併用した際のＢｕｒｋｉｔｔ‘ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株（Ｒａｊｉ）に対するＡＤＣＰ活性：１０μg／ｍＬにおけるドナー毎の反応性比較結果のうち、反応時間２時間（Ａ）、反応時間１６時間（Ｂ）、反応時間２時間における濃度依存性比較結果（Ｃ）、及び各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体による、マクロファージ同士が貪食するＳｅｌｆ－ＡＤＣＰ活性（Ｄ）を示す図である。各図中の「Ａｂ－」は抗体を添加しない陰性対照を示し、「＋　Ｒｍａｂ」はＲｉｔｕｘｉｍａｂを同時添加していることを示している。 ＯＳＥ－１７２抗体重鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＧ４Ｐｒｏ）及び軽鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＫ）のアミノ酸配列を示す図である。 ＫＷＡＲ２３抗体重鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＧ４Ｐｒｏ）及び軽鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＫ）のアミノ酸配列を示す図である。 ＡＤＵ－１８０５抗体重鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＧ２）及び軽鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＫ）のアミノ酸配列を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
抗ＳＩＲＰα抗体の特性
　本発明は、ＳＩＲＰα蛋白質の細胞外ＩｇＶドメインを認識し結合する抗ＳＩＲＰα抗体である。
　ＳＩＲＰα（ｓｉｇｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　α）は、マクロファージ、樹上細胞、好中球などのミエロイド細胞、及びグリア細胞に存在するＩｇスーパーファミリーの１回膜貫通型分子である。細胞外領域は１つのＩｇＶドメインと２つのＩｇＣドメインからなり、ＣＤ４７との結合部位であるＩｇＶドメインについては、ヒトではＶ１～Ｖ１０の１０種類のバリアントが報告されている。ＳＩＲＰα蛋白質の細胞外ＩｇＶドメインは、ＳＩＲＰα蛋白質を構成する３つの細胞外Ｉｇ様ドメインのうちの１つのＩｇＶドメインである。このうち、Ｖ１及びＶ２がメジャーなバリアントであり、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、メジャーなバリアントであるＶ１及びＶ２を含むすべてのバリアントに結合する。本発明において、「ＳＩＲＰα」を「ＳＩＲＰＡ」と称する場合がある。
　ヒトＳＩＲＰα蛋白質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：ＮＰ＿００１０３５１１１に開示されている。
　本発明で用いるモノクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウマ、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物をＳＩＲＰα又はその断片を免疫原として免疫し、脾臓細胞等とミエローマとを融合し、ハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生分泌する抗体として得ることができる。ハイブリドーマは公知の方法で作製することができる。
　免疫原としてのＳＩＲＰαは配列情報に基づいて化学合成することもでき、またタンパク質をコードするＤＮＡ配列情報に基づいて公知の方法でリコンビナントタンパク質として得ることもできる。
　抗体のスクリーニングは任意の方法で行うことができるが、好ましくは、ＳＩＲＰαをコードするＤＮＡでトランスフェクトした動物細胞を用いたＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡによりスクリーニングすればよい。ヒトＳＩＲＰαのＶ１蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５６に、ヒトＳＩＲＰαのＶ２蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５７に示す。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する。
　腫瘍細胞はＣＤ４７を高発現しており、貪食能を有する貪食細胞に発現しているＳＩＲＰαとＣＤ４７が結合し相互作用することにより、貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルを伝達し、貪食細胞による貪食から逃れている。抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害することにより、腫瘍細胞から貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルが伝達されるのを阻害し、貪食細胞による腫瘍細胞の貪食作用を増強する。その結果、抗腫瘍効果を発揮し得る。貪食能を有する貪食細胞として、Ｍ１型、Ｍ２型マクロファージなどのマクロファージやｉｍＤＣ（未成熟樹状細胞）などの樹状細胞等が挙げられる。
　この際、抗ＳＩＲＰα抗体がエフェクター機能を有し、マクロファージ等の貪食細胞やナチュラルキラー細胞やＴ細胞等のエフェクター細胞のＦｃγレセプター等のＦｃレセプターに結合すると、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：抗体依存性細胞傷害）やＡＤＣＰ（Ａｎｔｉｄｏｂｙ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：抗体依存性細胞貪食能）によりＰＢＭＣ（末梢血単核球）やマクロファージ等の自己のエフェクター細胞を攻撃してしまう。
　自己の細胞への攻撃を避けるため、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、エフェクター機能が低減されている。その結果、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、単にＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を抑制する作用のみを有し、エフェクター細胞のＦｃレセプターには結合せず、エフェクター機能を発揮しない。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、自己の免疫細胞を攻撃することがないため、副作用なしに医薬として安全に用いることができる。
　ただし、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、エフェクター機能が低減されているため、単独では十分な抗腫瘍効果を発揮しない。そのため、後記するように他の抗腫瘍剤と併用して用いる。
　エフェクター機能を低減させるためには、抗ＳＩＲＰα抗体のＦｃ部分がマクロファージやＴ細胞のＦｃレセプターに結合しないことが必要である。このため、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のサブクラスはＩｇＧ４由来のものに置換してある。一般的にヒトＩｇＧサブクラスの中で、ＩｇＧ４はＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性等のエフェクター機能が低いサブクラスとして知られている（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）。治療用抗体で正常臓器に発現する分子を標的とする場合にエフェクター機能を介した細胞障害による毒性を回避するためのＩｇＧフォーマットの一つとして利用される（オプジーボなど）。ただし、ＩｇＧ４サブクラスのエフェクター機能が低いといっても、全く無いわけではない。そこで、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は重鎖定常領域にエフェクター機能をさらに低減させるような変異、すなわちＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす１アミノ酸以上の置換等の変異を導入している。そのような変異として、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ　ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１　Ｆｉｆｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）により示される２３４位のフェニルアラニンのアラニンへの置換（Ｆ２３４Ａ）及び２３５位のロイシンのアラニンへの置換（Ｌ２３５Ａ）が挙げられる（Ｐａｒｅｋｈ　ｅｔ　ａｌ．，ｍＡｂｓ，３１０－３１８，２０１２）。このような抗体の変異をＦＡＬＡ変異と呼ぶ。ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンをＥＵナンバリング２３４のフェニルアラニンということもある。
　また、ＩｇＧ４は抗体重鎖間のＳＳ結合の形成が安定していないので、安定性を高めるために、抗体重鎖間のＳＳ結合の形成を促進させる変異を導入する。このような変異として、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２２８位のセリンのプロリンへの置換（Ｓ２２８Ｐ）が挙げられる（ＡＮＧＡＬ　ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０５－１０８，１９９３）。この抗体の変異をＰＲＯ変異と呼ぶ。
　本発明の抗体の定常領域には、上記のＦＡＬＡ変異及びＰＲＯ変異が同時に導入されていても良い（Ｖａｆａ　ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，１１４－１２６，２０１４）。ＦＡＬＡ変異及びＰｒｏ変異の両方の変異を有するＩｇＧ４重鎖を「ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡ」タイプ重鎖、「ＩｇＧ４ＰＦＡＬＡ」タイプ重鎖又は「ＩｇＧ４ｐｆ」タイプ重鎖とも呼ぶ。
　抗体重鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域からなり、ＣＨ１は、ＥＵインデックス１１８から２１５、ヒンジはＥＵインデックス２１６から２３０、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１から３４０、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１から４４６と定義される。ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンから置換されたアラニンは抗体Ｄ１３の重鎖アミノ酸配列を示す配列番号２５の第２５３番目のアラニン、抗体Ｆ４４の重鎖アミノ酸配列を示す配列番号２９の第２５２番目のアラニン及び抗体Ｆ６３の重鎖アミノ酸配列を示す配列番号３３の第２５７番目のアラニンに相当し、２３５位のロイシンから置換されたアラニンは配列番号２５の第２５４番目のアラニン、配列番号２９の第２５３番目のアラニン及び配列番号３３の第２５８番目のアラニンに相当する。また、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２２８位のセリンから置換されたプロリンは配列番号２５の第２４７番目のプロリン、配列番号２９の第２４６番目のプロリン及び配列番号３３の第２５１番目のプロリンに相当する。
　「ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡ」タイプ重鎖の定常領域のアミノ酸配列は、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
　ヒトＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ　サブクラスの中で、補体結合を介したＣＤＣ活性、抗体依存的な細胞障害活性といったエフェクター機能が非常に強く（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）、治療用抗体で癌に高発現する分子を標的とする場合に、エフェクター機能を介した細胞障害による癌細胞の細胞死誘導を促すことで治療効果を示すＩｇＧフォーマットとして利用される（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ｒｉｔｕｘｉｍａｂなど）。本発明の抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／００７０８９、Ｗ０９４／２８０２７、Ｗ０９４／２９３５１参照）。エフェクター機能を減弱させたＩｇＧ１の変異体としては、ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、IｇＧ１　ＬＡＧＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ）等が挙げられる。本発明の抗体の定常領域として、これらの変異が導入されたＩｇＧ１重鎖定常領域を使用することも可能である。
　ヒトＩｇＧ２は、ヒトＩｇＧ　サブクラスの中で、補体結合を介したＣＤＣ活性、抗体依存的な細胞障害活性といったエフェクター機能が非常に弱く（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）、治療用抗体で正常臓器に発現する分子を標的とする場合にエフェクター機能を介した細胞障害による毒性を回避するためのＩｇＧフォーマットの一つとして利用される（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、ｂｒｏｄａｌｕｍａｂなど）。本発明の抗体の定常領域として、ＩｇＧ２重鎖定常領域を使用することも可能である。
　種交差性については、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＳＩＲＰα及びサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ）に結合するが、マウスＳＩＲＰαには結合しない。
ヒトキメラ化抗体及びヒト化抗体
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させるために改変したヒトキメラ化抗体及びヒト化抗体も含む。ヒト化抗体はＣＤＲ移植抗体ともいう。
ヒトキメラ化抗体
　ヒトキメラ化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とからなる抗体をいう。ヒトキメラ化抗体は、抗ＳＩＲＰα抗体を産生するハイブリドーマより軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ及び重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを採取し、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを有する発現ベクターに挿入してヒトキメラ化抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入して発現させることにより作製することができる。
　重鎖定常領域は、３個のドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成されている。本発明においては、上記のように、キメラ抗体のヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域であってＰｒｏ変異及びＦＡＬＡ変異を有する重鎖定常領域ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡである。また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇに属すればよく、κ又はλ定常領域である。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のヒトキメラ化抗体の例として、ラット抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体Ｄ１３、Ｆ４４及びＦ６３の可変領域を有するヒトキメラ化抗体、抗体ｃＤ１３、抗体ｃＦ４４及び抗体ｃＦ６３が挙げられる。これら３つの抗体は、ヒトＳＩＲＰαとの結合性が高い抗体であり、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合の阻害活性が高い抗体である。この中でも、高い活性を有している抗体ｃＤ１３及び抗体ｃＦ６３が好ましい。
抗体ｃＤ１３
　抗体ｃＤ１３の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２２の６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図１７）、抗体ｃＤ１３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図１７）。
　また、抗体ｃＤ１３の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２４の５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図１８）、抗体ｃＤ１３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図１８）。
　すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、ヒトＳＩＲＰαに結合する抗ヒトＳＩＲＰα抗体である。
　また、上記の配列番号２２の６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２４の５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とCLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡであって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の配列番号２２の６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２４の５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域も含む。
　このような配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と、CLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　このような配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　さらに、抗体ｃＤ１３は、軽鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＧＡＳＫＳＶＲＴＹＭＨ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＳＡＳＮＬＥＡ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＱＱＳＮＥＰＰＹＴ）からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＩ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＲＹＹＧＦＮＹＰＦＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を含む（図２８）。
　すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む抗体である。
　上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。
　キメラ又はヒト化Ｄ１３抗体は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合するが、配列番号７４又は７５で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合しない。配列番号７３で表されるアミノ酸配列中のＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）は、配列番号７４ではＮＱＫＥＥ配列（配列番号７７）に、配列番号７５ではＳＦＴＥＧ配列（配列番号８０）に置換されており、キメラ又はヒト化Ｄ１３抗体とＳＩＲＰαの結合にＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）が必要であることが明らかになった。なお、Ｘ線結晶構造解析により、抗体ｃＤ１３は配列番号５７で表されるヒトＳＩＲＰαバリアント２のアミノ酸残基Ｇｌｎ８２、Ｌｙｓ８３、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｙ８５、Ｈｉｓ８６、Ｐｈｅ８７（各アミノ酸残基の位置は、配列表の配列番号５７に対応している）を介してＳＩＲＰαと結合することが示唆されており、Ｇｌｎ８２、Ｌｙｓ８３、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｙ８５からなる配列が、上記ＮＱＫＥＧ配列中のＱＫＥＧ部分に相当する。従って、ＮＱＫＥＧ配列はＤ１３抗体とヒトＳＩＲＰαの結合に必須なエピトープである。ＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）を特異的に認識する抗体、すなわちＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）を有する配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合するが該配列を有さない配列番号７４又は７５で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合しない抗体を選択することにより、Ｄ１３抗体と同一のエピトープを有する抗体を選択することができる。
抗体ｃＦ４４
　抗体ｃＦ４４の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２６の６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図１９）、抗体ｃＦ４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図１９）。
　また、抗体ｃＦ４４の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２８の５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図２０）、抗体ｃＦ４４の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図２０）。
　すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、ヒトＳＩＲＰαに結合する抗ヒトＳＩＲＰα抗体である。
　また、上記の配列番号２６の６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２８の５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とCLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡであって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の配列番号２６の６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２８の５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域も含む。
　このような配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と、CLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　このような配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　さらに、抗体ｃＦ４４は、軽鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号７で表されるアミノ酸配列（ＫＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列（ＳＧＳＴＬＱＳ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号９で表されるアミノ酸配列（ＱＱＨＮＥＹＰＰＴ）からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１０で表されるアミノ酸配列（ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＡ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列（ＹＩＴＴＧＧＧＳＴＹ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号１２で表されるアミノ酸配列（ＡＮＹＧＧＳＹＦＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を含む（図２９）。
　すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む抗体である。
　上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。
抗体ｃＦ６３
　抗体ｃＦ６３の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３０の６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図２１）、抗体Ｆ６３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図２１）。
　また、抗体ｃＦ６３の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３２の５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図２２）、抗体ｃＦ６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図２２）。
　すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、ヒトＳＩＲＰαに結合する抗ヒトＳＩＲＰα抗体である。
　また、上記の配列番号３０の６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号３２の５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とCLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡであって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の配列番号３０の６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号３２の５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域も含む。
　このような配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と、CLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　このような配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　さらに、抗体ｃＦ６３は、軽鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列（ＥＲＳＳＧＤＩＧＤＳＹＶＳ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列（ＡＤＤＱＲＰＳ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号１５で表されるアミノ酸配列（ＱＳＹＤＳＫＩＤＩ）からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１６で表されるアミノ酸配列（ＧＦＳＬＡＳＹＳＬＳ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列（ＲＭＹＹＤＧＤＴＡ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号１８で表されるアミノ酸配列（ＤＲＳＭＦＧＴＤＹＰＨＷＹＦＤＦ）からなるＣＤＲＨ３を含む（図３０）。
　すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む抗体である。
　上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。
ヒト化抗体
　ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体）は、ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の適切な位置に移植した抗体をいう。
　本発明のヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＳＩＲＰαに結合し、かつ、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害することにより、マクロファージの貪食能を増強するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ：ｆｒａｍｅ　ｗｏｒｋ）領域に移植した可変領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　具体的には、抗体Ｄ１３、抗体Ｆ４４又は抗体Ｆ６３のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計したＤＮＡ配列を合成すればよい。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するように選択される。また、必要な場合は、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい。ＣＤＲを移植したヒト化抗体の作製は、公知のＣＤＲグラフティング技術により行うことができる。
　上記の方法で、抗体Ｄ１３の重鎖可変領域のＣＤＲ（配列番号１～６に示すアミノ酸からなる６つのＣＤＲ）を有するヒト化抗体の重鎖であって、可変領域のフレームワーク領域の一部のアミノ酸が置換された重鎖として、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１及びヒト化抗体重鎖ｈＨ２が挙げられる。また、抗体Ｄ１３の軽鎖可変領域のＣＤＲを有するヒト化抗体の軽鎖であって、可変領域のフレームワーク領域の一部のアミノ酸が置換された軽鎖として、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ２、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ３及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ４が挙げられる。
　ヒト化抗体重鎖ｈＨ１の全長ヌクレオチド配列を配列番号４０に、アミノ酸配列を配列番号４１に示す。また、ヒト化抗体重鎖ｈＨ２の全長ヌクレオチド配列を配列番号４２に、アミノ酸配列を配列番号４３に示す。配列番号４０及び４２において、１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１８～１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。また、配列番号４１及び４３において、１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列、２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域、１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域のアミノ酸配列である。図１１に抗体Ｄ１３の重鎖可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ１の可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ２の可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）の比較を示す。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号４１又は４３の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域と１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖定常領域を有する抗体を含む。
　ヒト化抗体軽鎖ｈＬ２の全長ヌクレオチド配列を配列番号３４に、アミノ酸配列を配列番号３５に示す。また、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ３の全長ヌクレオチド配列を配列番号３６に、アミノ酸配列を配列番号３７に示す。さらに、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ４の全長ヌクレオチド配列を配列番号３８に、アミノ酸配列を配列番号３９に示す。配列番号３４、３６及び３８において、１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３８２～７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。配列番号３５、３７及び３９において、１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列、２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域、１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域のアミノ酸配列である。図１２に抗体Ｄ１３の軽鎖可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ２の可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＬ３の可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ４の可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）の比較を示す。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号３５、３７及び３９の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなる可変領域と１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖定常領域を有する抗体を含む。
　ヒト化抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域であってＰｒｏ変異及びＦＡＬＡ変異を有する重鎖定常領域ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡである。
　ヒトＳＩＲＰαとの結合性が高い抗体であり、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合の阻害活性が高い抗体として、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ３からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３抗体）、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ４からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４抗体）、ヒト化抗体重鎖ｈＨ２及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ２からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２抗体）及びヒト化抗体重鎖ｈＨ２及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ３からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体）が挙げられる。
　ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３抗体は、配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。
　ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４抗体は、配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。
　ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２抗体は、配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。
　ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体は、配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。
　なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られている（Ｔｓｕｂａｋｉ　ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ，１３９－１４７，２０１３）。しかし、この重鎖配列の欠失は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失した抗体も含まれる。
その他の抗体
　本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合性断片が保持する機能は、ＳＩＲＰαに対する結合活性である。
　例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域（Ｆｖ）、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
　さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
　本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。
　本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
　一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
　また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
　本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ　ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン－へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
　本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＳＩＲＰα抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
　本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。
　また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ　Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ　Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。
抗体の産生方法
　本発明の抗体は、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を培養することにより、リコンビナント抗体として細胞に産生させることができる。
　抗体をコードするＤＮＡは、重鎖可変領域をコードするＤＮＡと重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結することにより重鎖をコードするＤＮＡが得られ、さらに軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結することにより軽鎖をコードするＤＮＡが得られる。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、上記の重鎖をコードするＤＮＡ及び軽鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させることができる。この際、上記の重鎖をコードするＤＮＡ及び軽鎖をコードするＤＮＡを同じ発現ベクターに導入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよいし、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡを別々のベクターに挿入し、２つのベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよい。この際、重鎖定常領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを予め導入したベクターに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを導入してもよい。また、該ベクターは宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡをインフレームで連結しておく。抗体が産生された後にシグナルペプチドを除去することにより、抗体を成熟タンパク質として得ることができる。
　この際、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ及び重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡをプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。
　発現ベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、公知のプラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＣ１９、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。例えば、動物細胞として、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞等を用いればよい。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法等が挙げられる。産生された抗体は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用して精製することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択し、組み合わせればよい。
抗腫瘍剤
　本発明は、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤を包含する。ただし、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域であってＰｒｏ変異及びＦＡＬＡ変異を有する重鎖定常領域ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡであり、エフェクター機能を有しておらず、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害することにより、“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナル伝達を阻害する機能のみを有している。そのため、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のみでは、腫瘍細胞を十分に傷害することはできない。そこで、本発明はエフェクター機能を有し、腫瘍細胞を攻撃し傷害し得る他の抗腫瘍剤や腫瘍細胞による免疫細胞の免疫チェックポイントを阻害する他の抗腫瘍剤と併用する。併用に用いる他の抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に結合し、腫瘍細胞とマクロファージ等の貪食細胞とを接触させることができる。そのときに本発明の抗ＳＩＲＰα抗体が腫瘍細胞のＣＤ４７と貪食細胞のＳＩＲＰαとの結合を阻害することにより、貪食細胞の腫瘍細胞の貪食能を増強するので、腫瘍細胞は傷害される。すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と他の抗腫瘍剤を併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果を発揮することができる。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と併用する抗腫瘍剤として、免疫チェックポイント阻害剤、がん抗原に特異的に結合してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ－１と、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤などが挙げられ、具体的には抗ＰＤ－１抗体（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤＲ－００１、ＢＩ　７５４０９１）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ａｖｅｌｕｍａｂ、ｄｕｒｂａｒｕｍａｂ）、抗ＣＴＬＡ４抗体（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）等が挙げられる。また、がん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬としては、抗ＣＤ２０抗体（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、抗ＥＧＦＲ抗体（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＣＤ５２抗体（ａｌｅｍｕｔｕｚｕｍａｂ）等が挙げられる。
　ＡＤＣＣは、Ｆｃγレセプターを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ等）が標的細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応をいう。ＡＤＣＣを担うプライマリー細胞であるＮＫ細胞ではＦｃγＲＩＩＣとＦｃγＲＩＩＩＡが発現しており、単球ではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ及びＦｃγＲＩＩＩＡを発現している。一方、ＡＤＣＰは、Ｆｃレセプターを発現する貪食細胞（例えばマクロファージ、好中球等）が標的細胞上に結合した抗体を認識して、その後、ターゲット細胞を細胞内に貪食する細胞介在性反応をいう。ＡＤＣＰを担うプライマリー細胞である単球ではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ及びＦｃγＲＩＩＩＡが発現している。
　本発明は、抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、上記の他の抗腫瘍剤と併用される抗腫瘍剤を含む。
　さらに、本発明は抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤と上記の他の抗腫瘍剤の両方を含む抗腫瘍剤又はキットを含む。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤と上記の他の抗腫瘍剤は同時に投与しても、逐次に投与してもよい。また、投与順は限定されず、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤を投与した後に他の抗腫瘍剤を投与してもよく、他の抗腫瘍剤を投与した後に、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤を投与してもよい。
　本発明の抗腫瘍剤は、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽腫から選択される一種又は複数種に対して使用することができる。具体的には、がん腫では、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がんなどが挙げられ、肉腫では、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫などが挙げられ、リンパ腫では、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫などが挙げられ、白血病では、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群などが挙げられ、骨髄腫では、多発性骨髄腫などが挙げられ、胚細胞腫では、精巣がん、卵巣がんなどが挙げられ、脳腫瘍では、神経膠腫、髄膜腫などが挙げられる。
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、他の抗腫瘍剤と併用することにより細胞性免疫を増強する。本発明は、抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む細胞性免疫増強剤も包含する。該細胞性免疫増強剤においては、ナチュラルキラー細胞及び／又はＴ細胞の機能増強に伴う細胞性免疫を増強する。
　本発明の抗腫瘍剤は、治療に有効量の抗ＳＩＲＰα抗体と薬学上許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤等を含めることができる。「薬学上許容可能な担体」等は、対象疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜選択することができる。本発明の抗腫瘍剤の投与方法は適宜選択することができるが、例えば注射投与することができ、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調整するようにしてもよい。 
　他の投与方法についても、製剤の開発と共に適宜選択することができる。例えば経口投与の場合には、経口液剤や散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤等を適用することができる。経口液剤の場合には、懸濁剤及びシロップ剤等のような経口液体調整物として、水、シュークロース、ソルビトール、フラクト－ス等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクト－ス、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギニン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤及びカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の組成物における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセル剤を製造する際には、固体の製造担体が用いられる。
　治療に用いるに有効な抗体の量は、治療する病状の性質、患者の年齢や状態により変更され、最終的には医師が決めればよい。例えば、１回体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇである。所定の投与量は１～１８０日に１回投与してもよいし、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の分割投与とし適当な間隔で投与してもよい。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１．ラット抗ＳＩＲＰＡ抗体の作製
１）‐１　発現コンストラクト調製
１）‐１‐１　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ発現ベクターの構築
　ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＰ＿００１０３５１１１）のアミノ酸配列の１乃至３７３番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡと制限酵素ＸｂａＩとＰｍｅＩで消化したベクターｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｘＺ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて結合することにより、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号４５に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号４４に示す。
１）‐１‐２　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ発現ベクターの構築
　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１０３５１１１）のアミノ酸配列の１乃至１４９番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶのアミノ酸配列を配列表の配列番号４７に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号４６に示す。
１）‐１‐３　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターの構築
　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２（Ｖ１配列、ＪＢＣ　Ｖｏｌ.２８９，Ｎｏ１４，１００２４（２０１４）を元に改変）のアミノ酸配列の１乃至３７２番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号４９に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号４８に示す。
１）‐１‐４　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ発現ベクターの構築
　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２のアミノ酸配列の１乃至１４８番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶのアミノ酸配列を配列表の配列番号５１に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号５０に示す。
１）‐１‐５　ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ発現ベクターの構築
　ｃＳＩＲＰＡ（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１７６８）のアミノ酸配列の１乃至３７２番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ発現ベクターを作製した。ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号５３に、ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号５２に示す。
１）‐１‐６　ＣＤ４７‐Ｆｃ発現ベクターの構築
　ヒトＣＤ４７（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１２７１６７９）のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＣＤ４７‐Ｆｃ発現ベクターを作製した。ＣＤ４７‐Ｆｃのアミノ酸配列を配列表の配列番号５５に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号５４に示す。
１）‐２　リコンビナント蛋白質の調製
１）‐２‐１　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤの調製
　１）‐１‐１で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ　ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にトランスフェクションすることで一過性に発現させた。培養上清を３×ＰＢＳで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ　ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に添加したのち、３×ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に３×ＰＢＳ、５００　ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ　７．５で溶出した。回収したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ画分からＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤを精製した。
１）‐２‐２　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶの調製
　１）‐１‐２で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ　ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にトランスフェクションすることで一過性に発現させた。培養上清を３×ＰＢＳで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ　ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に添加したのち、３×ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に３×ＰＢＳ、５００　ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ　７．５で溶出した。回収したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ画分からＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶを精製した。
１）‐２‐３　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤの調製
　１）‐１‐３で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターを用いて１）‐２‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤを精製した。
１）‐２‐４　ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶの調製
　１）‐１‐４で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターを用いて１）‐２‐２と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤを精製した。
１）‐２‐５　ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤの調製
　１）‐１‐５で作製したｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ発現ベクターを用いて１）‐２‐１と同様の方法でｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤを精製した。
１）‐２‐６　ＣＤ４７‐Ｆｃの調製
　ＣＤ４７‐Ｆｃ発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ　ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にトランスフェクションすることで一過性に発現させた。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）にすべて入れたのち、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、ＣＤ４７‐Ｆｃの含まれる画分を集めた。回収したＣＤ４７‐Ｆｃ画分からＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＣＤ４７‐Ｆｃを精製した。
１）‐３　免疫
　免疫にはＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）を使用した。１）‐２で作製した抗原蛋白ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶそれぞれとＦｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社）を混合したものを尾根部に投与したラットのリンパ節及び脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
１）‐４　ハイブリドーマ作製
　リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０‐ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ‐１５８１）をＬＦ３０１‐Ｃｅｌｌ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｕｎｉｔ（ＢＥＸ社）を用いて電気細胞融合し、Ｃｌｏｎａ　Ｃｅｌｌ‐ＨＹ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ＭｅｄｉｕｍＤ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ＳＩＲＰＡ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを実施した。
１）‐５　抗原結合性抗体スクリーニング用発現ベクターの構築
１）‐５‐１　ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１及びＶ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ及びＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ）の構築
　ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１蛋白質（ＮＰ＿００１０３５１１１）、又はヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２蛋白質［ＮＰ＿００１０３５１１１、ＪＢＣ　Ｖｏｌ.２８９，Ｎｏ１４，１００２４(２０１４)を元に改変］をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれを発現するベクターｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ、Ｖ２＿ＥＣＤ（又はｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２）を構築した。ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５６に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５７にそれぞれ示す。
１）‐５‐２　サルＳＩＲＰＡ及びマウスＳＩＲＰＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ又はｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ）の構築
　サルＳＩＲＰＡ蛋白質（ＮＰ＿００１２７１６７９）又はマウスＳＩＲＰＡ蛋白質（Ｃ５７ＢＬ６：ＮＰ＿０３１５７３、ＢＡＬＢ／ｃ：ＢＡＡ２０３７６、１２９：Ｐ９７７９７、ＮＯＤ　ＳＣＩＤ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４３，６１－６７，２０１４を元に改変）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５－ＤＥＳＴベクター、又はｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれの蛋白質を発現するベクターｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ及びｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢ／ｃ、１２９、ＮＯＤ）を構築した。サルＳＩＲＰＡのアミノ酸配列を配列表の配列番号５８に、マウスＳＩＲＰＡ＿Ｃ５７ＢＬ／６のアミノ酸配列を配列表の配列番号５９に、マウスＳＩＲＰＡ＿ＢＡＬＢ／ｃのアミノ酸配列を配列表の配列番号６０に、マウスＳＩＲＰＡ＿１２９のアミノ酸配列を配列表の配列番号６１に、マウスＳＩＲＰＡ＿ＮＯＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号６２にそれぞれ示す。
１）‐６　ハイブリドーマスクリーニング
１）‐６‐１　Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
　ＨＥＫ２９３α細胞（インテグリンαｖ及びインテグリンβ３を発現するＨＥＫ２９３由来の安定発現細胞株）を１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中７．５×１０５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた形質移入手順に従い、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１若しくはｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２、又はコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入後、９６‐Ｈａｌｆ　ａｒｅａ　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に５０μＬずつ分注、又は９６‐ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注し、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で２４から２７時間培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。
１）‐６‐２　ヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価（Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ）
　実施例１）‐６‐１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２又はｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ‐Ｒａｔ　ＩｇＧ‐Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５　Ｍ　クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ　リン酸水素２ナトリウム・１２水　ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ　ＨＣＬを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＳＩＲＰＡに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５－ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１及びＳＩＲＰＡ＿Ｖ２発現ベクター導入２９３α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ＳＩＲＰＡ抗体産生陽性として選択した。
１）‐６‐３　ＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
　実施例１）‐６‐１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２又はｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、直後に終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５　Ｍ　クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ　リン酸水素２ナトリウム・１２水　ｐＨ４．５）にｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ　ＨＣｌを１００μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｅｖｉｃｅｓ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＳＩＲＰＡとＣＤ４７‐Ｆｃの結合を特異的に阻害する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールの培地添加群と比較し、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、又はＳＩＲＰＡ＿Ｖ２発現ベクター導入２９３α細胞において、より低い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを、リガンド結合阻害活性を持つ抗ＳＩＲＰＡ抗体産生陽性として選択した。
１）‐６‐４　マウス、サルＳＩＲＰＡに対する種交差性評価
　実施例１）‐５‐２で調製したｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、又はマウスＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法でサル、又はマウスＳＩＲＰＡに対する結合性を評価した。上記のヒト、及び動物種への結合活性、並びにＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性をもとに、Ｄ１３、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｆ４７、Ｆ６０、Ｆ６３、及びＦ８６抗体の計７クローンを選抜した。
１）‐７　抗体のアイソタイプ決定
　取得したラット抗ＳＩＲＰＡ抗体産生ハイブリドーマの中から、強く特異的にヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１及びＳＩＲＰＡ＿Ｖ２並びにサルＳＩＲＰＡに結合し、高いＳＩＲＰＡ－ＣＤ４７結合阻害活性能を有することが示唆されたＤ１３、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｆ４７、Ｆ６０、Ｆ６３、及びＦ８６抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Ｒａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により決定された。その結果、ラット抗ＳＩＲＰＡモノクローナル抗体Ｄ１３、Ｆ４２、Ｆ６０、及びＦ８６のアイソタイプはＩｇＧ１／κ鎖、Ｆ４４、Ｆ４７のアイソタイプはＩｇＧ２ａ／κ鎖、Ｆ６３のアイソタイプはＩｇＧ２ａ／λ鎖であることが確認された。
１）‐８　モノクローナル抗体の調製
１）‐８‐１　培養上清の調製
　７種類のラット抗ＳＩＲＰＡモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず各抗体産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ‐ＨＹ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で十分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　ＩｇＧ　ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２０％添加した、５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）含有Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に培地交換し、７日間培養した。本培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を通して滅菌した。
１）‐８‐２　抗体の精製
　実施例１）‐８‐１で調製したハイブリドーマの培養上清から抗体をＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に抗体を吸着させ、ＰＢＳでカラムを洗浄後に０．１Ｍ　グリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液に１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０～７．５に調整した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にてＰＢＳへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ‐Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例２．ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体（７種）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
２）‐１　抗原結合性抗体スクリーニング用発現ベクターの構築
２）‐１‐１　ＦＬＡＧ‐ヒトＳＩＲＰＡ発現ベクター（ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐Ｖ１０）の構築
　１０種類のヒトＳＩＲＰＡバリアント蛋白質（Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８，１３１３‐１３２３，２００７より抜粋）をコードするｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれのバリアント蛋白質を発現するベクターｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐Ｖ１０を構築した。
　ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ３のアミノ酸配列を配列表の配列番号６３に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ４のアミノ酸配列を配列表の配列番号６４に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ５のアミノ酸配列を配列表の配列番号６５に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ６のアミノ酸配列を配列表の配列番号６６に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ７のアミノ酸配列を配列表の配列番号６７に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ８のアミノ酸配列を配列表の配列番号６８に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ９のアミノ酸配列を配列表の配列番号６９に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１０のアミノ酸配列を配列表の配列番号７０に、それぞれ示す。
２）‐１‐２‐１　ヒトＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ、ＩｇＶ、及びＩｇＶ＿ＩｇＣ１発現ベクター（ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ、及びＩｇＶＩｇＶ＿ＩｇＣ１）の構築
　ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２の全長アミノ酸（１乃至５０４番）、及び１６５乃至３７１番の領域の欠損体（以下「ＩｇＶ体」と記す）、２２５乃至３７１番の領域の欠損体（以下「ＩｇＶ＿ＩｇＣ体」と記す）をコードするｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれの変異体蛋白質を発現するベクターを構築した。
　ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ体のアミノ酸配列を配列表の配列番号７１に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ＿ＩｇＣ１体のアミノ酸を配列表の配列番号７２に示す。
２）‐１‐２‐２　ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０、Δ１、及びΔ２＿マウスＳＩＲＰＡ発現ベクター（ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０、Δ１、及びΔ２）の構築
　配列番号６０に記載のマウスＳＩＲＰＡの８１乃至８５番目のアミノ酸残基からなるＳＦＴＧＥ配列（配列番号７８）をＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）に置換し、１２６乃至１３０番目のアミノ酸残基からなるＲＧＳＳＥ配列（配列番号７９）をＫＧＳ配列に置換したＳＩＲＰＡ変異体をｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０と命名した。配列番号６０に記載のマウスＳＩＲＰＡの８１乃至８５番のアミノ酸残基からなるＳＦＴＧＥ配列（配列番号７８）をＮＱＫＥＥ配列（配列番号７７）に置換したＳＩＲＰＡ変異体をｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１と命名した。さらに、配列番号６０に記載のマウスＳＩＲＰＡの８１乃至８５番のアミノ酸残基からなるＳＦＴＧＥ配列(配列番号７８）をＳＦＴＥＧ配列（配列番号８０）に置換したＳＩＲＰＡ変異体をｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２と命名した。これらのＳＩＲＰＡ変異体をコードするｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれのＳＩＲＰＡ変異体を発現するベクターを構築した。
　ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０のアミノ酸配列を配列表の配列番号７３に、ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１のアミノ酸を配列表の配列番号７４に、ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２のアミノ酸を配列表の配列番号７５にそれぞれ示す。
２）‐２　ヒトＳＩＲＰＡバリアントＶ１～Ｖ１０に対する結合性評価
　実施例２）‐１‐１で調製した１０種類のバリアント蛋白質の発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１～Ｖ１０又はｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ精製抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡバリアント発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐２に示すヒトＳＩＲＰＡの結合活性表価と同じ方法で、１０種類のヒトＳＩＲＰＡバリアント体に対する結合性を評価した。各バリアントに対するラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
　表１に示すように何れのクローンも全てのバリアントに対し結合性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２）‐３　マウス、サルＳＩＲＰＡに対する種交差性評価
　実施例１）‐５‐２で調製したｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、又はｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法でサル、又はマウスＳＩＲＰＡに対する結合性を評価した。
　表２に示す通り、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体はいずれもサルＳＩＲＰＡには結合性を示したが、マウスＳＩＲＰＡには結合性を示さなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
２）‐４　エピトープ解析
２）‐４‐１‐１　Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ解析（１）
　２）‐１‐２‐１で調製したｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＥＣＤ体、ＩｇＶ体、並びにＩｇＶ＿ＩｇＣ１体発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、それぞれの細胞に対し終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ精製抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡコンストラクト発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下はヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法で精製抗体７クローンの各ドメイン体への結合性を評価した。各コンストラクトに対するラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
　図１Ａに示す通り、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体は何れのコンストラクトに対しても結合を示すことから、ＩｇＶドメインを認識することが示唆された。
２）‐４‐１‐２　Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ解析（２）
　２）‐１‐２‐２で調製したｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０、Δ１、並びにΔ２発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、それぞれの細胞に対し終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＤ１３ヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体４種、及びキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体をそれぞれ５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡコンストラクト発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下はヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法で各コンストラクトへの結合性を評価した。各コンストラクトに対する抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
　図１Ｂに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３はＮＱＫＥＧ配列を持つｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０に対しては、添加した抗体濃度依存的な結合性を示したが、Δ１、及びΔ２に対しては、いずれの濃度においても結合性を示さなかった。
　以上のことから、ｈＤ１３及びcＤ１３の結合にはＮＱＫＥＧの配列が必要であることが示唆された。
２）‐４‐２　Ｘ線結晶構造解析によるエピトープ解析
２）‐４‐２‐１　複合体の結晶化
　全長型のｃＤ１３抗体を弱酸性下でＬｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（Ｗａｋｏ）により限定的に切断し、ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ　Ｓ陽イオン交換カラム（東ソー）を用いてｃＤ１３抗体のＦａｂ断片を分離した。実施例１）‐２で取得したＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶとｃＤ１３のＦａｂ断片をモル比１：１で混合し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５，１０／３００ＧＬゲルろ過カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で複合体画分を分離した後、限外ろ過により１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ　８．２）に緩衝液を置換し、３ｇ／Ｌに濃縮した。複合体溶液を蒸気拡散法により結晶化した。タンパク質溶液０．５μＬに沈殿剤溶液（０．２Ｍ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉｂａｓｉｃ、２０％（ｗ／ｖ）　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ　３３５０、ｐＨ　９．２)を等量加えた溶液を、０．０５ｍＬの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、２５℃で静置した。１週間後に０．２ｍｍ×０．２ｍｍ×０．０５ｍｍの棒状晶が得られた。得られた結晶を、Ｇｌｙｃｏｌで沈殿剤溶液を約１．４倍希釈した溶液に浸し、続いて液体窒素で凍結した。放射光施設フォトンファクトリー（つくば）のビームラインＰＦ　ＢＬ‐１７ＡにてＸ線回折データを収集した。得られた回折像からソフトウェアＸＤＳ（Ｍａｘ　Ｐｌａｎｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は六方晶系で空間群はＲ３２、結晶の単位格子はａ＝ｂ＝１４９．６１Å、ｃ＝１５５．６１Å、ａｌｐｈａ＝ｂｅｔａ＝９０°、ｇａｍｍａ＝１２０°であった。
２）‐４‐２‐２　複合体の構造解析
　得られた構造因子とＦａｂ断片のホモロジーモデル及びヒトＳＩＲＰＡのＩｇＶドメインの既知構造（ＰＤＢＩＤ：２ＪＪＳ）の三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。計算にはソフトウェアｐｈａｓｅｒ（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｎｏ．４）を使用した。結晶は非対称単位に１つの複合体を含んでいた。ソフトウェアＲｅｆｍａｃ５（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｎｏ．４）を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアｃｏｏｔを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、２．４Å分解能で最終のＲ値２２％、ｆｒｅｅ　Ｒ値２５％を得た。最終のモデルはｃＤ１３のＦａｂ断片のＬ鎖アミノ酸残基１‐２１３、Ｈ鎖アミノ酸残基１‐２２５、及び、ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のアミノ酸残基３３‐１４３を含む。
２）‐４‐２‐３　複合体の構造解析Ｄ１３のエピトープの同定
　ｃＤ１３のＦａｂ断片から４Å以内にあるヒトＳＩＲＰＡのアミノ酸残基（各アミノ酸残基の位置は、配列表の配列番号５７に対応している）は以下の通りである：Ｇｌｙ６４、Ｐｒｏ６５、Ｌｅｕ７８、Ｇｌｎ８２、Ｌｙｓ８３、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｙ８５、Ｈｉｓ８６、Ｐｈｅ８７、Ｔｈｒ９１、Ｔｈｒ９２、Ｇｌｕ９５、Ｔｈｒ９７、Ｌｙｓ９８、Ｌｙｓ１２６。図２に複合体全体のリボンモデルと表面を、図３にヒトＳＩＲＰＡのｂｅｔａ５以前（Ａ）とｂｅｔａ５以降（Ｂ）の領域とｃＤ１３との相互作用を示した。ｃＤ１３がヒトＳＩＲＰＡにおいて配列多様性の低いｂｅｔａ４‐５ループ、つまり残基番号８２‐８７を強く認識することが、様々なバリアントに強く結合することを可能としていることが示唆された（図４）。一方で、ｂｅｔａ５‐６ループつまり残基番号９２‐１０５の領域での相互作用は弱い。例えば、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸に置換されたバリアントが存在するＧｌｕ９５はＦａｂ近傍に存在するが、その側鎖の電子密度が観測されず相互作用に大きく寄与していないことが示唆される。なお、図４の配列において「・」はＳＩＲＰＡ＿Ｖ１と同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は異なるアミノ酸残基を示す。
２）‐５　ヒトＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
　１）‐５‐１で調製したヒトＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２又はｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ精製抗体を５０μＬ／ウェル添加した。直後に終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法で結合阻害活性を評価した。
　表３に示すとおり、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体は、何れもヒトＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７に対して結合阻害活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２）‐６　ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
２）‐６‐１　標的細胞の調製
　ヒト胃癌細胞株ＡＧＳ細胞はＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、３７℃　５分間反応後、剥離した。１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。４×１０７細胞を分取、遠心後、ＰＫＨ２６　Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ社製）付属のＤｉｌｌｕｅｎｔＣ　２ｍＬで細胞を懸濁した。標識溶液として１ｍＭ　ＰＫＨ２６　ＬｉｎｋｅｒをＤｉｌｌｕｅｎｔＣで１０μＭに希釈後、ただちに、細胞懸濁液と等量のＰＫＨ２６　Ｌｉｎｋｅｒ溶液を混合し、室温５分間静置した。２５ｍＬの１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、２×１０６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
２）‐６‐２　ＰＢＭＣ細胞の調製
　２０ｍＬ　Ｆｉｃｏｌｌ　Ｐａｑｕｅ　Ｐｌｕｓ（ＧＥ社製）に２５ｍＬ健常人血液をゆっくり重層後、室温１５００ｒｐｍ×３０分間遠心した。血漿とＦｉｃｏｌｌ　Ｐａｑｕｅ　Ｐｌｕｓの中間に位置する細胞層をスポイトで回収し、２０ｍＬ　１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に懸濁した。１５００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２０ｍＬ　１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、２回洗浄した。１ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ　ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に懸濁したのち、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測しエフェクター細胞として用いた。
２）‐６‐３　エフェクター細胞の調製
　実施例２）‐６‐２で調製したＰＢＭＣ細胞はＲｏｂｏＳｅｐ　ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）にて５×１０７細胞／ｍＬになるように調製した。Ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｋｉｔ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　ＣＤ１６　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）付属のＥａｓｙＳｅｐ　ｈｕｍａｎ　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｃｏｃｋｔａｉｌをＰＢＭＣ細胞懸濁液１ｍＬあたり５０μＬ添加した。４℃　１０分間反応後、ＥａｓｙＳｅｐ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ＰａｒｔｉｃｌｅｓをＰＢＭＣ細胞懸濁液１ｍＬあたり５０μＬ添加した。４℃　５分間反応後、２．５ｍＬになるようにＲｏｂｏＳｅｐ　ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）を添加し、ＥａｓｙＳｅｐ　Ｍａｇｎｅｔにセットした。２分３０秒後に上清を回収した後１２００ｒｐｍ×５分間遠心し、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ画分を分取した。１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加1回洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ‐ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣ社製）を含む１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、浮遊用２２５ｃｍ2フラスコ（住友ベークライト社製）に播種した。３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で１０日間培養した。培養上清を除き、１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ‐１０、１０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ‐ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣ社製）を含む１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、さらに２日間培養した。１２日後、分化誘導されたマクロファージはＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、３７℃　４０分間反応後、剥離した。１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、５×１０５細胞／ｍＬになるように、１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に再懸濁し、エフェクター細胞として用いた。
２）‐６‐４　ＡＤＣＰ活性の評価
　実施例２）‐６‐１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体７クローン、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４（抗ヒトＣＤ４７抗体：ＰｌｏＳ　ＯＮＥ　１０[９]：ｅ０１３７３４５、ＵＳ２０１５１８３８７４を元に調製）、ＴＴＩ‐６２１（ヒトＳＩＲＰＡ‐Ｆｃ：ＷＯ２０１４／０９４１２２を元に調製）又は各種コントロールＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。単剤群では１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、併用群では終濃度で２５０ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ社製）を５０μＬ／ウェル添加した。実施例２）‐６‐３で調製した、１×１０６細胞／ｍＬ、５０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を添加後、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で１６時間静置した。４℃　１２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。細胞に４５μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳ、５μＬ／ウェルのＡＰＣ　ｈｕｍａｎ　ＣＤ１１ｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）を添加し、４℃、１５分間静置した。２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、４℃、一晩静置した。翌日フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＰＥ陽性（Ａ）、ＡＰＣ、ＰＥ共に陽性（Ｂ）となる細胞数を算出した。ＡＰＣ、ＰＥ共に陽性（Ｂ）となった細胞をマクロファージにより標的細胞が貪食されたものとした。ＡＤＣＰ活性による細胞貪食率は次式で算出した。
細胞貪食率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００
　図５に示す通り、ＣＤ４７陽性ヒト胃癌細胞株ＡＧＳに対し、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体単剤では、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４（抗ヒトＣＤ４７抗体）、及びＴＴＩ‐６２１（ヒトＳＩＲＰＡ‐Ｆｃ）と比較し低いＡＤＣＰ活性を示した（図５Ａ）。一方で、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ併用時は、Ｈｕ５Ｆ９‐Ｇ４、及びＴＴＩ‐６２１と同等程度のＡＤＣＰ活性を示した（図５Ｂ）。よって、抗ＳＩＲＰＡ抗体によりＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７の結合を阻害することで、マクロファージの貪食能が増強することが示唆された。
実施例３．ラット抗ＳＩＲＰＡ抗体（Ｄ１３、Ｆ４４、Ｆ６３）可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
３）‐１　Ｄ１３の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
３）‐１‐１　Ｄ１３生産ハイブリドーマのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　Ｄ１３の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅するため、Ｄ１３産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）‐１‐２　５’‐ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＤ１３の軽鎖可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
　軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅は、実施例３）‐１‐１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの約１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。Ｄ１３の軽鎖遺伝子の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ　（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
　５’‐ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをプラスミドにクローニングし、次に軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＤ１３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｄ１３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１乃至３に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸は図２８にも示されている。
　各ＣＤＲのアミノ鎖配列は、ＡｂＭの定義　（Ｍａｒｔｉｎ，　Ａ．　Ｃ．　Ｒ．，　Ｃｈｅｅｔｈａｍ，　Ｊ．　Ｃ．　ａｎｄ　Ｒｅｅｓ，　Ａ．　Ｒ．　（１９８９）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８６，９２６８－９２７２）に基づき記載されている。
３）‐１‐３　５’-ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＤ１３の重鎖可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
　重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅は、実施例３）‐１‐１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの約１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。Ｄ１３の重鎖遺伝子の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
　５’‐ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをプラスミドにクローニングし、次に重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＤ１３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｄ１３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号４乃至６に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は図２８にも示されている。
３）‐２　Ｆ４４の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
　実施例３）‐１と同様の方法で実施した。決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ４４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。また、決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ４４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｆ４４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号７乃至１２に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は図２９にも示されている。
３）‐３　Ｆ６３の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
　実施例３）‐１と同様の方法で実施した。決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ６３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。また、決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ６３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｆ６３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１３乃至１８に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は図３０にも示されている。
実施例４．ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）の作製
４）‐１　ヒトキメラ化及びヒト化κタイプ軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
　プラスミドｐｃＤＮＡ３．３‐ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号１９に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
　ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ‐ＬＫを構築した。
４）‐２　ヒトキメラ化及びヒト化λタイプ軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ‐ＬＬの構築
　ｐＣＭＡ‐ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号２０で示されるヒト軽鎖シグナル配列及びヒトλ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐＣＭＡ‐ＬＬを構築した。
４）‐３　ヒトキメラ化及びヒト化ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ‐Ｇ４ＰＦＡＬＡの構築
　配列番号２１で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ４ＰＦＡＬＡ定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を用いて、実施例４）‐２と同様の方法でｐＣＭＡ‐Ｇ４ｐｒｏＦＡＬＡを構築した。
４）‐４　ｃＤ１３の発現ベクターの構築
４）‐４‐１　ｃＤ１３のＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
　実施例３）‐１で得られたＤ１３重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｉｎ‐ｆｕｓｉｏｎクローニング用に設計したプライマーでＰＣＲを行うことにより重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ｐＣＭＡ‐Ｇ４ｐｒｏＦＡＬＡを制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に、Ｉｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、増幅したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＤ１３重鎖発現ベクターを構築した。ｃＤ１３重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２４に示す。１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１８～１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＤ１３重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２５に示す。１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２４及び配列番号２５の配列は図１８にも示されている。
４）‐４‐２　ｃＤ１３の軽鎖発現ベクターの構築
　実施例３）‐１で得られたＤ１３軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｉｎ‐ｆｕｓｉｏｎクローニング用に設計したプライマーでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ｐＣＭＡ‐ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に、Ｉｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、増幅したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＤ１３軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＤ１３軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２に示す。１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３７９～６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＤ１３軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２３に示す。１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１２７～２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２２及び配列番号２３の配列は図１７にも示されている。
４）‐５　ｃＦ４４の発現ベクターの構築
４）‐５‐１　ｃＦ４４のＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
　実施例３）‐２で得られたＦ４４重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例４）‐４‐１と同様の方法でｃＦ４４重鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ４４重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２８に示す。１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１５～１３９５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ４４重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２９に示す。１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２８及び配列番号２９の配列は図２０にも示されている。
４）‐５‐２　ｃＦ４４の軽鎖発現ベクターの構築
　実施例３）‐２で得られたＦ４４軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例４）‐４‐２と同様の方法でｃＦ４４軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ４４軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２６に示す。１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３８２～７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ４４軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２７に示す。１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２６及び配列番号２７の配列は図１９にも示されている。
４）‐６　ｃＦ６３の発現ベクターの構築
４）‐６‐１　ｃＦ６３のＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
　実施例３）‐３で得られたＦ６３重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例４）‐４‐１と同様の方法でｃＦ６３重鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ６３重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３２に示す。１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４３０～１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ６３重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号３３に示す。１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号３２及び配列番号３３の配列は図２２にも示されている。
４）‐６‐２　ｃＦ６３の軽鎖発現ベクターの構築
　実施例３）‐３で得られたＦ６３軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｉｎ‐ｆｕｓｉｏｎクローニング用に設計したプライマーでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ｐＣＭＡ‐ＬＬを制限酵素ＢｓｉＷＩとＨｐａＩで切断した箇所に、Ｉｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、増幅したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＦ６３軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ６３軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３０に示す。１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３９１～７０８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ６３軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号３１に示す。１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１３１～２３６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号３０及び配列番号３１の配列は図２１にも示されている。
４）‐７　ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の調製
４）‐７‐１　ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の生産
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ　Ｆｅｒｎｂａｃｈ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍＬに調製した。４０ｍＬのＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．２４ｍｇの重鎖発現ベクターと０．３６ｍｇの軽鎖発現ベクターと１．８ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍＬのＥＸ‐ＣＥＬＬ　ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ　Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ（Ａｄｖａｎｔｅｃ　＃ＣＣＳ‐０４５‐Ｅ１Ｈ）でろ過した。
４）‐７‐２　ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の精製
　実施例４）‐７‐１で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィーの１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライしたのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍ　アルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ‐Ａ‐Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳ（－）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ‐Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例５．ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
５）‐１　ヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価
５）‐１‐１　ヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価（Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ）
　２９３α細胞［実施例１）‐６に記載］を１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２、若しくはｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、９６‐ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注したのち、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。培養上清を除去後、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２、若しくはｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入細胞のそれぞれに対し、実施例３及び実施例４で調製したｃＤ１３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ４４（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐ、ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ６３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）抗体を終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡコンストラクト発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ　Ｆ(ａｂ’)２Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ、　Ｆｃγ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を加えて、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５Ｍ　クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ　リン酸水素２ナトリウム・１２水　ｐＨ４．５）にｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ　ＨＣｌを１００μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＡＲＶＯ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。各コンストラクトに対するヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
　図６に示す通り、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３抗体はＳＩＲＰＡ＿Ｖ１とＳＩＲＰＡ＿Ｖ２両方に結合し（図６Ａ、Ｂ）、各アイソタイプ間で結合性はほぼ同等であった（図６Ｃ、Ｄ）。
５）‐１‐２　ヒトキメラ化抗体のヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価
　実施例4で作製したｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の実施例１で作製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶに対する解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、ヒトキメラ化抗体をリガンドとして捕捉し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、センサーチップとしてＣＭ５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。チップ上に１μｇ／ｍＬのヒトキメラ化抗体を１０μＬ／分で６０秒間添加した後、抗原としてヒトＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（０．５～８μｇ／ｍＬ）を流速３０μＬ／分で１２０秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を流速２０μＬ／分で３０秒間添加した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
５）‐２　サルＳＩＲＰＡに対する種交差性評価
　２９３α細胞を１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、若しくはｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、９６‐ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注したのち、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。培養上清を除去後、ヒトＳＩＲＰＡに対する結合活性と同様の方法でサルＳＩＲＰＡに対する結合活性を評価した。
　図７に示すように、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３抗体はサルＳＩＲＰＡに結合性を示した。
５）‐３　ヒト、又はサルＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
　実施例５）－１、５）－２で調製したヒトＳＩＲＰＡ、又はサルＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ又はｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したｃＤ１３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ４４（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐ、ＩｇＧ４ｐｆの定常領域４種）、及びｃＦ６３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）を５０μＬ／ウェル添加した。直後に終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法でＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を評価した。
　図８に示すように、ｃＦ４４、ｃＦ６３、ｃＤ１３はヒト及びサルＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を示し（図８Ａ(i)、(ii)、(iii)）、各アイソタイプ間でその活性はほぼ同等であった（図８Ｂ(i)、(ii)、(iii）。
５）‐４　ヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
５）‐４‐１　標的細胞の調製
　ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。以下は２‐６‐１と同様の方法にて標的細胞を調製した。
５）‐４‐２　ＰＢＭＣ細胞の調製
　２）‐６‐２と同様の方法にてＰＢＭＣ細胞を調製した。
５）‐４‐３　エフェクター細胞の調製
　２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製した。
５）‐４‐４　ＡＤＣＰ活性の評価
　実施例５）－４－１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４、ＴＴＩ‐６２１又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。単剤群では１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、併用群では終濃度で４００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＲｉｔｕｘｉｍａｂ（全薬工業社製）を５０μＬ／ウェル添加した。以下は２‐６‐４と同様の方法にてＡＤＣＰ活性を評価した。
　図９に示す通り、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３は、ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞に対し、単剤ではＡＤＣＰ活性を示さず（図９Ａ）、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ併用時において、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４並びにＴＴＩ－６２１と同程度のＡＤＣＰ活性を示した（図９Ｂ）。
５）‐５　ヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のＰＢＭＣ及びマクロファージに対する毒性評価
５）‐５‐１　標的細胞としてのＰＢＭＣ、並びにマクロファージの調製
　２）‐６‐２（ＰＢＭＣ）、並びに２）‐６‐３（マクロファージ）と同様の方法にて標的細胞を調製した。回収した各細胞は２）‐６‐１と同様の方法で蛍光標識し、標的細胞として用いた。
５）‐５‐２　エフェクター細胞の調製
　２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製した。
５）‐５‐３　ＡＤＣＰ活性の評価
　実施例５）－４－２の方法で調製したＰＢＭＣ、又はマクロファージ５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度で０.６４乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したｃＤ１３（ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ４４（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐ、ＩｇＧ４ｐｆの定常領域４種）、ｃＦ６３（ＩｇＧ４ｐｆ）、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４、ＴＴＩ‐６２１又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加した。以下は２‐６‐４と同様の方法にてＡＤＣＰ活性を評価した。なお、マクロファージに対するＡＤＣＰ活性の比率は各抗体添加時のマクロファージのカウント数をコントロール抗体添加時のカウント数で除することで算出した。
　図１０に示す通り、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３のＰＢＭＣに対するＡＤＣＰ活性はコントロールＩｇＧとほぼ同等であった（図１０Ａ）。また、定常領域の異なるｃＦ４４抗体を比較すると、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ４ｐ型では添加した抗体の濃度依存的にＡＤＣＰ活性を示すのに対し、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ４ｐｆ型ではＡＤＣＰ活性を示さなかった（図１０Ｂ）。
　一方で、抗体添加１６時間後のマクロファージの存在比について定常領域の異なるｃＦ４４抗体を比較すると、ＩｇＧ４ｐｆ型が最もマクロファージの減少率が低いことから、抗体添加により誘導される、ＳＩＲＰＡ陽性細胞に対する毒性が最も低い可能性が示された（図１０Ｃ）。
実施例６　ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体の設計
６）‐１　キメラ化抗体ｃＤ１３の可変領域の分子モデリング
　ｃＤ１３の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１‐１５３（１９９１）］を利用した。ｃＤ１３の重鎖と軽鎖の可変領域に対して高い配列同一性を有するＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１‐Ｄ３０３（２００７）］に登録されている構造（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＣＳＹ）を鋳型に、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いて行った。
６）‐２　ヒト化アミノ酸配列の設計
　ｃＤ１３は、ＣＤＲグラフティング［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９‐１００３３（１９８９）］によりヒト化した。ＩＭＧＴ（ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ　ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に登録されているヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＩＧＨＶ３‐３０＊１３とＩＧＨＪ３＊０１、及びＩＧＫＶ１‐６＊０１とＩＧＫＪ２＊０１、そしてＫａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］において既定されるヒトのカッパ鎖サブグループ４のコンセンサス配列がｃＤ１３のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、アクセプターとして選択された。アクセプター上に移入すべきドナー残基は、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９‐１００３３（１９８９）］によって与えられる基準などを参考に三次元モデルを分析することで選択された。
６）‐３　ｃＤ１３重鎖のヒト化
　設計された２種の重鎖をｈＨ１及びｈＨ２と命名した。ｈＨ１の重鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号４１に記載する。配列番号４１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４０に記載する。ｈＨ２の重鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号４３に記載する。配列番号４３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４２に記載する。配列番号４１及び４３において、１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。また、配列番号４０及び４２において、１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１８～１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。配列番号４０及び配列番号４１の配列は図２６にも、配列番号４２及び配列番号４３の配列は図２７にも、示されている。
　ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体ｃＤ１３の重鎖であるｃＤ１３＿Ｈ、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１、及びｈＨ２のアミノ酸配列の比較を図１１に示す。ｈＨ１及びｈＨ２の配列において「・」はｃ０１３＿Ｈと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。
６）‐４　ｃＤ１３軽鎖のヒト化
　設計された３種の軽鎖をｈＬ２、ｈＬ３、及びｈＬ４と命名した。ｈＬ２の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号３５に記載する。配列番号３４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３４に記載する。ｈＬ３の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号３７に記載する。配列番号３７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号３６に記載する。ｈＬ４の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号３９に記載する。配列番号３９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号３８に記載する。配列番号３５、３７及び３９において、１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。また、配列番号３４、３６及び３８において、１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３８２～７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。配列番号３４及び配列番号３５の配列は図２３にも、配列番号３６及び配列番号３７の配列は図２４にも、配列番号３８及び配列番号３９の配列は図２５にも、それぞれ示されている。
　ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体ｃＤ１３の軽鎖であるｃＤ１３＿Ｌ、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ２、ｈＬ３及びｈＬ４のアミノ酸配列の比較を図１２に示す。ｈＬ２、ｈＬ３、及びｈＬ４の配列において、「・」はｃＤ１３＿Ｌと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。
６）‐５　重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化抗体の設計
　ｈＨ１及びｈＬ３からなる抗体を「Ｈ１Ｌ３抗体」又は「Ｈ１Ｌ３」と称する。ｈＨ１及びｈＬ４からなる抗体を「Ｈ１Ｌ４抗体」又は「Ｈ１Ｌ４」と称する。ｈＨ２及びｈＬ２からなる抗体を「Ｈ２Ｌ２抗体」又は「Ｈ２Ｌ２」と称する。ｈＨ２及びｈＬ３からなる抗体を「Ｈ２Ｌ３抗体」又は「Ｈ２Ｌ３」と称する。
実施例７．ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体の作製
７）－１　ヒト化抗体の重鎖発現ベクターの構築
７）－１－１　ｈＨ１発現ベクターの構築
　配列表の配列番号４０に示すｈＨ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３４に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－Ｇ４ｐｒｏＦＡＬＡを制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈＨ１発現ベクターを構築した。
７）－１－２　ｈＨ２発現ベクターの構築
　配列表の配列番号４２に示すｈＨ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３４に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例７）－１－１と同様の方法でｈＨ２発現ベクターを構築した。
７）－２　ヒト化抗体の軽鎖発現ベクターの構築
７）－２－１　ｈＬ２発現ベクターの構築
　配列表の配列番号３４に示すｈＬ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈＬ２発現ベクターを構築した。
７）－２－２　ｈＬ３発現ベクターの構築
　配列表の配列番号３６に示すｈＬ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例７）－２－１と同様の方法でｈＬ３発現ベクターを構築した。
７）－２－３　ｈＬ４発現ベクターの構築
　配列表の配列番号３８に示すｈＬ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例７）－２－１と同様の方法でｈＬ４発現ベクターを構築した。
７）‐３　ヒト化抗体の調製
７）－３－１　ヒト化抗体の生産
　実施例４）－７－１と同様の方法で生産した。実施例６）‐５に示したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせに対応したＨ鎖発現ベクターとＬ鎖発現ベクターの組み合わせで、各種ヒト化抗体を取得した。
７）－３－２　ヒト化抗体の調製
　実施例７）－３－１で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの２段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライした後に、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２　Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で抗体を溶出した。抗体の含まれる画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行い、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ　ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した後に、５ｍＭ　ＮａＰｉ／５０ｍＭ　ＭＥＳ／３０ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ―１　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ　ヒスチジン／５％　ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にて抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例８．ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
８）‐１　ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト、サル、マウスＳＩＲＰＡに対する結合活性
８）‐１－１　ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト、サル、マウスＳＩＲＰＡに対する結合活性（Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ）
　２９３α細胞［実施例１］‐６に記載］を１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐Ｖ１０、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ若しくはｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、９６‐ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注したのち、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。培養上清を除去後、各種ＳＩＲＰＡ遺伝子導入細胞のそれぞれに対し、実施例６及び実施例７で調製したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３及びコントロール抗体を終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は実施例５－１と同様の方法にてヒトＳＩＲＰＡへの結合性を評価した。
　図１３Ａ～Ｃに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体はＳＩＲＰＡバリアント（Ｖ１‐Ｖ１０）、サルＳＩＲＰＡに対しｃＤ１３抗体と同等以上の結合性を示した。一方で、図１４Ａ及びＢに示す通りマウスＳＩＲＰＡに対しては、ヒト化抗体、ヒトキメラ化抗体共に結合性を示さなかった。
８）‐１－２　ヒト化抗体のＳＩＲＰＡに対する結合性評価
　実施例７で作製したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２及びｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３の、実施例１で作製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ及びサルＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤに対する解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化したＡｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）ａｎｔｉｂｏｄｙにヒト化抗体をリガンドとして捕捉し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、センサーチップとしてＣＭ５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。チップ上に１μｇ／ｍＬのヒト化抗体を１０μＬ／分で６０秒間添加した後、抗原としてヒトＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（０．５～８μｇ／ｍＬ）又はサルＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（１～１６μｇ／ｍＬ）を流速３０μＬ／分で１２０秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を流速２０μＬ／分で３０秒間添加した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
８）－２　ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト、又はサルＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
　実施例８）－１で調製したヒトＳＩＲＰＡ、又はサルＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ又はｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３を５０μＬ／ウェル添加し添加し、直後に５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＣＤ４７‐Ｆｃを加えて、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法でＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を評価した。
　図１５に示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体は、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１（図１５Ａ）、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２（図１５Ｂ）、サルＳＩＲＰＡ（図１５Ｃ）に対しｃＤ１３抗体と同等以上の結合阻害活性を示した。
８）‐３　ヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
８）‐３‐１　標的細胞の調製
　ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞、又はＲａｍｏｓ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。４×１０７細胞を分取、遠心後、ＣｅｌｌＶｕｅ　Ｃｌａｒｅｔ　Ｆａｒ　Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｋｉt（Ｓｉｇｍａ社製）付属のＤｉｌｌｕｅｎｔＣ　２ｍLで細胞を懸濁した。標識溶液として１ｍＭ　ＣｅｌｌＶｕｅ　Ｃｌａｒｅｔ　ＤｙｅをＤｉｌｌｕｅｎｔＣで１０μＭに希釈後、ただちに、細胞懸濁液と等量のＣｅｌｌＶｕｅ　Ｃｌａｒｅｔ　Ｄｙｅ溶液を混合し、室温１５分間静置した。２５ｍＬの１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、２×１０６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。以下は２）‐６‐１と同様の方法にて標的細胞を調製した。
８）‐３‐２　ＰＢＭＣ細胞の調製
　２）‐６‐２と同様の方法にてＰＢＭＣ細胞を調製した。
８）‐３‐３　エフェクター細胞の調製
　２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製し、ＰＢＳで２回洗浄後、１×１０６細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁した。標識溶液として１μＬ／１０６細胞／ｍＬのＣＦＳＥ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を添加し、室温１０分間静置した。２０ｍｌの１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、１×１０６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものをエフェクター細胞として用いた。
８）‐３‐４　ＡＤＣＰ活性の評価
　実施例８）－３－１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３抗体、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４、ＴＴＩ‐６２１又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。単剤群では１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、併用群では終濃度で４００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＲｉｔｕｘｉｍａｂ（全薬工業社製）を５０μＬ／ウェル添加した。実施例８‐３‐３で調製した、１×１０６細胞／ｍＬ、５０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を添加後、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で１６時間静置した。４℃　１２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、４℃、一晩静置した。翌日フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＡＰＣ陽性（Ａ）、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となる細胞数を算出した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となった細胞をマクロファージにより標的細胞が貪食されたものとした。ＡＤＣＰ活性による細胞貪食率は次式で算出した。
細胞貪食率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００
　図１６に示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３抗体添加群はＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ、及びＲａｍｏｓ細胞に対し、単剤ではＡＤＣＰ活性を示さず（図１６Ａ、Ｃ）、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ併用時において、添加した抗体濃度依存的なＡＤＣＰ活性を示した（図１６Ｂ、Ｄ）。なお、ヒト化抗体クローンはヒトキメラ化抗体クローンと同等以上のＡＤＣＰ活性を示した。
実施例９．各種抗ＳＩＲＰＡ抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
９）‐１　各種抗ＳＩＲＰＡ抗体のＳＩＲＰＡに対する結合性評価
　実施例７で作製したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３抗体、及びＯＳＥ‐１７２（国際公報第ＷＯ１７／１７８６５３号を参照して調製）、ＫＷＡＲ２３（国際公報第ＷＯ１８／０２６６００号を参照して調製）、又はＡＤＵ‐１８０５（国際公報第ＷＯ１８／１９０７１９号を参照して調製）の、実施例１で作製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ及びヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶに対する解離定数を測定した。なお、ＯＳＥ‐１７２の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号８１に、ＯＳＥ‐１７２の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８２に、ＫＷＡＲ２３の重鎖のアミノ酸配列は配列番号８３に、ＫＷＡＲ２３の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８４に、ＡＤＵ‐１８０５の重鎖のアミノ酸配列は配列番号８５に、ＡＤＵ‐１８０５の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８６に、それぞれ示されている。解離定数の測定には、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化したＡｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）ａｎｔｉｂｏｄｙに各抗体をリガンドとして捕捉し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、センサーチップとしてＣＭ５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。チップ上に２μｇ／ｍＬの各種抗体を１０μＬ／分で３０秒間添加した後、抗原としてヒトＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（０．２５～１６ｎＭ）を流速３０μＬ／分で１２０秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を流速２０μＬ／分で３０秒間添加した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
９）－２　各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
　実施例９）－１で調製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１又はＶ２発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加し、直後に５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル加えて、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法でＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を評価した。
　図３１Ａに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５抗体はＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐ＣＤ４７に対し結合阻害活性を示した。一方で、図３１Ｂに示す通りヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２‐ＣＤ４７に対して、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５は結合性を示したが、ＯＳＥ‐１７２は結合阻害活性を示さなかった。また、図３１Ｃで示されるように、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３が最も低濃度で結合を阻害した。
９）－３　各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＢ、及びヒトＳＩＲＰＧ結合活性評価
　ＳＩＲＰβ１（ｓｉｇｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　β１：ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿００６０５６としてアミノ酸配列が公開されている）、及び　ＳＩＲＰγ（ｓｉｇｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　γ：ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿０６１０２６としてアミノ酸配列が公開されている）は、　ＳＩＲＰＡのファミリー分子である。本発明において、「ＳＩＲＰα」を「ＳＩＲＰＡ」、「ＳＩＲＰβ１」を「ＳＩＲＰＢ１」、「ＳＩＲＰγ」を「ＳＩＲＰＧ」と称する場合がある。ＣＨＯ‐Ｋ１細胞を１０％　ＦＢＳ含有Ｈａｍ‘ｓ　Ｆ‐１２Ｋ培地中３．３ｘ１０５細胞／ｍＬになるよう調製し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で一晩培養した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ヒトＳＩＲＰＢ、ｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ヒトＳＩＲＰＧ、若しくはｐＦＬＡＧ　Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、１０％　ＦＢＳ含有Ｈａｍ‘ｓ　Ｆ‐１２Ｋ培地中で３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。得られた導入細胞を回収し、９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。培養上清を除去後、各種遺伝子導入細胞のそれぞれに対し、各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル添加し、４℃で２５分間静置した。遠心後、上清を除去し、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。遠心後、上清を除去し、ＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）の１／４００希釈溶液を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で２５分間静置した。遠心後、上清を除去し、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。
　遠心後、上清を除去し、１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＰＥの平均蛍光強度を計測した。二次抗体のみ反応させたサンプルの平均蛍光強度で標準化することで、各種抗体におけるファミリー分子への結合性を算出した。
　図３２Ａ及びＢに示す通り、各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体はヒトＳＩＲＰＢ、及びヒトＳＩＲＰＧに対し濃度依存的な結合性を示したが、ＯＳＥ‐１７２はヒトＳＩＲＰＧに対し結合性を示さなかった。
９）‐４　各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
９）‐４‐１　標的細胞の調製
　ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。１×１０６細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁した。標識溶液として１μＬ／１０６細胞／ｍＬのＣｅｌｌ　Ｔｒａｃｅ　Ｆａｒ　Ｒｅｄ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を添加し、室温１０分間静置した。２５ｍＬの１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、２×１０６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。以下は２）‐６‐１と同様の方法にて標的細胞を調製した。
９）‐４‐２　ＰＢＭＣ細胞の調製
　２）‐６‐２と同様の方法にてＰＢＭＣ細胞を調製した。
９）‐４‐３　エフェクター細胞の調製
　２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製し、ＰＢＳで２回洗浄後、１×１０６細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁した。標識溶液として１μＬ／１０６細胞／ｍＬのＣＦＳＥ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を添加し、室温１０分間静置した。２０ｍｌの１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、１×１０６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものをエフェクター細胞として用いた。
９）‐４‐４　ＡＤＣＰ活性の評価
　実施例８－３－１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈した各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。併用群として終濃度で１０００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＲｉｔｕｘｉｍａｂ（全薬工業社製）を５０μＬ／ウェル添加した。実施例８‐３‐３で調製した、１×１０６細胞／ｍＬ、５０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を添加後、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で２～１６時間静置した。４℃　１２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。５０μＬ／ウェルの１×ＢＤ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＡＰＣ陽性（Ａ）、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となる細胞数を算出した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となった細胞をマクロファージにより標的細胞が貪食されたものとした。ＡＤＣＰ活性による細胞貪食率は次式で算出した。
　細胞貪食率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００
　図３３Ａ－Ｃに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５抗体添加群は、ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉに対し、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ併用時において、ＡＤＣＰ活性を示した。２時間反応後のＡＤＣＰ増強活性の強さはｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＡＤＵ‐１８０５、ＫＷＡＲ２３、ＯＳＥ‐１７２の順であり（Ａ）、１６時間反応後はＡＤＵ‐１８０５、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＫＷＡＲ２３、ＯＳＥ‐１７２の順だった（Ｂ）。なお、１６時間での反応性は貪食活性の飽和状態にあると推測される。２時間反応後の濃度依存性とＡＤＣＰ活性比較については、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３が最も低濃度から高い活性を示し、ＡＤＵ‐１８０５とＫＷＡＲ２３はほぼ同等、ＯＳＥ‐１７２の順だった。以上の結果より、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３は短時間で最も低濃度からＡＤＣＰ活性を増強した。
９）‐４‐５　各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体によるマクロファージ同士の貪食活性（Ｓｅｌｆ‐ＡＤＣＰ活性）評価
　実施例８‐３‐３の方法で調製したエフェクター細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度０乃至５０００ｎｇ／ｍＬとなるように１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈した各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ　ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１００μＬ／ウェル添加した。３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で１６～２０時間静置した。４℃　１２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、各ウェルでのＦＩＴＣ陽性となる細胞数を算出した（Ａ）。抗体添加なしのウェルにおけるＦＩＴＣ陽性細胞のカウント（Ｂ）で標準化することで、各サンプルでの減少分はマクロファージ同士の貪食によるものとした。Ｓｅｌｆ‐ＡＤＣＰ活性は次式で算出した。
　Ｓｅｌｆ－ＡＤＣＰ（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
　図３３Ｂに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５抗体添加により、エフェクター細胞であるマクロファージに対し、Ｓｅｌｆ-ＡＤＣＰ活性を示した。減少率の高さはＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、ＡＤＵ‐１８０５、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３の順だった。減少率の高さは、抗ＳＩＲＰＡ抗体によるＳｅｌｆ-ＡＤＣＰ活性が高いことを示している。この現象は、各抗ＳＩＲＰＡ抗体の投与によりマクロファージや樹状細胞などＳＩＲＰＡ陽性細胞が減少又は枯渇する可能性を示唆しており、免疫系に対する副作用の指標となる。
実施例１０．各種抗ＳＩＲＰＡ抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ評価
　ＳＩＲＰＡは宿主の免疫細胞に発現する標的であることから、ヒトＳＩＲＰＡ抗体による抗腫瘍効果を評価するためには、ヒトＳＩＲＰＡを発現するマウスでの検討が必要となる［Ｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ.　ＰＮＡＳ,　２０１７　(１１４)　４９,　Ｅ１０５７８‐Ｅ１０５８５］。一方で、抗腫瘍効果における免疫系の寄与を評価するためには、免疫不全マウスではなく、免疫正常なマウスを用いることが重要である［Ｙａｎａｇｉｔａ　ｅｔ　ａｌ.　ＪＣＩ,　２０１７　(２)　１,　１‐１５］。ヒトＳＩＲＰＡ単独、若しくはヒトＳＩＲＰＡ及びヒトＣＤ４７の両方を免疫正常マウスに導入した遺伝子改変マウスに、ヒトＣＤ４７を遺伝子導入したマウスがん細胞株を移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３程度になったところで群分けを行う。これらのマウスに対し、各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、抗ＣＤ４７抗体又はＳＩＲＰＡ－Ｆｃ融合蛋白質等の抗ＣＤ４７バイオロジクス、又は陰性対照群としてＰＢＳ等を週に１～３回程度、１～３週間投与する。併用薬剤による抗腫瘍効果の上乗せを検討する場合には、これらの各群に対し化学療法剤、抗体医薬、分子標的薬等を併せて投与する。２～３日毎に各投与群における腫瘍径（長径／短径）を電子ノギス等で測定し、腫瘍体積を算出する。各種抗体投与群と陰性対照群の腫瘍体積から腫瘍増殖抑制率を算出することで、各々のｉｎ　ｖｉｖｏにおける薬効を比較評価することが出来る。なお、腫瘍体積、及び腫瘍増殖抑制率は次式で示される。
　腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長径×短径×短径）／２
　腫瘍増殖抑制率（％）＝（１－各投与群の腫瘍体積／陰性対象群の腫瘍体積）×１００
　本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、他のエフェクター機能を有する他の抗体医薬や免疫チェックポイント阻害作用を有する他の抗体医薬と併用するための抗体医薬として利用することができる。
配列番号１：Ｄ１３　ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号２：Ｄ１３　ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号３：Ｄ１３　ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号４：Ｄ１３　ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号５：Ｄ１３　ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号６：Ｄ１３　ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号７：Ｆ４４　ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号８：Ｆ４４　ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号９：Ｆ４４　ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｆ４４　ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｆ４４　ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｆ４４　ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｆ６３　ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１４：Ｆ６３　ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｆ６３　ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１６：Ｆ６３　ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１７：Ｆ６３　ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１８：Ｆ６３　ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１９：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ軽鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２０：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトλ軽鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２１：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ４ＰｒｏＦＡＬＡ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２２：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２３：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２５：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２７：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２９：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３０：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３１：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３２：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３３：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３４：ヒト化Ｄ１３のｈＬ２軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３５：ヒト化Ｄ１３のｈＬ２軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３６：ヒト化Ｄ１３のｈＬ３軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３７：ヒト化Ｄ１３のｈＬ３軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３８：ヒト化Ｄ１３のｈＬ４軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３９：ヒト化Ｄ１３のｈＬ４軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４０：ヒト化Ｄ１３のｈＨ１重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号４１：ヒト化Ｄ１３のｈＨ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号４２：ヒト化Ｄ１３のｈＨ２重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号４３：ヒト化Ｄ１３のｈＨ２重鎖のアミノ酸配列
配列番号４４：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＥＣＤをコードするヌクレオチド配列
配列番号４５：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号４６：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＩｇＶをコードするヌクレオチド配列
配列番号４７：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＩｇＶのアミノ酸配列
配列番号４８：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＥＣＤをコードするヌクレオチド配列
配列番号４９：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号５０：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＩｇＶをコードするヌクレオチド配列
配列番号５１：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＩｇＶのアミノ酸配列
配列番号５２：サルＳＩＲＰＡのＥＣＤをコードするヌクレオチド配列
配列番号５３：サルＳＩＲＰＡのＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号５４：ヒトＣＤ４７－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列
配列番号５５：ヒトＣＤ４７－ＦｃのＩｇＶのアミノ酸配列
配列番号５６：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のアミノ酸配列
配列番号５７：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のアミノ酸配列
配列番号５８：サルＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号５９：Ｃ５７　ＢＬ／６マウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６０：ＢＡＬＢ／ＣマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６１：１２９マウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６２：ＮＯＤマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６３：ヒトＳＩＲＰＡバリアント３のアミノ酸配列
配列番号６４：ヒトＳＩＲＰＡバリアント４のアミノ酸配列
配列番号６５：ヒトＳＩＲＰＡバリアント５のアミノ酸配列
配列番号６６：ヒトＳＩＲＰＡバリアント６のアミノ酸配列
配列番号６７：ヒトＳＩＲＰＡバリアント７のアミノ酸配列
配列番号６８：ヒトＳＩＲＰＡバリアント８のアミノ酸配列
配列番号６９：ヒトＳＩＲＰＡバリアント９のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１０のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ体のアミノ酸配列
配列番号７２：ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ＿ＩｇＣ１体のアミノ酸配列
配列番号７３：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０のアミノ酸配列
配列番号７４：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１のアミノ酸配列
配列番号７５：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２のアミノ酸配列
配列番号７６：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０のアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号７７：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１のアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号７８：ＢＡＬＢ／ＣマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号７９：ＢＡＬＢ／ＣマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列中の１２６番目～１３０番目のアミノ酸配列
配列番号８０：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２のアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号８１：ＯＳＥ－１７２抗体重鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＧ４Ｐｒｏ）のアミノ酸配列
配列番号８２：ＯＳＥ－１７２抗体軽鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＫ）のアミノ酸配列
配列番号８３：ＫＷＡＲ２３抗体重鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＧ４Ｐｒｏ）のアミノ酸配列
配列番号８４：ＫＷＡＲ２３抗体軽鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＫ）のアミノ酸配列
配列番号８５：ＡＤＵ－１８０５抗体重鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＧ２）のアミノ酸配列
配列番号８６：ＡＤＵ－１８０５抗体軽鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＫ）のアミノ酸配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (44)

  1. （a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
    （b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
    （c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
    （d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
    （e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
    （f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
    を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  2. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、請求項１記載の抗体。
  3. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項３記載の抗体。
  5. 　(ai)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
    (aii)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
    (bi)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
    (bii)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
    を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  6. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項５記載の抗体。
  7. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項６記載の抗体。
  8. （a）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
    （b）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
    （c）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
    （d）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
    （e）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
    （f）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
    を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  9. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、請求項８記載の抗体。
  10. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項８又は９に記載の抗体。
  11. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項１０記載の抗体。
  12. 　(ai)配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
    (aii)配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
    (bi)配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
    (bii)配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
    を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  13. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項１２記載のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  14. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項１３記載の抗体。
  15. （a）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
    （b）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
    （c）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
    （d）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
    （e）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
    （f）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
    を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  16. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、請求項１５記載の抗体。
  17. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項１５又は１６に記載の抗体。
  18. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項１７記載の抗体。
  19. 　(ai)配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
    (aii)配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
    (bi)配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
    (bii)配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
    を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  20. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項１９記載のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  21. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項２０記載の抗体。
  22. 　以下の（１）～（８）のいずれかの、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体：
    （１）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
    （２）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
    （３）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
    （４）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
    （５）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
    （６）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
    （７）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；及び
    （８）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  23. 　ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性が低減されている、請求項２２記載の抗体。
  24. 　配列番号５７で表されるヒトＳＩＲＰαの８２番目のＧｌｎ、８３番目のＬｙｓ、８４番目のＧｌｕ、８５番目のＧｌｙを含むエピトープに結合する、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
  25. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、請求項２４記載の抗体。
  26. 　重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項２４又は２５に記載の抗体。
  27. 　重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項２６記載の抗体。
  28. 　マクロファージの貪食作用を増強する請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体。
  29. 　請求項１～２８のいずれか１項に記載の抗体であって、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体。
  30. 　請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片。
  31. 　Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項３０に記載の抗体の抗原結合性断片。
  32. 　請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項３０若しくは３１に記載の抗体の抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物。
  33. 　抗腫瘍剤である、請求項３２記載の医薬組成物。
  34. 　抗腫瘍剤の有効成分として、さらに免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬を含む、請求項３３記載の医薬組成物。
  35. 　請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項３０若しくは３１に記載の抗体の抗原結合断片を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬と併用される医薬組成物。
  36. 　免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤である、請求項３４又は３５に記載の医薬組成物。
  37. 　がん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体からなる群から選択される、請求項３４又は３５に記載の医薬組成物。
  38. 　腫瘍が、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫及び腎芽腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  39. 　腫瘍が、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん、卵巣がん、神経膠腫及び髄膜腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、請求項３８記載の医薬組成物。
  40. 　請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
  41. 　請求項４０記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  42. 　請求項４０記載のポリヌクレオチド又は請求項４１記載のベクターを含む宿主細胞。
  43. 　請求項４２に記載の宿主細胞を培養し、培養物から抗体を精製することを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
  44. 　請求項４３記載の方法によって製造された抗体。
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