CN111548424A - 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111548424A
CN111548424A CN202010508021.XA CN202010508021A CN111548424A CN 111548424 A CN111548424 A CN 111548424A CN 202010508021 A CN202010508021 A CN 202010508021A CN 111548424 A CN111548424 A CN 111548424A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
ser
egfr
gly
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010508021.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张传能
徐圣涛
李强
张朝宾
郭雷鸣
吴国祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Keyi Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Keyi Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Keyi Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Shanghai Keyi Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202010508021.XA priority Critical patent/CN111548424A/zh
Publication of CN111548424A publication Critical patent/CN111548424A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明的涉及一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白，所述多功能融合蛋白包括识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区和用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段。本发明还涉及一种如前所述的多功能融合蛋白在制备克服EGFR耐药性药物中的应用。本发明是一种针对表达EGFR与CD47肿瘤的多功能融合蛋白，其由抗人EGFR单克隆抗体与人SIRPα膜外端第一个功能区串联而成。其识别与屏蔽人肿瘤细胞表面EGFR与CD47，阻断其结合区域。其多功能在于屏蔽信号通路、同时引起ADCC与ADCP等免疫杀伤，对于EGFR耐药性同样具有杀伤功能。

Description

一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白及其应用。
背景技术
EGFR是表达在细胞膜表面的一种蛋白，全称为表皮生长因子受体，可与表皮生长因子(EGF)结合，EGF/EGFR都是在正常细胞里面的蛋白，参与细胞正常的生长和分裂。然而，肿瘤细胞的生长、扩散与转移是恶性肿瘤发生的特征，其中EGF及其在肿瘤细胞上的受体EGFR过度表达是主要原因之一。针对EGFR的抗体通过与肿瘤细胞表面的EGFR结合，阻断其与配体的结合，降低细胞信传递，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、扩散与转移，并减少肿瘤内血管的形成，达到治疗的目的。Cetuximab是一种针对EGFR的治疗性单克隆抗体，对EGFR具有高亲和力，阻断细胞信号通路，从而对高表达EGFR的肿瘤有直接抑制功能，并能引起免疫反应杀伤肿瘤，从而在临床上有一定应用。当EGFR突变或肿瘤对于Cetuximab有耐药性后，并不能够有效杀伤肿瘤，对于很多患者而言并不能够获得好的临床效果。
CD47也称为整合素相关蛋白(integrin-associatedprotein，IAP)，为大小约为50kDa的免疫球蛋白超家族膜蛋白。其与抑制性受体信号调节蛋白α(signalregulatoryα，SIRPα)互为受体和配体，SIRPα主要表达在巨噬细胞和抗原递呈细胞表面，CD47与其结合可以抑制免疫信号，防止自体免疫的发生，抑制巨噬细胞的吞噬作用。CD47表达在红细胞、血小板，淋巴细胞以及干细胞上，这也是其阻止自身被吞噬的主要作用机制。肿瘤产生免疫抑制的一种方式也是高表达CD47，其与巨噬细胞或抗原递呈细胞结合后，产生一种免疫抑制，从而逃避免疫系统。当前，CD47普遍高表达肿瘤细胞上，也就是高表达CD47的细胞可以逃避巨噬细胞的识别与吞噬，从而引起肿瘤的生长与转移。现在有证据表明，利用抗体去阻断CD47与SIRPα的结合可以增加巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，抑制肿瘤细胞的生长。但当前多数CD47抗体容易与红细胞、血小板结合，带来较大的副作用，单纯的SIRPα与CD47亲和力弱，达不到相应的治疗效果。
为了增加EGFR抗体药物的综合药效，克服EGFR抗体的耐药性，解决Sirpα与CD47亲和力不足的缺点，本发明合成了一种多功能融合蛋白，该融合蛋白针对EGFR以及CD47。通过EGFR信号通路抑制肿瘤细胞生长与迁移，利用EGFR高亲和力去识别肿瘤细胞，将针对CD47的Sirpα胞外段带到肿瘤细胞表面达到封闭CD47的目的，屏蔽CD47的功能，从而让巨噬细胞能够识别肿瘤细胞，进行免疫杀伤。
目前，临床上并未有一种利用EGFR高亲和力带一种低亲和力片段去抑制信号通路，克服EGFR耐药性的蛋白药物。本发明的融合蛋白对EGFR突变以及耐药肿瘤都有较好的效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白，所述多功能融合蛋白包括识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区和用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段。
优选地，所述识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区为EGFR抗体可变区；所述屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区为SIRPα-D1；所述结合免疫细胞的功能区为人抗体IgGFc。
优选地，所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10。
优选地，所述EGFR抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述SIRPα-D1氨基酸序列为SEQ ID NO:6；所述用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段序列为SEQ ID NO:7；所述EGFR抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
优选地，所述多功能融合蛋白的制备步骤包括：
S1、通过人工合成的方式合成所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列SEQ IDNO:2和所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10相对应的所述多功能融合蛋白轻链碱基序列SEQ ID NO:1和所述多功能融合蛋白重链碱基序列SEQ ID NO:4或SEQID NO:9，组成融合蛋白的构造基因；
S2、将所述基因分别转至两个pCDNA3.1(-)；
S3、融合蛋白基因转入表达载体后，并转染至仓鼠卵巢细胞(CHO)进行蛋白表达；
S4、待37℃培养箱培养一段时间后，离心取上清，通过proteinA亲和层析纯化后制备得到重组融合蛋白。
本发明的第二方面是提供一种如前所述的多功能融合蛋白在制备克服EGFR耐药性药物中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的融合蛋白分别由一条重链基因以及一条轻链基因所编码的四条多肽链(两条重链与两条轻链)通过相应的二硫键连接所组成。本发明是一种针对表达EGFR与CD47肿瘤的多功能融合蛋白，其由抗人EGFR单克隆抗体与人SIRPα膜外端第一个功能区串联而成。其识别与屏蔽人肿瘤细胞表面EGFR与CD47，阻断其结合区域。其多功能在于屏蔽信号通路、同时引起ADCC与ADCP等免疫杀伤，对于EGFR耐药性同样具有杀伤功能。体外实验证明，该融合蛋白能够直接抑制表达EGFR肿瘤细胞的生长，封闭CD47后，能够引起巨噬细胞吞噬表达人CD47肿瘤细胞。在体内实验小鼠血液瘤模型中，能够快速清除表达CD47的淋巴瘤细胞，延长小鼠寿命，在小鼠皮下接种肿瘤细胞模型中，该融合蛋白增加EGFR抗体药效，对EGFR不敏感细胞株具有较好的抑制作用。
附图说明
图1为实施例1中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的结构图；
图2为实施例2中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的结构图；
图3为实施例1或实施例2中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的电泳结果图；
图4为实施例1或实施例2中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的HPLC结果图谱；
图5为检测实施例1中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图；
图6为检测实施例2中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图；
图7为检测实施例3中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图；
图8为检测实施例4中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图；
图9为检测实施例5中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图；
图10为检测实施例6中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图；
图11为检测实施例6中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白，所述多功能融合蛋白包括识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区和用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段。
优选地，所述识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区为EGFR抗体可变区；所述屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区为SIRPα-D1；所述结合免疫细胞的功能区为人抗体IgGFc。
优选地，所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
优选地，所述EGFR抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述SIRPα-D1氨基酸序列为SEQ ID NO:6；所述用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段序列为SEQ ID NO:7；所述EGFR抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
优选地，所述多功能融合蛋白的制备步骤包括：
S1、通过人工合成的方式合成所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列SEQ IDNO:2和所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列SEQ ID NO:5相对应的所述多功能融合蛋白轻链碱基序列SEQ ID NO:1和所述多功能融合蛋白重链碱基序列SEQID NO:4，组成融合蛋白的构造基因；
S2、将所述基因分别转至两个pCDNA3.1(-)；
S3、融合蛋白基因转入表达载体后，并转染至仓鼠卵巢细胞进行蛋白表达；
S4、待37℃培养箱培养一段时间后，离心取上清，通过proteinA亲和层析纯化后制备得到重组融合蛋白。
本实施例的融合蛋白分别由一条重链基因以及一条轻链基因所编码的四条多肽链(两条重链与两条轻链)通过相应的二硫键连接所组成；sirpαD1与重链的N端通过linger连接。
实施例2
如图2所示，本实施例提供一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白，所述多功能融合蛋白包括识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区和用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段。
优选地，所述识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区为EGFR抗体可变区；所述屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区为SIRPα-D1；所述结合免疫细胞的功能区为人抗体IgGFc。
优选地，所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
优选地，所述EGFR抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述SIRPα-D1氨基酸序列为SEQ ID NO:6；所述用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段序列为SEQ ID NO:7；所述EGFR抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
优选地，所述多功能融合蛋白的制备步骤包括：
S1、通过人工合成的方式合成所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列SEQ IDNO:2和所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列SEQ ID NO:10相对应的所述多功能融合蛋白轻链碱基序列SEQ ID NO:1和所述多功能融合蛋白重链碱基序列SEQ ID NO:9，组成融合蛋白的构造基因；
S2、将所述基因分别转至两个pCDNA3.1(-)；
S3、融合蛋白基因转入表达载体后，并转染至仓鼠卵巢细胞进行蛋白表达；
S4、待37℃培养箱培养一段时间后，离心取上清，通过proteinA亲和层析纯化后制备得到重组融合蛋白。
本实施例的融合蛋白分别由一条重链基因以及一条轻链基因所编码的四条多肽链(两条重链与两条轻链)通过相应的二硫键连接所组成；sirpαD1与重链的C端通过linger连接。
实施例1或实施例2中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的电泳结果图如图3所示，其中Lane 1为靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白，Lane M为Protein Marker；
实施例1或实施例2中靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白的HPLC结果图谱如图4所示，所述HPLC结果如下表所示。
Detector A Channel 2 280nm
Peak# Ret.Time Area Height Conc.
1 6.145 5936 322 0.307
2 7.103 1924605 84432 99.693
Total 1930541 84754
检测实施例1
多功能融合蛋白对EGFR与CD47阳性肿瘤细胞亲和试验：
人肺癌HCC827肿瘤细胞株高表达EGFR与CD47，选其作为融合蛋白亲和细胞株。不同浓度的融合蛋白和cetuximab(起始浓度为100μg/mL，按10倍浓度梯度稀释)与高表达EGFR与CD47的肺癌细胞株HCC827(2×105/孔)在室温下96孔板内反应30min，PBS洗涤一次，加入Anti-human IgG(Fc gamma specific)PE染色20min，PBS洗涤一次，流式细胞仪上机检测，进行PE荧光测定与后续的数据分析。图5中显示，随着融合蛋白浓度增加，MFI值逐渐升高，与浓度呈正相关性，融合蛋白与Cetuximab的IC50分别为0.4856μg/mL与0.2514μg/mL，显示出的融合蛋白活性略低于Cetuximab。
检测实施例2
多功能融合蛋白对CD47信号通路的屏蔽试验：
不同浓度的融合蛋白和cetuximab(起始浓度为100μg/mL，按10倍浓度梯度稀释)与高表达EGFR与CD47的肺癌细胞株HCC827(2×105/孔)在室温下96孔板内反应30min，PBS洗涤一次，加入anti-CD47-APC染色20min，PBS洗涤一次，流式细胞仪上机检测，进行APC荧光测定与后续的数据分析。图6中显示，随着融合蛋白浓度的增高，流式抗体显示的MFI值逐渐降低，并呈剂量梯度依赖性，融合蛋白与Cetuximab的IC50分别为0.7596μg/mL与7.725μg/mL，说明融合蛋白屏蔽住了CD47信号通路，cetuximab未能减少MFI，没有屏蔽CD47信号通路。
检测实施例3
多功能融合蛋白对cetuximab敏感细胞株抑制试验：
人HCC827肿瘤细胞株高表达EGFR，并且对cetuximab高度敏感。将HCC827细胞铺板到96孔板中，每孔加入3000个细胞，后加入不同浓度的cetuximab和融合蛋白，反应体系为200μL，药物终浓度为0、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL。72h后，加入CCK8，孵育1.5h，450nm处测吸光值。图7结果表明，融合蛋白也能够直接抑制HCC827肿瘤细胞，cetuximab与融合蛋白其IC50分别为0.1075μg/mL与0.1699μg/mL。说明融合蛋白依旧保留对EGFR信号通过的屏蔽，并能抑制肿瘤细胞的增殖。
检测实施例4
多功能融合蛋白作用于表达CD47淋巴瘤Raji细胞，引起小鼠RAW264.7巨噬细胞的吞噬作用：
将Raji细胞进行CFSE染色，染色完成后，与融合蛋白混合，在37℃孵育30min，取出后加入96孔板，与小鼠巨噬细胞RAW264.7混合，在37℃培养箱孵育4h。加入anti-mouse-CD14-APC流式抗体，洗涤一次，流式上机进行检测。图8结果显示，融合蛋白与单纯SIRPα-FC都有较好的吞噬作用，说明融合蛋白中SIRPα功能并未受到影响。
检测实施例5
多功能融合蛋白作用于高表达EGFR与CD47肺癌细胞株A549，引起小鼠RAW264.7巨噬细胞的吞噬作用：
将A549细胞进行CFSE染色，染色完成后，与融合蛋白混合，在37℃孵育30min，取出后加入96孔板，与小鼠巨噬细胞RAW264.7混合，在37℃培养箱孵育4h。加入anti-mouse-CD14-APC流式抗体，洗涤一次，流式上机进行检测。图9结果显示，在增加亲和力的时候融合蛋白据有较好的吞噬作用。
检测实施例6
多功能融合蛋白在NCG小鼠体内对血液瘤Raji细胞模型的抑制作用：
NCG小鼠尾静脉接种3×106Raji细胞，同时当天腹腔给cetuximab、SIRPα-FC和融合蛋白，剂量为10mg/kg，每周给药两次。10天后采取小鼠尾静脉血液，进行anti-human-CD19-PE染色，流式检测小鼠体内Raji细胞。图10中显示，给SIRPα-FC和融合蛋白药物组的小鼠，体内Raji细胞被清除掉，并且小鼠状态良好。
每只NCG小鼠尾静脉接种2×106raji细胞，分PBS、cetuximab、sirpα-D1和fusion-protein组，每组5只小鼠，接种肿瘤细胞当天开始腹腔给药，剂量为10mg/kg；每周给药三次，测量体重并观察小鼠状态。结果如图11所示，fusion-protein组与Sirpα-D1组能明显延长小鼠生存时间。
综上所述，本发明是一种针对表达EGFR与CD47肿瘤的多功能融合蛋白，其由抗人EGFR单克隆抗体与人SIRPα膜外端第一个功能区串联而成。其识别与屏蔽人肿瘤细胞表面EGFR与CD47，阻断其结合区域。其多功能在于屏蔽信号通路、同时引起ADCC与ADCP等免疫杀伤，对于EGFR耐药性同样具有杀伤功能。体外实验证明，该融合蛋白能够直接抑制表达EGFR肿瘤细胞的生长，封闭CD47后，能够引起巨噬细胞吞噬表达人CD47肿瘤细胞。在体内实验小鼠血液瘤模型中，能够快速清除表达CD47的淋巴瘤细胞，延长小鼠寿命，在小鼠皮下接种肿瘤细胞模型中，该融合蛋白增加EGFR抗体药效，对EGFR不敏感细胞株具有较好的抑制作用。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海科弈药业科技有限公司
<120> 一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gacatcctgc tgacccagag ccccgtgatc ctgagcgtga gccccggcga gcgcgtgagc 60
ttcagctgcc gcgccagcca gagcatcggc accaacatcc actggtacca gcagcgcacc 120
aacggcagcc cccgcctgct gatcaagtac gccagcgaga gcatcagcgg catccccagc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga gcatcaacag cgtggagagc 240
gaggacatcg ccgactacta ctgccagcag aacaacaact ggcccaccac cttcggcgcc 300
ggcaccaagc tggagctgaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 4
<211> 1767
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaggaggagc tgcaggtgat ccagcccgac aagagcgtga gcgtggccgc cggcgagagc 60
gccatcctgc actgcaccgt gaccagcctg atccccgtgg gccccatcca gtggttccgc 120
ggcgccggcc ccgcccgcga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccccgcgtg 180
accaccgtga gcgagagcac caagcgcgag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240
atcacccccg ccgacgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccgcaaggg cagccccgac 300
accgagttca agagcggcgc cggcaccgag ctgagcgtgc gcgccaagcc cagcgccccc 360
ggaggtgggg gcagcggcgg tggaggcagc ggcggcggcg gtagcggcgg cggaggcagc 420
caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc ccagccagag cctgagcatc 480
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgccagagc 540
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggagcg gcggcaacac cgactacaac 600
acccccttca ccagccgcct gagcatcaac aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcttc 660
aagatgaaca gcctgcagag caacgacacc gccatctact actgcgcccg cgccctgacc 720
tactacgact acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgccgcc 780
agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 840
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 900
aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 960
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 1020
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 1080
agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 1140
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 1200
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 1260
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gcgaggagca gtacaacagc 1320
acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1380
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1440
gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg 1500
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1560
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1620
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccgctggcag 1680
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1740
aagagcctga gcctgagccc cggcaag 1767
<210> 5
<211> 589
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile
145 150 155 160
Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp
165 170 175
Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
180 185 190
Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser
195 200 205
Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser
210 215 220
Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
245 250 255
Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
260 265 270
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
275 280 285
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
290 295 300
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
340 345 350
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
355 360 365
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
370 375 380
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
385 390 395 400
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
405 410 415
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
420 425 430
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
435 440 445
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
450 455 460
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
485 490 495
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
500 505 510
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
515 520 525
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
530 535 540
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
545 550 555 560
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
565 570 575
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro
115 120
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 9
<211> 1767
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc ccagccagag cctgagcatc 60
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgccagagc 120
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggagcg gcggcaacac cgactacaac 180
acccccttca ccagccgcct gagcatcaac aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcttc 240
aagatgaaca gcctgcagag caacgacacc gccatctact actgcgcccg cgccctgacc 300
tactacgact acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgccgcc 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480
aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 720
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gcgaggagca gtacaacagc 900
acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020
gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg 1080
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccgctggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagagcctga gcctgagccc cggcaaggga ggtgggggca gcggcggtgg aggcagcggc 1380
ggcggcggta gcggcggcgg aggcagcgag gaggagctgc aggtgatcca gcccgacaag 1440
agcgtgagcg tggccgccgg cgagagcgcc atcctgcact gcaccgtgac cagcctgatc 1500
cccgtgggcc ccatccagtg gttccgcggc gccggccccg cccgcgagct gatctacaac 1560
cagaaggagg gccacttccc ccgcgtgacc accgtgagcg agagcaccaa gcgcgagaac 1620
atggacttca gcatcagcat cagcaacatc acccccgccg acgccggcac ctactactgc 1680
gtgaagttcc gcaagggcag ccccgacacc gagttcaaga gcggcgccgg caccgagctg 1740
agcgtgcgcg ccaagcccag cgccccc 1767
<210> 10
<211> 589
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys
465 470 475 480
Ser Val Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val
485 490 495
Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly
500 505 510
Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg
515 520 525
Val Thr Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser
530 535 540
Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys
545 550 555 560
Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala
565 570 575
Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro
580 585

Claims (6)

1.一种靶向EGFR与CD47的多功能融合蛋白，其特征在于，所述多功能融合蛋白包括识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区和用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段。
2.根据权利要求1所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述识别肿瘤抗原EGFR的抗体功能区为EGFR抗体可变区；所述屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的胞外功能区为SIRPα-D1；所述结合免疫细胞的功能区为人抗体IgGFc。
3.根据权利要求1所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10。
4.根据权利要求2所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述EGFR抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述SIRPα-D1氨基酸序列为SEQ ID NO:6；所述用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段序列为SEQ ID NO:7；所述EGFR抗体重链可变区氨基酸序列为SEQID NO:8。
5.根据权利要求1所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述多功能融合蛋白的制备步骤包括：
S1、通过人工合成的方式合成所述多功能融合蛋白轻链氨基酸序列SEQ ID NO:2和所述多功能融合蛋白重链氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10相对应的所述多功能融合蛋白轻链碱基序列SEQ ID NO:1和所述多功能融合蛋白重链碱基序列SEQ ID NO:4或SEQID NO:9，组成融合蛋白的构造基因；
S2、将所述基因分别转至两个pCDNA3.1(-)；
S3、融合蛋白基因转入表达载体后，并转染至仓鼠卵巢细胞进行蛋白表达；
S4、待37℃培养箱培养一段时间后，离心取上清，通过proteinA亲和层析纯化后制备得到重组融合蛋白。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的多功能融合蛋白在制备克服EGFR耐药性药物中的应用。
CN202010508021.XA 2020-06-05 2020-06-05 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用 Pending CN111548424A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010508021.XA CN111548424A (zh) 2020-06-05 2020-06-05 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010508021.XA CN111548424A (zh) 2020-06-05 2020-06-05 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111548424A true CN111548424A (zh) 2020-08-18

Family

ID=72001705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010508021.XA Pending CN111548424A (zh) 2020-06-05 2020-06-05 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111548424A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114712495A (zh) * 2021-01-06 2022-07-08 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种多功能抗体的组合物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160186150A1 (en) * 2014-08-08 2016-06-30 Alexo Therapeutics International Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
CN106659779A (zh) * 2014-12-22 2017-05-10 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制造和使用方法
CN107857819A (zh) * 2017-07-03 2018-03-30 江苏西迪尔生物技术有限公司 多功能融合蛋白及其应用
CN108794641A (zh) * 2018-07-04 2018-11-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种针对EGFRvIII的多功能融合蛋白及其应用
CN109734811A (zh) * 2018-12-19 2019-05-10 上海科弈药业科技有限公司 一种针对egfr+肿瘤的融合蛋白及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160186150A1 (en) * 2014-08-08 2016-06-30 Alexo Therapeutics International Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
CN106659779A (zh) * 2014-12-22 2017-05-10 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制造和使用方法
CN107857819A (zh) * 2017-07-03 2018-03-30 江苏西迪尔生物技术有限公司 多功能融合蛋白及其应用
CN108794641A (zh) * 2018-07-04 2018-11-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种针对EGFRvIII的多功能融合蛋白及其应用
CN109734811A (zh) * 2018-12-19 2019-05-10 上海科弈药业科技有限公司 一种针对egfr+肿瘤的融合蛋白及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
厉朝龙: "《生物化学与分子生物学》", 中国医药科技出版社, pages: 590 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114712495A (zh) * 2021-01-06 2022-07-08 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种多功能抗体的组合物

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105330750B (zh) 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途
CN105452288B (zh) 抗人乳头瘤病毒16 e6 t细胞受体
CN109609533B (zh) 基于人源化cd276抗体的car慢病毒表达载体构建及其应用
CN111378043B (zh) 一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG及其制备方法和应用
AU2015266818A1 (en) Anti-human papillomavirus 16 E7 T cell receptors
CN108503711A (zh) 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法
CN105121474A (zh) 融合免疫调节蛋白及其制备方法
CN104395342B (zh) 人源抗纤连蛋白ed‑b结构域的抗体及其用途
CN107043425B (zh) 抗pd1和cd20双特异性抗体及其应用
CN110300603A (zh) Cd47-car-t细胞
UA123323C2 (uk) Димерний злитий поліпептид
CN110885376B (zh) 抗cd47/cd20双特异性抗体及其用途
CN109306017B (zh) 一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用
CN109627340B (zh) Cd3和prlr双特异性抗体及其构建与应用
CN111548424A (zh) 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用
US8703917B2 (en) Epidermal growth factor receptor variants and pharmaceutical compositions thereof
CN109535258A (zh) 一种针对Her2+肿瘤的多功能融合蛋白及其应用
CN111378040B (zh) 检测多种恶性肿瘤细胞的抗体及其应用
CN101948540B (zh) 抗egfr人源抗体mil27的设计及其应用
CN109734811A (zh) 一种针对egfr+肿瘤的融合蛋白及其应用
CN113603779B (zh) 一种结合人淋巴细胞活化基因3(lag-3)的抗体及其用途
CN108794641A (zh) 一种针对EGFRvIII的多功能融合蛋白及其应用
CN116023508A (zh) 重组犬PD-1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用
CN108795876A (zh) 一种通用性car-t细胞、制备方法及应用
CN114763384B (zh) 靶向pd-1的单域抗体及其衍生物和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 302, Building 1, Zhebei Life and Health Small and Micro Park, Yuedu Middle Road, Dipu Street, Anji County, Huzhou City, Zhejiang Province, 313399 (self declared)

Applicant after: Keyi (Zhejiang) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

Address before: Room 5A, 5th Floor, No. 5, Lane 908, Ziping Road, Pudong New Area, Shanghai, 200120

Applicant before: SHANGHAI KEYI PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200818