CN114712495A - 一种多功能抗体的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多功能抗体的稳定的药物组合物及其用途。具体而言，本发明涉及一种药物组合物，包含靶向PD‑1同时具有IL‑15/IL‑15Rα复合物的生物学效应的多功能抗体、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液、表面活性剂、糖和氨基酸。本发明的药物组合物有较高的稳定性和PD‑1结合力。

Description

一种多功能抗体的组合物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及靶向PD-1同时具有IL-15/IL-15Rα复合物的生物学效应的多功能抗体的药物组合物。
背景技术
PD-1(程序性死亡蛋白-1)是由PDCD1基因编码的一个抑制性共刺激分子，由288个氨基酸残基组成的50-55kDa的I型跨膜糖蛋白，由细胞外IgV结构域、跨膜结构区域以及细胞内尾部结构三部分构成。它可表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞等单核细胞及树突状细胞(DCs)表面，提示PD-1在免疫调节中扮演着更关键的角色。PD-1作为表达在活化T细胞上的负性共刺激分子与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，可抑制T细胞增殖，并促进活化T细胞的凋亡；而PD-1抗体则可以阻断PD-1/PD-L1的结合，使效应T细胞发挥其肿瘤杀伤作用。
细胞因子是一类在细胞通信中广泛使用的信号传导蛋白和糖蛋白，如激素和神经递质。虽然激素是由特定器官分泌到血液中，并且神经递质与神经活性有关，但是细胞因子为在其来源和用途方面更多样化类型的化合物。它们由多种造血细胞和非造血细胞类型产生，并可对邻近细胞或整个生物体都有作用，有时强烈地依赖于其它化学品的存在。细胞因子家族主要由质量为8至30kDa之间的较小的水溶性蛋白和糖蛋白组成。细胞因子对于天然免疫应答和适应性免疫应答的功能都重要。通常由已经遇到病原体的免疫细胞分泌，以作为活化和募集更多免疫细胞并增加系统对病原体反应的方式。
在细胞因子中，白细胞介素15(IL-15)是IL-2超家族的成员，其由很多细胞类型和组织(包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、角质细胞、成纤维细胞和神经细胞)分泌。IL15被美国国家癌症中心列为最有潜力癌症免疫治疗药物，名列20个最有潜力肿瘤免疫治疗靶点和12个最有希望治愈肿瘤靶点第一位。研究表明IL-15可以有效的激活免疫系中CD8+T细胞、NK细胞和NK细胞的增殖和活化，而这三类细胞是肿瘤免疫中最重要的免疫细胞。
然而，细胞因子在临床上的使用存在着单药给药靶向性差的缺点，只有高浓度给药才可以达到抗肿瘤作用，而高浓度给药会产生免疫抑制作用和高毒性。并且，非靶向性细胞因子对于免疫系统的激活是系统性的，免疫系统被广泛的激活，具有致命的副作用。此外，由于细胞因子属于小分子量蛋白，不具备抗体的体内循环保护机制，单纯的细胞因子往往半衰期较短，需要短时间重复高剂量给药。目前临床研究药物多采用PEG化或者Fc融合来提高细胞因子的半衰期，虽然半衰期得以延长，但仍无法解决细胞因子的靶向性差的问题。
IL15Rα和IL-15均表达于DC细胞和单核细胞，IL15Rα的主要作用为与IL-15结合后，将结合的IL-15提呈给IL2Rβ和IL2Rγ，从而刺激免疫细胞的增殖和活化，因此IL-15活性的发挥依赖于IL-15Rα的提呈。但是静息状态下DC细胞IL-15Ra的表达水平很低，单独的给予患者IL-15治疗，临床效果有限，因而IL15/IL15Rα和IL15RαIgFc复合物的形成，解决了该问题。已有研究表明，IL15/IL15Rα复合物相比较于单纯的IL-15其生物学活性可以提高100倍，而与FC的融合则有效的延长了抗体的半衰期。
在现有技术中，CN110214147A和CN110214148A都公开了含有IL-15/IL-15Ra的融合蛋白，解决了短半衰期阻碍有利用药的问题。但是其公开的包含IL-15/IL-15Ra结构的抗体中，由于其结构复杂，仍有轻重链错配的问题，而且针对其相关的稳定性高的制剂并没有相关的研究。
本发明创造性地将IL-15及其受体片段嵌合于所述抗体分子链中，并将二者设计为可相互结合的位置，利用二者特有的结合作用，更加易于所述抗体的异源二聚化，因而不会出现普通双特异性抗体常见的轻重链错配问题。同时，通过对多功能抗体的制剂的研究，开发出其稳定性更高，跟PD-1端亲和力更好的多功能抗体组合物，更易于质量控制，且其生产工艺和成药性更加稳定。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种药物分子具有较高亲和力，半衰期长，而且制剂稳定性好，生产成本较低的多功能抗体组合物。
本发明所述的多功能抗体的药物组合物，包含多功能抗体和缓冲剂；所述缓冲剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的一种或多种，优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；所述缓冲剂的pH为5.5-6.5。
在可选的实施方案中，所述缓冲剂的浓度为1-100mM，优选为5-50mM，更优选为20mM。
在可选的实施方案中，所述多功能抗体的浓度为0.5-50mg/ml，优选为1-20mg/ml，更优选为2-10mg/ml，最优选为5mg/ml。
在可选的实施方案中，所述药物组合物还包含表面活性剂，优选的，所述表面活性剂选自聚山梨酯-80或聚山梨酯-20，更优选的，所述表面活性剂为聚山梨酯-80。
在可选的实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.01-1mg/ml，优选为0.05-0.8mg/ml，更优选为0.2-0.6mg/ml，最优选为0.2mg/ml或0.4mg/ml。
在可选的实施方案中，所述药物组合物还包含糖，优选的，所述糖选自海藻糖、蔗糖和右旋糖酐-40。
在可选的实施方案中，所述糖的浓度为30-300mM，优选为50-200mM，更优选为100-150mM。
在可选的实施方案中，所述药物组合物还包含氨基酸，优选的，所述氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸。
在可选的实施方案中，所述氨基酸的浓度为10-200mM，优选为20-100mM，更优选为30-80mM。
在可选的实施方案中，所述多功能抗体包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。
在可选的实施方案中，所述第一重链和第二重链的免疫球蛋白Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的恒定区氨基酸序列，优选IgG1或IgG4的恒定区氨基酸序列。
在可选的实施方案中，所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段可以分别嵌合于所述链的Fc部分内部，也可以存在于Fc部分外部，优选位于所述相应重链的CH1和CH2功能区之间。
在可选的实施方案中，所述多功能抗体的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1；所述多功能抗体的第二重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:3；所述多功能抗体的第一轻链和第二轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5。
在可选的实施方案中，一种含多功能抗体的冻干制剂，所述制剂通过将上述药物组合物经冷冻干燥获得。
在可选的实施方案中，一种含多功能抗体的液体制剂，所述制剂通过将上述药物组合物无菌灌装获得。
在可选的实施方案中，所述液体制剂为注射制剂，优选的，所述注射制剂为水针。
在可选的实施方案中，上述药物组合物或冻干制剂或液体制剂在制备预防或治疗与PD-1抗原有关的疾病或病症如肿瘤的药物中的用途。
因此，本发明涉及以下实施方案：
1.一种多功能抗体的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含多功能抗体和缓冲剂；所述缓冲剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的一种或多种，优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；所述缓冲剂的pH为5.5-6.5。
2.根据方案1所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为1-100mM，优选为5-50mM。
3.根据方案1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述多功能抗体的浓度为0.5-50mg/ml，优选为1-20mg/ml，更优选为2-10mg/ml。
4.根据方案1-3其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含表面活性剂，优选的，所述表面活性剂选自聚山梨酯-80或聚山梨酯-20，更优选的，所述表面活性剂为聚山梨酯-80。
5.根据方案4所述的药物组合物，其特征在于，所述表面活性剂的浓度为0.01-1mg/ml，优选为0.05-0.8mg/ml，更优选为0.2-0.6mg/ml。
6.根据方案1-5其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含糖，优选的，所述糖选自海藻糖、蔗糖和右旋糖酐-40。
7.根据方案6所述的药物组合物，其特征在于，所述糖的浓度为30-300mM，优选为50-200mM，更优选为100-150mM。
8.根据方案1-7其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含氨基酸，优选的，所述氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸。
9.根据方案8所述的药物组合物，其特征在于，所述氨基酸的浓度为10-200mM，优选为20-100mM，更优选为30-80mM。
10.根据方案1-9其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述多功能抗体包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。
11.根据方案10所述的药物组合物，其特征在于，所述第一重链和第二重链的免疫球蛋白Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的恒定区氨基酸序列，优选IgG1或IgG4的恒定区氨基酸序列。
12.根据方案10或11所述的药物组合物，其特征在于，所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段可以分别嵌合于所述链的Fc部分内部，也可以存在于Fc部分外部，优选位于所述相应重链的CH1和CH2功能区之间。
13.根据方案1-12其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述多功能抗体的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1；所述多功能抗体的第二重链氨基酸序列选自SEQID NO:3；所述多功能抗体的第一轻链和第二轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5。
14.一种含多功能抗体的冻干制剂，其特征在于，所述制剂通过将方案1至13任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。
15.一种含多功能抗体的液体制剂，其特征在于，所述制剂通过将方案1至13任一项所述的药物组合物无菌灌装获得。
16.根据方案15所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂为注射制剂，优选的，所述注射制剂为水针。
17.根据方案1-13其中任意一项所述的药物组合物或方案14所述的冻干制剂或方案15或16所述的液体制剂在制备预防或治疗与PD-1抗原有关的疾病或病症如肿瘤的药物中的用途。
有益效果
本发明提供了一种药效学更好、纯度更高、更加稳定的抗体药物组合物，本发明创造性地将IL-15及其受体片段嵌合于所述抗体分子链中，并将二者设计为可相互结合的位置，利用二者特有的结合作用，更加易于所述抗体的异源二聚化，因而不会出现普通双特异性抗体常见的轻重链错配问题。
进一步地，本发明所获得的多功能抗体具有高效的PD-1抗原亲和力，且本发明的组合物稳定性好，不易产生多聚体和小分子片段，经过长时间的储存，仍然保持较高的抗体纯度。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其他技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的一般技术人员通常理解的含义。
术语
“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲剂。将pH控制在适当范围中的缓冲剂的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸盐、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲剂。
“磷酸盐缓冲剂”是包括磷酸根离子的缓冲剂，包括磷酸氢二钠/磷酸二氢钠。
“醋酸盐缓冲剂”是包括醋酸根离子的缓冲剂组氨酸/醋酸。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。
本文中，“缓冲剂”和“缓冲体系”并不互相排斥。本发明中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
附图说明
图1a为含有多功能抗体的第一重链的质粒pcDNA3.1-G418-16-1；
图1b为含有多功能抗体的第二重链的质粒pcDNA3.1-G418-16-2；
图1c为含有多功能抗体的第一/第二轻链(二者相同)的质粒pcDNA3.1-G418-16-3。
图2a为非还原条件下的SDS-PAGE图；
图2b为还原条件下的SDS-PAGE图。
图3a至3c为多功能抗体与PD-1抗原结合的ELISA结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1核苷酸序列的获得与优化
多功能抗体的轻链和重链氨基酸序列信息选自公开的或自研PD-1靶点单抗序列信息，分析获得该序列的可变区和恒定区信息。将天然IL-15序列或IL-15变体序列插入一条重链的氨基酸序列中，并在另一条重链的相应位置插入IL-15受体序列，优选为IL-15RαSushi序列。根据需要，调整所述抗体氨基酸序列的Fc为其他IgG类型，如IgG1等，并进一步在各重链中设计所需形式的氨基酸突变，由此得到目标抗体的氨基酸序列，分别为：
第一重链为SEQ ID NO:1，第二重链为SEQ ID NO:3，第一轻链和第二轻链(二者相同)为SEQ ID NO:5。
将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，并针对可能影响抗体在哺乳动物细胞中表达的一系列参数：密码子偏好性、GC含量(即DNA的4种碱基中鸟嘌呤G和胞嘧啶C所占的比率)、CpG岛(即CpG双核苷酸在基因组中密度较高的区域)、mRNA的二级结构、拼接位点、前成熟PolyA位点、内部Chi位点(基因组中一段短的DNA片段，在该位点附近发生同源重组的几率增加)或者核糖体结合位点、RNA不稳定序列、反向重复序列及可能干扰克隆的限制性酶切位点等进行优化；同时增加了可能会提高翻译效率的相关序列，例如Kozak序列、SD序列，以及终止密码子。设计得到编码上述多功能抗体分子的重链基因和轻链基因，另外在重链和轻链的5’端分别设计上根据氨基酸序列优化而得的编码信号肽的核苷酸序列；此外，还对轻链和重链核苷酸序列的3’端分别加上终止密码子。
最终优化获得多功能抗体优化核苷酸序列，为：
第一重链为SEQ ID NO:2，第二重链为SEQ ID NO:4，第一轻链和第二轻链(二者相同)为SEQ ID NO:6。
实施例2基因合成与表达载体的构建
采用pcDNA3.1-G418载体作为表达所述多功能抗体的轻链和重链的专用载体。pcDNA3.1-G418载体含有重链所使用的启动子CMVPromoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。基因合成得到多功能抗体的抗体表达轻链和重链的核苷酸序列，用HindIII和XhoI对载体和目的片段进行双酶切，回收后通过DNA连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述多功能抗体全长第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链的重组质粒，分别为pcDNA3.1-G418-16-1、pcDNA3.1-G418-16-2和pcDNA3.1-G418-16-3(第一轻链和第二轻链相同)。示例性的pcDNA3.1-G418-16-1、pcDNA3.1-G418-16-2和pcDNA3.1-G418-16-3的质粒图谱参见附图1a-1c。
实施例3质粒抽提
根据《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
实施例4质粒转染、瞬转表达与抗体纯化
在37℃、8％CO2、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×106cells/ml。使用脂质体分别将构建的载体PCDNA3.1-G418-16-1、PCDNA3.1-G418-16-2、PCDNA3.1-G418-16-3转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1μg/ml，脂质体浓度参照ExpiCHOTMExpressionSystem试剂盒确定，在32℃、5％CO2，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和5-8天之间分别补料一次。4000rpm离心上述培养产物，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用ProteinA、离子柱纯化所得的多功能抗体蛋白并收集洗脱液。
ProteinA、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用GE的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS(pH7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱目的蛋白，利用Tris调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于pI1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存。
经SDS-PAGE测定表明，在非还原条件下，结果显示表达的完整多功能抗体的分子量均稍高于IgG1抗体；在还原条件下IgG1抗体被还原为2条带，而多功能抗体被还原为3条带，即位置在约64kDa、58kDa和24kDa的目的蛋白，对应于所需抗体的两个不同的重链以及相同的轻链。因此，经所述质粒转染、瞬转表达和纯化，证明所得到的抗体结构正确，且纯度较高。多功能抗体相应的SDS-PAGE电泳图如附图2a和2b所示。
实施例5抗体制剂缓冲体系筛选
将抗体经过超滤换液至不同缓冲溶液中，缓冲液置换完成后分别加入蔗糖和聚山梨酯-80，维持最终浓度为蔗糖8％(w/v)，聚山梨酯-80 0.02％(w/v)，除菌过滤、无菌分装。
不同的缓冲体系实验方案如表1所示。
表1抗体的缓冲体系实验方案
Figure BDA0002884995710000091
将上述制备的抗体制剂放置于25℃，分别于第3周和第4周取出进行分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)的检测，以抗体制剂放置3周(3W)和4周(4W)的纯度，考查不同的缓冲溶液对制剂稳定性的影响，实验结果如表2所示
表2抗体不同缓冲体系筛选实验结果
Figure BDA0002884995710000101
注：HMW表示高分子量；LMW表示低分子量。
结果表明，当缓冲体系使用柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、组氨酸-盐酸组氨酸时，在第3周和第4周时，主峰纯度都比较低，不符合行业标准规定。当缓冲体系使用柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠时，在第3周和第4周时，高分子量和低分子量的含量都比较高，说明抗体制剂产生了较多的聚体和小分子片段，抗体制剂稳定性不好。当缓冲体系使用组氨酸-盐酸组氨酸时，在第3周和第4周时，高分子量虽然比较低，但是低分子量却非常高，说明抗体制剂产生了大量的小分子片段，抗体制剂稳定性不好。而当缓冲体系使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液时，在第3周和第4周时，主峰纯度都比较高，高分子量和低分子量的含量都比较低，说明抗体纯度比较高，稳定性好，不易产生聚体和小分子片段。
实施例6表面活性剂筛选
用表3所示的不同表面活性剂，分别添加20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、135mM海藻糖，配制5mg/ml的抗体制剂。考察具有不同含量的聚山梨酯20和聚山梨酯80对制剂处方的影响，分别进行反复冻融循环(循环温度：-80～4℃)和振荡7天(250rpm，25℃)，其实验结果如表4所示。
表3抗体组合物的表面活性剂实验方案
Figure BDA0002884995710000111
表4抗体组合物的表面活性剂实验方案结果
Figure BDA0002884995710000112
注：HMW表示高分子量，DR-2为反复冻融循环(循环温度：-80～4℃)2次，DR-5为反复冻融循环(循环温度：-80～4℃)5次；ZD-7D为振荡7天(250rpm，25℃)。
实施例7抗体制剂稳定剂的筛选
为了进一步对稳定剂种类进行优化，在含如表5所示的不同稳定剂的处方中，制备含5mg/ml单抗、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、pH为6.0的抗体制剂。
表5抗体组合物的稳定剂实验方案
Figure BDA0002884995710000121
将抗体经过超滤换液至不同稳定剂的缓冲溶液中，进行除菌过滤、无菌分装。将上述制备的抗体制剂放置于40℃，分别于第4周、第6周取出进行分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)的检测，以实验起始(T0)、放置4周(4W)和6周(6W)的纯度，考查不同的稳定剂对制剂稳定性的影响，结果如表6所示。
表6抗体组合物的稳定剂实验方案结果
Figure BDA0002884995710000122
Figure BDA0002884995710000131
注：HMW表示高分子量，LMW表示低分子量。
抗体组合物在40℃下放置4周和6周的结果表明：
(1)组合物中既不含有海藻糖，也不含有甘露醇的处方方案F1、F2、F6、F7、F10、F11和F12，随着时间的延长，多聚物显著增加，主峰纯度下降较多。
(2)组合物中含有海藻糖的处方方案F4、F5、F8和F9，多聚物含量增加较少，主峰纯度下降较少。
(3)组合物中含有甘露醇的处方方案F13和F14，多聚物含量增加较少，主峰纯度下降较少。
(4)经观察，方案F2、F12和F14的组合物出现了沉淀。
实施例8 ELISA检测抗体对PD-1抗原的亲和力
采用pH7.4的PBS缓冲液将PD1抗原稀释至0.2μg/mL，每孔100μL加入到96孔ELISA板中，4度包被过夜。用含2％BSA封闭液封闭1.5小时后。PBST洗3次后，将多功能抗体用0.5％BSA样品稀释液稀释至0.3μg/ml，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共7个梯度，并设阴性对照，每孔100μL，37℃孵育1h。再用PBST洗板3次，将HRP标记的山羊抗人IgGFc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100μL，室温孵育1小时。PBST洗板4次后，每孔加入100μLTMB底物，室温避光孵育10分钟，每孔加入100μL1MHCL液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值(OD)＝OD45nm-OD570nm。将多功能抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，得到多功能抗体与PD1抗原的结合曲线，如图3a-3c所示。测得的EC50值如表7和表8所示。
表7样品的EC50值
样品编号 EC50
F1-T0 4.084
F1-6W 9.24
F8-6W 5.237
表8样品的EC50值
样品编号 EC50
F1-T0 4.349
F13-6W 9.224
F14-6W 8.772
从PD-1端结合活性上来看，F1、F13和F14高温加速6周后活性下降，F8和T0起始样品比，没有显著差异，说明F8跟PD-1端的亲和力更高。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部保护范围由所附的权利要求书及其任何等同物给出。
序列表
<110> 盛禾（中国）生物制药有限公司
<120> 一种多功能抗体的组合物
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
225 230 235 240
Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu
245 250 255
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
275 280 285
Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
305 310 315 320
Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln
325 330 335
Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
355 360 365
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
370 375 380
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
385 390 395 400
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
405 410 415
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
420 425 430
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
435 440 445
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
450 455 460
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
465 470 475 480
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
485 490 495
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
500 505 510
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
515 520 525
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
530 535 540
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
545 550 555 560
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 2
<211> 1743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcagc tggtgcagag cggagtggag gtgaagaagc caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcttgcaagg cttccggcta cacattcacc aactactata tgtattgggt gagacaggct 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggaggc atcaacccct ccaatggcgg caccaacttc 180
aatgagaagt ttaagaatcg cgtgacactg accacagatt ccagcaccac aaccgcttac 240
atggagctga agagcctgca gttcgacgat accgccgtgt actattgtgc taggcgggac 300
tacaggttcg atatgggctt tgactattgg ggccagggca caaccgtgac cgtgtcttcc 360
gccagcacaa agggcccatc cgtgttccca ctggctccat gctcccggag cacctctgag 420
tccacagccg ctctgggctg tctggtgaag gactatttcc ctgagccagt gacagtgtct 480
tggaactccg gcgccctgac cagcggagtg cacacatttc ccgctgtgct gcagagctct 540
ggcctgtact ctctgtccag cgtggtgacc gtgccatctt ccagcctggg cacaaagacc 600
tatacatgca acgtggatca taagcccagc aatacaaagg tggacaagag ggtgggagga 660
ggaggatccg gaggaggagg aagcaactgg gtgaatgtga tcagcgatct gaagaagatc 720
gaggacctga tccagtctat gcacatcgat gccaccctgt acacagagtc tgacgtgcat 780
ccttcctgca aggtgaccgc tatgaagtgt tttctgctgg agctgcaggt catctccctg 840
gagtctggcg atgcctctat ccacgacacc gtggagaacc tgatcatcct ggctaatgat 900
tccctgtctt ccaacggcaa tgtgacagag agcggctgca aggagtgtga ggagctggag 960
gagaagaaca tcaaggagtt cctgcagtct tttgtgcata tcgtgcagat gttcatcaat 1020
accagcggag gaggaggatc tggaggagga ggaagcgagt ctaagtacgg accaccttgc 1080
ccaccatgtc cagctcctga gtttctggga ggaccatccg tgttcctgtt tcctccaaag 1140
cctaaggata ccctgatgat ctccagaacc cccgaggtga catgcgtggt ggtggatgtg 1200
agccaggagg accctgaggt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat 1260
gctaagacaa agcccaggga ggagcagttt aactccacct accgggtggt gagcgtgctg 1320
acagtgctgc atcaggactg gctgaacggc aaggagtata agtgcaaggt gtctaataag 1380
ggcctgccta gctctatcga gaagaccatc tccaaggcta agggacagcc tcgcgagcca 1440
caggtgtaca ccctgccccc ttctcaggag gagatgacaa agaaccaggt gtccctgtgg 1500
tgtctggtga agggcttcta tcctagcgat atcgctgtgg agtgggagtc taatggccag 1560
ccagagaaca attacaagac aaccccaccc gtgctggact ccgatggcag cttctttctg 1620
tattctagac tgaccgtgga caagtcccgc tggcaggagg gcaacgtgtt ttcctgtagc 1680
gtgatgcacg aggctctgca caatcattac acacagaagt ctctgtccct gagcctgggc 1740
aag 1743
<210> 3
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala
225 230 235 240
Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile
245 250 255
Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu
260 265 270
Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser
275 280 285
Leu Lys Cys Ile Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
290 295 300
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
305 310 315 320
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
325 330 335
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
340 345 350
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
355 360 365
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
370 375 380
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
385 390 395 400
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
405 410 415
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
420 425 430
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
435 440 445
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
450 455 460
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465 470 475 480
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Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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<210> 4
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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atggagctga agtccctgca gttcgacgat accgccgtgt actattgtgc taggcgggac 300
tacaggttcg atatgggctt tgactattgg ggccagggca caaccgtgac cgtgtcttcc 360
gccagcacaa agggcccatc cgtgttccca ctggctccat gctcccggag cacctctgag 420
tccacagccg ctctgggctg tctggtgaag gactatttcc ctgagccagt gaccgtgagc 480
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tatacatgca acgtggatca caagccctcc aataccaagg tggacaagag ggtgggagga 660
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gtggctcatt ggacaacccc tagcctgaag tgcatcaggg gaggaggagg atccgagagc 900
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<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagatcgtgc tgacccagtc tcctgctaca ctgtccctga gcccaggaga gagggccacc 60
ctgagctgtc gggcttctaa gggcgtgtct acatccggct actcctatct gcactggtac 120
cagcagaagc caggccaggc ccccagactg ctgatctacc tggcttccta tctggagagc 180
ggagtgccag ctcgcttcag cggctctggc tccggcaccg actttaccct gacaatctcc 240
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acctttggcg gcggcacaaa ggtggagatc aagcggaccg tggccgctcc tagcgtgttc 360
atctttcccc cttctgacga gcagctgaag tctggcacag cttccgtggt gtgcctgctg 420
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ggcaattctc aggagtccgt gaccgagcag gacagcaagg attctacata ttccctgtct 540
tccaccctga cactgtccaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtatgc ttgcgaggtg 600
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Claims (10)

1.一种多功能抗体的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含多功能抗体和缓冲剂；所述缓冲剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的一种或多种，优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；所述缓冲剂的pH为5.5-6.5。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为1-100mM，优选为5-50mM。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述多功能抗体的浓度为0.5-50mg/ml，优选为1-20mg/ml，更优选为2-10mg/ml。
4.根据权利要求1-3其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含表面活性剂，优选的，所述表面活性剂选自聚山梨酯-80或聚山梨酯-20，更优选的，所述表面活性剂为聚山梨酯-80。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述表面活性剂的浓度为0.01-1mg/ml，优选为0.05-0.8mg/ml，更优选为0.2-0.6mg/ml。
6.根据权利要求1-5其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含糖，优选的，所述糖选自海藻糖、蔗糖和右旋糖酐-40。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述糖的浓度为30-300mM，优选为50-200mM，更优选为100-150mM。
8.根据权利要求1-7其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含氨基酸，优选的，所述氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述氨基酸的浓度为10-200mM，优选为20-100mM，更优选为30-80mM。
10.根据权利要求1-9其中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述多功能抗体包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018071918A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments
WO2018184964A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
WO2018209194A2 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
AR110011A1 (es) * 2016-11-02 2019-02-13 GLAXOSMITHKLINE INTELLECTUAL PROPERTY Nº 2 LTD Proteína de unión, ácido nucleico que la codifica, vector que lo comprende, célula hospedadora que comprende dicho vector, método para producir la proteína y composición farmacéutica que comprende a la misma
CN110404066A (zh) * 2018-04-28 2019-11-05 齐鲁制药有限公司 一种抗人pd-1的单克隆抗体制剂、联合用药物及其用途
CN111548424A (zh) * 2020-06-05 2020-08-18 上海科弈药业科技有限公司 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018071918A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments
AR110011A1 (es) * 2016-11-02 2019-02-13 GLAXOSMITHKLINE INTELLECTUAL PROPERTY Nº 2 LTD Proteína de unión, ácido nucleico que la codifica, vector que lo comprende, célula hospedadora que comprende dicho vector, método para producir la proteína y composición farmacéutica que comprende a la misma
WO2018184964A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
WO2018209194A2 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
CN110404066A (zh) * 2018-04-28 2019-11-05 齐鲁制药有限公司 一种抗人pd-1的单克隆抗体制剂、联合用药物及其用途
CN111548424A (zh) * 2020-06-05 2020-08-18 上海科弈药业科技有限公司 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘素兰等: "《药剂学第3版》", 30 November 2020, 西安交通大学出版社, pages: 266 - 271 *

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