EA009289B1 - ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩЕЙ ПОЛИНЕВРОПАТИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ β-ИНТЕРФЕРОНА - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам лечения и лекарственным средствам, используемым при лечении млекопитающих, страдающих хронической демиелинизирующей невропатией, например CIDP, или подвергаемых риску возникновения такого заболевания. Указанные способы включают введение препаратов IFN-β.

Description

Уровень техники

Хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (СГОР) является неврологическим заболеванием, характеризующимся медленно прогрессирующей слабостью и нарушением чувствительности в ногах и руках. Причиной возникновения данного заболевания является разрушение миелиновой оболочки периферических нервов. Опухание нервных корешков также является отличительным признаком данного заболевания. Хотя указанное заболевание может возникать в любом возрасте и у обоих полов, СГОР чаще проявляется у молодых людей, причем у мужчин чаще, чем у женщин. Характерными симптомами являются покалывание или онемение (начиная с пальцев ног и рук), слабость рук и ног, ноющие боли в мышцах, утрата глубоких сухожильных рефлексов (арефлексия), усталость и атипичные ощущения.

СГОР взаимосвязана с некоторыми другими заболеваниями. Например, установлено, что воспалительная демиелинизирующая невропатия, например СГОР, диагностирована у трети сероположительных субъектов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), направляемых к врачу по поводу периферических нервных заболеваний. Кроме того, установлено, что СГОР встречается у субъектов, страдающих волчанкой, парапротеинемией, лимфомой или диабетом.

При отсутствии лечения СГОР приводит к потере трудоспособности, требующей проведения физиотерапии и трудотерапии, применения ортопедических аппаратов и длительного лечения. Для назначения правильного лечения нужно, чтобы квалифицированный врач наблюдал больного во внебольничных условиях.

Современные методы лечения СГОР включают введение кортикостероидов, таких как преднизон, который может быть назначен отдельно или в сочетании с иммунодепрессантами.

Иммунодепрессанты могут быть также назначены без стероида. Плазмаферез (замена плазмы) и внутривенное введение иммуноглобулина (IУ1д) также являются достаточно эффективными методами, применяемыми в настоящее время. 1У!д можно использовать даже в качестве основного лечения. Кроме того, физиотерапия может увеличить мышечную силу, функциональность и подвижность конечностей и минимизировать развитие контрактур.

СГОР по-разному развивается у разных людей. У некоторых людей после одного приступа СГОР может последовать спонтанное выздоровление, в то время как у других может быть много приступов с частичным восстановлением между рецидивами. Данное заболевание является поддающейся лечению приобретенной невропатией, поэтому лечение рекомендуется начинать как можно раньше, чтобы предотвратить утрату нервных клеток. Однако у некоторых субъектов сохраняется некоторое остаточное онемение или слабость конечностей.

Таким образом, современные методы лечения СГОР являются вредными (например, стероиды или иммунодепрессанты), дорогостоящими (например, 1У!д и плазмаферез) или неудобными (например, плазмаферез) методами. Поэтому весьма желательны эффективные терапевтические методы лечения хронических демиелинизирующих невропатий, например СГОР, которые будут менее токсичными, более дешевыми и более удобными по сравнению с современными методами.

Сущность изобретения

Один вариант осуществления изобретения относится к способам лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии у млекопитающего. Указанный способ может включать введение млекопитающему терапевтически эффективного количества препарата ΙΡΝ-β. Препарат ΙΡΝ-β можно вводить парентерально, не прибегая к подкожным инъекциям, например внутримышечно. В предпочтительном варианте осуществления изобретения невропатия является хронической воспалительной демиелинизирующей невропатией (СГОР).

Препарат ΙΡΝ-β может содержать человеческий ΙΡΝ-β. Например, препарат ΙΡΝ-β может содержать белок, который по меньшей мере примерно на 95% идентичен непроцессированному зрелому человеческому ΙΡΝ-β, имеющему 8ЕО ГО ΝΟ:4. Препарат ΙΡΝ-β может также содержать непроцессированный зрелый человеческий ΙΡΝ-β, имеющий 8ЕО ГО ΝΟ:4. Препарат ΙΡΝ-β может также содержать непроцессированный зрелый человеческий ΙΡΝ-β, имеющий 8ЕО ГО ΝΟ:4, слитый с гетерологичным полипептидом, например, с константным доменом молекулы человеческого иммуноглобулина. Молекула иммуноглобулина может представлять собой тяжелую цепь Ι§01. Препарат ΙΡΝ-β может содержать 8ЕО ГО ΝΟ:14. Препарат ΙΡΝ-β может также содержать пегилированный ΙΡΝ-β.

Препарат ΙΡΝ-β или содержащая его композиция может включать стабилизирующий агент, такой как белов: или аминокислота. Например, стабилизирующим агентом может быть аргинин. Препарат ΙΡΝβ или содержащая его композиция может иметь значение рН в пределах от около 4,0 до 7,2.

Препарат ΙΡΝ-β можно вводить один, два или три раза в неделю. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β вводят в количестве примерно 6 или 12 миллионов международных единиц (ММЕ). Препарат ΙΡΝ-β можно вводить внутримышечно или подкожно. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект является млекопитающим, предпочтительно человеком.

Данное изобретение относится также к способам лечения невропатии, например СГОР, включающим введение субъекту, страдающему невропатией, фармацевтически эффективного количества препа

- 1 009289 рата ΙΕΝ-β и последующее введение субъекту иммунодепрессанта или проведение плазмафереза. Указанный способ может включать введение субъекту иммунодепрессанта, выбранного из группы, состоящей из стероида, азотиоприна, циклоспорина, циклофосфамида и микофенолята.

В объем настоящего изобретения входят также способы лечения невропатии, например СГОР, включающие введение больному невропатией фармацевтически эффективного количества препарата ΙΕΝ-β в сочетании с дополнительным лечением невропатии, причем препарат ΙΕΝ-β вводят парентеральным способом, отличным от подкожного введения. Препарат ΙΕΝ-β можно вводить внутримышечно. Препарат ΙΕΝ-β можно вводить один раз в неделю, например около 6 ММЕ препарата ΙΕΝ-β один раз в неделю. Когда невропатия представляет собой СГОР, дополнительное лечение может быть выбрано из группы, включающей введение стероида, введение ΙνΙ§. введение противопоспалительного средства и проведение плазмафереза.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам лечения невропатии, например СГОР, включающим введение больному невропатией фармацевтически эффективного количества препарата ΙΕΝ-β в сочетании с дополнительным лечением невропатии, причем препарат ΙΕΝ-β вводят один раз в неделю. Если невропатия представляет собой СГОР, дополнительное лечение СГОР может быть выбрано из группы, включающей введение стероида, введение Ινΐ§, введение противовоспалительного средства и проведение плазмафереза.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способам лечения СГОР у субъекта, проходящего основной курс лечения СГОР, выбранный из группы, состоящей из введения стероида, введения противовоспалительного средства, введения ΙνΙ§ и проведения плазмафереза, которые помимо основного лечения СГОР включают введение препарата ΙΕΝ-β в количестве, эффективном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения СГОР, причем препарат ΙΕΝ-β вводят парентеральным способом, отличным от подкожного введения, для достижения эффективного ослабления симптомов СГОР. В соответствии с другим способом лечения СГОР нуждающийся субъект проходит основной курс лечения СГОР, выбранный из группы, состоящей из введения стероида, введения противовоспалительного средства, введения ΙνΙ§ и проведения плазмафереза, при этом помимо основного лечения СГОР субъекту вводят препарат ΙΕΝ-β один раз в неделю в количестве, эффективном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения СГОР, для достижения эффективного ослабления симптомов СГОР. Субъекту, имеющему СГОР, может быть также назначено основное лечение СГОР, выбранное из группы, состоящей из введения стероида, введения противовоспалительного средства и проведения плазмафереза, при этом помимо основного лечения СГОР субъекту вводят препарат ΙΕΝβ в количестве, эффективном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения СГОР, для достижения эффективного ослабления симптомов СГОР.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А-С показаны нуклеотидная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:11) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:12) слитого белка, содержащего сигнальную последовательность УСАМ, слитую со зрелым непроцессированным человеческим ΙΕΝ-β (8ЕО ГО ΝΟ:3 и 4), в котором глицин в положении аминокислоты 162 8ЕО ГО ΝΟ:4 заменен цистеином, слитым с шарнирными, СН2- и СН3доменами Εс-фрагмента Ι§01 человека (ΖΕ5107).

На фиг. 2А-С показаны нуклеотидная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:13) и аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:14) слитого белка, содержащего сигнальную последовательность УСАМ, слитую со зрелым непроцессированным человеческим ΙΕΝ-β (8ЕО ГО ΝΟ:3 и 4), в котором глицин в положении аминокислоты 162 8ЕО ГО ΝΟ:4 заменен цистеином, слитым с линкером С48, который в свою очередь слит с шарнирными, СН2- и СН3-доменами Εс-фрагмента Ι§01 человека (ΖΕ6206).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения хронических демиелинизирующих невропатий, например СГОР, включающим введение фармацевтически эффективного количества препарата ΙΕΝβ.

1. Определения терминов.

Для более четкого и точного изложения предмета изобретения, описанного в формуле изобретения, ниже приведены определения некоторых терминов, использованных в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения.

В значении, использованном в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, термины в форме единственного числа имеют обобщающее значение за исключением тех случаев, когда из контекста изобретения следует обратное.

Термин «хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия» имеет взаимозаменяемое значение с термином «СГОР». Нижеследующие заболевания являются идентичными или считаются, по существу, идентичными СГОР и поэтому входят в определение термина «СГОР», используемого в данном описании изобретения: «хроническая рецидивная полиневропатия», «хроническая идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия», «хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия» и «хроническая приобретенная демиелинизирующая полиневропатия» («САПР»).

- 2 009289

СГОР является хроническим прогрессирующим заболеванием с постепенным развитием или рецидивами (см., например, Пуск е! а1., (1993) ίη Пуск, Р.к, Тйотаз, Р1К., бпййи, 1.А., Ьо\\'. Р.А., Робиз1о, Ι.Ε., (Ебз.), Репр11ега1 №игора(йу, 3^гб еб. 8аиибегз, РЫ1абе1рЫа, рр. 1498-1517). Патологические признаки СГОР включают сегментную демиелинизацию и ремиелинизацию и наличие мононуклеарных клеточных инфильтратов в эндоневрие (Писк е! а1., см. выше). СГОР иногда определяют как периферическую разновидность рассеянного склероза (М8) (Тоука аиб Найиид (1996) Сшт. Орт. №ито1. 9, 240-250). Данное заболевание иногда определяют также как хроническую форму синдрома Гийена-Барре. Критериями для диагностики СГОР являются клинические, электрофизиологические исследования и анализ цереброспинальной жидкости (С8Е), описанные, например, в отчете специального подкомитета Американской академии неврологии, АГО8 1акз Гогсе (1991) №ито1оду 41:617. Диагностические исследования включают иглоукалывание в девяти точках; прохождение 10 м; шкалу Ранкина или ее модифицированную форму и суммирование баллов по шкале МКС или ее модифицированной форме (Ма11по\\'е1х е! а1., (1985) Оссирабоиа1 Тйетару 1. оГ Кез. 5:24; Тйотрзои е! а1., (1996) 1. №ито1. 243:280; Со11еи е! а1. , (1990) Ιηΐ. П1заЫ1йу 8!иб1ез 12:6; уаи 8\\зе1еп е! а1. (1988) 8!токе 19:604 аиб 1<1еу\\'ед е! а1., (1991) Мизс1е №туе 14:1103). Неврологические оценки могут также включать шкалу неврологической утраты трудоспособности (ΝΌ8); шкалу утраты трудоспособности (0, полностью здоров; 1, незначительные симптомы; 2, может ходить без помощи, но не может бегать; 3, может пройти 5 м с помощью; 4, прикован к инвалидному креслу/кровати); тест двигательной способности Хаммерсмита (НМАТ) (Пуск Р.1., Ιη «Рег1рНега1 №итора(йу» (1993), зирга, радез 686-697; 8со!! е! а1. (1982) Мизс1е №туе 5:291) и исследование проводимости нервов. Определение мышечной силы может включать оценку двигательных функций, например измерение максимального произвольного изометрического сокращения мышцы (МУ1С), известное в данной области, и измерения мышечной силы. Другие исследования утраты трудоспособности включают индекс способности перемещаться; измерение функциональной независимости; шкалу неврологической утраты трудоспособности Гая (ΟΝΟδ); суммирование баллов по шкале Медицинского научно-исследовательского совета; суммирование баллов по шкале чувствительности и функциональную шкалу Хьюза (Наизег е! а1. (1983) Ν. Еид1. 1. Меб. 308:173; На11 е! а1. (1993) 1. Неаб Тгаита КеЬаЬййабои 8:60; 8Ьатгаск е! а1. (1996) 1. №ито1. 243: 832 аиб Мегк1ез е! а1. (2002) Хеиго1оду 59:84). Электрофизиологические критерии диагностики СГОР были предложены специальным комитетом Американкой академии неврологии (ΑΑΝ) в 1991 г. и недавно были пересмотрены (№со1аз е! а1. (2002) Мизс1е №гуе 25:26). Другим исследованием, используемым для диагностики иммуноопосредованной сенсорно-двигательной полиневропатии, например, СГОР и синдрома Гийена-Барре (ОВ8), является психометрическая оценка причины возникновения и лечения воспалительной невропатии (ГЛСАТ) при помощи суммирования баллов чувствительности (Ι88) (Мегк1ез е! а1. (2000) №ито1оду 54:943). Антигены лейкоцитов человека Ών3, ΏΚν3, А1 и В8 чаще встречаются у больных СГОР, чем у здоровых людей (2уайаи-Нтб е! а1. (2002) СНгошс 1иГ1атта!огу Петуейиайид Ро1угаб1си1оиеигора!йу, адрес в Интернете тетете.етебкте.сот/иеиго).

Термин «ΙΕΝ-β-1η» означает гликозилированную молекулу ΙΕΝ-β, содержащую аминокислотную последовательности человеческого ΙΕΝ-β дикого типа.

Термин «ΙΕΝ-β-Φ» означает негликозилированную молекулу ΙΕΝ-β, содержащую аминокислотную последовательность ΙΕΝ-β дикого типа, где цистеин в положении 17 заменен серином и отсутствует метионин в положении 1 («инициирующий метионин»).

Термин «вариант ΙΕΝ-β» означает белок ΙΕΝ-β дикого типа, содержащий одну или несколько модификаций, например, делеции, добавления, замены аминокислот, посттрансляционную модификацию или включающий один или несколько искусственных аминокислотных остатков или связей между ними. Части ΙΕΝ-β входят в определение термина «вариант ΙΕΝ-β». Термин «биологически активный вариант ΙΕΝ-β» означает вариант ΙΕΝ-β, который обладает, по меньшей мере, некоторой активностью при лечения невропатии, например СГОР. Вариант ΙΕΝ-β может быть естественным ΙΕΝ-β, включающим, например, вставку, делецию или замену одной или нескольких аминокислот по сравнению с ΙΕΝ-β дикого типа, то есть естественным мутантом или полиморфным вариантом, либо искусственным ΙΕΝ-β.

Термин «международные единицы» или (МЕ) применительно к ΙΕΝ-β означает единицы измерения, принятые Всемирной организацией здравоохранения (АНО) в качестве международного стандарта для измерения интерферона.

Термин «выделенный» (имеющий взаимозаменяемое значение с термином «по существу чистый») применительно к полипептидам означает полипептид, который по своему происхождению или в результате манипуляций: (ί) присутствует в клетке-хозяине в качестве продукта экспрессии части экспрессирующего вектора; (ίί) связан с белком или другой химической частью молекулы, не являющейся частью молекулы, с которой он связан в природе; или (ш) не встречается в природе, например, белок, который химически модифицирован путем присоединения или добавления по меньшей мере одной гидрофобной части, в результате чего белок приобретает форму, не встречающуюся в природе. Термин «выделенный» далее означает белок, который: (ί) синтезирован химическим способом; или (ίί) экспрессирован в клеткехозяине и очищен от связанных и загрязняющих белков. Данный термин обычно служит для обозначения полипептида, который был отделен от других белков и нуклеиновых кислот, вместе с которыми он встре

- 3 009289 чается в естественных условиях. Кроме того, указанный полипептид предпочтительно отделен от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), используемых для его очистки. Термин «выделенный» (используемый взаимозаменяемо с термином «по существу чистый») применительно к нуклеиновым кислотам означает полинуклеотид РНК или ДНК, часть геномного полинуклеотида, кДНК или синтетический полинуклеотид, который по своему происхождению или в результате манипуляции: (ί) не связан со всем полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, находится в клеткехозяине в виде экспрессирующего вектора или его части); (ίί) связан с нуклеиновой кислотой или другой химической частью молекулы, которая не является частью молекулы, с которой он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Термин «выделенный» далее означает полинуклеотидную последовательность, которая: (ί) амплифицирована ίη νίΐτο, например, в результате выполнения полимеразной реакции синтеза цепи (РСК); (ίί) синтезирована химическим способом; (ίίί) продуцирована методами рекомбинантных ДНК путем клонирования; или (ίν) очищена путем расщепления и разделения в геле.

Термин «многоочаговая двигательная невропатия» или «ΜΜΝ» означает хроническую иммуноопосредованную демиелинизирующую невропатию, которая характеризуется постепенным развитием асимметричной мышечной слабости и амиотрофии, локализованной в областях анатомического распределения периферических нервов (Рсйгопк е! а1. (1988) Αηη. №иго1. 24:73 апй КотЬегд е! а1. (1995) Αηη. №иго1. (8ирр1. 1) 843). Электрофизиологическим признаком многоочаговой двигательной невропатии является постоянное блокирование проводимости нервов. В клиническом отношении данное заболевание описано как асимметричный чистодвигательный вариант СГОР с многоочаговым блокированием проводимости двигательных нервов. В процессе развития многоочаговой двигательной невропатии характер данного заболевания может постепенно трансформироваться с возникновением, по существу, симметричной картины, которая в клиническом отношении напоминает двигательную форму СГОР. Исследования патологии позволили объединить эти два заболевания (Кгсп0.с1 е! а1. (1996) Αηη. №иго1. 40:948 и Ой е! а1. (1995) №иго1о§у 45:1828). Большинство больных многоочаговой двигательной невропатией характеризуются высоким титром антител против ганглиозида ΟΜ1 (Ре8ΐ^οηк е! а1., см. выше и КотЬегд е! а1., см. выше).

Нуклеиновая кислота «функционально связана» с другой нуклеиновой кислотой, когда она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности (например, сигнальной последовательности или сигнального пептида) функционально связана с ДНК, кодирующей полипептид, если данная ДНК экспрессирована в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной последовательности; и сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если его положение облегчает трансляцию. Термин «функционально связанный» обычно означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, например, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Связывание может быть достигнуто в результате лигирования, например, на удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, можно использовать синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с известной практикой.

Термин «процентное тождество» или «процентное сходство» означает сходство последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Если в определенном положении двух сравниваемых последовательностей находится одно и то же основание или мономерная аминокислотная субъединица, соответствующие молекулы считаются идентичными в данном положении. Процентная идентичность двух последовательностей определяется числом совпадающих или идентичных положений в двух последовательностях, деленным на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являтся идентичными, тогда две последовательности характеризуются 60% гомологией. В качестве примера можно сравнить последовательности ДНК СТСАСТ и САССТТ, которые являются гомологичными на 50% (совпадают 3 из 6 положений). Сравнение обычно выполняют при выравнивании двух последовательностей для достижения максимальной идентичности. Такое выравнивание можно произвести, например, методом Карлина и Алтскула, который более подробно описан ниже. Применительно к нуклеиновой кислоте термины «процентная гомология» и «процентная идентичность» имеют взаимозаменяемые значения, а применительно к полипептиду термин «процентная гомология» означает степень сходства, при которой аминокислоты, представляющие собой консервативные замены других аминокислот, считаются идентичными указанным другим аминокислотам. Термин «консервативная замена» остатка в эталонной последовательности представляет собой замену аминокислотой, которая физически и функционально подобна соответствующему эталонному остатку, например, имеет аналогичный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или подобные характеристики. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются такие замены, которые удовлетворяют критерию, определяемому для «принятой точковой мутации» в публикации ЭауйоГГ е! а1., 5: А!1ак ок Рго1ет 8е^иеηсе аий 81гис1иге, 5: 8ирр1. 3, ейар1ег 22:354-352, №1. Бюшей. Кек. ВоипйЩюп. ^акИтдощ Э.С. (1978). Процентную гомологию или идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух

- 4 009289 последовательностей нуклеиновых кислот можно определить при помощи алгоритма выравнивания Карлина и Алтскула (Ргос. №11. Асаб. 8сЕ, И8А 87:2264 (1990)), модифицированного в публикации Карлина и Алтскула (Ргос. №11. Асаб. 8сЕ, И8А 90:5873 (1993)). Указанный алгоритм вводят в программы №ВЬА8Т или ХВЙА8Т, описанные в публикации А1Гксйи1 еГ а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403 (1990). Поиск методом ВЬА8Т выполняют при помощи программы №ВЬА8Т, оценка = 100, длина слова = 12, для обнаружения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте по данному изобретению. Поиск белка методом ВЬА8Т выполняют при помощи программы ХВЙА8Т, оценка = 50, длина слова = 3, для обнаружения аминокислотных последовательностей, гомологичных эталонному полипептиду. Для сравнения выровненных последовательностей с разрывами цепи используют метод ВЬА8Т с пробелами в соответствии с описанием, приведенным в публикации А11кс1ш1 еГ а1., №ис1ею Ас1бк Век., 25:3389 (1997). При использовании методов ВЬА8Т и ВЬА8Т с пробелами применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (ХВЙА8Т и №ВЬА8Т). См. в Интернете 1Шр://\\л\л\7псЫ.п1т. ηίΐι.βον.

Качество жизни можно измерить по визуальной аналоговой шкале ЕигоОо1 и суммированию баллов по анкете ЕигоОоБ: шкале определения состояния здоровья из 36 пунктов Мебюа1 ОиГсоте 8Гибу (8Е-36) и визуальной аналоговой шкале (УА8) (ЕигоОоБ Стоир (1990) Неа11й Ройсу 16:199 и Метктек еГ а1. (2002) №еито1о§у 59:84).

Считается, что препарат ΙΕ№-β обладает «терапевтической эффективностью» и количество препарата ΙΕ№-β является «терапевтически эффективным», если введение такого количества одного препарата ΙΕ№-β в комбинированной терапии достаточно для достижения клинически значимого ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания по сравнению с отсутствием лечения препаратом ΙΕ№-β. В предпочтительном варианте осуществления изобретения введение терапевтически эффективного количества препарата ΙΕ№-β субъекту, страдающему СГОР, вызывает ослабление по меньшей мере одного симптома СГОР, например мышечных или нервных нарушений.

Термин «ΙΕ№-β дикого типа» означает нативный или рекомбинантный ΙΕ№-β, содержащий естественную аминокислотную последовательность нативного ΙΕ№-β. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность нативного человеческого ΙΕ№-β приведены соответственно в 8ЕС ГО №О:1 и 2, которые являются последовательностями, представленными, например, в банке генов СепВапк под номерами доступа М28622 (и Е00029) и ААА36040 соответственно.

2. Препараты ΙΕ№-β.

Препараты ΙΕ№-β, которые можно использовать в соответствии с данным изобретением, включают ΙΕ№-β дикого типа и его биологически активные варианты, например естественные и искусственные варианты. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности естественного человеческого ΙΕ№-β дикого типа приведены, соответственно, в 8ЕС ГО №О:1 и 2, которые идентичны последовательностям, представленным в банке генов СепВапк под номерами доступа М28622 и ААА36040 соответственно. Указанные ΙΕ№-ρ описаны также в публикации 8едйа1 (1985) 1. ШГегГетоп Век. 5:521. Непроцессированный белок человеческий ΙΕ№-β состоит из 187 аминокислот, и кодирующая последовательность 8ЕС ГО №О:1 соответствует нуклеотидам 76-639. Сигнальная последовательность соответствует аминокислотам 1-21. Аминокислотная последовательность зрелой формы ΙΕ№-β соответствует аминокислотам 22-187 (нуклеотиды 139-639 8ЕС ГО №О:1). Зрелый белок ΙΕ№-β человека и нуклеотидная последовательность, кодирующая указанный белок, представлены соответственно в виде 8ЕС ГО №О:4 и 3.

ΙΕ№-β, продуцированный в клетках млекопитающего, является гликозилированным. Естественный ΙΕ№-ρ дикого типа гликозилирован по остатку 80 (Акп 80) зрелого полипептида 8ЕС ГО №О:4 или остатка 101 (Акп 101) незрелого полипептида 8ЕС ΙΌ №О:2.

Препараты ΙΕ№-β также включают ΙΕ№-β, отличные от человеческого, например, ΙΕ№-β позвоночных, таких как млекопитающие, например приматов, кроме человека, крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, кошек, собак, крыс и мышей, а также птиц или амфибий. С последовательностями ΙΕ№-β указанных видов можно ознакомиться в банке генов и/или в публикациях либо определить по нуклеиновым кислотам, полученным путем гибридизации в условиях низкой строгости с геном ΙΕ№-β другого вида.

Варианты белков ΙΕ№-β дикого типа включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична или гомологична ΙΕ№-β дикого типа, например человеческий ΙΕ№-β, имеющий 8ЕС ГО №О:2 или 4. Варианты могут включать замены, делеции или добавления одной или нескольких аминокислот. Например, можно использовать биологически активные фрагменты белков ΙΕ№-β дикого типа. В таких фрагментах могут быть удалены, добавлены или заменены 1, 2, 3, 5, 10 или до 20 аминокислот у С- или №-конца белка. Варианты могут также включать замены, делеции или добавления 1, 2, 3, 5, 10 или до 20 аминокислот. Некоторые варианты могут включать замены, делеции или добавления менее 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 или 5 аминокислот. Для замен могут быть использованы естественные аминокислоты или их аналоги, например Όстереоизомерные аминокислоты.

- 5 009289

В объем данного изобретения входят варианты ΙΡΝ-β, кодированные нуклеиновыми кислотами, гибридизирующими в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей естественный ΙΡΝ-β, например, выраженный 8ЕО ΙΌ N0:1 или 3, или ее комплементом. Условия соответствующей строгости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, например, 6,0-кратный объем хлорида натрия/цитрата натрия (88С) при температуре около 45°С с последующей промывкой 2,0-кратным объемом 88С при 50°С, известны специалистам в данной области или с ними можно ознакомиться в публикациях: Сиггеи! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойи \УПеу & 8оик, Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6; 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошид, А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8рппд НагЬог Ргекк, Ν.Υ.; 8. Адгатеа1 (еб.), Ме!йобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, уо1ите 20 и Туккео (1993), ЬаЬога!огу ТесНтсщек ίη ЬюсйетШгу аиб то1еси1аг Ь1о1оду-ВуЬг1б1ха11ои тейй иис1ею ас1б ргоЬек, е.д., рай I сйар!ег 2 «ОуеМете оГ ргтс1р1ек оГ йуЬпб17а!юи аиб !11е к1га1еду оГ иис1е1с ас1б ргоЬе аккаук», Е1кеу1ег, Υо^к. Например, концентрацию соли на стадии промывки можно выбрать в диапазоне от условий низкой строгости, соответствующих примерно 2,0-кратному объему 88С при 50°С, до условий высокой строгости, соответствующих примерно 0,2-кратному объему 88С при 50°С. Кроме того, температуру на стадии промывки можно повысить в интервале от условий низкой строгости при комнатной температуре, около 22°С, до условий высокой строгости при температуре около 65°С. Можно изменять температуру и концентрацию соли, либо температура или концентрация соли могут иметь постоянные значения при одновременном изменении другого параметра. Типичные условия гибридизации включают гибридизацию в 6,0-кратном объеме хлорида натрия/цитрата натрия (88С) при температуре около 50°С с последующей промывкой в 0,2-кратном объеме 88С при комнатной температуре. Температуру на стадии промывки можно повысить примерно до 45, 50, 55, 60 или 65°С с целью усиления строгости гибридизации. Гибридизацию можно также выполнять в 5-кратном объеме 88С, 4-кратном объеме 88С, 3-кратном объеме 88С, 2-кратном объеме 88С, 1-кратном объеме 88С или 0,2-кратном объеме 88С. Гибридизацию можно выполнять в течение по меньшей мере 1, 2, 5, 12 или 24 ч. В процессе гибридизации может быть также использован другой агент, влияющий на строгость гибридизации, например формамид. Например, строгая гибридизация может быть выполнена в присутствии 50% формамида, который повышает строгость гибридизации при указанной температуре. Стадия промывки может быть выполнена в присутствии детергента, например 8Ό8, в таком количестве, как 0,1 или 0,2% 8Ό8. После гибридизации может быть выполнена промывка, включающая одну стадию или по меньшей мере две стадии, которые могут производиться при одинаковой или разной солености и температуре. Например, после гибридизации могут быть выполнены две промывки при 65°С каждая в течение примерно 20 мин в 2-кратном объеме 88С, 0,1% 8Ό8, с последующим выполнением двух промывок при 65°С каждая в течение примерно 20 мин в 0,2-кратном объеме 88С, 0,1% 8Ό8. Типичные строгие условия гибридизации включают гибридизацию в течение ночи при 65°С в растворе, содержащем 50% формамида, 10-кратный объем раствора Денхардта (0,2% фиколла, 0,2% поливинилпирролидона, 0,2% альбумина бычьей сыворотки) и 2 00 мкг/мл денатурированной несущей ДНК, например фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующим выполнением двух промывок при 65°С каждая в течение примерно 20 мин в 2-кратном объеме 88С, 0,1% 8Ό8, и двух промывок при 65°С в течение примерно 20 мин в 0,2-кратном объеме 88С, 0,1% 8Ό8. Гибридизация может включать гибридизацию двух нуклеиновых кислот в растворе или нуклеиновой кислоты в растворе с нуклеиновой кислотой, прикрепленной к твердой подложке, такой как фильтр. В некоторых случаях, например, когда одна нуклеиновая кислота находится на твердой подложке, гибридизации может предшествовать стадия предварительной гибридизации, которую выполняют в течение по меньшей мере 1, 3 или 10 ч в таком же растворе и при такой же температуре, что и в растворе для гибридизации (без зонда). В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант ΙΡΝ-β, гибридизируют с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:1 или 3 или ее комплементом в условиях умеренной строгости, например, включающих промывку в 2,0-кратном объеме 88С при температуре около 40°С. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант ΙΡΝ-β, гибридизируют с последовательностью 8ЕО ΙΌ Ν0:1 или 3 или ее комплементом в условиях высокой строгости, например, включающих промывку в 0,2-кратном объеме 88С при температуре около 65°С.

Типичными модификациями являются консервативные модификации, которые оказывают минимальное влияние на вторичную и третичную структуру белка. Типичные консервативные замены включают замены, описанные в публикациях ОауйоГГ ш !йе А!1ак оГ Рго!еш 8еуиенсе аиб 8!гис!иге 5 (1978) и Агдок 1и ЕМВО 1., 8, 779-785 (1989). Например, аминокислоты, относящиеся к одной из нижеследующих групп, представлят собой консервативные замены: а1а, рго, д1у, д1и, аки, кег, 1Нг; сук, кег, !уг, 1Нг; уа1, 11е, 1еи, те!, а1а, рйе; 1ук, агд, Ык; и рйе, !уг, !гр, Ык.

Другие модификации включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой, которая необязательно может представлять консервативную замену. Например, можно производить замены, которые, по существу, не влияют на трехмерную структуру ΙΡΝ-β. Трехмерная структура негликозилированного человеческого ΙΡΝ-β описана, например, в публикации Κ.абйакπкйηаη е! а1. (1996) 8!гис!иге 4: 1453, и трехмерная структура гликозилированного ΙΡΝ-β описана, например, в публикации Кагрикак е! а1. (1997) ΡΝΑ8 94:11813. В частности, ΙΡΝ-β содержит пять спиралей: спираль А, включающую аминокислоты 2

- 6 009289

8ЕС ΙΌ ΝΟ:4; спираль В, включающую аминокислоты 51-71 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4; спираль С, включающую аминокислоты 80-107 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4; спираль Ό, включающую аминокислоты 118-136 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4, и спираль Е, включающую аминокислоты 139-162 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4 (Кагрикак с1 а1., см. выше). Спирали А, В, С и Е образуют левосторонний четырехспиральный тяж типа 2. В ΙΡΝ-β имеется длинная верхняя петля

AB, соединяющая спирали А и В, и три более короткие петли (именуемые ВС, СО и ΌΕ), соединяющие остальные спирали (Кагрикак с1 а1., см. выше). Ранее выполненные исследования показали, что Νконцевые, С-концевые и гликозилированные области спирали С молекулы ΙΡΝ-β не находятся в сайте связывания рецептора (см. заявки XVΟ 00/23472 и Ό88Ν 09/832659). Поэтому мутации в указанных областях не оказывают существенного вредного влияния на биологическую активность молекулы ΙΡΝ. Кроме того, ранее было установлено, что мутации в спирали С (аминокислоты 81, 82, 85, 86 и 89 зрелого человеческого ΙΡΝ-β) вызывают образование молекулы, обладающей более высокой антивирусной активностью по сравнению с ΙΡΝ-β дикого типа (см. заявки νΟ 00/23472 и Ό88Ν 09/832659). Аналогичным образом было установлено, что мутанты в спирали А (аминокислоты 2, 4, 5, 8 и 11 зрелого человеческого ΙΡΝ-β) и петле СО (аминокислоты 110, 11, 113, 116 и 119) обладают более высовой активностью связывания с рецептором и более высокой антивирусной и антипролиферативной активностью по сравнению с естественным человеческим ΙΡΝ-β дикого типа (см. заявки νΟ 00/23472 и Ό88Ν 09/832659).

Другие предпочтительные модификации или замены устраняют сайты для межмолекулярного перекрестного сшивания и неправильного образования дисульфидных связей. Например, известно, что ΙΡΝ-β имеет три остатка сук в положениях 17, 31 и 141 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4 дикого типа. Одним вариантом ΙΡΝ является ΙΡΝ, в котором остаток сук (С) в положении 17 заменен остатком кег (8), как это описано, например, в патенте США № 4588585. Другими вариантами ΙΡΝ-β являются варианты ΙΡΝ-β, в которых один или несколько остатков сук (С) в положении 17 заменены остатками кег (8) и остаток уа1 (V) в положении 101 заменен остатком рйе (Ρ), 1гр (V), 1уг (Υ) или Ык (Н), предпочтительно рйе (Ρ), при нумерации в соответствии с ΙΡΝ-р дикого типа, имеющего, например, 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4, аналогично описанному, например, в патенте США № 6127332. Другие предпочтительные варианты включают полипептиды, содержащие последовательность ΙΡΝ-β дикого типа, например, 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4, в которой остаток уа1 (V) в положении 101 при нумерации в соответствии с ΙΡΝ-β дикого типа заменен остатком рйе (Ρ), 1уг (Υ), 1гр (V), Ык (Н) или рйе (Ρ), как это описано в патенте США № 6127332.

Другие варианты ΙΡΝ-β представляют собой молекулы зрелого ΙΡΝ-β, в которых отсутствует инициирующий метионин, например, метионин 1 8ЕС ΙΌ ΝΟ:4. В типичных вариантах ΙΡΝ-β отсутствует инициирующий метионин и заменена по меньшей мере одна аминокислота, например, в положении 17 зрелой формы, как это описано в патенте США № 4588585.

Молекулы ΙΡΝ-β можно также модифицировать путем замены одной или нескольких аминокислот одной или несколькими производными аминокислот, являющимися естественными или искусственными аминокислотами, в которых естественная боковая цепь или концевая группа модифицирована в результате выполнения химической реакции. Такие модификации включат, например, гамма-карбоксилирование, бета-карбоксилирование, пегилирование, сульфатирование, сульфирование, фосфорилирование, амидирование, этерификацию, Ν-ацетилирование, карбобензилирование, тозилирование и другие модификации, известные в данной области.

Другие модификации включают использование аминокислотных аналогов или производных аминокислот, в которых боковая цепь удлинена или укорочена с образованием карбоксильной, аминогруппы или другой реакционноспособной функциональной группы-предшественника для циклизации, а также аминокислотных аналогов, имеющих разные боковые цепи с соответствующими функциональными группами. Например, соединение по данному изобретению может включать аминокислотный аналог, такой как, например, цианоаланин, канаванин, дьенколовая кислота, норлейцин, 3-фосфосерин, гомосерин, дигидроксифенилаланин, 5-гидрокситриптофан, 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, диаминопимелиновая кислота, орнитин или диаминомасляная кислота. Специалистам в данной области должны быть известны другие естественные аминокислотные метаболиты или предшественники, имеющие приемлемые боковые цепи, которые входят в объем настоящего изобретения.

Другие варианты ΙΡΝ-β включают обратные или ретро пептидные последовательности. «Обратная» или «ретро» пептидная последовательность означает часть общей последовательности ковалентно связанных аминокислотных остатков (их аналогов или псевдоостатков), в которой нормальное образование пептидной связи в направлении от карбоксиконца к аминоконцу в аминокислотном остове было изменено таким образом, что при считывании в обычном направлении слева направо аминоконцевая часть пептидной связи предшествует (а не находится позади) карбоксиконцевой части. См. публикацию Сообщав.

M. апб Сйогеу, М. ЛссоиШк о£ Сйет. Кек. 1979, 12, 423. Пептиды с обратной ориентацией, рассмотренные в данном описании изобретения, включают (а) пептиды, в которых один или несколько аминоконцевых остатков расположены в обратной («геу») ориентации (образуя таким образом второй «карбоксиконец» в левой части молекулы), и (Ь) пептиды, в которых один или несколько карбоксиконцевых остатков расположены в обратной («геу») ориентации (образуя второй «аминоконец» в правой части молекулы). Пептидная (амидная) связь не может быть образована на поверхности раздела между остатком с нор

- 7 009289 мальной ориентацией и остатком с обратной ориентацией. Поэтому некоторые обратные полипептиды по данному изобретению можно получить, используя соответствующую аминокислотную псевдочасть для связывания двух смежных частей последовательностей при помощи обратной пептидной (обратной амидной) связи. В вышеуказанной случае (а) центральный остаток дикетосоединения можно успешно использовать для связывания структур двумя амидными связями с получением псевдопептидной структуры. В вышеуказанном случае (Ь) центральный остаток диаминосоединения можно аналогичным образом использовать для связывания структур двумя амидными связями с образованием псевдопептидной структуры. Обратное направление связывания в таких полипептидах обычно требует дополнительной инверсии энантиомерной конфигурации обратных аминокислотных остатков для сохранения пространственной ориентации боковых цепей, которая аналогична ориентации нормального пептида. Конфигурация аминокислот в обратной части пептидов предпочтительно является Ό-конфигурацией, и конфигурация нормальной части предпочтительно является Ь-конфигурацией. Противоположные или смешанные конфигурации являются приемлемыми для оптимизации активности связывания в тех случаях, когда это возможно. Модификации полипептидов далее описаны, например, в патенте США № 6399075.

Препараты ΙΡΝ-β включают также белки ΙΡΝ-β и их варианты (например зрелый белок), слитые с одним или несколькими гетерологичными полипептидами. Г етерологичный полипептид может быть добавлен, например, для увеличения полупериода существования белка ΙΡΝ-β или усиления его продуцирования. Типичные гетерологичные полипептиды включают молекулы иммуноглобулина (1д) или их части, например, константный домен легкой или тяжелой цепи молекулы 1д. В одном варианте осуществления изобретения белок ΙΡΝ-β или его вариант сливают или каким-либо другим образом связывают со всей или частью шарнирной и константной областей легкой цепи, тяжелой цепью или обеими цепями иммуноглобулина. Таким образом, данное изобретение относится к молекуле, которая включает:

(1) белковую часть ΙΡΝ-β (то есть ΙΡΝ-β или его вариант), (2) второй пептид, например, пептид, увеличивающий растворимость или время существования ίη νίνο части ΙΡΝ-β, в частности, член надсемейства иммуноглобулинов, его фрагмент или часть, например часть или фрагмент Ι§0, а именно константную область тяжелой цепи !дС 1 человека, например, СН2-, СН3- и шарнирные области. В частности, термин «слитый белок ΙΕΝ-β/Ι§» означает белок, содержащий биологически активную часть ΙΡΝ-β, связанную с Ν-концом цепи иммуноглобулина. Подвидом слитого белка ΙΕΝ-β/Ι§ является «слитый белок ΙΕΝ-β/Εο», который является белком, содержащим часть ΙΡΝ-β, связанную по меньшей мере с частью константного домена иммуноглобулина. Предпочтительный Ροслитый белок содержит часть ΙΡΝ-β, связанную с фрагментом антитела, включающим С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина.

Слитый белок может содержать полипептид ΙΡΝ-β или его вариант, с Ν- и С-концами которого связаны гетерологичные полипептиды. Гетерологичный полипептид может также находиться внутри полипептида ΙΡΝ-β или его варианта.

В одном варианте осуществления изобретения слитый белок имеет общую формулу Χ-Υ-Ζ, где X означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность ΙΡΝ-β, его части или варианта; Υ означает необязательную линкерную часть и Ζ означает полипептид, содержащий по меньшей мере часть полипептида, не являющуюся бета-интерфероном части X. В других вариантах осуществления изобретения слитый белок имеет формулу Ζ-Υ-Χ, где полипептид, не являющийся ΙΡΝ-β, слит с Νконцевой частью линкера, слитой с Ν-концевой частью полипептида ΙΡΝ-β, его части или варианта. Часть Ζ может быть частью полипептида, содержащей иммуноглобулиноподобные домены. Примеры таких полипептидов включают СЭ1, СЭ2, СЭ4 и основные антигены гистосовместимости, относящиеся к классу Ι и классу ΙΙ. См. патент США № 5565335 (Сароп е! а1) для ознакомления с примерами таких полипептидов.

Часть Ζ может включать, например, несколько остатков гистидина или предпочтительно Ρο-область иммуноглобулина; термин «Ρο» в данном описании изобретения означает фрагмент антитела, содержащий С-концевой домен тяжелой цепи иммуноглобулина.

Часть Υ может быть любым линкером, позволяющим части ΙΡΝ-β сохранять свою биологическую активность. Часть Υ может состоять из одной аминокислоты или по меньшей мере из двух аминокислот. Υ может также включать от около 2 до около 5 аминокислот; от около 3 до около 10 аминокислот либо 10 или более аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Υ включает последовательность С1уС1уС1уС1у8ег (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:6), кодированную, например, нуклеотидной последовательностью ООСООТООТООСАОС (8ЕО ΙΌ ΝΟ:5). Υ может также включать сайт узнавания энтерокиназы, например, АкрАкрАкрАкрЬук (8ЕО ΙΌ ΝΟ:8), кодированный, например, последовательностью ОАСОАТОАТОАСААО (8ЕО ΙΌ ΝΟ:7). В другом варианте осуществления изобретения Υ включает последовательность 8ег8егО1уА8рА8рА8рА5рЬу8 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:10), кодированную, например, последовательностью АОСТССООАОАСОАТОАТОАСААО (8ЕО ΙΌ ΝΟ:9).

Кроме того, часть ΙΡΝ-β (X) и вторая часть Ζ, не являющаяся ΙΡΝ-β (например, Ρο-область иммуноглобулина), могут быть также связаны в результате осуществления любой химической реакции, которая позволяет связать две молекулы вместе при сохранении частями X и Ζ соответствующей активности.

- 8 009289

Указанное химическое связывание может включать многие химические механизмы, такие как ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляция, координационное связывание и комплексообразование. Типичные связующие агенты (то есть линкеры (Υ) в общей формуле), используемые для ковалентного связывания части ΙΕΝ-β с частью Ζ, могут включать органические соединения, такие как сложные тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидоэфиры, диизоцианаты, такие как толилен-2,6-диизоцианат, глутеральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины, такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин, бифункциональные производные имидоэфиров, такие как диметиладипимидат, и бис-активные соединения фтора, такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. В вышеуказанный перечень входят разные классы химических связующих агентов, известных в данной области. Многие указанные агенты можно приобрести коммерческим путем, в частности, №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8РОР), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС), 4-сукцинимидилоксикарбонилальфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол (8МРТ; Р1егсе Сйсш. Со., № по каталогу 215586).

Предпочтительный слитый белок ΙΕΝ-β/Ιβ имеет 8Е6 ΙΌ ΝΟ:12, которая содержит непроцессированную зрелую форму человеческого ΙΕΝ-β, то есть 8Е6 ΙΌ ΝΟ:4, слитую с Εс-областью человеческого Ι§61 (ΖΕ5107) (см. заявки ΑΟ 00/23472 и υ88Ν 09/832659) (см. фиг. 1). Соответствующая нуклеотидная последовательность приведена в 8Е6 ΙΌ ΝΟ:11. ДНК, кодирующая человеческий ΙΕΝ-β, заканчивается у триплета нуклеотидов 568-570 (ААС, кодирующий аргинин), и ДНК, кодирующая константную область человеческого Ι§61, начинается у триплета (6АС, кодирующий аспарагиновую кислоту), начинающегося с нуклеотида 574 8Е6 ΙΌ ΝΟ: 11.

Другой предпочтительный слитый белок ΙΕΝ-β/Ιβ приведен в 8Е6 ΙΌ ΝΟ:14 и кодирован 8Е6 ΙΌ ΝΟ:13 (см. заявки ΑΟ 00/23472 и υ88Ν 09/832659) (см. фиг. 2). Указанный слитый белок включает человеческий ΙΕΝ-β, слитый с линкером 648, который в свою очередь связан с Εс-областью человеческого Ι§61 (ΖΕ6206). Линкер 648 (кодированный нуклеотидами 571-585 8Е6 ΙΌ ΝΟ:7) включает аминокислотную последовательность 66668 (8Е6 ΙΌ ΝΟ:9). Способы продуцирования указанных белков описаны в заявках ΑΟ 00/23472 и υ88Ν 09/832659.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид ΙΕΝ-β слит у С-конца по меньшей мере с частью Εс-области иммуноглобулина. ΙΕΝ-β образует аминоконцевую часть, и Есобласть образует карбоксиконцевую часть. В указанных слитых белках Εс-область предпочтительно ограничена шарнирной областью константного домена и СН2- и СН3-доменами. Εс-область в указанных слитых белках может быть также ограничена частью шарнирной области, способной образовывать межмолекулярные дисульфидные связи, и СН2- и СН3-доменами или их функциональными эквивалентами. Указанные константные области могут быть получены у любого млекопитающего (предпочтительно человека) и выделены из любого соответствующего класса и/или изотипа, включая ΙβΛ, ΙβΌ, ΙβΜ, ΙβΕ и Ι§61, Ι§62, Ι§63 и Ι§64.

Молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующие Ιβ-слитые белки, могут быть получены любым методом, известным в данной области (ΜαηίαΙίδ е1 а1., 1982, Мо1еси1аг С1ошид; А ЕаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЕаЬогаФгу, Со1е. 8ргтд НагЬог, Ν.Υ.), или выделены из доступных клонов. Методы получения генов, кодирующих константные области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулинов, рассмотрены, например, в заявке РСТ, КоЬткои, К. е1 а1., публикация ΑΟ 87/02671. Последовательность кДНК, кодирующая молекулу интерферона или ее фрагмент, может быть непосредственно связана с кДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи Ι§, или при помощи линкерной последовательности. В других вариантах осуществления изобретения может быть создана рекомбинантная векторная система для введения последовательностей, кодирующих бета-интерферон, в правильную рамку считывания с синтетической шарнирной областью. Кроме того, может быть желательно, чтобы рекомбинантная векторная система включала в виде составной части нуклеиновые кислоты, соответствующие 3'фланкирующей области гена иммуноглобулина, содержащего сайты расщепления/полиаденилирования РНК и нижние последовательности. Далее может быть желательно создать сигнальную последовательность вверху от последовательностей, кодирующих слитый белок иммуноглобулина, для облегчения секреции слитой молекулы из клетки, трансформированной рекомбинантным вектором.

Настоящее изобретение относится к димерным слитым молекулам, а также к мономерным или многомерным молекулам, содержащим слитые белки. Такие многомеры можно получить, используя Рсобласти или их части молекул Ιβ, которые обычно являются многовалентными, такие как пентамеры ΙβΜ или димеры ^А. Очевидно, что для образования и стабилизации пентамеров ΙβΜ и димеров ^А может быть нужен соединительный полипептид I. Альтернативно, многомеры слитых белков ΙΕΝ-β могут быть образованы с использованием белка, обладающего сродством к Εс-области молекул Ι§, такого как белок А. Например, несколько слитых белков ΙΕΝ-β/иммуноглобулина можно связать с агарозными гранулами, содержащими белок А.

Указанные многовалентные формы являются весьма полезными, так как они имеют несколько сайтов связывания с рецепторами бета-интерферона. Например, двухвалентный растворимый ΙΕΝ-β может содержать два последовательных повтора аминокислот 1-166 8Е6 ΙΌ ΝΟ:4 (или повторы, кодированные нуклеиновыми кислотами 1-4 98 8Е6 ΙΌ ΝΟ:3) (часть X в общей формуле), разделенных линкерной об

- 9 009289 ластью (часть Υ), причем указанные повторы связаны по меньшей мере с одной частью константного домена иммуноглобулина (часть Ζ). Можно также создать альтернативные многовалентные формы, например, в результате химического связывания слитых белков ΙΕΝ-β/Ι§ с любой клинически приемлемой несущей молекулой, полимером, выбранным из группы, состоящей из фиколла, полиэтиленгликоля или декстрана, при помощи обычных методов связывания. Альтернативно, ΙΡΝ-β может быть химически связан с биотином, и полученный конъюгат биотина и Рс-области бета-интерферона затем связывают с авидином, в результате чего образуются трехвалентные молекулы авидина/биотина/бета-интерферона. Слитые белки ΙΡΝ-β/Ι§ могут быть также ковалентно связаны с динитрофенолом (ΌΝΡ) или тринитрофенолом (ΤΝΡ), после чего полученный конъюгат осаждают при помощи антитела против ΌΝΡ или антитела против ΤΝΡ-Ι§Μ с образованием декамерных конъюгатов с валентностью 10 для сайтов связывания рецепторов бета-интерферона.

Производные белков по данному изобретению включают также разные структурные формы первичного белка, сохраняющие биологическую активность. Благодаря наличию ионизируемых амино-и карбоксильных групп, белки ΙΡΝ-β и их варианты могут находиться в форме кислых или основных солей или в нейтральной форме. Отдельные аминокислотные остатки могут быть также модифицированы окислением или восстановлением. Кроме того, первичная аминокислотная структура (включая Ν- и/или С-концы) или гликан ΙΡΝ-β могут быть модифицированы (с получением производных соединений) путем образования ковалентных или агрегированных конъюгатов с другими химическими частями, такими как гликозильные группы, полиалкиленгликоли, в частности полиэтиленгликоль, липиды, фосфаты, ацетильные группы и тому подобные, или путем создания мутантов аминокислотной последовательности.

Другие производные бета-интерферона/Ι^ включают ковалентные или агрегированные конъюгаты бета-интерферона или его фрагментов с другими белками или полипептидами, например, полученные в результате синтеза в рекомбинантной культуре в виде дополнительных Ν- или С-концов. Например, конъюгированный пептид может быть сигнальной (или лидерной) полипептидной последовательностью в Ν-концевой области белка, которая одновременно с трансляцией или после трансляции направляет перенос белка с сайта синтеза на функциональный сайт внутри или снаружи клеточной мембраны или стенки (например, лидерная последовательность альфа-фактора дрожжей). Например, сигнальный пептид может быть последовательностью ΙΡΝ-β, включающей, в частности, аминокислоты 1-21 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2, соответствующие нуклеотидам 76-138 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1. Сигнальный пептид может также иметь последовательность УСАМ, то есть включать аминокислоты 1-24 8ЕО ΙΌ ΝΟ:12, которая кодирована нуклеотидами 1-72 8ЕО ΙΌ ΝΟ:11.

Гетерологичный полипептид (например пептид) или другую молекулу можно также использовать в качестве метки или для облегчения очистки препарата ΙΡΝ-β. Такие пептиды хорошо известны в данной области. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может быть слит в рамке считывания с маркерной последовательностью, определяемой также как «Тад-последовательность», кодирующая «Тадпептид», которая позволяет метить и/или очищать полипептид по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновую метку, например, переносимую вектором РОЕ-9. Многие другие Тад-пептиды можно приобрести коммерческим путем. Другие часто используемые Тад-метки включают тус-эпитопы (см., например, ЕШкои е! а1. (1991), 1. ΒίοΙ. Сйет. 266:21150-21157), которые содержат последовательность из 10 остатков, выделенную из с-тус, систему рРЬАС (Ι п(егпа!1опа1 Вю!есйио1од1е8, Шс.), систему ρΕΖΖбелок А (Рйаттааа, Ν1) и часть белка гемагглютинина НаеторЫ1и§ шПиеп/а. состоящую из 16 аминокислот. Кроме того, в качестве Тад-метки можно использовать любой полипептид, если можно получить или идентифицировать реагент, например антитело, специфически взаимодействующее с Тадполипептидом.

В одном варианте осуществления изобретения белок ΙΡΝ-β или его вариант слит у Ν- или С-конца с одним из нижеследующих пептидов: ΗίδΗίδΗίδΗίδΗίδΗίδ (8ЕО ΙΌ ΝΟ:6), который может быть кодирован нуклеотидной последовательностью САТСАТСАТСАТСАТСАТ (8ЕО ΙΌ ΝΟ:15); ^τΟ/Ο/ΗίδΗίδΗίδΗίδΗίδΗίδ (8ЕО ΙΌ ΝΟ:18), который может быть кодирован нуклеотидной последовательностью ТСССССССССАТСАТСАТСАТСАТСАТ (8ЕО ΙΌ ΝΟ:15) и ЖаТНуСИу I НМ НМ ПК ПК ПК ПчНегНегСИ_уАчрАкрАкрАкрЬук (8ЕО ΙΌ ΝΟ:20), который может быть кодирован нуклеотидной последовательностью ТСССССССССАТСАТСАТСАТСАТСАТАССТССССАСАССАТСАТСАСААС (8ЕО ΙΌ ΝΟ:19).

Аминокислотная последовательность бета-интерферона может быть также связана с пептидом АкрТугЕукАкрАкрАкрАкрЬук (ΌΥΚΌΌΌΌΚ) (8ЕО ΙΌ νΟ:21) (Норр е! а1., Вю/Тесйио1оду 6:1204, 1988). Указанная последовательность является высокоантигенной и содержит эпитоп, обратимо связывающийся специфическим моноклональным антителом, позволяя производить экспресс-анализ и простую очистку экспрессированного рекомбинантного белка. Кроме того, указанная последовательность специфически расщепляется энтерокиназой слизистой оболочки крупного рогатого скота у остатка, следующего сразу же за парой остатков Акр-Ьук.

В другом варианте осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β содержит белок ΙΡΝ-β или его вариант, слитый с белком альбумина, его вариантом или частью. Такой слитый белок можно получить спосо

- 10 009289 бом, описанным, например, в заявке ЛО 01/77137.

Препарат ΙΕΝ-β может также содержать молекулу, которая не является полипептидом. Например, белок ΙΕΝ-β или его вариант может быть ковалентно или нековалентно связан с полимером, например с биологически разрушаемым полимером. Например, белок ΙΕΝ-β или его вариант может быть модифицирован полиэтиленгликолем, например, связан с полиэтиленгликолем (ПЭГ) способом, описанным в заявке Л О 00/23114.

В соответствии с широким объемом настоящего изобретения для конъюгации с ΙΕΝ-β может быть использована одна молекула полимера, хотя известно, что к ΙΕΝ-β может быть также присоединено несколько полимерных молекул. Очевидно, что для конъюгации полимера можно использовать любые группы, части или другие конъюгированные разновидности, соответствующие конечному применению. В качестве примера можно отметить, что полимер можно использовать в некоторых применениях для ковалентного связывания с функциональной частью, сообщающей полимеру устойчивость к деструкции под действием УФ-излучения, антиоксидантные или другие свойства. В качестве другого примера можно отметить, что в некоторых применениях желательно активировать полимер, чтобы сделать его реакционноспособным или перекрестно сшиваемым с целью усиления разных свойств или характеристик конъюгированного вещества. Поэтому полимер может содержать любые функциональные группы, повторяющиеся группы, связи или другие структуры, которые не ухудшают эффективность конъюгированной композиции ΙΕΝ-β для предполагаемого применения.

ΙΕΝ-β предпочтительно конъюгируют при помощи концевой реакционноспособной группы в полимере, хотя конъюгацию можно также производить в виде боковой цепи при помощи неконцевых реакционноспособных групп. Полимер, имеющий одну или несколько реакционноспособных групп, определяется в данном описании изобретения как «активированный полимер». Реакционноспособная группа избирательно взаимодействует со свободными аминогруппами или другими реакционноспособными группами в белке. Активированный полимер подвергают взаимодействию так, чтобы его можно было присоединить по любой имеющейся аминогруппе ΙΕΝ-β, такой как альфа-аминогруппы или эпсилонаминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, должным образом активированные карбонильные группы, гидроксильные, гуанидильные, окисленные углеводородные части и меркаптогруппы ΙΕΝ-β (при их наличии) можно также использовать в качестве сайтов присоединения.

Несмотря на то, что полимер можно присоединить в любом месте цепи молекулы ΙΕΝ-β или его варианта либо другой аминокислоты, присоединенной при помощи прямой или непрямой связи к молекуле ΙΕΝ-β, наиболее предпочтительным сайтом для связывания полимера является Ν-конец молекулы ΙΕΝ-β. Вторичные сайты расположены у С-конца или рядом с ним и на всех сайтах цепи сахарных частей. Таким образом, наиболее предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают: (1) конъюгаты ΙΕΝ-β или его варианта с полимером, присоединенным у Ν-конца; (ίί) конъюгаты ΙΕΝ-β или его варианта с полимером, присоединенным у С-конца; (ίίί) конъюгаты с полимером, связанные сахарными частями; (ίν) конъюгаты белков ΙΕΝ-β или их вариантов с полимером, присоединенным у Ν-, Сконца и при помощи сахарных частей.

Обычно используют от около 1,0 до около 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество должно представлять собой баланс между максимальным увеличением эффективности реакции и минимальным образованием неспецифических модификаций продукта, а также между созданием химической структуры, сохраняющей оптимальную активность, и оптимизацией, если это возможно, полупериода существования белка. Желательно сохранить по меньшей мере около 50% биологической активности белка и наиболее предпочтительно 100%.

Указанные реакции можно выполнять любым приемлемым методом, используемым для осуществления взаимодействия биологически активных веществ с инертными полимерами, предпочтительно при рН около 5-7, если реакционноспособные группы находятся в положении альфа-аминогруппы у Ν-конца. Указанный процесс обычно включает получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу) и последующее взаимодействие белка с активированным полимером с образованием растворимого белка, приемлемого для получения лекарственного средства.

Вышеуказанная модификация реакции может быть выполнена несколькими методами, включающими одну или несколько стадий.

Как указано выше, в наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения используется Ν-конец ΙΕΝ-β в качестве связующего звена для полимера. Существуют приемлемые методы для избирательного получения ΙΕΝ-β с модифицированным Ν-концом. Одним методом является восстановительное алкилирование, при выполнении которого используют разную реакционную способность первичных аминогрупп разных типов (эпсилон-аминогруппы лизина по сравнению с аминогруппами Νконцевого метионина), используемых для получения производных соединений ΙΕΝ-β. В соответствующих избирательных условиях может быть получено производное соединение ΙΕΝ-β, к Ν-концу которого присоединяют полимер, содержащий карбонильную группу. Указанную реакцию выполняют при значении рН, позволяющем использовать преимущество различий между показателями рКа эпсилон

- 11 009289 аминогрупп остатков лизина и альфа-аминогруппы Ν-концевого остатка ΙΡΝ-β. Химическая реакция такого типа хорошо известна специалистам в данной области.

Например, можно использовать схему реакций, в которой подобная избирательность сохраняется в результате выполнения реакций при низком значении рН (обычно 5-6) в условиях, при которых ПЭГальдегидный полимер подвергают взаимодействию с ΙΡΝ-β в присутствии цианоборогидрида натрия. После очистки ПЭГ-ΙΡΝ-β и анализа методом 808-РАСЕ, масс-спектрометрии ΜΑΕΌΙ и секвенирования/картирования пептида получают ΙΡΝ-β, к Ν-концу которого направленно присоединена часть ПЭГ.

Кристаллическая структура ΙΡΝ-β показывает, что Ν- и С-концы расположены близко друг к другу (см. Кагрикак е! а1., 1997, Ргос. Ναΐΐ. Асаб 8с1. 94:11813-11818). Таким образом, модификации С-конца ΙΡΝ-β должны также оказывать минимальное влияние на активность. Хотя не существует простого химического метода направленной доставки полиалкиленгликоля, такого как ПЭГ, к С-концу, подобный результат может быть достигнут в результате генетического создания сайта, который можно использовать для направленного присоединения полимерной части. Например, введение остатки Сук в положение, расположенное у С-конца или рядом с ним, позволяет получить специфическую модификацию с использованием имида малеиновой кислоты, винилсульфона или полиалкиленгликоля (например, ПЭГ), активированного гелогенацетатом. Указанные производные можно специфически использовать для модификации созданных цистеинов благодаря высокой селективности данных реагентов в отношении остатков Сук. Другие методы, такие как введение гистидиновой метки, обладающей направленным действием (Ρаηсу е! а1., (1996) СЬет & ΒίοΙ. 3:551), или создание дополнительного сайта гликозилирования, представляют собой другие альтернативы для модификации С-конца ΙΡΝ-β.

Гликан в ΙΡΝ-β также занимает положение, которое позволяет производить дальнейшую модификацию без изменения активности. Методы направленной доставки к сахарам, используемым в качестве сайтов для химической модификации, также хорошо известны и поэтому весьма вероятно, что полиалкиленгликоль может быть непосредственно и специфически присоединен к сахарам в ΙΡΝ-β, которые были активированы путем окисления. Например, можно получить гидразид полиэтиленгликоля, который образует относительно устойчивые гидразоновые связи в результате конденсации с альдегидами и кетонами. Указанное свойство было использовано для модификации белков при помощи окисленных олигосахаридных связей. См. публикацию Апбгекх. Н. е! а1., (1978), Макгото1. СЬет. 179:301. В частности, обработка карбоксиметилгидразида полиэтиленгликоля нитритом позволяет получить карбоксиметилазид полиэтиленгликоля, который представляет собой электрофильно активную группу, взаимодействующую с аминогруппами. Указанную реакцию можно использовать также для получения белков, модифицированных полиалкиленгликолем. См. патенты США №№ 4101380 и 4179337.

Химическая структура, созданная при помощи тиолового линкера, может далее облегчить перекрестное сшивание белков. Указанную реакцию можно выполнить путем создания реакционноспособных альдегидов в углеводородных частях при помощи периодата натрия, образования конъюгатов цистамина с использованием альдегидов и индукции перекрестного сшивания при помощи тиоловых групп в цистаминах (см. Рершкку, В. е! а1., (1991), 1. Βίο1. СЬет., 266: 18244-18249 апб Сбей, Ь.Ь. е! а1., (1991) 1. Βίο1. СЬет., 266: 18237-18243). Поэтому предполагается, что данный тип химической структуры пригоден для модификации полиалкиленгликолями, если в сахар введен линкер и полиалкиленгликоль присоединен к указанному линкеру. Хотя аминотиоловые или гидразинсодержащие линкеры пригодны для добавления одной полимерной группы, структура линкера может быть изменена с возможностью присоединения нескольких полимеров и/или изменения пространственной ориентации полимера относительно ΙΡΝ-β.

Типичными полимерами являются водорастворимые полимеры, такие как полиалкиленгликоль. Неограничивающий список таких полимеров включает другие гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и блоксополимеры. Другие примеры главной цепи приемлемых водорастворимых и непептидных полимеров включают полиоксиэтилированный полиол, полиолефиновый спирт, поливинилпирролидон, полигидроксипропилметакриламид, поли-а-гидроксикислоту, поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-Νакрилоилморфолин и их сополимеры, тройные сополимеры и смеси. В одном варианте осуществления изобретения полимерным остовом является полиэтиленгликоль или монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ) со средней молекулярной массой от около 200 Да до около 400000 Да. Должно быть понятно, что другие родственные полимеры также пригодны для осуществления настоящего изобретения, и ПЭГ или полиэтиленгликоль входит в перечень таких полимеров. Термин ПЭГ означает полиэтиленгликоль в любых формах, включая алкокси-ПЭГ, бифункциональный ПЭГ, ПЭГ с множественным разветвлением, ПЭГ с раздвоенной цепью, ПЭГ с разветвленной цепью, ПЭГ с боковыми заместителями или ПЭГ с расщепляемыми связями.

В одном варианте осуществления изобретения полиалкиленгликолевые остатки С1-С4 алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), или полиоксиалкиленгликолевые остатки таких гликолей входят в представляющие интерес полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединяют белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) или полиоксиэтилированным полиолом, при условии что во всех случаях полимер растворяется в воде при комнатной тем

- 12 009289 пературе.

Неограничивающие примеры таких полимеров включают гомополимеры полиалкиленоксида, такие как ПЭГ или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и блоксополимеры, при условии сохранения водорастворимости блоксополимера. Примеры полиоксиэтилированных полиолов включают, например, полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу и тому подобные. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина аналогичен естественному остову, существующему, например, у животных и человека в моно-, дии триглицеридах. Поэтому такое разветвление необязательно должно быть чужеродным для организма.

В качестве альтернативы полиалкиленоксидам можно использовать декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, углеводородные полимеры и тому подобные. Специалистам в данной области должно быть понятно, что приведенный выше список является иллюстративным и в объем изобретения входят все полимеры, обладающие описанными свойствами.

Полимер может иметь любую молекулярную массу, но предпочтительная молекулярная масса находится в пределах от около 300 до 100000, более предпочтительно от 10000 до 40000. В частности, молекулярная масса, равная 20000 или больше, лучше всего позволяет предотвратить потерю белка вследствие фильтрации в почках.

Производные соединения полиалкиленгликоля обладают рядом свойств, полезных для получения конъюгатов полимер-ΙΡΝ-β при осуществлении настоящего изобретения, таких как лучшая водорастворимость при одновременном сохранении антигенной или иммуногенной реакции; высокая степень биосовместимости; отсутствие биоразрушения производных полиалкиленгликоля ίη νίνο и более легкое выведение из живых организмов.

Кроме того, другим объектом данного изобретения является использование ΙΡΝ-β, ковалентно связанного с полимером, причем в данном случае конъюгация достигается за счет расщепляемых ковалентных химических связей. Такая конъюгация позволяет контролировать время, по истечении которого полимер может быть отщеплен от ΙΡΝ-β. Ковалентная связь между препаратом ΙΡΝ-β и полимером может быть расщеплена в результате химической или ферментативной реакции. Продукт, представляющий собой ΙΡΝ-β-полимерный конъюгат, сохраняет активность на приемлемом уровне. Одновременно с этим в конъюгирующем полимере присутствуют части полиэтиленгликоля, сообщающие ΙΡΝ-β-полимерному конъюгату высокую водорастворимость и более продолжительное сохранение в кровотоке. Благодаря улучшенным характеристикам ΙΡΝ-β-полимерного конъюгата данное изобретение делает возможной парентеральную, назальную и пероральную доставку активного ΙΡΝ-β-полимерного конъюгата с последующим гидролитическим расщеплением связей, улучшает биологическую доступность ΙΡΝ-β при применении ίη νίνο.

Взаимодействие полимера и ΙΡΝ-β с образованием конъюгатов, например, продуктов, конъюгированных у Ν-конца, можно легко выполнить при помощи целого ряда схем реакций. Активность и устойчивость конъюгатов ΙΡΝ-β можно изменять разными способами, используя полимеры с разной молекулярной массой. Растворимость конъюгатов можно варьировать путем изменения пропорции и размера фрагмента полиэтиленгликоля, введенного в полимерную композицию.

В одном варианте осуществления изобретения конъюгаты по настоящему изобретению получают, осуществляя взаимодействие белка с активированным соединением полиалкиленгликоля (РСС). Например, ΙΡΝ можно подвергнуть взаимодействию с ПЭГ-альдегидом в присутствии восстановителя (например, цианоборогидрида натрия) при помощи восстановительного алкилирования для получения ПЭГбелкового конъюгата, соединенного амидной связью. См., например, европейский патент № 0154316 В1 и заявку на международный патент № РСГ/и803/01559.

В некоторых вариантах осуществления изобретения человеческий ΙΡΝ-β ПЭГ-модифицируют с использованием следующих активированных полиалкиленгликолей: мПЭГ-О-2-метилпропиональдегид 20 кДа, мПЭГ-О-п-метилфенил-О-2-метилпропиональдегид 20 кДа, мПЭГ-О-м-метилфенил-О-2-метилпропиональдегид 20 кДа, мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид 20 кДа, мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегид 20 кДа и мПЭГ-О-м-фенилацетальдегид 20 кДа, получая при этом ΙΡΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-2метилпропиональдегидом 20 кДа, ΙΡΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-п-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом 20 кДа, ΙΡΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-м-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом 20 кДа, ΙΡΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом 20 кДа, ΙΡΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегидом 20 кДа, и ΙΡΝ-β, модифицированный мПЭГ-Ом-фенилацетальдегидом 20 кДа. Подробное описание получения и исследования человеческого ΙΡΝ-β, модифицированного мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом: 20 кДа и мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом 20 кДа, приведено ниже, а также в заявке на международный патент № РСТ/и803/01559.

В одном варианте осуществления изобретения пегилированный ΙΡΝ-β получают следующим образом. ΙΡΝ-β, например ΑνΟΝΕΧ® (нерасфасованный промежуточный продукт ΙΡΝ-β-1 а. (клиническая партия нерасфасованного лекарственного средства, прошедшая все испытания для использования при лечении человека) в количестве 250 мкг/мл в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ ΝαΟΙ) разводят

- 13 009289 равным объемом 100 мМ ΜΕ8, рН 5,0, и доводят показатель рН до 5,0, добавляя НС1. Образец вводят в колонку ЕЕ 8Р-8ер11аго5е® (Рйагтас1а, Рщса1атау, N1) при 6 мг ΙΕΝ-β/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ №С1, и продукт элюируют 30 мМ фосфата натрия, рН 6,0, 600 мМ №С1. Элюированные фракции анализируют, измеряя оптическую плотность при 280 нм, и на основании оптической плотности определяют концентрацию интерферона в образцах, используя коэффициент экстинкции, равный 1,51 для 1 мг/мл раствора.

К ΙΕΝ-β, полученному из элюата 8Р, в количестве 1 мг/мл раствора, добавляют 0,5 М фосфата натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборогидрид натрия (А1йг1сй, Μ^1\νаикее. XVI) до 5 мМ и ПЭГ-альдегид с молекулярной массой 20000 (8йеаг^а1ег Ро1утег§, НийэтШе, АЬ) до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 20 ч. Пегилированный интерферон очищают от продуктов реакции, выполняя последовательные стадии хроматографии в сортирующей колонке 6 ЕРЬС 8ирего8е® (Рйагтас1а) с использованием 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 150 мМ №101 в качестве подвижной фазы и 8Р8ер11аго5е® ЕЕ. В сортирующей колонке происходит разделение модифицированного и немодифицированного ΙΕΝ-β. Элюат, содержащий пегилированный бета-интерферон, собранный после гельфильтрации, разводят водой в отношении 1:1 и вводят в количестве 2 мг бета-интерферона/мл смолы в колонку 8Р-8ерйаго5е®. Колонку промывают 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ №С1, после чего пегилированный бета-интерферон элюируют из колонки 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 800 мМ №С1. Элюированные фракции анализируют в отношении содержания белка на основании оптической плотности при 280 нм. Концентрация пегилированного интерферона указана в эквивалентах интерферона, так как ПЭГ не влияет на оптическую плотность при 280 нм. Указанный метод и исследование пегилированного ΙΕΝ-β описаны в заявке νΟ 00/23114. Конъюгация ΙΕΝ-β с ПЭГ, по-видимому, не изменяет антивирусную активность. Кроме того, удельная активность пегилированного ΙΕΝ-β значительно выше (примерно в 10 раз), чем у ΙΕΝ-β, не модифицированного полиэтиленгликолем (νΟ 00/23114).

ΙΕΝ-β можно также модифицировать ПЭГ-альдегидной частью с молекулярной массой 5000, производимой, например, компанией Инка, Иас (№ по каталогу 75936, Кοηкοηкοтаη, ΝΥ), в соответствии со способом, приведенным выше для ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 20000.

ΙΕΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом 20 кДа, можно получить следующим образом. 10 мл ΛνΟΝΕΧ® (нерасфасованный промежуточный продукт ΙΕΝ-β-^, (клиническая партия нерасфасованного лекарственного средства, прошедшая все испытания для использования при лечении человека) в количестве 250 мкг/мл в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ №1С1 разводят 12 мл 165 мМ ΜΕ8, рН 5,0, и 50 мкл 5н. раствора НС1. Образец вводят в 300 мкл колонку ΕΕ 8Р 8ер11аго5е (Рйагтааа). Колонку трижды промывают 300 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 7 5 мМ №1С1 и элюируют белок 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 600 мМ №С1. Элюированные фракции анализируют в отношении оптической плотности при 280 нм и определяют концентрацию ΙΕΝ-β в образцах, используя коэффициент экстинкции, равный 1,51 для 1 мг/мл раствора. Соответствующие пику фракции собирают, получая при этом ΙΕΝ-β в концентрации 3,66 мг/мл, который затем разбавляют водой до 1,2 мг/мл.

К 0,8 мл ΙΕΝ-β, полученного из разбавленного элюата из колонки 8Р-8ерйаго5е, добавляют 0,5 М фосфата натрия, рН 6,0 до 50 мМ, цианоборогидрид натрия (А1йпсй) до 5 мМ и мПЭГ-О-2метилпропиональдегид 20 кДа до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 16 ч в темноте. Пегилированный ΙΕΝ-β очищают от реакционной смеси в 0,5 мл колонке ΕΕ 8Р-8ерйаго5е следующим образом: 0,6 мл реакционной смеси разбавляют 2,4 мл 20 мМ ΜΕ8, рН 5,0, и вводят в колонку 8Р-8ер11аго5е. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ №С1, после чего пегилированный ΙΕΝ-β элюируют из колонки 25 мМ ΜΕ8, рН 6,4, 400 мМ №С1. Пегилированный ΙΕΝ-β затем очищают в сортирующей колонке 8ирего8е 6 НК 10/30 ΕΡΕΟ используя 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 150 мМ №1С1 в качестве подвижной фазы. Очистку в сортирующей колонке (25 мл) производят со скоростью 20 мл/час и собирают 0,5 мл фракции. Элюированные фракции анализируют в отношении содержания белка на основании оптической плотности при 280 нм, собирают и определяют концентрацию белка в собранном элюате. Концентрация пегилированного ΙΕΝ-β указана в эквивалентах ΙΕΝ, так как ПЭГ не влияет на оптическую плотность при 280 нм. Отбирают образцы для анализа и остальную часть элюата разводят до 30 мкг/мл НА8-содержащим буфером, отбирают аликвоты в количестве 0,25 мл/пробирку и хранят при 70°С.

ΙΕΝ-β, модифицированный мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом 20 кДа, можно получить следующим образом. 20 мл ΑVΟNΕX® (нерасфасованный промежуточный продукт ΙΕΝ-β, клиническая партия нерасфасованного лекарственного средства, прошедшая все испытания для использования при лечении человека, в количестве 250 мкг/мл в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ №1С1) разводят 24 мл 165 мМ ΜΕ8, рН 5,0, 100 мкл 5н. раствора НС1 и 24 мл воды. Образец вводят в 600 мкл колонку ΕΕ 8Р8ер11аго5е (Рйагташа). Колонку дважды промывают 900 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ №1С1 и элюируют белок 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 600 мМ №С1. Элюированные фракции анализируют в отношении оптической плотности при 280 нм и определяют концентрацию ΙΕΝ-β в образцах, используя коэффициент экстинкции, равный 1,51 для 1 мг/мл раствора. Соответствующие пику фракции собирают,

- 14 009289 получая при этом ΙΕΝ-β в концентрации 2,3 мг/мл. К 1,2 мл ΙΕΝ-β-1α, полученного из элюата, собранного с колонки ЗР-Зср11аго5С. добавляют 0,5 М фосфата натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборогидрид натрия (Αΐάποίι) до 5 мМ и мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид 20 кДа до 10 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 18 ч в темноте. Пегилированный ΙΕΝ-β можно очистить от реакционной смеси в 0,75 мл колонке ΕΕ ЗР-Зерйатоке следующим образом: 1,5 мл реакционной смеси разводят 7,5 мл 20 мМ МЕЗ, рН 5,0, 7,5 мл воды и 5 мкл 5н. раствора НС1 и вводят в колонку ЗР-Зерйатоке. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ №С1, после чего пегилированный ΙΕΝ-β элюируют из колонки 20 мМ МЕЗ, рН 6,0, 600 мМ ИаСЕ Затем пегилированный ΙΕΝ-β очищают в сортирующей колонке Зирегоке 6 НК 10/30 ΕΡ^, используя 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 150 мМ №1С1 в качестве подвижной фазы. Очистку в сортирующей колонке (25 мл) выполняют со скоростью 20 мл/ч и собирают 0,5 мл фракции. Элюированные фракции анализируют в отношении содержания белка на основании оптической плотности при 280 нм, собирают и определяют концентрацию белка в элюате. Концентрация пегилированного ΙΕΝ-β указана в эквивалентах ΙΕΝ после внесения поправки на ПЭГ (мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид 20 кДа имеет коэффициент экстинкции при 280 нм, равный 0,5 для 1 мг/мл раствора) в оптическую плотность при 280 нм, используя коэффициент экстинкции, равный 2 для 1 мг/мл раствора пегилированного ΙΕΝ-β. Отбирают образцы для анализа и остальную часть собранного продукта разводят до 30 мкг/мл НАЗ-содержащим буфером, отбират аликвоты в количестве 0,25 мл/пробирку и хранят при -70°С.

Гликозилированный ΙΕΝ-β, связанный с искусственным полимером, можно использовать при осуществлении способов по данному изобретению. Полимер может содержать полиалкиленгликолевую часть. Полиалкиленовая часть может быть связана с бета-интерфероном при помощи группы, выбранной из альдегидной группы, малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы, нескольких остатков гистидина, гидразиновой группы и аминотиоловой группы. ΙΕΝ-β может быть связан с полиэтиленгликолевой частью, причем ΙΕΝ-β связывают с полиэтиленгликолевой частью при помощи неустойчивой связи, которая расщепляется в результате биохимического гидролиза и/или протеолиза. Полимер может иметь молекулярную массу от около 5 до около 40 кДа. Другой ΙΕΝ-β, который можно использовать, является физиологически активным бета-интерфероном композиции, включающей физиологически активный гликозилированный бета-интерферон, Ν-конец которого связан с полимером, содержащим полиалкиленгликолевую часть, при этом физиологически активный бета-интерферон и полиалкиленгликолевая часть расположены так, что физиологически активный бета-интерферон, входящий в состав композиции, обладает, по существу, такой же активностью, что и физиологически активный бета-интерферон, не имеющий указанной части, о чем свидетельствуют результаты измерения методом антивирусного анализа.

Гетерологичные полипептиды или другие молекулы могут быть ковалентно или нековалентно связаны с белком ΙΕΝ-β или его вариантом. Термин «ковалентно связанный» означает, что разные части молекулы по данному изобретению ковалентно связаны друг с другом прямой связью или ковалентно связаны друг с другом непрямой связью при помощи одной или нескольких промежуточных частей, таких как мостик, спейсер, одна или несколько линкерных частей. Одну или несколько промежуточных частей именуют «связующей группой». Термин «конъюгированный» имеет взаимозаменяемое значение с термином «ковалентно связанный».

Бета-интерфероны, предназначенные для использования в данном изобретении, могут быть гликозилированными или негликозилированными. Негликозилированные ΙΕΝ-β можно продуцировать в прокариотической клетке-хозяине.

Белки ΙΕΝ-β и их варианты можно также модифицировать, присоединяя полисахариды, которые обычно отсутствуют в ΙΕΝ-β.

3. Методы получения препаратов ΙΕΝ-β.

Препараты ΙΕΝ-β по настоящему изобретению можно получить любыми приемлемыми методами, которые включают получение нуклеиновой кислоты, кодирующей препарат ΙΕΝ-β, и экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в приемлемом трансформированном хозяине. При помощи такого метода можно получить препараты рекомбинантного ΙΕΝ-β. Препараты ΙΕΝ-β можно также получить химическим синтезом или комбинацией химического синтеза и методов рекомбинантных ДНК.

В одном варианте осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую препарат ΙΕΝ-β, получают путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей ΙΕΝ-β или его вариант. Например, слитый белок ΙΕΝ-β можно получить методом, рассмотренным в данном описании изобретения. Естественную нуклеиновую кислоту ΙΕΝ-β можно получить методами, хорошо известными в данной области. Например, нуклеиновую кислоту можно выделить при помощи полимеразной реакции синтеза цепи с обратной транскриптазой (КТ-РСК), используя РНК, полученную из клетки, которая, как известно, экспрессирует ΙΕΝ-β, например лейкоцита, и затравки на основе последовательности гена ΙΕΝ-β, например, ЗЕО ΙΌ ΝΟ:1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ΙΕΝ-β, можно также получить в результате скрининга библиотек, например библиотек кДНК, созданных из клеток, экспрессирующих ΙΕΝβ, при помощи зонда, например, олигонуклеотида, содержащего часть последовательности ΙΕΝ-β.

- 15 009289

Альтернативно, полную аминокислотную последовательность можно использовать для создания гена, транслированного в обратном направлении. Можно синтезировать олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую препарат ΙΡΝ-β. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части требуемого полипептида, и затем лигировать их друг с другом. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3'-концевые выступы для комплементарной сборки.

В нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ΙΡΝ-β, можно внести изменения методами, хорошо известными в данной области. Например, можно произвести изменения при помощи сайт-специфического мутагенеза, описанного, например, в публикации Магк е1 а1. «8йе-кресШс Ми1адепек1к Ο£ И1е Нитап ΡίЬгоЬ1ак( Шейегоп Сепе», Ргос. Νηϊ1. Асаб. 8с1. И8А, 81, рр. 5662-66 (1984) и патенте США № 4588585.

Другим методом создания нуклеиновой кислоты, кодирующей препарат ΙΡΝ-β, является химический синтез. Например, ген, кодирующий требуемый препарат ΙΡΝ-β, можно синтезировать химическим путем в синтезаторе олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды создают на основе аминокислотной последовательности требуемого препарата ΙΡΝ-β.

При выборе нуклеиновой кислоты для экспрессии в экспрессирующей системе желательно выбрать такие кодоны, которые благоприятны для клетки-хозяина или экспрессирующей системы, в которой будет продуцирован препарат рекомбинантного ΙΡΝ-β. Известно, например, что определенные кодоны более предпочтительно экспрессируются в прокариотических клетках по сравнению с другими («предпочтение кодонов»).

Последовательность ДНК, кодирующая препарат ΙΡΝ-β, может включать или не включать последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность. Такая сигнальная последовательность, в случае ее наличия, является последовательностью, узнаваемой клеткой, выбранной для экспрессии препарата ΙΡΝ-β. Сигнальная последовательность может быть прокариотической, эукариотической или комбинацией обеих последовательностей. Сигнальные последовательности хорошо известны в данной области, где описано несколько разных последовательностей. Сигнальная последовательность может быть последовательностью нативного (то есть естественного) ΙΡΝ-β. Введение сигнальной последовательности зависит от желания секретировать препарат ΙΡΝ-β в рекомбинантных клетках, в которых он продуцирован. Если выбранные клетки являются прокариотическими, обычно желательно, чтобы последовательность ДНК не кодировала сигнальную последовательность. Если выбранные клетки являются эукариотическими, обычно желательно иметь кодированную сигнальную последовательность и особенно предпочтительно использовать сигнальную последовательность ΙΡΝ-β дикого типа.

После сборки (путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другим методом) нуклеиновую кислоту, кодирующую препарат ΙΡΝ-β, вводят в экспрессирующий вектор, в котором она функционально связана с экспрессирующей регулярной последовательностью, пригодной для экспрессии препарата ΙΡΝβ в требуемом трансформированном хозяине. Правильность сборки может быть подтверждена секвенированием нуклеиновой кислоты, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в приемлемом хозяине или клетке-хозяине. Как известно в данной области, для достижения высоких уровней экспрессии трансфецированного гена в хозяине или клетке-хозяине указанный ген должен быть функционально связан с экспрессирующими регулярными последовательностями транскрипции и трансляции, функционирующими в выбранном экспрессирующем хозяине.

Выбор экспрессирующей регулярной последовательности и экспрессирующего вектора зависит от выбора клетки-хозяина. Можно использовать разные комбинации экспрессирующего хозяина/вектора. Приемлемыми экспрессирующими векторами для эукариотических хозяев, например, эукариотических клеток-хозяев, являются векторы, содержащие экспрессирующие регулярные последовательности, выделенные из 8ν40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса, в частности, нижеследующие векторы: рс^NАI/атр, рс^NАI/ηео, рКс/СМ^ р8V2дрΐ, р8V2пео, р8V2-б11Γ^. рТк2, рК8^ео, рМ8С, р8УТ7, рко-пео и рНуд. Альтернативно, для временной экспрессии белков в эукариотических клетках можно использовать производные вирусов, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (ΒРV-1) или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, выделенный из рКЕР и р205). В данной области известны разные методы получения плазмид и трансформации организмов-хозяев. Для ознакомления с другими экспрессирующими системами см. публикацию Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2^пб Еб., еб. Ьу 8атЬгоок, Вг11ксЬ апб Матайк (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк: 1989), Сйар1егк 16 апб 17.

Приемлемые экспрессирующие векторы для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, в частности, плазмиды, полученные из Е. со11, включающие со1 Е1, рСК1, рВК322, рМВ9 и их производные, плазмиды с более широким спектром хозяев, такие как КР4, фаговые ДНК, например многочисленные производные лямбда-фага, такие как ИМ989, и другие ДНК-содержащие фаги, такие как М13 и нитчатые одноцепочечные ДНК-содержащие фаги. Приемлемые экспрессирующие векторы для дрожжевых клеток включают плазмиду 2.ти. и ее производные. Приемлемые векторы для клеток насекомых включают р^ 941. См. также публикацию Са1е е1 а1., «ЕокЮоп о£ 111е Воуте Апб Нитап Сепек Еог Ми11епап IπЫЬ^ΐ^пд 8иЬк1апсе Апб Ехргеккюп о£ 111е Нитап Сепе Ιπ Ашта1 Се11к», Се11, 45, рр. 685-98 (1986).

- 16 009289

Кроме того, в указанных векторах можно использовать разные экспрессирующие регулярные последовательности. Пригодные экспрессирующие регулярные последовательности включают экспрессирующие регулярные последовательности, связанные со структурными генами вышеуказанных экспрессирующих векторов. Примеры приемлемых экспрессирующих регулярных последовательностей включают, например, ранние и поздние промоторы 8У-40 или аденовируса, 1ас-системы, Ггр-системы, систему ТАС или ТВС, главные операторные и промоторные области лямбда-фага, например РЬ, контрольные области белка оболочки вируса Гб, промотор 3-фосфоглицераткиназы или другие гликолитические ферменты, промоторы кислой фосфатазы, например Рйо5, промоторы системы альфа-спаривания дрожжей и другие последовательности, которые, как известно, контролируют экспрессирую генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов и разных их комбинаций.

Для продуцирования препаратов ΙΕ№-β можно использовать любого приемлемого хозяина, включая бактерии, грибы (в том числе дрожжи), растительные клетки, клетки насекомых, клетки млекопитающих и другие подходящие животные клетки или линии клеток, а также трансгенных животных или растения. Типичными хозяевами являются штаммы Е. сой, Ркеиботопак, ВасШик, 8ГгерГотусек, грибные клетки, дрожжевые клетки, клетки насекомых, таких как 8роборГега Ггиа1регба (8Е9), животные клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки мышей, такие как №8/0, клетки африканской зеленой мартышки, такие как СО8 Ι, СО8 7, В8С 1, В8С 40 и ВМТ 10, и клетки человека, а также растительные клетки в культуре ткани. Такие клетки можно получить из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Предпочтительные клетки-хозяева для экспрессии в животных клетках включают культивируемые клетки СНО и СО8 7 и особенно линию клеток СНО-ΌΌυΚΥ-β 1.

Должно быть понятно, что не все векторы и экспрессирующие регулярные последовательности одинаково хорошо экспрессируют последовательности ДНК, рассмотренные в данном описании изобретения. Точно так же не все хозяева одинаково хорошо подходят для одной и той же экспрессирующей системы. Однако специалист в данной области может выбрать необходимые векторы, экспрессирующие регулярные последовательности и хозяев без излишнего экспериментирования. При этом необходимо также учесть число копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессию любых других белков, кодированных данным вектором, таких как маркер устойчивости к антибиотикам. Например, предпочтительные векторы для данного изобретения включают векторы, позволяющие амплифицировать ДНК, кодирующую препарат ΙΕ№-β, в виде нескольких копий. Такие амплифицируемые векторы хорошо известны в данной области. К таким векторам относятся, например, векторы, которые можно амплифицировать методом амплификации ΌΗΕΒ (см., например, КаиГтап, патент США № 4470461, публикацию КаиГтап апб 8йагр, «СопкГгисГюп оГ а Моби1аг П1йубгаГо1аГе ВебисГаке сЭ№А Сепе: Апа1ук1к оГ 81дпа1к ийН/еб Гог ЕГПс1еп1 Ехргеккюп», Мо1. Се11. Вю1., 2, рр. 1304-19 (1982)) или амплификации глутаминсинтетазы («С8») (см., например, патент США № 5122464 и опубликованную заявку на европейский патент № 338841).

При выборе экспрессирующей регулярной последовательности необходимо учесть ряд факторов. Такие факторы включают, например, относительную прочность последовательности, ее регулируемость и совместимость с действительной последовательностью ДНК, кодирующей препарат ΙΕ№-β, в частности, в отношении возможных вторичных структур. При выборе хозяев необходимо учитывать их совместимость с выбранным вектором, токсичность продукта, кодированного последовательностями ДНК по данному изобретению, характеристики секреции, способность осуществлять правильную укладку полипептидных цепей, требования, предъявляемые к ферментации или культуре, и простоту очистки продуктов, кодированных последовательностями ДНК.

С учетом вышеуказанных параметров специалист в данной области может выбрать разные комбинации вектора/экспрессирующей регулярной последовательности/хозяина, которые будут экспрессировать требуемые последовательности ДНК в ферментационной или крупномасштабной животной культуре, например, с использованием клеток СНО или СО8 7. Использование линии клеток СНО, такой как СНО-КиКХ-В1 ΌΗΡΒ кир, для экспрессии вариантов ΙΕ№-β подробно описано в патенте США. № 6127332.

Препарат ΙΕ№-β можно также продуцировать в системе т уйго, например, системе трансляции, такой как клеточный лизат, в частности лизат ретикулоцитов. Термин «система трансляции ш уйго», имеющий взаимозаменяемое значение с термином «бесклеточная система трансляции», означает систему трансляции, которая представляет собой бесклеточный экстракт, содержащий по меньшей мере минимум элементов, необходимых для трансляции молекулы РНК в белок. Системы трансляции ш ν 11го обычно включают макромолекулы, такие как ферменты, факторы трансляции, инициации и элонгации, химические реагенты и рибосомы. Например, система трансляции ш ν 11го может содержать по меньшей мере рибосомы, тРНК, инициирующий метионил-тРНК^МеГ, белки или комплексы, участвующие в трансляции, например, еГЕ₂, еГЕз, кэп-связывающий (СВ) комплекс, включающий кэп-связывающий белок (СВР) и эукариотический фактор инициации 4Е (еШ^). В данной области хорошо известны разные системы трансляции ш νιΙΐΌ, которые включают коммерчески доступные наборы. Примерами систем трансляции ш νίΙΐΌ являются лизаты эукариотических клеток, такие как лизаты ретикулоцитов кролика, лизаты ооци

- 17 009289 тов кролика, лизаты клеток человека, лизаты клеток насекомых и экстракты ростков пшеницы. Лизаты производятся на коммерческой основе такими компаниями как Рготеда Согр, Маб1зои, А1з; 8йа!адеие, Ьа Эо11а, СайГ.; АтегзЬат, Аг1шд!ои Не1д1!з, 111.; и СШСО/ВКЬ, Сгаиб Ыаиб, Ν.Υ. РНК, используемую в системах трансляции 1и У1!то, можно продуцировать ш уйго, например, при помощи промоторов 8Р6 или Т7 методами, известными в данной области.

В соответствии с другим способом препарат ΙΕΝ-β экспрессируют из эндогенного гена в клеткехозяине. Данный способ может включать введение гетерологичного промотора вверху от кодирующей области гена ΙΕΝ-β, например индуцируемого промотора, экспрессирующего эндогенный ген ΙΕΝ-β, и выделение продуцированного ΙΕΝ-β. Гетерологичный промотор можно ввести в клетки путем «вбивания» методами, известными в данной области, или альтернативно путем введения промотора в ген ΙΕΝ-β.

Препарат ΙΕΝ-β, полученный способом по настоящему изобретению, может быть гликозилированным или негликозилированным в зависимости от организма-хозяина, использованного для продуцирования данного препарата. Если в качестве хозяина были выбраны бактерии, продуцированный препарат ΙΕΝ-β будет негликозилированным. Эукариотические клетки, с другой стороны, гликозилируют препараты ΙΕΝ-β.

Препарат ΙΕΝ-β, продуцированный трансформированным хозяином, можно очистить любым приемлемым способом. Известны разные способы очистки ΙΕΝ-β. См., например, патенты США №№ 4289689, 4359389, 4172071, 4551271, 5244655, 4485017, 4257938, 4541952 и 6127332. В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат ΙΕΝ-β очищают при помощи иммуноаффинной хроматографии, описанной, например, в публикации Окатига е! а1., «Нитаи Ь1ЬгоЬ1аз(о1б ШкгГегои: IттииозогЬеи! Со1ити СЬгота!одгарйу аиб №Тегтта1 Атто Ас1б 8едиеисе». ВюсЬет, 19, рр. 3831-35 (1980).

Например, белки ΙΕΝ-β и их варианты можно выделить и очистить известными методами, такими как экстракция, преципитация, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез или тому подобными. Например, белки и фрагменты интерферона можно очистить, пропуская раствор через колонку, содержащую иммобилизованный рецептор интерферона (см. патент США № 4725669). Связанную молекулу интерферона затем можно элюировать, производя обработку хаотропной солью или водным раствором уксусной кислоты. Слитые белки иммуноглобулина можно очистить, пропуская раствор, содержащий слитый белок, через колонку, заполненную белком А или белком С, который избирательно связывается с Εс-частью слитого белка. См., например, публикацию Ке1з, К.1. е! а1., I. Iттиηо1. 132:3098-3102 (1984); заявку РСТ, публикация № АО 87/00329. Химерное антитело можно затем элюировать, производя обработку хаотропной солью или водным раствором уксусной кислоты.

Альтернативно белки интерферона и молекулы, слитые с иммуноглобулином, можно очистить в колонках с антителом против интерферона или в колонках с антителом против иммуноглолубина, получив при этом по существу чистый белок. Термин «по существу чистый» означает, что белок не содержит загрязняющих веществ, которые связаны с ним в естественных условиях. О существенной чистоте свидетельствует одна полоса, полученная при выполнении электрофореза.

Продуцированный и очищенный ΙΕΝ-β можно исследовать методом пептидного картирования. Например, образец препарата ΙΕΝ-β можно гидролизовать эндопротеиназой Ьуз-С и исследовать методом ВЭЖХ с обращенной фазой в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 6127332.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат ΙΕΝ-β по существу не содержит другой клеточный материал, например белки. Термин «по существу чистый» или «очищенные препараты ΙΕΝ-β» означает препарат ΙΕΝ-β, содержащий менее примерно 20% (в пересчете на сухую массу) загрязняющего клеточного материала, например нуклеиновых кислот, белков и липидов, и предпочтительно содержащий менее примерно 5% загрязняющего клеточного материала.

Предпочтительные препараты ΙΕΝ-β содержат менее примерно 2% загрязняющего клеточного материала; еще предпочтительнее менее примерно 1% загрязняющего клеточного материала и наиболее предпочтительно менее примерно 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001% загрязняющего клеточного материала.

Предпочтительные композиции на основе препарата ΙΕΝ-β также, по существу, не содержат других клеточных белков (определяемых также как «загрязняющие белки»), то есть указанные композиции содержат менее примерно 20% (в пересчете на сухую массу) загрязняющего белка и предпочтительно содержат менее примерно 5% загрязняющего белка.

Предпочтительные препараты полипептидов по данному изобретению содержат менее примерно 2% загрязняющего белка; еще предпочтительнее менее примерно 1% загрязняющего белка и наиболее предпочтительно менее примерно 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001% загрязняющих белков.

Чистоту и концентрацию препаратов ΙΕΝ-β можно определить методами, известными в данной области, например при помощи гель-электрофореза, и методами, описанными в публикации КоЬей К. 8сорез, Рто!еш Рштйса!юи, Ртшс1р1ез аиб Ртасйсе, ТЫтб Еб., 8рттдет Ует1ад №\ν Υо^к, 1993 и в ссылках, приведенных в данной публикации.

Биологическую активность препаратов ΙΕΝ-β можно исследовать любым приемлемым методом, известным в данной области, например, путем нейтрализации антителом антивирусной активности, индук

- 18 009289 ции активности протеинкиназы, олигоаденилат-2,5-А-синтетазы или фосфодиэстеразы, в соответствии с описанием, приведенным в заявках ЕР-В 1-41313 и ЛО 00/23472. Такие анализы включают также иммуномодуляторные анализы (см., например, патент США № 4753795), анализы методом торможения роста и измерение связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы интерферона. Типичные антивирусные анализы описаны в патенте США № 6127332 и заявке ЛО 00/23472.

Пригодность препаратов ΙΕΝ-β для лечения гломерулонефрита можно также оценить с использованием животных моделей, например, описанных в примерах и далее в данном описании изобретения. Исследование может быть произведено в соответствии с описанием, приведенным в примерах.

Препараты ΙΕΝ-β можно также приобрести коммерческим путем под следующими торговыми названиями: ЛУОХЕХ® (ΙΕΝ-β-Ια) (Вюдеп, Ιηο.. СашЬпбдс. МА); ΚΕΒΙΕ® (ΙΕΝ-β-1 а) (8егопо, 8.А., Сепста. 8\\'Цхег1апб) и ΒΕΤΑΕΕΚΌΝ® (ΙΕΝ-β-1Ь) (8сйегтд АкбепдезеШсйай, Вег1т, Сегтапу), который также представлен на рынке под названием ΒΕΤΑ8ΕΚΌΝ® (Вег1ех, МопМ11е, ΝΕ ΙΕΝ-β-№). ΑΥΌΝΕΧ® и ΚΕΒΙΕ® представляют собой рекомбинантный гликозилированный человеческий ΙΕΝ-β дикого типа, продуцированный в клетках яичника китайского хомячка. ΒΕΤΑΕΕΚОN® продуцирован в бактериях.

4. Способы лечения препаратами ΙΕΝ-β.

Настоящее изобретение относится к способам лечения и профилактики невропатии у нуждающегося субъекта, включающим введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества препарата ΙΕΝ-β необязательно в качестве вспомогательного средства при лечении другим препаратом. В одном варианте осуществления изобретения невропатия является демиелинизирующей невропатией, такой как хроническая демиелинизирующая невропатия. Примеры хронической демиелинизирующей невропатии включают СШР и многоочаговую двигательную невропатию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения невропатия является СШР.

Нуждающимся субъектом может быть субъект, у которого обнаружена невропатия. Невропатия может быть диагностирована у субъекта методами, известными в данной области. В частности, СШР может быть диагностирована методами, известными в данной области, которые более подробно описаны ниже. Лечение субъекта с диагнозом невропатии может быть начато препаратом ΙΕΝ-β в любое время. Кроме того, лечению может быть подвергнут субъект, у которого не обнаружена невропатия, но, повидимому, может возникнуть. Такие субъекты могут быть выявлены генетическими методами обследования. Субъекты, у которых может возникнуть невропатия, являются также субъектами, у которых обнаружены некоторые, но не все симптомы, характерные для невропатии, поэтому в некоторых случаях может быть неясно, действительно ли у субъекта может возникнуть невропатия. Лечение может проводиться в течение по меньшей мере около 1 месяца, по меньшей мере около 3 месяцев, по меньшей мере около 6 месяцев, по меньшей мере около 1 года, по меньшей мере около 3 лет, по меньшей мере около 5 лет или дольше.

Нуждающимся субъектом может быть животное, в частности млекопитающее. Примеры млекопитающих включают людей, крупный рогатый скот, овец, свиней, лошадей, собак, кошек, приматов, кроме человека, мышей и крыс.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ΙΕΝ-β вводят нуждающемуся субъекту в виде дополнительной терапии, то есть при одновременном проведении другого лечения. Например, субъект, страдающий СШР, может проходить курс лечения ΙνΙμ; стероидами, такими как преднизолон; иммунодепрессантом, таким как азотиоприн, циклоспорин или циклофосфамид; или плазмаферезом помимо введения препарата ΙΕΝ-β. Комбинированная терапия с использованием препарата ΙΕΝ-β может свести до минимума применение других лекарственных средств, которые могут быть более вредными (например стероиды), более дорогими (например, ΙνΙβ) или менее удобными (замена плазмы). Поэтому в некоторых вариантах осуществления изобретения введение субъекту препарата ΙΕΝ-β позволяет уменьшить дозу и/или частоту введения другого лекарственного средства. Например, дозу и/или частоту введения можно уменьшить по меньшей мере примерно на 10, 30, 50, 75, 100% (то есть в два раза), пять раз, 10 раз или больше. Ниже приведены действующие нормативы лечения СШР.

Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения хронической демиелинизирующей невропатии, например СШР, у субъекта, проходящего основной курс лечения СШР, выбранный из группы, состоящей из введения стероида, введения противопоспалительного средства, введения ΙνΙβ и проведения плазмафереза, который помимо основного лечения СШР включает введение субъекту препарата ΙΕΝ-β в количестве, достаточном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения СШР, для достижения эффективного ослабления симптомов СШР.

В настоящее время для лечения СШР используют иммунодепрессанты. Например, установлено, что стероиды оказывают благоприятный эффект при лечения СШР. Положительная реакция обычно наблюдается через 4 недели. Обычно используемым стероидом является преднизон (дельтазон, оразон, метикортен). Преднизон является пероральным кортикостероидом, который подавляет воспалительную и иммунную реакции и, как считают, изменяет функцию медиатора на сайте подавления воспалительных и иммунных реакций при заболевании СШР. Хотя вводимые дозы могут быть различными, большинство взрослых субъектов начинают с дозы 0,5-1 мг/кг/сутки при пероральном введении (РО) (от около 30-40

- 19 009289 до 60-80 мг/сутки). Улучшение может наблюдаться в течение следующих 2 месяцев. Затем указанную дозу можно вводить через день с последующим уменьшением дозы до достижения наименьшей эффективной дозы, позволяющей поддерживать у субъекта состояние ремиссии.

Другим иммунодепрессантом, который был признан эффективным для лечения СГОР, является азатиоприн (имуран), аналог пурина, уменьшающий метаболизм пуринов и ингибирующий синтез ДНК и РНК. Считается, что азатиоприн повышает трудоспособность и ослабляет симптомы СГОР, подавляя иммуноопосредованное поражение нервов. Начальная доза составляет около 50 мг при пероральном введении в сутки (ежедневно в течение месяца), которую постепенно увеличивают до общей суточной дозы, равной 2-3 мг/кг/сутки при пероральном введении. Хотя терапевтические дозы азатиоприна трудно определить для каждого субъекта, некоторые данные позволяют предположить, что показателем терапевтической дозы является повышение эритроцитов (МСУ). Реакция на лечение может быть получена более чем через 6 месяцев.

Еще одним иммунодепрессантом, используемым в настоящее время для лечения СГОР, является микофенолят (Се11Сер1). который является пролекарством для такого иммунодепрессанта как микофенольная кислота. Считается, что микофенолят ингибирует синтез пурина в лимфоцитах, подавляя фермент инозинмонофосфатдегидрогеназу. Типичная доза для взрослого человека составляет от 250 мг до 3 г/сутки с возможностью изменения дозы в зависимости от клинического эффекта.

Циклоспорин (сандиммун, неорал), который является циклическим полипептидом, содержащим 11 аминокислот, можно также использовать для лечения СГОР. Циклоспорин ингибирует первую фазу активации Т-клеток и не влияет на гуморальный иммунитет. Считается, что, подавляя Т-клетки, циклоспорин может иннгибировать клеточно-опосредованное поражение нервов на сайте воспалительной/иммунной реакции. Циклоспорин начинают вводить в дозе 5 мг/кг/сутки при пероральном введении (два раза в день в течение месяца) и увеличивают дозу в зависимости от реакции. Необходимо контролировать минимальные и максимальные уровни для определения эффективности и во избежание токсичности; хотя специально для СГОР не был определен требуемый минимальный уровень, при иммунологических нарушениях нижний предел обычно равен 100-250.

Другим иммунодепрессантом является циклофосфамид (цитоксан), который представляет собой антинеопластический агент, не оказывающий специфического воздействия на определенную фазу клеточного цикла, и иммунодепрессант, действующий в качестве алкилирующего агента. Доза указанного препарата обычно составляет 1-2 мг/кг/сутки при пероральном введении.

Другим стандартным методом лечения больных СГОР является внутривенное введение иммуноглобулина (1У1д) . Раствор для внутривенного вливания обычно в основном содержит гетерологичный 1дС, а также небольшие количества 1дА и 1дМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения раствор для внутривенного введения является гетерогенным по отношению к эпитопам, узнаваемым антителами, например, такой раствор не является препаратом антитела, полученным в результате иммунизации животного определенным антигеном. Предполагаемый механизм действия такого препарата основан на том, что ΐνΐ§ содержит произвольные наборы антител, нейтрализующих иммунные факторы, вызывающие поражение периферического нерва в случае СГОР. В среднем улучшение наблюдается на 10-й день и продолжается до 42-го дня. Полупериод существования указанного препарата в сыворотке составляет примерно 21-29 дней. Нуждающиеся субъекты обычно должны проходить повторные курсы лечения через каждые несколько недель или месяцев для сохранения ремиссии или лечения рецидивов. Обычная доза составляет от 0,4 до 2 г/кг, которую делят на 5 суточных доз по 400 мг/кг. Лечение может быть начато с более высокой дозы, равной, например, 2 г/кг, которую постепенно снижают до 0,5-1 г/кг. Частота введения указанных доз может быть различной, причем большинство субъектов принимают указанные дозы каждые 2-8 недель. Например, ΐνΐθ можно вводить в дозе от 0,4 г/кг в течение нескольких дней до 1-2 г/кг каждый 1-4 недели.

Другим признанным методом лечения СГОР является плазмаферез (или замена плазмы). Считается, что указанный метод лечения позволяет удалить антитела и комплементы, ответственные за иммуноопосредованное поражение периферических нервов. Плазму удаляют из крови методом, подобным диализу.

Эффективность данного метода, по-видимому, аналогична эффективности ΐνΐ§ при лечении СГОР. Нуждающимся субъектам обычно заменяют плазму три раза в неделю на протяжении первых двух недель; затем частоту лечения определяют по клинической реакции.

Препарат ΙΕΝ-β можно вводить субъекту вместе с введением иммунодепрессанта, например стероида, введением ΐνΐ§ и/или выполнением плазмафереза. Препарат ΙΕΝ-β и вспомогательное средство можно вводить одновременно или последовательно. При последовательном введении вспомогательное средство можно вводить в тот же день или в другие дни. При объединении лечения препаратом ΐΕΝ-р с плазмаферезом препарат ΐΕΝ-β вводят после выполнения плазмафереза во избежание выведения препарата ΐΕΝ-β из организма в процессе выполнения плазмафереза. При объединении лечения препаратом ΐΕΝ-β с лечением ΐνΐ§ два разных лекарственных средства предпочтительно вводят раздельно с промежутком времени, равным по меньшей мере одному или двум часам.

- 20 009289

В другом варианте осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β вводят субъектам, не восприимчивым к другим вышеописанным методам лечения СГОР. В других ситуациях препарат ΙΡΝ-β вводят субъектам, у которых не обнаружена невосприимчивость к другим методам лечения СГОР. Например, препарат ΙΡΝ-β можно вводить субъектам, которые восприимчивы к одному или нескольким другим методам лечения. В других вариантах осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β вводят субъектам, которые ранее не подвергались никакому лечению СГОР. Если субъект раньше не подвергался лечению СГОР, методы лечения препаратом ΙΡΝ-β могут сначала включать выявление у субъекта СГОР или вероятность заболевания СГОР.

Лечение может представлять собой следующее: препарат ΙΡΝ-β вводят субъекту, проходящему основной курс лечения СГОР, например, препаратом ΙνΙΟ, при этом комбинированное лечение продолжают в течение определенного периода времени, по истечении которого основное лечение СГОР прекращают. Основное лечение СГОР может быть прекращено постепенно, например, путем уменьшения дозы и/или частоты проведения основного лечения СГОР. В иллюстративном варианте осуществления изобретения субъекту вводят ΙνίΟ один раз каждые две недели или один раз каждые четыре недели. Затем субъект вместе с лечением ΙνΙ§ проходит курс лечения ΙΡΝ, который включает введение препарата ΙΡΝ-β один раз в неделю или в две недели. Комбинированное лечение может быть продолжено в течение примерно 10-20 недель, например в течение примерно 16 недель. Во время комбинированного лечения препараты ΙνΙ§ и ΙΡΝ-β желательно вводить с промежутком времени, равным по меньшей мере 1-3 часам, например, примерно 2 ч. Примерно через 16 недель основное лечение СГОР прекращают или сокращают. Например, субъекту затем вводят меньшие дозы ΙνΙ§ или прежние дозы, но гораздо реже. Если у субъектов не наблюдается улучшения после прекращения или сокращения основного лечения СГОР, можно возобновить основное лечение СГОР и продолжить лечение препаратом ΙΡΝ-β.

Препараты ΙΡΝ-β можно вводить любым способом. Например, препараты ΙΡΝ-β можно применять местно в виде инъекции или наносить непосредственно на пораженную ткань либо системно, например, парентерально или перорально. Местное применение включает, например, введение непосредственно в пораженную мышцу. Парентеральное введение включает аэрозоли, подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутрисуставные, внутрибрюшинные, внутригрудинные, подоболочечные, внутрипеченочные, внутриочаговые и внутричерепные инъекции или вливания. Можно периодически инъецировать ударные дозы препарата ΙΡΝ-β или производить более продолжительное внутривенное или внутрибрюшинное введение из наружного резервуара (например, баллона для внутривенного вливания) или внутреннего резервуара (например, биоразрушаемого имплантата или имплантированного насоса).

Препараты ΙΡΝ-β предпочтительно вводят в виде стерильной фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Термин «носитель» в используемом здесь значении означает приемлемые адъюванты и наполнители.

Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях по данному изобретению, включают, не ограничиваясь ими, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполного глицерида насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат проламина, динатрийгидрофосфат, калийгидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на целлюлозной основе, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль, ланолин, декстроза, глицерин, этанол и тому подобные или их комбинации. Препараты ΙΡΝ-β можно получить в виде композиции, содержащей один или несколько других белков, используемых, например, для стабилизации препарата ΙΡΝ-β. Например, препараты ΙΡΝ-β могут быть смешаны с альбумином.

При парентеральном введении препарата ΙΡΝ-β часть композиции предпочтительно составляет водный раствор. Указанный раствор должен быть физиологически приемлемым, чтобы не оказывать вредного влияния на электролитный и/или объемный баланс при доставке требуемого препарата ΙΡΝ-β в организм нуждающегося субъекта. Так, водная среда для препарата ΙΡΝ-β может содержать нормальный физиологический раствор (например, 0,9% ΝαΡΙ, 0,15 М, рН 7-7,4). Приемлемые растворы для парентерального введения можно получить любыми методами, хорошо известными в фармацевтической области, которые описаны, например, в публикации Кетшд1оп'к Рйаттасеи11са1 8с1епсек (Оеппаго, А., еб.), Маск РиЬ., 1990.

Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного препарата для инъекций, например стерильной инъекционной водной или масляной суспензии. Указанная суспензия может быть получена методами, известными в данной области, с использованием приемлемых диспергирующих или смачиващих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. Приемлемыми наполнителями и растворителями, которые могут быть использованы в данном изобретении, являются вода, рас

- 21 009289 твор Рингена и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для указанной цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- и диглицериды. Для получения препаратов для инъекций можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, а также природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, в частности, их полиоксиэтилированные формы. Указанные масляные растворы или суспензии могут также содержить длинноцепной спиртовой разбавитель или диспергатор.

Фармацевтические композиции, содержащие препараты ΙΡΝ-β, можно также вводить перорально. Например, их можно вводить в виде любых дозированных лекарственных форм, приемлемых для перорального введения, которые включают, не ограничиваясь ими, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального введения используемые носители обычно включают лактозу и сухой кукурузный крахмал. Кроме того, в состав таблеток обычно добавляют смазыващие агенты, такие как стеарат магния. Приемлемые разбавители, используемые для перорального введения в виде капсул, обычно включат лактозу и сухой кукурузный крахмал. Если необходимо получить водные суспензии для перорального введения, активный ингредиент объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании могут быть также добавлены определенные подсластители, ароматизаторы или красители. Кроме того, можно также использовать чрескожные пластыри для местного применения.

Фармацевтические композиции по данному изобретению можно также вводить в виде аэрозолей или ингаляции в нос при помощи распылителя, ингалятора сухого порошка или дозирующего ингалятора. Такие композиции получают методами, хорошо известными в фармацевтической области, в виде растворов в физиологическом растворе, с использованием бензилового спирта или других приемлемых консервантов, стимуляторов абсорбции, усиливающих биологическую доступность, фторуглеродов и/или других известных солюбилизирующих или диспергирующих агентов.

Препараты ΙΡΝ-β можно вводить в виде липосомных систем доставки, таких как мелкие однослойные пузырьки, большие однослойные или многослойные пузырьки. Липосомы могут быть образованы из разных фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах осуществления изобретения пленку липидных компонентов гидратируют водным раствором лекарственного средства для образования липидного слоя, инкапсулирующего лекарственное средство, как это описано в патенте США № 5262564. Липосомы могут содержать поверхностные молекулы, которые направляют их в определенные клетки или ткани. Такие модифицированные липосомы можно получить методами, известными в данной области.

ΙΡΝ-β или их варианты могут быть также связаны с растворимыми полимерами, используемыми в качестве носителей направленно доставляемого лекарственного средства. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропилметакриламидофенол, полигидроксиэтиласпанамидофенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. ΙΡΝ-β или их варианты могут быть также связаны с белками, такими как, например, рецепторные белки и альбумин. Кроме того, ΙΡΝ-β и их варианты могут быть связаны с биоразрушаемыми полимерами, используемыми для регулируемого высвобождения лекарственного средства, такими как полимер молочной кислоты, полиэпсилон-капролактон, полигидроксимасляная кислота, полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианоакрилаты и перекрестно сшитые или амфипатические блоксополимеры гидрогелей.

Препарат ΙΡΝ-β может быть также получен в виде жидкой композиции, содержащей стабилизирующий агент. Стабилизирующий агент может присутствовать в количестве от около 0,3 до 5 мас.% препарата ΙΡΝ-β. В качестве стабилизирующий агента можно использовать аминокислоту, такую как кислая аминокислота (например, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота), аргинин или глицин. Если стабилизирующим агентом является аргинин-НС1, его концентрация предпочтительно находится в пределах от 0,5% (мас./об.) до 5% и наиболее предпочтительно равна 3,13% (что эквивалентно 150 мМ аргинин-НС1). Если стабилизирующим агентом является глицин, его концентрация предпочтительно находится в пределах от 0,5% (мас./об.) до 2,0% и наиболее предпочтительно равна 0,52% (что эквивалентно 66,7 мМ - 266,4 мМ и наиболее предпочтительно 70 мМ). Если стабилизирующим агентом является глутаминовая кислота, ее концентрация предпочтительно находится в пределах от 100 мМ до 200 мМ и наиболее предпочтительно равна 170 мМ (что эквивалентно 1,47%-2,94% (мас./об.) и наиболее предпочтительно равно 2,5%). В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрации препаратов ΙΡΝ-β в жидких составах находятся в пределах от около 30 мкг/мл до около 250 мкг/мл, в частности равно 4878 мкг/мл например около 60 мкг/мл. Указанное количество зависит, например, от удельной активности конкретного препарата ΙΡΝ-β. Дозировка обычно находится в пределах от около 1 миллиона международных единиц (ММЕ) до около 50 ММЕ, например около 3, 6, 9 или 12 ММЕ в одной дозе.

В одном варианте осуществления изобретения аминокислотным стабилизирующим агентом является аргинин, который вводят в кислой форме (аргинин-НС1) в растворах с рН около 5,0. В данном случае предпочтительными являются полиионные наполнители. Жидкая композиция может находиться в сосу

- 22 009289 де, таком как шприц, в котором поверхность контактирования с жикостью покрыта материалом, инертным к ΙΡΝ-β, например, силиконом или политетрафторэтиленом. Предпочтительные композиции имеют значение рН от 4,0 до 7,2. В некоторых вариантах осуществления изобретения раствор, содержащий стабилизирующий агент, не лиофилизуют и/или не подвергают воздействию кислородсодержащего газа во время получения и хранения.

Буферы с органическими кислотами и фосфатные буферы, предназначенные для использования в настоящем изобретении для сохранения показателя рН в пределах от около 4,0 до около 7,2, в частности, от около 4,5 до около 5,5, например 5,0, могут быть приемлемыми буферами, получаемыми из органических кислот и их солей, такими как цитратные буферы (например, смесь мононатрийцитрата и динатрийцитрата, смесь лимонной кислоты и тринатрийцитрата, смеси лимонной кислоты и мононатрийцитрата), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты и мононатрийсукцината, смесь янтарной кислоты и гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты и динатрийсукцината), тартратные буферы, фумаратные буферы, глюконатные буферы, оксалатные буферы, лактатные буферы, фосфатные буферы и ацетатные буферы, описанные в заявке \¥О 98/28007.

Типичные составы, которые могут быть получены способами, описанными в заявке XVО 98/38007, содержат:

(ί) 20 мМ ацетатного буфера с рН 5,0, который предпочтительно не был предварительно лиофилизован и содержит ΙΡΝ-β и по меньшей мере один ингредиент, выбиранный из (а) 150 мМ аргинин-НС1; (Ь) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина; (с) 150 мМ аргинин-НС1 и 15 мг/мл сывороточного альбумина человека; (б) 150 мМ аргинин-НС1 и 0,1% плуроник Ρ-68; (е) 140 мМ хлорида натрия; (ί) 140 мМ хлорида натрия и 15 мг/мл сывороточного альбумина человека и (д) 140 мМ хлорида натрия и 0,1% плуроник Ρ-68;

(ίί) жидкость с рН 5,0, которая включает ΙΡΝ-β или его вариант, 170 мМ Ь-глутаминовой кислоты и 150 мМ гидроксида натрия, причем указанная жидкость предпочтительно не была предварительно лиофилизована; и (ΐϊϊ) 20 мМ фосфатного буфера с рН 7,2, который предпочтительно не был предварительно лиофилизован и содержит ΙΡΝ-β и по меньшей мере один ингредиент, выбранный из: (а) 140 мМ аргинин-НС1 и (Ь) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина.

Предпочтительные композиции содержат также полисорбат, например 0,005% (мас./об.) полисорбата 20.

ΙΡΝ-β или его вариант можно также вводить вместе с растворимым рецептором ΙΡΝ типа Ι или его частью, такой как ΙΡΝ-связывающая цепь рецептора, способом, описанным в патенте США № 6372207. Как указано в данном патенте, введение ΙΡΝ типа Ι в виде комплекса с ΙΡΝ-связывающей цепью рецептора улучшает устойчивость ΙΡΝ и усиливает действие ΙΡΝ. Указанный комплекс может быть комплексом, соединенным нековалентной или ковалентной связью.

Препараты ΙΡΝ-β можно получить в виде сухого порошка, который может быть солюбилизован или суспендирован, а также не солюбилизован или суспендирован до введения нуждающемуся субъекту. В частности, установлено, что препараты ΙΡΝ-β, конъюгированные с полимером, например ПЭГ, являются особенно устойчивыми в сухой форме (см., например, заявки VΟ 00/23114 и РСТ/И8/95/06008).

Полученные композиции могут содержать терапевтически эффективные количества препарата ΙΡΝβ, то есть они могут содержать препарат ΙΡΝ-β в таких количествах, которые обеспечивают соответствующие концентрации препарата ΙΡΝ-β в мышечных или других тканях в течение периода времени, достаточного для предотвращения, подавления, замедления или ослабления постоянной или прогрессирующей утраты мышечной функции или оказания другого терапевтического действия. Специалистам в данной области должно быть понятно, что концентрация препаратов ΙΡΝ-β в лекарственной композиции может изменяться в зависимости от ряда факторов, включающих биологическую эффективность выбранного препарата ΙΡΝ-β, химические свойства (например, гидрофобность) используемого препарата ΙΡΝ-β, применяемые наполнители, способ введения и предполагаемый способ лечения, например введение препарата ΙΡΝ-β непосредственно в ткань или системное введение. Предпочтительная доза может также зависеть от таких переменных факторов, как состояние тканей субъекта, степень утраты мышечной функции и общее состояние здоровья конкретного субъекта. Доза может также зависеть от возраста, массы тела, пола, общего состояния здоровья, обмена веществ субъекта, а также от восприимчивости субъекта к побочным эффектам и введению препарата ΙΡΝ-β совместно с другими лекарственными средствами. Лечащий врач или ветеринар может легко определить и назначить эффективное количество препарата ΙΡΝ-β, необходимое для предотвращения, противодействия или замедления развития заболевания.

Назначенные дозы можно вводить постоянно или ежедневно, но в настоящее время указанные дозы предпочтительно вводят один, два или три раза в неделю на протяжении всего времени сохранения удовлетворительной реакции (измеряемой, например, на основании стабилизации и/или ослабления симптомов заболевания при помощи соответствующих медицинских маркеров и/или индексов качества жизни). Дозы препарата можно вводить еще реже, например один раз в месяц. Чтобы облегчить переносимость частых вливаний, можно посоветовать имплантировать полупостоянный стент (например, внутривен

- 23 009289 ный, внутрибрюшинный или внутрикапсульный).

Любые вышеуказанные фармацевтические композиции могут содержать 0,1-99%, 1-70% или предпочтительно, 1-50% препарата ΙΡΝ-β в качестве активного ингредиента.

При любом способе введения можно использовать разделенные или однократные дозы. Например, препараты ΙΡΝ-β можно вводить один раз в день или в неделю в виде однократной дозы, или общую дозу можно разделить на две, три или четыре дозы.

Препараты ΙΡΝ-β можно вводить в количестве от около 0,001 до около 100 мг/кг массы тела в расчете на одну дозу, например от около 0,1 до около 50 мг/кг массы тела, от около 0,1 мг/кг массы тела до около 20 мг/кг массы тела или от около 1 мг/кг массы тела до около 3 мг/кг массы тела. Указанные дозы можно вводить с интервалами в 1-14 дней, например, каждый день, через день, каждый третий день, каждый пятый день, один раз в неделю или один раз в две недели. В зависимости от удельной активности препарата ΙΡΝ-β его можно также вводить в дозе от около 10 до около 100 мкг/дозу, в частности от около 20 до около 50 мкг/дозу, например около 30 мкг/дозу.

При вычислении в международных единицах препарат ΙΡΝ-β можно вводить в дозе от около 1 до 30 ММЕ/дозу, в частности, от 3 до 20 ММЕ/дозу, например от 3 до 12 ММЕ. Предпочтительные дозы содержат около 3 ММЕ, 6 ММЕ и 12 ММЕ в расчете на одну дозу. Такие дозы предпочтительно вводят примерно один или два раза в неделю. Вводимую дозу можно оптимизировать, например, путем введения препарата ΙΡΝ-β с последующим определением концентрации препарата ΙΡΝ-β в кровотоке или локальной концентрации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β вводят в виде подкожной инъекции, обеспечивающей доставку 0,01-100 мкг/кг или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг ΙΡΝ-β, например пегилированного ΙΡΝ-β, в течение одной недели, причем две инъекции в дозе 0,005-50 мкг/кг или более предпочтительно 0,005-5 мкг/кг можно вводить в 0-й период времени и через 72 ч. Кроме того, одним способом парентерального введения является имплантация системы с медленным или отсроченным высвобождением лекарственного средства, обеспечивающей поддержание постоянного уровня дозы, которая описана в патенте США № 3710795.

Дозы для перорального введения по настоящему изобретению, предпочтительно для препаратов пегилированного ΙΡΝ-β, находятся в пределах около 0,01-100 мкг/кг/сутки при пероральном введении или, более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг/сутки при пероральном введении. Композиции предпочтительно получают в форме рифленых таблеток, содержащих 0,5-5000 мкг или более предпочтительно 0,5-500 мкг препарата ΙΡΝ-β. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъекту, страдающему невропатией, например СГОР, препарат ΙΡΝ-β вводят в виде внутримышечных инъекций. Препарат ΙΡΝ-β можно вводить один раз в неделю. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β вводят субъекту один раз в неделю в дозе около 6 ММЕ. В других вариантах осуществления изобретения нуждающемуся субъекту один раз в неделю вводят около 6 ММЕ препарата ΙΡΝ-β, причем введение необязательно является внутримышечным.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ΙΡΝ-β вводят в соответствии с одной схемой в течение определенного периода времени и затем в соответствии с другой схемой. Например, субъект может принимать препарат ΙΡΝ-β один раз в неделю в течение двух месяцев и затем два раза в неделю на протяжении последующих месяцев. Препарат можно сначала вводить подкожно и затем внутримышечно. В соответствии с другими схемами лечения дозу, способ введения или препарат ΙΡΝ-β изменяют при каждом последующем введении.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения ΙΡΝ-β является препаратом АVΟNЕX®. АVΟNЕX® представлен на рынке в виде лиофилизованного порошка, имеющего следующий состав:

Состав в расчете на 1 мл дозу:

мкг интерферона-Ь-1а (6 миллионов международных единиц (ММЕ));

мМ фосфата натрия;

100 мМ хлорида натрия;

мг сывороточного альбумина человека;

рН 7,2.

Удельная активность интерферона АVΟNЕX® составляет 2х10⁸ единиц/мг, то есть 200 ММЕ антивирусной активности на миллиграмм белка ГР№Ь-1а. Нуждающийся субъект восстанавливает порошок стерильной водой до выполнения внутримышечной инъекции в 1 мл дозе один раз в неделю. АVΟNЕX® может быть также получен в виде жидкого препарата, имеющего следующий состав:

Состав в расчете на 0,5 мл дозу:

мкг ШЫ-Ь-1а (6 миллионов международных единиц (ММЕ));

мМ ацетата (ацетат натрия и уксусная кислота);

150 мМ аргинин-НС1

0,005% (мас./об.) полисорбата 20;

- 24 009289 вода для инъекций;

рН 4,8.

Препарат может быть упакован в предварительно наполненный шприц. Нуждающийся субъект может использовать шприц вручную или при помощи автоинжектора. Препарат вводят в количестве 6 ММЕ (то есть 30 мкг) внутримышечно один раз в неделю.

В другом варианте осуществления изобретения ΙΡΝ-β является препаратом ΚΕΒΙΡ®, который получают в виде лиофилизованного порошка или жидкого препарата. Лиофилизованный порошок имеет следующий состав:

Состав в расчете на 2,0 мл дозу:

ΙΡΝ-Ε-1;·ι в количестве 3 ММЕ;

маннит;

сывороточный альбумин человека (Н8А);

ацетат натрия;

рН 5,5.

Удельная активность интерферона ΚΕΒΙΡ® составляет 2,7х10⁸ единиц/мг, то есть 270 МЕ антивирусной активности на миллиграмм белка ΙΡΝ-Ε-1;·ι. Нуждающийся субъект восстанавливает порошок раствором хлорида натрия (0,9% №101) до выполнения подкожных инъекций три раза в неделю. Жидкий препарат КЕЫР® имеет следующий состав:

Состав в расчете на 0,5 мл дозу:

или 12 ММЕ ΙΡΝ-Ε-1;·ι;

или 2 мг сывороточного альбумина человека (Н8А);

27,3 мг маннита;

0,4 мг ацетата натрия;

вода для инъекций;

Жидкий препарат, упакованный в предварительно наполненный шприц, вводят подкожно при помощи автоинжектора (КеЬуес)) или без него (6 или 12 ММЕ, что соответствует 66 мкг/неделю или 132 мкг/неделю) 3 раза в неделю.

В другом варианте осуществления изобретения ΙΡΝ-β является препаратом ΒΕΤΛ8ΕΚΟΝ® (компании Вег1ех), в котором ΙΡΝ-β, имеющий мутацию с заменой сук-17 на кет, продуцируют в Е. сой. Указанный негликозилированный ΙΡΝ-β является менее активным, чем ΑνΟΝΕΧ® или ΚΕΒΙΡ®. которые продуцируют в клетках СНО. Указанные препараты продают в 250 мкг (8 ММЕ) дозах в виде лиофилизованных и жидких препаратов, предназначенных для подкожных инъекций, вводимых через день. ΒΕΤΑΡΕΚΟΝ® является еще одним коммерчески доступным препаратом ΙΡΝ-β, который можно вводить подкожно в соответствии с инструкциями изготовителя.

Помимо препарата ΙΡΝ-бета и необязательно другого лекарственного средства нуждающимся субъектам могут быть также назначены лекарственные средства от невропатических болей, например антиэпилептические средства. Двумя наиболее часто используемыми лекарственными средствами являются габапентин (нейронтин) и карбамазепин (тегретол). Альтернативно, для лечения невропатических болей можно также использовать трициклические антидепрессанты, например амитриптилин (элавил).

Течение болезни и реакцию на лекарственные средства можно контролировать при помощи клинических исследований и лабораторных анализов. Эффективность лечения по данному изобретению определяют по ослаблению ранее описанных признаков и симптомов заболевания и по устранению или значительному уменьшению естественных побочных эффектов интерферона (то есть симптомов, напоминающих грипп, таких как лихорадка, головная боль, озноб, миалгия, усталость и т.д., и симптомов, относящихся к центральной нервной системе, таких как депрессия, парестезия, нарушение концентрации внимания и т.д.).

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые не ограничивают объем изобретения. Содержание всех приведенных ссылок (включая научные публикации, выданные патенты, опубликованные заявки на патент) включено в данное описание изобретения в качестве ссылки.

При осуществлении настоящего изобретения можно использовать, за исключением особо оговоренных случаев, обычные методы, применяемые в биологии клетки, культивировании клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, генной инженерии и иммунологии, которые известны в данной области. Такие методы всесторонне описаны в научной литературе. См., например, нижеследующие публикации: Мо1еси1аг С1ошид А ЬаЬота)огу Мапиа1, 2'¹ Еб., еб. Ьу 8атЬгоок, Ρι-йксй апб Машайк (Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога)огу Ргекк: 1989); ΌΝΑ С1ошпд, ^1итек Ι апб ΙΙ (Ό.Ν. С1оуег еб., 1985); Ойдопис1еойбе 8уп1йек1к (Мб. Сай еб., 1984); Мц1йк е) а1. патент США № 4683195; МШею Ас1б Н|Ьпб|/аОоп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщщпк ебк. 1984); Тгапкспрйоп апб Тгапк1айоп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщщпк ебк. 1984); СиЙиге Οί Ашта1 Се11к (Κ.Ι. Ρ^екйпеу, А1ап Κ. Ыкк, Шс., 1987); йптоЬШ/еб Се11к Апб Епхутек ДКЬ Ргекк, 1986); Β. РегЬа1, А Ргасйса1 Сшбе То Мо1еси1аг С1ошпд (1984); )йе 1геайке, Ме1йобк Ш Еп/уто1оду (Асабетю Ргекк, Шс., Ν.Υ.); Сепе ТгапкЕег Vесΐо^к Ρо^ Маттайап Се11к (ТН. Мй1ег апб М.Р. Са1ок ебк., 1987,

- 25 009289

Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬога!огу); Мебюбк Ш Еи7уто1оду, Уо1к. 154 аиб 155 (\Уи е! а1. ебк.), [ттипосйетоб МеЫобк Ш Се11 Аиб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег аиб ^а1кег, ебк., Асабепис Ргекк, Ьоибои, 1987); НаибЬоок ОГ Ехрептеи!а1 Iттиηо1оду, Уо1итек НУ (ГОМ. \Уей аиб С.С. В1асктее11, ебк., 1986); МатрШайид (Не Мойке ЕтЬгуо, (Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог, Ν.Υ., 1986).

Примеры

Пример 1. Лечение больных СГОР препаратом ΙΡΝ-β-^.

Больных СГОР, проходящих курс лечения Ιν^, переводят на лечение препаратом ΙΡΝ-β следующим образом.

Субъектов с установленным диагнозом СГОР, проходящих курс лечения, включающий постоянное введение один раз в две недели или один раз в четыре недели, переводят на одну из нижеследующих схем введения ΓΕΝ-β-^ при помощи внутримышечных инъекций: 30 мкг (6 ММЕ) ΑУОNЕX® один раз в неделю; 30 мкг (6 ММЕ) ΑУОNЕX® два раза в неделю; 60 мкг (12 ММЕ) АУО№Х® один раз в неделю или 60 мкг (12 ММЕ) АУО№Х® два раза в неделю. При введении и ΙΡΝ-β-^ в один и тот же день оба препарата вводят с промежутком времени, равным по меньшей мере двум часам. Субъекты проходят данный курс комбинированного лечения в течение 16 недель, и на протяжении указанного периода времени у них оценивают развитие болезни примерно через каждые четыре недели. В конце 16-й недели больным прекращают вводить ΙνΊ^ и продолжают лечение препаратом ΙΗΝ-β-^ в соответствии с ранее применявшейся схемой лечения.

У испытуемых субъектов продолжают контролировать развитие болезни. Если субъекты чувствовали себя лучше при комбинированном лечении, возобновляют курс лечения ШЦ. Затем можно постепенно уменьшать введение Ιν^, сокращая количество или частоту введения ШЦ.

Эквиваленты

Специалисты в данной области должны признать или установить в результате обычного экспериментирования наличие многих вариантов, эквивалентных конкретным вариантам осуществления изобретения, рассмотренным в данном описании изобретения. Все такие эквиваленты входят в приведенную ниже формулу изобретения.

Claims (43)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение препарата ΙΡΝ-β для получения лекарственного средства для лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии, при этом лекарственное средство вводится субъекту, который ранее не признавался как устойчивый к лечению хронической демиелинизирующей двигательной невропатии другими способами.
2. 2. Применение по п.1, в котором лекарственное средство вводят субъекту, которого лечили другими способами лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии, и лечение дополнительно включает прекращение другого лечения.
3. 3. Применение по п.1, где препарат ΙΡΝ-β вводят в комбинированном лечении, включающим второе лечение, выбранное из группы, состоящей из введения кУ^д, введения иммунодепрессантов, противовоспалительных лекарственных средств и плазмафереза.
4. 4. Применение по п.3, где вторым лечением является введение ШЦ.
5. 5. Применение по п.3, где вторым лечением является введение иммунодепрессанта.
6. 6. Применение по п.5, где иммунодепрессант выбран из группы, состоящей из стероида, азотиоприна, циклоспорина, циклофосфамида и микофенолята.
7. 7. Применение по п.3, где вторым лечением является введение противовоспалительного лекарственного средства.
8. 8. Применение по п.3, где вторым лечением является плазмаферез.
9. 9. Применение препарата ΙΡΝ-β для получения лекарственного средства для лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии, где прапарат ΙΡΝ-β вводят в комбинированной терапии, включающей введение иммунодепрессанта, противовоспалительного агента или плазмаферез.
10. 10. Применение по п.9, где препарат ΙΡΝ-β вводят в комбинации с введением иммунодепрессанта или с плазмаферезом.
11. 11. Применение по п.9, где комбинированным лечением является введение препарата ΙΡΝ-β и иммунодепрессанта.
12. 12. Применение по п.11, где иммунодепрессант выбран из группы, состоящей из стероида, азотиоприна, циклоспорина, циклофосфамида и микофенолята.
13. 13. Применение по п.9, где комбинированная терапия представляет собой введение препарата ΙΡΝ-β и противовоспалительного средства.
14. 14. Применение по п.9, где комбинированная терапия представляет собой плазмаферез и введение препарата ΙΡΝ-β.
15. 15. Применение по любому из пп.9-14, где лекарственное средство вводят субъекту у которого ранее не была обнаружена устойчивость к другим видам лечения хронической демиелинизирующей невро

    - 26 009289 патии.
16. 16. Применение по любому из пп.1-15, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят парентеральным способом, отличным от подкожного введения.
17. 17. Применение по п.16, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят внутримышечно.
18. 18. Применение по п.16, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят внутривенно.
19. 19. Применение по любому из пп.1-18, где хроническая демиелинизирующая двигательная невропатия является хронической демиелинизирующей невропатией.
20. 20. Применение по любому из пп.1-19, в котором препарат ΙΕΝ-β содержит зрелый ΙΕΝ-β.
21. 21. Применение по любому из пп.1-20, в котором в препарате ΙΕΝ-β отсутствует первый остаток метионина.
22. 22. Применение по любому из пп.1-21, в котором ΙΕΝ-β является человеческим ΙΕΝ-β.
23. 23. Применение по п.22, в котором ΙΕΝ-β по меньшей мере примерно на 95% идентичен непроцессированному зрелому человеческому ΙΕΝ-β, имеющему 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4.
24. 24. Применение по п.23, в котором ΙΕΝ-β содержит 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4.
25. 25. Применение по любому из пп.1-24, в котором ΙΕΝ-β гликозилирован.
26. 26. Применение по любому из пп.1-24, в котором ΙΕΝ-β не гликозилирован.
27. 27. Применение по п.22 в котором ΙΕΝ-β является ΙΕΝ-β-Φ.
28. 28. Применение по п.22, в котором ΙΕΝ-β является ΙΕΝ-β-1ό.
29. 29. Применение по любому из пп.1-28, в котором препарат ΙΕΝ-β содержит ΙΕΝ-β, слитый с константным доменом молекулы иммуноглобулина.
30. 30. Применение по п.29, в котором молекула иммуноглобулина является молекулой человеческого иммуноглобулина.
31. 31. Применение по п.30, в котором молекула иммуноглобулина является тяжелой цепью Ι§61.
32. 32. Применение по п.31, в котором ΙΕΝ-β содержит 8ЕО ΙΌ ΝΟ:14.
33. 33. Применение по любому из пп.1-32, в котором препарат ΙΕΝ-β содержит пегилированный ΙΕΝ-β.
34. 34. Применение по любому из пп.1-33, в котором препарат ΙΕΝ-β содержит стабилизирующий агент.
35. 35. Применение по п.34, в котором стабилизирующий агент является кислой аминокислотой.
36. 36. Применение по п.35, в котором стабилизирующий агент является аргинином.
37. 37. Применение по любому из пп.1-36, в котором препарат ΙΕΝ-β имеет значение рН в пределах от около 4,0 до 7,2.
38. 38. Применение по любому из пп.1-37, которое включает введение млекопитающему нескольких доз препарата ΙΕΝ-β.
39. 39. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят один раз в неделю в дозе около 6 ММЕ.
40. 40. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят два раза в неделю в дозе около 6 ММЕ.
41. 41. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят один раз в неделю в дозе около 12 ММЕ.
42. 42. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат ΙΕΝ-β вводят два раза в неделю в дозе около 12 ММЕ.
43. 43. Применение по любому из пп.1-42, в котором препарат вводят человеку.