KR20050059195A - 인터페론-β를 이용한 만성 염증성 탈수초성다발성신경병증의 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만성 탈수초성 신경병증, 예를 들어 CIDP가 발병되었거나 발병 위험이 있는 포유동물 피험체의 치료 방법 및 치료에 사용하기 위한 의약을 제공한다. 이 방법은 IFN-β 치료제를 투여하는 것을 포함한다.

Description

인터페론-β를 이용한 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증의 치료{THERAPIES FOR CHRONIC INFLAMMATORY DEMYELINATING POLYNEUROPATHY USING INTERFERON-β}

만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(CIDP)은 다리와 팔의 느린 진행성 약화 및 감각 장애를 특징으로 하는 신경 질병이다. 이 질병은 말초 신경의 수초에의 손상에 의해 야기된다. 신경 뿌리의 팽윤 또한 이 질병의 특징이다. 이 질병은 어느 연령 및 성별에서도 일어날 수 있음에도 불구하고, CIDP는 젊은 성인에서 그리고 여자보다 남자에서 더 일반적이다. 증상은 저림 또는 무감각(발가락 및 손가락에서 시작함), 팔과 다리의 약함, 근욕통, 깊은 힘줄 반사의 소실(무반사), 피로 및 비정상적인 감각을 포함한다.

CIDP는 일부 다른 질병과 연합된다. 예를 들어, 염증성 탈수초성 신경병증, 예를 들어 CIDP는 말초 신경 질병을 갖는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)-양성혈청반응 환자의 3분의 1에서 진단된다. CIDP는 또한 루푸스, 파라단백혈증, 림프종 또는 당뇨병을 앓고 있는 환자에서 발생하는 것으로 확인되었다.

치료되지 않은 CIDP는 물리적 및 작업적 요법, 보조기학 장치 및 장기적 치료를 요하는 축적성 장애를 특징으로 한다. 그 분야에 지식을 가진 의사가 계속적으로 보호하는 것이 치료 조절에 필요하다.

CIDP를 위한 치료의 현 방법은 단독으로 또는 면역억제 약물과 함께 처방될 수 있는 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드의 투여를 포함한다. 면역억제 약물은 또한 스테로이드 없이 투여될 수도 있다. 혈장분리반출술(혈장 교환) 및 정맥 면역글로불린(IVIg) 요법은 또한 상대적으로 효과적이며 현재 이용되고 있다. IVIg는 심지어 1차(first-line) 치료법으로 이용될 수도 있다. 또한, 물리치료는 근육 강도, 기능 및 이동성을 개선시키고, 구축의 발생을 최소화시킬 수 있다.

CIDP의 과정은 개인들 사이에서 매우 다르다. 일부는 CIDP의 발작 및 후속되는 자발적 회복을 가질 수 있는 한편, 다른 사람들은 재발 사이에 부분적 회복을 갖는 다수의 발작을 가질 수도 있다. 이 질병은 후천성 신경병증의 치료가능한 원인이며 신경 세포의 손실을 막기 위한 초기 치료의 개시가 추천된다. 하지만, 일부 개인은 일부 잔류 무감각 또는 쇠약함이 남을 수 있다.

따라서, CIDP의 치료의 현재 방법들은 해로운(예, 스테로이드 또는 면역억제제); 비싼(예, IVIg 및 혈장분리반출술); 또는 불편한(예, 혈장분리반출술) 방법들로 구성된다. 따라서, 만성 탈수초성 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하기 위한, 현재 방법보다 덜 독성이고, 덜 비싸며 더 편리한 효과적인 치료 방법을 갖는 것이 매우 바람직할 것이다.

발명의 개요

한 구체예에서, 본 발명은 포유동물에서 만성 탈수초성 운동 신경병증을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 IFN-β 치료제의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. IFN-β 치료제는 비피하 비경구 경로, 예를 들어 근욕내 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 신경병증은 만성 염증성 탈수초성 신경병증(CIDP)이다.

IFN-β 치료제는 사람 IFN-β를 포함할 수 있다. 예를 들어, IFN-β 치료제는 서열 번호 4를 갖는 전길이 성숙 사람 IFN-β와 적어도 약 95% 동일한 단백질을 포함할 수 있다. IFN-β 치료제는 또한 서열 번호 4를 갖는 전길이 성숙 사람 IFN-β를 포함할 수 있다. IFN-β 치료제는 또한 이종성 폴리펩티드, 예를 들어 사람 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 서열 번호 4를 갖는 전길이 성숙 사람 IFN-β를 포함할 수 있다. 면역글로불린 분자는 IgG1의 중쇄일 수 있다. IFN-β 치료제는 서열 번호 14를 포함할 수 있다. IFN-β 치료제는 또한 페길화된 IFN-β를 포함할 수 있다.

IFN-β 치료제 또는 이를 포함하는 조성물은 단백질 또는 아미노산과 같은 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 아르기닌일 수 있다. IFN-β 치료제, 또는 이를 포함하는 조성물은 약 4.0∼7.2 사이의 pH를 가질 수 있다.

IFN-β 치료제는 주 1회, 2회 또는 3회 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, IFN-β 치료제는 약 6백만 또는 천이백만 국제 단위(MIU)로 투여된다. IFN-β 치료제는 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 피험체는 포유동물이며, 바람직하게는 사람이다.

본 발명은 또한 신경병증을 가진 피험체에게 약학적 유효량의 IFN-β 치료제를 투여하고, 추가로 피험체에게 면역억제제를 투여하거나 또는 피험체에 혈장분리반출술을 실시하는 것을 포함하는, 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 스테로이드, 아조티오프린, 사이클로스포린, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트로 구성되는 군에서 선택되는 면역억제제를 피험체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.

신경병증을 가진 피험체에게 약학적 유효량의 IFN-β 치료제와 함께 신경병증을 위한 제2의 치료제를 투여하는 것을 포함하며, 이때 IFN-β 치료제의 투여가 비피하 비경구 경로를 통해 이루어지는, 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하는 방법 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. IFN-β 치료제의 투여는 근육내 투여를 통해 이루어질 수 있다. IFN-β 치료제는 매주 투여될 수 있으며, 예를 들어 약 6 MIU의 IFN-β 치료제가 매주 투여될 수 있다. 신경병증이 CIDP일 경우, 제2 치료는 스테로이드의 투여, IVIg의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 신경병증을 갖는 피험체에게 신경병증에 대한 제2의 치료와 함께 약학적 유효량의 IFN-β 치료제를 매주 투여하는 것을 포함하는, 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하는 방법을 제공한다. 만일 신경병증이 CIDP이면, 제2의 CIDP 치료는 스테로이드의 투여, IVIg의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여, IVIG의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받고 있는 피험체에서 CIDP를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 제1의 CIDP 치료에 더하여, 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 크게 감소시키는 데 유효한 양의 IFN-β 치료제 투여량을 피험체에 투여하는 것을 포함하며, 이때 IFN-β 치료제의 투여는 비피하 비경구 경로를 통해 이루어져 CIDP의 증상을 효과적으로 경감시킨다. CIDP를 치료하는 다른 방법에서, 피험체는 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여, IVIG의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받으며, 개선 사항은 제1의 CIDP 치료에 더하여, 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 크게 감소시키는 데 유효한 양의 IFN-β 치료제의 투여량을 주 1회 피험체에 투여하여 CIDP의 증상을 효과적으로 경감시키는 것을 포함한다. CIDP를 갖는 피험체는 또한 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받음으로써 치료될 수 있으며, 개선 사항은 제1의 CIDP 치료에 더하여, 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 크게 감소시키는 데 유효한 양의 IFN-β 치료제의 투여량을 피험체에 투여하여 CIDP의 증상을 효과적으로 경감시키는 것을 포함한다.

도 1A∼C는 사람 IgG1Fc(ZL5107)의 CH2 및 CH3 도메인인 힌지에 융합된 성숙한 전길이 사람 IFN-β(서열 번호 3 및 4)에 융합된 VCAM 시그널 서열로 구성된 융합 단백질의 뉴클레오티드(서열 번호 11) 및 아미노산 서열(서열 번호 12)을 보여주며, 이때 서열 번호 4의 아미노산 162에서 글리신은 시스테인으로 대체된다.

도 2A∼C는 사람 IgG1Fc(ZL6206)의 CH2 및 CH3 도메인인 힌지에 융합된 G4S 링커에 융합된 성숙한 전길이 사람 IFN-β(서열 번호 3 및 4)에 융합된 VCAM 시그널 서열로 구성된 융합 단백질의 뉴클레오티드(서열 번호 13) 및 아미노산 서열(서열 번호 14)을 보여주며, 이때 서열 번호 4의 아미노산 162에서 글리신은 시스테인으로 대체된다.

본 발명은 약학적 유효량의 IFN-β 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 만성 탈수초성 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하는 방법을 제공한다.

1. 정의:

청구된 발명의 대상을 보다 명확하고 간결하게 나타내기 위하여, 명세서와 청구범위에서 사용된 구체적인 용어를 위한 하기 정의를 제공한다.

본 명세서와 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 단수 형태는 명확하게 달리 나타내지 않으면 복수를 포함한다.

"만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증"은 여기서 "CIDP"와 상호교환적으로 이용된다. 하기 조건은 CIDP와 동일하거나 본질적으로 동일한 것으로 간주되며 따라서 여기서 이용될 때 용어 "CIDP"에 포괄된다: "만성 재발성 다발성신경병증", "만성 특발성 탈수초성 다발성신경병증", "만성 염증성 탈수초성 다발신경근병증", 및 "만성 후천성 탈수초성 다발성신경병증"("CADP"). CIDP는 만성의 진행성, 단계적 또는 재발성 과정을 갖는다(예, Dyck, P. J., Thomas,P1K., Griffin, J. W., Low, P. A., Poduslo, J. F. (Eds), Peripheral Neuropathy,3d ed. Saunders, Philadelphia, pp. 1498-1517내의 Dyck et al. (1993) 참고). CIDP의 병리학적 특징은 분절성 탈수초성 및 수초재생 및 신경섬유막에서의 단핵 세포 침윤물이다(Dyck et al.,상기). CIDP는 때때로 다발성경화증(MS)의 말초 대응물로 불린다(Toyka and Hartung (1996) Curr. Opin. Neurol. 9, 240-250). 이것은 또한 길라인-바레 증후군의 만성 형태로 불린다. CIDP의 진단을 위한 기준은 예를 들어 American Academy of Neurology AIDS 태스크 포스의 특별 위원회 (1991)로부터의 보고 Neurology 41: 617에서 개시된, 임상적, 전기생리학적 및 뇌척수 유체(CSF) 기준을 포함한다. 진단적 테스트는 나인 홀 페그 테스트; 10 미터 걷기 테스트; 랭킨(Rankin) 스케일 또는 그 변형; 및 MRC 합계점수 또는 그 변형을 포함한다(Mathiowetz et al. (1985) Occupational Therapy J. of Res. 5: 24; Thompson et al. (1996) J. Neurol. 243: 280; Collen et al. (1990) Int. Disability Studies 12: 6; van Swieten et al. (1988) Stroke 19: 604 및 Kleyweg et al. (1991) Muscle Nerve 14: 1103). 신경학적 평가는 또한 신경 장애 스케일(NDS); 장애 스케일(0, 건강함; 1, 소수의 신호; 2, 도움 없이 걸을 수 있으나 달릴 수 없음; 3, 도움을 받아 단지 5미터 걸을 수 있음; 4, 의자/침대 의존); 해머스미스(Hammersmith) 운동 능력 테스트(HMAT)(Dyck P. J., In "Peripheral Neuropathy" (1993), 상기, 페이지 686-697; Scott et al. (1982) Muscle Nerve 5: 291); 및 신경 전달의 테스트를 포함한다. 근육 평가는 예를 들어 당업계에서 알려진 대로, 최대 자발적 등척수축(MVIC)을 측정함에 의한 운동 기능 평가; 및 근육 강도 측정에 관련될 수 있다. 장애의 또 다른 테스트는 보행 지수; 기능 독립 측정; 남성 신경 장애 스케일(GNDS); 의학 연구 위원회 합계점수; 감각 합계점수; 및 휴그스 기능 스케일을 포함한다(Hauser et al. (1983) N. Engl. J. Med. 308: 173; Hall et al. (1993) J. Head Trauma Rehabilitation 8: 60; Sharrack et al. (1996) J. Neurol. 243:532 and Merkies et al. (2002) Neurology 59: 84). CIDP를 위한 전기생리학적 기준은 1991년에 미국 신경학 학회의 특별 위원회에 의해 제안되었으며, 최근에 수정되었다(Nicolas et al. (2002) Muscle Nerve 25: 26). 감각 운동 면역-매개 다발성신경병증, 예를 들어 CIDP 및 길라인-바레 증후군(GBS)을 위해 이용되는 다른 테스트는 염증성 신경병증 원인 및 치료(INCAT) 감각 합계점수(ISS)의 심리측정학적 평가 이다 (Merkies et al. (2000) Neurology 54: 943). 사람 백혈구 항원 Dw3, DRw3, A1 및 B8은 건강한 집단에서보다 CIDP를 가진 환자에서 더욱 자주 발생한다(Zvartau-Hind et al. (2002) Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy,at www. emedicine. com/neuro).

"IFN-β-1a"는 야생형 사람 IFN-β의 아미노산 서열을 갖는 IFN-β 분자를 말하며, 당화된다.

"IFN-β-1b"는 야생형 IFN-β의 아미노산 서열을 갖는 IFN-β 분자를 말하며, 이때 위치 17에서의 시스테인은 세린으로 대체되며; 위치 1에서의 메티오닌("개시 메티오닌")이 없으며, 상기 분자는 당화되지 않는다.

"IFN-β 변이체"는 예를 들어 아미노산 결실, 부가, 치환, 번역후 변형 또는 하나 이상의 비천연 발생 아미노산 잔기 또는 그들 사이의 연결을 비롯한 하나 이상의 변형을 갖는 야생형 IFN-β 단백질을 말한다. IFN-β의 일부는 용어 "IFN-β 변이체"에 포함된다. "생물학적으로 활성인 IFN-β 변이체"는 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하는 데 있어 적어도 일부의 활성을 갖는 IFN-β 변이체이다. IFN-β 변이체는 야생형 IFN-β에 대하여 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 천연 발생 IFN-β, 즉 천연 발생 돌연변이 또는 다형 변이체일 수 있거나, 또는 비천연 발생 IFN-β일 수 있다.

IFN-β의 "국제 단위", 즉 (IU)는 인터페론을 위한 세계 보건 기구(WHO) 국제 표준에 의해 정의된 단위를 말한다.

폴리펩티드에 적용될 때 "분리된"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 사용됨)은 그것의 기원 또는 조작에 의해 (i) 발현 벡터의 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포에 존재하거나; (ii) 그것이 자연에서 연결되는 것외의 단백질 또는 다른 화학 부분에 연결되거나; 또는 (iii) 자연에서 발생하지 않는 폴리펩티드를 의미하며, 예를 들어 적어도 하나의 소수성 부분을 부착하거나 첨가하여 화학적으로 조작된 자연에서 발견되지 않는 형태의 단백질이다. "분리된"에 의해, (i) 화학적으로 합성되거나; 또는 (ii) 숙주 세포에서 발현되고, 연합된 오염 단백질로부터 정제되는 단백질을 추가로 의미한다. 상기 용어는 일반적으로 자연에서 발생하는 다른 단백질 및 핵산으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 또한 그것을 정제하기 위해 이용되는 항체 또는 젤 매트릭스(폴리아크릴아미드)와 같은 물질로부터 분리된다. 핵산에 적용될 때 "분리된"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 이용됨)은 그 기원 또는 조작에 의해 (i) 그것이 자연에서 연합되는 폴리뉴클레오티드 모두와 연합되지 않거나(즉, 발현 벡터 또는 그 일부로서 숙주 세포에 존재); 또는 (ii) 그것이 자연에서 연결되는 것과 다른 핵산 또는 다른 화학적 부분에 연결되거나; 또는 (iii) 자연에서 발생하지 않는 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드, 게놈 폴리뉴클레오티드의 일부, cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 말한다. "분리된"에 의해, 그것은 추가로 (i) 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생체외에서 증폭되거나; (ii) 화학적으로 합성되거나; (iii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나; 또는 (iv) 절단 및 젤 분리에 의해서와 같이, 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"다초점 운동 신경병증" 또는 "MMN"은 말초 신경의 해부학적 분포 영역에서 국소화된 비대칭 근육 약화 및 근위축증의 단계적 진행을 특징으로 하는 만성 면역 매개 탈수초성 신경병증이다(Pestronk et al. (1988) Ann. Neurol. 24: 73 및 Kornberg et al. (1995) Ann. Neurol. (suppl. 1) S43). 다초점 운동 신경병증의 전기생리학적 특징은 지속적인 전달 차단이다. 임상적으로, 이 질병은 또한 다초점 운동 전달 차단을 갖는 CIDP의 비대칭의 순수한 운동 변이체로 설명된다. 다초점 운동 신경병증의 진화동안, 다초점 특징은 본질적으로 대칭인 패턴으로, 임상적으로는 CIDP의 운동 형태와 유사하게 진화할 수 있다. 병리학적 연구는 이들 두 질병을 연결시켰다(Krendel et al. (1996) Ann. Neurol. 40: 948 및 Oh et al. (1995) Neurology 45: 1828). 다초점 운동 신경병증을 갖는 대부분의 환자는 강글리오사이드 GM1에 대해 높은 역가의 항체를 가진다(Pestronk et al., 상기 및 Kornberg et al., 상기).

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 다른 핵산에 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비성 리더(예, 시그널 서열 또는 시그널 펩티드)를 위한 DNA는 폴리펩티드를 암호하는 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되면 이 DNA에 작동적으로 연결되는 것이며; 프로모터 또는 인핸서는 암호 서열의 전사에 영향을 주면 상기 암호 서열에 작동적으로 연결되는 것이며; 그리고 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하기 위해 위치되면 암호 서열에 작동적으로 연결되는 것이다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하며, 예를 들어 분비성 리더의 경우에는, 인접하고 판독 상내로 연결됨을 의미한다. 연결은 예를 들어 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 이루어질 수 있다. 만일 그러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 프랙티스에 따라 이용될 수 있다.

"퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 유사성"은 두 폴리펩티드, 분자 사이 또는 두 핵산 사이의 서열 유사성을 말한다. 두 가지의 비교된 서열 둘 다에서 한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 차지될 경우, 각 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열간의 백분율 동일성은 두 서열에 의해 공유되는 매칭되거나 동일한 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나눈 값에 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 두 서열에서 10 개의 위치 중 6개가 매치되거나 동일하면, 두 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 CTGACT와 CAGGTT는 50% 상동성(총 6개 위치 중 3개가 매치됨)을 갖는다. 일반적으로, 두 서열이 최대 동일성을 갖도록 배열될 때 비교가 이루어진다. 그러한 배열은 예를 들어 하기에 더욱 상세하게 개시된 칼린과 알츌의 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 핵산을 언급할 때, "퍼센트 상동성" 및 "퍼센트 동일성"은 상호교환적으로 사용되는 반면, 폴리펩티드를 말할 때, "퍼센트 상동성"은 유사성의 정도를 말하며, 이때 다른 아미노산의 보존된 치환을 나타내는 아미노산은 이들 다른 아미노산과 동일한 것으로 간주된다. 기준 서열에서 잔기의 "보존적 치환"은 상응하는 기준 잔기와 물리적 또는 기능적으로 유사한, 예를 들어 공유 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 비롯한 유사한 크기, 모양, 전기적 전하, 화학적 특성을 갖는 아미노산에 의한 치환이다. 특히 바람직한 보존적 치환은 Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D. C. (1978)에서 "허용된 점 돌연변이"에 대해 정의된 기준을 충족하는 것들이다. 두 아미노산 서열 또는 두 핵산 서열의 퍼센트 상동성 또는 동일성은 칼린과 알츌(Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993))에서 변형된 대로 칼린과 알츌의 배열 알고리즘(Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87: 2264 (1990))을 이용하여 결정될 수 있다. 그러한 알고리즘은 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)의 NBLAST 또는 XBLAST 프로그램내로 통합된다. BLAST 서치는 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12를 이용하여 실행되어 본 발명의 핵산과 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻는다. BLAST 단백질 서치는 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3을 이용하여 실행되어 기준 폴리펩티드에 상동성인 아미노산 서열을 얻는다. 비교를 위한 갭을 가진 배열을 얻기 위하여, 갭을 가진 BLAST를 Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997)에 개시된 대로 이용한다. BLAST와 갭을 가진 BLAST를 이용할 경우, 각 프로그램(XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 이용한다. http://www/ncbi. nlm. nih.gov.를 참고한다.

생명의 질은 EuroQoL 시각적 유사체 스캐일 및 EuroQoL 질문사항 합계 점수; 의학적 결과 연구 36-아이템 단기 형태 건강 상태 스케일(SF-36); 및 시각적 유사체 스케일 (VAS) (EuroQoL Group (1990) Health Policy 16: 199 및 Merkies et al. (2002) Neurology 59: 84)에 의해 측정될 수 있다.

IFN-β 치료제는 "치료 효과"를 갖는 것으로 말해지며, IFN-β 치료제의 양은 만일 조합 치료에서 그 양의 IFN-β 치료제 단독 투여가 IFN-β 치료 부재에 비하여 질병의 증상 적어도 하나에서 임상적으로 유의한 개선을 야기하기에 충분하면 "치료적으로 효과적인" 것으로 말한다. 바람직한 구체예에서, CIDP를 가진 피험체에서 IFN-β 치료제의 치료적 유효량의 투여는 CIDP의 적어도 한 가지 증상, 예를 들어 근육 또는 신경 손상의 개선을 야기한다.

"야생형 IFN-β"는 천연이건 재조합성이건 간에, 천연 IFN-β의 정상 발생 아미노산 서열을 갖는 IFN-β를 말한다. 천연 사람 IFN-β의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 1과 2에 개시되며, 이들은 예를 들어 각각 GenBank 기탁 번호 M28622(및 E00029) 및 AAA36040으로 나타난 서열이다.

2. IFN-β 치료제

본 발명에 따라 이용될 수 있는 IFN-β 치료제는 야생형 IFN-β 및 생물학적으로 활성인 그 변이체, 예를 들어 자연 발생 및 비-자연 발생 변이체를 포함한다. 야생형 자연 발생 사람 IFN-β의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 1과 2에 개시되며, 이들은 예를 들어 각각 GenBank 기탁 번호 M28622 및 AAA36040과 동일하다. 이들 IFN은 또한 예를 들어 Seghal (1985) J. Interferon Res. 5: 521에 개시된다. 전길이 사람 IFN-β 단백질은 187 아미노산 길이이며, 서열 번호 1의 암호 서열은 뉴클레오티드 76-639에 해당한다. 시그널 서열은 아미노산 1∼21에 해당한다. 이 IFN-β의 성숙 형태의 아미노산 서열은 아미노산 22-187(서열 번호 1의 뉴클레오티드 139-639)에 해당한다. 성숙한 사람 IFN-β 단백질 및 이를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 4와 3에 개시된다.

포유동물 세포에서 생산된 IFN-β는 당화된다. 자연 발생 야생형 IFN-β는 서열 번호 4의 성숙한 폴리펩티드의 잔기 80(Asn 80) 또는 서열 번호 2의 미성숙 폴리펩티드의 잔기 101(Asn 101)에서 당화된다.

IFN-β 치료제는 또한 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스와 같은 척추동물; 또는 조류 또는 양서류로부터의 비인간 IFN-β를 포함한다. 이들 종으로부터의 IFN-β 서열은 GenBank 및/또는 문헌으로부터 얻을 수 있거나, 또는 다른 종으로부터의 IFN-β 유전자와의 낮은 엄격도 하이브리드화에 의해 분리된 핵산으로부터 유래될 수 있다.

야생형 IFN-β 단백질의 변이체는 야생형 IFN-β, 예를 들어 서열 번호 2 또는 4를 갖는 사람 IFN-β에 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 예를 들어, 야생형 IFN-β 단백질의 생물학적으로 활성인 단편이 이용될 수 있다. 그러한 단편은 단백질의 C- 또는 N- 말단에서 결실, 부가 또는 치환된 1, 2, 3, 5, 10 또는 최대 20개의 아미노산을 가질 수 있다. 변이체는 또한 1, 2, 3, 5, 10 또는 최대 20개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 일부 변이체는 약 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7, 또는 5개 미만의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 치환은 자연 발생 아미노산 또는 그 유사체, 예를 들어 D-입체이성질체성 아미노산으로 이루어질 수 있다.

예를 들어, 서열 번호 1 또는 3에 의해 나타내어지는 자연 발생 IFN-β를 암호하는 핵산에 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 핵산 또는 그 상보체에 의해 암호되는 IFN-β 변이체 또한 본 발명에 포함된다. DNA 하이브리드화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건, 예를 들어 약 45℃에서 6.0 X 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC) 및 이어서 50℃에서 2.0 X SSC의 세척이 당업계에 공지되어 있거나, 문헌[ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; 및 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes, e. g., part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York]에 개시되어 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0 X SSC의 낮은 엄격도에서 50℃에서 약 0.2 X SSC의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격도 조건에서 약 65℃의 높은 엄격도 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 농도 둘 다 변화될 수 있으며, 또는 온도 또는 염 농도 중 하나가 일정하게 유지되고 나머지 하나가 변화될 수 있다. 예시적인 하이브리드화 조건은 약 50℃에서 6.0 X 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)에서의 하이브리드화 및 이어서 실온에서 0.2 X SSC에서의 세척을 포함한다. 세척 단계의 온도는 약 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 또는 65℃로 증가되어 하이브리드화의 엄격도를 증가시킬 수 있다. 하이브리드화는 또한 5 X SSC, 4 X SSC, 3 X SSC, 2 X SSC, 1 X SSC, 또는 0.2 X SSC에서 실시될 수 있다. 하이브리드화는 적어도 약 1, 2, 5, 12 또는 24 시간 동안 실시될 수 있다. 하이브리드화는 또한 엄격도에 영향을 주는 다른 제제, 예를 들어 포름아미드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 엄격한 하이브리드화는 50% 포름아미드의 존재하에 실시될 수 있으며, 이것은 한정된 온도에서 하이브리드화의 엄격도를 증가시킨다. 세척 단계는 세제, 예를 들어, SDS, 예를 들어 0.1% 또는 0.2% SDS의 존재하에 실시될 수 있다. 하이브리드화는 단일 세척 단계 또는 적어도 두번의 세척 단계로 구성되는 세척이 후속될 수 있으며, 두번의 세척은 동일하거나 상이한 염도 및 온도일 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화는 2 X SSC, 0.1% SDS에서 약 20 분간 각각 65℃에서의 두번의 세척 단계 및 이어서 0.2 X SSC, 0.1% SDS에서 약 20 분간 각각 65℃에서의 두번의 세척 단계에 의해 후속될 수 있다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 50% 포름아미드, 10X 덴하르트(0.2% 피콜, 2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 소 혈청 알부민) 및 200 μg/ml의 변성 담체 DNA, 예를 들어 전단 연어 정자 DNA를 포함하거나 이로 구성되는 용액에서 65℃에서의 밤새 하이브리드화 및 2 X SSC, 0.1% SDS에서 약 20 분간 각각 65℃에서의 두번의 세척 단계 및 이어서 0.2 X SSC, 0.1% SDS에서 약 20 분간 각각 65℃에서의 두번의 세척 단계를 포함한다. 하이브리드화는 용액중의 두 핵산을 하이브리드화시키거나, 또는 용액내의 핵산을 고체 지지체, 예를 들어 필터에 부착된 핵산에 하이브리드화시키는 것으로 구성될 수 있다. 일부 상황에서는, 예를 들어, 한 핵산이 고체 지지체상에 있을 경우, 적어도 약 1 시간, 3 시간 또는 10 시간 동안 실시될 수 있으며 하이브리드화 용액과 동일한 용액 및 동일한 온도에서(프로브 없이) 이루어질 수 있는 예비하이브리드화 단계가 하이브리드화에 선행될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, IFN-β 변이체를 암호하는 핵산은 온건한 조건, 예를 들어 약 2.0 X SSC 및 약 40℃에서의 세척을 비롯한 조건하에서 서열 번호 1 또는 3 중 하나 또는 그 상보체에 하이브리드화할 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, IFN-β 변이체를 암호하는 핵산은 높은 엄격도 조건, 예를 들어 0.2 X SSC와 약 65℃에서의 세척하에서 서열 번호 1 또는 3 또는 그 상보체에 하이브리드화할 것이다.

예시적인 변형은 단백질의 2차 및 3차 구조에 최소의 영향을 미치는 보존적 변형이다. 예시적인 보존적 치환은 Dayhoff in the Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), 및 Argos in EMBO J., 8, 779-785 (1989)에 개시된 것을 포함한다. 예를 들어, 하기 그룹 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; 및 phe, tyr, trp, his.

다른 변형은 반드시 보존적 치환을 나타내지 않을 수도 있는 다른 아미노산으로 하나의 아미노산이 치환되는 것을 포함한다. 예를 들어, 본질적으로 IFN-β의 3차 구조에 영향을 주지 않는 치환이 만들어질 수 있다. 당화되지 않은 사람 IFN-β의 3차 구조는 예를 들어 Radhakrishnan et al. (1996) Structure 4: 1453에 개시되며 당화된 IFN-β의 3차 구조는 예를 들어 Karpusas etal.(1997) PNAS 94: 11813에 개시된다. 본질적으로, IFN-β는 다섯 개의 헬릭스를 포함한다: 서열 번호 4의 약 아미노산 2∼22로 구성되는 헬릭스 A; 서열 번호 4의 약 아미노산 51∼71로 구성되는 헬릭스 B; 서열 번호 4의 약 아미노산 80-107로 구성되는 헬릭스 C; 서열 번호 4의 아미노산 118-136으로 구성되는 헬릭스 D 및 서열 번호 4의 약 아미노산 139-162로 구성되는 헬릭스 E(Karpusas etal., 상기). 헬릭스 A, B, C 및 E는 레프트-핸디드, 타입 2의 4-헬릭스 묶음을 형성한다. 헬릭스 A와 B를 연결하는 긴 오버핸드 루프, AB 루프 및 나머지 헬릭스를 연결하는 세 개의 짧은 루프(BC, CD 및 DE로 명명)가 있다. 이전의 연구들은 IFN-베타 분자의 N-말단, C-말단 및 당화된 C 헬릭스 영역이 수용체 결합 부위내에 존재하지 않음을 보여주었다( WO 00/23472호 및 USSN 09/832,659호 참고). 따라서, 이들 영역에서의 돌연변이는 IFN 분자의 생물학적 활성에 크게 나쁜 영향을 주지 않을 것이다. 헬릭스 C(성숙한 사람 IFN-β의 아미노산 81, 82, 85, 86 및 89)에서의 돌연변이는 야생형 IFN-β에 비하여 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 분자를 형성시킴이 이전에 밝혀졌다(WO 00/23472호 및 USSN 09/832,659호). 유사하게, 헬릭스 A(성숙한 사람 IFN-β의 아미노산 2, 4, 5, 8 및 11) 및 CD 루프(아미노산 110, 11, 113, 116 및 119)의 돌연변이는 자연 발생 야생형 사람 IFN-β에 비하여 수용체에 대해 더 높은 결합 활성 및 더 높은 항바이러스 및 항증식 활성을 갖는다(WO 00/23472호 및 USSN 09/832,659호 참고).

다른 바람직한 변형 또는 치환은 분자간 가교 또는 부정확한 이황화 결합 형성을 위한 부위를 제거한다. 예를 들어, IFN-β는 서열 번호 4의 야생형 위치 17, 31 및 141에서, 세 개의 시스테인 잔기를 갖는 것으로 알려져 있다. 하나의 IFN 변이체는 위치 17에서의 시스테인(C)이 예를 들어 미국 특허 4,588,585호에 개시된 대로 세린(S)으로 치환된 IFN이다. 다른 IFN-β 변이체는 예를 들어 미국 특허 6,127,332호에 개시된 것과 같은, 서열 번호 4를 갖는 야생형 IFN-β에 따라 번호 매길 때, 위치 17에서 시스테인(C)을 위해 치환된 세린(S) 및 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 티로신(Y) 또는 히스티딘(H), 바람직하게는 페닐알라닌(F)로 치환된 위치 101에서의 발린(V) 중 하나 이상을 갖는 IFN-β 변이체를 포함한다. 다른 바람직한 변이체는, 예를 들어 서열 번호 4를 갖는 야생형 IFN-β의 서열을 가지며 이때 야생형 IFN-β에 따라 번호를 매길 때 위치 101에서 발린(V)이 미국 특허 6,127,332호에 개시된 대로, 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 히스티딘(H) 또는 페닐알라닌(F)로 치환된 폴리펩티드를 포함한다.

다른 IFN-β 변이체는 개시 메티오닌, 예를 들어 서열 번호 4의 메티오닌 1이 결핍된 성숙 IFN-β 분자이다. 예시적인 IFN-β 변이체는 개시 메티오닌이 결핍되며 미국 특허 4,588,585호에 개시된 대로 예를 들어, 성숙한 형태의 위치 17에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다.

IFN-β 분자는 또한 하나 이상의 아미노산을, 정상 발생 측쇄 또는 말단기가 화학 반응에 의해 변형된 천연 또는 비천연 아미노산인 유도된 아미노산 하나 이상으로 치환시켜 변형될 수 있다. 그러한 변형은 예를 들어, 감마-카복실화, 베타-카복실화, 페길화, 황화, 설폰화, 인산화, 아미드화, 에스테르화, N-아세틸화, 카르보벤질화, 토실화 및 기타 당업계에 공지된 변형을 포함한다.

다른 변형은 카르복실, 아미노, 또는 고리화를 위한 다른 반응성 전구체 기능기를 여전히 제공하는 한편 측쇄가 길어지거나 짧아진 아미노산 유사체 또는 유도된 아미노산 및 적절한 기능기를 가진 변이성 측쇄를 갖는 아미노산 유사체의 사용을 포함한다. 예를 들어, 대상 화합물은 예를 들어, 시아노알라닌, 카나바닌, 드젠콜산, 노르루이신, 3-포스포세린, 호모세린, 디하이드록시-페닐알라닌, 5-하이드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 디아미노피멜산, 오르니틴, 또는 디아미노부티르산과 같은 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 여기서 적합한 측쇄를 갖는 다른 자연 발생 아미노산 대사물 또는 전구체는 당업자가 인식할 것이며 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 IFN-β 변이체는 역전된 또는 레트로 펩티드 서열을 포함한다. "역전된" 또는 "레트로" 펩티드 서열은 공유적으로-결합된 아미노산 잔기의 전체적인 서열(또는 그 유사체 또는 모방체)의 일부를 말하며, 이때 아미노산 골격에서 펩티드 결합 형성의 정상적인 카르복실에서 아미노로의 방향이, 종래의 좌측에서 우측으로의 판독이 펩티드 결합의 아미노 부분이 카르보닐 부분을 선행하도록 역전된다. 일반적으로, Goodman, M. and Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979,12, 423를 참고한다. 여기서 개시된 역전된 배향 펩티드는 (a) 하나 이상의 아미노말단 잔기가 역전된("rev") 배향으로 전환된(따라서 분자의 가장 좌측 부분에서 두 번째 "카르복실 말단"을 생성) 것들 및 (b) 하나 이상의 카르복실-말단 잔기가 역전된("rev") 배향으로 전환된(분자의 가장 우측 부분에서 두 번째 "아미노 말단"을 생성) 것들을 포함한다. 펩티드 (아미드) 결합은 정상 배향 잔기와 역전 배향 잔기 사이에서 계면에서 형성될 수 없다. 따라서, 본 발명의 일부 역전된 폴리펩티드는 역전된 펩티드(역전된 아미드) 결합을 이용하여 서열들의 두 이웃한 부분을 연결하기 위해 적절한 아미노산 모방체 부분을 이용함으로써 형성될 수 있다. 상기 (a) 경우에, 디케토 화합물의 중앙 잔기는 펩티도모방체 구조를 이루기 위하여 두 아미드 결합을 갖는 구조를 연결하기 위해 편리하게 이용될 수 있다. 상기 (b) 경우에, 디아미노 화합물의 중앙 잔기는 유사하게 펩티도모방체 구조를 형성하기 위해 두 아미드 결합을 갖는 구조를 연결하기 위해 유용할 것이다. 또한, 그러한 폴리펩티드에서 결합의 역전된 방향은 일반적으로 역전되지 않은 펩티드의 공간 배향과 유사한 측쇄의 공간 배향을 유지하기 위하여 역전된 아미노산 잔기의 거울상이성체 형태의 전도를 요구할 것이다. 펩티드의 역전된 부분에서 아미노산의 형태는 바람직하게는 (D)이며, 역전되지 않은 부분의 형태는 바람직하게는 (L)이다. 반대 또는 혼합 형태는 결합 활성을 최적화하기 위해 적절할 때 허용가능하다. 폴리펩티드의 변형은 추가로 미국 특허 6,399,075호에 개시된다.

IFN-β 치료제는 또한 하나 이상의 이종성 폴리펩티드에 융합된 IFN-β 단백질 및 그 변이체(예, 성숙 단백질)을 포함한다. 이종성 폴리펩티드는, 예를 들어 IFN-β 단백질의 반감기를 연장시키거나 그 생산을 개선할 목적으로 추가될 수 있다. 예시적인 이종성 폴리펩티드는 면역글로불린(Ig) 분자 또는 그 일부, 예를 들어 Ig 분자의 경쇄 또는 중쇄의 불변 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, IFN-β 단백질 또는 그 변이체는 면역글로불린 경쇄, 중쇄 또는 둘 다의 힌지 및 불변 영역의 전부 또는 일부에 융합되거나 다르게는 연결된다. 따라서, 본 발명은 (1) IFN-β 단백질 부분(즉, IFN-β 또는 그 변이체), (2) 두 번째 펩티드, 예를 들어 IFN-β 부분의 가용성 또는 생체내 수명을 증가시키는 것, 예를 들어 면역글로불린 수퍼 패밀리의 구성원 또는 그 단편 또는 일부, 예를 들어 IgG의 일부 또는 단편, 예를 들어 사람 IgG1 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함하는 분자를 특징으로 한다. 구체적으로, "IFN-β/Ig 융합체"는 면역글로불린 쇄의 N-말단에 연결된 생물학적으로 활성인 IFN-β 부분을 포함하는 단백질이다. IFN-β/Ig 융합체의 종은 면역글로불린의 불변 도메인의 적어도 일부에 연결된 IFN-β 부분을 포함하는 단백질인 "IFN-β/Fc 융합체"이다. 바람직한 Fc 융합체는 중쇄 면역글로불린 쇄의 C 말단 도메인을 함유한 항체의 단편에 연결된 IFN-β 부분을 포함한다.

융합 단백질은 이종성 폴리펩티드가 그것의 N- 및 C-말단 둘 다에 연결된 IFN-β 폴리펩티드 또는 그 변이체를 포함한다. 이종성 폴리펩티드는 또한 IFN-β 폴리펩티드 또는 그 변이체에 대해 내부일 수 있다.

한 구체예에서, 융합 단백질은 일반식 X-Y-Z를 가지며, 이때 X는 IFN-β 또는 그 일부 또는 변이체의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이며; Y는 선택적 링커 부분이며; 그리고 Z는 부분 X의 인터페론 베타 이외의 폴리펩티드의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 식 Z-Y-X를 가지며, 이때 비-IFN-β 폴리펩티드는 IFN-β 폴리펩티드 또는 그 일부 또는 변이체의 N-말단 부분에 융합되는 링커의 N-말단 부분에 융합된다. 부분 Z는 면역글로불린-유사 도메인을 함유하는 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 그러한 다른 폴리펩티드의 예는 CD1, CD2, CD4 및 클래스 I 및 클래스 II 주요 조직적합성 항원의 구성원을 포함한다. 그러한 폴리펩티드의 예를 위해 미국 특허 5,565,335호(Capon et al)을 참고한다.

부분 Z는 예를 들어, 복수의 히스티딘 잔기, 또는 바람직하게는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함할 수 있으며 여기서 "Fc"는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 도메인을 함유한 항체의 단편으로 정의된다.

부분 Y는 IFN-β 부분이 그 생물학적 활성을 보유하도록 허용하는 임의의 링커일 수 있다. 부분 Y는 1 아미노산 길이 또는 적어도 2 아미노산 길이일 수 있다. Y는 또한 약 2∼약 5 아미노산; 약 3∼약 10 아미노산 길이 또는 10 이상 아미노산 길이일 수 있다. 바람직한 구체예에서, Y는 예를 들어 뉴클레오티드 서열 GGCGGTGGTGGCAGC(서열 번호 5)에 의해 암호되는 GlyGlyGlyGlySer(서열 번호 6)로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. Y는 또한 엔테로키나제 인식 부위, 예를 들어 GACGATGATGACAAG(서열 번호 7)에 의해 암호되는 AspAspAspAspLys(서열 번호 8)로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, Y는 예를 들어 AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG(서열 번호 9)에 의해 암호되는 SerSerGlyAspAspAspAspLys(서열 번호 10)으로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.

더욱이, IFN-β 부분(X)과 두 번째의 비-IFN-β 부분 Z(예, 면역글로불린의 Fc 영역) 사이의 커플링은 또한, X와 Z 부분이 본질적으로 그들의 각각의 활성을 보유하는 한 두 분자를 함께 결합시킬 임의의 화학 반응에 의해 이루어질 수 있다. 이 화학 결합은 공유 결합, 친화성 결합, 삽입, 배위 결합 및 복합화와 같은 많은 화학 기작을 포함할 수 있다. IFN-β 부분과 Z 부분 사이의 공유 결합을 형성시키기 위한 대표적인 커플링제(즉, 일반식에서 링커 "Y")는 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 톨릴렌-2,6-디이소시아네이트와 같은 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 비스-(p-디아조늄-벤조일)-에틸렌디아민과 같은 헥사메틸렌 디아민, 디메틸 아디프이미데이트와 같은 이미도에스테르의 이기능성 유도체, 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은 비스-활성 불소 화합물과 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이 리스트는 당업계에 공지된 화학 커플링제의 다양한 부류를 배제하고자 함이 아니다. 이들 중 다수는 N-숙신아미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(SMPT:Pierce Chem.Co.,Cat.#21558G)와 같이 시판된다.

바람직한 IFN-β/Ig 융합 단백질은 사람 IgG1Fc(ZL5107)에 융합된, 사람 IFN-β의 전길이 성숙 형태 즉, 서열 번호 4를 함유하는 서열 번호 12로 구성되거나 이를 포함한다(WO 00/23472호 및 USSN 09/832,659호 참고)(도 1 참고). 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11에 개시된다. 사람 IFN-β를 암호하는 DNA는 뉴클레오티드 트리플렛 568-570(아르기닌을 암호하는 AAC)에서 끝나며 사람 IgG1 불변 영역을 암호하는 DNA는 서열 번호 11의 뉴클레오티드 번호 574로 시작하는 트리플렛(아스파르트산을 암호하는 GAC)에서 시작한다.

다른 바람직한 IFN-β/Ig 융합 단백질은 서열 번호 14에 개시되고 서열 번호 13에 의해 암호된다(WO 00/23472호 및 USSN 09/832,659호 참고)(도 2 참고). 이 후자의 융합 단백질은 그 자체가 사람 IgG1Fc(ZL6206)에 연결된 G4S 링커에 연결된 사람 IFN-β로 구성된다. G4S 링커(서열 번호 7의 뉴클레오티드 571∼585에 의해 암호됨)는 아미노산 서열 GGGGS(서열 번호 9)로 구성된다. 이들 단백질의 생산 방법은 WO 00/23472호 및 USSN 09/832,659호에 개시된다.

바람직한 구체예에서, IFN-β 폴리펩티드는 그것의 C-말단을 통해서 면역글로불린의 Fc 영역의 적어도 일부에 융합된다. IFN-β는 아미노 말단 부분을 형성하고, Fc 영역은 카르복시 말단 부분을 형성한다. 이들 융합 단백질에서, Fc 영역은 바람직하게는 불변 도메인 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인에 제한된다. 이들 융합체에서 Fc 영역은 또한 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 힌지 영역의 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인 또는 그 기능성 등가물에 제한될 수 있다. 이들 불변 영역은 임의의 포유동물 소스(바람직하게는 사람)로부터 유래될 수 있으며 IgA, IgD, IgM, IgE 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 적절한 부류 및/또는 아이소타입으로부터 유래될 수 있다.

Ig 융합체를 암호하는 재조합 핵산 분자가 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 얻어지거나(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) 또는 공개적으로 구할 수 있는 클론으로부터 얻어질 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 암호하는 유전자의 제조 방법은 예를 들어 Robinson, R. et al., PCT 출원 공개 W087/02671호에 의해 교시된다. 인터페론 분자 또는 단편을 암호하는 cDNA는 직접 중쇄 Ig 불변 영역을 암호하는 cDNA에 연결되거나 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 재조합 벡터 시스템은 합성 힌지 영역과 정확한 리딩 프레임으로 인터페론 베타를 암호하는 서열을 수용하도록 형성될 수 있다. 부가적으로, 재조합 벡터 시스템의 일부로서, RNA 절단/폴리아데닐화 부위 및 하부 서열을 비롯한 면역글로불린 유전자의 3' 인접 영역에 해당하는 핵산을 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. 더욱이, 재조합 벡터로 형질전환된 세포로부터 융합된 분자의 분비를 촉진하기 위하여 면역글로불린 융합 단백질-암호 서열의 상부의 시그널 서열을 조작하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명은 융합 단백질을 포함하는 단량체 또는 다량체 분자뿐만 아니라 이량체 융합 분자를 제공한다. 그러한 다량체는 IgM 펜타머 또는 IgA 이량체와 같은 다가인 Ig 분자의 Fc 영역, 또는 그 일부를 이용하여 생성될 수 있다. J 쇄 폴리펩티드는 IgM 펜타머 및 IgA 이량체를 형성하고 안정화시키기 위해 필요할 수 있다. 다르게는, IFN-β 융합 단백질의 다량체는 단백질 A와 같은 Ig 분자의 Fc 영역에 대한 친화성을 갖는 단백질을 이용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, IFN-β/면역글로불린 융합 단백질 다수가 단백질 A-아가로스 비드에 결합될 수도 있다.

이들 다가 형태는 다수의 인터페론 베타 수용체 결합 부위를 보유하므로 유용하다. 예를 들어, 이가의 가용성 IFN-β는 링커 영역(부분 Y)에 의해 분리된 서열 번호 4의 아미노산 1∼166(즉 서열 번호 3의 1∼498번 핵산에 의해 암호되는 것)의 두 개의 탠덤 반복물(일반식에서 부분 X)로 구성될 수 있으며, 상기 반복물들은 면역글로불린 불변 도메인의 적어도 일부(부분 Z)에 결합된다. 다른 다가 형태는 또한 예를 들어, 통상적인 커플링 기법을 이용하여 IFN-β/Ig 융합체를 임의의 임상적으로 허용가능한 담체 분자, 즉 피콜, 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란으로 구성되는 군에서 선택되는 중합체에 화학적으로 커플링시켜 구성될 수 있다. 다르게는, IFN-β는 비오틴에 화학적으로 연결될 수 있으며, 비오틴-인터페론 베타 Fc 접합체는 이어서 아비딘에 결합하여 4가의 아비딘/비오틴/인터페론 베타 분자를 형성한다. IFN-β/Ig 융합체는 또한 디니트로페놀(DNP) 또는 트리니트로페놀(TNP)에 공유적으로 연결될 수 있으며, 생성된 접합체는 항-DNP 또는 항-TNP-IgM과 침전되어 인터페론 베타 수용체 결합 부위에 대해 10의 가수를 갖는 10량체 접합체를 형성한다.

본 발명의 단백질의 유도체는 또한 생물학적 활성을 보유한 1차 단백질의 다양한 구조적 형태를 포함한다. 이온화가능한 아미노기 및 카르복실기의 존재로 인해, IFN-β 단백질과 그 변이체는 산성 또는 염기성 염의 형태일 수 있으며, 또는 중성 형태일 수 있다. 개별 아미노산 잔기는 또한 산화 또는 환원에 의해 변형될 수 있다. 또한, 1차 아미노산 구조(N- 및/또는 C-말단 끝을 포함) 또는 IFN-β의 글리칸은 글리코실기, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜 중합체, 지질, 포스페이트, 아세틸기 등과 같은 다른 화학적 부분과 공유적 또는 응집성 접합체를 형성하거나, 또는 아미노산 서열 돌연변이를 형성시킴으로써 변형될 수 있다("유도체화").

인터페론 베타/Ig의 다른 유도체는 부가적인 N-말단, 또는 C-말단으로서 재조합 배양물에서 합성됨에 의한 것과 같은, 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 인터페론 베타 또는 그 단편의 공유적 또는 응집성 접합체를 포함한다. 예를 들어, 접합된 펩티드는 단백질이 그 합성 부위로부터 세포막 또는 벽의 내부 또는 외부의 기능 부위로 이동하도록 번역과 동시에 또는 번역 후에 지시하는 단백질의 N-말단 영역의 시그널(또는 리더)폴리펩티드 서열일 수 있다.(예, 효모 알파-인자 리더). 예를 들어, 시그널 펩티드는 IFN-β의 시그널 펩티드, 즉 서열 번호 1의 뉴클레오티드 76∼138에 해당하는 서열 번호 2의 아미노산 1∼21일 수 있다. 시그널 펩티드는 VCAM의 시그널 펩티드, 즉 서열 번호 11의 뉴클레오티드 1∼72에 의해 암호되는 서열 번호 12의 아미노산 1∼24일 수 있다.

이종성 폴리펩티드(예, 펩티드) 또는 다른 분자가 또한 IFN-β 치료제의 정제를 돕기 위해 또는 라벨로서 이용될 수 있다. 그러한 펩티드는 당업계에서 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드의 마킹 및/또는 정제를 허용하는, "태그 펩티드"를 암호하는 "태그 서열"로 여기서 불리는 마커 서열에 인 프레임(in frame)으로 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마커 서열은 헥사히스티딘 태그, 예를 들어 PQE-9 벡터에 의해 공급되는 것이다. 많은 다른 태그 펩티드가 시판된다. 다른 자주 이용되는 태그는 c-myc으로부터의 10-잔기 서열을 포함하는 myc-에피토프(예, Ellison et al.(1991) J Biol Chem 266:21150-21157 참고), pEZZ-단백질 A 시스템(Pharmacia, NJ), 및 해모필러스 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 16 아미노산 부분을 포함한다. 더욱이, 임의의 폴리펩티드는 태그 폴리펩티드와 특이적으로 상호작용하는 시약, 예를 들어 항체가 이용가능하거나 제조되거나 확인될 수 있으면 태그로 이용될 수 있다.

한 구체예에서, IFN-β 단백질 또는 그 변이체는 하기 펩티드 중 하나와 N-말단 또는 C-말단에서 융합된다: 뉴클레오티드 서열 CATCATCATCATCATCAT (서열 번호: 15)에 의해 암호될 수 있는 HisHisHisHisHisHis (서열 번호: 16); TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT(서열 번호 15)에 의해 암호될 수 있는 SerGlyGlyHisHisHisHisHisHis (서열 번호: 18); 및 뉴클레오티드 서열 TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCTCCGGAGACGATGATGACAAG(서열 번호 : 19)에 의해 암호되는 SerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspAspAspLys (서열 번호: 20).

인터페론 베타의 아미노산 서열은 또한 펩티드 AspTyrLysAspAspAspAspLys(DYKDDDDK) (서열 번호 : 21)에 연결될 수 있다 (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204,1988). 후자의 서열은 매우 항원성이며 특이적 모노클론 항체에 의해 가역적으로 결합되는 에피토프를 제공하여, 신속한 분석 및 발현된 재조합 단백질의 용이한 정제를 가능하게 한다. 이 서열은 또한 Asp-Lys 쌍에 바로 이어지는 잔기에서 소 점막 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단된다.

다른 구체예에서, IFN-β 치료제는 알부민 단백질, 그 변이체 또는 일부에 융합된 IFN-β 단백질 또는 그 변이체를 포함한다. 그러한 융합 단백질은 예를 들어 WO 01/77137호에 개시된 대로 생성될 수 있다.

IFN-β 치료제는 또한 폴리펩티드가 아닌 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, IFN-β 단백질 또는 그 변이체는 공유적으로 또는 비공유적으로 중합체, 예를 들어 생분해성 중합체에 연결될 수 있다. 예를 들어, IFN-β 단백질 또는 그 변이체는 페길화될 수 있어, 예를 들어 WO 00/23114호에 개시된 대로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결될 수 있다.

본 발명의 범위내에서, 하나보다 많은 중합체 분자가 또한 부착될 수 있음에도 불구하고, 하나의 중합체 분자가 IFN-β와의 접합을 위해 이용될 수 있다. 접합 중합체는 최종 사용 분야에 적절한 임의의 기, 부분, 또는 다른 접합된 종을 이용할 수 있음이 인식될 것이다. 예로서, 일부 분야에서는 UV-분해 내성, 또는 항산화, 또는 다른 특성 또는 특징을 중합체에 부여하는 기능성 부분을 중합체에 공유적으로 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 추가의 예로서, 일부 적용에서는 중합체를 반응성 또는 교차결합성으로 만들어 전체적인 접합된 물질의 다양한 특성 또는 특징을 개선하기 위하여 중합체를 기능화시키는 것이 유리할 수도 있다. 따라서, 중합체는 그 목적을 위하여 접합된 IFN-β 조성물의 효능을 배제하지 않는 임의의 기능기, 반복기, 결합, 또는 다른 구성 구조를 함유할 수 있다.

IFN-β는 가장 바람직하게는 중합체 상의 말단 반응성기를 통해 접합되며, 접합은 또한 비말단 반응성 기로부터 분지될 수 있다. 반응성 기를 갖는 중합체는 여기서 "활성화된 중합체"로 지정된다. 반응성 기는 선택적으로 단백질상의 자유 아미노 또는 다른 반응성기와 반응한다. 활성화된 중합체는 라이신의 알파 아미노기 또는 입실론-아미노기와 같은 임의의 이용가능한 IFN-β 아미노기에서 부착이 발생할 수 있도록 반응된다. (이용가능하다면) IFN-β의 자유 카르복실기, 적합하게 활성화된 카르보닐기, 하이드록실, 구아니디닐, 산화된 탄수화물 부분 및 머캡토 기가 또한 부착 부위로 이용될 수 있다.

중합체는 IFN-β 분자 또는 그 변이체상의 임의의 곳 또는 IFN-β 분자에 직접 또는 간접적으로 연결된 다른 아미노산에서 부착될 수 있지만, 중합체 커플링을 위한 가장 바람직한 부위는 IFN-β 분자의 N-말단이다. 두 번째 부위는 C-말단 또는 그 근처이며 당 부분을 통해서이다. 따라서, 본 발명은 그 가장 바람직한 구체예로서 하기를 고려한다: (i) IFN-β 또는 그 변이체의 N-말단 결합된 중합체 접합체; (ii) IFN-β 또는 그 변이체의 C-말단 결합된 중합체 접합체; (iii) 중합체 접합체의 당-결합된 접합체; 및 (iv) IFN-β 단백질 또는 그 변이체의 N-, C- 및 당-결합된 중합체 접합체.

일반적으로 단백질 농도에 따라, 단백질 몰당 약 1.0∼약 10 몰의 활성화된 중합체가 이용된다. 최종 양은 생성물의 비특이적 변형을 최소화하는 한편 반응의 정도를 최대화시키는 것과, 동시에 최적 활성을 유지할 화학을 정의하는 한편 동시에 가능하다면 단백질의 반감기를 최적화하는 것 사이의 밸런스이다. 바람직하게는 단백질의 생물학적 활성의 적어도 약 50%가 보유되며, 가장 바람직하게는 100%가 보유된다.

상기 반응은 생물학적으로 활성인 물질을 불활성 중합체와, 바람직하게는 반응성기가 N-말단의 알파 아미노기상에 있다면 약 pH 5∼7에서 반응시키기 위해 이용되는 임의의 적절한 방법에 의해 발생할 수 있다. 일반적으로 상기 과정은 활성화된 중합체(적어도 하나의 말단 하이드록실기를 가질 수 있음)를 제조하고 그 후에 상기 단백질을 활성화된 중합체와 반응시켜 제제에 적합한 가용성 단백질을 생산하는 것에 관련된다. 상기 변형 반응은 하나 이상의 단계에 관련될 수 있는 몇가지 방법에 의해 실시될 수 있다.

전술한 대로, 본 발명의 가장 바람직한 구체예는 중합체에의 연결로서 IFN-β의 N-말단 끝을 이용한다. 적합한 방법은 N-말단 변형된 IFN-β를 선택적으로 얻기 위해 이용가능하다. 한 가지 방법은 IFN-β의 유도화에 이용가능한 1차 아미노기의 다른 타입의 다른 반응성(라이신상의 입실론 아미노기 대 N-말단 메티오닌상의 아미노기)을 이용하는 환원성 알킬화 방법에 의해 예시된다. 적절한 선택 조건하에서, 카르보닐기를 함유한 중합체를 이용한 그 N-말단에서의 IFN-β의 실질적으로 선택적인 유도화가 이루어질 수 있다. 상기 반응은 라이신 잔기의 입실론-아미노기와 IFN-β의 N-말단 잔기의 알파-아미노기 사이의 pKa 차이를 이용하도록 하는 pH에서 실시된다. 이 타입의 화학은 당업자에게 공지되어 있다.

예를 들어, PEG-알데히드 중합체가 소듐 시아노보로하이드라이드의 존재하에 IFN-β와 반응하는 조건하에서 낮은 pH(약 5∼6)에서 반응을 실시함으로써 이러한 선택성이 유지되는 반응 도식이 이용될 수 있다. PEG-IFN-β의 정제 및 SDS-PAGE, MALDI 질량 분광법 및 펩티드 서열결정/맵핑을 이용한 분석 후, 이것은 N-말단이 PEG 부분에 의해 특이적으로 표적화된 IFN-β를 야기하였다.

IFN-β의 결정 구조는 N- 및 C-말단이 서로 가까이 위치함을 나타낸다(Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818 참고). 따라서, IFN-β의 C-말단 끝의 변형은 또한 활성에 최소한의 효과를 가져야 한다. PEG와 같은 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 C-말단에 표적화시키는 데 있어 간단한 화학적 전략은 없지만, 중합체 부분을 표적화시키기 위해 이용될 수 있는 부위를 유전적으로 조작하는 것이 직접적일 것이다. 예를 들어, C-말단 또는 그 근처 부위에서 시스테인을 통합시키면 말레이미드, 비닐설폰 또는 할로아세테이트-활성화된 폴리알킬렌 글리콜(예, PEG)를 이용한 특이적 변형을 허용할 것이다. 이들 유도체는 시스테인에 대한 이들 시약의 높은 선택성으로 인해, 조작된 시스테인의 변형을 위해 특이적으로 이용될 수 있다. 표적화될 수 있는 히스티딘 태그((Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3:551) 또는 부가적인 당화 부위의 통합과 같은 다른 전략은 IFN-β의 C-말단을 변형하기 위한 다른 대안을 나타낸다.

IFN-β 상의 글리칸은 또한 활성 변화 없이 추가 변형을 가능하게 하는 위치에 있다. 화학적 변형을 위한 부위로서 당을 표적화하는 방법은 또한 공지되어 있으며, 따라서 폴리알킬렌 글리콜 중합체는 산화를 통해 활성화된 IFN-β상의 당에 직접적으로 그리고 특이적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 알데히드와 케톤과의 응축에 의해 상대적으로 안정한 하이드라존 결합을 형성하는 폴리에틸렌글리콜-하이드라지드가 생성될 수 있다. 이 특성은 산화된 올리고당 결합을 통한 단백질의 변형을 위해 이용되어 왔다. Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301 참고. 특히, 니트라이트를 이용한 PEG-카르복시메틸 하이드라지드의 처리는 아미노기에 대해 반응성인 친전자성 활성기인 PEG-카르복시메틸 아지드를 생성한다. 이 반응은 또한 폴리알킬렌 글리콜-변형된 단백질을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 미국 특허 4,101,380호 및 4,179,337호 참고.

티올 링커-매개된 화학은 추가로 단백질의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이것은 예를 들어 소듐 페리오데이트를 이용하여 탄수화물 부분상에 반응성 알데히드를 생성시키고, 알데히드를 통해 시스타민 접합체를 형성하고 시스타민상의 티올기를 통해 가교결합을 유도시켜 실시될 수 있다(Pepinsky, B. et al.,(1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 및 Chen, L. L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237- 18243 참고). 따라서, 이러한 타입의 화학은 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 이용한 변형에 적합할 것으로 예상되며, 이 경우 링커는 당내로 포함되고 폴리알킬렌 글리콜 중합체는 링커에 부착된다. 아미노티올 또는 하이드라진-함유 링커는 단일 중합체 기의 추가를 허용하는 한편, 링커의 구조는 다수의 중합체가 첨가되고/되거나 IFN-β에 대한 중합체의 공간 배향이 변화되도록 변화될 수 있다.

예시적인 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 중합체와 같은 수용성 중합체를 포함한다. 그러한 중합체의 비제한적인 리스트는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 그 공중합체 및 그 볼록 공중합체와 같은 다른 폴리알킬렌 옥사이드 단독중합체를 포함한다. 적합한 수용성 및 비펩티드성 중합체 골격의 다른 예는 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴오일모르폴린) 및 그 공중합체, 삼중합체 및 혼합물을 포함한다. 한 구체예에서, 중합체 골격은 약 200 Da∼약 400,000 Da의 평균 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다. 다른 관련 중합체 또한 본 발명의 실시에 사용하기 적합하며 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 이러한 면을 포함하며 배제하지 않음이 이해되어야 한다. 용어 PEG는 알콕시 PEG, 이기능성 PEG, 다가-아암 PEG, 분지를 가진 PEG, 측쇄 PEG, 펜던트 PEG, 또는 분해가능한 연결을 그 안에 가진 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.

한 구체예에서, C1-C4 알킬 폴리알킬렌 글리콜의 폴리알킬렌 글리콜 잔기, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 그러한 글리콜의 폴리(옥시)알킬렌 글리콜 잔기가 대상 중합체 시스템에 포함된다. 따라서, 단백질이 부착되는 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 단독중합체일 수 있으며, 또는 모든 경우에 중합체가 실온에서 수용성이면 폴리옥시에틸화된 폴리올이다. 그러한 중합체의 비제한적인 예는 PEG 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥사이드 단독중합체, 그 공중합체 및, 블록 중합체의 수용성이 유지되기만 하면, 그 블록 공중합체를 포함한다. 폴리옥시에틸화 폴리올의 예는 예를 들어, 폴리옥시에틸화 글리세롤, 폴리옥시에틸화 솔비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스, 등을 포함한다. 폴리옥시에틸화 글리세롤의 글리세롤 골격은 예를 들어 동물 및 사람에서 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 자연 발생하는 것과 동일한 골격이다. 따라서, 이 측쇄는 반드시 신체에서 외래 제제로 보여지지는 않을 것이다.

폴리알킬렌 옥사이드에 대한 대안으로서, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알콜, 탄수화물계 중합체 등이 이용될 수 있다. 당업자는 전술한 리스트가 단지 예시적이며 여기서 개시된 특질을 갖는 모든 중합체 물질이 고려됨을 이해할 것이다.

중합체는 임의의 특정 분자량일 수 있으나, 분자량은 약 300∼100,000 사이, 더욱 바람직하게는 약 10,000∼40,000 사이이다. 특히, 20,000 이상의 크기가 신장에서의 여과로 인한 단백질 손실을 막는데 최상이다.

폴리알킬렌 글리콜 유도체화는 폴리알킬렌 글리콜 유도체의 하기 특성들과 연합하여, 본 발명의 실시에서 중합체-IFN-β 접합체의 형성에서 유익한 특성을 많이 갖는다: 수용성의 개선, 및 동시에 항원성 또는 면역원성 반응의 비유발; 고도의 생물적합성; 폴리알킬렌 글리콜 유도체의 생체내 생분해 부재; 및 살아있는 유기체에 의한 분비의 용이성.

더욱이, 본 발명의 다른 태양에서, 접합의 특성이 절단가능한 공유 화학 결합에 관련되는, 중합체 성분에 공유 결합된 IFN-β를 이용할 수 있다. 이것은 중합체가 IFN-β로부터 절단될 수 있는 시간 과정의 면에서 조절을 허용한다. IFN-β 약제와 중합체 간의 이러한 공유 결합은 화학적 또는 효소적 반응에 의해 절단될 수 있다. 중합체-IFN-β 생성물은 허용가능한 양의 활성을 보유한다. 동시에, 폴리에틸렌 글리콜의 부분은 접합 중합체에 존재하여 중합체-IFN-β 접합체에 높은 수용성 및 연장된 혈액 순환 능력을 부여한다. 이들 개선된 특성의 결과로서, 본 발명은 활성 중합체-IFN-β 종의 비경구, 비강, 및 경구 전달, 및 생체내 적용에서 이어지는 가수분해적 절단, IFN-β 그 자체의 생물이용성을 포함한다.

접합체, 예를 들어 N-말단 접합된 생성물을 얻기 위한 IFN-β와 중합체의 반응은 다양한 반응 도식을 이용하여 쉽게 실시될 수 있다. IFN-β 접합체의 활성 및 안정성은 다른 분자 크기의 중합체를 이용하여 다양한 방식으로 변화될 수 있다. 접합체의 용해도는 중합체 조성물내로 포함된 폴리에틸렌 글리콜 단편의 비율과 크기를 변화시켜 바꿀 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 접합체는 단백질을 활성화된 폴리알킬렌 글리콜 화합물(PCG)과 반응시켜 제조한다. 예를 들어, IFN은 환원제(예, 소듐 시아노보로하이드라이드)의 존재하에 환원성 알킬화를 통해 PEG-알데히드와 반응하여, 아민 결합을 통해 부착된 PEG-단백질 접합체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 0154316 B1호 및 국제 특허 출원 PCT/US03/01559호를 참고한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 사람 IFN-β는 활성화된 폴리알킬렌 글리콜인 20 kDa mPEG-O-2-메틸프로피온알데히드, 20 kDa mPEG-O-p-메틸페닐-O-2-메틸프로피온알데히드, 20 kDa mPEG-O-m-메틸페닐-O-2-메틸프로피온알데히드, 20 kDa mPEG-O-p-페닐아세트알데히드, 20 kDa mPEG-O-p-페닐프로피온알데히드, 및 20 kDa mPEG-O-m-페닐아세트알데히드로 페길화되어 20 kDa mPEG-O-메틸프로피온알데히드-개질된 IFN-β, 20 kDa mPEG-O-p-메틸페닐-O-2-메틸프로피온알데히드-개질된 IFN-β, 20 kDa mPEG-O-m-메틸페닐-O-2-메틸프로피온알데히드-개질된 IFN-β, 20 kDa mPEG-O-p-페닐아세트알데히드-개질된 IFN-β, 20 kDa mPEG-O-p-페닐프로피온알데히드-개질된 IFN-β, 및 20 kDa mPEG-O-m-페닐아세트알데히드-개질된 IFN-β를 각각 얻는다. 20 kDa mPEG-O-2-메틸프로피온알데히드 및 20 kDa mPEG-O-p-페닐아세트알데히드로 개질된 사람 IFN-β의 제조 및 특성규명의 상세한 설명은 하기에 개시되며 또한 국제 특허 출원 PCT/US03/01559호에 개시된다.

한 구체예에서, 페길화된 IFN-β는 하기와 같이 제조된다. IFN-β, 예를 들어, 비조제된 AVONEX^® (IFN-β-1a 벌크 중간체, (사람에서의 사용을 위해 모든 테스트를 통과한 벌크 약제의 임상적 배치), 100 mM 소듐 포스페이트 pH 7.2, 200 mM NaCl중의 250 ㎍/ml)를 동부피의 100 mM MES pH 5.0으로 희석시키고, pH를 HCl을 이용하여 5.0으로 조절한다. 샘플을 6 mg IFN-β/ml 수지로 SP-세파로스^® FF 컬럼(Pharmacia, Pisataway, NJ)상에 로딩한다. 컬럼을 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 75 mM NaCl로 세척하고, 생성물을 30 mM 소듐 포스페이트 pH 6.0, 600 mM NaCl로 용출시킨다. 용출 분획을 그들의 280 nm에서의 흡광도 값 및 1 mg/ml 용액에 대해 1.51의 소멸 계수를 이용하여 흡광도로부터 추정된 샘플내의 인터페론의 농도에 대해 분석할 수 있다.

SP 용출액으로부터의 IFN-β의 1 mg/ml 용액에, 0.5 M 소듐 포스페이트 pH 6.0을 50 mM로 첨가하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich, Milwaukee, WI)를 5 mM로 첨가하고, 20K PEG 알데히드 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL)를 5 mg/ml로 첨가한다. 샘플을 실온에서 20 시간 동안 항온처리한다. 페길화된 인터페론을 이동상으로써 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 150 mM NaCl을 이용하고 SP-세파로스^® FF를 이용하여 Superose^® 6 FPLC 사이징 컬럼(Pharmacia)에서 순차적 크로마토그래피 단계에 의해 반응 생성물로부터 정제한다. 사이징 컬럼은 개질된 IFN-β 및 개질되지 않은 IFN-β의 기본선 분리를 야기한다. 젤 여과로부터의 PEG-인터페론 베타-함유 용출 풀은 물로 1:1로 희석되고 SP-세파로스^® 컬럼상에 2 mg 인터페론 베타/ml 수지로 로딩된다. 컬럼을 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 75 mM NaCl로 세척하고 이어서 페길화된 인터페론 베타를 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 800 mM NaCl로 컬럼으로부터 용출시킨다. 용출 분획을 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 함량에 대해 분석한다. 페길화된 인터페론 농도는 PEG 부분이 280 nm에서의 흡광도에 기여하지 않기 때문에 인터페론 당량으로 보고된다. 이들 방법 및 얻어진 페길화된 IFN-β의 특성규명은 WO 00/23114호에 추가로 개시된다. IFN-β의 PEG 접합은 그 항바이러스 활성을 바꾸는 것으로 보이지 않는다. 또한, 페길화된 IFN-β의 특이적 활성은 비페길화된 IFN-β의 것보다 훨씬 더 큰것으로 발견되었다(약 10배)(WO 00/23114호).

IFN-β는 또한 20K PEG 알데히드를 위해 상기한 것과 동일한 프로토콜을 따라, 예를 들어 Fluka, Inc. (Cat. No. 75936, Ronkonkoman, NY)로부터 구입할 수 있는 5K PEG-알데히드 부분으로 페길화될 수 있다.

20 kDa mPEG-O-2-메틸프로피온알데히드-개질된 IFN-β는 하기와 같이 제조될 수 있다. 10 mL의 비조제된 AVONEX^® (IFN-β-1a 벌크 중간체, (사람에서의 사용을 위해 모든 테스트를 통과한 벌크 약제의 임상적 배치), 100 mM 소듐 포스페이트 pH 7.2, 200 mM NaCl중의 250 ㎍/ml)를 12mL의 165 mM MES pH 5.0 및 50 ㎕의 5N HCl로 희석시킨다. 샘플을 300 ㎕ SP-세파로스^® FF 컬럼(Pharmacia, Pisataway, NJ)상에 로딩한다. 컬럼을 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 75 mM NaCl 300 ㎕로 3회 세척하고, 단백질을 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 600 mM NaCl로 용출시킨다. 용출 분획을 그들의 280 nm에서의 흡광도 및 1 mg/ml 용액에 대해 1.51의 소멸 계수를 이용하여 추정된 샘플내의 인터페론의 농도에 대해 분석한다. 피크 분획을 모아 3.66 mg/ml의 IFN-β 농도를 얻고, 이것은 이어서 물로 1.2 mg/ml로 희석된다.

희석된 SP-세파로스 용출 풀로부터의 IFN-β 0.8 mL에, 0.5 M 소듐 포스페이트 pH 6.0를 50 mM로 첨가하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich)를 5 mM로 첨가하고, 20 kDa mPEG-0-2-메틸프로피온알데히드를 5 mg/mL로 첨가한다. 샘플을 암실에서 실온에서 16 시간 동안 항온처리한다. 페길화된 IFN-β를 하기와 같이 0.5 mL SP-세파로스 FF 컬럼상에서 반응 혼합물로부터 정제한다: 0.6mL의 반응 혼합물을 2.4 mL 20 mM MES pH 5.0로 희석하고 SP-세파로스 컬럼상에 로딩한다. 컬럼을 소듐 포스페이트 pH 5.5, 75 mM NaCl로 세척하고 페길화된 IFN-β를 25 mM MES pH 6.4, 400 mM NaCl을 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 페길화된 IFN-β는 세파로스 6 HR 10/30 FPLC 사이징 컬럼에서 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 150 mM NaCl을 이동상으로 하여 추가 정제된다. 사이징 컬럼(25mL)은 20 mL/h로 런닝되고 0.5 mL 분획이 수집된다. 용출 분획을 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 함량에 대해 분석하고, 모으고, 풀의 단백질 농도를 결정한다. 페길화된 IFN-β 농도는 PEG 부분이 280 nm에서 흡광도에 기여하지 않기 때문에 IFN 당량으로 보고된다. 풀의 샘플을 분석을 위하여 제거하고, 나머지를 HSA-함유 제제 완충액으로 30 ㎍/ml로 희석하고, 0.25 ml/바이얼로 분취하고, -70℃에서 저장할 수 있다.

20 kDa mPEG-O-p-페닐아세트알데히드-개질된 IFN-β는 하기와 같이 제조될 수 있다. 20 mL의 비조제된 AVONEX^® (IFN-β 벌크 중간체, 사람에서의 사용을 위해 모든 테스트를 통과한 벌크 약제의 임상적 배치, 100 mM 소듐 포스페이트 pH 7.2, 200 mM NaCl중의 250 ㎍/ml)를 24mL의 165 mM MES pH 5.0, 100 ㎕의 5N HCl 및 24 mL 물로 희석시킨다. 샘플을 600 ㎕ SP-세파로스^® FF 컬럼(Pharmacia)상에 로딩한다. 컬럼을 2 X 900 ㎕의 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 75 mM NaCl로 세척하고, 단백질을 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 600 mM NaCl로 용출시킨다. 용출 분획을 그들의 280 nm에서의 흡광도 및 1 mg/ml 용액에 대해 1.51의 소멸 계수를 이용하여 추정된 샘플내의 인터페론-β의 농도에 대해 분석한다. 피크 분획을 모아 2.3 mg/ml의 IFN-β 농도를 얻었다. SP-세파로스 용출 풀로부터의 IFN-β-1a 1.2 mL에, 0.5 M 소듐 포스페이트 pH 6.0를 50 mM로 첨가하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich)를 5 mM로 첨가하고, 20 kDa mPEG-0-p-페닐아세트알데히드를 10 mg/mL로 첨가한다. 샘플을 암실에서 실온에서 18 시간 동안 항온처리한다. 페길화된 IFN-β를 하기와 같이 0.75 mL SP-세파로스 FF 컬럼상에서 반응 혼합물로부터 정제한다: 1.5 mL의 반응 혼합물을 7.5 mL 20 mM MES pH 5.0, 0.75 ml 물 및 5 ㎕ 5N HCl로 희석하고 SP-세파로스 컬럼상에 로딩한다. 컬럼을 소듐 포스페이트 pH 5.5, 75 mM NaCl로 세척하고 페길화된 IFN-β를 20 mM MES pH 6.4, 600 mM NaCl을 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 페길화된 IFN-β는 세파로스 6 HR 10/30 FPLC 사이징 컬럼에서 5 mM 소듐 포스페이트 pH 5.5, 150 mM NaCl을 이동상으로 하여 용출된다. 사이징 컬럼(25 mL)은 20 mL/h로 런닝되고 0.5 mL 분획이 수집된다. 용출 분획을 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 함량에 대해 분석하고, 모으고, 풀의 단백질 농도를 결정한다. 페길화된 IFN-β 농도는 페길화된 IFN-β의 1 mg/ml 용액에 대해 2의 소멸 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도에 대한 PEG의 기여에 대해 조절한 후(20 kDa mPEG-0-p-페닐아세트알데히드는 1 mg/ml 용액에 대해 0.5의 280 nm에서의 소멸 계수를 가짐) IFN 당량으로 보고된다. 풀의 샘플을 분석을 위하여 제거하고, 나머지를 HSA-함유 제제 완충액으로 30 ㎍/ml로 희석되고, 0.25 ml/바이얼로 분취하고, -70℃에서 저장할 수 있다.

비자연적으로 발생하는 중합체에 결합된 당화된 IFN-β는 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함할 수 있다. 폴리알킬렌 부분은 알데히드 기, 말레이미드 기, 비닐설폰기, 할로아세테이트기, 다수의 히스티딘 잔기, 히드라진 기 및 아미노티올기로부터 선택된 기를 통해 인터페론-베타에 결합될 수 있다. IFN-β는 폴리에틸렌 글리콜 부분에 결합될 수 있으며, 이때 IFN-β는 불안정한 결합에 의해 폴리에틸렌 글리콜 부분에 결합되며, 이때 불안정한 결합은 생화학적 가수분해 및/또는 단백질분해에 의해 절단가능하다. 중합체는 약 5∼약 40 킬로달톤의 분자량을 가질 수 있다. 이용될 수 있는 다른 IFN-β는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체에 N-말단 결합된 생리학적으로 활성인 당화된 인터페론-베타를 포함하는 생리학적으로 활성인 인터페론-베타 조성물이며, 이때 생리학적 활성 인터페론-베타 및 폴리알킬렌 글리콜 부분은 생리학적 활성 인터페론-베타 조성물내의 생리학적 활성 인터페론-베타가 항바이러스 분석에 의해 측정할 때, 생리학적 활성 인터페론-베타가 없는 상기 부분에 비하여 실질적으로 유사한 활성을 갖도록 배열된다.

이종성 폴리펩티드 또는 다른 분자는 IFN-β 단백질 또는 그 변이체에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있다. "공유적으로 결합된"은 본 발명의 다른 부분이 서로 직접 공유결합되거나, 또는 가교, 스페이서, 또는 연결 부분 또는 부분들과 같은 개입 부분 또는 부분들을 통해 서로 간접적으로 공유 결합된 것을 의미한다. 개입 부분 또는 부분들은 "커플링 기"로 불린다. 용어 "접합된"은 "공유적으로 결합된"과 상호교환적으로 이용된다.

본 발명에 사용하기 위한 IFN-β는 당화되거나 당화되지 않을 수 있다. 당화되지 않은 IFN-β는, 예를 들어 원핵 숙주 세포에서 생산될 수 있다.

IFN-β 단백질 또는 그 변이체는 또한 정상적으로는 IFN-β에 존재하지 않는 다당류를 부착함으로써 변형될 수 있다.

3. IFN-β 치료제를 생산하는 방법

본 발명의 IFN-β 치료제는 IFN-β 치료제를 암호하는 핵산을 구성하고 이 핵산을 적절한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 것을 포함하는 방법과 같은 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이 방법은 재조합 IFN-β 치료제를 생산할 것이다. IFN-β 치료제는 또한 화학 합성 또는 화학 합성과 재조합 DNA 기법의 조합에 의해 생산될 수 있다.

한 구체예에서, IFN-β 치료제를 암호하는 핵산은 IFN-β 또는 그 변이체를 암호하는 DNA 서열을 분리하거나 합성하여 구성된다. 예를 들어, IFN-β 융합 단백질은 예를 들어 여기서 개시된 대로 생산될 수 있다. 자연 발생 IFN-β 핵산은 공지의 방법에 따라 얻어질 수 있다. 예를 들어, 핵산은 IFN-β를 발현하는 것으로 알려진 세포, 예를 들어 백혈구로부터 얻어진 RNA, 및 IFN-β 유전자의 서열, 예를 들어 서열 번호 1에 기초한 프라이머를 이용하여 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 분리될 수 있다. IFN-β 단백질을 암호하는 핵산은 또한 라이브러리, 예를 들어 IFN-β를 발현하는 세포로부터 만들어진 cDNA 라이브러리를 프로브, 예를 들어 IFN-β 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 스크리닝하여 분리될 수 있다.

다르게는, 완전한 아미노산 서열은 역번역된 유전자를 구성하기 위해 이용될 수 있다. IFN-β 치료제를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 함유한 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 폴리펩티드의 일부를 암호하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드를 합성하여 연결시킬 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상보적인 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.

공지의 방법을 이용하여 IFN-β 단백질을 암호하는 핵산내로 변화를 도입할 수 있다. 예를 들어, 변화는 문헌[Mark et al.,"Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984)] 및 미국 특허 4,588,585호에 개시된 대로 부위 특이적 돌연변이유발법에 의해 만들어질 수 있다.

IFN-β 치료제를 암호하는 핵산을 구성하는 다른 방법은 화학 합성을 통해서이다. 예를 들어, 바람직한 IFN-β 치료제를 암호하는 유전자를 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 화학적 수단에 의해 합성할 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 바람직한 IFN-β 치료제의 아미노산 서열에 기초하여 고안된다.

발현 시스템에서의 발현을 위한 핵산을 선택할 때, 재조합 IFN-β 치료제가 생산될 숙주 세포 또는 발현 시스템에서 선호되는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 코돈은 바람직하게는 원핵 세포에서 것들보다 우선적으로 발현되는 것으로 알려진다("코돈 선호").

IFN-β 치료제를 암호하는 DNA 서열은 또한 시그널 서열을 암호하는 DNA 서열을 포함할 수도 그렇지 않을 수도 있다. 그러한 시그널 서열은, 만일 존재한다면, IFN-β 치료제의 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인식되는 것이어야 한다. 시그널 서열은 원핵성, 진핵성, 또는 그 둘의 조합성일 수 있다. 시그널 서열은 공지되어 있으며, 몇가지 다른 것들이 개시되어 있다. 시그널 서열은 천연(즉, 자연 발생의) IFN-β의 시그널 서열일 수 있다. 시그널 서열의 포함은 IFN-β 치료제가 생산되는 재조합 세포로부터 IFN-β 치료제가 분비되는 것이 바람직한 지 여부에 의존한다. 만일 선택된 세포가 원핵성이면, 일반적으로 DNA 서열은 시그널 서열을 암호하지 않는 것이 바람직하다. 만일 선택된 세포가 진핵성이면, 일반적으로 이그널 서열이 암호되는 것이 바람직하며 가장 바람직하게는 야생형 IFN-β 시그널 서열이 이용된다.

일단 조립되면(합성, 부위 지시된 돌연변이 유발 또는 다른 방법에 의해), IFN-β 치료제를 암호하는 핵산은 발현 벡터내로 삽입되며, 원하는 형질전환된 숙주 세포에서 IFN-β 치료제의 발현을 위해 적절한 발현 조절 서열에 벡터내에서 작동적으로 연결된다. 적절한 조립은 핵산 서열결정, 제한 효소 맵핑 및 적절한 숙주 또는 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 공지된 것처럼, 숙주 또는 숙주 세포에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해서는, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어야 한다.

발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 의존할 것이다. 다양한 발현 숙주/벡터 조합을 이용할 수 있다. 진핵 숙주, 예를 들어 진핵 숙주 세포를 위한 유용한 발현 벡터는, 예를 들어 SV40, 소 파필로마 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터, 예를 들어 하기 벡터를 포함한다: pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터. 다르게는, 소 파필로마바이러스(BPV-1), 또는 엡스타인-바아 바이러스(pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스의 유도체를 진핵 세포에서의 단백질의 일시적 발현을 위해 이용할 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법이 공지되어 있다. 다른 적합한 발현 시스템을 위해서, Molecular Cloning A Laboratory Manual,2 Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 및 17을 참고한다.

박테리아 숙주를 위해 유용한 발현 벡터는 col E1, pCRl, pBR322, pMB9 및 그 유도체를 비롯한 이. 콜라이로부터의 플라스미드와 같은 공지의 박테리아 플라스미드, RP4와 같은 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 파지 DNA, 예를 들어 파지 람다의 많은 유도체, 예를 들어 NM989 및 M13 및 필라멘트성 단일쇄 DNA 파지와 같은 다른 DNA 파지를 포함한다. 효모 세포를 위한 유용한 발현 벡터는 2.mu 플라스미드 및 그 유도체를 포함한다. 곤충 세포를 위해 유용한 벡터는 pVL 941을 포함한다. Cate et al., "Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986)을 참고한다.

또한, 다양한 발현 조절 서열 중 임의의 것을 이들 벡터에서 이용할 수 있다. 그러한 유용한 발현 조절 서열은 전술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연합된 발현 조절 서열을 포함한다. 유용한 발현 조절 서열의 예는 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 파지 람다, 예를 들어 PL의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리서레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소를 위한 프로모터, 산 포스파타제, 예 Pho5의 프로모터, 효모 알파-메이팅 시스템의 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열 및 다양한 그 조합을 포함한다.

박테리아, 진균(효모 포함), 식물, 곤충, 포유동물, 또는 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주 및 형질전환 동물 또는 식물을 비롯한 임의의 적합한 숙주가 IFN-β 치료제를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 예시적인 숙주는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이신, 진균, 효모, 스포도프테라 프루아이페르다(SF9)와 같은 곤중 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NS/0과 같은 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 녹색 원숭이 세포, 및 사람 세포 및 조직 배양된 식물 세포를 포함한다. 그러한 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 얻을 수 있다. 동물 세포 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 배양된 CHO 세포 및 COS7 세포 및 특히 CHO-DDUKY-β1 세포주를 포함한다.

모든 벡터와 발현 조절 서열이 여기서 개시된 DNA 서열을 발현하기 위하여 동등하게 잘 작용하지는 않을 것임이 이해될 것이다. 모든 숙주가 동일한 발현 시스템으로 동등하게 잘 작용하지는 않을 것이다. 하지만, 당업자는 과도한 실험 없이 이들 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주중에서 선택할 수 있다. 벡터의 카피수, 카피수를 조절하는 능력, 및 항생제 마커와 같은 그 벡터에 의해 암호된 다른 단백질의 발현 또한 고려되어야 한다. 예를 들어, 이 발명에 사용하기 위한 바람직한 벡터는 IFN-β 치료제를 암호하는 DNA가 카피수로 증폭되도록 하는 것을 포함한다. 그러한 증폭성 벡터는 공지되어 있다. 그들은 예를 들어 DHFR 증폭(예, Kaufman, 미국 특허 4,470,461호, Kaufman and Sharp,"Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982) 참고) 또는 글루타민 신세타제("GS") 증폭(미국 특허 5,122,464호 및 유럽 공개 출원 338,841호 참고)에 의해 증폭될 수 있는 벡터를 포함한다.

발현 조절 서열의 선택에서, 다양한 인자가 또한 고려되어야 한다. 이들은 예를 들어, 상대적인 서열의 강도, 그 조절성 및 특히 잠재적인 2차 구조에 있어서, IFN-β 치료제를 암호하는 실제 DNA 서열과의 융화성을 포함한다. 숙주는 선택된 벡터와의 융화성, 본 발명의 DNA 서열에 의해 암호되는 생성물의 독성, 그들의 분비 특성, 그들이 정확하게 폴리펩티드로 접히는 능력, 그들의 발효 또는 배양 요건, 및 DNA 서열에 의해 암호되는 생성물의 정제의 용이성의 고려에 의해 선택되어야 한다.

이들 파라미터내에서, 당업자는 예를 들어 CHO 세포 또는 COS7 세포를 이용한 발효 또는 대규모 동물 배양에서 원하는 DNA 서열을 발현할 다양한 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선택할 수 있다. IFN-β 변이체를 발현하기 위한 CHO 세포주 CHO-KUKX-B1 DHFR sup의 이용은 미국 특허 6,127,332호에서 추가로 개시된다.

IFN-β 치료제는 또한 생체외 시스템, 예를 들어 생체외 번역 시스템, 예를 들어 세포 용해물, 예를 들어 적혈구 용해물에서 생산될 수 있다. 여기서 용어 "무세포 번역 시스템"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "생체외 번역 시스템"은 RNA 분자를 단백질로 번역하는 데 필요한 적어도 최소의 요소를 함유한 무세포 추출물인 번역 시스템이다. 생체외 번역 시스템은 대개 효소와 같은 거대분자, 번역, 개시 및 신장 인자, 화학 시약 및 리보솜을 포함한다. 예를 들어, 생체외 번역 시스템은 적어도 리보솜, ^tRNA, 개시 메티오닐-^tRNA^Met, 번역에 관련된 단백질 또는 복합체, 예를 들어 eIF₂, eIF₃ , 캡-결합 단백질(CBP)와 진핵 개시 인자 4F(eIF_4F)를 포함하는 캡-결합(CB) 복합체를 포함할 수 있다. 다양한 생체외 번역 시스템이 공지되어 있으며 시판되는 키트를 포함한다. 생체외 번역 시스템의 예는 토끼 적혈구 용해물, 토끼 난모세포 용해물, 사람 세포 용해물, 곤충 세포 용해물 및 맥아 추출물과 같은 진핵성 용해물을 포함한다. 용해물은 Promega Corp., Madison, Wis.;Stratagene, La Jolla, Calif.; Amersham, Arlington Heights, Ill.; 및 GIBCO/BRL, Grand Island, N. Y.과 같은 제조사에서 판매한다. 생체외 번역 시스템에 사용하기 위한 RNA는 예를 들어 공지의 방법에 따라 SP6 또는 T7 프로모터를 이용하여 생체외에서 생산될 수 있다.

다른 방법에서, IFN-β 치료제는 숙주 세포에서 내인성 유전자로부터 발현된다. 상기 방법은 IFN-β 유전자의 암호 영역의 상부에 이종성 프로모터, 예를 들어 유도성 프로모터를 삽입하고, 내인성 IFN-β 유전자를 발현시키고 생산된 IFN-β를 회수하는 것을 포함한다. 이종성 프로모터는 공지 방법에 따라 "넉인"에 의해 또는 다르게는 IFN-β 유전자내에 프로모터를 삽입함으로써 세포내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 IFN-β 치료제는 치료제를 생산하기 위해 이용되는 숙주 유기체에 따라 당화 또는 당화되지 않을 수 있다. 만일 박테리아가 숙주로 선택되면, 생산되는 IFN-β 치료제는 당화되지 않을 것이다. 한편, 진핵 세포는 IFN-β 치료제를 당화시킬 것이다.

형질전환된 숙주에 의해 생산된 IFN-β 치료제는 임의의 적절한 방법에 따라 정제될 수 있다. 다양한 방법이 IFN-β 정제를 위해 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,289,689호, 4,359,389호, 4,172,071호, 4,551,271호, 5,244,655호, 4, 485,017호, 4,257,938호, 4,541,952호 및 6,127,332호를 참고한다. 바람직한 구체예에서, IFN-β 치료제는 예를 들어 문헌[Okamura et al.,"Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence." Biochem., 19, pp. 3831-35 (1980)]에 개시된 대로, 면역친화성에 의해 정제된다.

예를 들어, IFN-β 단백질 및 그 변이체는 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등과 같이 통상의 조건에 따라 분리되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 인터페론 단백질 및 단편은 그 용액을 그 위에 고정된 인터페론 수용체를 갖는 컬럼을 통해 통과시켜 정제될 수 있다(미국 특허 4,725,669호 참고). 결합된 인터페론 분자는 이어서 카오트로픽 염을 이용한 처리 또는 수성 아세트산을 이용한 용출에 의해 용출될 수 있다. 면역글로불린 융합 단백질은 융합 단백질의 Fc 부분에 선택적으로 결합하는 고정된 단백질 A 또는 단백질 G를 함유한 컬럼을 통해 융합 단백질을 함유한 용액을 통과시켜 정제될 수 있다. 예를 들어 문헌[Reis, K. J., et al., J. Immunol. 132: 3098-3102 (1984)]; PCT 출원 공개 W087/00329호 참고. 이어서 키메라 항체는 카오트로픽 염을 이용한 처리 또는 수성 아세트산을 이용한 용출에 의해 용출될 수 있다.

다르게는, 인터페론 단백질 및 면역글로불린-융합 분자는 항-인터페론 항체 컬럼 또는 항-면역글로불린 항체 컬럼상에서 정제되어 실질적으로 순수한 단백질을 제공할 수 있다. 용어 "실질적으로 순수한"은 단백질이 자연적으로 그들과 연합된 불순물이 없음을 의도한다. 실질적인 순도는 전기영동에 의한 단일 밴드에 의해 입증될 수 있다.

생산되고 정제된 IFN-β는 예를 들어 펩티드 맵핑에 의해 특성을 밝힐 수도 있다. 예를 들어, IFN-β 치료제 샘플은 엔도프로테이나제 Lys-C를 이용하여 분해될 수 있으며 미국 특허 6,127,332호에 개시된 대로 역상 HPLC에서 분석될 수 있다.

바람직한 구체예에서, IFN-β 치료제는 실질적으로 다른 세포 물질, 예를 들어 단백질이 없다. 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "IFN-β 치료제의 정제된 제제"는 약 20%(건조 중량 기준) 미만의 오염 세포 물질, 예를 들어 핵산, 단백질 및 지질을 가지며, 바람직하게는 약 5% 미만의 오염성 세포 물질을 갖는 IFN-β 치료제의 제제를 말한다. IFN-β 치료제의 바람직한 제제는 약 2% 미만의 오염 세포 물질을 가지며, 더욱 바람직하게는 약 1% 미만의 오염 세포 물질 그리고 가장 바람직하게는 약 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001% 미만의 오염 세포 물질을 갖는다.

바람직한 IFN-β 치료제 조성물은 또한 실질적으로 다른 세포 단백질("오염 단백질"로도 불림)이 없으며, 즉 상기 조성물은 약 20% 미만(건조 중량 기준)의 오염 단백질을 가지며, 바람직하게는 약 5% 미만의 오염 단백질을 갖는다. 대상 폴리펩티드의 바람직한 제제는 약 2% 미만의 오염 단백질을 가지며, 더욱 바람직하게는 약 1% 미만의 오염 단백질, 가장 바람직하게는 약 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001% 미만의 오염 단백질을 갖는다.

IFN-β 제제의 순도 및 농도는 예를 들어 샘플을 젤 전기영동하거나, 예를 들어 문헌[RobertK. Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, Third Ed., Springer Verlag New York, 1993] 및 여기에 인용된 참고문헌에 개시된 대로 공지 방법에 따라 결정할 수 있다.

IFN-β 치료제의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 EP-B1-41313호와 WO 00/23472호에 개시된 대로, 항바이러스 활성의 항체 중화, 단백질 키나제의 유도, 올리고아데닐레이트 2,5-A 신세타제 또는 포스포디에스테라제 활성에 의해 분석할 수 있다. 그러한 분석은 또한 면역조절 분석(예, 미국 특허 4,753,795호 참고), 성장 억제 분석 및 인터페론 수용체를 발현하는 세포에의 결합의 측정을 포함한다. 예시적인 항바이러스 분석은 미국 특허 6,127,332호와 WO 00/23472호에 추가로 개시된다.

사구체신염을 치료하는 IFN-β 치료제의 능력은 또한 실시예 및 여기서 추가로 개시된 것들과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 테스트는 예를 들어 실시예에서 개시된 대로 실시될 수 있다.

IFN-β 치료제는 또한 하기의 상표명으로 판매되는 것을 구입할 수 있다: AVONEX^® (IFN-β-1a) (Biogen, Inc., Cambridge, MA); REBIF^®(IFN-β-1a) (Serono, S. A., Geneva, Switzerland); 및 BETASERON^® (Berlex, Montville, NJ;IFN-β-1b)로도 판매되는 BETAFERON^® (IFN-β-1b) (Schering Aktiengesellschaft, Berlin, Germany). AVONEX^® 및 REBIF^® 은 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 재조합 야생형 사람 당화 IFN-β이다. BETAFERON^®은 박테리아에서 생산된다.

4. IFN-β 치료제를 이용한 치료 방법

본 발명은 치료적 유효량의 IFN-β 치료제를, 선택적으로는 다른 요법에 대한 부가성분으로서 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 신경병증을 치료하거나 방지하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 신경병증은 만성 탈수초성 신경병증과 같은 탈수초성 신경병증이다. 만성 탈수초성 신경병증의 예는 CIDP 및 다초점 운동 신경병증을 포함한다. 바람직한 구체에에서, 신경병증은 CIDP이다.

피험체는 신경병증을 갖는 것으로 확인된 피험체일 수 있다. 피험체는 공지 방법에 따라 신경병증으로 진단될 수 있다. 특히, CIDP의 진단은 예를 들어 여기서 추가로 개시된 대로 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. IFN-β 치료제를 이용한 치료는 신경병증으로 진단된 사람에서 임의의 시점에 시작할 수 있다. 치료는 또한 신경병증을 갖는 것으로 보이지 않지만 신경병증이 발생할 가능성이 있는 사람에서 시작할 수 있다. 그러한 피험체는 예를 들어 유전적 기준에 의해 확인될 수 있다. 신경병증을 일으킬 가능성이 있는 피험체는 또한 신경병증과 일반적으로 관련된 모든 증상은 아니지만 일부 증상을 가져 그 피험체가 사실상 신경병증을 일으킬 것인지가 명확하지 않을 수 있는 피험체를 포함한다. 치료는 적어도 약 1 개월, 적어도 약 3 개월, 적어도 약 6 개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 3년, 적어도 약 5년 또는 그 이상 동안 실시될 수 있다.

피험체는 포유동물와 같은 동물일 수 있다. 포유동물의 예는 사람, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 비인간 영장류, 마우스 및 래트를 포함한다.

일부 구체예에서, IFN-β 치료제는 부가 요법으로서, 즉 다른 치료를 받고 있는 피험체에 투여된다. 예를 들어, CIDP를 갖는 사람은 IFN-β 치료제 투여에 더하여, IVIg; 프레드니소론과 같은 스테로이드; 또는 아조티오프린, 사이클로스포린 또는 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제의 투여에 의해; 또는 혈장 교환에 의하여 치료될 수 있다. IFN-β 치료제를 이용한 조합 요법은 더 해롭고(예, 스테로이드), 더 비싸며(예, IVIg), 더 불편한(혈장 교환) 다른 치료의 사용을 최소화시킬 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, IFN-β 치료제의 피험체에의 투여는 다른 치료의 투여량 및/또는 빈도를 감소시킬 수 있도록 한다. 예를 들어, 투여량 및/또는 빈도는 적어도 약 10%, 30%, 50%, 75%, 100%(즉, 두배), 5배, 10배 또는 그 이상 감소될 수 있다. 하기에 개시된 것은 CIDP를 위한 케어의 현 표준이다.

따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 스테로이드의 투여; 항염증 약물의 투여; IVIg의 투여; 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받고 있는 피험체에서, 상기 제1의 CIDP 치료에 더하여, CIDP의 증상을 효과적으로 경감시키기 위하여 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 상당히 감소시키기에 효과적인 양의 IFN-β 치료제의 투여량을 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 만성 탈수초성 신경병증, 예를 들어 CIDP를 치료하는 방법을 제공한다.

면역억제제는 현재 CIDP를 치료하기 위해 이용된다. 예를 들어, 스테로이드는 CIDP에서 유익한 것으로 밝혀졌다. 바람직한 반응은 대개 4주 이내에 나타난다. 흔히 이용되는 한 가지 스테로이드는 프레드니손(델타손, 아라손, 메티코르텐)이다. 프레드니손은 염증과 면역 반응을 억제하는 경구용 코르티코스테로이드이며 CIDP에서 염증 부위에서 매개자 기능을 바꾸고 면역 반응을 억제하는 것으로 생각된다. 투여량은 변하지만, 대부분의 성인 환자는 0.5∼1 mg/kg/일 PO로(즉, 입으로) 처음에(약 30∼40 내지 60∼80 mg/일) 시작된다. 개선은 다음 2 개월 내에 기대할 수 있다. 나중에, 투여는 격일 치료로 전환되고 이어서 환자를 완화 상태로 유지하도록 하는 최저의 유효량으로 적정될 수 있다.

CIDP를 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 다른 면역억제제는 퓨린의 대사를 감소시키며 또한 DNA와 RNA 합성을 억제할 수 있는 퓨린 유사체인 아자티오프린(이뮤란)이다. 아자티오프린은 면역-매개된 신경 손상을 억제하여 CIDP의 장애와 증상을 감소시키는 것으로 생각된다. 초기 투여량은 약 50 mg PO qd(입으로, 매일)이며, 대개 2∼3 mg/kg/일 PO의 총 일일 투여량으로 점점 증가된다. 아자티오프린의 치료적 투여량은 각 환자를 위해 결정하기 어렵지만, 일부 증거는 적혈구 세포 부피(MCV)의 증가가 치료적 투여를 나타냄을 제안한다. 치료 반응은 뚜렷해지는데 6 개월 넘게 걸릴 수도 있다.

CIDP 치료를 위해 현재 이용되는 또 다른 면역억제제는 면역억제제 마이코페놀산을 위한 전구약물인 마이코페놀레이트(셀셉트)이다. 마이코페놀레이트는 효소 이노신 모노포스페이트 디하이드로게나제를 억제하여 림프구 퓨린 합성을 억제하는 것으로 생각된다. 성인을 위한 일반적인 투여량은 250 mg∼3 g/일이며, 임상 효과에 따라 투여량이 조절된다.

11개의 아미노산으로 구성된 고리형 폴리펩티드인 사이클로스포린(산디문, 네오랄) 또한 CIDP 치료에 이용될 수 있다. 사이클로스포린은 T 세포 활성화의 첫 번째 단계를 억제하며 투여는 체액성 면역에 영향을 주지 않는다. T 세포를 억제함으로써, 사이클로스포린은 염증/면역 반응의 부위에서 세포-매개된 신경 손상을 억제할 수 있는 것으로 생각된다. 대개, 처음에는 5 mg/kg/일 PO 하루에 두번으로 분할(입으로, 하루 두번)되어 투여되고 투여량은 반응에 따라 증가된다. CIDP를 위한 정의된 바람직한 저점 수준이 구체적으로 확인되지 않았으며, 면역 질환을 위해 이용된 일반적인 저점 수준은 100∼250 사이임에도 불구하고, 저점 및 정점 수준을 모니터하여 효능을 등록하고 독성을 피해야 한다.

다른 면역억제제는 세포-주기 단계-비특이적 항종양 제제이며 알킬화제로 작용하는 면역억제제인 사이클로포스파미드(시톡산)이다. 투여량은 대개 1∼2 mg/kg/d PO이다.

CIDP 환자의 치료를 위한 다른 표준 방법은 정맥을 통한 면역글로불린(IVIg) 투여이다. 정맥 주입 용액은 일반적으로 주로 이종성 사람 IgG 및 소량의 IgA와 IgM으로 구성된다. 일부 구체예에서, IV 용액은 항체에 의해 인식되는 에피토프에 대하여 이질성이며, 예를 들어, 특정 항원으로 동물을 면역시켜 얻어지는 항체의 제제가 아니다. 그것의 제안된 작용 기작은 IVIg가 CIDP에서 말초 신경에 손상을 야기하는 면역 인자를 중화시킬 항체의 임의 세트를 함유한다는 생각에 기초한다. 평균적으로, 10일째에 개선이 나타나고 42일까지 계속된다. 혈청 반감기는 약 21-29일이다. 환자는 대개 완화를 유지하기 위하여 또는 재발 치료를 위하여 매 수주 또는 수 개월의 반복 치료를 요한다. 일반적인 투여량은 0.4∼2 g/kg이며, 대개 400 mg/kg씩 최대 하루 5회로 나누어 투여된다. 치료는 더 높은 투여량, 예를 들어 2 g/kg으로 시작하여 나중에 더 낮은 투여량, 예를 들어 0.5∼1 g/kg으로 감소될 수 있다. 이들 투여량의 투여 빈도는 다양하며, 대부분의 환자는 매 2∼8주마다 투여된다. 예를 들어, IVIG는 수일에 걸쳐 1∼4주마다 1∼2 g/kg까지 0.4 g/kg으로 투여될 수 있다.

CIDP의 다른 승인된 치료 방법은 혈장분리반출술(또는 혈장 교환)이다. 이 치료는 말초 신경의 면역-매개 손상을 일으키는 항체 및 보체 성분을 제거하는 것으로 생각된다. 혈장은 투석과 유사한 방법을 통해 혈액으로부터 제거된다. 그 효능은 CIDP 치료에서 IVIg의 효능과 비슷한 것으로 보인다. 일반적으로 환자는 처음 2주 동안은 주 3회의 혈장 교환을 받으며, 그 후에는 치료의 수와 빈도는 임상적 반응에 의해 결정된다.

따라서, IFN-β 치료제는 면역억제제, 예를 들어 스테로이드의 투여; IVIg의 투여 및/또는 혈장분리반출술과 함께 피험체에 투여될 수 있다. IFN-β 치료제와 부가적 약물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되면, 동일한 날 또는 다른 날에 투여될 수 있다. IFN-β 치료가 혈장분리반출술과 결합되면, IFN-β 치료제는 IFN-β 치료제가 혈장분리반출술동안 제거되지 않도록 혈장분리반출술 후에 투여될 수 있다. IFN-β 치료가 IVIg 요법과 결합되면, 상기 두 가지 상이한 약물의 투여는 바람직하게는 적어도 한 시간 또는 두 시간에 의해 분리된다.

다른 구체예에서, IFN-β 치료제는 상기한 것과 같은 다른 CIDP 요법으로 치료되지 않는 피험체에 투여된다. 다른 상황에선, IFN-β 치료제는 다른 CIDP 용법으로 치료되지 않는 피험체에 투여된다. 예를 들어, IFN-β 치료제는 하나 이상의 다른 요법에 반응성인 피험체에 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, IFN-β 치료제는 이전에 CIDP 치료를 전혀 받은 적이 없는 피험체에 투여된다. 피험체가 이전에 CIDP 치료를 받은 적이 없는 경우, IFN-β 치료제를 이용한 치료 방법은 먼저 피험체를 CIDP를 갖는지 CIDP를 일으킬 가능성이 있는지를 확인하는 것을 포함할 수 있다.

치료는 또한 하기와 같을 수 있다: IFN-β 치료제는 IVIG와 같은 제1의 CIDP 치료를 받는 사람에게 투여되고, 조합 치료가 일정 시간 동안 계속되고, 이어서 제1의 CIDP 치료가 중단된다. 제1의 CIDP 치료는 제1의 CIDP 치료의 투여량 및/또는 빈도를 감소시키는 것과 같이 점진적으로 중단될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 피험체는 2주 1회 또는 4주 1회 IVIG를 받는다. 피험체는 이어서 IVIG 치료와 함께, IFN 치료를 IFN-β 치료제의 주 1회 또는 주 2회 투여와 같이 받는다. 결합 치료는 약 10∼20주, 예를 들어 약 16주 동안 계속될 수 있다. 결합 치료동안, 적어도 약 1∼3 시간, 예를 들어 적어도 약 2 시간 정도의 간격으로 IVIg와 IFN-β 치료제의 투여를 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 약 16주 후, 제1의 CIDP 치료는 중단되거나 감소된다. 예를 들어, 피험체는 이어서 더 적은 투여량의 IVIg 또는 적은 빈도의 투여를 받을 수 있다. 제1의 CIDP 치료의 중단 또는 감소 후에 나아지지 않는 개인에서는, 제1의 CIDP 치료는 재개되고 IFN-β 치료제와의 조합 치료를 할 수도 있다.

일반적으로, IFN-β 치료제는 임의의 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, IFN-β 치료제는 직접, 예를 들어 국소적으로, 조직 좌에의 주사 또는 국소 투여에 의해 또는 전신적으로, 예를 들어 비경구 또는 경구로 개인에게 제공될 수 있다. 국소 투여는 예를 들어 영향을 받은 근육내로 직접 투여하는 것을 포함한다. 비경구 투여는 에어로졸, 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 복강내, 흉골내, 포막내, 간내, 병변내 및 두개골내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 투여는 IFN-β 치료제 환괴의 주기적 주사에 의할 수도 있고, 또는 외부의(예, i.v. 백) 또는 내부의(예, 생물부식성 이식체 또는 이식된 펌프) 저장소로부터 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 보다 연속적으로 이루어질 수도 있다.

IFN-β 치료제는 바람직하게는 약학적 허용 담체를 함유한 멸균 약학 조성물로 투여된다. 여기서 이용될 때, 용어 "담체"는 허용가능한 어쥬번트와 비히클을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용될 수 있는 약학적 허용 담체는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 사람 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 완충액 물질, 글리신, 솔브산, 포타슘 솔베이트, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 프로라민 설페이트와 같은 염 또는 전해질, 디소듐 하이드로젠 포스페이트, 포타슘 하이드로젠 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 모 지방, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 또는 그 조합을 포함한다. IFN-β 치료제는 예를 들어 IFN-β 치료제 안정화를 위하여 하나 이상의 다른 단백질을 포함하는 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, IFN-β 치료제는 알부민과 혼합될 수 있다.

IFN-β 치료제가 비경구로 제공되는 경우, 상기 제제는 바람직하게는 수용액의 일부를 구성한다. 상기 용액은 피험체에 원하는 IFN-β 치료제를 전달하는 것에 더하여, 용액이 피험체의 전해질 및/또는 부피 밸런스에 나쁜 영향을 주지 않도록 생리학적으로 허용성이다. IFN-β 치료제를 위한 수성 매질은 따라서 정상의 생리적 염수(예, 0.9% NaCl, 0.15 M, pH 7∼7.4)를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 유용한 용액은, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990]에 개시된 대로, 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

약학 조성물은 멸균 주사용 제제 형태일 수 있으며, 예를 들어 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이 현탁액은 적절한 분산 또는 습윤 제제 및 현탁 제제를 이용하여 공지된 기술에 따라 조제될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성 비경구 허용성 희석제 또는 용매 예를 들어 1,3-부탄디올중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매중에는 물, 링거 용액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 주로 용매 또는 현탁 매질로서 이용된다. 이 목적을 위하여, 합성 모노 또는 디-글리세라이드를 비롯한 임의의 독하지 않은 고정 오일이 이용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산 및 그 글리세라이드 유도체가 주사제제의 제조에 유용하며, 올리브 오일 또는 피마자유와 같은 천연 약학적 허용 오일이 특히 그들의 폴리옥시에틸화 버젼으로 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다.

IFN-β 치료제를 포함한 약학 조성물은 또한 경구로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 이들은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 경구 허용성 투여 형태로 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우, 흔히 이용되는 담체는 락토스와 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제 또한 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 락토스와 건조 옥수수 전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요할 경우, 활성 성분은 유화제 및 현탁제와 배합된다. 필요하면, 일부 감미제, 향미제 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다. 국소적 경피 패치 또한 이용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 분무기, 건조 분말 흡입기 또는 계량된 투여량 흡입기의 사용을 통해 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 그러한 조성물은 약학 제제 분야에서 공지된 기법에 따라 제조되며 벤질 알콜 또는 다른 적합한 방부제, 생물이용성을 증가시키는 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 다른 통상의 가용화 또는 분산 제제를 이용하여, 염수중의 용액으로서 제조될 수 있다.

IFN-β 치료제는 작은 단일층 소낭, 큰 단일층 소낭 및 다층 소낭과 같은 리포좀 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민, 또는 포스파티딜콜린을 함유한 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 일부 구체에에서, 미국 특허 5,262,564호에 개시된 대로, 지질 성분의 필름이 약물의 수용액으로 수화되어 약물을 캡슐화하는 지질층을 형성한다. 리포좀은 그들을 특정 세포 또는 조직으로 보내는 표면 분자를 함유할 수 있다. 그러한 변형 리포좀은 공지 방법에 따라 제조될 수 있다.

IFN-β 또는 그 변이체는 또한 표적화가능한 약물 담체로서의 가용성 중합체에 결합될 수 있다. 그러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리하이드록시에틸아스파나미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드폴리리신을 포함할 수 있다. IFN-β 또는 그 변이체는 또한 예를 들어 수용체 단백질 및 알부민과 같은 단백질에 결합될 수 있다. 더욱이, IFN-β 또는 그 변이체는 약물의 서방성 방출을 이루는 데 유용한 생분해성 중합체 부류, 예를 들어 폴리락트산, 폴리입실론 카프로락톤, 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로젤의 교차결합되거나 양쪽성인 블록 공중합체에 결합될 수 있다.

IFN-β 치료제는 또한 안정화제를 포함하는 액체 조성물로서 제공될 수 있다. 안정화제는 IFN-β 치료제의 중량 기준으로 0.3%∼5%의 양으로 존재할 수 있다. 안정화제는 산성 아미노산(예, 글루탐산 및 아스파르트산) 또는 아르기닌 또는 글리신과 같은 아미노산일 수 있다. 만일 안정화제가 아르기닌-HCl이면, 그 농도는 바람직하게는 0.5%(w/v)∼5%이고 가장 바람직하게는 3.13%(150 mM 아르기닌-HCl에 해당)이다. 만일 안정화제가 글리신이면, 그 농도는 바람직하게는 0.5%(w/v)∼2.0%이고 가장 바람직하게는 0.52%(66.7 mM∼266.4 mM, 그리고 가장 바람직하게는 70 mM에 해당)이다. 만일 안정화제가 글루탐산이면, 그 농도는 바람직하게는 100 mM∼200 mM이고, 가장 바람직하게는 170 mM이다(1.47%∼2.94% 범위의 w/v 퍼센트 및 가장 바람직하게는 2.5%에 해당). 일부 구체예에서, 액체 제제중의 IFN-β 치료제의 농도 범위는 약 30 ㎍/ml∼약 250 ㎍/ml이며, 예를 들어 48∼78 ㎍/ml, 예를 들어 약 60 ㎍/ml이다. 이 양은 예를 들어 특정 IFN-β 치료제의 비(specific) 활성에 의존할 것이다. 일반적으로, 투여량의 범위는 투여당 약 1백만 국제 단위(MIU)∼약 50 MIU, 예를 들어 약 3, 6, 9 또는 12 MIU일 것이다.

한 구체예에서, 아미노산 안정화제는 아르기닌이며, 이것은 약 pH 5.0 용액에서 산성 형태(아르기닌-HCl)로 포함된다. 따라서, 다가이온성 부형제가 이 예에서 바람직하다. 액체 조성물은 용기, 예를 들어 시린지내에 함유될 수 있으며, 이때 용기는 IFN-β에 내성인 물질, 예를 들어 실리콘 또는 폴리테트라플루오로에틸렌으로 코팅된, 상기 액체와 접촉하는 표면을 갖는다. 바람직한 조성물은 4.0∼7.2 사이의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 안정화제를 포함하는 용액은 제조 및 저장동안 동결되지 않았고/않았거나 산소 함유 가스에 노출되지 않았다.

약 4.5∼약 5.5, 예를 들어 5.0과 같은 약 4.0∼약 7.2의 범위의 pH를 유지하기 위해 본 발명에 이용될 유기산 및 인산염 완충액은 WO 98/28007에 개시된 대로, 시트레이트 완충액(예, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물, 등), 석시네이트 완충액(예, 숙신산-모노소듐 석시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 숙신산-디소듐 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충액, 푸마레이트 완충액, 글루코네이트 완충액, 옥살레이트 완충액, 락테이트 완충액, 포스페이트 완충액 및 아세테이트 완충액과 같은 통상의 유기산과 그 염의 완충액일 수 있다.

WO 98/38007에 개시된 대로 제조될 수 있는 예시적인 제제는 하기를 포함한다:

(i) 이전에 동결된적이 없으며, IFN-β 및 (a) 150 mM 아르기닌-HCl; (b) 100 mM 소듐 클로라이드 및 70 mM 글리신; (c) 150 mM 아르기닌-HCl 및 15 mg/ml 사람 혈청 알부민; (d) 150 mM 아르기닌-HCl 및 0.1% 플루로닉 F-68; (e) 140 mM 소듐 클로라이드; (f) 140 mM 소듐 클로라이드 및 15 mg/ml 사람 혈청 알부민; 및 (g) 140 mM 소듐 클로라이드 및 0.1% 플루로닉 F-68로부터 선택된 성분 하나 이상을 포함하는 pH 5.0의 20 mM 아세테이트 완충액;

(ii) IFN-β 또는 그 변이체, 170 mM L-글루탐산 및 150 mM 소듐 하이드록사이드를 포함하며 바람직하게는 이전에 동결되지 않았던 pH 5.0의 액체; 및

(iii) 이전에 동결된적이 없으며, IFN-β 및 (a) 140 mM 아르기닌-HCl; (b) 100 mM 소듐 클로라이드 및 70 mM 글리신으로부터 선택된 성분 하나 이상을 포함하는 pH 7.2의 20 mM 포스페이트 완충액.

바람직한 조성물은 또한 폴리솔베이트, 예를 들어 0.005% w/v 폴리솔베이트 20을 포함한다.

IFN-β 또는 그 변이체는 또한 예를 들어 미국 특허 6,372,207호에 개시된 대로, 수용체의 IFN-결합 쇄와 같은 가용성 IFN 타입 I 수용체 또는 그 일부와 함께 투여될 수 있다. 상기 특허에서 개시된 대로, 수용체의 IFN 결합 쇄와의 복합체 형태인 IFN 타입 I의 투여는 IFN의 안정성을 개선하고 IFN의 성능을 증가시킨다. 상기 복합체는 비공유적 복합체 또는 공유적 복합체일 수 있다.

IFN-β는 피험체에 투여되기 전에 가용화되거나 현탁되거나 그렇지 않을 수 있는 건조 분말 형태로 조제될 수 있다. 특히, 중합체, 예 PEG에 접합된 IFN-β가 건조 형태로 특히 안정함이 나타났다(예, WO 00/23114호 및 PCT/US/95/06008호 참고).

조제된 조성물은 치료적으로 유효한 양의 IFN-β 치료제를 함유할 수 있어, 즉 근육 기능의 영구한 또는 점진적인 손실을 방지, 억제, 지연 또는 완화시키거나 다르게는 치료 효능을 제공하기에 충분한 시간 동안 근육 조직 또는 다른 적절한 조직에 IFN-β 치료제의 적절한 농도를 제공하는 양의 IFN-β 치료제를 함유할 수 있다. 당업자라면 이해할 것처럼, 치료 조성물내의 IFN-β 치료제의 농도는, 선택된 IFN-β 치료제의 생물학적 효능, 이용된 IFN-β 치료제의 화학적 특성(예, 소수성), IFN-β 치료 부형제의 제제, 투여 경로, 및 IFN-β 치료제가 직접 조직내로 투여될 지 또는 전신성으로 투여될지와 같은 고려되는 치료를 비롯한 많은 인자에 따라 변할 수 있다. 투여될 바람직한 투여량은 또한 피험체의 조직의 상태, 근육 손실의 정도 및 특정 피험체의 전체적인 건강 상태와 같은 변수들에 의존할 수 있다. 또한 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강, 환자의 분비의 식이 속도 및 부작용에 대한 피험체의 민감성 및 IFN-β 치료제가 다른 약물과 동시투여되는지 여부에 의존할 수 있다. 평균 지식의 의사 또는 수의사는 상태의 진전을 방지, 중지 또는 중단시키는 데 필요한 IFN-β 치료제의 효과적인 양을 쉽게 결정하여 처방할 수 있다.

투여량은 연속적으로 또는 매일 투여될 수 있으나, 현재로서는 투여량은 만족스러운 반응이 지속되는 한(예를 들어, 적절한 의학적 마커 및/또는 수명 지수의 질에 의해 질병의 안정화 및/또는 개선에 의해 측정할 때) 주 1회, 2회 또는 3회 투여되는 것이 바람직하다. 덜 빈번한 투여, 예를 들어 월 1회의 투여 또한 이용할 수 있다. 빈번한 주입을 용이하게 하기 위하여, 반영구적인 스텐트(예, 정맥내, 복강내 또는 캡슐내) 이식이 이용될 수 있다.

상기 약학 조성물 중 임의의 것이 활성 성분으로서 0.1∼99%, 1∼70%, 또는 바람직하게는 1∼50%의 IFN-β 치료제를 함유할 수 있다.

임의의 투여 경로를 위하여, 분할 또는 단일 투여를 이용할 수 있다. 예를 들어, IFN-β 치료제는 단일 투여로 매일 또는 매주 투여되거나, 또는 전체 투여량이 두번, 세번 또는 네번의 분할된 투여로 투여될 수 있다.

IFN-β 치료제는 1회 투여량당 약 0.001∼약 100 mg/kg 체중, 예를 들어 약 0.1∼약 50 mg/kg 체중; 약 0.1 mg/kg 체중∼약 20 mg/kg 체중; 또는 약 1 mg/kg 체중∼약 3 mg/kg 체중의 투여량 수준으로 투여될 수 있다. 이들 1회 투여량은 매일, 2일 1회, 3일 1회, 5일 1회, 주 1회, 또는 2주에 1회와 같이 1∼14일마다 1회의 간격으로 투여될 수 있다. 구체적으로 IFN-β 치료제의 비활성에 의존하면서, 약 20∼약 50 ㎍/1회 투여, 예를 들어 약 30 ㎍/1회 투여와 같은, 약 10∼약 100 ㎍/1회 투여 범위의 1회 투여량으로 투여될 수 있다.

국제 단위의 개념에서, IFN-β 치료제는 3∼20 MIU/1회 투여량, 예를 들어 3∼12 MIU 사이와 같은 약 1∼30 MIU/1회 투여량의 1회 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직한 1회 투여량은 1회 투여당 약 3 MIU, 6 MIU 및 12 MIU를 포함한다. 그러한 1회 투여량은 바람직하게는 주 1회 또는 2회 투여된다. 투여량의 최적화는 예를 들어 IFN-β 치료제의 투여 및 이어서 IFN-β 치료제의 순환 또는 국소 농도의 평가에 의해 결정될 수 있다.

일부 구체예에서, IFN-β 치료제는 0.01∼100 ㎍/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.01∼10 ㎍/kg의 IFN-β, 예를 들어 페길화된 IFN-β를 전달하기 위하여 1 주일에 걸쳐 피하 주사에 의해 투여되며, 0.005∼50 ㎍/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.005∼5 ㎍/kg의 두번의 주사를 각각 0 및 72 시간에 투여할 수 있다. 부가적으로는, 비경구 투여를 위한 한 가지 접근법은 미국 특허 3,710,795호에 따라 느린 방출 또는 지속적인 방출 시스템의 이식을 이용하며, 이것은 일정한 수준의 투여가 유지되도록 한다.

바람직하게는 페길화된 IFN-β 치료제를 위해, 본 발명의 경구 투여량은 경구로 약 0.01∼100 ㎍/kg/일, 또는 더욱 바람직하게는 경구로 0.01∼10 ㎍/kg/일범위일 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 0.5∼5000 ㎍, 더욱 바람직하게는 0.5∼500 ㎍의 IFN-β 치료제를 함유한 스코어된 정제 형태로 제공된다. 바람직한 구체예에서, 신경병증, 예를 들어 CIDP를 갖는 피험체는 IFN-β 치료제를 근육내 투여하여 IFN-β 치료제로 치료된다. IFN-β 치료제는 주 1회 투여될 수 있다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, IFN-β 치료제는 약 6 MIU의 투여량으로 주 1회 피험체에 투여된다. 다른 구체예에서, 피험체는 약 6 MIU의 IFN-β 치료제의 주 1회의 투여에 의해 치료되며 이 투여는 반드시 근육내일 필요는 없다.

일부 구체예에서, IFN-β 치료제는 일정 시간 간격 동안 한 가지 투약 계획에 따라 투여되고, 이어서 다른 투약 계획에 따라 투여된다. 예를 들어, 피험체는 2 개월 동안 매주 IFN-β 치료제를 받고 이어서 다음 달에는 주 2회 받을 수 있다. 피험체는 또한 먼저 피하 투여에 의해 치료되고 이어서 근육내 투여에 의해 치료될 수 있다. 다른 투약 계획에서는, 구체적인 투여량, 투여 모드 또는 IFN-β 치료제가 매번 다른 투여를 위해 다른 투여량, 투여 모드 또는 IFN-β 치료제로 바뀐다.

가장 바람직한 구체예에서, IFN-β 치료제는 AVONEX^®이다. AVONEX^®은 하기로 구성되는 동결 분말로 판매된다:

1 ml 1회 투여량당 제제:

30 mcg 인터페론-b-1a (6백만 국제 단위(MIU))

50 mM 소듐 포스페이트

100 mM 소듐 클로라이드

15 mg 사람 혈청 알부민

pH 7.2

AVONEX^® 인터페론의 비활성은 2 X 10⁸ 유닛/mg, 즉, IFN-b-1a 단백질 밀리그램당 200 MU의 항바이러스 활성이다. 환자는 주 1회 1 ml의 근육내 주사에 앞서 멸균수로 상기 분말을 재구성한다. AVONEX^® 은 또한 하기로 구성된 액체 제제로 제조될 수 있다:

0.5 ml 1회 투여량당 제제:

30 mcg(㎍) IFN-b-1a (6백만 국제 단위(MIU))

20 mM 아세테이트 (소듐 아세테이트 및 아세트산)

150 mM 아르기닌 HCl

0.005% w.v 폴리솔베이트 20

주사용 물

pH 4.8

이 제제는 미리 충전된 시린지에 패키지될 수 있다. 환자는 제공된 대로 수작업으로 시린지를 이용하거나 또는 자동주사기와 함께 이용할 수 있다. 투여 스케쥴은 주당 한번 6 MIU(즉, 30 mcg) 근육내 투여이다.

다른 구체예에서, IFN-β는 REBIF^®이며, 이것은 동결 분말 및 액체 제제로 제공된다. 동결 분말은 하기로 구성된다:

2.0 ml 1회 투여량당 제제:

3 MIU의 IFN-b-1a

만니톨

HSA

소듐 아세테이트

pH 5.5

REBIF^® 인터페론의 비특이적 활성은 2.7 X 10⁸ 유닛/mg, 즉, IFN-b-1a 단백질 밀리그램당 270 MU의 항바이러스 활성이다. 환자는 주 3회 피하 주사에 앞서 소듐 클로라이드 용액(0.9% NaCl)로 상기 분말을 재구성한다.

액체 REBIF^®의 제제는 하기와 같다:

0.5 ml 1회 투여량당 제제:

6 또는 12 MIU의 IFN-b-1a

4 또는 2 mg HSA

27.3 mg 만니톨

0.4 mg 소듐 아세테이트

주사용 물

액체 제제는 미리 충전된 시린지에 패키지되며 자동주사기 장치(Rebiject)를 사용하거나 사용하지 않고 피하로 주 3회(6 또는 12 MIU, 각각 66 ㎍/주 또는 132 ㎍/주에 해당) 투여된다.

또 다른 구체예에서, IFN-β는 BETASERON^®(Berlex)이며, 이것은 이. 콜라이에서 생산되는, 시스테인-17이 세린으로 돌연변이된 IFN-β이다. 이 비당화 IFN-β는 둘 다 CHO 세포에서 생산되는 AVONEX^® 또는 REBIF^®보다 덜 강력하다. 1회 투여량은 2일마다 피하 주사하는 경우, 동결 및 액체 제제 둘 다, 250 mcg(8 MIU) 1회 투여량으로 판매된다. BETAFERON^®은 또 다른 시판되는 IFN-β이며, 제조자의 지시에 따라 피하 투여될 수 있다.

IFN-β 치료제 및 선택적으로 다른 요법에 더하여, 피험체는 또한 신경병증 고통의 치료를 위한 의약, 예를 들어 간질약이 제공될 수 있다. 두 가지 가장 자주 이용되는 의약은 가바펜틴(뉴로틴) 및 카르바마제핀(테그레톨)이다. 다르게는, 트리시클릭 항우울증제, 예를 들어 아미트립틸린(엘라빌)이 또한 신경병증 고통의 치료를 위하여 이용될 수 있다.

질병의 과정 및 의약 치료에 대한 그 반응은 임상적 검사 및 실험적 발견이 후속될 수 있다. 본 발명의 요법의 효과는 이전에 개시된 질병의 신호 및 증상이 완화되는 정도 및 인터페론의 일반적인 부작용(즉, 열, 두통, 추위, 근육통, 피로 등과 같은 플루-형 증상 및 우울증, 감각이상, 손상된 농도 등과 같은 중추 신경계 관련 증상)이 제거되거나 실질적으로 감소되는 정도에 의해 결정된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이것은 어떤 식으로도 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 모든 인용된 문헌의 내용(본 출원에 걸쳐 인용된 문헌, 발행된 특허, 공개된 특허 출원을 포함)은 여기서 참고로 통합된다.

본 발명의 실시는 달리 표시되지 않으면, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상의 기법을 이용하며, 이들은 당업계 기술 범위에 속한다. 그러한 기술은 문헌에 완전히 개시된다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis에 의해 편집된 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis 등의 미국 특허 4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.1. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.) ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, VolumesI-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986)를 참고한다.

실시예

실시예 1 : IFN-β 1a를 이용한 CIDP 환자의 치료

IVIg로 치료중인 CIDP 환자를 하기와 같이 IFN-β 1a 치료로 전환한다.

CIDP로 확실히 진단되고 IVIgIVIGIVIg의 2 주에 한번 또는 4 주에 한번 투약 계획으로 치료중인 환자에게 근육내 주사를 통해 IFN-β 1a의 하기 투약 계획 중 하나를 제공한다: 30 mcg (6 MIU)의 AVONEX^® 를 주 1회; 30 mcg (6 MIU)의 AVONEX^® 를 주 2회; 60 mcg (12 MIU)의 AVONEX^® 를 주 1회; 또는 60 mcg (12 MIU)의 AVONEX^®를 주 2회. IVIg와 IFN-β 1a를 동일한 날에 투여할 경우, 투여는 적어도 두 시간 기간에 의해 분리된다. 환자는 16주 동안 이러한 조합을 받을 것이며, 이 기간동안 환자의 질병 상태는 약 4주마다 평가될 것이다. 16주에, IVIg를 중단하고 IFN-β 1a 치료를 앞에서와 같이 동일한 투약 계획을 따라 계속할 것이다.

질병은 환자에서 계속 모니터될 것이다. 환자가 조합 치료에서 더 좋은 상태이면, IVIg 치료가 재개될 것이다. IVIg는 IVIg 투여의 양 또는 빈도를 점차 감소시킴으로써 나중에 감소될 수 있다.

균등물

당업자는 일상적인 실험을 이용하여 여기서 개시된 본 발명의 구체적인 구체예의 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있다. 그러한 균등물은 하기의 청구범위에 포함되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN, INC. SANDROCK, ALFRED <120> THERAPIES FOR CHRONIC INFLAMMATORY DEMYELINATING POLYNEUROPATHY USING INTERFERON-BETA <130> BII-002.25 <140> PCT/US03/30532 <141> 2003-09-26 <150> 60/414,307 <151> 2002-09-27 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (76)..(639) <400> 1 acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60 gttcgtgttg tcaac atg acc aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg 111 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu 1 5 10 ttg tgc ttc tcc act aca gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga 159 Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly 15 20 25 ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa 207 Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln 30 35 40 ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac 255 Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp 45 50 55 60 atc cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac 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aac tga 639 Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 175 180 185 agatctccta gcctgtgcct ctgggactgg acaattgctt caagcattct tcaaccagca 699 gatgctgttt aagtgactga tggctaatgt actgcatatg aaaggacact agaagatttt 759 gaaattttta ttaaattatg agttattttt atttatttaa attttatttt ggaaaataaa 819 ttatttttgg tgcaaaagtc a 840 <210> 2 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 <210> 3 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(501) <400> 3 atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag ctg cag 144 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gag atg ctc cag 192 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc tat cat cag ata aac 288 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 336 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 aca ggt tac ctc cga aac tga 501 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic illustrative oligonucleotide <400> 5 ggcggtggtg gcagc 15 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic illustrative oligonucleotide <400> 7 gacgatgatg acaag 15 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic enterokinase recognition site <400> 8 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic illustrative oligonucleotide <400> 9 agctccggag acgatgatga caag 24 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 10 Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 11 <211> 1257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide construct sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1254) <400> 11 atg cct ggg aag atg gtc gtg atc ctt gga gcc tca aat ata ctt tgg 48 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 ata atg ttt gca gct tct caa gcc atg agc tac aac ttg ctt gga ttc 96 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30 cta caa aga agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg 144 Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu 35 40 45 aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc 192 Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile 50 55 60 cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca 240 Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 ttg acc atc tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa 288 Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln 85 90 95 gat tca tct agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg 336 Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110 gct aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa 384 Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125 aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg 432 Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140 cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag 480 His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 145 150 155 160 gag tac agt cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg 528 Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg 165 170 175 aac ttt tac ttc att aac aga ctt aca tgt tac ctc cga aac gtc gac 576 Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Val Asp 180 185 190 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 624 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 195 200 205 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 672 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 210 215 220 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 720 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 225 230 235 240 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 768 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 245 250 255 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 816 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 260 265 270 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 864 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 275 280 285 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 912 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 290 295 300 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 960 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 305 310 315 320 acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg 1008 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 325 330 335 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1056 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 340 345 350 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1104 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 355 360 365 ttg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1152 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 370 375 380 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1200 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 385 390 395 400 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccc 1248 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 405 410 415 ggg aaa tga 1257 Gly Lys <210> 12 <211> 418 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fusion protein sequence <400> 12 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30 Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu 35 40 45 Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile 50 55 60 Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln 85 90 95 Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110 Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125 Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140 His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 145 150 155 160 Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg 165 170 175 Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Val Asp 180 185 190 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 195 200 205 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 210 215 220 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 225 230 235 240 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 245 250 255 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 260 265 270 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 275 280 285 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 290 295 300 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 305 310 315 320 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 325 330 335 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 340 345 350 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 355 360 365 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 370 375 380 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 385 390 395 400 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 405 410 415 Gly Lys <210> 13 <211> 1272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide construct sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1269) <400> 13 atg cct ggg aag atg gtc gtg atc ctt gga gcc tca aat ata ctt tgg 48 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 ata atg ttt gca gct tct caa gcc atg agc tac aac ttg ctt gga ttc 96 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30 cta caa aga agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg 144 Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu 35 40 45 aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc 192 Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile 50 55 60 cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca 240 Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 ttg acc atc tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa 288 Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln 85 90 95 gat tca tct agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg 336 Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110 gct aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa 384 Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125 aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg 432 Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140 cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag 480 His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 145 150 155 160 gag tac agt cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg 528 Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg 165 170 175 aac ttt tac ttc att aac aga ctt aca tgt tac ctc cga aac ggc ggt 576 Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Gly Gly 180 185 190 ggt ggc agc gtc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 624 Gly Gly Ser Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 195 200 205 gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 672 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 210 215 220 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 720 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 225 230 235 240 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 768 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 245 250 255 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac 816 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 260 265 270 aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 864 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 275 280 285 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 912 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 290 295 300 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 960 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 305 310 315 320 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag 1008 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 325 330 335 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1056 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 340 345 350 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 1104 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 355 360 365 acc acg cct ccc gtg ttg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1152 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 370 375 380 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca 1200 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 385 390 395 400 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc 1248 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 405 410 415 ctc tcc ctg tct ccc ggg aaa tga 1272 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 <210> 14 <211> 423 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fusion protein sequence <400> 14 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30 Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu 35 40 45 Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile 50 55 60 Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln 85 90 95 Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110 Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125 Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140 His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 145 150 155 160 Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg 165 170 175 Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 195 200 205 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 210 215 220 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 225 230 235 240 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 245 250 255 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 260 265 270 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 275 280 285 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 290 295 300 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 305 310 315 320 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 325 330 335 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 340 345 350 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 355 360 365 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 370 375 380 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 385 390 395 400 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 405 410 415 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 catcatcatc atcatcat 18 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6X-His tag <400> 16 His His His His His His 1 5 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 tccgggggcc atcatcatca tcatcat 27 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ser Gly Gly His His His His His His 1 5 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 tccgggggcc atcatcatca tcatcatagc tccggagacg atgatgacaa g 51 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ser Gly Gly His His His His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (74)

1. 만성 탈수초성 운동 신경병증의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 IFN-β 치료제의 용도.
2. 제1항에 있어서, IFN-β 치료제는 비피하 비경구 경로를 통해 투여되는 것인 용도.
3. 제2항에 있어서, IFN-β 치료제는 근육내로 투여되는 것인 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 탈수초성 운동 신경병증은 만성 염증성 탈수초성 신경병증(CIDP)인 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 성숙 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 첫 번째 메티오닌이 없는 것인 용도.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β는 사람 IFN-β인 용도.
8. 제7항에 있어서, IFN-β는 서열 번호 4의 전길이 성숙 사람 IFN-β와 약 95% 이상 동일한 것인 용도.
9. 제8항에 있어서, IFN-β는 서열 번호 4를 포함하는 것인 용도.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β는 당화되는 것인 용도.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β는 당화되지 않는 것인 용도.
12. 제7항에 있어서, IFN-β는 IFN-β-1a인 용도.
13. 제7항에 있어서, IFN-β는 IFN-β-1b인 용도.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
15. 제14항에 있어서, 면역글로불린 분자는 사람 면역글로불린 분자인 용도.
16. 제15항에 있어서, 면역글로불린 분자는 IgG1의 중쇄인 용도.
17. 제16항에 있어서, IFN-β는 서열 번호 14를 포함하는 것인 용도.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 페길화된 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 안정화제를 포함하는 것인 용도.
20. 제19항에 있어서, 안정화제는 산성 아미노산인 용도.
21. 제20항에 있어서, 안정화제는 아르기닌인 용도.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 pH가 약 4.0∼7.2 사이인 용도.
23. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 정맥내로(i.v.) 투여되는 것인 용도.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제의 수회 투여량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 용도.
25. 제24항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 6 MIU의 투여량으로 주 1회 투여되는 것인 용도.
26. 제24항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 6 MIU의 투여량으로 주 2회 투여되는 것인 용도.
27. 제24항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 12 MIU의 투여량으로 주 1회 투여되는 것인 용도.
28. 제24항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 12 MIU의 투여량으로 주 2회 투여되는 것인 용도.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 사람인 용도.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 탈수초성 신경병증에 대한 다른 치료에 내성이 있는 것으로 사전에 확인되지 않은 피험체에 투여되는 의약의 제조에 사용되는 것인 용도.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 면역억제제 또는 혈장분리반출술을 포함하는 조합 치료로 투여되는 것인 용도.
32. 제30항에 있어서, 의약은 스테로이드, 아조티오프린, 사이클로스포린, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트로 구성되는 군에서 선택되는 면역억제제를 포함하는 조합 치료로 투여되는 것인 용도.
33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 제2의 CIDP 치료를 포함하는 조합 치료로 투여되며, IFN-β 치료제의 투여는 비피하 비경구 경로를 통해 이루어지는 것인 용도.
34. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 제2의 CIDP 치료를 포함하는 조합 치료로 투여되며, IFN-β 치료제의 투여는 주 1회 이루어지는 것인 용도.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 제2의 CIDP 치료는 IVIg의 투여, 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
36. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 만성 탈수초성 운동 신경병증에 대한 다른 치료로 치료중인 피험체에 투여되며, 상기 치료는 다른 치료를 단계적으로 중단하는 것을 추가로 포함하는 것인 용도.
37. IFN-β 치료제의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 만성 탈수초성 운동 신경병증의 치료 방법.
38. 제37항에 있어서, IFN-β 치료제는 비피하 비경구 경로를 통해 투여하는 것인 방법.
39. 제37항에 있어서, IFN-β 치료제는 근육내로 투여하는 것인 방법.
40. 제37항에 있어서, 만성 탈수초성 운동 신경병증은 만성 염증성 탈수초성 신경병증(CIDP)인 방법.
41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 성숙 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 첫 번째 메티오닌이 없는 것인 방법.
43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β는 사람 IFN-β인 방법.
44. 제43항에 있어서, IFN-β는 서열 번호 4의 전길이 성숙 사람 IFN-β와 약 95% 이상 동일한 것인 방법.
45. 제44항에 있어서, IFN-β는 서열 번호 4를 포함하는 것인 방법.
46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β는 당화되는 것인 방법.
47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β는 당화되지 않는 것인 방법.
48. 제43항에 있어서, IFN-β는 IFN-β-1a인 방법.
49. 제43항에 있어서, IFN-β는 IFN-β-1b인 방법.
50. 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 면역글로불린 분자는 사람 면역글로불린 분자인 방법.
52. 제51항에 있어서, 면역글로불린 분자는 IgG1의 중쇄인 방법.
53. 제52항에 있어서, IFN-β는 서열 번호 14를 포함하는 것인 방법.
54. 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 페길화된 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
55. 제37항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 안정화제를 포함하는 것인 방법.
56. 제55항에 있어서, 안정화제는 산성 아미노산인 방법.
57. 제56항에 있어서, 안정화제는 아르기닌인 방법.
58. 제37항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 pH가 약 4.0∼7.2 사이인 방법.
59. 제37항, 제38항 및 40항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제는 정맥내로(i.v.) 투여하는 것인 방법.
60. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제의 수회 투여량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
61. 제60항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 6 MIU의 투여량으로 주 1회 투여하는 것인 방법.
62. 제60항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 6 MIU의 투여량으로 주 2회 투여하는 것인 방법.
63. 제60항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 12 MIU의 투여량으로 주 1회 투여하는 것인 방법.
64. 제60항에 있어서, IFN-β 치료제는 약 12 MIU의 투여량으로 주 2회 투여하는 것인 방법.
65. 제37항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 사람인 방법.
66. CIDP를 가진 피험체에 약학적 유효량의 IFN-β 치료제를 투여하고, 추가로 상기 피험체에 면역억제제를 투여하거나 상기 피험체에 혈장분리반출술을 실시하는 것을 포함하는, CIDP의 치료 방법.
67. 제66항에 있어서, 스테로이드, 아조티오프린, 사이클로스포린, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트로 구성되는 군에서 선택되는 면역억제제를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
68. 제2의 CIDP 치료와 함께 약학적 유효량의 IFN-β 치료제를 CIDP를 갖는 피험체에 투여하는 것을 포함하며, IFN-β 치료제의 투여는 비피하 비경구 경로를 통해 이루어지는 것인 CIDP의 치료 방법.
69. 제68항에 있어서, 제2의 CIDP 치료는 IVIg의 투여, 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
70. 제2의 CIDP 치료와 함께 약학적 유효량의 IFN-β 치료제를 CIDP를 갖는 피험체에 투여하는 것을 포함하며, IFN-β 치료제의 투여는 주 1회 이루어지는 것인 CIDP의 치료 방법.
71. 제70항에 있어서, 제2의 CIDP 치료는 IVIg의 투여, 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
72. 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여, IVIG의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받고 있는 피험체에서 CIDP를 치료하는 방법으로서, 제1의 CIDP 치료에 더하여, 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 크게 감소시키는 데 유효한 양의 IFN-β 치료제 투여량을 피험체에 투여하여 CIDP의 증상을 효과적으로 경감시키는 것을 포함하며, 이때 IFN-β 치료제의 투여는 비피하 비경구 경로를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
73. 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여, IVIG의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받고 있는 피험체에서 CIDP를 치료하는 방법으로서, 제1의 CIDP 치료에 더하여, 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 크게 감소시키는 데 유효한 양의 IFN-β 치료제 투여량을 주 1회 피험체에 투여하여 CIDP의 증상을 효과적으로 경감시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
74. 스테로이드의 투여, 항염증제의 투여 및 혈장분리반출술로 구성되는 군에서 선택되는 제1의 CIDP 치료를 받고 있는 피험체에서 CIDP를 치료하는 방법으로서, 제1의 CIDP 치료에 더하여, 제1의 CIDP 치료의 투여량 또는 빈도를 크게 감소시키는 데 유효한 양의 IFN-β 치료제 투여량을 피험체에 투여하여 CIDP의 증상을 효과적으로 경감시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.