KR20010085932A - 인터페론-베타 융합 단백질 및 용도 - Google Patents

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Abstract

융합 폴리펩티드가 글리코실화된 인터페론-베타(X)의 아미노산 서열을 포함하는 X-Y-Z 아민노산 서열을 보유한다. 여기서 Y는 선택적 링커 분절이고, Z는 글리코실화된 인터페론-베타이외의 폴리펩티드의 일부를 적어도 포함하는 폴리펩티드이다. X는 인간 인터페론-베타-1a인 것이 바람직하다. 인터페론-베타-1a의 돌연변이가 또한 설명된다.

Description

인터페론-베타 융합 단백질 및 용도{INTERFERON-BETA FUSION PROTEINS AND USES}
목적하는 용도를 위하여 상기 단백질 물질의 유용성을 제한하는 주된 요인은 비경구적으로 투여되는 경우 단시간내 체내로부터 제거된다는 점이다. 이것은 신장내 여과와 같이 단백질 제거를 위한 통상적 경로를 사용한 클리어란스(clearance) 또는 프로테아제에 의한 대사의 결과로서 생성될 수 있다. 단백질 투여의 상기 경로와 관련된 문제는 약학 산업에서 공지되었고, 다양한 방법이 상기 문제를 해결하기 위하여 사용되었다.
투여 및 생체-동화를 향상시키기 위한 임상적 작용 및 노력의 초점이 된 펩티드 족은 인터페론이다. 인터페론은 다양한 임상적 질병에서 시험되었다. 이 족의 한 일원인 인간 인터페론 베타의 용도는 다발성 경화증의 치료에서 가장 잘 수립된다. 재조합 인터페론 베타의 2가지 형태는 상기 질병의 치료에 대하여 유럽 및 미국에서 최근에 허가받았다. 제1 형태는 인터페론-베타-1a(메사추세츠, 캠브리지의 바이오겐, 인크.에서 상품명 AVONEX, mfg.로 시판)이고 본원에서 "인터페론-베타-1a" 또는 "IFN-베타-1a" 또는 "IFN-β-1a" 또는 "인터페론-β-1a"과 상호교환적으로 사용된다. 제2 형태는 인터페론-베타-1b(캘리포니아주 리치몬드 버렉스에서 상품명 BETASERON으로 시판)이고, 본원에서 "인터페론-베타-1b"이다. 인터페론 베타-1a는 천연 인간 유전자 서열을 사용한 포유동물 세포에서 생성되며 글리코실화된다. 반면 인터페론 베타-1b는 아미노산 위치 17에서 유전공학적으로 시스테인-대-세린 치환을 포함하는 개질된 인간 유전자 서열을 사용하여 E.coli 박테리아에서 제조되며, 비글리코실화된다.
기존에, 본 발명자 중의 일부는 기능적 분석에서 인터페론-베타-1a 및 인터페론 베타 1b의 상대적 시험관내 성능을 직접 비교하여 인터페론-베타-1a의 특이적 활성이 인터페론-베타-1b의 특이적 활성보다 약 10배 강하다는 것을 보여주었다 (Runkel et al., 1998, Pharma. Res. 15: 641-649). 상기 활성 차이에 대한 구조적 기초를 동정하기 위하여 설계된 연구에서부터 본 발명자는 특이적 활성에 영향을 주는 생성물간의 공지된 구조적 차이 중의 하나로써 글리코실화를 동정하였다. 탄수화물의 영향은 구조를 안정화시키는 기능을 통하여 대략 현시화되었다. 탄수화물의 안정화 효과는 열변성 실험 및 SEC 분석에서 증명된다. 글리코실화의 부족은 또한 열변성에 대한 감도의 증가 및 응집 증가와 관련되어 있다. PNGase F에 의한 인터페론-베타-1a로부터 탄수화물의 효소적 제거는 탈글리코실화된 생성물의 광범위한 침전을 일으킨다.
상기 연구는 인터페론-베타-1a 및 인터페론-베타-1b간 서열이 보존되지만, 이들은 별개의 생화학적 완전체이므로, 인터페론-베타-1b에 대하여 공지된 대부분의 것이 인터페론-베타-1a에 응용될 수 없으며 또한 그 역도 마찬가지임을 나타낸다.
특정 질병의 전신 치료를 위한 폴리펩티드 및 단백질의 용도가 현재 의학 관행에서 잘 허용되고 있다. 이들 물질이 치료에서 하는 역할이 중요하므로, 재조합 DNA 기법에 의한 대량 합성을 위하여 다수의 연구가 이루어지고 있다. 상기의 폴리펩티드 중 다수는 그들이 생물학적 활성을 유도하는데 있어서 특이적이고 매우 강력한 내인성 분자이다.
도1히스티딘 태그된-인터페론-베타 융합(또한 "his IFN-베타" 또는"His 6 -태그"로 불림)의 cDNA 및 추론된 아미노산 서열.his IFN-베타-1a의 전장 DNA 및 단백질 서열이 제시된다. 절단된 VCAM-1 신호 서열이 히스티딘 태그(His6, 위치 4-9)의 상부에 3개 아미노 말단 잔기(SerGlyGly)를 남긴다. 엔테로키나제 링커 서열(AspAspAspAspLys)은 스페이서(spacer)(위치10-12, SerSerGly)에 의하여 히스티딘 태그에서 격리된다. 천연 IFN-베타-1a 단백질 서열은 위치(Met18-Asn183)에 걸쳐있다.
도2인터페론-베타-1a/Fc 융합에 대한 cDNA 및 추론된 아미노산 서열.인간 IFN-베타-1a/마우스 Fc의 전장 DNA 및 단백질이 제시된다. 인간 IFN-베타-1a 단백질 서열은 아미노산 잔기 1-166(DNA 서열 1-498)에 걸쳐 있다. 엔테로키나제 링커 서열은 아미노산 잔기 167-171(DNA 서열 499-513)에 걸쳐있다. 뮤린 IgG2a 중쇄 단백질 서열은 잔기 172-399(DNA 서열 514-437)에 걸쳐 있다.
도3.유형 I 인터페론 수용체 쇄의 세포외 영역, IFNAR2/Fc로 구성된 2량체 융합 단백질에 알라닌으로 치환된 인터페론-베타 돌연변이체의 결합.IFNAR2 수용체에 대한 알라닌 치환된 IFN 돌연변이체(A1-E)의 결합 친화성이 실시예1(서브섹션 D)에서 설명된 바와 같이 결정되었다. 도수 분포도는 야생형 his-IFN-베타(야생형%)에 상대적인 상기 분석에서 결합 친화성을 나타낸다. 야생형% 값을 (야생형 his-IFN-베타의 친화성)/(돌연변이체 IFN-베타의 친화성) X 100 으로 계산하였다. 다중 분석(n=3)에 대한 야생형%(X) 및 실험적 세트에 대한 평균 야생형%(X)가 제시된다. 돌연변이체 A2, AB1, AB2 및 E는 야생형 his-IFN-베타 EC 50(*)보다 500배이상의 농도에서 IFNAR2/Fc에 결합하지 않는다.
도4.다우디 버킷츠 림프종 세포상에 발현되는 유형 I 인터페론 세포 표면 수용체 복합체("IFNAR1/2 복합체")에 알라닌 치환된 인터페론-베타 돌연변이체의 결합.알라닌 치환 돌연변이체의 수용체 결합 성질은 FACS 기초한, 세포 표면 수용체 결합 분석을 사용하여 실시예1에 설명한 바와 같이 결정하였다(서브섹션 D). 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(야생형%)에 상대적 상기 분석에 이것의 수용체 결합 친화성을 제시한다. 각 돌연변이체에 대한 야생형% 값을 (야생형 his-IFN-베타의 친화성)/(돌연변이체 IFN-베타의 친화성) X 100으로 계산하였다. 도수분포도하 다중 분석에서 야생형%(O) 및 실험적 세트에 대한 평균 야생형%(X) 값이 제시된다.
도5.알라닌 치환된 인터페론-베타 돌연변이체의 항바이러스 활성
알라닌 치환 돌연변이체(A1-E)의 항바이러스 활성은 실시예1에 설명된 바와 같이(서브섹션 E) EMC 바이러스로 공격된 인간 A549 세포상에서 결정되었다. 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(야생형%)에 비하여 상기 분석에서 이들의 활성을 제시한다. 야생형%은 돌연변이체 IFN-베타(50% cpe)의 농도/야생형 his-IFN-베타 (50%cpe)의 야생형의 농도 X100의 역으로 계산되었다. 다중 분석에 대한 %야생형(O) 및 실험적 데이타 세트에 대한 평균(X)이 제시된다.
도6.알라닌 치환된 인터페론-베타 돌연변이체의 항증식 활성
알라닌 치환 돌연변이체(A1-E)의 항증식 활성을 실시예1(서브 섹션E)에 나타난 다우디 버킷츠 림프종 세포상에서 결정하였다. 도수분포도는 야생형 his-IFN-베타(%야생형)에 비하여 상기 분석에서 이들의 활성을 제시한다. %야생형은 야생형his-IFN-베타 농도(50% 성장 저해)/돌연변이체 IFN-베타 농도(50% 성장 저해) X100 으로 계산하였다. 다중 분석에 대한 %야생형(O) 및 실험적 데이타 세트(X)에 대한 평균이 제시된다.
도7.알라닌 치환된 인터페론-베타 돌연변이체의 상대적 항바이러스 및 항증식 활성.항바이러스(x축) 및 항증식(y축) 분석에서 알라닌 치환 돌연변이체(A1-E)의 상대적 활성이 비교되었다. 도5 및 도6에 제시된 평균 백분율 야생형 his-IFN-베타(%야생형(x))는 상기 비교를 위하여 사용되었다. 활성에서 좌표의 감소/증가를 갖는 상기 돌연변이체는 수직선 매우 가까이 또는 그 위에 떨어질 것이다. 항바이러스 또는 항증식 활성에 부적절한 감소/증가를 갖는 돌연변이체는 대각선(DE1, D, C1)에서 상당히 멀리 떨어질 것이다. 상당함은 사용된 평균 %야생형 값에 고유한 표준 변이를 고려하여 결정하였다.
도8.인터페론-베타-1a/Ig 융합의 항바이러스 활성
X 축상의 표시된 농도에서 인터페론-베타-1a(상품명 AVONEX로 사용) 또는 인터페론-베타-1a/뮤린Ig2a 융합의 활성이 EMC 바이러스로 공격된 인간 폐암(A549) 세포를 사용한 항바이러스 분석에서 측정되었다. 바이러스와 2일 배양한 후, 살아있는 세포를 MTT로 염색하고, 플레이트를 450nm에서 판독하여, 세포 생성률을 반영하는 흡수율을 Y축에 나타낸다. 표준 변이는 에러바로 나타난다. 50% 최대 OD450을 제공하고 50% 바이러스 치사("50% 세포독성 효과")인 인터페론-베타-1a(상품명 AVONEX의 커다란 중간체로서 사용)의 농도는 약 0.4 pM이고 인터페론-베타-1a 융합에 대한 50% 세포독성 효과는 약 0.15 pM이었다.
도9.인터페론-베타-1a/Fc 융합 또는 인터페론-베타-1a로 처리된 마우스의 혈장에서 인터페론-베타 항바이러스 활성의 측정.
마우스를 인터페론-베타-1a(상품명 AVONEX의 커다란 중간체로서 사용)의 50,000 유니트 또는 인터페론-베타-1a/Fc 융합의 50,000 유니트로 정맥내 주사한다. 상기 마우스에서 X 축상에 표시된 바와 같이 인터페론 주사후 다양한 시간에 역-주기 채혈을 통하여 혈액을 얻는다. 각 시간 포인트에서 3 마리 이상의 마우스를 채혈하여 혈장을 제조하고 냉동시켜, 인터페론-베타 활성을 뇌심근염 바이러스로 공격된 인간 폐 암(A549) 세포를 사용하여 항바이러스 분석에서 측정한다. 살아있는 세포를 MTT 용액으로 염색하고, 플레이트를 450nm에서 판독하여, 세포 생성률 및 인터페론-베타 활성을 반영하는 흡수율을 측정한다. 표준 커브는 상품명 AVONEX로서 인터페론-베타-1a를 사용하여 각 플레이트에 대하여 생성되고 각 샘플에서 인터페론-베타 활성의 양을 측정하는 데 사용된다. 각 동물에서의 데이터가 제시된다.
도10. 인간 IFN 베타 및 인간 IgG1Fc(ZL5107)의 직접 융합의 개방 판독 구조의 전장 DNA 및 단백질 서열
도11. 인간 IFN 베타/G4S 링커/인간 IgG1FC(ZL6206)으로 구성된 융합 단백질의 개방 판독 구조의 전장 DNA 및 단백질 서열
본 발명의 요약
본 발명자는 비글리코실화된 형태에 비하여 글리코실화된 인터페론-베타의 장점에 대하여 조사하였다. 더욱 구체적으로, 본 발명자는 인터페론-베타-1b에 비하여 활성이 증가되고 또한 융합 단백질이 아닌 인터페론-베타-1a 형태에 비교하여 일반적으로 활성의 실질적 손실이 없는 융합 단백질의 유익한 성질을 갖는 인터페론-베타-1a 조성물을 개발하였다. 따라서, 상기 방식으로 개질되어 생성물(인터페론-베타 1a 융합 단백질)이 이들의 생물학적 활성의 전부 또는 대부분을 보유한다면, 약동력학 및 약물역학(예, 장기간동안 혈관구조에 체류하는 능력)의 변형으로 인한 조직 분포의 변형 및 반감기의 증가가 발생할 것이다. 상기 제형은 약학계 및 의학계에서 실질적 진보로서, 인터페론이 유용한 다양한 질병, 예를 들면, 다발성 경화증, 섬유증 및 기타 염증성 또는 자가면역 질환, 암, 간염 및 기타 바이러스 질환 및 신생혈관생성에 의하여 특성화되는 질환의 관리에 상당한 기여를 할 것이다. 특히, 장기간 혈관에 체류하는 능력에 의하여 인터페론-베타-1a의 혈관생성 억제 및 잠재적으로는 혈관-뇌 장막의 통과에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 아미노산 서열 X-Y-Z를 갖는 분리형 폴리펩티드에 관한 것이다. 여기서 X는 인터페론 베타의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열 또는 그것의 일부를 갖는 폴리펩티드이고, Y는 선택적 링커(linker) 분절이고; 및 Z는 인터페론 베타 외의 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드이다. 선택적 분절 Y 및 필요한 분절 Z는 인터페론 베타(X)의 N- 또는 C- 말단에 연결될 수 있다. 바람직하게는, X는 인간 인터페론-베타-1a이다. 바람직한 구체예에서, Z는 면역글로블린의 불변부의 적어도 일부이고, IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE에서 선택되는 부류의 면역글로블린에서 유래될 수 있다. 부류가 IgG라면, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 중의 하나에서 선택된다. 인간 IgM 및 IgE의 불변부는 4개의 불변부(CH1, (힌지), CH2, CH3 및 CH4)를 포함하며, 인간 IgG, IgA 및 IgD의 불변부는 3개의 불변부(CH1, (힌지), CH2 및 CH3)를 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 융합 단백질에서 불변부는 적어도 힌지, CH2, CH3 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 분절 Z는 면역글로블린-유사 영역을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 일부이다. 상기 기타 폴리펩티드의 예는 CD1, CD2, CD4 및 부류 I 및 부류 II 주요 조직적합성 항원의 일원을 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예는 인터페론 베타의 아미노산 서열 또는 이것의 일부로 구성된 아미노 말단 영역을 갖고 인터페론 베타 이외 단백질의 적어도 일부를 포함하는 카르복시 말단을 갖는 융합 단백질이다. 카르복시 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE에서 선택된 부류의 면역글로블린에서 유래된 면역글로블린의 불변부의 적어도 일부가 바람직하다. 가장 바람직한 융합 단백질에서 불변부는 힌지, CH2 및CH3 영역을 적어도 포함한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 인터페론 베타 분절(예, 상기 식에서 x)이 인터페론-베타-1a의 비돌연변이 형에 비하여 항바이러스 및/또는 항증식 활성 또는 기타 이로운 성질이 선택적으로 향상된 뮤테인(mutein)을 제공하도록 돌연변이된 융합 단백질이다.
그러나 본 발명의 또다른 구체예는 상술된 융합 단백질을 암호화하는 분리형 DNA이다. 또한 본 발명은 발현 조절 서열 및 상술된 융합 단백질을 암호화하는 분리형 DNA를 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다. 여기서 발현 조절 서열은 DNA에 작동적으로 연결된다. 본 발명의 범위는 본 발명의 재조합 DNA 서열로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 숙주 세포의 집단을 제공하는 단계; 조건하에서 세포의 집단을 성장시켜서 재조합 DNA에 의하여 암호화하는 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및 발현된 폴리펩티드를 분리시키는 단계를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태는 실질적으로 순수한 형태에서 고유하게 결합되지 않은 추가적 폴리펩티드 및 인터페론-베타-1a를 포함하는 인터페론-베타-1a 융합 단백질이다. 여기서 융합 단백질도 추가적 폴리펩티드가 부족한 인터페론-베타-1a의 항-바이러스 활성에 동등한 항바이러스 활성을 갖는다.
또한, 본 발명의 또다른 양태는 인터페론-베타-1a 융합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물이다.
또한, 본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 혈관형성 및 신생혈관형성을 저해하는 방법이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 상세한 설명에 인용된 문헌은 다른 지시가 없으면 본원에 참고로 포함된다. 다음의 용어는 본원에서 다음과 같이 사용된다:
I. 정의:
인터페론- "인터페론"(또한 "IFN"으로 언급됨)은 바이러스, 폴리펩티드, 미토겐 등과 같은 다양한 유도체에 노출시 반응하여 포유동물 세포에 의하여 생성된 소형의, 종-특이적, 단일 쇄 폴리펩티드이다. 본 발명에 사용된 가장 바람직한 인터페론은 재조합 DNA 기법에 의하여 바람직하게 유도되고, 잔기 80(Asn 80)에서 글리코실화된, 인간, 인터페론-베타이다. 상기 바람직한 글리코실화된 인터페론 베타는 "인터페론-베타-1a"(또는 "IFN-베타-1a" 또는 "IFN-β-1a" 또는 "인터페론 베타 1a" 또는 "인터페론-베타-1a" 또는 "인터페론-β-1a", 모두 상호교환적으로 사용됨)라고 불린다. 용어 "인터페론-베타-1a"는 Asn 80 잔기에서 글리코실화된 모든 돌연변이 형태(즉, 실시예1)를 포함하는 것으로 의도된다.
인터페론을 비롯한 단백질을 제조하기 위한 재조합 DNA 방법이 공지되었다. 예를 들면, 미국특허 제 4,399,216호, 제5,149,636호, 제5,179,017호(Axel et al) 및 제4,470,461호(Kaufman).
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 바람직한 인터페론-베타-1a 폴리뉴클레오티드는 다양한 척추동물, 바람직하게는 포유동물의 야생형 인터페론 베타 유전자서열에서 유래하고, 미국 특허 제5,461,656호(1997. 6. 24에 발행: 조류 유형 I 인터페론 프로프로틴 및 성숙한 조류 유형 I 인터페론을 암호화하는 DNA); 미국특허 제5,605,688호(1997. 2. 25-재조합 개 및 말 유형 I 인터페론); 미국특허 제5,231,176호(1993, 7, 27, 인간 백혈구 인터페론을 암호화하는 DNA 분자); 미국특허 제5,071,761호(1991, 12, 10, 인간 림프아세포 인터페론 LyIFN-알파-2 및 LyIFN-알파-3의 하위-서열을 코딩하는 DNA 서열); 미국특허 제4,970,161호(1990, 11, 13, 인간 인터페론-감마를 암호화하는 DNA 서열); 미국특허 제4,738,931호 (1998, 4, 19; 인간 인터페론 베타 유전자를 함유하는 DNA); 미국특허 제4,695,543호(1987. 9. 22, 인간 알파-인터페론 Gx-1 유전자) 및 미국특허 제4,456,748호 (1984, 6, 24, 천연 발생하는 다양한 백혈구 인터페론의 하위-서열을 암호화하는 DNA)에서 설명된 방법과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 획득된다.
인터페론-베타-1a의 돌연변이체는 본 발명의 범위에 따라 사용될 수 있다. 돌연변이는 당업계에 공지된 지시된 돌연변이유발법의 통상적 방법을 사용하여 개발된다. 또한, 본 발명은 기능적으로 동등한 인터페론-베타-1a 폴리펩티드를 암호화하는 기능적으로 동등한 인터페론-베타-1a 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
인터페론-베타-1a를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드가 다음의 조건 중 1 이상을 만족시키면 인터페론-베타-1a를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드와 비교할 때 "기능적 균등물"이다:
(a) "기능적 균등물"은 표준 혼성화 조건하에서 제2 폴리뉴클레오티드에 혼성화되거나 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드 서열에 축퇴(degenerate)된 제1 폴리뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게는, 이것은 인터페론-베타-1a의 (치료적) 활성을 갖는 돌연변이체 인터페론을 암호화한다;
(b) "기능적 균등물"은 발현시 제2 폴리펩티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드이다.
요약하자면, 용어 "인터페론"은 기능적 동등물 및 상술된 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 균등물"은 기능적 균등물로 간주되는 인터페론과 동일한 효과 또는 향상된 유리한 효과를 포유동물 수용체에 주는 인터페론-베타-1a 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 인터페론-베타-1a 단백질을 의미한다. 당업자에 의하여 평가되는 바와 같이, 기능적으로 균등한 단백질은 예를 들면, "기능적으로 균등한 DNA"를 발현시킴 으로써 재조합 기법에 의하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 비천연 발생하는 DNA에 의하여 또한 천연-발생하는 DNA에 의하여 암호화되는 인터페론-베타-1a 단백질을 포함하며, 여기서 비천연 발생하는 DNA는 천연-발생하는 DNA에 의하여 암호화되는 것과 동일한 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 코딩 서열의 축퇴로 인하여, 기타 폴리뉴클레오티드도 인터페론-베타-1a를 암호화하는 데 사용될 수 있다. 이것은 서열 내 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 다른 코돈을 치환함으로써 변형시켜 잠재(silent) 변형을 제조하는 상기 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 상기 변형된 서열은 상기 서열의 균등물로서 간주된다. 예를 들면, Phe(F)는 2개의 코돈, TTC 또는 TTT에 의하여 암호화되고, Tyr(Y)는 TAC 또는 TAT에 의하여 암호화되며, His(H)는 CAC 또는 CAT에 의하여 암호화된다. 즉, Trp(W)는 단일 코돈, TGG에의하여 암호화된다. 따라서, 특정 인터페론을 암호화하는 주어진 DNA 서열에 있어서, 이것을 암호화할 다수의 DNA 축퇴 서열이 존재할 것으로 생각된다. 상기 축퇴 DNA 서열은 본 발명의 범위내로 간주된다.
"융합"은 각 펩티드 골격에 의한, 2 이상의 단백질 또는 이들 단편의 공-선형의 공유 연결을 의미하며, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현에 의한 것이 가장 바람직하다. 단백질 또는 이들의 단편이 서로 다른 근원에서 유래함이 바람직하다. 따라서, 바람직한 융합 단백질은 인터페론이 아닌 제2 분절에 공유적으로 연결된 인터페론-베타-1a 단백질 또는 단편을 포함한다. 구체적으로, "인터페론-베타/Ig 융합"은 본 발명의 인터페론 베타 분자(즉, 인터페론-베타-1a) 또는 이들의 단편을 포함하는 단백질이다. 이것의 N-말단 또는 C-말단은 면역글로블린 쇄의 N-말단에 연결되었으며, 상기 면역글로블린의 N-말단의 일부는 인터페론 베타로 대체된다. 인터페론-베타/Ig 융합의 종은 면역글로블린 쇄의 불변부의 적어도 일부에 연결된 본 발명의 인터페론 베타 분자(예, 인터페론-베타-1a)를 포함하는 단백질인 "인터페론-베타/Fc 융합"이다. 바람직한 Fc 융합은 중쇄 면역글로블린 쇄의 C 말단 영역을 포함하는 항체의 단편에 연결된 본 발명의 인터페론 베타 분자를 포함한다.
또한, 용어 "융합 단백질"은 하기에 설명된 정제된 단백질로부터 신규하게 제조되고 인터페론 베타 단백질이 아닌 제2 분절에 단일- 또는 이종 기능성 분자를 통하여 화학적으로 연결된 인터페론 베타 단백질을 의미한다.
본원에서 사용된 "재조합"은 단백질이 재조합 포유동물 발현계로부터 유래됨을 의미한다. 대부분의 박테리아 배양액, 예컨대 E. coli에서 발현된 단백질은 글리칸이 없으므로, 상기 발현계는 바람직하지 않다. 효모에서 발현된 단백질은 포유동물 세포에서 발현된 것과 다른 올리고다당류 구조를 가질 수 있다.
인터페론-베타 1a의 특징으로서 본원에서 사용된 바와 같이, "생물학적 활성"은, 하기에 설명된 바와 같이 실시예 1에 나타난 유형의 시험관내 항바이러스 분석에서 측정된 바와 같이, 특정 분자가 항바이러스 활성이 가능한 본원에 개시된 본 발명의 구체예와 충분한 아미노산 서열 상동성을 공유함을 의미한다.
본원에 사용된 "치료적 조성물"은 본 발명의 단백질 및 기타 생리적으로 혼합가능한 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 치료적 조성물은 단백질과 같은 담체, 미네랄 및 물과 같은 부형제를 포함할 것이다.
"아미노산"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체 단위이다. 모두 L-이소형이며 천연 발생하는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에서 찾을 수 있는 20종의 아미노산이 존재한다. 또한 용어는 단백질 아미노산 및 이들의 유사체의 D-이소형 및 아미노산의 유사체를 포함한다.
"유도된" 아미노산은 화학 반응에 의하여 개질된 통상 발생하는 측쇄 또는 말단기(또는 인터페론-베타-1a의 경우에 당 부분)인 천연 또는 비천연 아미노산이다. 상기 개질은 예를 들면, 감마-카르복실화, 베타-카르복실화, PEG화 (pegylation), 설페이트화, 술폰화, 포스포릴화, 아미드화, 에스테르화, N-아세틸화, 카르보네질화, 토실화 및 기타 당업계에 공지된 개질을 포함한다. "유도된 폴리펩티드"는 폴리펩티드가 글리코실화되면, 1 이상의 유도된 당 및/또는 1 이상의유도된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다.
"단백질"은 임의의 20 아미노산을 실질적으로 구성하는 임의의 중합체이다. "폴리펩티드"는 종종 상대적으로 큰 폴리펩티드로 언급되는 반면, "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드로 언급되며, 이들 용어의 용도는 당업계에서 혼용되며 다양하다. 다른 지시가 없으면, 본원에서 사용된 용어 "단백질"은 펩티드, 단백질 및 폴리펩티드를 의미한다.
아미노산 잔기의 "기능적 균등물"은 기능적 균등물에 의하여 대체되는 아미노산 잔기와 유사한 이화학적 성질을 갖는 아미노산이다.
"돌연변이체"는 유기체의 유전 물질에서 임의의 변형, 특히 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에서 임의의 변형(예, 결실, 치환, 부가 또는 변형) 또는 야생형 단백질에서 임의의 변형을 의미한다. 용어 "뮤테인"은 "돌연변이체"와 상호교환적으로 사용된다.
"야생형"은 통상 생체내 존재하는 단백질의 엑손의 자연발생적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이것의 일부 또는 단백질 서열 또는 이것의 일부 각각을 의미한다.
"표준 혼성화 조건"은 혼성화 및 세척을 위하여 0.5 X SSC 내지 약 5X SSC 및 65℃에 실질적으로 동등한 염 및 온도 조건을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "표준 혼성화 조건"은 작동 정의이며 일정 범위의 혼성화 조건을 포함한다. 매우 엄격한 조건은 12 내지 20 시간 동안 65℃에서 플라크 스크린 완충액(0.2 % 폴리비닐피롤리돈, 0.2 % 피콜 400; 0.2 % 소 혈청 알부민, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5); 1M NaCl; 0.1 % 나트륨 피로포스페이트; 1 % SDS); 10 % 덱스트란 설페이트및 100 ug/ml의 변성되고 초음파 분쇄된 연어 정자 DNA로 혼성화하고, 65℃에서 75 mM NaCl/7.5 mM 나트륨 시트레이트(0.5X SSC)/1 % SDS로 세척하는 단계를 포함한다. 낮은 엄격한 조건은 예를 들면 12 내지 20 시간 동안 55℃에서 플라크 스크린 완충액, 10 % 덱스트란 설페이트 및 110 ug/ml의 변성되고 초음파분쇄된 연어 정자 DNA로 혼성화하고, 55℃에서 300 mM NaCl/30mM 나트륨 시트레이트(2.0X SSC)/1% SDS로 세척하는 단계를 포함한다. 참조 Current Protocles in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Sections 6.3.1-6.3.6(1989).
"발현 조절 서열"은 유전자에 작동적으로 연결되어 유전자의 발현을 조절하고 제어하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"작동적으로 연결된"은 발현 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역을 조절하고 제어하는 경우 폴리뉴클레오티드 서열(DNA, RNA)이 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 용어 "작동적으로 연결된"은 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열의 앞에 적절한 출발 신호(예, ATG)을 갖고, 발현 조절 서열의 조절하에 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되어 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 원하는 폴리펩티드가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.
"발현 벡터"는 발현 벡터가 숙주 세포내로 도입되는 경우 1 이상의 유전자의 발현을 허용하는 DNA 플라스미드 또는 파지(기타 공통 예 중)와 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 백터는 세포내에서 복제될 수 있거나 또는 복제될 수 없다.
"분리형"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 사용)은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드 서열에 적용되는 경우, 원래 또는 조작에 의하여 (i) 천연에서 결합된 폴리뉴클레오티드의 전부와 결합되지 않은(즉, 발현 벡터 또는 이것의 일부로서 숙주세포에서 존재); 또는 (ii) 자연에서 연결되는 것 이외의 기타 화학 분절 또는 핵산에 연결된; 또는 (iii) 자연에서 발생하지 않는 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드, 게놈 폴리뉴클레오티드의 일부, cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한 "분리형"은 폴리뉴클레오티드 서열이 (i) 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 시험관내 증식되거나; (ii) 화학적으로 합성되거나; (iii) 클로닝에 의하여 재조합 생성되거나; 또는 (iv) 절단 및 겔 분리에 의하여 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
따라서, "실질적으로 순수한 핵산"은 핵산이 유도된 유기체의 천연 발생하는 게놈에서 통상 인접하는 코딩 서열의 한쪽 또는 양쪽과 직접 인접하지 않는 핵산이다. 실질적으로 순수한 DNA는 또한 추가적 서열을 암호화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"분리형"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 사용된)이 폴리펩티드에 적용되는 경우, 기원 또는 조작에 의하여 (i) 발현 벡터의 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포에서 존재하거나; 또는 (ii) 천연에서 연결된 것 이외의 단백질 또는 기타 화학 분절에 연결되거나; 또는 (iii) 자연에서 발생하지 않는 폴리펩티드 또는 이것의 일부를 의미한다. "분리형"은 또한 (i) 화학적으로 합성된; 또는 (ii) 숙주 세포에서 발현되고 결합된 단백질로부터 분리된 단백질을 의미한다. 용어는 일반적으로 자연발생하는 기타 단백질 및 핵산에서 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 또한 이를 정제하기 위해 사용되는 항체 또는 겔매트릭스(폴리아크릴아미드)와 같은 물질로부터 분리된다.
본원에 사용된 "이종 프로모터"는 유전자 또는 정제된 핵산과 자연적으로 결합되지 않는 프로모터이다.
본원에서 사용된 "상동(homologous)"은 용어 "동일성"과 유사어이고, 2개의 폴리펩티드, 분자간 또는 2개의 핵산간의 서열 유사성을 의미한다. 2개의 비교된 서열의 양자의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유니트에 의하여 채워지면(예컨대, 2종의 DNA 분자에서 하나의 위치가 아데닌에 의하여 채워지면, 또는 2개의 폴리펩티드 각각의 위치가 라이신에 의하여 채워지면), 각 분자는 그 위치에서 상동이다. 2 서열간의 백분율 상동성은 비교된 위치의 수에 의하여 나누어진 2 서열 X 100에 의하여 공유된 정합 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. 예를 들면, 2 서열내 위치에서 10 중의 6이 정합되거나 상동이면, 2 서열은 60% 상동성이다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50% 상동성을 공유한다(총 6개 위치 중 3이 정합). 일반적으로, 2 서열이 최대 상동성을 갖도록 정렬시켜 비교한다. 상기 정렬은 Align program(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램에 의하여 통상적으로 수행되는 Needleman et al., J. Mol Biol. 48:443-453(1970)의 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 상동성 서열은 동일한 또는 유사한 아미노산 잔기를 공유하며, 여기서 유사한 잔기는 통상적 치환이며, 정렬된 참조 서열에 상응하는 아미노산 잔기의 "허용된 점 돌연변이"이다. 이러한 관점에서, 참고 서열 중 잔기의 "보존적 치환"은 상응하는 참고 잔기에 물리적 또는 기능적으로 유사한 상기 치환, 예를 들면 유사한 크기, 형태, 전하 및 공유 결합 또는 수소 결합과 같은 화학적 성질이다. 특히 바람직한 보존적 치환은 "허용된 점 돌연변이"를 위한 정의된 기준을 수행하는 것이다[문헌: Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978)].
용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 또한 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "신생혈관형성" 및 "혈관생성"은 넓은 의미에서 신규한 혈관의 보충을 의미한다. 특히, "혈관생성"은 또한 종양 부위에 신규한 혈관의 보충을 의미한다.
"IFNAR2", "IFNAR1", "IFNAR1/2"는 세포 표면 유형 I 인터페론 수용체를 구성하는 것으로 알려진 단백질을 의미한다. IFNAR2 쇄의 세포외 영역(엑토도메인: ectodomain) 부분은 단독으로 인터페론 알파 또는 베타에 결합할 수 있다.
본 발명의 실행은 다른 지시가 없으면 당업계에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학의 통상적 기법을 사용할 것이다. 상기 방법은 문헌에 설명된다. 참조, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucletide Synthesis, (M.J. Gait, ed), 1984; 미국특허 제4,683,195호(Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames and S.J.Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation(B.D.Hames and S.J.Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells(R.I. Freshney, ed). Alan R.Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155(Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vector for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
II. 융합 단백질의 생성 및 발현
본 발명은 인터페론-베타-1a 융합 단백질의 제조를 위한 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 상기 단백질 및 이것의 제조에 사용되는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 전장(full length) 인터페론-베타-1a 또는 인터페론-베타-1a의 절두형은 cDNA를 사용하는 공지된 재조합 DNA 기법에 의하여 제조될 수 있다(하기 참조).
원하는 인터페론-베타-1a 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 표준 방법은 유전자를 합성하는데 적용될 것이다. 예를 들면, 아미노산 서열은 역-번역된 유전자를 제조하는데 사용될 것이다. 인터페론-베타-1a를 암호화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 함유하는DNA 올리고머가 한 단계로 제조될 수 있다. 대안적으로, 원하는 인터페론-베타-1a의 일부를 암호화하는 수개의 소형 올리고뉴클레오티드가 합성되어 함께 연결된다. 인터페론-베타-1a 분절을 암호화하는 DNA 서열은 수개의 분리된 올리고뉴클레오티드로서 제조된 후 함께 연결된다(실시예2 참조). 각 올리고뉴클레오티드는 통상 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행을 포함한다.
일단 조립되면, 바람직한 유전자는 제한 엔도뉴클레아제에 의하여 인식되는 서열, 사용될 숙주 발현계(바람직하게는 포유동물 세포)를 고려한 바람직한 코돈, 및 전사되는 경우 안정하고 효과적으로 번역되는 RNA를 생성하는 서열에 의하여 특성화될 것이다. 적절한 조립은 적절한 숙주에서 뉴클레오티드 서열결정, 제한효소 맵핑 및 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의하여 입증될 것이다.
포유동물 인터페론 베타 cDNA는 교차-종 혼성화에 의하여 특정 포유동물 cDNA 라이브러리를 검색하기 위한 프로브로서 적절한 인간 인터페론 베타 DNA 서열을 사용함으로써 분리될 것이다. 본 발명에 사용된 포유동물 인터페론 베타는 실시예의 방법에 따라 영장류, 인간, 뮤린, 개과, 고양이과, 소과, 말과 및 돼지과 인터페론 베타를 포함한다. 포유동물 인터페론 베타는 포유동물 cDNA 라이브러리에서 인터페론 베타 cDNA를 분리하기 위한 혼성화 프로브로서 인간 인터페론 베타 DNA 서열에서 유래한 단일쇄 cDNA를 사용하여 교차 종 혼성화에 의하여 얻을 수 있다. 인터페론 유전자 서열을 분리하고 클로닝하는데 사용될 수 있는 방법들은 상기 요약된 미국특허에서 발견된다. 그러나, 인간 인터페론 베타 유전자를 함유하는 DNA를 설명하는 미국특허 제4,738,931호(1998, 4, 19)의 교시가 특히 관련이 있다.
또한 본 발명은 상술된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 DNA 분자는 이것으로 형질전환된 숙주에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 지시할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 상기 발현을 위한 조절 서열에 작동적으로 연결되어야 한다. 프로모터/발현 조절 서열이 글리코실화된 인터페론 베타를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 유도할 수 있다면, 본 발명의 재조합 작제물의 적절한 전사를 제공하기 위하여 적절한 프로모터/인헨서 서열이 재조합 벡터내로 함입되는 것이 바람직할 것이다. 면역글로블린에 기초한 융합 단백질의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있는 프로모터가 SV40 초기 프로모터 영역(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 사코마 바이러스의 3'롱 터미날 리피트에 포함된 프로모터(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 노팔린 합성효소 프로모터 영역을 포함하는 식물 발현 벡터(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) 또는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), 및 광합성 효소 리불로스 비포스페이트 카르복실라제에 대한 프로모터(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); Gal 4 프로모터처럼 효모 또는 기타 균류에서 프로모터 요소, ADC(알코올 탈수소효소) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼린 포스파타제 프로모터 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스유전자 동물에 이용되는 다음의 동물 전사 조절 영역: 췌장 세포에서활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 인헨서 또는 프로모터(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프구 세포에서 활성인 면역글로블린 유전자 인헨서 또는 프로모터(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 및 인헨서 영역(Boshart et al., 1985, Cell 41:521-530); 고환, 흉부, 림프선 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유선 종양 바이러스 조절 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); 간에서 활성인 알파 페토프로테인 유전자 조절 영역(Krumlant et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 조절 영억 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수종 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌내 희돌기교세포에서 활성인 골수종 기초 단백질 유전자 조절 영역(Readheaed et al., 1987, Cell 48:703-712); 골근육에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Sani, 1986, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 호르몬 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 발현된 인터페론 베타가 글리코실화되지 않는 한 LAC 또는 베타-락타마제 프로모터와 같은 원핵생물 발현계(Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)는 바람직하지 않을 것이다. 그러나, 원핵생물 숙주 또는 진핵생물 숙주에서 인터페론 베타의 글리코실화를 허용할 원핵생물 발현계는 본 발명의 범위내에 포괄된다.
사용될 수 있는 발현 벡터는 다음의 벡터 또는 이들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 또는 동물 바이러스, 예를 들면 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스에 기초한 벡터; 곤충 바이러스, 예컨대 바큘로바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터 등. 구체적으로는, 바람직한 진핵 숙주에 대한 유용한 발현 벡터는 SV40, 소 파필로마바이러스, 사이토메갈로바이러스에서 유래한 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 또한, 각 특이적 발현 벡터내에서, 다양한 위치가 상기 DNA 서열의 삽입을 위하여 선택될 것이다. 상기 위치는 이들을 절단하는 제한 엔도뉴클레아제에 의하여 통상 설계된다. 이들은 당업자에 의하여 잘 인식된다. 본 발명에 유용한 주어진 발현 벡터는 선택된 DNA 단편의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 위치를 보유할 필요가 없다. 대신, 벡터는 대안적 수단에 의하여 단편에 의하여 연결될 것이다.
선택된 DNA 단편에 삽입되고 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되기 위하여 선택된 발현 벡터 및 위치는 다양한 인자, 예컨대 특정 제한 효소에 공격받기 쉬운 위치의 수, 폴리펩티드의 크기, 폴리펩티드가 프로테아제에 의하여 용이하게 분해되는 정도 등에 의하여 결정된다. 주어진 DNA에 대한 벡터 및 삽입 위치의 선택은 상기 인자의 균형에 의하여 결정된다.
본 발명의 재조합 작제물은 형질전환(예, DEAE-덱스트란 또는 칼슘 포스페이트 기법 사용), 형질감염, 미세주입, 감염, 세포 총 및 전기충격(electroporation)를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 융합 단백질 재조합 핵산 서열이 그 세포 유형내 mRNA로 적절하게 전사되고 세포가 단백질을 글리코실화시킬 수 있다면 임의의 숙주 세포 유형이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 핵산 작제물은 면역글로블린에 기초한 융합 단백질을 제조할 수 있는 비인간 트랜스유전자 동물을 제조하는데 사용될 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이다.
주어진 발현 벡터내로 상기 폴리뉴클레오티드 작제물의 성공적 삽입은 3가지 일반적 접근법에 의하여 동정될 것이다: (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 및 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 제1 접근법에서, 발현 벡터내에 삽입된 인터페론-베타-1a 유전자의 존재는 삽입된 융합 단백질 유전자에 상동하는 서열을 함유하는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 혼성화에 의하여 검색될 수 있다. 제2 접근법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터내 외부 유전자의 삽입에 의하여 야기되는 특정 "마커" 유전자 기능(예, 티미딘 키나제 활성, G418과 같은 항생제에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스에서 폐색체 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 선택되고 동정될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드가 삽입되어벡터의 마커 유전자 서열을 방해하면, 삽입체를 함유하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의하여 동정될 수 있다. 제3 접근법에서, 재조합 발현 벡터는 재조합 벡터에 의하여 발현되는 외부 유전자 생성물을 분석함으로써 동정될 수 있다. 상기 분석은 예를 들면 생검계에서 유전자 생성물의 물리적 성질 또는 기능적 성질에 기초할 것이다.
모든 숙주/발현 벡터 조합이 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 발현하는데 동등한 효능으로 작용하지는 않을 것임을 알 수 있을 것이다. 그러나, 숙주-발현 벡터 조합의 특정 선택은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 본원에서 설명된 원칙의 적절한 고려 후 당업자에 의하여 제조될 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 융합 단백질 및 이것을 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 인터페론-베타-1a 이외 단백질의 영역을 포함하는 카르복시-말단 영역 및 인터페론-베타-1a의 아미노산 서열에 의하여 특성화되는 아미노-말단 영역을 갖는다. 상기 유전자를 위한 바람직한 식은 1차 아미노산 서열 X-Y-Z를 갖는 단백질이다. 여기서, X는 인간 인터페론 베타의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열 또는 이것의 일부를 갖는 폴리펩티드이고; Y는 선택적 링커 분절이고; 및 Z는 인간 인터페론 베타 이외의 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드이다. 한 구체예에서, 분절 Z는 면역글로블린 유사 영역을 포함하는 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 상기 기타 폴리펩티드의 예는 CD1, CD2, CD4 및 부류 I 및 부류 II 주요 조직적합성 항체의 일원을 포함한다. 상기 폴리펩티드의 예로 미국특허 제5,565,335호(Capon et al.) 참조.
분절 Z는 예를 들면, 복수의 히스티딘 잔기 또는 바람직하게는 면역글로블린의 Fc 영역을 포함한다. 여기서 "Fc"는 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 함유하는 항체의 단편으로 정의된다.
가장 바람직한 융합 단백질에서, 인터페론-베타-1a 폴리펩티드는 면역글로블린의 Fc 영역의 적어도 일부에 이것의 C-말단에 의하여 융합된다. 인터페론-베타-1a는 아미노-말단 일부를 형성하고, Fc 영역은 카르복시 말단 일부를 형성한다. 상기 융합 단백질에서, Fc 영역은 불변부 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 영역으로 제한되는 것이 바람직하다. 또한 상기 융합에서 Fc 영역은 힌지 영역의 일부로 제한되고, 일부는 분자간 이황화 결합, CH2 및 CH3 영역 또는 이것의 균등물을 형성할 수 있다. 상기 불변부는 임의의 포유동물(바람직하게는 인간) 근원에서 유래될 수 있고 임의의 적절한 부류 및/또는 이소형, 예를 들면 IgA, IgD, IgM, IgE 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에서 유래될 것이다.
Ig 융합을 암호화하는 재조합 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 방법(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 또는 공개적으로 입수가능한 클론에서 얻을 수 있다. 면역글로블린의 경쇄 또는 중쇄 불변부를 암호화하는 유전자의 제조 방법은 예를 들면 문헌[Robinson, R. et al., PCT 공개공보 제WO87-02671호]에 의하여 교시된다. 인터페론 분자 또는 단편을 암호화하는 cDNA 서열은 링커 서열에 의하여 연결될 수 있거나 또는 중쇄 Ig 불변부를 암호화하는 cDNA에 직접 연결될 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 재조합 벡터 시스템은 합성힌지 영역 및 정확한 해독구조에서 인터페론 베타를 암호화하는 서열을 수용하도록 제조될 수 있다. 또한, 재조합 벡터 시스템의 일부로서, RNA 절단/폴리아데닐화 부위 및 하단 서열을 포함하는 면역글로블린 유전자의 3' 인접 영역에 상응하는 핵산을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 재조합 벡터로 형질전환된 세포로부터 융합된 분자의 분비를 용이하게 하는 면역글로블린 융합 단백질을 암호화하는 서열의 신호 서열 상단을 조작하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 융합 단백질을 포함하는 단량체 분자 또는 다량체 분자 및 이량체 융합 분자를 제공한다. 상기 다량체는 IgM 5량체 또는 IgA 이량체와 같이 통상 다가인 Ig 분자의 Fc 영역 또는 이것의 부분을 사용하여 생성될 수 있다. J쇄 폴리펩티드가 IgM 5량체 및 IgA 이량체를 형성하고 안정화시키는 데 필요할 것으로 이해된다. 대안적으로, 인터페론-베타-1a 융합 단백질의 다량체는 프로틴 A와 같은 Ig 분자의 Fc 영역에 대한 친화성을 갖는 단백질을 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들면, 복수의 인터페론-베타-1a/면역글로블린 융합 단백질 프로틴 A-아가로스 비드에 결합할 수 있다.
상기의 다가 형태는 다수의 인터페론 베타 수용체 결합 부위를 보유하기 때문에 유용하다. 예를 들면, 링커 영역(분절Y)에 의하여 분리된 2가 가용성 인터페론-베타-1a는 서열 목록 번호:2의 아미노산 1 내지 166(또는 서열목록 번호:1의 핵산 1 내지 498에 의하여 암호화되는 것)의 2개 종렬 반복(일반식에서 분절 X), 면역글로블린 불변부의 적어도 일부에 결합된 반복부(분절Z)로 구성될 것이다. 또한 대안적 다가 형태는 인터페론-베타-1a/Ig 융합을 통상의 커플링 기법을 사용하여피콜, 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란으로 구성된 군에서 선택된 중합체, 임상적으로 허용가능한 임의의 담체 분자에 화학적으로 커플링시킴으로써 제작될 수 있다. 대안적으로, 인터페론-베타-1a는 비오틴에 화학적으로 커플링될 수 있고, 이어서 비오틴-인터페론 베타 Fc 접합체는 아비딘에 결합되어 4가 아비딘/비오틴/인터페론 베타 분자를 생성한다. 또한 인터페론-베타-1a/Ig 융합은 디니트로페놀(DNP) 또는 트리니트로페놀(TNP)에 공유적으로 커플링될 수 있고 생성된 접합체는 항-DNP 또는 항-TNP-IgM과 침전되어 인터페론 베타 수용체 결합 부위에 대하여 10의 결합가를 갖는 10가 접합체를 형성한다.
본 발명의 인터페론-베타-1a 단백질, 단편 및 융합 단백질을 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등과 같은 통상의 조건에 따라 분리하고 정제할 것이다. 예를 들면, 인터페론 단백질 및 단편이 컬럼에 고정화된 인터페론 수용체를 갖는 컬럼을 통하여 이것의 수용액을 통과시킴으로써 정제될 것이다(참조 미국특허 제4,725,669호). 이어서 결합된 인터페론 분자는 수용성 아세트산으로 용출됨으로써 또는 카오트로픽(chaotropic) 염으로 처리함으로써 용출될 것이다. 면역글로블린 융합 단백질은 융합 단백질의 Fc 부분에 선택적으로 결합하는 고정화된 단백질 A 또는 단백질 G를 포함하는 컬럼을 통하여 융합 단백질을 함유하는 용액을 통과시킴으로써 정제될 것이다. 참조, Reis, K.J., et al., J. Immunol. 132:3098-3102(1984); PCT 출원, 공개공보 WO87/00329. 이어서 키메라 항체는 수용성 아세트산으로 용출함으로써 또는 카오트로픽 염으로 처리함으로써 용출될 것이다.
대안적으로 인터페론 단백질 및 면역글로블린-융합 분자는 항-인터페론 항체 컬럼 상에서 또는 항-면역글로블린 항체 컬럼 상에서 정제되어 실질적으로 순수한 단백질을 생성할 수 있다. 용어 "실질적으로 순수한"은 자연적으로 결합된 불순물이 없는 단백질을 의미한다. 실질적 순수함은 전기영동에 의한 단일 밴드에 의하여 증명될 것이다.
본 발명의 유용한 인터페론-베타-1a/Ig 융합 단백질의 예는 서열 목록 번호:2로서, 발현 플라스미드 pCMG261을 함유하는 진핵 세포에 의하여 세포 배양물내로 분비된다(실시예 2). 상기 단백질은 뮤린 Ig의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변부의 일부에 융합된 성숙한 인간 인터페론-베타-1a로 구성된다. 이것은 프로틴 A, Fc 결합 단백질에 의하여 인식되는 뮤린 면역글로블린의 충분한 일부를 포함한다.
인간 인터페론-베타-1a를 함입하는 본 발명의 기타 융합 단백질은 (a) his 태그된 인터페론-베타-1a 융합의 cDNA 및 추론된 아미노산 서열 각각에 대한 서열 목록 번호:3 및 4(도1에 나타남) 및; (b) 서열 목록 번호:2의 인터페론-베타-1a/Ig 융합 단백질을 암호화하는 cDNA에 대한 서열 목록 번호:1(도2에 나타남)에 나타난다.
본 발명의 바람직한 인터페론-베타-1a 단백질은 신규한 "연결부(junction)" DNA 서열 목록 번호:5 및 아미노산 서열 목록 번호:6을 포함한다. 서열 목록 번호:5는 인간 면역글로블린 불변부를 암호화하는 DNA 및 인간 인터페론 베타 DNA간의 연결부의 한쪽에 11개의 트리플렛 코돈을 제시한다(참조 실시예5:서열 목록 번호:41 및 42). 구체적으로, 서열 목록 번호:5에서 인간 인터페론-베타-1a를 암호화하는 DNA는 뉴클레오티드 트리플렛 568-570(AAC)로 종결되고, 인간 IgG1 불변부를 암호화하는 DNA는 서열 목록 번호:41의 뉴클레오티드 번호 574로 출발하는 트리플렛(GAC)로 출발한다. 상응하는 추론된 아미노산 "연결부" 서열은 서열 목록 번호:6에 나타나고, 서열 목록 번호:42에 기초한다. 또다른 유일한 "연결부" 서열은 최종 DNA 작제물 내 링커 서열을 포함하는 것으로 정의된다(참조 실시예5: 서열 목록 번호:43 및 44). 상기 "연결부" DNA 및 아미노산 서열은 인터페론-베타-1a 서열의 말단(서열 목록 번호:43에서 뉴클레오티드 번호 570) 및 링커 서열(서열 목록 번호:8에서 GGGGS; 서열 목록 번호:43에서 뉴클레오티드 571 내지 585)간의 직접 연결부 한쪽에 11 트리플렛 코돈을 나타내는 서열 목록 번호:7 및 8 각각에 나타난다.
DNA "연결" 서열은 DNA 프로브로서 사용될 수 있고, 표준 조건하에서 임의의 인터페론-베타-1a/Ig 융합 단백질을 암호화하는 임의의 DNA 서열에 혼성화를 위하여 필요한 최소 DNA일 것이다. 그러나, 프로브 전체가 연결부의 양면에 혼성화되고 인터페론 베타/불변부 연결부의 양면이 혼성화에 참가한다면, 더 작은 서열이 존재할 것이다. 또한, 당업자는 서열 목록 번호:5 또는 7 보다 큰 DNA 서열이 혼성화에 적절할 것임을 이해할 것이다. 당업자는 서열 목록 번호:5 또는 7과 같은 특정 프로브가 단일 쇄 센스 올리고뉴클레오티드 또는 단일 쇄 안티-센스 올리고뉴클레오티드 중의 하나의 5'말단을 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 적절하게 표지된 ATP의 포스페이트로 표지화함으로써 연결의 양면에 혼성화 가능한지를 시험할 수 있다. 본 발명의 서열은 혼성화되어야 하고 따라서 양 올리고뉴클레오티드 프로브에 의하여 표지되어야 한다. 또한 본 발명은 연결부 서열 목록 번호:5 또는 7을 암호화하는 축퇴 서열을 충분히 포함한다.
III. 인터페론 융합 폴리펩티드의 기타 변이체
본 발명의 단백질의 유도체는 또한 생물학적 활성을 보유하는 1차 단백질의 다양한 구조적 형태를 포함한다. 이온화되는 아미노기 및 카르복시기의 존재로 인하여, 예를 들면 인터페론 베타 융합 단백질은 산성염 또는 염기성염의 형태일 수 있으며, 중성 형태일 수 있다. 각 아미노산 잔기는 또한 산화 또는 환원에 의하여 개질될 수 있다. 또한, 1차 아미노산 구조(N-및/또는 C-말단을 포함) 또는 인터페론-베타-1a의 글리칸은 다른 화학 분절, 예를 들면, 글리코실기, 폴리알킬렌 글리콜 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG: 공출원되고 통상 양수된 출원 제60/104,491 및 60/720,237호 참조), 지질, 포스페이트, 아세틸기 등으로 공유 결합 또는 응집성 접합을 형성함으로써 또는 아미노산 서열 돌연변이체를 제조함으로써 개질될 수 있다.
인터페론 베타/Ig의 기타 유도체는 예를 들면 추가적 N-말단 또는 C-말단과 같은 재조합 배지 중 합성에 의한 기타 단백질 또는 폴리펩티드와 인터페론 베타 또는 이것의 단편의 공유성 또는 응집성 접합을 포함한다. 예를 들면, 접합된 펩티드는, 합성된 부위에서 세포막 또는 벽의 외부 또는 내부의 기능 부위로 단백질을 공번역적 또는 후번역적으로 직접 이동시키는, 단백질의 N-말단 영역의 신호(또는 리더) 폴리펩티드 서열(예, 효모 알파-인자 리더)일 수 있다. 인터페론 베타 수용체 단백질은 인터페론 베타(예, 히스티딘/인터페론-베타-1a 융합)의 정제 또는 동정을 용이하게하기 위하여 추가된 펩티드를 포함할 것이다. 또한 인터페론 베타의 아미노산 서열은 펩티드 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)에 연결될 수 있다(Hopp et al., Bio/Technology 6:1204,1988). 뒤쪽 서열은 고도의 항원성이고 특이적 모노클론 항체에 의하여 가역적으로 결합되는 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 빠른 분석 및 용이한 정제를 가능하게 한다. 또한 상기 서열은 Asp-Lys 쌍에 직접 연결된 잔기에 소 점막 엔테로키나제에 의하여 특이적으로 절단된다.
기타 유사체는 1 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 1 이상의 비보존적 아미노산 치환 또는 분리된 단백질의 생물학적 활성을 제거하지 않는 결실 또는 삽입에 의하여 서열 목록 번호:2, 4, 6, 또는 8에 나타난 것과 다른 인터페론 베타 서열의 인터페론 베타 융합 Fc 단백질 또는 이것의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다. 보존적 치환은 다음의 군내의 치환처럼 통상 한 아미노산을 유사한 성질을 갖는 또다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신 및 쓰레오닌; 아스파르산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 쓰레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 기타 보존적 치환은 당업자에 의하여 용이하게 알려질 수 있다. 예를 들면, 아미노산 알라닌에 있어서, 보존적 치환은 D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인 중의 임의의 하나에 의하여 행해질 수 있다. 라이신에 있어서, D-라이신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴, 또는 D-오르니틴 중의 하나로 대체될 수 있다. 일반적으로, 분리된 폴리펩티드의 기능성 성질에서 전하를 유도하는 것으로 예상될 수 있는 치환은 (i) 극성 잔기, 예, 세린 또는 쓰레오닌이 소수성 잔기, 예, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 또는 알라닌으로 치환되는 것 또는 그 역; (ii) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기로 치환되는 것 또는 그 역; (iii) 전기적 양성 측쇄를 갖는 잔기, 예, 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘이 전기적 음성 측쇄, 예, 글루탐산 또는 아스파르트산을 갖는 잔기로 치환되는 것 또는 그 역; 또는 (iv) 커다란 측쇄를 갖는 잔기, 예, 페닐알라닌이 글리신과 같은 측쇄를 갖지 않는 것으로 치환되는 것 또는 그 역의 경우이다. 본 발명은 분리된 분자: 대립유전자 변이체, 천연 돌연변이체, 유도된 돌연변이체, 높은 또는 낮은 엄격한 조건하에서 서열 목록 번호 2, 4, 6, 또는 8과 같은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 혼성화되는 DNA에 의하여 암호화되는 단백질을 포함한다.
본 발명자는 본 발명의 인터페론-베타-1a 분절의 추가적 변이체인 인터페론-베타-1a 돌연변이체를 개발하였다. 상기 인터페론-베타-1a 분절이 야생형 인터페론-베타-1a에서 발견되지 않는 신규한 성질을 나타내는 한 특히 유용할 것이다(실시예1 참조). 간단히, 본 발명자는 활성 및 수용체 결합에 필요한 잔기의 맵핑을 목적으로 인간 인터페론-베타-1a의 돌연변이적 분석을 수행하였다. 인간 인터페론-베타-1a의 3-D 결정 구조의 유용성(참조, Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818)은 알라닌(또는 세린) 치환을 위하여 인터페론 베타 수용체 상호작용에 유용한 용매-노출된 잔기의 동정을 가능하게 하고, 분자내 결합에 관여하는 아미노산을 보유하게 만든다. 인터페론-베타-1a의 각 나선형(A, B, C, D, E) 및 루프(AB1, AB2, AB3, DC1, DC2, DE1, DE2)의 각 분별적 영역을 따라 2개 및 8개의 잔기 사이에 대체된 15개 알라닌 스캐닝 돌연변이의 패널이 설계되었다. 실시예1 참조.
아미노-말단 히스티딘 태그("his" 태그)가 포유동물 세포 발현된 돌연변이체의 친화성 정제를 위하여 유도되었다(서열 목록 번호:2:도1). 상기 돌연변이체의 기능적 결과는 항바이러스 및 항증식 분석으로 분석하였다. 비방사능 결합 분석은 인터페론 베타 표면 세포 수용체(IFNAR1/2 세포 표면 수용체)에 대한 상기 돌연변이체의 결합을 분석하기 위하여 개발되었다. 또한, 인터페론에 결합하는 IFNAR2-엑토도메인/Fc 융합 단백질을 이용하는 ELISA-기초한 분석이 인터페론-베타-1a 및 IFNAR2 간의 표면 상호작용을 맵핑하는데 사용되었다(실시예1 참조). 상기 돌연변이적 분석은 N- 및 C- 말단이 수용체 결합 또는 생물학적 기능에 중요하지 않은 인터페론-베타 분자의 부분에 위치함을 보여주었다.
본 발명자는 표적화된 돌연변이 유발에 의하여 야기된 3가지 유형의 효과를 동정하였다. 상기 효과는 특정 환경하에서 인터페론 약물 개발에 이로울 것이다. 3가지 유형의 효과는 다음과 같다: (a) his-야생형 인터페론-베타-1a보다 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이(예, 돌연변이체 C1); (b) his-야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항바이러스 활성에 대하여 항증식 활성이 부적절하게 낮지만, 항바이러스 및 항증식 분석에서 활성을 나타내는 돌연변이(예, 돌연변이체 C1, D 및 DE1); 및 (c) his-야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 수용체 결합에 있어서 항바이러스 및 항증식 활성이 부적절하게 낮은 기능성 길항제(예, A1, B2, CD2 및 DE1).
또한, 인터페론-베타-1a 분절(X)과 제2의 비-인터페론-베타-1a 분절(Z)(예, 면역글로블린의 Fc 영역)간의 커플링은 면역글로블린 및 인터페론-베타-1a가 각 활성을 보유하는 한, 2 분자에 함께 결합할 임의의 키메라 활성에 의하여 영향을 받을 수 있다. 상기 키메라 연결은 공유 결합, 친화적 결합, 삽입, 배위 결합 및 혼성 결합과 같은 다수의 화학 기작을 포함할 수 있다. 인터페론-베타-1a 및 면역글로블린 분절 간의 공유 결합을 발전시키는 대표적 커플링제(즉, 일반식에서 링커 "Y")가 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르와 같은 유기 화합물, 토일렌-2,6-디이소시아네이트, 글루테르알데히드, 디아조벤젠과 같은 디이소시아네이트, 및 비스-(p-디아조니움-벤조일)-에틸렌디아민과 같은 헥사메틸렌 디아민, 디메틸 아디프이미데이트와 같은 이미도에스테르의 이기능성 유도체 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은 비스-활성 플루오로 화합물을 포함할 수 있다. 상기 목록은 당업계에 공지된 다양한 부류의 화학 커플링제를 포괄하지는 않았다. N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC); 4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(SMPT: Pierce Chem. Co., Cat. #21558G)와 같이 다수가 시판되고 있다.
IV. 본 발명의 용도
본 발명의 융합 단백질은 인터페론 베타 치료법으로 불리는 치료 조성물에 사용될 수 있다. 상기 분자는 융합 단백질, 특히 Ig 융합과 결합된 통상의 이점; 즉 혈관에서 반감기의 증가 및 보유 시간의 증가를 유도하도록 약동력학 및 약물역학을 변형시킨다. 또한, 인터페론 베타1b에 구조적으로 유사하지만, 특히 바람직하게 글리코실화된 인터페론-베타-1a 단백질이 비-글리코실화된 인터페론 베타 1b 보다 생물학적으로 수배 더 활성이다. 참조 Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649.
본 발명의 생성물은 치료적 인터페론-베타 1a의 반감기를 유지하는데 유용한 것으로 알려졌으며, 물 또는 허용가능한 액체 배지에서 용해됨으로써 치료적 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구, 에어로졸 또는 경구에 의하여 투여된다. 에어로졸 제제가 천연에서 액체 또는 건분말일 수 있지만, 미세한 콜로이드 현탁액이 비경구 투여를 위하여 저류조 영향을 생성할 수 있도록 제조되거나 또는 경구 투여에 의하도록 제조될 것이다. 건조, 냉동건조된 상태 또는 용액 제제에서 본 발명의 인터페론-베타-1a융합은 양호한 저장 안정성을 가져야만 한다.
본 발명의 치료적 단백질은 인터페론-베타-1a 조성이 효과가 있는 임의의 질병 상태의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 생물학적 시스템 또는 표본에 구조, 조건 또는 질병 상태의 진단 및 비생리적 시스템의 진단 목적을 위하여 사용될 수 있다.
치료 용도에서, 본 발명은 상기 질병의 치료가 요구되고 상기 질병 또는 질환을 가진 또는 잠재적으로 가질 수 있는 동물 피검체를 치료하는 방법으로서, 상기 질병의 치료에 효과적인 본 발명의 융합 단백질의 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질에 의하여 치료되는 피검체는 포유동물 피검체이고 가장 바람직하게는 인간 피검체를 포함한다. 당업계에서 결정될 수 있는 것처럼, 부적절한 실험없이, 치료해야 할 특정 질병 또는 질환에 따라 동물 피검체에 임의의 적절한 치료적 유효량 및 안전한 용량으로 본 발명의 인터페론 베타-1a 융합 단백질을 투여하는 것이 바람직하다. 유형 I 인터페론의 종(species) 장막으로 인하여, 적절한 종에서 유래된 인터페론으로 본원에서 설명된 인터페론-융합 단백질을 제조하는 것이 필요할 것이다.
인터페론-베타의 항-세포 증식 활성이 공지되었다. 특히, 본원에서 설명된 특정 인터페론-베타-1a 융합은 골형성 육종, 림프종, 급성 림프구 백혈병, 흉부 암, 흑색종 및 비인두 암과 같은 종양 및 암, 섬유종, 루푸스 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다. 또한 융합 단백질에 의하여 나타나는 항바이러스 활성, 특히 본원에서 설명된 특정 인터페론-베타-1a 뮤테인이 ECM 감염, 인플루엔자 및 기타 호흡기관 감염, 광견병 및 간염과 같은 바이러스 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한 본원에서 설명된 단백질에 의하여 나타나는 인터페론-베타-1a의 면역조절 활성이 섬유종, 다발성 경화증과 같은 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 신규 혈관의 형성(혈관신생 또는 신생혈관 생성)을 저해하는 인터페론의 능력으로 인해, 본 발명의 단백질이 당뇨병망막증, 미숙망막증, 남성퇴화, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 후수정체 섬유증식증,홍색증 및 오슬러-베버 증후군과 같은 혈관신생 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 인터페론의 항내피 활성이 수 시간 동안으로 알려졌고 인터페론 활동의 한 잠재적 기작이 종양 세포에 의하여 생성된 혈관생성 인자의 생성 또는 효능을 저해함으로써 내피 세포 활성을 억제할 수 있다. 일부 혈관 종양, 예컨대 혈관종은 특히 인터페론의 치료에 민감하다. 인터페론-알파로의 치료는 상기 질환에 대한 단지 문헌화된 치료이다. 접합체가 비접합된 인터페론보다 더 장시간동안 혈관에서 보유되므로 항-혈관형성제의 용도로서 더욱 효과적이고 효능있는 치료법으로 예상되기 때문에, 본 발명의 인터페론-베타-1a 융합 단백질은 치료는 약동력학 및 약물역학의 관점에서 실질적인 약학적 장점을 제공할 것으로 기대된다. 실시예 9 참조.
본 발명의 중합체-인터페론-베타-1a 융합은 단독으로 투여될 뿐 아니라 약학적으로 허용가능한 에스테르, 염 및 기타 이것의 생리적 기능 유도체의 형태로서 투여될 수 있다. 상기 약물 및 의학 제제에서, 인터페론-베타-1a는 1 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들) 및 선택적으로 임의의 기타 치료 성분과 함께 사용된다. 담체(들)은 제제의 기타 성분과 혼용된다는 관점에서 약학적으로 허용가능하며, 이것의 수용체에 부적절하게 해로운 것은 아니다. 인터페론-베타-1a는 상술한 바와 같이 원하는 약리적 효과를 달성하기에 효과적인 양 및 원하는 일일 투여량을 달성하기에 적절한 양으로 제공된다.
제형은 비경구 및 경구 투여를 위하여 적절한 것을 포함하고, 특정 투여 방식은 경구, 직장, 구강, 국부, 비강, 눈으로, 피하, 근육내, 피부투과, 포막내, 관절내, 동맥내, 지주막내, 기관지내, 림프, 질내 및 자궁내 투여를 포함한다. 경구,비강 및 비경구 투여를 위한 제형이 바람직하다.
인터페론-베타-1a를 액체 용액을 포함하는 제형으로 사용하는 경우, 제형은 경구적으로 또는 비경구적으로 투여되는 것이 유리할 것이다. 인터페론-베타-1a는 액체 현탁액 제형 또는 생혼화성 담체 제형내 분말로서 사용되는 경우, 제형은 구강, 직장 또는 기관지로 투여되는 것이 바람직하다.
인터페론-베타-1a를 분말화된 고체의 형태로 직접 사용하는 경우, 인터페론-베타-1a는 경구로 투여되는 것이 유리할 것이다. 대안적으로, 담체 기체내 분말의 분무화를 통하여 비강 또는 기관지로 투여하여 적절한 분무 기관을 포함하는 호흡 순환으로부터 환자에 의하여 흡입되는 분말의 기체 분산을 형성한다. 본 발명의 단백질을 포함하는 제형은 단일 용량 형태로 편리하게 제시될 수 있고 약학계에서 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 것이다. 상기 방법은 유효성분을 1 이상의 보조 성분으로 구성된 담체와 배합시키는 단계를 일반적으로 포함한다. 통상, 제형은 유효 성분이 액체 담체, 미세하게 분할된 고형 담체 또는 이들 양자와 균일하게 직접적으로 혼합시키는 단계, 또한 필요하다면 원하는 제형의 용량 형태로 생성물을 형성시키는 단계에 의하여 제조한다.
경구 투여에 적절한 본 발명의 제형은 캡슐, 정제 또는 마름모꼴 정제와 같은 분리된 단위로 제공될 수 있고, 각각은 분말 또는 과립; 또는 수용액 또는 비수용액중 현택액, 예를 들면 시럽, 에릭서제, 에멀션 또는 드라우트로서 유효 성분의 예정된 양을 포함한다.
정제는 1 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 주형에 의하여 제조될 것이다.압축된 정제는 결합제, 붕해제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면활성제 또는 방전제와 선택적으로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동형인 활성 화합물과 함께 적절한 기계에서 압축됨으로써 제조될 수 있다. 적절한 담체의 분말화된 중합 접합체의 혼합물로 구성된 주형화된 정제는 적절한 기계에서 주형화됨으로써 제조된다.
시럽은 임의의 보조 성분을 첨가할 수 있는 당, 예를 들면 수크로스의 농축된 수용액에 활성 화합물을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 상기 보조제는 감미료, 적절한 보존제, 당의 결정화 지연제 및 임의의 기타 성분의 용해성 증가제, 예를 들면 폴리히드록시 알코올, 예를 들면 글리세롤 또는 소르비톨을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위하여 적절한 제형은 수용체의 혈액과 등장인 활성 접합제의 살균 수성 제제(예, 생리 식염수)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제형은 현탁제 및 농조화제 또는 혈액 성분 또는 1 이상의 기관에 화합물을 표적화시키도록 고안된 기타 미세 입자계를 포함할 것이다. 제형은 단일용량 또는 다중용량 형태로 제공될 수 있다.
비강 분무 제형은 보존제 및 등장제와 함께 활성 접합제의 정제된 수용액을 포함한다. 상기 제형은 비강 점막과 혼화될 수 있는 pH 및 등장 상태로 조정되는 것이 바람직하다.
직장 투여를 위한 제형은 적절한 담체, 예컨대 코코아 버터, 수화된 지방 또는 수화된 지방성 카르복실산과 함께 좌약으로서 제공될 수 있다.
아이 드롭(eye drop)을 위한 안과 제형은 pH 및 등장성 요건이 눈에 적합하게 조절되는 것이 바람직한 것을 제외하고는 비강 분무와 유사한 방법에 의하여 제조될 것이다.
국부 제형은 1 이상의 매체, 에컨대 광유, 페트로륨, 폴리히드록시 알코올 또는 국부 약학 제제에 사용되는 기타 염기에서 용해되거나 현탁되는 본 발명의 접합체를 포함한다.
전술된 성분 뿐 아니라, 본 발명의 제형은 또한 희석제, 완충액, 감미제, 붕해제, 표면활성제, 농조화제, 윤활제, 보존제(항산화제 포함) 등에서 선택되는 1 이상의 보조 성분을 포함한다.
따라서, 본 발명은 치료 용도 이외의 바람직한 예시적 용도로서 용액중 인터페론-베타-1a의 시험관내 안정화를 위한 적절한 융합 단백질의 제공을 고려한다. 융합 단백질은 인터페론-베타 1a의 효소적 분해에 대한 내성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있고, 저장기간, 실온 안정성 및 시험 시약 및 키트에 대한 강성도를 향상시키는 수단을 제공한다.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되며, 본 발명의 제한으로써 해석되어서는 안된다. 특히, 본원에서 설명된 생체내 동물 실험은 다양할 수 있으며, 기타 변형 및 기본 방법의 변이가 가능함을 이해해야 할 것이다. 예를 들면, 실시예 7에서 당업자는 기타 네오프테린 분석을 사용할 수 있으며 또는 사용된 영장류의 수 및 종류를 변경할 수 있다. 실시예에 대한 상기 변형 및 변이는 본 발명의 핵심 및 범위내로 간주될 것이다.
실시예 1: 알라닌/세린 치환 돌연변이를 사용한 인간 인터페론-베타-1a의 구조/활성 연구: 수용체 결합 부위 및 기능 영역의 분석
A. 개요
인간 인터페론-베타-1a(IFN-베타-1a)의 광범위한 돌연변이 분석은 활성 및 수용체 결합에 필요한 잔기를 맵핑하기 위한 목적으로 수행되었다. 인간 IFN-베타의 3-D 결정 구조의 유용성(Karpusas, M. et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818)은 알라닌(또는 세린) 치환에 대하여 수용체 상호작용에 이용가능한 용매-노출된 잔기를 동정하게 하고, 분자내 결합에 관여하는 아미노산을 보유하게 한다. 15개 알라닌 치환 돌연변이 패널은 나선형(A, B, C, D, E) 및 루프(AB, CD, EF) 각각의 분별된 영역을 따라 2개 내지 8개 잔기에서 대체되도록 설계되었다. 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노-말단 태그가 친화성 정제를 위하여 포함되고, 엔테로키나제 링커 서열 부위가 아미노-말단 신장의 제거를 위하여 포함되었다. 생성된 인터페론은 "his 태그된-인터페론(IFN)-베타" 또는 "His6-인터페론-베타" 등으로 상호교환적으로 호칭된다.
야생형 IFN-베타 유전자 작제물을 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용하여 다양한 돌연변이체 his-태그된-IFN-베타 발현 플라스미드를 제작하였다. 돌연변이유발 방법은 야생형 his-태그된-IFN 베타 유전자를 통하여 유일한 제한효소 절단 부위를 도입하는 단계를 제1로 포함하고, 이어서 알라닌(또는 세린) 치환 돌연변이를 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드 2본쇄로 선택된 제한 부위 사이의 독특한 DNA 서열을 대체하는 단계를 포함한다. 최종적으로, 인간 293 신장 세포주에서 포유동물 세포 발현을 지시하는 플라스미드 내로 돌연변이 IFN 유전자를 서브클론하였다.
상기 돌연변이의 기능성 결과를 항바이러스 및 항증식 분석에서 분석하였다. 인간 다우디 버킷츠 림프종 세포의 표면 수용체("IFNAR1/2 복합체")에 결합하는 돌연변이를 분석하기 위하여 비방사능 IFN 결합 분석을 개발하였다. 또한, 힌지, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 영역에 융합된 IFN 수용체 단백질 IFNAR2 세포외 영역으로 구성된 IFNAR2/Fc 융합 단백질을 이용하는 his-IFN-베타 돌연변이와 IFNAR2 간의 표면 상호작용을 맵핑하는 분석을 개발하였다.
1.돌연변이유발을 위한 주형으로서 인터페론 베타 유전자의 제조
IFN-베타 알라닌(또는 세린) 치환된 돌연변이를 제조하기 위한 한 방법은 먼저 유전자 주위에 흩어진 유일한 제한 효소 절단 부위를 보유하나 야생형 단백질을 암호화하는 개질된 IFN-베타 유전자를 제조하는 것이다. 유일한 부위는 돌연변이된 코돈을 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드 2본쇄에 대하여 야생형 서열을 교환하는데 사용되었다. 돌연변이 유전자의 생성에 적절한 인간 IFN-베타-1a 발현 카세트를 얻기 위하여, IFN-1베타 cDNA(GenBank 기탁번호 #E00029)를 PCR에 의하여 증폭시켰다. 플라스미드 pMJB107, pACYC184의 유도체내로(참조 Rose et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(1) 355) IFN-베타 유전자의 초기 클로닝은 돌연변이유발을 통하여 생성될 수 있는 특이적 제한 효소 부위가 부족한 플라스미드 중 유전자의 부위-지정된 돌연변이유발을 수행하기 위하여 필요하였다.
인간 IFN-베타 유전자의 코딩 서열을 서브클론하는데 사용된 PCR 프라이머로 IFN-베타 유전자(5'PCR 프라이머 5'TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3'(서열 목록번호:9:"BET-021", 및 3'PCR 프라이머 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCY\TGTAAGTC-3'(서열 목록 번호:10:"BET-022")와 부합되는 프레임으로 그 상부에 엔테로 키나제 링커 서열을 도입하고 플라스미드 pMJB107 부위내로 클로닝하는데 유용한 인접하는 제한 효소 부위(BspEI 및 XhoI)를 도입할 수 있다. 생성된 DNA는 PCR 단편 A로 언급된다.
인간 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 신호 서열로부터의 효과적인 신호서열 및 6개의 히스티딘 태그를 pDSW247(단편B)에서 제조된 제2 DNA 단편으로부터 최종 작제물내로 도입하였다. 플라스미드 pDSW247은 EBNA-1 유전자가 결실된 pCEP4(캘리포니아주 칼스배드, 인비트로겐)의 유도체로서 6개 히스티딘 태그의 상단에서 프레임에 부합되도록 융합된 VCAM-1 신호 서열(VCAMss)을 보유한다. VCAMss-1/히스티딘 태그 카세트 분절을 생성하는데 사용되는 PCR 프라이머가 KID-369(5'PCR 프라이머 5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3': 서열 목록 번호:11) 및 KID 421 (3'PCR 프라이머 5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3": 서열 목록 번호:12)이며, 이것은 단편 B DNA의 절단을 허용하는 인접하는 제한 효소 절단 부위(NotI 및 BspEI)를 함입하고 있다.
VCAM-1 신호 서열 his 태그 및 인터페론-베타 유전자를 보유하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여, 본 발명자는 플라스미드 벡터 pMJB107(NotI 및 XhoI 절단됨), PCR 단편 A(BspEI 및 XhoI 절단됨) 및 단편 B(NotI 및 BspEI 절단됨)에서 겔 정제된 DNA 단편을 사용하여 3-방식 연결을 수행하였다. 상기 연결된 플라스미드는 JA221 또는 XL1-Blue E. Coli 세포를 형질전환시키는데 사용되고, 암피실린 저항성콜로니를 위하여 제한 맵 분석에 의하여 삽입체에 대하여 시험되었다. 맥시프펩 (Maxiprep)에 의해 DNA를 다량 얻어, 삽입체 서열을 DNA 서열결정에 의하여 확인하였다. 생성된 작제물을 pCMG260이라고 한다.
2.pCMG260에서 인간 인터페론-베타의 알라닌 치환 돌연변이체의 제조
플라스미드 pCMG260은 수회의 돌연변이유발법(U.S.E. 부위 지정된 돌연변이유발 키트, 뵈링거-만하임)을 위한 주형으로 사용되었다. 상기 방법은 IFN-베타 단백질 코딩 서열을 따라 위치내에 유일한 제한 절단 부위를 도입시키나 생성된 단백질의 서열을 변화시키지 않는다. 돌연변이된 플라스미드는 E.coli의 JA221 또는 XL1-Blue를 형질전환시키는 데 사용되었고, 균주 및 재조합 콜로니는 클로람페니콜 저항성에 대하여 선택된다. 클로람페니콜 저항성 콜로니는 DNA 제한 맵핑 분석에 의하여 원하는 유일한 제한 효소 부위의 존재에 대하여 추가로 시험되었다. 유일한 제한 효소 절단 부위의 완전한 세트 및 유전자의 DNA 서열을 포함하는 생성된 IFN-베타 플라스미드, pCMG275.8가 증명되었다. 개질된 his-태그된 인터페론 베타 유전자의 전장 DNA 서열은 야생형 단백질 코딩 서열과 함께 도1에 제시된다.
알라닌 치환 돌연변이의 완전한 세트가 표1에 설명된다(다음 페이지). 돌연변이체의 이름은 돌연변이가 도입되는 구조 영역(나선형 및 루프)를 특정한다. 알라닌(세린) 치환의 완전한 패널이 인간 IFN-베타의 165개 아미노산 중의 65개의 돌연변이를 생성한다.
돌연변이의 패널은 표2(하기 참조)에 나타난 유전자 코딩 정보를 보유하는 합성 올리고뉴클레오티드 2본쇄로 유일한 제한 효소 부위 간의 DNA의 분절을 대체함으로써 pCMG275.8에서 제조되었다. 다양한 알라닌 치환 돌연변이체 플라스미드를 제조하기 위하여, 겔 정제된 pCMG275.8 벡터(적절한 제한 효소로 절단된, 각 IFN-베타 구조 영역에 대하여 아래 목록에서 지시한 바와 같음)와 올리고뉴클레오티드 2본쇄를 함께 연결하였다. 연결 혼합물이 암피실린 저항성에 대하여 선택된 재조합 콜로니 및 E.coli의 JA221 균주를 형질전환시키는데 사용되었다. 적절한 제한 효소 부위에 대한 검색에 의하여 돌연변이의 삽입의 존재에 대하여 암피실린 저항성 콜로니를 시험하였다. 2개의 돌연변이체(A2 및 CD2)에 있어서, 클로닝 전략은 상보적인 오버행 말단을 보유하여 3가지 방식 연결에서 벡터 IFN-베타 골격과 서로 연결되도록 하는 합성 올리고뉴클레오티드의 2개의 2본쇄(표2에 나타남)를 사용하는 것을 필요로 하였다. 다음의 목록은 표2에서 돌연변이된 올리고뉴클레오티드를 클론하는데 사용되는 부위를 예시한다. 클로닝 계획(서브섹션 B)은 인터페론 베타 유전자 상에 상기 유일한 부위의 위치를 나타낸다.
A 나선형 BspEI 내지 MunI 또는 BglII 내지 PstI
AB 루프 MunI 내지 PstI 또는 MunI 내지 BsaHI
H 나선형 BspHI 내지 BsaI 또는 BsaHI 내지 BsaI
C 나선형 BsaI 내지 XbaI
CD 루프 XbaI 내지 BspHI 또는 XbaI 내지 DraIII
D 나선형 BspHI 내지 DraIII
DE 루프 BspHI 내지 PvuI
E 나선형 PvuI 내지 BstEII
IFN-β지정된 선은 야생형 인간 IFN-β서열을 나타낸다. IFN-β잔기의 알라닌 또는 세린 치환은 돌연변이의 각각에 대하여 나타나고, 하기 적절한 영역에서 점선은 야생형 서열을 나타낸다. 나선형 및 루프 구조는 하기 돌연변이의 선으로 나타난다. DE 루프는 D 및 E 나선형 사이의 갭에 걸쳐있다. 2개의 추가적 알라닌 치환 돌연변이(H93A, H97A 및 H121A)가 생성되고 항바이러스 분석에서 분석되어 결정 구조 이량체에서 아연을 킬레이트하는 상기 히스티딘를 돌연변이시키는 영향을 측정한다. 이것은 IFN-β활성에 대하여 중요하지 않은 아연-개질된 이량체 형성을 제시한다.
B.EBNA 293 발현 플라스미드의 제작
VCAM-1 신호 서열, his 태그 및 엔테로키나제 링커 서열에 융합된, 야생형 및 돌연변이 IFN-베타 유전자가 761 염기쌍 NotI 및 BamHI 제한 단편으로서 겔 정제되었다. 정제된 유전자는 pCEP4(캘리포니아, 칼스바드, 인비트로겐)의 유도체이며 NotI 및 BamHI로 절단된 플라스미드 벡터 pDSW247내로 서브클론된다. 플라스미드 pDSW247은 인간 EBNA 293 신장 세포(캘리포니아, 칼스바드, 인비트로겐)에서 단백질의 한시적 발현을 위한 발현 벡터이다. 이것은 사이토메칼로바이러스 초기 유전자 프로모터 및 이 시스템에서 고도의 유전자 발현을 위하여 필요한 EBV 조절 인자 및 E.coli(암피실린 저항성)에 대한 선택 마커 및 EBNA 293 세포(히그로마이신 저항성)를 포함한다. 연결된 플라스미드는 JA221 또는 XL1-블루 E.Coli 세포를 형질전환시키는데 사용되었고, 암피실린 저항성 콜로니를 채취하여 제한 효소 맵 분석에 의하여 삽입체에 대하여 시험되었다. 최대 제조 DNA를 제조하고 삽입체의 서열을 DNA 서열결정에 의하여 확인하였다. 원하는 돌연변이된 서열을 보여주는 양성 클론은 인간 EBNA 293 신장 세포를 형질감염시키는데 사용되었다.
전체 클로닝 및 발현 방법은 도12에 제시된다.
C.IFN-베타-1a 알라닌 치환 돌연변이체의 발현 및 정량
인간 EBNA 293 세포(캘리포니아주, 칼스바드, 인비트로겐, 키텐덴, T. (1989) J. Virol. 63; 3016-3025)는 10 % 태아 소 혈청, 2mM 글루타민 및 250 ug/ml 제네티신(메릴랜드 게터스버그, 라이프 테크놀로지)로 보충받은 둘베코스의 개질된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's media)에서 하위합류성 배양물로서 유지되었다. pDSW247 발현 플라스미드는 리포펙타민 프로토콜(라이프 테크놀로지, Gibco/BRL)을 사용하여 EBNA 293 세포내로 순간적으로 형질감염시켰다. 조건화된 배지는 형질감염 후 3-4일째에 회수하고, 세포 파편을 원심분리기에 의하여 제거하고, his-IFN-베타 농도는 ELISA에 의하여 정량화하였다.
ELISA 분석은 폴리클론 래빗 항체(프로틴 A, 정제된 Ig, 항체는 정제된 인간 IFN-베타-1a에 대하여 상승됨)을 사용하여 96-웰 ELISA 플레이트를 코우팅하고, 동일한 폴리클론 래빗 Ig의 바이오틴화된 형태를 제2 시약으로 사용하여 스트렙트아비딘-연결된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: Jackson ImmunoResearch. W. Grove, PA)를 사용하여 인터페론을 검색하였다. 인터페론-베타-1의 희석 시리즈(바이오겐, 인크.에서 상품명 AVONEX로 시판)을 사용하여 표준 농도 곡선을 만들었다. EBNA 형질감염체로부터 his-IFN-베타-함유 조건화된 배지를 희석하여 ELISA 분석에서 10ng/ml 내지 3.0ng/ml 범위의 농도를 갖는 샘플을 획득하였다. ELISA에 의하여 결정되는 배지내 IFN-베타의 농도를 입증하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 감소된 배양 상층액 및 IFN-베타-1a 표준은 10-20% 구배 겔(캘리포니아주 샌디에고 노벡스)상의 SDS-PAGE에 주입하고 PDVF 막위에서 블롯하였다. 면역반응성 밴드를 래빗 폴리클론 항-IFN-베타-1a 항혈청(#447, 바이오겐, 인크. IFN-베타-1a에 대하여 상승하는 제2 항혈청)으로 검색한 후, HRP-연결된 당나귀 항-래빗 IgG(펜실베니아주 더블유. 그로브, Jackson ImmunoResearch)으로 처리하였다.
D.인터페론-베타 돌연변이체의 수용체 결합 분석
2개의 다른 결합 분석을 사용하여 C에서 설명한 인터페론-베타 돌연변이의 수용체 결합 성질이 분석되었다. 한 분석은 인간 IgG의 불변부의 일부에 융합된 인간 IFNAR2 수용체 쇄의 세포외 영역을 포함하는 융합 단백질, IFNAR2/Fc에 대한 인터페론-베타 돌연변이의 결합을 측정하였다. IFNAR2-Fc를 차이니즈 햄스터난자(CHO) 세포에서 발현시키고 제작자의 지시에 따른 프로틴 A 세파로스 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제하였다(Pierce Chem. Co., Pockford, IL, 카탈로그 #20334). IFNAR2-Fc에 대한 인터페론-베타 돌연변이체의 결합을 ELISA 포맷 분석에서 측정하였다. 코우팅 완충액(50 mM NaHCo3, 0.2mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, pH9.6) 중 10㎍/ml의 마우스 항-인간 IgG1 모노클론 항체(CDG5-AA9, Biogen, Inc.) 50 ㎕/웰로 밤새 4 ℃에서 평평한-바닥의 96 웰 플레이트를 코우팅함으로써 ELISA 플레이트를 제조하였다. 플레이트를 0.05 % 트윈-20을 포함하는 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중 0.5 % 무지방 건조 우유로 차단하였다. 2회 이상의 세척 후에, 0.05 % 트윈-20을 포함하는 PBS 중 0.5 % 우유 중의 50ul의 1ug/ml IFNAR2-Fc를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1 시간동안 항온처리한 후, 이어서 플레이트를 2회 이상 세척하였다. 10% 태아 소 혈청으로 보충된 둘베코스 개질된 이글스 배지(DMEM)에서 연속적으로 희석된 조건화된 배지 중의 50 ul/웰 돌연변이 인터페론-베타를 첨가한 후 4℃에서 2시간 동안 항온처리함으로써 IFNAR2-Fc에 대한 인터페론-베타 돌연변이의 결합을 측정하였다. 인터페론-베타 돌연변이체의 희석은 통상 약 1 uM 에서 10 pM의 범위이다. 세척 후, 플레이트에 결합된 인터페론-베타는 래빗 폴리클론 항-인터페론 항체(#447, 바이오겐, 인크.) 및 호스래디쉬 퍼옥사이드(HRP)-표지된 당나귀 항-래빗 IgG(잭슨 이뮤노리서치)의 1:1000 희석으로 구성된 칵테일의 50 ul/웰을 첨가한 후 4℃에서 15분 동안 항온저리함으로써 검색하였다. 2회 세척 후, HRP 기질을 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 항온처리한 후, 450 nm의 흡착에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 흡착 대 돌연변이 인터페론-베타의 농도로서 데이터를 플롯하고, IFNAR2-Fc에 대한 돌연변이 인터페론-베타의 결합에 대한 친화성을 단순한 포물선 결합 식에 데이터를 맞춤으로써 측정하였다. 상기 분석의 결과는 표3에 나타나며, 3중 실험에서 결정된 각 돌연변이에 대한 결합 친화성은 His6-야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 측정된 것의 백분율로서 표현된다.
제2 수용체 결합 분석은 인터페론-베타에 대한 수용체를 함께 포함하는 IFNAR1 및 IFNAR2의 양 수용체 쇄를 발현시키는 다우디 세포에 결합된 인터페론-베타 돌연변이의 친화성을 측정하는 데 사용되었다. 상기 FACS-기초한 분석은 인터페론-베타가 결합된 수용체로부터 비어있는(유리) 수용체를 구별하기 위하여 IFNAR1의 세포외 영역에 대하여 지시된 차단성 모노클론 항체, EA12(바이오겐, 인크.)를 사용하였다. 다우디 세포(2.5×107세포/ml에서 20 ul)를 다양한 농도의 인터페론-베타 돌연변이(PBS 중 5% FBS, 0.1 % NaN3; FACS 완충액 중 20 ul)로 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 인터페론-베타 돌연변이의 바람직한 일련의 희석은 0.5 uM에서 0.5 pM의 범위이다. 각 웰에 바이오틴화된 뮤린 항-IFNAR1 모노클론 항체 EA12(10ul) 100 ng을 첨가한 후, 추가로 2분 동안 실온에서 플레이트를 항온처리한 후, FACS 완충액(4℃)로 2회 세척하였다. 이어서 세포는 50 ul/웰의 1:200 희석의 R-피코에리트린-접합된 스트렙트아비딘(펜실베니아주 웨스트 그로브, 잭슨 이뮤노리서치)으로 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, FACS 완충액에서 2회 세척한 후, 0.5 % 파라포름알데히드를 포함하는 300 ul FACS 완충액에 재현탁하고, 12×75 mm폴리스티렌 튜브(팔콘 2052)내로 이전시켰다. 이어서 샘플을 FACScan(벡톤 디킨슨)상에서 플로우 시토메트리에 의하여 분석하였다. 평균 채널 형광 강도(MFCI) 대 인터페론-베타 돌연변이체의 농도로 데이터를 플롯하였다. 결합 친화성은 항체 염색을 50 % 저해하는 인터페론-베타 돌연변이의 농도로서 정의하였다. 각 돌연변이는 여러번 시험하였다. 도4는 상기 방법에 의하여 측정된 각 인터페론-베타 돌연변이에 대한 수용체 결합 친화성을 나타내며, 이것은 각 실험에서 His6-야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 측정된 친화성의 백분율로서 표현된다.
E.인터페론-베타 돌연변이체의 기능 분석
세포 증식을 저해하는 인터페론-베타의 능력 및 항바이러스 활성에 대한 시험관내 분석을 사용하여 인터페론-베타 돌연변이의 기능 활성에 대하여 시험하였다. 3개의 항바이러스 분석의 최소점, 각 3중 데이터 점은 각 돌연변이에 대하여 수행되었다. His6-야생형 인터페론-베타-1a는 매 실험에서 참고로서 포함되었다. 항바이러스 분석은 완전한 항바이러스 보호에서 바이러스 세포 사멸로부터의 비보호 사이의 범위에 걸치는 농도로 돌연변이체 인터페론-베타의 2배 연속 희석액들로 A549 인간 폐암 세포(ATCC CCL185)를 처리함으로써 수행되었다. 다음날, 인터페론의 부재시 완전한 세포 사멸을 야기하는 희석된 뇌심근염 바이러스(ECMV)로 세포를 2일동안 공격하였다. 이후 플레이트를 대사 염색 MTT(2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포-페닐]-2H-테트라졸리움-5-카르복시아니라이드)(미주리주 세이트 루이스, 시그마, M-5655)로 현상하였다. MTT의 주용액을 PBS중 5mg/ml에서 제조하고 살균 여과 시킨 후, 상기 용액의 50 ul을 세포 배양액(웰 당 100ul)내로 희석하였다. 실온에서 30 내지 60분 동안 항온처리한 후, MTT/배지 용액을 폐기하고, 세포를 100 ul PBS로 세척하고, 최종적으로 대사된 염색약을 90% 이소프로판올 중 100 ul 1.2 N 염산으로 용해하였다. 살아있는 세포(염색약의 존재에 의하여 증명된)는 450 nm 흡광도에 의하여 정량되었다. 데이터를 농도 인터페론-베타 돌연변이에 대한 흡광도를 플롯함으로써 분석하고, 각 돌연변이의 활성도를 세포의 50%가 사멸되는 농도로서 정의하였다. 도5는 각 실험에서 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 측정된 활성의 백분율로서 표현된 각 돌연변이의 활성도를 나타낸다.
인터페론-베타 돌연변이를 또한 항증식 분석에서 기능에 대하여 분석하였다. 인간 다우디 버킷츠 림프종 세포(ATCC #CCL213)를 2 mM L-글루타민 및 10% 한정된 태아 소 혈청(유타 로간 하이클론)으로 보충된 RPMI에 2×105세포/ml로 종균하였다. 또한 각 웰은 웰당 배지 100 ul의 최종 총부피 중에 주어진 농도의 인터페론-베타 돌연변이를 포함하였다. 사용된 인터페론-베타 농도는 다우디 세포 증식의 최대 저해로부터 비저해(즉, 완전 증식)까지의 범위에 걸치도록 선택되었다. 시험된 인터페론-베타 돌연변이의 각 농도에 대하여 두벌의 실험적 포인트를 사용하고, 비처리된 세포의 두벌 세트가 모든 실험에 포함되었다. 세포를 37℃의 5 % CO2항온배양기에 2일 동안 항온배양한 후, 50 ul 배지중 삼중화 티미딘((메틸-3H), 티미딘, 아머스샴 TRK758)을 웰 당 1u Ci로 각 웰에 첨가하고, 추가로 4 시간동안 항온배양하였다. 세포를 LKB 플레이트 수확기를 사용하여 수확하고, 삼중화된 티미딘의 함입을 LKB 베타 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 두벌 실험값을 평균화하고 표준 편차를 결정하였다. 데이터를 분당 평균 계수 대 인터페론-베타 돌연변이의 농도로 플롯하고, 각 돌연변이의 활성을 관찰된 최대 성장의 50%를 저해하는 데 필요한 농도로서 정의하였다. 각 돌연변이에 대한 다중 분석을 수행하였다. 도6은 각 실험에서 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 발견된 활성의 백분율로서 표현되는 결과를 보여준다.
F.인터페론-베타 돌연변이의 성질
히스티딘 태그된 야생형 인터페론-베타-1a는 태그되지 않은 야생형 인터페론-베타-1a에 대하여 발견된 상응하는 활성보다 각각 약 3배 낮은 항바이러스 및 항증식 분석의 활성을 갖는 것으로 발견되었다. 인터페론-베타 돌연변이 A1-E 모두는 이것의 N-말단에 동일한 his 태그 서열을 갖기 때문에, 분자의 성질에 미치는 돌연변이의 효과는 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에서 관찰된 활성에 대한 항바이러스, 항증식 및 결합 분석에서 상기 돌연변이체의 활성을 비교함으로써 결정되었다. 상기에서, 본 발명자는 his 태그된 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 돌연변이 A1-E의 활성의 변이는 N-말단 his 태그의 부재시 상기 동일한 돌연변이가 갖는 효과와 정량적 및 정성적으로 동일하다고 가정한다. 기타 가용성 시토킨의 태그된 또는 융합 작제물에 대한 동등한 가정은, 특히 태그된 또는 융합 작제물의 시험관내 기능성 활성이 본원에서처럼 야생형 시토킨과 밀접한 경우 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법의 실행에 의하여 통상 사실로 지지된다. 참조, Pearce K.H.Jr, et al., J.Biol.Chem. 272:20595-20602(1997) 및 Jones J.T., et al., J.Biol. Chem. 273:11667-11674 (1998).
도3-6에 나타난 데이터는 표적화된 돌연변이유발법에 의하여 야기된 3가지 유형의 영향을 제안한다. 상기 영향은 특정 환경하에서 인터페론 약물 개발에 있어서 유리할 것이다. 3가지 유형의 영향은 다음과 같다: (a) 야생형 인터페론-베타-1a보다 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이(예, 돌연변이 C1); (b) 항바이러스 및 항증식성 분석에서 활성을 나타내지만, 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 항바이러스 활성에 비하여 불균형적으로 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이(예, 돌연변이 C1, D 및 DE1); 및 (c) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여 수용체 결합에 비하여 불균형적으로 낮은 항증식 및 항바이러스 활성을 나타내는 기능성 길항제(예, A1, B2, CD2 및 DE1). 일부 돌연변이는 1 이상의 부류에 속할 수 있다. 상기 부류는 다음과 같이 재고된다. 본 발명자는 열거된 상기 실시예에 있어서 상기 부류의 돌연변이를 특성화하는 경우, 상기 영역에서 기타 돌연변이가 활성에 있어서 유사한 또는 매우 향상된 효과를 야기할 수 있다고 평가한다:
(a) 돌연변이체 C1은 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a보다 약 6배 큰 항바이러스 활성을 보유한다. 상기 돌연변이 및 기타 상기 유형은 주어진 수준의 항바이러스 영향을 달성하기 위하여 투여되어야 하는 인터페론-베타의 양을 감소시키는데 유용할 것으로 예측된다. 투여되는 단백질의 양을 낮추는 것은 단백질의 면역생성원을 낮추는 것으로 예측되며, 또한 기작에 기초하지 않은 독성에 의한 부작용을 감소시킬 것이다. 인터페론-베타 투여의 치료적 이점이 항바이러스 효과로부터 야기되는 경우 및 항증식 효과가 독성 또는 원치않는 부작용을 야기하는 경우에 상기 부류의 돌연변이가 이로울 것으로 예측된다.
(b) 항바이러스 및 항증식 분석에서 알라닌 치환된 돌연변이의 상대적 활성(% 야생형)은 도7에서 비교된다. 조화적으로 변하는 활성(즉, 야생형 his 태그된-인터페론-베타-1a의 활성으로부터 동일한 인자만큼 차등화되는 항바이러스 및 항증식 활성)이 대부분의 돌연변이에서 나타난다(대각선 상에 위치함). 그러나, 일부 돌연변이는 대각선으로부터 전이에 의하여 증명되는 바와 같이, 야생형 his 태그된 인터페론-베타-1a에 비하여, 한 분석에서의 활성이 다른 것에 비하여 더 큰 변이를 나타낸다. 3개의 상기 돌연변이는 아래와 같은 표에서 나타난다. 돌연변이 C1은 항바이러스 활성이 야생형 his 태그된 인터페론-베타-1a보다 6배 높지만, 항증식 분석에서 야생형과 유사한 활성을 나타낸다. 따라서 돌연변이 C1은 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성에 대하여 5.2 인자만큼 향상되는 항바이러스 활성을 갖는다. 유사하게는, 돌연변이체 D는 항바이러스 분석에서 야생형 활성의 65%를 나타내지만, 항증식 분석에서 야생형 활성의 단 20%를 나타내며, 따라서 야생형에 비하여 항증식 활성에 대하여 3.4 배 향상된 항바이러스 활성을 갖는다. 돌연변이체 DE1은 항바이러스 분석에서 야생형 활성의 26%를 나타내지만, 항증식 분석에서 야생형 활성의 8.5%만을 나타내므로, 따라서 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a에 비하여 항증식 활성에 대한 3.0배 향상된 항바이러스 활성을 갖는다. 원하는 수준의 항바이러스 활성을 달성하기에 충분한 농도로 투여하는 경우 상기 돌연변이 단백질은 야생형 단백질보다 실질적으로 낮은 수준의 항증식 활성을 나타낼 것이다. (a) 부류에서처럼, 상기 부류에서 돌연변이는 인터페론-베타 투여의 치료적 이점이 항바이러스 효과에서 야기되는 경우 및 항증식 효과가 독성 또는 원치않는 부작용을 야기하는 경우에 이로울 것으로 예측된다.
돌연변이 항바이러스 활성(AV)(% 야생형) 항증식(AP)활성(% 야생형) AV/AP
C1 571 109 5.2
D 65 19 3.4
DE1 26 8.5 3.0
(c) 야생형 his-태그된 인터페론-베타-1a에 비하여, 수용체 결합에 있어서 낮은 항바이러스 및 항증식 활성을 갖는 돌연변이(하기 표 참조). 돌연변이체 A1은 야생형 his 태그된 인터페론-베타-1a에서 관찰된 것보다 2.0 배 및 1.8 배 높은 항바이러스 및 항증식 활성을 나타내지만, 야생형보다 29배 높은 친화성으로 다우디 세포에 대한 동족 수용체에 결합한다. 따라서, IFN-베타 수용체에 대한 상기 돌연변이의 결합은 단백질의 항바이러스 및 항증식 활성에 비하여 약 15배 향상된다. 유사하게는, 돌연변이체 B2, CD2 및 DE1은 항바이러스 활성에 대하여 각각 4.6-, 4.6- 및 18-배의 결합 증가를 나타내며, 항증식 활성에 대하여 3.5-, 15- 및 54-배의 결합의 향상을 나타낸다. 상기 단백질은 수용체에 결합하고 차지하는 능력을 갖기 때문에 내인성 IFN-베타의 활성 및 기타 내인성 유형 I 인터페론의 가능한 활성에 대한 기능적 길항제로서 유용하다고 예측되지만, 야생형 IFN-베타와 함께 나타나는 기능적 반응의 작은 부분을 표적 세포에서 생성한다.
돌연변이 항바이러스 활성(AV)(%야생형) 항증식활성(AP)(%야생형) 세포 결합 활성(%야생형) 결합/AV 결합/AP
A1 200 180 2900 15 16
B2 7.1 9.2 33 4.6 3.5
CD2 150 46 690 4.6 15
DE1 26 8.5 460 18 54
G.인터페론의 3차 구조와 뮤테인의 관계
뮤린 인터페론 베타의 비-글리코실화된 형태[T. Senda, S.Saitoh 및 Y. Mitsuri. 2.15Å 해상도에서 재조합 뮤린 인터페론-β의 정제된 결정 구조, J. Mol. Biol. 253: 187-207 (1995)] 및 인간 인터페론 알파-2b[R. Radhakishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta, T.L. Nagabhushan 및 M.R. Walter. X-선 결정학에 의하여 밝혀진 인간 인터페론-α2b의 아연 매개된 이량체. Structure. 4: 1453-1463(1996)]에 대하여 출판된 결정 구조는 인간 인터페론 베타의 폴리펩티드 골격에 대한 모델을 제공하였으며, 본 발명자는 최근에 글리코실화 단계에서 인터페론-베타-1a를 위한 구조를 해석하였다[M. Karpusas, M. Nolte, C. B. Benton, W. Meier, W. N. Lipscomb, 및 S. E Goelz. 2.2Å 해상도에서 인간 인터페론-β의 결정 구조. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818(1997)].
본원의 돌연변이 분석의 결과는 인터페론-베타-1a의 3D- 구조에 관하여 요약될 수 있다(본원에서 제시되지 않음). 특정 돌연변이 잔기는 활성을 감소시킨다(2 내지 5배 이상의 감소). 돌연변이된 영역은 표1 및 2에서 주어진 치환에 상응한다.
기능에 매우 상당한 영향을 미치는 돌연변이는 활성 및 세포 표면 수용체 결합을 상당히 감소시킨다. 상기 돌연변이 중 어느 것도 본원의 분석에서 IFNAR/Fc에 결합하지 않기 때문에, 상기 영역(A2 나선형, AB&AB2 루프 및 E 나선형)은 IFNAR2 결합 영역의 돌연변이와 상응한다.
IFNAR2 결합에 중요한 상기 돌연변이는 또한 세포 결합에 영향을 주는 한편,세포 표면 결합 성질은 또한 분자의 기타 영역(B1 나선형, C2 나선형)의 잔기에 의하여 영향을 받는다. IFN-베타-1a 분자의 N-말단, C-말단 및 글리코실화된 C 나선형 영역이 수용체 결합 부위내에 존재하지 않는다는 것은 알라닌 치환 돌연변이의 영향을 도시하는 3-D 모델에서 알 수 있다(제시되지 않음). 상기 영역에서 돌연변이는 생물학적 활성을 감소시키지 않거나 또는 세포 표면 수용체 결합을 감소시키지 않았다.
실시예2: 인터페론-베타-1a 융합(IFN-베타/Fc) 단백질의 발현을 위한 플라스미드의 제작
PCR 기법은 뮤린 IgG2 중쇄 분자의 Fc 부분에 융합된 인간 IFN-베타 DNA 서열을 암호화하는 발현 플라스미드를 제작하는데 사용되었다. 플라스미드 벡터 pDSW247(실시예1 참조)은 EBNA-1 유전자가 결실된 것에서 유래한 pCEP4의 유도체(캘리포니아주, 칼스바드, 인비트로겐)이다. 상기 플라스미드는 EBNA293 인간 신장 세포(캘리포니아 칼스바드, 인비트로겐, Shen. E. S., et al. 1995, Gene 156, 235-239)에서 한시적 단백질 발현에 사용되는 발현 벡터의 제작에 사용되었다. 인터페론 베타 서열의 상단에 그 프레임과 부합되도록 인간 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 신호 서열을 포함하고, 인터페론 베타 및 Ig 서열의 연결부에 엔테로키나제 링커 서열을 포함하도록 설계되었다.
융합 단백질 발현 카세트는 일부 DNA 단편으로부터 조립되었다. 인간 IFN-베타 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 얻기 위하여, 인간 IFN-베타의 cDNA 서브클론(GenBank 기탁 #E00029)은 IFN-베타의 제1 코돈의 상단에 제한 효소 절단부위(BsaI)를 함입하는 프라이머(5'- GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC(서열 목록 번호:31:"BET-025") 및 5'-GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG(서열 목록 번호:32:"BET-026")를 사용하는 PCR에 대한 주형으로서 사용되었다. IFN-베타 유전자에 대한 3'PCR 프라이머(서열 목록 번호:32:BET-026)가 IFN-베타 말단 코돈을 제거하고, 발현 벡터내로 서브클로닝하는데 유용한, 프레임내 엔테로키나제 링커 서열(DDDDK) 및 말단 제한 효소 부위(XhoI) 모두를 함입하였다. IFN-베타 코딩 서열의 상단에 도입되는 BsaI 부위로 인하여 IFN-베타 유전자 코딩 서열과 부합되게 그 상부에 VCAM-1 신호 서열을 연결시켰다. 상기 VCAM-1 신호 서열은 또한 5' 제한 효소 절단 부위(NotI, pDSW247 NotI 클로닝 부위에의 연결을 위함) 및 3' 제한 효소 절단 부위(BsaI, IFN-베타-1a 5'PCR 단편에의 연결을 위함)를 포함하는 프라이머 쌍 5'-CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3'(서열 목록 번호:33:"BET-023") 및 5'-GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3'(서열 목록 번호:34:"BET-024")을 사용하여 PCR에 의하여 생성되었다. PCR을 위한 주형은 인간 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) cDNA(GenBank 기탁번호 X53051)이었다.
IFN-베타-1a/Fc 융합 유전자를 제작하기 위하여, 다음의 방법을 수행하였다. 뮤린 IgG2a 단편을 SalI+BamHI 절단 DNA 단편의 겔 정제에 의하여 pEAG293으로부터 제거하였다. 플라스미드 pEAG293은 뮤린 IgG2a(GenBank 기탁번호 V00798)의 힌지, CH2 및 CH3 영역의 블루스크립트 IISK+(캘리포니아주 라졸라 스트라타진, 카탈로그 #212205) 서브클론이다. PCR 프라이머쌍 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3'(서열 목록 번호:35), 여기서 S=C 또는 G, M=A 또는 C, R=A 또는 G, W=A 또는 T, 및 5'-CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3'(서열 목록 번호:36)은 카세트의 5' 및 3' 말단에 각각 인접하는 SalI 및 NotI 부위를 형성한다. 뮤린 IgG2a Fc 영역 카세트는 단일 염기(코돈 V369)에서 GenBank 서열과 달라, 잠재(silent) 돌연변이를 만든다. 따라서, 야생형 Fc 단백질은 상기 IgG2a Fc 카세트로부터 발현된다.
C-말단 엔테로키나제 링커 서열을 가진 huIFN-베타 유전자에 융합된 VCAM-1 신호 서열을 함유하는 DNA 단편을 NotI과 BamHI 절단에 의해 pCMG258로부터 절단하여 겔 정제하였다. SalI 부위는 원래의 pDSW247 플라스미드 상에 존재하고, IFN-베타 유전자 코딩 서열에 부합되는 프레임으로 바로 하단에 위치한다. 플라스미드 벡터 pDSW247은 겔 정제된 NotI+BamHI 단편(실시예1 참조)으로 제조되었다. 상술된 단편을 사용한 3-방식법을 수행하여, IFN-베타-1a/IgG2a 융합을 암호화하는 최종 발현 벡터를 조립하였다. 상기 발현 플라스미드는 pCMG261로 명명되고 성숙한 인간 IFN-베타, 엔테로키나제 링커 서열 및 뮤린 IgG2a Fc 영역을 위한 유전자와 융합된 VCAM-1 신호 서열을 포함한다. 융합 단백질의 전장 DNA(서열 목록 번호:1) 및 단백질 서열(서열 목록 번호:2)은 도2에 제시된다.
실시예3: 포유동물 세포에서 인터페론-베타-1a 융합 단백질의 생성
재조합 IFN-베타/Fc 발현 벡터, pCMG261을 인간 EBNA 293 신장 세포내로 한시적 형질감염시켜 본 발명의 IFN-베타-1a 융합 단백질의 발현을 달성하였다. 상기 재조합 발현 플라스미드는 EBNA 293 세포의 100 mm 배양 접시에 대하여 1-3 마이크로그램 플라스미드 DNA를 사용하는 제조자의의 프로토콜(Life Technologies, 메릴랜드주 게터스버그, Hawley-Nelson, P., Ciccarone, V., Gebeyehu, G. Jessee, J., Felgner, P. L. (1993) Focus 15.73)에 따라 리포펙타민 프로토콜(카탈로그 #18324-020, Life Technologies)에 의하여 EBNA 283 인간 신장 세포내로 형질감염된다. 세포를 리포펙타민으로 형질감염시킨 다음날, 배지를 성장 배지(둘베코스 개질된 이글스 배지, 10% 태아 소 혈청, 4mM 글루타민, 250 mg 젠테신/ml(Life Technologies, 메릴랜즈주 게터스버그)로 대체한다. 조건화된 배지를 3-4일 후에 수확하고, IFN-베타-1a-Fc의 농도를 하기에 설명한 바와 같이 측정하였다.
또한 기타 포유동물 세포 및 원핵 세포 발현계에서 IFN-베타/Fc 융합 단백질의 생성은 적절한 발현 벡터내로 융합 단백질을 위한 단백질 코딩 영역의 전이시 수행될 수 있다. 대안적 발현계로서 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(Barsoum, J. 1995, Methods in Mol.Biol. 48, chapter 18, 225-237) 및 NS-0 뮤린 세포 (Rossman, C. et al., 1996, Protein and Expression and Pur. 7, 335-342), 및 COS7 그린 원숭이 신장 세포(Ettinger, R. et al., 1996, Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 93:23, 13102-13107)와 같은 포유동물 세포 발현계를 포함할 것이다. 적용할 수 있는 기타 진핵 발현계는 효모 피키아 바스토리스(Pichia pastoris)(Eldin, P.E. et al. 1997, J. Immum. Methods, 201, 67-75) 및 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)(Horwitz, A.H., 1998., Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 85, 8678-8682)일 것이다.
형질전환된 EBNA 293 세포의 배양 상층액에서 IFN-베타-1a-Fc 단백질 발현 수준의 정량은 96-웰 플레이트를 코우팅하기 위하여 래빗 항-IFN-베타-1a 폴리클론항체(항원은 정제된 IFN-베타-1a, 바이오겐, 인크.)의 프로틴 A 정제된 IgG 단편을 사용하여 ELISA에 의하여 수행되었다. 항체는 10ng/ml 내지 0.3ng/mL의 인터페론 농도 범위에서 IFN-베타-1a 표준 및 배양 상층액을 검출한다. 바이오틴화된 래빗 폴리클론 항-IFN-베타-1a(상술된 동일한 항체) 및 스트렙트아비딘-연결된 호스라디쉬 퍼옥시다제를 결합된 인터페론을 검출하는데 사용하였다. ELISA 값을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 환원된 배양 상층액과 IFN-베타-1a 표준을 5-20% 트리스-글리신 겔(캘리포니아주 샌디에고, 노벡스) 상에 전개시키고, PVDF 막에 전이시키고(오하이오주 클레브랜드, 아머샴 라이프 사이언스, 인크.), 다른 래빗 폴리클론 혈청으로 검색한 후 호스라디쉬 퍼옥시다제 연결된-당나귀 항-래빗 IgG(펜실베니아주 웨스트 그로브 잭슨 이뮤노리서치) 항체로 검색(IFN-베타-1a에 대하여 상승)을 수행한다.
실시예4: IFN-베타-1a/뮤린-IgG2a 융합 단백질의 항바이러스 활성
인간 폐암 세포(A549)는 뇌심근염 바이러스(EMCV)로 공격하기 전에 IFN-베타-1a 또는 IFN-베타-뮤린 IgG2a(61, 41, 27, 18, 12, 8.2, 5.5, 3.7, 2.5, 1.6 pg/mL)로 24 시간 동안 예비 처리하였다. 바이러스로 2일간 항온배양한 후, 살아있는 세포를 XTT:PMS(인산 완충된 식염수중의 각각 333ug/mL 및 2ng/mL의 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸리움-5-카르복사닐리드 내부 염: 페나진 메토설페이트의 용액으로 염색하고, 450nM에서 분광기로 측정하였다. 분석은 각 IFN 농도에 대한 삼중 데이터 점을 사용하여 수행하였다.
도8에서 표준 편차는 에러 바로 나타난다. IFN-베타-1a에 대한 50% 세포변성효과는 약 0.4 pM로 측정되었다. IFN-베타-뮤린 IgG2a에 대한 50% 세포변성 효과는 0.15pM 로 발견되었다.
실시예5: 인간 인터페론 베타-1a/인간 IgG1 Fc 융합 단백질의 제작 및 생성
A. 인간 인터페론 베타-1a/인간 IgG1 Fc 융합 단백질의 제작
인간 IgG1 중쇄 분자의 Fc 부분(힌지, CH2 및 CH3 영역)에 융합된 인간 IFN 베타 DNA 서열을 암호화하는 발현 플라스미드를 제작하기 위하여 PCR 기법을 사용하였다.
EBNA 작제물: 플라스미드 벡터 pCH269는 EBNA-1 유전자가 결실된 pCEP4(캘리포니아주 칼스바드, 인비트로겐)의 유도체이다. EBNA 293 인간 신장 세포(캘리포니아주 칼스바드, 인비트로겐; Shen E.S., et al 1995, Gene 156, 235-239)에서 한시적 단백질 발현에 유용한 발현 벡터의 제작을 위하여 이 플라스미드를 사용되었다.
융합 단백질 발현 카세트는 3개의 DNA 단편으로 조립되었다: 인간 IFN 베타를 암호화하는 서열에 부합되는 프레임으로 융합된 VCAM-1 신호 서열을 암호화하는 NotI/SalI 단편, 인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 암호화하는 SaI/NotI 단편, 및 EBNA 발현 벡터 pCH269의 NotI 단편.
인간 IFN 베타 유전자에 부합 프레임으로 융합된 성숙한 VCAM-1 신호 서열을 암호화하는 2개의 별도의 NotI/SalI 단편을 PCR 기법에 의하여 제조하였다. PCR 주쇄는 그자체로 엔테로키나제 링커 서열에 융합되고 프레임내에 있는 인간 IFN 베타 유전자에 프레임내로 융합된 성숙한 VCAM-1 신호 서열을 암호화하는 플라스미드pCMG258(실시예2 참조)이었다. PCR 프라이머 2세트가 사용되었다. 프라이머(5'- AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3'(서열 목록 번호:37) 및 5'-ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3':(서열 목록 번호:38)) 중의 한 세트는 위치 162에서 G에서 C로 아미노산을 변화시켰다. 상기 단편은 인간 IFN 베타-C162로 명명된다.
제2 프라이머 세트(5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3'(서열 목록 번호:39) 및 5'-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3'(서열 목록 번호:40))는 또한 G162 에서 C162 아미노산 치환을 도입하고 엔테로키나제 링커 서열(DDDDK)를 인간 IFN 베타 유전자에 프라임내로 3' 융합된 GGGGS 링커 서열로 변화시켰다. 상기 단편은 인간 IFN 베타 C-162/G4S라고 불린다. 두 프라이머 세트는 pCH269로 연결시킬 수 있는 5' NotI 부위를 포함하고, 인간 IgG1의 SalI/NotI 단편과 연결가능한 3' SalI 절단 부위를 포함한다.
인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 암호화하는 인간 IgG1 단편은 플라스미드 SAB 144(미국 특허 제5,547,853호에서 설명)의 유도체인 플라스미드 pEAG409의 제한 효소(SalI/NotI) 절단에 의하여 제조되었다. 단편을 절단하고 겔 정제시켰다. EBNA 발현 벡터 플라스미드 pCH269는 NotI으로 절단하고 겔 정제시켰다.
2개의 인간 IFN-베타-인간-IgG1 Fc 융합 작제물을 2개의 3-방식 연결에 의하여 생성하였다 제1 작제물, ZL6206은 G4S 링커를 포함하고; 제2 작제물, ZL5107은 직접 융합물이다. 직접 융합(실시예10)의 개방 해독 프레임의 전장 DNA 및 단백질 서열은 서열 목록 번호:41 및 서열 목록 번호:42 각각에서 나타난다. 링커 융합의개방 해독 프레임의 전장 DNA 및 단백질 서열(실시예11)은 서열 목록 번호:43 및 서열 목록 번호:44 각각에서 나타난다.
CHO 작제물:
인간 IFN 베타-인간IgG1 Fc 융합 CHO 안정한 발현 작제물은 인간 IgG1 Fc에직접 연결된 인간 IFN 베타로 구성되어 제조되었다. 인간 IFN 베타-인간 IgG1 Fc 단편을 플라스미드 ZL 5107로부터 NotI으로 절단하고 겔 정제시켰다; 이것을 [pAD2베타 플라스미드로부터 유래한] 종열 SV40 초기 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 유일한 NotI 클로닝 부위 및[pCMV베타 플라스미드로부터 유래한] SV40 후기 전사 종결 및 폴리A 신호를 포함하는 발현 벡터 pEAG347의 NotI 부위내로 연결하였다. pEAG347은 MTX 선별 및 형질감혐된 CHO 세포에서의 증식을 위한 pSV2dhfr-유래된 dhfr 및 pUC19-유래된 플라스미드 골격을 포함한다.
B. 포유동물 세포에서 인간 인터페론-베타-1a/인간 IgG1 Fc 융합 단백질의 생성
EBNA293 세포내로 인간 IFN 베타 융합 작제물의 한시적 형질감염:
상술된 재조합 IFN-베타/인간 IgG1 Fc 발현 벡터를 인간 EBNA 293 신장 세포내로 한시적으로 형질감염시켜 본 발명의 IFN-베타-1a 융합 단백질을 발현시켰다. 상기 재조합 발현 플라스미드는 상기 실시예3에 설명된 프로토콜에 따라 EBNA 293 인간 신장 세포내 리포펙타민 프로토콜(카탈로그 #18324-020, Life Techologies)에 의하여 형질감염되었다.
dhfr-CHO 세포내로 인간 IFN베타-1a/인간 IgG1 Fc 융합 작제물(링커 없음)의안정한 형질감염:
상술된 재조합 IFN-베타/인간 IgG1 Fc(링커 없음) dhfr을 함유하는 발현 벡터를 dhfr-CHO 세포내로 안정하게 형질감염시켜 본 발명의 IFN-베타-1a 융합 단백질을 발현시켰다. 상기 재조합 발현 플라스미드는 일렉트로포레이션 (electroporation)에 의하여 형질감염시키고 양성 클론의 선택을 다음 프로토콜에 따라 수행하였다:
BglII로 절단된 플라스미드 DNA(20 mcg)를 침전시키고, HEPES 완충액의 800 mcl로 재현탁시켜 10×107CHO 세포/ml에 첨가하였다. 일렉트로포레이션 후, 세포를 2일동안 DMEM 완전 배지에 배양하였다. 이어서 세포를 완전 DMEM/투석된 10% FBS를 갖는 20-40개의 10cm 접시에 나누고 5일 동안 배양한 후, 2주동안 DMEM에서 MTX의 상승 농도(50-200 ng/ml)를 갖는 선택 배지로 세포를 이동시켰다. 2주 후에, 세포의 단일 콜로니를 선택하여 증식시켰다. 22개의 CHO 클론에서 유래된 상층액을 항바이러스 분석에서 시험하였다:
활성:
융합 단백질의 항-바이러스 활성을 실시예4에서 설명된 CPE 분석에서 결정하였다. 분석에서 사용된 인터페론-베타-1a의 60MU/mg 비(spcetif)활성에 기초하여, 링커의 존재시 한시적으로 (EBNA) 발현되는 인간 인터페론-베타-1a/인간 IgG1 Fc 융합 단백질의 활성은 900 U/ml이었고, 링커의 부재시 활성은 440 U/ml이었다. CHO 발현된 인간 인터페론-베타-1a/인간 IgG1 Fc 융합 단백질의 활성은 50 U/ml이었다.
실시예6: 인터페론-베타-1a 및 인터페론-베타-1a/뮤린 IgG2a 융합 단백질로 처리된 마우스의 원형질에서 인터페론-베타-1a 항바이러스 활성의 측정
마우스(C57/B16)에 50,000 유니트의 인터페론-베타-1a(거대) 또는 5,000 유니트의 인터페론-베타-1a 뮤린 IgG2a 융합 단백질로 꼬리 정맥을 통하여 정맥내 주사한다. 대조구로서 인산 완충액의 동등한 부피를 투여한다.
혈액은 다른 시간 포인트(즉시, 0.25, 1.4, 24 및 48 시간)에서 역-순환 채혈을 통하여 샘플을 얻는다. 시간 포인트 당 3마리 이상의 마우스가 있다. 전 혈은 항응고제를 함유하는 관으로 수집되고, 세포를 제거하여 생성된 원형질을 분석 시점까지 냉동시킨다. 원형질 표본을 무혈청 분석 배지로 1:10 희석하고, 2.0 um 주사 여과기를 통과시켰다.
이어서 희석된 표본을 A549 세포를 포함한 96 웰 조직 배양액 플레이트의 지정된 웰내로 적정시킨다. 표준 인터페론-베타-1a(10, 6.7, 4.4, 2.9, 1.3, 0.9, 및 0.6 U/ml AVONEX) 및 4개 표본을 모든 플레이트 상에 전개시킨다. 세포를 EMC 바이러스로 공격하기 전에 24 시간동안 표본으로 예비처리한다. 바이러스로 2일 항온처리한 후, 살아있는 세포를 1시간 동안 MTT(인산 완충액중 5mg/ml)의 용액으로 염색하고, 인산 완충액으로 세척하고, 이소프로판올 중 1.2N HCl으로 가용화한다. 웰을 450 nm에서 판독하였다. 표준 곡선은 각 플레이트에 대하여 생성되고 각 표본에서 인터페론-베타-1a 활성양을 측정하는데 사용되었다. 다른 마우스로부터의 표본의 활성은 도9에서 시간 포인트에 대하여 도시된다.
시간의 함수로서 순환시 인터페론-베타-1a 융합 단백질의 손실이 더 느릴수록 융합 단백질의 반감기가 개질되지 않은 인터페론-베타-1a 대조구보다 더 길어진다. 연구로부터 발견된 제2 사항은 15분 및 60분 시간포인트에서 활성이 유사하게 높았던 점에 의하여 증명된 바와 같이, 융합 단백질의 극소량이 분배 단계동안 소실된다는 점이다. 데이터는 대조구 인터페론-베타-1a와는 달리, 인터페론-베타-1a 융합 단백질이 거의 혈관류에 제한되어 분포함을 시사한다.
실시예7: 영장류에서 비교 약동력학 및 약물역학
비교 연구는 인터페론-베타 1a 융합체 및 고유의 인터페론-베타 1a(pH7.2, 200 mM NaCl, 100 mM 인산 나트륨 중의 비제형화된 거대한 중간체 AVONEX 상품명인 인터페론-베타-1a)로 수행되며 영장류에서 이것의 상대적 안정성 및 활성을 측정한다. 상기 연구에서, 영장류에서 인터페론-베타-1a 융합체의 약동력학 및 약물역학이 고유의 인터페론-베타 1a에 비교되고 인간에게 합리적으로 유추될 수 있다.
동물 및 방법
연구 설계
본 연구는 인터페론-베타-1a 융합 단백질 및 비융합 인터페론-베타-1a의 비교 약동력학 및 약물역학을 평가하는 병렬군, 반복 투여 연구이다.
건강한 영장류(바람직하게는 붉은털 원숭이)를 본 연구에 사용한다. 투여전, 모든 동물은 시험 품목 투여 이전 14일 이내에 2회 실험실 동물 수의사에 의하여 건강 상태에 대하여 평가받을 것이다: 건강한 동물만이 시험 품목을 투여받을 것이다. 기초 임상 병리학 및 인터페론-베타-1a에 대한 기초 항체 수준을 위하여 투여전 채혈하고 일반적인 건강을 진단할 것이다. 모든 동물은 체중을 측정하고 시험 품목 투여 전 24 시간 이내에 체온을 기록할 것이다.
12마리 피검체를 등록하고, 융합여부를 제외하고는 동일한, 융합되거나 또는 비융합된 인터페론-베타-1a로서 1 MU/kg의 인터페론-베타-1a를 투여받는 3마리의 군으로 할당한다. 피하(SC) 또는 정맥(IV) 경로로 투여한다. 6마리 숫컷 동물은 IV 경로(3/처리)에 의하여 시험 품목을 투여받을 것이고, 또다른 6마리 숫컷 동물은 SC 경로(3/처리)에 의하여 시험 품목을 투여받을 것이다. 모든 동물은 인터페론-베타 처리를 받은 적이 없어야 한다. 각 동물은 2회 투여받을 것이고, 투여는 4주로 분리될 것이다. 투여 부피는 1.0ml/kg일 것이다.
약동력학 시험을 위하여 각 주사후 0, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간에 채혈한다. 인터페론 유도된 생물학적 반응 마커, 혈청 네오프테린의 측정을 위한 혈액 표본은 연구 약물의 투여 후 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504 시간에 채혈한다.
연구 기간 동안의 평가는 독성의 신호를 위한 투여 후 30분 및 1시간 후 수행된 임상적 관찰을 포함한다. 매일 우리옆 관찰을 하고, 일반적 외관, 독성 신호, 불안 및 행동의 변화를 기록할 것이다. 투여 후 21일동안 규칙적 간격으로 체중 및 체온을 기록할 것이다.
분석 방법
세포변성 효과(CPE) 생검을 사용하여 혈청내 인터페론 베타의 수준을 정량한다. CPE 분석은 인터페론-매개된 항바이러스 활성의 수준을 측정한다. 표본에서 항바이러스 활성의 수준은 혈액을 채취한 때 표본에 함유된 활성 인터페론의 분자 수를 반영한다. 상기 접근법은 인터페론 베타의 약동력학을 측정하는 표준방법이다.본 연구에서 사용된 CPE 분석은 뇌막심근염(EMC) 바이러스에 기인한 세포독성으로부터 인간 폐암 세포(A549, #CCL-185, 기탁번호, 미주리 록빌)을 보호하는 인터페론 베타의 능력을 검출한다. 세포는 혈청 표본과 15 내지 20 시간동안 예비항온처리하여 인터페론 유도된 단백질의 유도 및 합성을 가능하게 하여 항바이러스 반응에 이른다. 이후 EMC 바이러스를 첨가하여 추가로 30시간 동안 항온처리하고, 결정 바이올렛 염색을 사용하여 세포독성을 측정하였다. 내부 인터페론 베타 표준 및 인터페론-베타-Ig 내부 표준이 각 분석 플레이트에서 표본과 함께 시험된다. 상기 표준은 인간 섬유아세포 인터페론 참고 표준에 대하여 보정화된다(WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). 또한 각 분석 플레이트는 EMC 또는 임의의 종류의 인터페론을 포함하지 않는 세포 성장 대조구 웰을 포함하고, 바이러스 대조구 웰은 세포 및 EMC를 포함하나 인터페론 베타를 포함하지 않는다. 표준 및 표본을 포함하는 대조구 플레이트는 세포 성장에 대한 표본의 효과를 결정하기 위하여 제조된다. 상기 플레이트는 바이러스 첨가없이 염색된다.
표준 및 표본은 각각의 2 복제 분석 플레이트에 대하여 한벌로 시험되며, 표본 당 4개 데이터 포인트를 산출한다. 4 복제의 기하학적 평균 농도가 보고된다. 본 분석에서 검출 한계는 10 유니트(U)/ml이다.
네오프테린의 혈청 농도는 시판되는 분석을 사용하여 임상적 약물학적 단위에서 측정된다.
약물동력학 및 통계적 방법
Rstrip TM 소프트웨어(유타주 솔트레이크 시티, 마이크로매스, 인크.)가 약물동력학 모델에 데이터를 조정하는데 사용된다. 기하학적 평균 농도는 각 군에 대하여 시간에 의하여 플롯된다. 분석 결과가 희석되어 표현되므로, 기하학적 평균이 산술적 평균보다 더 적절한 것으로 고려된다. 혈청 인터페론 수준이 기초값에 대하여 조정되고, 검출불가능한 혈청 농도는 검출의 하한치의 반을 나타내는 5 U/ml로 고정된다.
IV 융합 데이터에 있어서, 2 구획 IV 융합 모델은 각 피검체에 대한 검출가능한 혈청 농도로 조정하고, SC 데이터는 2 구획 주입 모델로 조정한다.
다음의 약물동력학 매개변수를 산출한다:
(i) 관찰된 피크 농도, C최대(U/ml);
(ii) 0 내지 48 시간의 곡선 이하 면적, 사다리꼴 법칙을 사용한 AUC;
(iii) 제거 반감기;
및 , IV 주입 데이터로부터(만일IV가 사용되면):
(iv) 분배 반감기(h);
(v) 제거율(ml/h)
(vi) 분배의 겉보기 부피, Vd(L).
윈논린(노스 캐롤리나주 아펙스, 버젼 1.0, 사이언티픽 컨설팅 인크.) 소프트웨어는 SC 및 IM 주사후 제거 반감기를 계산하는데 사용된다.
네오프테린에 있어서, 시간에 의한 산술적 평균이 각 군에 대하여 제시된다.E최대는 기초로부터의 최대 변화값이 계산된다. C최대, AUC 및 E최대는 변이의 일방 분석을 수행하여 투여 군을 비교한다. C최대및 AUC는 분석전에 지수적으로 전환된다: 기하학적 평균이 보고된다.
실시예8: 인터페론 베타-1a 융합체의 항-혈관형성 효과
시험관내 내피 세포 증식을 저해하는 인터페론-베타-1a 융합체의 능력을 측정
인간 정맥 내피 세포(Cell Systems, Cat. #2V0-p75) 및 인간 피부 미세혈관 내피 세포(Cell Systems, Cat. #2M1-C25)는 CS-C 배지 키트(Cell Systems, Cat. #4Z0-500)와 함께 배양액에서 유지된다. 실험전 24시간에 세포를 트립신 처리하고 분석 배지, 90% M199 및 10% 태아 소 혈청(FBS)에서 재현탁하고, 원하는 세포 밀도로 조정한다. 이어서 세포는 겔라틴-코우팅된 24 또는 96 웰 플레이트 상에 각각 12,500 세포/웰 또는 2,000 세포/웰로 플레이트된다.
밤새 항온배양 후, 분석 배지는 인간 재조합 기초 섬유아세포 성장 인자(벡톤 디킨슨, Cat. #40060) 및 융합 및 비융합 인터페론-베타-1a 단백질 또는 양성 대조구(엔도스타탄은 bFGF에 대한 항체일 수 있듯이 양성 대조구로서 사용될 수 있음)의 다양한 농도를 함유하는 신선한 배지로 대체한다. 최종 부피를 96 웰 플레이트 중 0.2 ml 또는 24 웰 플레이트중 0.5 ml로 조정한다.
72 시간 후에, 세포를 코울터 계수를 위하여 트립신화하고, 시콴트(CyQuant) 형광 판독을 위해 냉동시키거나 또는 [3H]티미딘으로 표지시킨다.
상기 시험관내 분석은 본 발명의 인간 인터페론-베타 분자가 내피 세포 증식에 미치는 영향을 시험하는 것으로, 이것은 생체내 항-혈관형성 효과를 시사할 수 있다. 참조 O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y.Shing, N. Fukal, G. Vasios, W.Lane, E. Flynn, J.Birkhead, B.Olsen, 및 J. Folkman. (1997). 엔도스테인: 혈관신행 및 종양 성장의 내인성 저해제. Cell 88, 277-285.
실시예9: 인터페론-베타-1a/Ig 융합체의 항-혈관형성 및 신생혈관형성 영향을 시험하는 생체내 모델
다양한 모델이 본원에서 설명된 분자의 항-혈관형성 및 항-신생혈관형성에 미치는 영향에 대하여 시험하기 위하여 개발되었다. 상기 모델 중의 일부는 미국 특허 제5,733,876호(1998. 3. 31:"혈관형성의 저해 방법") 및 제5,135,919호(1992. 8. 4:"혈관형성의 저해를 위한 약학 조성물 및 방법")에서 설명되었다. 기타 분석은 외피가 없는 융모요막(CAM) 분석[S. Taylor and J. Folkman; Nature, 297, 307(1982) 및 R. Crum. S. Szabo and J. Folkman; Science. 230. 1375(1985)]; 마우스 척추 에어 삭 방법 항혈관형성 모델[Folkman, J. et al.; J. Exp. Med., 133, 275(1971)] 및, 500ng의 기초 FGF(소, R&D 시스템, 인크.)를 이식하고, 각 각막에서 EVA(에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체) 펠렛에 함침함으로써 스프라그-다울리 균주(Charles River, 일본)의 성숙한 숫컷 래트에서 유도되는 각막 혈관형성에서 래트 각막 미세포켓 분석[Gimbrone, M.A. Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, 413(1974)]을 포함한다.
동물 모델에서 항-혈관형성 영향에 대한 인터페론-베타/Ig 융합체를 시험하는 기타 방법은 초기 암 화학요법 리포트[Cancer Chemotherapy Report, Part 3, Vol.3, No.2, 1972, 9] 및 생체내 암 모델에서 보충[the supplement In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH 공개번호 84-2635, 1984, 2]에서 설명된 바와 같은 신규한 잠재적 항암제를 검색하기 위한 프로토콜을 포함한다(그러나, 이에 제한되지 않음). 유형 I 인터페론의 종 장막 때문에 설치류 모델에서 인터페론-베타 융합의 항-혈관형성의 활성을 측정하기 위하여, 설치류 인터페론-베타/Ig 융합 제제가 제조된다. 상기 검색 방법은 피하적으로 이식된 루이스 폐암(Lewis Lung Carcinoma)에 대한 뮤린 인터페론-베타/Ig 융합체의 항-혈관형성 영향을 시험하는 프로토콜에 의하여 예시된다.
종양주의 기원:
C57BL/6 마우스에서 폐암으로서 1951에 자연 발생.
시험 과정의 요약:
종양 단편이 B6D2F1 마우스의 보조 영역에 피하적으로 이식된다. 시험 제제(즉, 본 발명의 융합 단백질)를 종양 이식 후 수일에 다양한 투여, 피하(SC) 또는 복강(IP)내 투여한다. 측정된 매개변수는 평균 생존 시간이다. 결과는 대조구 생존 시간의 백분율로서 표현된다.
동물:
번식: C57BL/6 마우스
시험: B6D2F1 마우스
중량: 마우스는 숫컷에서 18gm및 암컷에서는 17gm의 최소 중량을 갖고 3gm중량 범위내여야 한다.
성별: 일회 실험에서 모든 시험 및 대조구 동물에 대하여 한 성별만이 사용된다.
근원: 한 실험에서 모든 동물은 가능하면 한 근원이다.
실험 규모:
시험 군 당 10 마리 동물
종양 전이:
번식:
단편: 피하 공여 종양의 2-4 mm 단편을 준비
시간: 13-15일
부위: 서혜 영역에 구멍을 갖는 액생 영역에 피하 단편을 이식.
시험:
단편: 피하 공여 종양의 2-4 mm 단편을 준비.
시간: 13-15일
부위: 서혜 영역에 구멍을 갖는 액생 영역에 피하 단편을 이식.
시험 계획:
0일: 종양 이식. 박테리아 배양액 전개. 모든 홀수번 실험에서 양성 대조구 화합물을 시험. 재료 준비. 치사율 매일 기록.
1일: 배양액 체크. 오염되었으면 실험 폐기. 동물 무작위 선택. 지시대로 처리(1일 및 다음날).
2일: 배양액 다시 체크. 오염되었으면 실험 폐기.
5일: 초기 시험 제제 독성 평가의 날 및 2일 중량 측정.
14일: 초기 치사일 조절.
48일: 비흡입일 조절.
60일: 실험을 끝내고 평가. 종양에 대하여 폐 비대를 측정.
정성적 대조구:
모든 홀수번 실험에서 양성 대조구 화합물(NSC 26271(100mg/kg/주사의 용량인 시톡산))을 계획. 본 요법은 1일에만 복강으로 투여한다. 양성 대조구에 대한 시험/대조구 하한치는 140%이다. 허용가능한 비처리된 대조구 평균 생존 시간은 19-35.6 일이다.
평가:
측정된 매개변수는 평균 생존 시간이다. 1일 및 5일에 있어서 평균 동물 체중을 계산하고, 모든 시험 군에 대하여 시험/대조구 비율을 계산한다. 시작일 및 최종 평가 일에 대한 평균 동물 체중이 계산된다. 시험/대조구 비율이 5일에서 65% 이상 생존을 갖는 함께 모든 시험 군에 대하여 계산된다. 시험/ 대조구 비율이 86% 이하이면 독성을 의미한다. 또한 과도한 체중 변화 차이(시험 마이너스 대조구)는 독성을 평가하는데 사용될 수 있다.
활성에 대한 기준:
140%이거나 이상인 초기 시험/대조구 비율은 중간 활성을 나타내는데 필요한 것으로 생각된다. 150%이거나 이상인 재생가능한 시험/대조구 비율값은 상당한 활성으로 생각된다.

Claims (31)

  1. X는 글리코실화된 인터페론-베타의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열 또는 이것의 일부를 갖는 폴리펩티드이고;
    Y는 선택적 링커 부분이며; 및
    Z는 글리코실화된 인터페론-베타 이외의 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드인, 아미노산 서열 X-Y-Z을 갖는 분리형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 X가 인터페론-베타-1a인 분리형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 X가 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도성 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만, 야생형 인터페론 베타-1a에 비교할때 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 적어도 1 이상을 갖는 돌연변이인 분리형 폴리펩티드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 인터페론 베타-1a가 유도된 것인 분리형 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유도체가 폴리알킬글리콜 중합체인 분리형 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 Z는 면역글로블린 불변부의 적어도 일부인 분리형 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 불변부의 적어도 일부가 부류 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE로부터 선택된 부류의 면역글로블린에서 유래되는 분리형 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 부류가 IgG인 분리형 폴리펩티드.
  9. 제6항에 있어서, 상기 불변부의 적어도 일부가 적어도 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 분리형 폴리펩티드.
  10. 글리코실화된 인터페론-베타의 아미노산 서열 또는 이것의 일부로 구성된 아미노 말단 영역 및 글리코실화된 인터페론-베타 이외의 단백질의 적어도 일부를 포함하는 카르복시 말단 영역을 갖는 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 X는 인터페론-베타-1a인 분리형 단백질.
  12. 제10항에 있어서, 상기 X는 (a) 항바이러스 활성이 바이러스 유도된 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성을 갖는 돌연변이 성질; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 항바이러스 활성이 높은 돌연변이 성질; (c) 인터페론 수용체에 결합하지만 야생형 인터페론 베타-1a에 비교할 때, 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 갖는 돌연변이 성질 중에서 적어도 1 이상을 갖는 돌연변이인 분리형 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 상기 인터페론-베타-1a는 유도된 것인 분리형 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유도체는 폴리알킬글리콜 중합체인 분리형 단백질.
  15. 제10항에 있어서, 상기 인터페론 베타 이외의 단백질의 적어도 일부가 면역글로블린의 불변부 영역의 적어도 일부인 분리형 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 불변부의 적어도 일부는 부류 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE로부터 선택된 부류의 면역글로블린에서 유래되는 분리형 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 부류는 IgG인 분리형 단백질.
  18. 제15항에 있어서, 상기 불변부의 적어도 일부는 적어도 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 분리형 폴리펩티드.
  19. 제1항 및 제10항의 단백질을 암호화하는 분리형 DNA 서열.
  20. DNA에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열 및 제19항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA.
  21. 제20항의 재조합 DNA 서열로 형질전환된 숙주 세포.
  22. (a) 제21항에 따른 숙주 세포 집단을 제공하는 단계; (b) 상기 재조합 DNA에 의하여 암호화되는 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 상기 세포의 집단을 성장시키는 단계; 및 (c) 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  23. 글리코실화된 인터페론 베타 및 이와 고유적으로 결합되지 않는 추가적 폴리펩티드를 포함하는 실질적으로 정제된 형태의 인터페론-베타 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 상기 인터페론 베타는 인간 인터페론-베타-1a인 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 융합체가 (a) 바이러스 유도된 세포 용균에 의하여 측정될때, 야생형 인터페론 베타 1a보다 더 높은 항바이러스 활성; (b) 야생형 인터페론-베타-1a에 비하여, 항증식 활성보다 더 높은 항바이러스 활성; (c) 수용체결합 활성을 포함하나, 야생형 인터페론-베타-1a에 비교할 때, 수용체 결합 활성에 비하여 더 낮은 항바이러스 활성 및 더 낮은 항증식 활성을 포함하는 활성으로 구성된 군에서 선택된 항바이러스 활성을 갖는 융합 단백질.
  26. 제1항, 제10항 및 제23항의 인터페론 베타 융합 단백질의 치료학적 유효량을 포함하는 약학 조성물.
  27. 제26항의 조성물의 유효량을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 피검체에서 혈관형성을 저해하는 방법.
  28. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이가 유도된 것인 분리형 폴리펩티드.
  29. 제27항에 있어서, 상기 유도체가 폴리알킬글리콜 중합체인 분리형 폴리펩티드.
  30. 제12항에 있어서, 상기 돌연변이가 유도된 것인 분리형 단백질
  31. 제29항에 있어서, 상기 유도체가 폴리알킬글리콜 중합체인 분리형 단백질.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100725315B1 (ko) * 2003-11-13 2007-06-07 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1039931T3 (da) * 1997-12-01 2005-08-08 Fang Fang Multivalente rekombinante antistoffer til at behandle HRV infektioner
ES2265693T3 (es) * 1998-10-16 2007-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Proteinas de fusion con interferon-beta y usos.
ES2630278T3 (es) * 1998-10-16 2017-08-21 Biogen Ma Inc. Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos
US20030035798A1 (en) * 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US6697363B1 (en) 2000-06-28 2004-02-24 Alcatel Canada Inc. Method and apparatus for longest matching prefix determination in a communication network
WO2002036628A2 (en) * 2000-11-02 2002-05-10 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
KR100804885B1 (ko) * 2000-12-06 2008-02-20 라보라토리스 세로노 에스.에이. 경피증의 치료 또는 예방을 위한 ｓａｒｐ-1의 용도
DE50204952D1 (de) * 2001-02-01 2005-12-22 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur herstellung von rekombinantem trypsin
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
CA2441095A1 (en) * 2001-03-15 2002-09-26 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Modified interferon beta with reduced immunogenicity
JP2005522192A (ja) * 2001-07-19 2005-07-28 パーラン セラピューティクス， インコーポレイテッド マルチマータンパク質およびマルチマータンパク質を作製および使用する方法
AU2003209755B2 (en) * 2002-02-06 2007-11-22 Ares Trading S.A. Tumor necrosis factor combined with interferon in demyelinating diseases
MXPA05000658A (es) * 2002-07-17 2005-08-19 Biogen Idec Inc Terapias para la insuficiencia renal utilizando interferon-beta.
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
CA2498319A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
NZ565990A (en) * 2002-09-27 2009-10-30 Biogen Idec Inc Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-beta
US20040137581A1 (en) * 2002-10-01 2004-07-15 Xencor Interferon variants with improved properties
EP2204190A1 (en) * 2003-07-15 2010-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IgM production by transformed cells and methods for quantifying said IgM production
JP2007503838A (ja) 2003-09-05 2007-03-01 ジーティーシー バイオセラピューティクス， インコーポレイティド トランスジェニック動物の乳汁中での融合タンパク質の産生方法
US20070212346A1 (en) 2003-10-09 2007-09-13 Tomoyuki Igawa Highly Concentrated Stabilized Igm Solution
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
JP2007526317A (ja) * 2004-03-01 2007-09-13 エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド インターフェロン−ベータ・ポリマー結合体
US20050276785A1 (en) * 2004-06-09 2005-12-15 Schering Aktiengesellschaft Treatment of cardiomyopathy and of endothelial dysfunction
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
LT1845925T (lt) * 2005-01-12 2016-09-26 Biogen Ma Inc. Interferono-beta pateikimo būdas
JP2009507003A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 視神経炎の治療
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US7553940B2 (en) 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting EPO polypeptides and derivatives thereof and methods thereof
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
MX2008014971A (es) 2006-05-24 2008-12-05 Serono Lab Regimen de cladribine para tratar esclerosis multiple.
US8414897B1 (en) * 2006-10-02 2013-04-09 The Uab Research Foundation Pathway for Th-17 cell development and methods utilizing same
FR2907454B1 (fr) * 2006-10-18 2009-01-23 Biomethodes Sa Variants ameliores de l'interferon beta humain
WO2008137471A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
BRPI0817108B8 (pt) 2007-09-21 2021-05-25 Univ California composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma.
US20100203009A1 (en) * 2007-10-02 2010-08-12 The Uab Research Foundation Pathway for Th-17 Cell Development and Methods Utilizing Same
AU2008314697B2 (en) * 2007-10-22 2013-08-29 Merck Serono S.A. Single IFN-beta fused to a mutated lgG Fc fragment
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
MX2011000861A (es) 2008-07-23 2011-06-21 Hanmi Holdings Co Ltd Un complejo polipeptidico que consiste en un polimero no-peptidil que posee tres terminaciones funcionales.
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
BRPI1011384A2 (pt) 2009-02-23 2016-03-15 Cytomx Therapeutics Inc pro-proteinas e seus metodos de uso
CA2759333A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
HUE025878T2 (en) * 2010-02-12 2016-05-30 Biogen Ma Inc Neuroprotection in demyelinating diseases
US9308277B2 (en) 2010-02-25 2016-04-12 Mesoblast International Sàrl Protease-resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
CN103747795A (zh) * 2011-06-07 2014-04-23 美索布拉斯特国际有限公司 使用基质细胞衍生因子-1的蛋白酶抵抗突变体修复组织损伤的方法
SG10201602076QA (en) 2011-10-01 2016-04-28 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
EP3559049A4 (en) 2011-10-28 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF
MY167814A (en) 2012-04-19 2018-09-26 Opko Biologics Ltd Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
US9783589B2 (en) * 2012-08-13 2017-10-10 Immungene Inc Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
CA2891393A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Opko Biologics Ltd. Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
KR102073748B1 (ko) 2013-01-31 2020-02-05 한미약품 주식회사 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법
CN104334574B (zh) 2013-03-29 2020-01-14 株式会社糖锁工学研究所 附加唾液酸化糖链的多肽
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
EP2992013B1 (en) 2013-04-29 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
CN106967175A (zh) * 2013-05-15 2017-07-21 复旦大学 长效干扰素及其制备方法和用途
US10093745B2 (en) 2013-05-29 2018-10-09 The Regents Of The University Of California Anti-CSPG4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
EP3083977B1 (en) 2013-12-20 2018-02-28 F. Hoffmann-La Roche AG Improved recombinant polypeptide production methods
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
AU2015337858B2 (en) 2014-10-29 2020-09-24 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Interferon alpha2b variants
CN108289851B (zh) 2015-06-19 2021-06-01 Opko生物科学有限公司 长效凝固因子及其产生方法
DK3313879T3 (da) 2015-06-24 2022-03-14 Hoffmann La Roche Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114014936A (zh) 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
US11236141B2 (en) * 2016-05-13 2022-02-01 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
KR102506179B1 (ko) * 2020-01-23 2023-03-06 주식회사 제넥신 Pd-l1 단백질이 포함된 융합 단백질 및 이의 용도
JP2023520468A (ja) * 2020-04-03 2023-05-17 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル Ａｃｅ２標的化ウイルスに対して有用な結合タンパク質

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3359030A (en) * 1966-12-16 1967-12-19 Newman George Bumper guard assembly
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0098876A1 (en) * 1982-01-19 1984-01-25 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) * 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2524586B2 (ja) * 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US4868802A (en) * 1986-07-28 1989-09-19 Kabushiki Kaisha Toshiba Magnetooptic recording and erasing head which performs biasing, tracking and focusing
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SG47099A1 (en) 1991-03-15 1998-03-20 Amgen Boulder Inc Pegylation of polypeptides
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5255519A (en) 1992-08-14 1993-10-26 Millennium Technologies, Inc. Method and apparatus for increasing efficiency and productivity in a power generation cycle
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU5098193A (en) 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
PT730470E (pt) 1993-11-10 2002-08-30 Enzon Inc Conjugados melhorados de interferao-polimero
DE69534676T2 (de) 1994-02-08 2006-08-17 Amgen Inc., Thousand Oaks Orale Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen
US5545723A (en) 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
GB9415379D0 (en) * 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
CA2206852A1 (en) 1994-12-07 1996-06-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
KR0154850B1 (ko) * 1995-10-09 1998-10-15 김광호 바이씨모스 및 그의 제조방법
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
ATE200030T1 (de) 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
NZ502375A (en) 1997-07-14 2001-11-30 Bolder Biotechnology Inc The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ES2307865T3 (es) 1998-03-12 2008-12-01 Nektar Therapeutics Al, Corporation Metodo para preparar conjugados polimericos.
CA2330451A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
ES2630278T3 (es) 1998-10-16 2017-08-21 Biogen Ma Inc. Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos
ES2265693T3 (es) * 1998-10-16 2007-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Proteinas de fusion con interferon-beta y usos.
BR0013638A (pt) 1999-08-27 2002-05-14 Maxygen Aps Novas moléculas semelhantes a interferon beta
MXPA02006216A (es) 1999-12-22 2004-02-26 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados estericamente impedidos de polimeros solubles en agua.
US20080033818A1 (en) 2005-03-17 2008-02-07 Inc2 Webcom Ltd. Real time interactive response system and methods

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100725315B1 (ko) * 2003-11-13 2007-06-07 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법

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