CN103747795A - 使用基质细胞衍生因子-1的蛋白酶抵抗突变体修复组织损伤的方法 - Google Patents

使用基质细胞衍生因子-1的蛋白酶抵抗突变体修复组织损伤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明特征在于使用组合物的静脉内给予来治疗或改善组织损伤的方法，所述组合物包含基质细胞衍生因子-1(SDF-1)肽或突变的SDF-1肽，将所述突变的SDF-1肽突变以使其抵抗蛋白酶消化，但保留化学引诱剂活性。SDF-1和蛋白酶抵抗的SDF-1突变体的全身性递送，特别是静脉内(“IV”)递送，对治疗组织损伤是非常有效的。

Description

使用基质细胞衍生因子-1的蛋白酶抵抗突变体修复组织损伤的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月7日提交的美国临时申请号61/494,079的权益，所述申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明背景
总的来说，本发明涉及使用SDF-1或基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)的蛋白酶抵抗突变体修复组织损伤的方法。
SDF-1 (亦称为CXCL12)为趋化因子家族的68个氨基酸成员，其为休眠的T-淋巴细胞、单核细胞和CD34+干细胞的化学引诱剂。SDF-1以多种形式产生：SDF-1α (CXCL12a)、SDF-1β (CXCL12b)和SDF-1γ，其为差别mRNA剪接的结果。SDF-1α和SDF-1β的序列基本上相同，只是SDF-1β在C端延伸了4个氨基酸(Arg-Phe-Lys-Met)。SDF-1γ的前三个外显子与SDF-1α和SDF-1β的前三个外显子相同。SDF-1γ的第四个外显子位于SDF-1基因座上第三个外显子下游的3200个碱基对处，并且位于SDF-1β的第三个外显子和第四个外显子之间。起始制备的SDF-1带有信号肽(长度为21个氨基酸)，所述信号肽被切割以制备活性肽。
在胚胎发育期间和干细胞移植之后，SDF-1在将造血干细胞靶向骨髓中起关键作用。除其在干细胞靶向中的作用之外，SDF-1在心脏发生和血管发生中亦为重要的。SDF-1缺陷型小鼠在围产期死亡并且在心室隔膜形成、骨髓血细胞生成和器官特异性血管发生方面有缺陷。亦已报道，异常低水平的SDF-1至少部分是与糖尿病患者有关的受损伤口愈合的原因，并且病损可通过在组织损伤的部位给予SDF-1来逆转。
在正常成人心脏中，SDF-1组成型表达，但是在心肌梗死后的数天内表达增量调节。先前已显示，通过过表达SDF-1的稳定转染的成心肌细胞的心肌内移植联合G-CSF疗法，SDF-1表达在心肌梗死后八周增加。此程序与心脏中骨髓干细胞(c-Kit或CD34+)和内皮细胞的较高数量有关，并导致血管密度的增加和左心室功能的改善。这些研究表明自然发生的心肌修复过程的不足可能部分地归因于不足的SDF-1可用性。因此，在心肌梗死之后以受控方式递送SDF-1可吸引更多的祖细胞并因此促进组织修复。
在本领域中存在对促进伤口愈合和组织修复的改进方法的需要。
发明概述
SDF-1涉及造血干细胞的靶向，并涉及心脏发生和血管发生。为了促进其干细胞募集和伤口愈合效果，认为需要SDF-1的局部梯度来吸引祖细胞并促进血管再生和修复。鉴于对SDF-1的局部梯度的需要，我们已发现，SDF-1和蛋白酶抵抗SDF-1突变体的全身性递送，特别是静脉内(“IV”)递送，对组织损伤的治疗非常有效，这是一个出乎意料的结果。与其它给药途径相比，IV递送具有许多临床优势，包括但不限于易于递送。此外，我们已发现，从组织损伤事件(例如心肌梗死)后数分钟直至组织损伤(例如心脏组织损伤、血管组织损伤或来自伤口的组织损伤)发生后数小时、数天、数周或数月中的任何时间在给予SDF-1或突变的SDF-1肽的静脉内给药上的延迟亦对促进血管再生和修复有效。鉴于某些病况和疾病中急性的组织损伤性质，此处再次地，我们对于一段时间的延迟之后所述组合物的功效的发现为出乎意料的结果。
因此，本发明特征在于静脉内给予包含SDF-1和突变的SDF-1肽的组合物，所述突变的SDF-1肽以这样的方式突变，所述方式保留其起化学引诱剂作用的能力，但使其抵抗通过蛋白酶(特别是基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、二肽基肽酶IV (DPPIV/CD26)、白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、羧肽酶M和羧肽酶N)的失活。本发明的方法可用于治疗例如外周血管疾病(PVD；亦称为外周动脉疾病(PAD)或外周动脉闭塞性疾病(PAOD))；胃肠道中或别处的溃疡；由事故、外科手术或疾病造成的伤口；慢性心力衰竭；组织损伤；或者因心肌梗死或其它心血管事件造成的心脏组织损伤。本发明的方法亦可用于治疗由糖尿病患者中的伤口、溃疡或病变造成的组织损伤或降低其可能性。
在一方面，本发明特征在于通过静脉内给予组合物来治疗或改善有需要的受试者中的组织损伤(例如由疾病或病况造成的组织损伤)的方法，所述组合物包含分离的SDF-1或具有下式的突变形式的SDF-1肽：突变的SDF-1 (mSDF-1)、mSDF-1-Yz、Xp-mSDF-1或Xp-mSDF-1-Yz。SDF-1为具有SEQ ID NO:53的至少第1-8个氨基酸的氨基酸序列的肽，并且其可任选在C端延伸SEQ ID NO:53的剩余序列的全部或任何部分，并且SEQ ID NO:53包含氨基酸序列：
K P X3 X4 X5 X6 Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:53)，其中X3、X4、X5和X6为任何氨基酸，和
a) Xp为蛋白质生成(proteinogenic)氨基酸或者蛋白酶保护的有机基团以及p为1-4的任意整数；
b) Yz为蛋白质生成氨基酸或者蛋白酶保护的有机基团以及z为1-4的任意整数；
c) mSDF-1或mSDF-1-Yz维持对T细胞的化学引诱剂活性，并且其以比天然SDF-1的灭活速率小至少50%的速率被基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、白细胞弹性蛋白酶和/或组织蛋白酶G灭活；和
d) Xp-mSDF-1或Xp-mSDF-1-Yz维持对T细胞的化学引诱剂活性，其以比天然SDF-1的灭活速率小至少50%的速率被二肽基肽酶IV (DPPIV)灭活，并且其以比天然SDF-1的灭活速率小至少50%的速率被MMP-2、MMP-9、白细胞弹性蛋白酶和/或组织蛋白酶G灭活；
其中分离的突变形式的SDF-1以足以治疗或改善受试者中的组织损伤的量经静脉内给予。
在一个具体的实施方案中，所述分离的突变形式的SDF-1肽不包含SEQ ID NO:52的至少第1-8个氨基酸的氨基酸序列。
在一个实施方案中，X3为缬氨酸、组氨酸或半胱氨酸。在另一个实施方案中，X4为丝氨酸或缬氨酸。在另一个实施方案中，X5为亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在另一个实施方案中，X6为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
在本发明的方法的某些实施方案中，所述肽为Xp-mSDF-1肽或Xp-mSDF-1-Yz肽，其中X为丝氨酸以及p为1。在其它实施方案中，所述肽为mSDF-1-Yz肽或Xp-mSDF-1-Yz肽，其中Y为丝氨酸以及z为1。
在某些实施方案中，可对本文所述的任何SDF-1肽(包括但不限于野生型SDF-1)进行C端修饰，所述修饰包括添加Fc肽。
在某些实施方案中，所述分离的突变形式的SDF-1包含SEQ ID NO: 63、67或69中所述的序列。
本发明的方法特征还可在于分离的突变形式的SDF-1，其中SDF-1为式A-(L)n-Fc的融合蛋白，其中：A为分离的突变形式的SDF-1；n为0-3的整数(例如1)；L为3-9个氨基酸的接头序列；和Fc为来自免疫球蛋白的Fc区的Fc肽。在某些实施方案中，L为GGGGS (SEQ ID NO:66)。在某些实施方案中，所述融合蛋白可形成生物学上相容的肽膜。
在本发明的任何实施方案中，治疗的疾病或病况可以是中风、肢体缺血、因创伤所致的组织损伤、心肌梗死、外周血管疾病、慢性心力衰竭或糖尿病。
在本发明的任何实施方案中，所述损伤的组织为心脏组织或血管组织。
在本发明的任何实施方案中，将所述SDF-1或突变的SDF-1蛋白组合物给予到哺乳动物体内的任何静脉，包括但不限于外周静脉(例如手臂上的静脉、腿中的静脉、手背静脉或中肘静脉)或中心静脉，例如经由中心静脉管到大静脉(例如上腔静脉或下腔静脉或在心脏的右心房内)。
在本发明的任何实施方案中，在组织损伤初始发生之后或者疾病或病况发作、识别或诊断之后数分钟内，或者1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间内给予所述SDF-1或突变的SDF-1蛋白组合物。
在本发明另外的实施方案中，SDF-1或突变的SDF-1蛋白组合物与SDF-1或突变SDF-1肽的动脉内给予联合给予。静脉内给予可在动脉内给予之前或之后。在一个实例中，首先动脉内给予SDF-1或突变的SDF-1蛋白组合物，并随后在范围从数分钟至1小时至数小时、至1天至1周至1个月至1年的一段时间之后，静脉内给予SDF-1或突变的SDF-1蛋白组合物。可在静脉内给予之前或静脉内给予之后的一段时间期间重复动脉内给予。
SDF-1或突变的SDF-1蛋白组合物可给予一次或多次以改善疾病或病况的一种或多种症状。SDF-1或突变的SDF-1组合物可给予一次或多次直至组织损伤降低、组织修复或新血管形成发生。
在多个实施方案中，所述疾病或病况为因创伤所致的组织损伤、心肌梗死或外周血管疾病。在另外的实施方案中，所述疾病或病况为心血管疾病。
在本发明的任何实施方案中，所述损伤的组织为心脏组织或血管组织。
“足够的量”意指以临床相关的方式治疗或改善病症或病况所需的单独或者与另一种治疗方案组合的治疗剂(例如mSDF-1肽)的量。在一个实例中，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽的足够的量为促进伤口愈合或组织修复或新血管形成(例如血管发生)的量。实施本发明所使用的用于治疗性治疗例如组织损伤的治疗剂的足够的量根据给予的方式、受试者的年龄和总体健康而不同。最终，建议所述治疗的执业医师将决定适当的量和给药方案。
“片段”意指核酸或多肽的一部分，其包含所述核酸或多肽的全长的至少例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。核酸片段可包含例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200或更多个核苷酸，直至所述核酸的全长。多肽片段可包含例如10、20、30、40、50或60或更多个氨基酸，直至所述多肽的全长。可如本文所述以及如本领域已知修饰片段。
“静脉内给予”、“静脉内疗法”、“IV给予”或“IV疗法”意指将物质给予到静脉(例如外周的或中心的)中。静脉内给予可包括经由与注射器直接连接或者与一段输液管和容器(例如装有待给予的药物组合物的无菌容器)连接的针头直接注入静脉中。
“药学上可接受的载体”意指对治疗的受试者而言为生理上可接受的载体，其同时保留与之一起给予的组合物的治疗特性。一个示例性的药学上可接受的载体物质为生理盐水。其它生理上可接受的载体及其制剂为本领域技术人员已知，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences (第20版, A. Gennaro编辑, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。
“促进伤口愈合”或“促进组织修复”意指增进、改善、增加或诱导伤口或损伤组织的闭合、愈合或修复。所述伤口或组织损伤可以是任何病症或病况(例如疾病、损伤或外科手术)的结果，并且可在受试者的任何部位(例如内部或外部伤口)发现。例如，所述伤口或组织损伤可以是诸如心肌梗死等心血管病况的结果，并且所述损伤的组织可以是心脏组织。或者，所述伤口或组织损伤可以是外周血管疾病或糖尿病的结果。
“蛋白质”、“多肽”、“多肽片段”或“肽”意指不论是否翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)，组成天然存在的多肽或肽的全部或部分或者组成非天然存在的多肽或肽的两个或更多个氨基酸残基的任何链。如果已采用物理、机械或化学方法将多肽从细胞成分中移出，则多肽或肽可被称为“分离的”或“基本上纯的”。通常认为“分离的肽”、“基本上纯的多肽”或“基本上纯的和分离的多肽”从细胞成分中移出，并且当其按重量计至少60%不含其天然伴随的蛋白质和天然存在的有机分子时认为其为基本上纯的。所述多肽可以是按重量计至少75%、80%、85%、90%、95%或99%纯的。基本上纯的多肽可通过标准技术获得，例如通过从天然来源(例如细胞系或生物流体)中提取，通过编码所述多肽的重组核酸的表达，或者通过化学合成所述多肽。纯度可通过任何适当方法测定，例如通过柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或高压液相色谱(HPLC)分析法。或者，如果多肽已通过人为干涉改变，位于并非其天然部位的位置，或者如果将其引入到一种或多种细胞中，则认为多肽为分离的。
如上所定义的本发明的肽和多肽，包括所有的“模拟物”和“拟肽”形式。术语“模拟物”和“拟肽”是指具有与本发明的肽或多肽基本上相同的结构和/或功能特征的合成的化学化合物。模拟物可完全由氨基酸的合成的非天然类似物组成，或者可以是天然氨基酸和氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。所述模拟物亦可掺入任何量的保守取代，只要所述取代基本上不改变模拟物的结构或活性。
“预防”或“减少可能性”意指减少疾病或病症(例如心肌梗死或外周血管疾病)或其症状的严重性、频率和/或持续时间。
“蛋白酶保护的有机基团”意指除蛋白质生成氨基酸之外的有机基团，当其加到SDF-1或突变形式的SDF-1 (mSDF-1)的N端氨基酸上时，得到修饰的肽，所述修饰的肽保持至少例如10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100%的未修饰SDF-1的化学引诱剂活性(如通过例如Jurkat T细胞迁移测定法或者本领域已知的测定趋化性的其它测定法所确定)，并且所述修饰的肽以未修饰SDF-1的灭活速率的少于例如50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1%的速率被酶(例如DPPIV)灭活。
“蛋白酶抵抗”意指与天然或野生型肽或多肽(例如天然或野生型SDF-1)相比，在其氨基酸的原始序列中包含一个或多个修饰的肽或多肽，并且与不含所述一个或多个氨基酸修饰的天然或野生型肽或多肽相比，其表现出对蛋白水解的抵抗增加。“增加的蛋白酶抵抗”意指与缺乏氨基酸序列变化的肽或多肽相比，通过体外或体内测定法评价的增加。对蛋白酶增加的抵抗可通过使用诸如Jurkat T-淋巴细胞迁移测定法、CXCR-4-cAMP受体激活测定法和CXCR4-或CXCR7-β-抑制蛋白测定法等测定法，测试在暴露给特定蛋白酶(例如MMP-2、MMP-9、DPPIV、白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、羧肽酶M或羧肽酶N)之后的活性或表达来评价。通常，与缺乏氨基酸序列上的变化(其赋予所述抵抗)的相同的肽或多肽相比，在蛋白酶抵抗上的增加为至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。
“蛋白质生成的”意指多肽或肽的氨基酸为以下氨基酸的L-异构体：丙氨酸(A)；精氨酸(R)；天冬酰胺(N)；天冬氨酸(D)；半胱氨酸(C)；谷氨酸(E)；谷氨酰胺(Q)；甘氨酸(G)；组氨酸(H)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；赖氨酸(K)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(F)；脯氨酸(P)；丝氨酸(S)；苏氨酸(T)；色氨酸(W)；酪氨酸(Y)；或缬氨酸(V)。
“SDF”或“SDF-1”意指可包含SEQ ID NO:52的序列的基质细胞衍生因子肽或者多种形式的SDF (例如SDF-1α (CXCL12a)、SDF-1β (CXCL12b)和SDF-γ，通过相同基因的可变剪接产生)中的任一种。SDF-1β在SDF-1α的C端包含另外的四个氨基酸残基Arg-Phe-Lys-Met。SDF-1γ的前三个外显子与SDF-1α和SDF-1β的前三个外显子相同。SDF-1γ的第四个外显子位于SDF-1基因座上第三个外显子下游的3200个碱基对处，并且位于SDF-1β的第三个外显子和第四个外显子之间。尽管SEQ ID NO:52显示SDF-1α的序列，但此序列可在C端延伸以包含另外的氨基酸残基。本发明包括SDF-1α、SDF-1β和SDF-γ的突变。为了本发明的目的，术语“SDF”或“SDF-1”是指所述肽的活性形式，即在信号肽切割之后。
“mSDF-1”、“mSDF”或“SDF(NqN')”(此处N为起始存在的氨基酸的单字母名称，q为其距离肽的N端的位置，和N′为取代N的氨基酸)意指突变的SDF-1肽。通过在N端添加氨基酸(例如一个或多个氨基酸)来突变的肽缩写为“Xp-R”，此处X为蛋白质生成氨基酸或蛋白酶保护的有机基团，p为整数，和R为延伸之前的肽(例如SDF-1或mSDF-1)。例如，“S-SDF-1”或“S-mSDF-1”分别为在N-端添加有丝氨酸残基的SDF-1或mSDF-1分子。通过在C端添加氨基酸(例如一个或多个氨基酸)来突变的肽缩写为“R-Yz”，此处Y为蛋白质生成氨基酸或蛋白酶保护的有机基团，z为整数，和R为延伸之前的肽(例如SDF-1、mSDF-1或Xp-mSDF-1)。除非另有指示，否则可使用肽的所有药学上可接受形式，包括所有药学上可接受的盐。
“本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽”意指本文所述的任何野生型SDF-1 (包括同种型)或突变的SDF-1肽。该术语中还包括含有本文所述的野生型SDF-1或突变的SDF-1肽的组合物(例如，药物组合物)。
“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、犬科动物、绵羊科动物或猫科动物。
“持续释放”或“控制释放”意指以受控速率从制剂中释放治疗上的活性组分，使得在范围从例如约12小时至约4周(例如12小时、24小时、48小时、1周、2周、3周或4周)的延长时期内维持所述组分的治疗上有益的水平(但低于毒性水平)，从而提供例如12小时-4周剂型。
“治疗”或“改善”意指给予药物组合物以用于治疗目的，或者给予已罹患病症的受试者治疗以改善受试者的病况。“治疗病症”或“改善病症”意指病症以及与所述病症有关的症状被例如减轻、降低、治愈或者处于缓和的状态。与等同的未治疗对照相比，所述改善或治疗的程度为至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%，如通过任何标准技术所测定。
本发明的其它特征和优势将从发明详述以及从权利要求中显而易见。
附图简述
图1为直方图，显示与PBS对照相比，在局部缺血再灌注损伤之后7天经IV递送的SSDF-1 (S4V)改进射血分数达10个百分点。
发明详述
本发明基于以下发现：损伤组织(例如损伤的心脏组织)的恢复通过静脉内给予野生型SDF-1或突变以增强对酶促切割(例如通过MMP-2、MMP-9、DPPIV、白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、羧肽酶M或羧肽酶N中的一种或多种)的抵抗的SDF-1来促进。所述肽可作为分离的肽给予，含或不含药学上可接受的载体。此外，我们出乎意料地发现，从组织损伤初始发生之后或者疾病或病况发作、识别或诊断之后数分钟内，到组织损伤初始发生之后或者疾病或病况发作、识别或诊断之后1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间内的延迟给药在促进损伤组织的恢复方面亦是有效的。
静脉内给予
将用于本发明的方法的含SDF-1或突变的SDF-1肽的组合物经静脉内给予，例如通过静脉内(IV)注射或使用可植入装置(例如导管)。静脉内给予一般包括注入到哺乳动物体内的任何可进入的静脉，包括但不限于外周静脉(例如手臂上的静脉、腿中的静脉、手背静脉或中肘静脉)或者经由中心管注入大静脉(例如上腔静脉或下腔静脉或在心脏的右心房内)。静脉内给予亦可包括通过外周插入的中心导管、中心静脉管或可植入的端口来给予。
外周IV管由使用例如经针头的套管(cannula-over-needle)装置通过皮肤插入外周静脉(例如不在胸内侧或腹内侧的任何静脉)的短导管(几厘米长)组成，在所述装置中，柔性塑料套管安置在金属套针上。保留在皮肤外面的导管部分称为连接器(connecting hub)；其可与注射器或静脉内输注管连接。开口的(ported)套管在顶端具有注射口，其可用于给予本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽。
当需要在延长的时期内IV接入或者当待输注的物质将导致外周IV的快速损伤和早期失效时以及当常规的中心管可能太危险而不能尝试时，使用外周插入的中心导管(PICC)。
在本发明的IV递送法中还包括中心静脉管，其中例如将导管插入到锁骨下的内部颈静脉或股静脉，并朝心脏推进直至其到达上腔静脉或右心房。
另一种中心IV递送法是通过使用中心IV管，其通过尖端在大静脉内的导管流动，所述大静脉通常为上腔静脉或下腔静脉或者在心脏的右心房内。
用于本发明的IV递送法的另一类型的中心管为Hickman管或Broviac导管，将其插入到靶静脉中并随后在皮肤下“穿过(tunneled)”以在短距离外伸出。
可植入端口亦用于本发明的SDF-1和突变的SDF-1肽化合物的IV递送。可植入端口为不具有外部连接器的中心静脉管；相反，其具有覆盖有硅酮橡胶并植入皮肤下的小型储存器。通过将小针头穿过皮肤刺穿硅酮置入储存器中来间歇给予所述肽化合物。端口可保留在受试者体内达数周、数月、甚至数年。间歇输注为另一类型的静脉内给予，其可在受试者仅在某些时候需要给予本发明的SDF-1和mSDF-1肽化合物时使用。
可将含SDF-1或mSDF-1肽的组合物给予到一条静脉或数条静脉中。可将含SDF-1或mSDF-1肽的组合物静脉内给予到例如一条或多条静脉中达约1分钟、1-5分钟、10-20分钟、20-30分钟的一段时间或者如临床医师所确定的足够时间。可间歇地重复给予以达到或维持预期的益处。用于重复给予的时限基于受试者的反应，例如通过监测与组织损伤有关的症状。待给予的治疗上有效剂量或量的含SDF-1或mSDF-1肽的组合物可分成两次或更多次剂量，并且可使用单次穿刺或多次穿刺将剂量给予到两条或更多条静脉中。
SDF-1和蛋白酶抵抗突变体
SDF-1为属于趋化因子家族的小细胞因子，其正式命名为趋化因子(C-X-C基序)配体12 (CXCL12)。通过相同基因的可变剪接，以多种形式(SDF-1α (CXCL12a)、SDF-1β (CXCL12b)和SDF-1γ)产生SDF-1。
未突变的SDF-1α具有以下序列：
K P V S L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:52)。
本文所述的SDF-1肽包括具有突变的SDF-1肽，所述突变致使所述肽抵抗例如基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、二肽基肽酶IV (DPPIV)、白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、羧肽酶M或羧肽酶N。本发明的方法中，未突变的SDF-1亦可通过静脉内递送来给予，以用于治疗或改善组织损伤。
本发明的方法特征在于突变形式的SDF-1 (mSDF-1)，其以自未突变SDF-1的N端的第3、4、5和/或6个氨基酸中的变化为特征。本发明的mSDF-1肽具有SEQ ID NO:53的至少第1-8个氨基酸，并且可在C端延伸SEQ ID NO:53的剩余序列的全部或任何部分，SEQ ID NO:53具有以下序列：
K P X3 X4 X5 X6 Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:53)，其中X3、X4、X5和X6为任何氨基酸残基。
在某些实施方案中，X3为缬氨酸、组氨酸或半胱氨酸。
在某些实施方案中，X4为丝氨酸或缬氨酸。
在某些实施方案中，X5为亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在某些实施方案中，X6为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
例如，mSDF-1肽可包含在第4个(例如Ser→Val)和/或第5个(例如Leu→Pro)氨基酸位置上的突变。
K P V V L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:63)
K P V S P S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:64)
K P V VP S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:65)
在另一个实例中，mSDF-1肽可包含在第3个氨基酸位置上的Val→His (SEQ ID NO:54)或Val→Cys (SEQ ID NO:55)突变。
K P H S L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:54)
K P C S L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:55)
在其它实施方案中，mSDF-1肽可包含在第5个氨基酸位置上的Leu→Thr (SEQ ID NO:56)或Leu→Val (SEQ ID NO:60)突变。
K P V S T S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:56)
K P V S V S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:60)
在其它实施方案中，mSDF-1肽可包含在第6个氨基酸位置上的Ser→Cys (SEQ ID NO:61)或Ser→Gly (SEQ ID NO:62)突变。
K P V S L C Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:61)
K P V S L G Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:62)
本发明的方法亦可包括包含本文所述的突变的任何组合的肽。例如，mSDF-1肽可包含在SEQ ID NO:53的第3个氨基酸位置上的Val→Cys突变和在SEQ ID NO:53的第6个氨基酸位置上的Ser→Cys突变。
对SDF-1肽进行的赋予蛋白酶抵抗的突变亦可包括例如向例如mSDF-1肽(上文所述)的N端添加部分(例如蛋白质生成氨基酸或蛋白酶保护的有机基团)，得到Xp-mSDF-1。例如，X可以是：R1-(CH2)d-，此处d为0-3的整数，和R1选自：氢(要说明的是当R1为H时，d必须至少为1)；支链或直链的C1-C3烷基；直链或支链的C2-C3烯基；卤素，CF3；-CONR5R4；-COOR5；-COR5；-(CH2)qNR5R4；-(CH2)qSOR5；-(CH2)qSO2R5, -(CH2)qSO2NR5R4；和OR5，其中R4和R5各自独立为氢或者直链或支链的C1-C3烷基。在其中有机基团用于X的情况下，p应为1。X亦可表示蛋白质生成氨基酸，其中例如向SDF-1 (例如mSDF-1)的N端添加1-10 (例如1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1)个氨基酸，并且这些添加的氨基酸中的一个或多个可取代为蛋白酶保护的有机基团。例如，可向SDF-1 (例如mSDF-1)的N端添加蛋白质生成氨基酸(例如丝氨酸)或蛋白酶保护的有机基团，以赋予例如对DPPIV切割的抵抗而基本上不改变化学引诱剂活性或者对其它蛋白酶(例如MMP-2)的抵抗。以下序列表示在N端添加有丝氨酸氨基酸的示例性SDF-1突变体。
S K P X3 X4 X5 X6 Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:68)，其中X3、X4、X5和X6为任何氨基酸残基。
在某些实施方案中，X3为缬氨酸、组氨酸或半胱氨酸。
在某些实施方案中，X4为丝氨酸或缬氨酸。
在某些实施方案中，X5为亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在某些实施方案中，X6为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
序列的具体实例包括：
S K P V V L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:69)
S K P V S P S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:70)
S K P V VP S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:71)
S K P H S L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:72)
S K P C S L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:73)
S K P V S T S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:74)
S K P V S V S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:75)
S K P V S L C Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:76)
S K P V S L G Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:77)
对SDF-1肽进行的赋予蛋白酶抵抗的突变亦可包括例如向例如mSDF-1肽(上文所述)的C端添加部分(例如蛋白质生成氨基酸)，得到mSDF-1-Yz或Xp-mSDF-1-Yz。Y可表示蛋白质生成氨基酸，其中例如向SDF-1 (例如mSDF-1或Xp-mSDF-1)的C端添加1-10 (例如1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1)个氨基酸。例如，可向SDF-1、mSDF-1或Xp-mSDF-1的C端添加蛋白质生成氨基酸(例如丝氨酸)，以赋予例如对羧肽酶M或羧肽酶N切割的抵抗而基本上不改变化学引诱剂活性或者对其它蛋白酶(例如MMP-2)的抵抗。在一个实施方案中，本发明特征在于分离的mSDF-1-Yz或Xp-mSDF-1-Yz肽，其中SDF-1包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。然而，可对本文所述的SDF-1和任何SDF-1肽进行C端修饰。本文所述的突变的SDF-1肽保留其充当化学引诱剂的能力，但是抵抗酶促(例如蛋白水解的)消化。所述mSDF-1肽以未突变SDF-1灵敏性的至少例如10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100%的灵敏性(如通过例如在例如Jurkat T细胞迁移测定法或本领域已知的任何其它趋化性测定法中获得50%的最大反应所需的有效浓度所确定)保持化学引诱剂活性。化学引诱剂活性的丢失可能归因于通过例如MMP-2、MMP-9、白细胞弹性蛋白酶、DPPIV、组织蛋白酶G、羧肽酶M或羧肽酶N的切割。mSDF-1的失活速率可少于例如SDF-1的失活速率的50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1%。
突变的SDF-1肽可抵抗通过例如MMP-2、MMP-9、DPPIV、白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、羧肽酶M或羧肽酶N的切割。因此，它们理想地适用于在其中蛋白水解酶以高浓度存在的诸如损伤的组织(例如损伤的心脏组织)等部位使用，或者经由血液或血浆递送到所述部位。因此，突变的SDF-1肽可适于静脉内给予，这是因所述肽的改进的稳定性所致。
本文所述的蛋白酶抗性SDF-1肽可包含通过诸如翻译后加工等天然过程或者通过使用本领域已知技术的化学修饰来修饰的氨基酸或序列。修饰可在多肽的任何位置发生，包括多肽主链、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。同种类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定多肽的数个部位，并且多肽可包含多于一种类型的修饰。修饰包括例如PEG化、乙酰化、酰化、乙酰氨基甲基(Acm)基团的添加、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、氨甲酰化、羧乙基化、酯化、与黄素(fiavin)的共价连接、与血红素部分的共价连接、与核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、与药物的共价连接、与标志物(例如荧光或放射性标志物)的共价连接、与脂质或脂质衍生物的共价连接、与磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸(例如精氨酰化)和遍在蛋白化。翻译后修饰亦包括添加聚合物以稳定肽或者改善药代动力学或药效动力学。示例性的聚合物包括例如聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(亚乙基共乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯) (PLGA)、聚谷氨酸(PGA)和聚原酸酯。
融合蛋白
本发明的方法亦可利用融合蛋白，其中将本文所述的SDF-1、mSDF-1、Xp-mSDF-1、mSDF-1-Yz或Xp-mSDF-1-Yz肽序列中的任一个与IgG (例如人IgG1)的Fc区连接。或者，所述Fc区可来源于人或其它动物的IgA、IgM、IgE或IgD，所述其它动物包括猪、小鼠、兔、仓鼠、山羊、大鼠和豚鼠。IgG的Fc区包括IgG重链的CH2和CH3结构域以及铰链区。所述铰链充当Fc融合蛋白的两个部分之间的柔性间隔区，允许分子的各部分独立地起作用。用于本发明的Fc区可以例如单体和二聚体形式制备。
示例性的Fc融合肽为具有以下氨基酸序列的S-SDF-1(S4V)-Fc。GGGGS接头(SEQ ID NO:66)用粗体表示以及Fc肽用下划线表示。
S K P V V L S Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K G G G G S V D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L Met I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V Met H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K (SEQ ID NO:67)
Fc融合肽的其它非限制性实例包括例如SDF-1(S4V)-Fc、SDF-1(L5P)-Fc、SDF-1(S6C)-Fc、SDF-1(V3H)-Fc、SDF-1-Fc、S-SDF-1-Fc和SDF-1-Fc。
所有上述蛋白质均包含在术语“本发明的SDF-1和mSDF-1蛋白质”或“本发明的肽”中。
肽合成
用于本发明的方法的SDF-1或蛋白酶抵抗突变的SDF-1肽可通过使用例如标准N-叔丁氧羰基(t-Boc)化学反应的固相肽合成以及使用N-甲基吡咯烷酮化学反应的循环来制备。用于合成肽的示例性方法例如在美国专利号4,192,798；4,507,230；4,749,742；4,879,371；4,965,343；5,175,254；5,373,053；5,763,284和5,849,954中找到，其通过引用予以结合。这些肽亦可利用重组DNA技术制备。
一旦肽合成，便可利用诸如反相柱上的HPLC等过程将其纯化。纯度亦可通过HPLC来评价，并且正确组合物的存在可通过氨基酸分析来确定。适于mSDF-1肽的纯化过程例如在美国专利公布号2008/0095758中描述，其通过引用予以结合。
融合蛋白可以经化学合成或者利用重组DNA技术制备。Fc融合肽的其它非限制性实例包括例如SDF-1(S4V)-Fc、SDF-1(L5P)-Fc、SDF-1(S6C)-Fc、SDF-1(V3H)-Fc、SDF-1-Fc、S-SDF-1-Fc和SDF-1-Fc。
药物组合物和剂量
用于本发明的方法的任何肽可以任何适当的量包含在任何合适的载体物质中并且蛋白酶抵抗的肽或融合蛋白通常以按重量计组合物总重量的1-95%的量存在，例如5%、10%、20%或50%。可将本文所述的蛋白酶抵抗SDF-1肽或融合蛋白掺入到含有诸如盐水、水、Ringer’s溶液和其它试剂或赋形剂等载体的药物组合物中。将组合物设计为用于静脉内递送(例如通过注射或可植入端口)。因此，组合物可呈例如混悬剂、乳剂、溶液剂或注射剂的形式。所有组合物均可使用本领域中标准的方法制备(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版, A. Oslo.编辑, Easton, PA (1980))。
本发明的肽可在控制释放或持续释放系统中递送。例如，可使用聚合材料以实现肽的控制释放或持续释放(参见例如Medical Applications of Controlled Release (控制释放的医学应用), Langer和Wise (编辑), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (受控的药物生物利用度、药品设计和性能), Smolen和Ball (编辑), Wiley, N.Y. (1984)；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463和5,128,326；PCT公布号WO 99/15154和WO 99/20253，通过引用予以结合)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括例如聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(亚乙基共乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯) (PLGA)、聚谷氨酸(PGA)和聚原酸酯。
预期技术人员可使用临床医学中完善建立的方法根据实际情况调整肽的剂量。最佳剂量可通过本领域已知的方法确定，并且可受诸如待治疗受试者的年龄、疾病状态和其它临床相关因素等因素影响。一般而言，当给予人时，本文所述的任何治疗剂(例如SDF-1或蛋白酶抵抗突变的SDF-1肽)的剂量将取决于所述剂的性质，并且可通过本领域技术人员容易地确定。通常，所述剂量一般为约0.001 μg-2000 mg/天，理想地为约1 mg-1000 mg/天，以及更理想地为约5 mg-500 mg/天。在一个实施方案中，所述剂量为0.01 mg/kg-100 mg/kg，或者理想地为1 mg/kg-10 mg/kg/天。
本发明的肽可每天一次、两次、三次、四次或五次；每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次或每周六次；每月一次、每两月一次、每三月一次或每六月一次；或每年一次静脉内给予。或者，本发明的肽可给予一次或两次，并且可能不需要重复给予。本文所述的肽的给予可持续直至组织损伤(例如由心肌梗死或外周血管疾病造成的组织损伤)愈合或改善。治疗的持续时间可以是例如1天-1周、1周-1个月、1周-1年或者1周-超过1年；或者，可将本发明的肽给予更短或更长的持续时间。可能不需要用所述肽连续每日给药。治疗方案可能需要数个周期，在所述周期期间不给予组合物，或者可根据需要提供治疗。
本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可在组织损伤时立即递送或者在组织损伤初始发生之后或者疾病或病况发作、识别或诊断之后(例如心肌梗死之后)的数分钟内递送。本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽亦可在初始组织损伤之后的短时或长时延迟之后递送。例如，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可在初始损伤发生之后的任何时期递送，所述时期范围从组织损伤初始发生之后或者疾病或病况发作、识别或诊断之后数分钟至1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间之内。对于实际上更慢性并且随时间出现的组织损伤，包括但不限于PVD或糖尿病伤口，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可在损伤发生之后立即递送或者在损伤(例如PVD或糖尿病伤口)的诊断或开始或随后的适应症之后立即递送。在这种情况下，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽的递送可以是在组织损伤发生之后或者组织损伤或疾病或病况的发作、识别或诊断之后3天、7天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或甚至1年或更长时间进行。
对于本文所述的任何类型的组织损伤、疾病或病症，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽的初始IV给予可以在这样的时间进行，所述时间范围从组织损伤的初始发生、识别或诊断之后数分钟至2年，或者从组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1小时至2年，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1天至1年，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1天至6个月，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1个月至6个月，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1天至1个月，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1周至1个月，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1周至2周，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1小时至1周，组织损伤的初始发生、识别或诊断之后1小时至3天，或者组织损伤的初始发生、识别或诊断之后数分钟至1小时。
本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可在治疗的持续时间内递送一次或者在治疗的持续时间内递送多次。根据组织损伤的严重性，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可随时间重复递送以确保损伤组织的修复或恢复。
此外，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽的静脉内递送可与本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽的其它递送形式组合。在一个实例中，在心肌梗死之后，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可经由冠状动脉内方法或动脉内方法初始递送，并随后接着在初始递送之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长时间开始的经由静脉内方法的后续递送。此处再次地，根据组织损伤的严重性，本发明的SDF-1或突变的SDF-1肽可随时间重复递送以确保损伤组织的修复或恢复。
用于本发明的方法的肽的适当剂量取决于数个因素，包括给予方法、病症的严重性以及待治疗的受试者的年龄、体重和健康。此外，关于具体受试者的药物基因组信息(例如基因型对治疗药的药代动力学、药效动力学或功效特征的影响)可影响所用的剂量。
诊断和治疗
本发明的方法用于治疗已诊断为具有或罹患组织损伤(例如因心肌梗死所致的对心脏组织的损伤或者由外周血管疾病造成的组织损伤)或伤口(例如糖尿病伤口)的任何受试者。组织损伤可以是例如心血管病况(例如心肌梗死)；外周血管疾病(PVD)；外周动脉疾病(PAD)；溃疡(例如皮肤伤口溃疡)；外科手术；或糖尿病的结果。本发明的方法可用于促进伤口愈合或组织修复。本领域技术人员将理解的是，本发明的受试者可能已经经受标准测试或者可能无需检查便已鉴定为由于一个或多个风险因素的存在而处于高风险。这些病症的诊断可利用本领域已知的任何标准方法进行。
本文所述的方法亦可用于治疗以高浓度蛋白酶(例如MMP-2、MMP-9、DPPIV、白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、羧肽酶M和/或羧肽酶N)为特征的任何疾病或病况，其中在蛋白酶抵抗SDF-1肽给予之后干细胞的吸引可诱导再生或愈合。通过本发明的组合物治疗的示例性病症包括炎性疾病和缺血性疾病(例如心肌梗死、中风或肢体缺血)、伤口愈合和糖尿病性溃疡。
治疗的功效可利用本领域技术人员已知的方法监测，包括例如评价疾病或病症的症状、体格检查、组织病理学检查、血液化学分析、计算机断层扫描、细胞学检查和磁共振影像学。在某些实施方案中，收集血液动力学数据以确定治疗功效。血液动力学测试可包括例如确定射血分数(例如随着每次心搏从心室泵出的血液分数)、确定舒张期末压以及确定收缩期末弹性(例如存在于左心室中的血量)。在一个实例中，血液动力学测试可用于监测受试者中的心脏功能，所述受试者患有因心肌梗死或其它形式的心脏缺血造成的组织损伤。
本发明的方法可与其它疗法联用以促进伤口愈合或组织修复。可与本发明的方法联用的治疗疗法包括但不限于肝素、β-阻断剂(例如阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔或噻吗洛尔)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利或贝那普利)、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(例如坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦或缬沙坦)、利尿剂、阿司匹林、降胆固醇药(例如HMG-CoA还原酶抑制剂(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀或辛伐他汀))、细胞疗法、抗血小板药(例如氯吡格雷、普拉格雷、噻氯匹定、西洛他唑、阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班或双嘧达莫)、抗高血压药、抗心律失常药(例如奎尼丁、普鲁卡因胺、丙吡胺、利多卡因、美西律、妥卡尼、苯妥英、莫雷西嗪、氟卡尼、索他洛尔、伊布利特、胺碘酮、溴苄胺、多非利特、地尔硫卓或维拉帕米)、血管发生药、伤口敷料、PDGF和/或负压装置和疗法。
实施例
本发明通过以下实施例阐述，其决不意图限制本发明。
实施例1.抗蛋白酶SDF-1变体的延迟的和IV给药在啮齿类动物缺血再灌注模型中改善心脏功能。
在以下实施例中，我们描述了证实含mSDF-1肽的组合物的静脉内递送和长期延迟给药在缺血再灌注模型中改善心脏功能的实验。
用0.05 mg/kg丁丙诺啡和2-3%异氟烷将大鼠麻醉。插管之后，在第4和第5根肋骨之间打开胸腔，并将左前降支(LAD)冠状动脉结扎90分钟。90分钟之后，从LAD移除缝线以开始在梗死区的再灌注。然后闭合大鼠的胸腔和皮肤。在梗死形成之后7天通过静脉内注射给予mSDF-1肽(>15只大鼠/组)。对于静脉内注射，将100 μl含S-SDF-1 (S4V) (剂量为0、0.1和1.0 mg/kg)的PBS注入大鼠的尾静脉中。
在上文描述的各实验中，在静脉内给药之后4周(缺血再灌注损伤之后5周)用随机和盲检研究分析大鼠中的血液动力学函数。用0.05 mg/kg丁丙诺啡和2-3%异氟烷将大鼠麻醉。将16G气管内导管插入大鼠中并开始机械通气。用PE 10给左颈静脉插管以递送高渗盐水(50 μl 25% NaCl水溶液)。高渗盐水用于测定体积测量的平行气传导率。
为了确定射血分数和室内压，给右颈动脉插管。插入压力-体积导管并进入左心室。获得基线压力-体积测定。将高渗盐溶液(上文所述)注入颈静脉，并随后获得压力-体积测定。
我们的结果显示，与PBS对照相比，在缺血再灌注损伤之后7天递送的S-SDF-1(S4V)的静脉内注射导致大鼠中测定的射血分数的10%改善(图1)。
其它实施方案
根据以上描述，显然可对本文所述的发明作出变动和修改以使其适用于多种用法和病况。这样的实施方案亦在本文的权利要求的范围之内。
在此说明书中提及的所有出版物、专利申请和专利均通过引用结合到本文中，引用程度如同具体和单独地指出各单独的出版物或专利申请通过引用结合一样。
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Claims (31)

1. 一种治疗或改善有需要的受试者中的组织损伤的方法，所述组织损伤由疾病或病况造成，其中所述方法包括静脉内给予包含分离的突变形式的基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)肽的组合物，所述肽包括下式：突变的SDF-1 (mSDF-1)、mSDF-1-Yz、Xp-mSDF-1或Xp-mSDF-1-Yz，其中所述SDF-1为包含SEQ ID NO:53的至少第1-8个氨基酸的氨基酸序列的肽并且其可任选在C端延伸SEQ ID NO:53的剩余序列的全部或任何部分，所述SEQ ID NO:53包含氨基酸序列：
K P X3 X4 X5 X6 Y R C P C R F F E S H V A R A N V K H L K I L N T P N C A L Q I V A R L K N N N R Q V C I D P K L K W I Q E Y L E K A L N K (SEQ ID NO:53)，其中X3、X4、X5和X6为任何氨基酸，和其中
a) Xp为蛋白质生成氨基酸或者蛋白酶保护的有机基团并且p为1-4的任意整数；
b) Yz为蛋白质生成氨基酸或者蛋白酶保护的有机基团并且z为1-4的任意整数；
c)所述mSDF-1或所述mSDF-1-Yz维持对T细胞的化学引诱剂活性并且以比天然SDF-1的灭活速率小至少50%的速率被基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、白细胞弹性蛋白酶和/或组织蛋白酶G灭活；和
d)所述Xp-mSDF-1或所述Xp-mSDF-1-Yz维持对T细胞的化学引诱剂活性，以比天然SDF-1的灭活速率小至少50%的速率被二肽基肽酶IV (DPPIV)灭活，和以比天然SDF-1的灭活速率小至少50%的速率被MMP-2、MMP-9、白细胞弹性蛋白酶和/或组织蛋白酶G灭活；
其中所述分离的突变形式的SDF-1以足以治疗或改善所述受试者中的所述组织损伤的量经静脉内给予。
2. 权利要求1的方法，其中所述分离的突变形式的SDF-1肽不包含SEQ ID NO:52的至少第1-8个氨基酸的氨基酸序列。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述X3为缬氨酸、组氨酸或半胱氨酸。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述X4为丝氨酸或缬氨酸。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述X5为亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述X6为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述肽为Xp-mSDF-1肽或Xp-mSDF-1-Yz肽并且其中X为丝氨酸以及p为1。
8. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述肽为mSDF-1-Yz肽或Xp-mSDF-1-Yz肽并且其中Y为丝氨酸以及z为1。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述分离的突变形式的SDF-1为包括式A-(L)n-Fc的融合蛋白，其中：A为分离的突变形式的SDF-1；n为0-3的整数；L为3-9个氨基酸的接头序列；和Fc为来自免疫球蛋白的Fc区的Fc肽。
10. 权利要求9的方法，其中n=1且L为GGGGS (SEQ ID NO:66)。
11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中所述疾病或病况选自中风、肢体缺血、因创伤所致的组织损伤、心肌梗死、外周血管疾病、慢性心力衰竭、糖尿病和糖尿病性伤口愈合。
12. 权利要求11的方法，其中所述疾病或病况为心肌梗死。
13. 权利要求11的方法，其中所述疾病或病况为外周血管疾病。
14. 权利要求11的方法，其中所述疾病或病况为糖尿病。
15. 权利要求11的方法，其中所述疾病或病况为糖尿病性伤口愈合。
16. 权利要求1-15中任一项的方法，其中将所述组合物给予外周静脉或中心静脉。
17. 权利要求1-16中任一项的方法，其中在所述疾病、病况或组织损伤发生之后数分钟内给予所述组合物。
18. 权利要求1-16中任一项的方法，其中在所述疾病、病况或组织损伤发生或诊断之后24小时或更长时间给予所述组合物。
19. 权利要求1-16中任一项的方法，其中在所述疾病、病况或组织损伤发生或诊断之后48小时或更长时间给予所述组合物。
20. 权利要求1-16中任一项的方法，其中在所述疾病、病况或组织损伤发生或诊断之后7天或更长时间给予所述组合物。
21. 权利要求1-16中任一项的方法，其中在所述疾病、病况或组织损伤发生或诊断之后1个月或更长时间给予所述组合物。
22. 权利要求1-16中任一项的方法，其中在所述疾病、病况或组织损伤发生或诊断之后6个月或更长时间给予所述组合物。
23. 权利要求1-22中任一项的方法，其中将所述方法与SDF-1或突变的SDF-1肽的动脉内给予组合。
24. 权利要求17-23中任一项的方法，其中所述疾病或病况为因创伤所致的组织损伤、心肌梗死或外周血管疾病。
25. 权利要求17-23中任一项的方法，其中所述疾病或病况为心血管疾病。
26. 权利要求1-25中任一项的方法，其中将所述组合物给予一次或多次直至所述组织损伤降低、修复或新血管形成发生。
27. 权利要求1-25中任一项的方法，其中将所述组合物给予一次或多次以改善所述疾病或病况的一种或多种症状。
28. 权利要求1-27中任一项的方法，其中所述组织为心脏组织。
29. 权利要求1-27中任一项的方法，其中所述组织为血管组织。
30. 权利要求1-29中任一项的方法，其中所述分离的突变形式的SDF-1包含SEQ ID NO: 67的序列。
31. 权利要求1-29中任一项的方法，其中所述SDF-1包含SEQ ID NO: 69的序列。
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