WO2007111350A1 - 血管新生ならびに癌細胞のmesenchymal型およびamoeboid型浸潤を阻害するための薬剤 - Google Patents

血管新生ならびに癌細胞のmesenchymal型およびamoeboid型浸潤を阻害するための薬剤 Download PDF

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WO2007111350A1
WO2007111350A1 PCT/JP2007/056670 JP2007056670W WO2007111350A1 WO 2007111350 A1 WO2007111350 A1 WO 2007111350A1 JP 2007056670 W JP2007056670 W JP 2007056670W WO 2007111350 A1 WO2007111350 A1 WO 2007111350A1
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seq
type
angiogenesis
polypeptide
amino acid
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PCT/JP2007/056670
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Hisataka Sabe
Ari Hashimoto
Shigeru Hashimoto
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Osaka Bioscience Institute
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to angiogenesis and tumor angiogenesis and mesenchymal type and amoeboid type invasion of cancer cells containing a peptide compound or a structural analog thereof, or a polynucleotide encoding them as an active ingredient. It relates to a drug that inhibits.
  • the drug inhibits atypical SH3Zproline ligand binding, which is not found in the normal SH3 region binding found in the protein-protein interaction between AMAP1 and cortactin, thereby inhibiting angiogenesis and tumor angiogenesis.
  • the present invention also provides an inhibitor of angiogenesis and tumor angiogenesis, mesenchymal type, and mesenchymal type, characterized by administering to a patient the above peptide-like compound or a structural analog thereof, or a polynucleotide encoding them.
  • the present invention relates to a method for treating diseases in which it is beneficial to inhibit amoeboid type cancer invasion and metastasis.
  • the present invention relates to the above peptide-like compound or a structural analog thereof, or a polynucleotide encoding the same, for producing a drug that inhibits angiogenesis and tumor angiogenesis and mesenchymal type and amoeboid type invasion of cancer cells. Also related to the use of.
  • the type that destroys the basement membrane and infiltrates is the mesenchymal type, the type is amoeboid, almost independent of proteolytic activity, and the type is amoeboid type. be called. Particularly high malignancy!
  • cancer cells infiltrate like an amoeba see Non-Patent Document 5. It is thought that this type of cancer needs to inhibit invasion and metastasis more specifically and effectively at the earliest possible stage.
  • the present inventors have a complex consisting of three kinds of proteins called AMAP1, paxillin, and cortactin in invasive breast cancer, and this protein ternary complex functions as a molecular device specific for exerting invasive activity of breast cancer.
  • This complex is low in invasiveness even in human normal mammary epithelium and breast cancer, and is not detected in noninvasive cancer or non-invasive cancer (Non-patent Document 6).
  • This complex is formed by the binding of the paxillin proline sequence in the Src homology domain 3 (SH3) domain of AMAP1 and the binding of the SH3 domain of cortactin to the proline-rich sequence of AMAP1.
  • SH3 domain of AMAP1 the binding mode of the cortactin SH3 domain and the proline sequence of AMAP1 is very different from other general SH3 / pr 0 line binding. Searching for peptides that specifically inhibit binding.
  • Non-patent literature l Folkman, JN Engl. J. Med., 1971, Nov 18; 285 (21): 1182-1186
  • Non-patent literature 2 Liotta LA, Kohn EC. Cancer Medicine 6th, 2003, Chap. 10: 151 -159
  • Non-Patent Document 3 Wolf K, Mazo I, Leung H, Engelke K, von Andrian UH, Deryugina EI, Strongin AY, Brocker EB, Friedl PJ Cell Biol, 2003, Jan 20; 160 (2): 267-277
  • Non-Patent Document 4 Friedl P, Wolf K. Nat. Rev. Cancer, 2003, May; 3 (5): 362-74.
  • Non-Patent Document 5 Rintoul RC, Sethi T. Lancet Oncol, 2001, Jul; 2 (7): 437-42.
  • Patent Document 6 Onodera Y, Hashimoto S, Hashimoto A, Morishige M, Mazaki Y, Yam ada A, Ogawa E, Adachi M, Sakurai T, Manabe T, Wada H, Matsuura N, Sabe H. E MBO J., 2005, Mar 9; 24 (5): 963-973
  • An object of the present invention is to treat angiogenesis, tumor angiogenesis, cancer invasion, and metastasis of cancer that has angiogenesis and invasive ability, particularly cancer that exhibits mesenchymal type and a moeboid type invasion, It is to provide a means to suppress this.
  • An object of the present invention is to provide a drug that inhibits angiogenesis and tumor angiogenesis and cancer cell invasion, especially mesenchymal type and amoeboid type invasion, by utilizing a newly discovered molecular target. .
  • the present inventors have conducted extensive research and inhibit the formation of AMAPl / cortactin protein complex using mouse individuals, human vascular endothelial cells, human fibrosarcoma cells, and human breast cancer cells. It has been shown that it can effectively inhibit angiogenesis and tumor angiogenesis and various types of cancer cell infiltration, especially mesenchymal and amoeboid type invasion.
  • the present inventors have succeeded in producing a cell-permeable polypeptide that inhibits AMAPl / cortactin complex formation at a low concentration.
  • This polypeptide was also found to efficiently inhibit angiogenesis, tumor angiogenesis, and invasion of mesenchymal and amoeboid cancer cells. Therefore, this polypeptide can be a lead compound in the treatment of diseases by angiogenesis and tumor angiogenesis, inhibition of cancer invasive metastasis, and the like.
  • the present invention provides an angiogenesis and tumor angiogenesis and invasion ability, particularly mesenchy mal type and amoeboid type invasion, which contains a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention relates to a drug that inhibits the invasion of cancer cells.
  • This polypeptide contains an amino acid sequence corresponding to the fourth sequence of the AMAP1 proline-rich region, and AMAP1 exhibits the inhibitory effect by binding to the SH3 region of cortactin using this peptide sequence.
  • the HIV TAT protein of SEQ ID NO: 2 is added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptide sequence (Vives E., Brodin P., & Leblus BJ Biol. Chem., 19 97, Jun 20; 272 (25): 16010-16017, Nagahara H "Vocero- Akbani AM, Snyder EL, Ho A., Latham DG, Lissy NA, Becker— Hapak M., Ezhevsky SA, & Dowdy SF Nat. Med., Dec; 4 (12): 1449-1452, Vocero— Akbani A., Heyden NV, Lissy N.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 1 can be efficiently introduced into the cell simply by adding extracellular force (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 3 extracellular force
  • the introduction time can be shortened, and when administered to an individual, it can be introduced into each tissue by intraperitoneal injection or intravenous injection.
  • This TAT sequence is either the N-terminal or ZC-terminal of the target peptide sequence, etc. In the future, it can be used freely when designing low molecular weight compounds based on SEQ ID NO: 1 as a drug in the future.
  • the polypeptide with the added peptide is the polypeptide of SEQ ID NO: 3.
  • polypeptides may be directly administered to the subject, but are preferably formulated as a drug together with a pharmaceutically acceptable carrier and administered to the subject.
  • the present invention provides angiogenesis and tumor angiogenesis and cancer cell invasion, in particular mesenchy mal type and amoeboid type invasion, comprising the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 as an active ingredient. It relates to drugs that inhibit. Examples of diseases where it is beneficial to inhibit angiogenesis and tumor angiogenesis include rheumatism, age-related macular degeneration, heart failure, periodontal disease, solid cancer and the like.
  • the polypeptide of the present invention as an active ingredient in a drug and administering it to a subject, the above-mentioned diseases in the subject can be treated and Z or prevented.
  • One preferred drug of the present invention comprises a polypeptide comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 3 as an active ingredient.
  • the peptide that is the active ingredient of the drug of the present invention may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or an analog thereof.
  • Such analogs include, for example, one or several, eg, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid added, deleted, or other amino acids (natural,
  • a label may be added to confirm the uptake and localization of the peptide of the present invention into cells.
  • a fluorescent substance fluorescein isothiocyanate (FITC) is attached to the C-terminal side of the polypeptide of SEQ ID NO: 3.
  • a polynucleotide encoding these polypeptides may be introduced into cells by a gene introduction method and expressed. Therefore, the present invention provides an angiogenesis and tumor angiogenesis, and a cancer cell mesenchym al type comprising, as an active ingredient, a polynucleotide encoding the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or an analog thereof. And drugs that inhibit amoeboid type infiltration. By prescribing the polynucleotide as an active ingredient in a drug and administering it to a subject, the disease in the subject can be treated and Z or prevented.
  • a preferred drug of the present invention comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as an active ingredient.
  • polynucleotide refers to a polymer of two or more nucleotides.
  • polypeptide refers to a peptide having 10 or more amino acid residues, but may be used together with the term “peptide”.
  • an interface related to protein interaction which has not been tried until now, is used as a molecular target, and the formation of the protein complex is inhibited, so that angiogenesis and tumor angiogenesis are very effectively performed.
  • mesechymal invasion of cancer cells and amoeb It was shown that oid type infiltration can be suppressed.
  • the identified interface involves a protein interaction module called the SH 3 region. Based on this finding, it is possible to design and synthesize low molecular weight compounds, or to screen for compounds that bind to these modules and inhibit the protein interaction. In the future, angiogenesis and tumor blood vessels will be screened.
  • Diseases beneficial to inhibit neoplasia various cancers including breast cancer, especially the inhibition of mesechymal and amoeboid type invasion of cancer cells promotes the development of effective drugs for beneficial cancer Expected to be able to.
  • FIG. 1 is a micrograph of the inhibition of tube formation of human vascular endothelial cells by P4-TAT-FITC peptide.
  • FIG. 2 is a graph showing suppression of angiogenesis of FGF-2 induced in vivo vascular endothelial cells by P4-TAT-FITC peptide.
  • FIG. 3 is a graph showing inhibition of VEGF-induced in vivo vascular endothelial cell angiogenesis by P4-TAT-FITC peptide.
  • FIG. 4 is a graph showing suppression of tumor angiogenesis by P4-TAT-FITC peptide
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examining human vascular endothelial cell survival activity by P4-TAT-FITC peptide by measuring the MTS activity of cells.
  • FIG. 6 is a graph showing suppression of mesenchymal type invasion of cancer cells by P4-TAT-FITC peptide.
  • FIG. 7 is a graph showing suppression of amoeboid type invasion of cancer cells by P4-TAT-FITC peptide.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining the survival activity of mesenchymal and amoeboid cells by P4-TAT-FITC peptide by measuring the MTS activity of cells.
  • a method for producing a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and analogs thereof, there are a chemical synthesis method, a gene recombination method, a combination thereof, and the like. A trader can select and use these methods as appropriate.
  • a chemical synthesis method the Merrifield solid phase peptide synthesis method is convenient. In this method, a t-butoxycarbol (B o c ) derivative of the carboxy terminal amino acid of the peptide to be synthesized is introduced into chloromethylated crosslinked polystyrene. Next, a second Boc-amino acid is introduced into the amino group on the resin obtained by removing the Boc group. When this procedure is repeated and the desired peptide chain is constructed, all protecting groups are removed and the peptide is separated from the resin.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and analogs thereof can also be produced by a genetic recombination method.
  • a polynucleotide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide encoding the analog thereof, for example, a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, etc. is incorporated into an appropriate vector.
  • An expression vector can be constructed.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is contained.
  • Polypeptides and their analogs can be produced.
  • An expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or an analog thereof can be constructed by a method known to those skilled in the art.
  • a preferred vector will have a promoter for initiation of transcription immediately upstream of the insertion site of the polynucleotide.
  • Appropriate promoters are also known in the art and can be selected according to functional properties in the host cell
  • the SV40 virus early gene promoter, peptide chain elongation factor EF-1a promoter, metamouthonein gene promoter, ⁇ -actin promoter, CMV virus promoter, etc. can be expressed in animal cell systems.
  • These promoters and the beta-galactosidase gene promoter can be used for expression in bacteria and gonococci.
  • An appropriate vector can be selected from those known in the art in consideration of a promoter, a transcription termination signal, a selection marker, and other conditions.
  • Escherichia coli, pGE MEX, pUC, pTAT, etc. can be mentioned.
  • a selectable marker such as a drug resistance marker is present in the vector.
  • an expression vector containing human hematopoietic type PGD synthase and a plasmid encoding drug resistance such as a separate antibiotic may be transformed simultaneously.
  • a host cell that can be used for the expression of the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or an analog thereof may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic microorganisms such as E. coli
  • eukaryotic microorganisms such as S. cerevisiae
  • mammalian cells are used.
  • Tissue culture cells include avian or mammalian cells such as murine, rat and monkey cells. Selection and use methods of appropriate host cell vector systems are known to those skilled in the art and can be selected as appropriate.
  • a desired protein can be obtained by culturing transformed cells according to a conventional method.
  • the culture medium and culture conditions used for the culture can be appropriately selected according to the properties of the host. For example, when the host is Escherichia coli, the LB medium or TB medium is used. When the host is a mammalian cell, RPMI 1640 A culture medium etc. can be used suitably.
  • Isolation and purification of the peptide, which is the active ingredient of the drug of the present invention, with the culture strength obtained by this culture can be carried out by conventional methods.
  • the culture is subjected to physical and chemical studies of the protein. It is possible to carry out using various processing operations using properties. Specifically, treatment with a protein precipitating agent, ultrafiltration, high performance liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, affinity chromatography and the like can be used alone or in combination.
  • the peptide of the present invention and its analogs can be introduced into cultured cells or living bodies. They may be introduced alone into cells or living bodies as they are. As described above, it is preferable to administer to a living body as a drug containing these as active ingredients.
  • Polypep of SEQ ID NO: 3 The peptide is the peptide with SEQ ID NO: 2 added to the C-terminus of the polypeptide with SEQ ID NO: 1 so that the polypeptide of SEQ ID NO: 1 can be efficiently introduced into the cell simply by adding it from outside the cell. It is easier to introduce.
  • the cell type is not particularly limited.
  • the introduction efficiency varies depending on the cell type.
  • the efficiency of introduction into cells can be evaluated by, for example, the fluorescence intensity of FITC added to the C-terminal side of the polypeptide of SEQ ID NO: 3.
  • the concentration of the introduced substance is in the range of 1 ⁇ to 10 ⁇ in the final concentration.
  • the introduction time is about 30 minutes to 2 hours.
  • the polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 can be formulated as a liquid or solid preparation by mixing and diluting an analog thereof with a known carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, purified water, physiological saline, ethanol such as ethanol “propylene glycol” glycerin “polyethylene glycol”, triacetin or the like can be used.
  • the liquid preparation thus prepared can be used by diluting it into, for example, a maintenance liquid comprising a lactated Ringer's solution, an infusion electrolyte solution, a postoperative recovery liquid, a dehydration replenisher, a drip physiological saline, or the like.
  • Additives that are appropriately selected and used for liquids for example, buffer for adjusting ⁇ (for example, phosphate buffer, borate buffer, citrate buffer, tartaric acid buffer, acetate buffer, etc.), isotonic An agent (for example, sorbitol, glycerin, polyethylene darcol, propylene glycol, glucose, sodium chloride, etc.) may be prepared.
  • buffer for adjusting ⁇ for example, phosphate buffer, borate buffer, citrate buffer, tartaric acid buffer, acetate buffer, etc.
  • An agent for example, sorbitol, glycerin, polyethylene darcol, propylene glycol, glucose, sodium chloride, etc.
  • Such preparations further include pharmaceutically acceptable salts such as benzalkonium, noroxybenzoic acid esters, benzyl alcohol, parachloromethaxinol, chlorcresol, phenethyl alcohol, sorbic acid or salts thereof, Adequate antiseptics such as thimerosal and chlorobutanol, wetting agents such as talc, emulsifiers such as polyethylene glycol monooleate, dispersants, stabilizers such as stabilizers such as sulfites, bisulfites and metabisulfites. May be added. Also preferred is a suspension using gum arabic, kaolin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc. as a suspending agent.
  • pharmaceutically acceptable salts such as benzalkonium, noroxybenzoic acid esters, benzyl alcohol, parachloromethaxinol, chlorcresol, phenethyl alcohol, sorbic acid or salts thereof.
  • Adequate antiseptics such as thime
  • solid preparations such as tablets, granules, and powders.
  • soft Semi-solid preparations such as salves or suppositories can also be prescribed.
  • the manufacturing method, dosage method, and usage method of these dosage forms are also known to those skilled in the art.
  • Parenteral administration is preferable as a route of administration of the peptide of the present invention or its analog, for example, intravenous administration, transcerebral spinal fluid administration, transarterial local administration using a catheter, or surgical administration. Local administration. In general, it is administered by injection such as intraperitoneal injection, subcutaneous injection and intravenous injection, or infusion. Oral administration is also possible.
  • the dosage of the peptide of the present invention or an analog thereof is about 0.1 to about 100 mgOkgZkgZ day, preferably about 1 to about 500 mgZkgZ day. These doses and administration methods can be appropriately increased or decreased or changed depending on the type of subject, sex, type of disease to be treated, site, and the like.
  • the efficiency of introduction into each tissue can be evaluated by, for example, the fluorescence intensity of FITC attached to the C-terminal side of the polypeptide of SEQ ID NO: 3.
  • the drug containing the peptide of the present invention or an analog thereof as an active ingredient may contain one or more additional active ingredients.
  • additional active ingredients include cell growth inhibitors (eg, Herceptin) and anticancer agents (eg, tamoxifen).
  • cell growth inhibitors eg, Herceptin
  • anticancer agents eg, tamoxifen
  • the additional active ingredient can be appropriately selected by a doctor depending on the condition of the subject, the disease to be treated, and the like. Moreover, you may use the chemical
  • the present invention provides a drug that inhibits angiogenesis and mesenchymal type invasion and amoeboid type invasion of cancer cells as described above, and comprises a polyamino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the present invention also relates to drugs containing polynucleotides encoding peptides or their analogs.
  • a drug is usually in a form containing the above polypeptide dissolved or suspended in a nuclease-free liquid carrier.
  • the polynucleotide may be incorporated in a vector as it is.
  • polynucleotide encoding the polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 examples include a polynucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • An example of a polynucleotide encoding a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is a polynucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, for example.
  • These polynucleotides can be introduced into a cell or a living body by a gene transfer method known in the art, and the desired peptide can be expressed in the cell.
  • Examples of gene transfer methods include microinjection method, calcium phosphate method, eletroporation method, protoplast fusion method, DEAE dextran method, lipofuxion method, virus method using virus vector, particle gun method and the like.
  • a preferred method is the lipofusion method.
  • DNA is bound to ribosomes, and polynucleotides are introduced into cells using cell fusion.
  • a ribosome-polynucleotide complex can be formed by mixing cationic ribosomes made of artificially produced lipid bilayers and polynucleotides. When cells are cultured in a solution containing this complex, the polynucleotide in the complex is taken up by the cells.
  • lipofectin trade name
  • lipofuectamine trade name
  • the drug containing the polynucleotide as an active ingredient may contain a polynucleotide encoding one or more additional active ingredients. These polynucleotides may be present in the drug separately, and two or more polynucleotides may be linked. These polypeptides may be incorporated into an appropriate vector. Further active ingredients include cell growth inhibitors (such as Herceptin) and anticancer agents (such as Tamoxifen). Further active ingredients can be appropriately selected by a doctor depending on the condition of the subject, the disease to be treated, and the like. Further, the drug of the present invention may be used in combination with other drugs. There are various forms of concomitant administration such as simultaneous administration and sequential administration, and the doctor can also select appropriately according to various conditions.
  • the present invention is characterized in that a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or an analog thereof, or a polynucleotide encoding them is administered to a patient. Relates to the inhibition of angiogenesis and tumor angiogenesis in patients and methods of inhibiting mesenchymal and amoeboid cancer invasion and metastasis.
  • the dosage and administration method of the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and the analogs thereof, or the polynucleotide encoding them in the therapeutic method of the present invention are as described above.
  • the diseases that can be sampled by the method of the present invention are also as described above.
  • a cell growth inhibitor and And other active ingredients such as anticancer agents may be used in combination.
  • other treatment methods such as drugs, radiation or immunotherapy may be used in combination with the treatment method of the present invention.
  • the present invention provides SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 for the manufacture of a medicament for inhibiting angiogenesis and tumor angiogenesis and mesenchymal and amoeboid type invasion of cancer cells. It also relates to the use of polypeptides comprising amino acid sequences or analogs thereof, or polynucleotides encoding them. In producing the above drug, another drug such as a cell growth inhibitor or an anticancer drug may be used in combination.
  • Example 1 Example 1
  • FITC human umbilical vein-derived vascular endothelial cells
  • AMAPlZcortactin complex formation for vascular endothelial cell lumen formation induced by FGF-2 or VEGF stimulation.
  • P4-TAT-FITCj The inhibitory effect of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 (hereinafter referred to as “P4-TAT-FITCj”) was examined.
  • P4-TAT-FITC peptide in a medium containing FGF-2 or VEGF, or scramble-TAT-FITC peptide with SEQ ID NO: 2 and FITC attached to a peptide randomly rearranged as SEQ ID NO: 1 as a control was added to the overlaid collagen and cultured at 37 ° C for 3 days to examine the inhibitory effect of vascular endothelial cells on tube formation.
  • Matrigiel was supplemented with FGF-2 or VEGF, and P4-TAT-FITC peptide or the above-mentioned scramble-TAT-FITC peptide as a control, and a 0.15 cm diameter lcm tube (angioreactor; CULTREX ) And allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to gel, then transplanted subcutaneously into mice. After breeding for 9 days, new blood vessels that had invaded Matrigel were taken out together with Matrigel, and Matrizier was decomposed with a solution containing protease to collect vascular endothelial cells.
  • the collected vascular endothelial cells were reacted with lectin to which the marker, piotin was added, and the reacted lectin was reacted with avidin to which a dye was added, and angiogenesis was measured by measuring the fluorescence intensity.
  • Matrigiel was supplemented with MDA-MB-231 cells and P4-TAT-FITC peptide or the above-mentioned scramble-TAT-FITC peptide as a control, and a 0.15 cm diameter lcm tube (angioreactor CULTREX) was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour to gel, and then transplanted subcutaneously into mice. After breeding for 9 days, new blood vessels that had invaded Matrigel were taken out together with Matrigel, and Matrizier was decomposed with a solution containing protease to collect vascular endothelial cells.
  • angioreactor CULTREX angioreactor CULTREX
  • the collected vascular endothelial cells were reacted with lectin to which the marker, piotin was added, and the reacted lectin was reacted with avidin to which a dye was added, and angiogenesis was measured by measuring the fluorescence intensity.
  • Human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC) were adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and 100 1 each was dispensed into a 96-well plate. After culturing at 37 ° C for 6 hours, the medium is changed to a medium containing no growth factors, and after culturing, FGF-2 or VEGF and the above-mentioned scramble-TAT-FITC peptide are added as a control or P4-TAT-FITC peptide. Cut and cultured for 3 days.
  • VEC Human umbilical vein-derived vascular endothelial cells
  • the vertical axis shows the relative invasive activity of each treated cell when the invasive activity or MTS activity of untreated cells is 100.
  • P4-TAT-FITC peptide Had no effect on cytotoxicity and significantly reduced mesenchymal invasive activity of cancer cells
  • the present invention relates to the field of pharmaceuticals, particularly for the treatment and Z or prevention of diseases beneficial for inhibiting angiogenesis and diseases beneficial for inhibiting mesenchymal and amoeboid type invasion of cancer cells. It can be used in the field of pharmaceuticals.

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Abstract

　本発明は、配列番号：１または配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはその類縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、血管新生ならびに癌細胞のmesenchymal型およびamoeboid型の浸潤を阻害する薬剤に関する。また本発明は、上記ペプチド又はその類縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを特徴とする、血管新生の阻害、ならびにmesenchymal型およびamoeboid型の癌浸潤と転移を阻害することが有益な疾病の治療方法に関する。さらに本発明は、血管新生ならびに癌細胞のmesenchymal型およびamoeboid型浸潤を阻害する薬剤の製造のための上記ペプチド又はその類縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用にも関する。

Description

血管新生ならびに癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を阻 害するための薬剤
技術分野
[0001] 本発明は、ペプチド性ィ匕合物又はその構造類縁物、あるいはそれらをコードするポ リヌクレオチドを有効成分として含有する、血管新生および腫瘍血管新生ならびに癌 細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を阻害する薬剤に関する。該薬剤は、 AMAP1と cortactinとの蛋白質間相互作用に見出された通常の SH3領域の結合には みられな 、非典型的な SH3Zprolineリガンド結合を阻害することにより、血管新生、 腫瘍血管新生の阻害、ならびに mesenchymal型および amoeboid型の癌浸潤と転移の 阻害作用を発揮する。また本発明は、上記ペプチド性ィ匕合物又はその構造類縁物、 あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを特徴とする、血 管新生および腫瘍血管新生の阻害、ならびに mesenchymal型および amoeboid型の 癌浸潤と転移を阻害することが有益な疾病の治療方法に関する。さらに本発明は、 血管新生および腫瘍血管新生ならびに癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型 浸潤を阻害する薬剤の製造のための上記ペプチド性ィ匕合物又はその構造類縁物、 あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用にも関する。
背景技術
[0002] 癌の最も大きな脅威は、その浸潤 ·転移性にある。癌細胞が増殖するためには、栄 養や酸素などを供給するための血管の新生が必要である (非特許文献 1参照)。また 、このように癌へ新生した血管は、癌細胞の転移の為のルートともなる。癌細胞が浸 潤するメカニズムと、血管が新生するメカニズムは類似していることが知られている（ 非特許文献 2参照)。血管新生は、正常なヒト成体において認められる生理的現象で あるとともに、固形癌、リウマチ、加齢性黄斑変性症、心不全、歯周病等の様々な疾 患にも認められることから、現在、詳細なメカニズムの解明及びその過程に関与する 様々な分子を標的とした薬剤の開発が進められている。
[0003] 癌の転移には多くの場合、細胞が浸潤性を獲得し、周囲の基底膜を破壊し運動す る能力を獲得することが必要である。従って、腫瘍細胞が浸潤性を獲得することは、 その悪性度の進行と密接に関連する。このような基底膜を破壊し運動する能力を獲 得するためには、蛋白質の分解が必要である。近年、基底膜破壊に直接関わるマトリ ックスメタ口プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素活性を当該する阻害剤で十分に阻 止しても、ある種の浸潤性癌細胞はアメーバ様の運動形態を示し浸潤することが報 告された (非特許文献 3,4参照)。癌細胞の浸潤タイプは様々であるが、このうち、基 底膜を破壊し浸潤していくタイプを mesenchymal型、蛋白質分解活性に殆ど依存せ ずアメーバ様に浸潤して 、くタイプを amoeboid型と呼ばれる。特に悪性度の高！、小 細胞肺癌等にぉ 、て、癌細胞がアメーバ様に浸潤することが確認されて 、る（非特 許文献 5参照)。この種の癌は非常に進行が早ぐできるだけ早い段階でより特異的、 効果的に浸潤 ·転移を阻害することが必要と考えられて 、る。
本発明者らは、浸潤性乳癌において AMAP1、 paxillin, cortactinと呼ばれる 3種の 蛋白質からなる複合体が存在し、この蛋白質三者複合体が乳癌の浸潤活性発揮に 特異的な分子装置として機能して 、ることを明らかにした (非特許文献 6)。この複合 体は、ヒト正常乳腺上皮や乳癌であっても浸潤性の低!、ものや非浸潤的な癌では検 出されない（非特許文献 6)。この複合体は、 AMAP1の Srcホモロジ一ドメイン 3(SH3)ド メインで paxillinの proline配列との結合と、 cortactinの SH3ドメインと AMAP1の prolineに 富む配列との結合によって形成される。特に cortactinの SH3ドメインと AMAP1の prolin e配列との結合様式が、他の一般的な SH3/pr0line結合とは大きく異なることを明らか にしており、本発明者らは、この cortactin/AMAPlの結合を特異的に阻害するぺプチ ドを検索中である。
非特許文献 l : Folkman, J. N. Engl. J. Med., 1971, Nov 18;285(21):1182- 1186 非特許文献 2 : Liotta LA, Kohn EC. Cancer Medicine 6th, 2003, Chap. 10: 151-159 非特許文献 3 : Wolf K, Mazo I, Leung H, Engelke K, von Andrian UH, Deryugina EI, Strongin AY, Brocker EB, Friedl P. J. Cell Biol, 2003, Jan 20;160(2):267-277. 非特許文献 4 : Friedl P, Wolf K. Nat. Rev. Cancer, 2003, May;3(5):362-74.
非特許文献 5 : Rintoul RC, Sethi T. Lancet Oncol, 2001, Jul ;2 (7) :437- 42.
特許文献 6 : Onodera Y, Hashimoto S, Hashimoto A, Morishige M, Mazaki Y, Yam ada A, Ogawa E, Adachi M, Sakurai T, Manabe T, Wada H, Matsuura N, Sabe H. E MBO J., 2005, Mar 9;24(5):963- 973
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、血管新生や浸潤能を有する癌、とりわけ mesenchymal型および a moeboid型の浸潤を示す癌の治療に関して、血管新生、腫瘍血管新生、癌浸潤、並 びに癌の転移、を抑制する手立てを提供することである。本発明の目的は、今までに はない新しく見いだした分子標的を利用し、血管新生および腫瘍血管新生ならびに 癌細胞の浸潤、とりわけ mesenchymal型および amoeboid型の浸潤を阻害する薬剤を 提供することである。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、マウス個体、ヒト血管内皮細胞 、ヒト繊維肉腫細胞、ヒト乳癌細胞を用いて、 AMAPl/cortactin蛋白質複合体形成を 阻害することで、血管新生および腫瘍血管新生ならびに癌細胞の種々のタイプの浸 潤、とりわけ mesenchymal型および amoeboid型の浸潤を効果的に阻害できることを明 らかにした。
[0007] 本発明者らは、 AMAPl/cortactinの複合体形成を低濃度で阻害する細胞透過性ポ リペプチドの作成に成功した。このポリペプチドは、血管新生および腫瘍血管新生な らびに mesenchymal型および amoeboid型の癌細胞の浸潤を効率よく阻害することも確 認した。従って、このポリペプチドは血管新生および腫瘍血管新生、癌の浸潤転移の 阻害などによる疾患治療におけるリード化合物となりうる。
[0008] すなわち、本発明は、配列番号 1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを有効成分とし て含有する、血管新生および腫瘍血管新生や浸潤能を有する癌、とりわけ mesenchy mal型および amoeboid型の浸潤を示す癌細胞の浸潤を阻害する薬剤に関する。この ポリペプチドは、 AMAP1の prolineに富む領域の第 4配列に相当するアミノ酸配列を 含み、 AMAP1はこのペプチド配列を用いて cortactinの SH3領域と結合することにより 上記阻害効果を奏する。
[0009] 本発明においては、配列番号 1のアミノ酸配列に配列番号 2の HIVの TATタンパク 質に由来するポリペプチド配列（Vives E., Brodin P., & Leblus B. J. Biol. Chem., 19 97, Jun 20;272(25):16010-16017, Nagahara H" Vocero- Akbani A. M., Snyder E. L. , Ho A., Latham D. G., Lissy N. A., Becker— Hapak M., Ezhevsky S. A., & Dowdy S. F. Nat. Med., Dec;4(12): 1449-1452, Vocero— Akbani A., Heyden N. V., Lissy N. A ., Ratner L., & Dowdy S. F. Nat. Med., 1999, Jan;5(l):29— 33, Schwarze S., Ho A., Vocero— Akbani A., & Dowdy S. F. Science, 1999, Sep 3;285(5433): 1569— 1572)を 結合させることにより、細胞外力 添加するだけで配列番号 1のポリペプチドが細胞内 に効率よく導入されるように工夫している（配列番号 3)。また、配列番号 2のポリぺプ チド配列を結合させることにより、導入時間が短くてすむ、個体への投与の際、腹腔 内注射や静脈注射などにより各組織に導入できる等の利点も生じる。この TAT配列 は、目的のペプチド配列等の N末 ZC末のいずれにも付加することができ、今後薬剤 として配列番号 1に基づ!ヽた低分子性化合物等をデザインする際にも自由に利用で きる。配列番号 1のポリペプチドの C末端に配列番号 2のペプチドを付加したものが 配列番号： 3のポリペプチドである。
[0010] これらのポリペプチドは、そのまま対象に投与してもよいが、好ましくは医薬上許容 される担体とともに薬剤として処方して対象に投与する。
[0011] したがって、本発明は、配列番号 1または配列番号： 3のポリペプチドを有効成分と して含む、血管新生および腫瘍血管新生ならびに癌細胞の浸潤、とりわけ mesenchy mal型および amoeboid型の浸潤を阻害する薬剤に関する。血管新生および腫瘍血管 新生を阻害することが有益である疾患の例としては、リウマチ、加齢性黄斑変性症、 心不全、歯周病、固形癌等が挙げられる。癌細胞の mesenchymal型および amoeboid 型の浸潤を阻害することが有益である癌の例としては、乳癌をはじめとし血管新生を 伴う癌、基底膜を分解して浸潤する癌 (例えば、神経肉腫、神経膠腫等)、基底膜の 分解を伴わずに浸潤する癌 (例えば、小細胞肺癌、小細胞前立腺癌、リンパ腫等）が 挙げられる。本発明のポリペプチドを有効成分として薬剤中に処方して、これを対象 に投与することにより、該対象における上記疾患を治療および Zまたは予防すること ができる。本発明の 1の好ましい薬剤は、配列番号： 3に示す配列を含むポリペプチド を有効成分として含むものである。 [0012] さらに、本発明の薬剤の有効成分たるペプチドは、配列番号： 1または配列番号: 3 のアミノ酸配列を含むポリペプチドのほ力、それらの類縁物であってもよい。かかる類 縁物としては、例えば、配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列に対して 1個な いし数個、例えば、 1個ないし 9個、 1個ないし 8個、 1個ないし 7個、 1個ないし 6個、 1 個ないし 5個、 1個ないし 4個、 1個ないし 3個、 1個ないし 2個、あるいは 1個のアミノ酸 が付加、欠失、あるいは他のアミノ酸 (天然型、非天然型いずれであってもよい）で置 換されて 、るアミノ酸配列を含むペプチドであって、血管新生および腫瘍血管新生 ならびに癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を阻害する活性を有するも のが挙げられる。
[0013] また、本発明のペプチドの細胞への取り込みおよび局在化を確認するため、標識 を付加してもよい。本願明細書の実施例においては、配列番号 3のポリペプチドの C 末側に蛍光物質である fluorescein isothiocyanate (FITC)が付カ卩されている。
[0014] また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを遺伝子導入の方法で細 胞に導入して発現させてもよい。従って、本発明は、配列番号： 1または配列番号： 3 のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類縁物をコードするポリヌクレオチド を有効成分として含む、血管新生および腫瘍血管新生ならびに癌細胞の mesenchym al型および amoeboid型浸潤を阻害する薬剤に関する。上記ポリヌクレオチドを有効成 分として薬剤中に処方して、これを対象に投与することにより、該対象における上記 疾患を治療および Zまたは予防することができる。本発明の好ましい薬剤は、配列番 号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分とし て含むものである。
[0015] 本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは 2以上のヌクレオチドが重合したものを いう。また本明細書において、「ポリペプチド」とはアミノ酸残基数が 10以上のぺプチ ドをいうが、「ペプチド」なる語と混用されることがある。
発明の効果
[0016] 今回の発明において、今まで試されたことがない蛋白質相互作用に関わるインター フェースを分子標的とし、当該蛋白質複合体形成を阻害することによって非常に効 果的に血管新生、腫瘍血管新生ならびに癌細胞の mesechymal型浸潤および amoeb oid型浸潤を抑制できることが示された。同定されたインターフェースには ヽずれも SH 3領域と呼ばれる蛋白質相互作用モジュールが関与している。この知見に基づき、低 分子化合物をデザインして合成すること、ある 、はこれらのモジュールに結合して当 該蛋白質相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能となり、今後、 血管新生および腫瘍血管新生を阻害することが有益な疾病、乳癌をはじめとする様 々な癌、特に癌細胞の mesechymal型浸潤および amoeboid型浸潤を阻害することが 有益な癌に対して有効な薬剤の開発を促進することができると期待される。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、 P4-TAT- FITCペプチドによるヒト血管内皮細胞の管腔形成阻害の顕 微鏡写真である。
[図 2]図 2は、 P4- TAT- FITCペプチドによる FGF-2誘導 in vivo血管内皮細胞の血管 新生の抑制を示すグラフである。
[図 3]図 3は、 P4- TAT- FITCペプチドによる VEGF誘導 in vivo血管内皮細胞の血管 新生の抑制を示すグラフである。
[図 4]図 4は、 P4-TAT-FITCペプチドによる腫瘍血管新生の抑制を示すグラフである
[図 5]図 5は、細胞の MTS活性を測定することにより、 P4-TAT-FITCペプチドによるヒ ト血管内皮細胞生存活性を調べた結果を示すグラフである。
[図 6]図 6は、 P4-TAT- FITCペプチドによる癌細胞の mesenchymal型浸潤の抑制を示 すグラフである。
[図 7]図 7は、 P4-TAT-FITCペプチドによる癌細胞の amoeboid型浸潤の抑制を示す グラフである。
[図 8]図 8は、細胞の MTS活性を測定することにより、 P4- TAT-FITCペプチドによる me senchymal型と amoeboid型細胞の生存活性を調べた結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそれらの 類縁物を製造する方法としては、化学合成法や遺伝子組み換え法、それらの組み合 わせ等があり、当業者はこれらの方法を適宜選択して用いることができる。 [0019] 化学的合成法としてはメリフィールド固相ペプチド合成法が便利である。この方法 では、合成しょうとするペプチドのカルボキシ末端アミノ酸の t-ブトキシカルボ-ル (B oc)誘導体を、クロロメチルイ匕した架橋ポリスチレンに導入する。次に Boc基を除去し て得られる榭脂上のアミノ基に第二の Boc-アミノ酸を導入する。この操作を繰り返し、 目的とするペプチド鎖が構築できたら、全保護基を除くとともにペプチドを榭脂から切 り離す。
[0020] 遺伝子組み換え法によっても配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含む ポリペプチド、およびそれらの類縁物を製造することができる。配列番号 1または配列 番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはそれらの類縁物をコードするポリ ヌクレオチド、例えば配列番号 4または配列番号： 6のヌクレオチド配列を含むポリヌク レオチド等を適当なベクターに組み込んで、発現ベクターを構築することができる。 得られた発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を上記ポリ ヌクレオチドの発現に適した条件下で培養することにより、配列番号 1または配列番 号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそれらの類縁物を製造することがで きる。
[0021] 配列番号 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはそれらの 類縁物をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で 構築することができる。好ましいベクターは、該ポリヌクレオチドの挿入部位の直ぐ上 流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモーターも当 該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる
。例えば、 SV40ウィルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因子 EF-1 a のプロモーター、メタ口チォネイン遺伝子のプロモーター、 β -ァクチンのプロモータ 一、 CMVウィルスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、 Τ7ポリメラーゼのプ 口モーターやベータ一ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌、大臉菌での 発現に用いることができる。発現させるべきポリヌクレオチドの挿入部位下流には転 写終結シグナルがあることが望ま 、。
[0022] 適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他の条件 を考慮し、当該技術分野で既知のもの力 選択することができる。配列番号 1または 配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類縁物をコードするポリ ヌクレオチドを挿入し、培養細胞に導入してこのポリヌクレオチドを発現する目的に用 いることができるベクターとして、例えば動物細胞での発現においては pKCR、 pEF -BOS, CDM8、 pCEV4ゥシパピローマウィルス DNA等、大腸菌においては pGE MEX、 pUC、 pTAT等を挙げることができる。
[0023] ベクター中には、例えば薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在する ことが望ましい。あるいは、ヒト造血器型 PGD合成酵素を含有する発現ベクターと別 個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換してもよ い。
[0024] 配列番号 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはそれらの 類縁物の発現に用い得る宿主細胞は、上記ポリペプチドを発現し得る増殖可能なも のであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、 S.セレビジェのような真核 性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ又は哺乳類細 胞、例えばネズミ、ラット及びサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞 ベクターシステ ムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、適宜選択することができる。
[0025] 形質転換した細胞を常法に従い培養することにより所望の蛋白質が得られる。培養 に用いる培地および培養条件は宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、 例えば宿主が大腸菌である場合には LB培地や TB培地が、宿主が哺乳動物細胞で ある場合には RPMI 1640培地等を適宜用いることができる。
[0026] この培養により得られる培養物力 の本発明の薬剤の有効成分たるペプチドの単 離および精製は、常法により行うことが可能であり、例えば培養物を蛋白質の物理的 及びィ匕学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。具体的 には、蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離 、電気泳動、ァフィ-ティクロマトグラフィーなどを単独で、又は組み合わせて用いるこ とがでさる。
[0027] 本発明のペプチドおよびその類縁物を培養細胞や生体に導入することができる。そ れらを、そのまま単独で細胞や生体に導入してもよい。上述のごとぐこれらを有効成 分として含有する薬剤として生体に投与することが好ましい。配列番号： 3のポリぺプ チドは、配列番号： 1のポリペプチドの C末端に配列番号： 2のペプチドを付加したも のであり、細胞外から添加するだけで配列番号 1のポリペプチドが細胞内に効率よく 導入されるようになって ヽるので、さらに導入が容易である。
[0028] 本発明で用いたペプチドの培養細胞への導入方法にお!、ては、特に細胞の種類 は問わない。しかしながら、細胞種によって導入効率は異なる。細胞への導入効率は 、例えば、配列番号 3のポリペプチドの C末側に付加した FITCの蛍光強度により評 価することが可能である。本明細書の実施例においては、導入物質濃度は、最終濃 度が 1 μ Μから 10 μ Μの範囲で行っている。また、導入時間は、 30分から 2時間程 度で十分である。
[0029] 通常は、配列番号 1または 3の配列を含むポリペプチドある 、はその類縁物を自体 公知の担体と混合希釈して、例えば液剤や固形剤等として製剤化することができる。 液剤を調製するには、医薬上許容される担体、例えば精製水、生理食塩水、ェタノ ール 'プロピレングリコール 'グリセリン 'ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリ ァセチン等を用いることができる。このように調製した液剤は、例えば乳酸リンゲル液 、輸液用電解質液よりなる維持液、術後回復液、脱水補給液、点滴用生理食塩液等 に希釈して用いることができる。液剤に適宜選択して用いられる添加剤、例えば、 ρΗ 調整用の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クェン酸緩衝液、酒石酸緩 衝液、酢酸緩衝液等）、等張化剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、ポリエチレンダリ コール、プロピレングリコール，グルコース、塩化ナトリウム等）をカ卩えても良い。このよ うな製剤には、さらに薬学上許容しうる塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、ノラオキシ安息香酸 エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキシノール、クロルクレゾール、フエ ネチルアルコール、ソルビン酸又はその塩、チメロサール、クロロブタノール等の適当 な防腐殺菌剤、タルク等の湿潤剤、モノォレイン酸ポリエチレングリコール等の乳化 剤、分散剤、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩等の安定剤のような補助剤 を加えても良い。また、アラビアゴム、カオリン、メチルセルロース、カルボキシメチル セルロースナトリウム等を懸濁化剤として用いた懸濁剤も好まし 、剤型の 1つと 、える
[0030] また、錠剤、顆粒、粉末等の固形剤を処方することも可能である。さらにパスタ、軟 膏等の半固形剤、あるいは坐薬等も処方可能である。これらの剤形の製造方法、投 与方法、使用方法等も当業者に公知である。
[0031] 本発明のペプチドまたはその類縁物の投与経路としては非経口投与が好ましぐ例 えば経静脈的投与、経脳脊髄液投与、カテーテルによる経動脈的な局所投与、もし くは外科的な局所投与を含む。一般的には、腹腔注射、皮下注射及び静脈注射等 の注射または輸液により投与する。経口投与も可能である。本発明のペプチドまたは その類縁物の投与量は、約 0. 1〜約 lOOOmgZkgZ日、好ましくは約 1〜約 500m gZkgZ日である。これらの投与量、ならびに投与方法は対象の種類、性別、処置す べき疾患の種類、部位等により適宜増減あるいは変更されうる。各組織への導入効 率は、例えば、配列番号 3のポリペプチドの C末側に付カ卩した FITCの蛍光強度によ り評価することが可能である。
[0032] 本発明のペプチドまたはその類縁物を有効成分として含む薬剤は、 1種またはそれ 以上のさらなる有効成分を含有していてもよい。さらなる有効成分としては、細胞増殖 抑制剤（例えば、ハーセプチン等）、抗癌剤（例えば、タモキシフェン等）が例示でき る。さらなる有効成分は、対象の状態、処置すべき疾患等により医師が適宜選択する ことができる。また、本発明の薬剤を、他の薬剤と併用してもよい。併用の形態は同時 投与、逐次投与等様々であり、やはり医師が諸条件に応じて適宜選択することができ る。
[0033] さらに本発明は、上述のごとぐ血管新生ならびに癌細胞の mesenchymal型浸潤お よび amoeboid型浸潤を阻害する薬剤であって、配列番号 1または配列番号： 3のアミ ノ酸配列を含むポリペプチドあるいはそれらの類縁物コードするポリヌクレオチドを含 む薬剤にも関する。かかる薬剤は、通常には、ヌクレアーゼ不含の液体担体中に溶 解または懸濁された上記ポリペプチドを含む形態である。上記ポリヌクレオチドは、そ のままの形態であってもよぐベクター中に組み込まれていてもよい。配列番号 1のァ ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号 4に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがある。また、配列番号 3のアミノ酸 配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号 6に 示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがある。 [0034] これらのポリヌクレオチドを、当該分野で公知の遺伝子導入 (gene transfer)の方法 にて細胞または生体に導入して、細胞内で目的のペプチドを発現させることができる 。遺伝子導入の方法としては、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレ タトロポレーシヨン法、プロトプラスト融合法、 DEAEデキストラン法、リポフエクシヨン法 、ウィルスベクターを用いるウィルス法、パーティクルガン法等がある。好ましい方法 はリポフエクシヨン法である。この方法では DNAが結合したリボソームを用い細胞融合 を利用して細胞にポリヌクレオチドを導入する。人工的に作成した脂質二重層ででき た陽イオンリボソームとポリヌクレオチドを混合するとリボソーム ポリヌクレオチド複合 体ができる。この複合体を含む溶液で細胞を培養すると複合体中のポリヌクレオチド が細胞に取り込まれる。陽イオンリボソームを作る人工脂質としてはリポフエクチン (商 品名）、リポフエクタミン (商品名）等を好ましく利用できる。
[0035] 上記ポリヌクレオチドを有効成分として含む薬剤は、 1種またはそれ以上のさらなる 有効成分をコードするポリヌクレオチドを含有して ヽてもよ ヽ。これらのポリヌクレオチ ドは別々に薬剤中に存在していてもよぐ 2以上のポリヌクレオチドが連結されていて もよい。これらのポリペプチドは適当なベクター中に組み込まれていても良い。さらな る有効成分としては、細胞増殖抑制剤（例えば、ハーセプチン等）、抗癌剤（例えば、 タモキシフェン等）が例示できる。さらなる有効成分は、対象の状態、処置すべき疾患 等により医師が適宜選択することができる。また、本発明の薬剤を、他の薬剤と併用 してもよい。併用の形態は同時投与、逐次投与等様々であり、やはり医師が諸条件 に応じて適宜選択することができる。
[0036] 本発明は、さらなる態様において、配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を 含むポリペプチドあるいはそれらの類縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオ チドを患者に投与することを特徴とする、患者における血管新生および腫瘍血管新 生の阻害、ならびに mesenchymal型および amoeboid型の癌浸潤と転移を阻害する方 法に関する。本発明の治療方法における配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸 配列を含むポリペプチド、およびそれらの類縁物、あるいはそれらをコードするポリヌ クレオチドの投与量や投与方法は上述のとおりである。本発明の方法により試料され うる疾病も上述のとおりである。また、本発明の方法において、細胞増殖阻害剤およ び抗癌剤などの他の有効成分を併用してよい。さらに、薬物、放射線または免疫療 法などの他の治療方法を本発明の治療方法と併用してもよい。
[0037] 本発明は、さらにもう 1つの態様において、血管新生および腫瘍血管新生ならびに 癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を阻害する薬剤の製造のための配 列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはそれらの類 縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用にも関する。上記薬剤を製 造するにあたり、細胞増殖阻害剤または抗癌剤などの他の薬剤を併用してもよい。 実施例 1
[0038] 本 S月のペプチド、 用いた 細q 5fe阳. 験
ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞 (HUVEC)を用い、 FGF-2又は VEGF刺激によって 誘導される血管内皮細胞の管腔形成にお!、て、 AMAPlZcortactin複合体形成を阻 害する、 C末端に FITCが付加されている配列番号 3のポリペプチド (以下、「P4-TAT -FITCjと称す)による阻害効果の検討を行った。
[0039] 0.3%タイプ Iコラーゲン、 5倍濃度の濃縮培地、再構成用緩衝液 (0.05N水酸ィ匕ナトリ ゥム溶液 100mlに対し、重炭酸ナトリウム 2.2g、 HEPES4.77gを溶かし、濾過滅菌したも の）を、冷却しながら 7 : 2 : 1の割合で混合する。コラーゲン混合液を培養皿に分注し、 37°C 30分静置させることでゲル化させる。ゲル化したコラーゲン上に HUVEC細胞を 撒き、一晩培養した後、コラーゲンを重層する。 FGF-2又は VEGFを含む培地に、 P4- TAT-FITCペプチド、又はコントロールとして配列番号 1を無作為に並べ替えたぺプ チドに配列番号 2及び FITCを付カ卩した scramble-TAT-FITCペプチドを、重層したコ ラーゲン上に添加し、 3日間 37°Cで培養することで、血管内皮細胞の管腔形成阻害 効果を検討した。
[0040] その結果、図 1に示すように、 P4-TAT- FITCペプチドは、血管内皮細胞の管腔形 成を阻害することが確認された。
実施例 2
[0041] マウス個体を用いた in vivo血管新生阻害試験
P4-TAT-FITCペプチドの in vivoでの血管新生抑制作用を調べるために、 FGF-2ま たは VEGFを加えたマトリジエルをマウスの皮下に移植し、マトリジエルに侵入した新 生血管を血管内皮細胞のマーカーを用い染色し、蛍光強度を測定することで阻害作 用を検討した。
[0042] マトリジエルに、 FGF- 2または VEGF、及び P4- TAT- FITCペプチド又はコントロール として前述の scramble- TAT-FITCペプチドを添カ卩し、直径 0.15cm、長さ lcmのチュー ブ（angioreactor; CULTREX)に注入し、 37°C1時間静置してゲル化させた後、マウス の皮下に移植した。 9日間飼育した後、マトリジエルに侵入した新生血管をマトリジェ ルと共に取り出し、プロテアーゼを含む溶液でマトリジエルを分解し、血管内皮細胞を 回収した。回収した血管内皮細胞を、そのマーカーであるピオチンを付加したレクチ ンと反応させ、さらに反応したレクチンを色素が付加されたアビジンと反応させ、その 蛍光強度を測定することにより血管新生を測定した。
[0043] 結果を図 2、 3に示す。 P4- TAT-FITCペプチドを加えた場合、 in vivoにおける血管 新生が大幅に低下した。
実施例 3
[0044] マウス 本を用いた 11重 亲斤牛皿 験
腫瘍細胞によって誘導される血管新生を P4-TAT-FITCペプチドが抑制するかを調 ベるために、乳癌細胞 MDA- MB-231を混入したマトリジエルをマウスの皮下に移植し 、マトリジエルに侵入した新生血管を血管内皮細胞のマーカーを用い染色し、蛍光 強度を測定することで阻害作用を検討した。
[0045] マトリジエルに、 MDA- MB- 231細胞及び P4-TAT-FITCペプチド又はコントロールと して前述の scramble- TAT-FITCペプチドを添カ卩し、直径 0.15cm、長さ lcmのチュー ブ（angioreactor; CULTREX)に注入し、 37°C1時間静置してゲル化させた後、マウス の皮下に移植した。 9日間飼育した後、マトリジエルに侵入した新生血管をマトリジェ ルと共に取り出し、プロテアーゼを含む溶液でマトリジエルを分解し、血管内皮細胞を 回収した。回収した血管内皮細胞を、そのマーカーであるピオチンを付加したレクチ ンと反応させ、さらに反応したレクチンを色素が付加されたアビジンと反応させ、その 蛍光強度を測定することにより血管新生を測定した。
[0046] 結果を図 4に示す。 P4-TAT-FITCペプチドをカ卩えた場合、腫瘍血管新生が大幅に 低下している。 実施例 4
[0047] ヒト血管内皮細胞牛.存活件の測定
ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞 (HUVEC)を 1 X 105 cells/mlに調整し、 96穴プレー トに 100 1ずつ分注した。 37°Cで 6時間培養後、増殖因子を含まない培地に変え、一 晚培養した後、 FGF-2又は VEGFと、 P4-TAT-FITCペプチド又はコントロールとして 前述の scramble-TAT-FITCペプチドを添カ卩し、 3日間培養した。細胞の生存活性を MTSアツセィキット（3— (4,5— dimethylthiazoト 2— yl)— 5— (3— carboxyphenyl)— 2— (4— sulfoph enyl)- 2H- tetrazolium assay kit) (プロメガ社製）により評価した。結果を図 5に示す。 縦軸は未処理の細胞の示す MTS活性を 100とした時の、各々の処理細胞の相対的 活性を示す。
[0048] P4-TAT-FITCペプチドは、細胞毒性に影響を与えないことが確認された。
実施例 5
[0049] P4-TAT-FITCペプチドによる癌細胞の mesenchvmal型と amoeboid型浸潤活性阻害 試験
(1)癌細胞の mesenchymal型浸潤活性の抑制
ヒト繊維肉腫細胞 HT1080のコラーゲン上での mesenchymal型浸潤における P4-TAT- FITCによる阻害効果の検討を行った。タイプ Iコラーゲンに 10倍濃度の濃縮培地と 0. IN NaOHを 10分の 1ずつ加えた混合液を、トランスゥエルの上層のチャンバ一に分注 し、 37°C 60分間静置させることでゲル化させた。ゲル化したコラーゲン上に P4- TAT- FITCペプチド、又はコントロールとして scramble- TAT-FITCペプチドをカ卩えた 0.2% 血清含有培地で浮遊させた細胞を撒き、下のチャンバ一に 10%血清含有培地をカロ え、 3日間 37°Cで培養する。コラーゲン中に浸潤した細胞を生細胞染色試薬 (Calcein -AM)で染色し、蛍光顕微鏡にてコラーゲンの上から下へ 20 mずつ写真を撮り、上 部から 300 mより下に浸潤した細胞の割合を評価した。同時に、細胞の生存活性を MTSアツセィキット（3— (4,5— dimethylthiazoト 2— yl)— 5— (3— carboxyphenyl)— 2— (4— sulfoph enyl)- 2H- tetrazolium assay kit) (プロメガ社製）により評価した。
[0050] 結果を図 6、 8に示す。縦軸は未処理の細胞の示す浸潤活性あるいは MTS活性を 1 00とした時の、各々の処理細胞の相対的浸潤活性を示す。 P4-TAT-FITCペプチド は、細胞毒性に影響を与えず、癌細胞の mesenchymal型浸潤活性が大幅に減少した
[0051] (2)癌細胞の amoeboid型浸潤活性の抑制
ヒト繊維肉腫細胞 HT1080のコラーゲン上での amoeboid型浸潤における P4- TAT- FIT Cによる阻害効果の検討を行った。 HT1080細胞に蛋白質分解酵素阻害剤の混合溶 液を加えると、 ( 1)の mesenchymal型とは形態が異なった蛋白質分解非依存的な浸 潤を示すことが知られている。（1)と同様の方法で、タイプ Iコラーゲンをゲルイ匕させ、 ゲルイ匕したコラーゲン上に、蛋白質分解酵素阻害剤の混合溶液 (50 M GM6001 ( カルビオケム社製）、 250 M E64 (シグマ社製）、 100 M PepstatinA (シグマ社製）、 2 μ Leupeptin (シグマ社製）、 2.2 M Aprotinin (シグマ社製） )、 P4— TAT— FITCぺ プチド、又はコントロールとして scramble-TAT- FITCペプチドを加えた 0.2%血清含有 培地で浮遊させた細胞を撒き、（1)と同様の方法で、浸潤した細胞の割合を評価した 。結果を図 7、 8に示す。 P4-TAT-FITCペプチドは、細胞毒性に影響を与えず、癌細 胞の amoeboid型浸潤活性が大幅に減少した。
産業上の利用可能性
[0052] 本発明は、医薬品の分野、特に、血管新生を阻害することが有益な疾患ならびに 癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型の浸潤を阻害することが有益な疾患の治 療および Zまたは予防用の医薬品の分野において利用可能である。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類 縁物を有効成分として含む、血管新生を阻害する薬剤。
[2] 配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを有効成分として含む、請求項 1記 載の血管新生を阻害する薬剤。
[3] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類 縁物をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、血管新生を阻害する薬剤。
[4] 配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効 成分として含む、請求項 3記載の血管新生を阻害する薬剤。
[5] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類 縁物を有効成分として含む、癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を阻害 する薬剤。
[6] 配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを有効成分として含む、請求項 5記 載の癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を阻害する薬剤。
[7] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類 縁物をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、癌細胞の mesenchymal型お よび amoeboid型浸潤を阻害する薬剤。
[8] 配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効 成分として含む、請求項 7記載の癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸潤を 阻害する薬剤。
[9] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはその類 縁物をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、腫瘍血管新生を阻害する 薬剤。
[10] 配列番号： 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効 成分として含む、請求項 9記載の腫瘍血管新生を阻害する薬剤。
[I I] 配列番号： 1または配列番号： 3のアミノ酸配列を含むペプチドあるいはその構造類 縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを特徴とす る、患者における血管新生、腫瘍血管新生、ならびに mesenchymal型および amoeboi d型の癌浸潤と転移を阻害する方法。
血管新生、腫瘍血管新生、ならびに癌細胞の mesenchymal型および amoeboid型浸 潤を阻害する薬剤の製造のための配列番号： 1または配列番号: 3のアミノ酸配列を 含むペプチドあるいはその構造類縁物、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチド の使用。
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