CN107446024B - 一种可拮抗ddx3蛋白rna结合活性的多肽dip-13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

Description

一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽DIP-13及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，随着工业化的进程，肿瘤的发病率逐年攀升。根据国际癌症研究中心(IARC)报告：未来几十年内，癌症发病人数仍将快速增长，预计2030年全球将有2136万癌症新发病例，死亡病例将达1315万，肿瘤治疗的需求将持续快速增长。传统手术、化疗、放疗是治疗肿瘤的主要手段，然而这些方法在治疗的同时，往往会带来很多副作用，给肿瘤患者及其家庭带来了极大的痛苦。因此，疗效显著、副作用少、特异性高的肿瘤靶向性治疗成为了目前研究的热点。

肿瘤靶向治疗是指针对已明确的致癌位点(蛋白或DNA)，设计相应的靶向治疗药物，因其特异性高、副作用少，可显著降低肿瘤病人痛苦，在肿瘤治疗方面具有非常重要的应用前景。分子靶向治疗又被称为“生物导弹”，药物通过特异性地识别致癌位点来发挥作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而对正常组织细胞几乎没有损伤。要满足这种要求，靶向药物成分的选择成为了关键，而多肽具有血浆清除速度快、亲和力高、组织细胞穿透性强、易于摄取、免疫原性低等特点，非常适合靶向药物的开发。

DDX3蛋白由DDX3基因编码，属于DEAD-BOX蛋白家族，在进化过程中高度保守，是一种ATP依赖的RNA解旋酶，几乎参与了RNA在细胞内的所有生物代谢过程，包括前体mRNA的剪切和拼接、mRNA的转运、核糖体的组装以及mRNA的翻译等过程。近年来，大量研究表明：DEAD-BOX蛋白家族在肿瘤的发生、发展过程中发挥着非常重要的作用，而DDX3作为DEAD-BOX蛋白家族中至关重要的成员，逐渐成为了研究热点。临床研究发现，DDX3在包括胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中异常高表达，大数据生存分析显示：高表达DDX3患者的预后普遍较低表达DDX3患者的预后差。鉴于DDX3在研发肿瘤靶向治疗药物的巨大潜能，美国约翰霍普金斯大学医学院的研究团队在2016年研发出针对DDX3的抑制剂RK-33，这种化合物可竞争性结合DDX3的ATP结合功能区，并抑制其RNA结合能力，在肿瘤细胞和小鼠模型中均展现显著的抑癌功能；然而这种化合物由于缺乏特异性，无法满足肿瘤靶向治疗的需求。

因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。

发明内容

为解决以上问题，发明人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。

基于该研究，本发明提供了一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌基因DDX3与RNA的结合，并在细胞及动物水平表现出明显的肿瘤抑制作用。

本发明还提供了上述可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接DDX3的RNA结合活性肽段后，在细胞水平和动物水平均可观察到明显的肿瘤抑制效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

附图说明

图1为DIP-13竞争性拮抗DDX3蛋白与RNA相互作用原理的示意图；

图2为对照肽和DIP-13处理HeLa细胞48小时后的荧光显微镜照片；

图3为不同浓度的DIP-13或对照肽处理HeLa细胞24小时后的MTT比色统计图；

图4为20μmol/L的DIP-13或对照肽处理HeLa细胞24小时后的MTT比色统计图；

图5为平板克隆形成实验照片；

图6为根据图5计算的细胞克隆数的统计图；

图7为Transwell细胞侵袭实验照片；

图8为根据图7计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；

图9为小鼠体内实验中对照肽和DIP-13对肿瘤重量影响的统计图；

图10为小鼠体内实验中对照肽和DIP-13对肿瘤体积影响的统计图；

图11为对照肽和DIP-13对DDX3与RNA(HOTAIR)结合水平的影响的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.抗肿瘤多肽的合成

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQ ID NO:1所示，穿膜结构域序列如SEQ IDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-VLAPTRELAVQIK(SEQ ID NO:3)，命名为DIP-13。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC，N端连接生物素标记Biotin。

DIP-13竞争性拮抗DDX3蛋白与RNA相互作用的原理如图1所示。

2.DIP-13的细胞定位检测

取对数生长期的HeLa细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔10000个细胞种植于内置无菌爬片的24孔板内，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后加入20μmol/L的多肽，维持24小时和48小时。弃去上清，1×PBS洗两次后采用4％多聚甲醛固定，室温固定30分钟后弃甲醛，用1×PBS洗两次，然后采用DAPI染核，3-5分钟后再次用1×PBS洗两次，然后纯甘油制片，整个操作过程均要求严格避光；制片结束后在激光共聚焦显微镜下观察带有FITC荧光基团的多肽在细胞内的定位。实验结果如图2所示，DIP-13能够有效被细胞摄取，48小时后多肽积聚于肿瘤细胞的细胞核，呈现强胞核染色。

3.MTT比色法分析检测DIP-13对肿瘤细胞生长的抑制作用

采用人宫颈癌细胞HeLa细胞，进行MTT细胞活力比色实验。取对数生长期的HeLa细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔5000个细胞种植于96孔板内，每个样品设定10个复孔，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后分别加入不同浓度的多肽，该浓度梯度为0、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L及25μmol/L，维持24小时后收细胞；然后多肽以20μmol/L加入到培养基中，分别在0、24、48、72及96小时收获细胞。

到达标定时间后，弃去上清，每孔加入90μl DMEM培养基和10μl MTT溶液，置于37℃培养箱中反应4小时，反应结束后弃上清，用1×PBS洗两次，向样品孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，10分钟后用酶标仪检测490nm吸光度值。

结果如图3和4所示，与对照组多肽相比，DIP-13多肽处理的实验组肿瘤细胞的活力显著降低，并且该作用呈时间和剂量依赖性，说明该新型多肽可有效降低肿瘤细胞的细胞活力；当处理细胞时间相同时，多肽浓度为20-25μmol/L的细胞活力抑制率较高；当处理细胞浓度相同时，多肽处理时间为72小时的细胞活力抑制率较高。

4.平板克隆形成实验检测DIP-13对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用

取对数生长期的HeLa细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔1000个细胞种植于6孔板内，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后分别加入不同浓度的多肽，该浓度梯度为0μmol/L、10μmol/L及20μmol/L，培养10-14天待其形成细胞克隆集落后收集细胞。

实验结果如图5和6所示，与对照组多肽相比，DIP-13多肽处理的实验组肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低，并且该作用呈剂量依赖性，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。

5.Transwell实验检测DIP-13对肿瘤细胞迁移活性的影响

采用HeLa细胞进行多肽Transwell细胞侵袭实验。在24孔培养板中放置Transwell小室，向底层加入含15％胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，并向培养基中加入不同浓度的多肽。取对数期生长的HeLa细胞，用无血清培养基重悬，经过计数后按每孔10000个细胞均匀种植于Transwell小室内，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱中培养，24小时后取出小室放入4％多聚甲醛中常温固定15分钟，1×PBS洗两次，置于0.5％结晶紫染色液染色，1小时后染色结束，再用棉签轻轻擦去小室上层中未穿过多孔膜的细胞，在倒置显微镜下观察计数，比较差异。

结果如图7和8所示，与对照组多肽相比，DIP-13处理的实验组肿瘤细胞的迁移数目明显降低，说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的迁移能力。

6.裸鼠皮下成瘤治疗实验

采用人前列腺细胞PC-3细胞进行多肽裸鼠皮下成瘤治疗实验。收集大量对数期生长的PC-3细胞，用1×无菌PBS重悬细胞，细胞终浓度约为1000万/ml，采用BLAB/c裸鼠品系作为动物模型，选取4周龄、体重约15g的BLAB/c裸鼠，随机分为两组，每组5只，在其右上肢内侧皮下注射PC-3细胞悬液100μl，约3-5天后可在细胞注射处观察到小皮丘，直径约2mm。

一周后落实皮下瘤体直径约4mm，此时开始进行多肽干预治疗，两组裸鼠体重和瘤体大小在多肽干预之前无统计学差异，实验组多肽和对照组均以3mg/kg·体重在瘤体周围皮下注射，每周两次，一共4周，动态观察裸鼠皮下瘤体的体积大小。

结果如图9和10所示，与对照组多肽相比，DIP-13处理的实验组裸鼠中瘤体的体积和重量都明显减小，说明该新型多肽在动物水平亦可有效抑制肿瘤细胞的成瘤能力，具有显著的肿瘤抑制功能。

7.DIP-13抑制肿瘤的作用机制

RNA免疫共沉淀(RIP)实验检测DIP-13对DDX3结合RNA(本发明实施例以HOTAIR为例)的影响：DDX3蛋白几乎参与了RNA所有的代谢过程，现采用HOTAIR(Hox transcriptantisense intergenic RNA)进行RIP验证，检测该新型多肽对DDX3结合RNA能力的影响。

采用人宫颈癌细胞HeLa细胞进行RIP实验。将对数期生长的HeLa细胞种植于100mm培养皿内，37℃恒温培养箱中培养，待其密度为70％时按照20μmol/L的浓度加入多肽，24小时后收集细胞，用RIP Buffer裂解细胞，将细胞上清分装备用，取10％的细胞上清作为阳性对照组Input，剩下的分别用DDX3抗体和IgG抗体进行免疫共沉淀，最后收集样品用蛋白酶K处理后，利用酚-氯仿-异丙醇抽提的方法提取RNA，经过逆转录之后进行普通PCR和实时定量PCR实验检测不同处理组之间DDX3对RNA的富集水平差异。

结果如图11所示，与对照组多肽相比，DIP-13多肽可明显降低DDX3与RNA(HOXAIR)的结合水平，说明本发明实施例设计的多肽可显著拮抗DDX3结合RNA的能力，进而降低DDX3在细胞内结合、影响RNA的生物学活性的功能，发挥肿瘤抑制的功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽DIP-13及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Leu Ala Pro Thr

1 5 10 15

Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Lys

20

Claims (6)

1.一种可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的可拮抗DDX3蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗人宫颈癌和抗人前列腺癌药物中的应用。

3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3或4所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

6.权利要求3-5中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抗人宫颈癌和抗人前列腺癌药物中的应用。

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