CN114605499B - 一种可拮抗rbsm1蛋白rna结合活性的多肽rip-18及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽RIP‑18及其应用，属于分子生物技术领域，该多肽RIP‑18包括白血病肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，其中，白血病肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的抗白血病肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接抗白血病肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制白血病肿瘤细胞增殖、克隆形成的效应。本发明的抗白血病肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗白血病肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制白血病。

Description

一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽RIP-18及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽RIP-18及其应用。

背景技术

白血病是造血干细胞在骨髓中的克隆增殖，它是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性增殖的白血病细胞因为生长调节失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。白血病严重影响着人类的健康，目前已有的抗白血病方法虽有一定疗效，但仍存在疗效低、选择性差、毒副反应大、易产生耐药等问题。因此，寻找新型高效低毒的抗白血病药物一直是国内外医药研发的热点。

白血病靶向治疗是指在分子水平上，通过药物靶向作用于白血病细胞，使其特异性死亡，而不影响正常组织细胞。与传统细胞毒化疗不一样，白血病分子靶向治疗具有特异性抗肿瘤作用，且毒性明显减少。靶向治疗的发展使得人类对癌症的治疗更加精准。近十年来，抗肿瘤靶向药物的研发已经占到肿瘤药物研发中的3/4强，其中包括小分子抑制剂和单克隆抗体等。

靶向多肽由于易于合成、免疫原性低、活性高、不良反应轻和来源广泛等优点，已应用于抗肿瘤药物研究。抗瘤性多肽通过与特定位点的结合，发挥抑制肿瘤发生、发展的作用。因此，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，广泛参与调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。近年来，利用现代生物技术合成的多肽药物已成为药物研发的热点之一。

但是针对白血病的靶向多肽面临靶点寻找困难等问题，所以有必要积极研究针对白血病的靶向多肽的靶点，并给予相应的靶向多肽干预。

RBSM1(全称为RNA-binding motif,single-stranded-interacting protein 1)是一个多功能的RNA结合蛋白，主要定位于细胞核。RBSM1属于结合单链DNA/RNA的蛋白质小家族成员。这些蛋白质存在核糖核蛋白共有序列(RNP-CS)，即RNA结合蛋白中可见的保守基序RNP1和RNP2，并且是DNA/RNA结合所必需的。这些蛋白质与DNA复制、基因转录、细胞周期进程和细胞凋亡等多种功能有关。RBSM1可通过调控多种肿瘤靶细胞的生长分化相关信号通路，在细胞增殖、DNA修复和癌症进展中发挥多种功能。研究发现RBSM1在白血病中表达显著增加，促进白血病发展。已知RBSM1与多种肿瘤之间有着密切的联系，比如结直肠癌、胃癌、急性白血病、肺癌、淋巴瘤等，RBSM1在这些肿瘤的发生、发展中均起到促进作用。目前，RBSM1特异性抑制剂尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽RIP-18及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过设计靶向多肽，针对RBSM1的作用位点，从而阻断RBSM1的促癌效应，最终抑制肿瘤的发生发展；并且将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向白血病肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌基因RBSM1与RNA的结合，并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。

本发明还提供一种多肽在拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供一种多肽在制备抗白血病肿瘤药物中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供一种抗白血病肿瘤多肽，包括白血病肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，其中，所述白血病肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述穿膜结构域连接于所述白血病肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

本发明还提供一种如上所述的抗白血病肿瘤多肽在制备抗白血病肿瘤药物中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明设计的多肽，通过特异性、竞争性抑制RBSM1和RNA的结合，从而阻遏两者相互作用带来的生物学效应，发挥抑制白血病肿瘤的作用。此外，可在该多肽N端添加穿膜肽以提高其进入细胞的效率。加入生物素标记，使得其更方便的在细胞水平中进行应用，实验通过生物素富集相关的分子，从而进行下一步的机制研究。加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记使其可通过荧光共聚焦显微镜观察该多肽分子在细胞中的定位，明确其发挥作用的区域。

本发明的抗白血病多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接白血病细胞杀伤结构域后，有明显的抑制白血病细胞增殖、克隆形成的效应。本发明的抗白血病肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗白血病的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制白血病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RBSM1蛋白的结构域示意图；

图2为RIP-18竞争性拮抗RBSM1蛋白与RNA相互作用的原理示意图；

图3为RIP-18多肽被细胞摄取效率图；

图4为不同浓度RIP-18多肽对肿瘤细胞的增殖能力的影响；

图5为不同时间RIP-18多肽对肿瘤细胞的增殖能力的影响；

图6为RIP-18克隆形成实验的染色图；

图7为RIP-18克隆形成实验的结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1抗肿瘤多肽的合成

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列为LVKLCQPYGKIVSTKAIL(SEQ ID No.1)，穿膜结构域序列为YGRKKRRQRRR(SEQ ID No.2)，穿膜结构域连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-LVKLCQPYGKIVSTKAIL(SEQ ID No.3)，命名为RIP-18。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC，N端连接生物素标记Biotin。

生物公司合成的抑肿瘤多肽RIP-18经过高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography-HPLC)检测证实纯度达到96.1％。将多肽溶于无菌PBS缓冲液(Sigma-Aldrich公司)，储存浓度为1mmol/L，分装于1.5ml的避光EP管中，终浓度为200μmol/L，均避光冻存于-80℃备用。

RBSM1蛋白的结构域示意图如图1所示。

RIP-18竞争性拮抗RBSM1蛋白与RNA相互作用的原理如图2所示。

实施例2RIP-18的细胞定位检测

采用RIP-18多肽穿膜及细胞定位实验，采用人白血病细胞系Kasumi-1(中国典型培养物保藏中心)进行检测。将对数期生长的悬浮细胞种植在24孔板中，每孔约15000个细胞。以10％胎牛血清(HyClone公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)培养，并加入30μM的多肽RIP-18，维持48小时。以与该多肽相同组成的氨基酸随机重新排列后的错序肽作为对照肽。分别吸取各孔内细胞悬液，调整离心机(Fresco21,ThermoFisher公司)转速1000转/min离心5min，1x PBS 5ml清洗后加入4％多聚甲醛(Sigma-Aidrich公司)500μl，室温固定细胞20分钟，弃去多聚甲醛，1x PBS清洗两次，每次5分钟。加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma-Aidrich公司)溶液300μl，室温染细胞核5分钟，1x PBS充分洗涤5次，每次5分钟。取干的干净载玻片，将细胞沉淀滴片。其中滴片的细胞悬液量每张载玻片1～2滴，每滴20～30ul。将盖玻片固定于载玻片上。采用激光共聚焦显微镜(A1,Nikon公司)检测带有荧光基团的多肽在细胞内的定位，拍照并保存。以上实验结果在相同条件下重复三次。

结果如图3所示：由于多肽3'-端带有FITC基团，可以此观察多肽进入细胞的情况，发现在加入多肽48小时后，该多肽被细胞摄取率达89.5％，此外我们利用DAPI染色观察细胞核，从而客观简明区分细胞核与细胞浆，更清晰的观察多肽进入细胞的情况，发现该多肽RIP-18定位于细胞核内，与RBSM1分子的定位相同。可见，该多肽能高效进入细胞，并定位于RBSM1相同的细胞核内。

实施例3MTT比色法分析检测RIP-18对白血病细胞生长的抑制作用

采用MTT法检测该多肽对肿瘤细胞的增殖活性影响。采用人白血病细胞系Kasumi-1进行检测。以与该多肽相同组成的氨基酸随机重新排列后的错序肽作为对照肽。在96孔细胞培养板中，每孔种植5000个细胞培养，每个样品设定10个复孔。24小时后，加入多肽。多肽及其对照多肽浓度分别为10μM、15μM、20μM、30μM；作用时间分别为为24小时、48小时、72小时。到达标定时间之后，96孔板离心机(Eppendorf公司)离心后，吸弃培养上清，用1×PBS清洗样品孔3次，每次5分钟。再向样品孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO,Sigma-Aldrich公司)溶液。将培养板静置于37℃，10分钟。取出后轻轻混匀孔内样品。用酶标仪检测570nm吸光度。收集数据，计算并统计。以上实验在相同条件下重复三次。进行MTT实验后的计算公式：lgIC50＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)，其中，Xm＝lg最大剂量，I＝lg(最大剂量/相临剂量)，P＝阳性反应率之和，Pm＝最大阳性反应率，Pn＝最小阳性反应率。由此计算得到该多肽RIP-18的IC50为25μmol/L。

以上述实验得到的IC50为基础，进一步进行MTT实验，在不同时间、多肽浓度的情况下检测该多肽对肿瘤细胞(本实验中利用的Kasumi-1细胞)的增殖能力的影响。

结果如图4和5所示，与对照组多肽相比，RIP-18多肽处理的肿瘤细胞的活力显著降低，且该作用呈时间和剂量依赖性，说明该新型多肽可有效降低肿瘤细胞的细胞活力；当处理细胞时间相同时，多肽浓度为20-30μmol/L的细胞活力抑制率较高；当处理细胞浓度相同时，多肽处理时间为48-72小时的细胞活力抑制率较高。

实施例4克隆形成实验检测RIP-18对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用

采用软琼脂克隆形成实验检测RIP-18多肽对肿瘤细胞克隆形成能力的抑制作用。收集对数生长期的Kasumi-1细胞进行活细胞计数，然后调整细胞浓度，用含20％胎牛血清(FBS,HyClone公司)的DMEM(Gibco公司)制成1000活细胞/ml的细胞悬液。用蒸馏水分别制备1.2％、0.7％两个浓度的低熔点琼脂糖(Sigma-Aldrich公司)，高压灭菌后，维持在40℃不会凝固状态。将1.2％琼脂糖和2xDMEM等体积混合，在6孔板中加入1.4ml并在常温下凝固作为底层琼脂，置细胞培养温箱中备用。将0.7％琼脂糖和2xDMEM等体积混合，再加入含有RIP-18多肽和对照肽的细胞悬液充分混匀，常温下凝固作为上层琼脂，注意不要有气泡。将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。然后移培养6孔板于CO2培养箱中37℃进行培养。培养7～10天，不断观察细胞的生长情况。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。使用倒置显微镜(IX73,Olympus公司)拍摄染色的克隆，并使用Image J软件(National Institutes of Health,NIH)自动计数。结果判定：以肉眼可见的细胞团作为计数集落的标准。集落的计数和计算：集落数＝n孔中细胞集落数总和/n孔。以上实验在相同条件下重复三次。

实验结果如图6和7所示，与对照组多肽相比，RIP-18多肽处理的肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低，并且该作用呈剂量依赖性，说明该新型多肽可有效抑制白血病细胞的增殖能力。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽RIP-18及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Val Lys Leu Cys Gln Pro Tyr Gly Lys Ile Val Ser Thr Lys Ala

1 5 10 15

Ile Leu

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Val Lys Leu Cys

1 5 10 15

Gln Pro Tyr Gly Lys Ile Val Ser Thr Lys Ala Ile Leu

20 25

Claims (6)

1.一种可拮抗RBSM1蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种多肽在制备抗白血病肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种抗白血病肿瘤多肽，其特征在于，包括白血病肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，其中，所述白血病肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求3所述的抗白血病肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求3或4所述的抗白血病肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域连接于所述白血病肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

6.一种权利要求3-5任一项所述的抗白血病肿瘤多肽在制备抗白血病肿瘤药物中的应用。

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