WO2020147176A1 - 一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽 - Google Patents

一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽 Download PDF

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钟安
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Definitions

  • AML acute myeloid leukemia cell line
  • T-All acute T lymphocytic leukemia cell line
  • GAS2 is abnormally highly expressed in a variety of malignant hematological tumors and colon cancer, and it can effectively inhibit the proliferation of colon cancer cells and BCR-ABL+ hematopoietic cells. This indicates that GAS2 can promote /Maintain the function of tumor cell proliferation.
  • GAS2 mainly binds to Calpain2 (calpain) through its N-terminal, and the C-terminal exercises the function of inhibiting the activity of Calpain2 (calpain) to promote tumor cell proliferation.
  • GAS2 growth-arrest-specific 2
  • GAS2 growth-arrest-specific 2
  • CD34+ cells that maintain CML
  • targeting GAS2 may improve the treatment of multiple types of leukemia. It may also help eliminate leukemia stem/progenitor cells.
  • the results have been published (Zhou X, PloS One, 2014; 9: e86195; Sun L, Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2015; 47: 795.).
  • RNA interference and expression of GAS2DN can enhance the IM sensitivity of CML cell line K562, suggesting that targeting GAS2 may enhance the chemotherapy sensitivity of leukemia cells.
  • the present invention develops a key peptide in GAS2DN that specifically binds to Calpain2 (calpain), determines the sequence of a small GAS2-like peptide, and provides a peptide that has the effect of inhibiting the proliferation of leukemia cells, so that it has the GAS2DN protein Inhibition function, acting as a GAS2 inhibitor, enabling leukemia patients to obtain therapeutic effects.
  • Calpain Calpain2
  • polypeptide with the effect of inhibiting the proliferation of leukemia cells is composed of 37 amino acids, and the amino acid sequence is:
  • the N-terminus of the polypeptide is connected with myristic acid, enters leukemia cells through myristic acid modification, inhibits the proliferation of white blood cells, and is used for preparing a medicine for treating leukemia.
  • step f To the reaction column that has completed step f), add an appropriate amount of methanol, dry by nitrogen agitation, then add an appropriate amount of DCM, and dry by nitrogen agitation to obtain the synthetic peptide resin, which is placed in a suitable vessel and placed in a vacuum dryer for vacuum drying ;
  • the deprotection solution is made up of 20% hexahydropyridine and 80% DMF.
  • the protected amino acid is a protected amino acid in the form of Fmoc-Aa-oh, and the amino acid mixed solution is made by dissolving the protected amino acid in DMF.
  • the A solution of the Kaiser test reagent is 80% phenol and 20% absolute ethanol
  • the B solution is redistilled pyridine
  • the C solution is 5 grams of ninhydrin and 100 ml of absolute ethanol.
  • Liquid B 0.1% Trifluoroacetic in 100% Water
  • step c) Under preparation conditions, balance the instrument for about 6 minutes and then stop all pumps, and inject the filtrate filtered in step a) with the injection valve. First perform a 30-90% gradient for 20 minutes, and then perform 100-0% Gradient, collect fractions;
  • new targeted therapeutic drugs for the treatment of leukemia can be developed, providing a brand-new treatment method and reducing side effects , To alleviate the suffering of patients, improve the cure rate and survival rate of leukemia.
  • leukemia subtypes such as acute T lymphocytic leukemia cell line (T-All) and acute myeloid leukemia cell line (AML)
  • T-All acute T lymphocytic leukemia cell line
  • AML acute myeloid leukemia cell line
  • the polypeptide of the present invention can Effectively inhibit the above two kinds of leukemia cells, suggesting that the development of new targeted therapy drugs for leukemia with this polypeptide as the core component may fill the gap in targeted therapy drugs in the field of leukemia treatment; (3) research has found RNA interference And expression of GAS2DN can enhance the IM sensitivity of CML cell line K562, suggesting that targeting GAS2 may enhance the chemotherapy sensitivity of leukemia cells. Therefore, a new type of targeted therapy for leukemia developed with this polypeptide as the core component can be used in combination with chemotherapy drugs to enhance the efficacy.
  • the purpose of the present invention is to develop key polypeptides in GAS2DN, determine the sequence of small GAS2-like peptides, and provide a polypeptide with the effect of inhibiting the proliferation of leukemia cells, so that it has the inhibitory function of GAS2DN protein, and acts as a GAS2 inhibitor to enable leukemia patients to obtain therapeutic effects .
  • polypeptide of the present invention consists of 37 amino acids, and the amino acid sequence of the polypeptide is:
  • the N-terminus of the polypeptide is modified with myristic acid, and the polypeptide can enter cells through the myristic acid modification to exert its inhibitory function and inhibit the proliferation of leukemia cells.
  • Protected amino acids various amino acids contained in the polypeptide are made into protected amino acids in the form of Fmoc-Aa-oh.
  • Condensing agent and organic base HBTU, NMM.
  • Solvents DMF, DCM, methanol, hexahydropyridine.
  • Liquid A 80% phenol + 20% absolute ethanol
  • Liquid B redistilled pyridine
  • Resin swelling Pour Fmoc-Asn(trt)wang Resin resin into the glass reaction column, add DCM and soak for 30 minutes, and drain it.
  • Deprotection Add an appropriate amount of deprotection solution to the glass reaction column, stir and agitate with nitrogen for 30 minutes, and drain.
  • Deprotection washing Add appropriate amount of DMF to the glass reaction column, agitate with nitrogen for 2 minutes, drain, and repeat the operation 6 times.
  • Feeding Add 3 times the molar amount of the amino acid mixed solution of the resin or weigh the same amount of the protected amino acid and 2.85 times the molar amount of HBTU into the glass reaction column, then add 6 times the molar amount of NMM of the resin, stir and agitate with nitrogen for 30 minutes .
  • washing after the reaction Drain the solution in the glass reaction column, add an appropriate amount of DMF for washing, agitate with nitrogen for 2 minutes, drain, and repeat the operation 3 times to obtain particulate matter.
  • Detection Take an appropriate amount (10-20 pellets) of granular substance in a small test tube, add two drops each of A, B, and C solutions. Put it in a dry heater and heat for 3 minutes (110 degrees Celsius).
  • K562 cells are incubated with polypeptide for 38h/24+38h
  • the leukemia subtypes represented by the above three leukemia cells have covered more than 70% of the number of leukemia patients.
  • the polypeptide can significantly inhibit the proliferation of a variety of leukemia cells, and is related to the dose and number of doses. There is a positive correlation. At the same time, it has no inhibitory effect on normal cell proliferation.

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Abstract

本发明公开一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，具体涉及一种多肽在治疗白血病药物中的应用，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn，所述多肽的N端与肉豆蔻酸连接，本发明制备的多肽，通过与肉豆蔻酸连接，可以进入白血病细胞，达到抑制白血病细胞的增殖的效果。

Description

一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽 技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种多肽在治疗白血病药物中的应用。
背景技术
白血病是一种造血干细胞恶性肿瘤。临床上按照其发病的缓急和病变细胞将其分类，由于白血病发病分型和预后分层较为复杂，因此需制定综合性的治疗方案，近年来随着医疗技术的发展，相当多的患者可以得到治愈，但是仍有一部分人不能得到治疗或者是由于对治疗药物产生耐药性、治疗的副作用和预后而受病痛，化疗药物除能治愈个别类型的白血病，其他类型白血病的治疗仍面临诸多困扰。如急性髓细胞白血病细胞系(AML)和急性T淋巴细胞白血病细胞系(T-All)，目前无相应的靶向药物，化疗效果也非常不理想，因此寻找新的治疗手段刻不容缓。
Schneider用血清饥饿的方法处理NIH-3T3(小鼠成纤维细胞)鉴定出一组特异性高表达的基因，并称之为Growth-arrest Specific Genes(生长特异抑制性基因)，GAS2是其中的一员。
有文献报道，GAS2在多种恶性血液肿瘤和结肠癌中表现为异常性高表达，并且在结肠癌细胞和BCR-ABL+造血细胞中打靶，均能有效抑制其增殖的作用，这表明GAS2具有促进/维持肿瘤细胞增值的功能。GAS2主要通过其N-端与Calpain2(钙蛋白酶)结合，C-端行使抑制Calpain2(钙蛋白酶)的活性的功能从而促进肿瘤细胞的增殖。
GAS2的截短型突变体GAS2Δ171-313也可通过N-端与Calpain2(钙蛋白酶)结合，但却因为C端缺失，没有抑制Calpain2(钙蛋白酶)的活性的功能，因此是GAS2的显性负性突变体(GAS2DN)。但由于Calpain2存在于细胞内，外源性GAS2DN无法穿透细胞膜进入细胞内与Calpain2(钙蛋白酶)结合。
多项研究表明GAS2(growth-arrest-specific 2)在多种白血病中的异常高表达，也发现GAS2是维持CML的CD34+细胞的新调控因子，提示靶向GAS2可能改善多种类型白血病的治疗，也可能帮助清除白血病干/祖细胞。结果已发表(Zhou X,PloS One,2014；9:e86195；Sun L,Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015；47:795.)。
研究还发现RNA干扰及表达GAS2DN都能增强CML细胞株K562的IM敏感性，提示 靶向GAS2可能增强白血病细胞的化疗敏感性。
发明内容
为解决上述问题，本发明研发GAS2DN中起到与Calpain2(钙蛋白酶)特异性结合作用的关键多肽，确定类GAS2小肽序列，提供一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，使其具有GAS2DN蛋白抑制功能，充当GAS2抑制剂使白血病患者获得治疗效果。
一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：
Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn。
所述多肽的N端与肉豆蔻酸连接，通过肉豆蔻酸修饰进入白血病细胞，抑制白细胞的增殖，用于制备治疗白血病的药物。
.所述多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)多肽的合成
a.将Fmoc-Asn(trt)wang Resin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡，抽干；
b.加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动抽干；
c.向玻璃反应柱中加入适量DMF，通氮气搅拌鼓动抽干；
d.将氨基酸混合溶液或保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入NMM，通氮气搅拌鼓动抽干；
e.加入适量DMF洗涤，氮气搅拌鼓动抽干，得到颗粒状物质；
f.取适量颗粒状物质于小试管中，加入Kaiser test试剂的A、B、C液各两滴，放入干式加热器中，加热，若溶液颜色微黄，颗粒状物质无色透明则为反应完全，重复上述步骤b-e,连接下一个氨基酸，直到连完最后一个氨基酸及肉豆蔻酸；
g.向完成步骤f)的反应柱中，加入适量甲醇，氮气鼓动抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动抽干，得到合成的多肽树脂，装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥；
2)多肽的切割
向多肽树脂中，加入多肽切割液，放置于恒温环境下振荡；之后进行过滤，在滤液 加入无水乙醚，搅拌后析出白色固体；向白色固体中加入无水乙醚，离心洗涤，真空干燥后得到的白色粉末，即为多肽的粗品；
3)多肽的纯化
取适量多肽的粗品，加入纯水和ACN超声溶解，滤膜过滤后取滤液；用高效液相色谱仪进行正向色谱柱进行梯度检测分析；制备色谱柱吸附和洗脱收集馏分；将收集的馏分进行检测，纯度合格后进行冷冻干燥，得到纯化后的多肽。
进一步的，所述脱保护溶液由20％的六氢吡啶和80％的DMF配置而成。
进一步的，所述保护氨基酸为Fmoc-Aa-oh形式的保护氨基酸，所述氨基酸混合溶液由保护氨基酸溶于DMF制成。
进一步的，所述Kaiser test试剂的A液为80％的苯酚和20％的无水乙醇，B液为重蒸吡啶，C液为5克茚三酮和100ML无水乙醇。
进一步的，所述多肽切割液的组成成分为：87.5％TFA，5％苯甲硫醚，2.5％苯酚，2.5％EDT和2.5％H2O。
进一步的，所述3)多肽的纯化步骤如下：
制备条件：
波长：220nm
流速：0.5-1.5ml/min
制备柱：Gemini-NX 5μ C18 110A,4.6*250mm
流动相：A液：0.1％Trifluoroacetic in 100％Acetonitrile
B液:0.1％Trifluoroacetic in 100％Water
a)称量适量多肽的粗品于烧杯中，加入纯水和ACN超声溶解，待完全溶解后用0.45μ的滤膜过滤；
b)取少量多肽的粗品于离心管中用纯水超声溶解至澄清过滤，用梯度10-100％检测分析；
c)在制备条件下，平衡仪器约6分钟后停所有泵，将a)步骤中过滤后的滤液用进样阀进样，先执行30-90％的梯度20min，再执行100-0％的梯度，收集馏分；
d)将收集的馏分进行检测，纯度合格的进行冷冻干燥，得到纯化后的多肽。
有益效果：(1)本发明制备的多肽，具有抑制具有GAS2DN蛋白抑制功能，能够起到GAS2抑制作用，从而起到抑制白血病细胞的增殖的作用，但因GAS2DN无法穿透细胞膜进入细胞，即使有抑制白血病细胞的增殖的功能，也达不到抑制白血病细胞的增殖的 效果，而本发明制备的多肽，通过与肉豆蔻酸连接，可以进入白血病细胞，达到抑制白血病细胞的增殖的效果；(2)本发明制备的多肽具有抑制白血病细胞增殖的作用，同时对正常细胞没有抑制作用，以该多肽为核心成分可研发出治疗白血病的新型靶向治疗药物，提供一种全新的治疗方式，减少副作用，减轻病人的痛苦，提高白血病的治愈率和生存率。尤其对于某些白血病亚型，如急性T淋巴细胞白血病细胞系(T-All)和急性髓细胞白血病细胞系(AML)，目前化疗效果不佳，也没有适用的靶向药物，本发明多肽可以有效的抑制上述两种白血病细胞，提示如以该多肽为核心成分研发出治疗白血病的新型靶向治疗药物，有可能填补在这些白血病治疗领域靶向治疗药物的空白；(3)研究发现RNA干扰及表达GAS2DN都能增强CML细胞株K562的IM敏感性，提示靶向GAS2可能增强白血病细胞的化疗敏感性。因此以该多肽为核心成分研发出的治疗白血病的新型靶向治疗药物，可以与化疗药物联合使用，增强疗效。
具体实施方式
本发明的目的在于研发GAS2DN中的关键多肽，确定类GAS2小肽序列，提供一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，使其具有GAS2DN蛋白的抑制功能，充当GAS2抑制剂使白血病患者获得治疗效果。
本发明的多肽由37个氨基酸组成，所述多肽的氨基酸序列为：
Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn。
所述多肽的N端用肉豆蔻酸修饰，所述多肽通过肉豆蔻酸修饰可以进入细胞发挥其抑制功能，抑制白血病细胞增殖。
实施例1
多肽的制备方法：
原料及所需试剂的配置
保护氨基酸：将所述多肽中含有的各种氨基酸制成Fmoc-Aa-oh形式的保护氨基酸。
氨基酸混合溶液：称取上述各种保护氨基酸1mmol分别溶于63.4mlDMF溶液中，配制成0.3mmol/ml的氨基酸混合溶液，备用。
起始树脂：Fmoc-Asn(trt)wang Resin。
缩合剂及有机碱：HBTU，NMM。
溶剂：DMF，DCM，甲醇，六氢吡啶。
Kaiser test试剂的配制：
A液：80％的苯酚+20％的无水乙醇
B液：重蒸吡啶
C液：5克茚三酮+100ML无水乙醇
脱保护溶液的配制：
20％的六氢吡啶+80％的DMF
多肽切割液的配制：
87.5％TFA+5％苯甲硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O
1)多肽的合成
a.树脂溶胀：称Fmoc-Asn(trt)wang Resin树脂倒入玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干。
b.脱保护：向玻璃反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干。
c.脱保护洗涤：向玻璃反应柱中加入适量DMF，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次。
d.投料：将树脂3倍摩尔量的氨基酸混合溶液或称取同样量的保护氨基酸和2.85倍摩尔量的HBTU加入玻璃反应柱中，再加入树脂6倍摩尔量的NMM，氮气搅拌鼓动30分钟。
e.反应后洗涤：将玻璃反应柱中的溶液抽干，加入适量DMF洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次，得到颗粒状物质。
f.检测：取适量(10-20颗)颗粒状物质于小试管中，加入A，B，C液各两滴。放入干式加热器中，加热3分钟(110摄氏度)。
取出后若溶液显蓝色，颗粒状物质有杂色不透明，则反应没有完全，需要重新再反应一次；
若溶液颜色微黄，颗粒状物质无色透明则为反应完全，可以连接下一个氨基酸，具体步骤重复以上b-f这五个步骤，直到连完最后一个氨基酸。
h.合成完毕后的洗涤和干燥：在连完最后一个氨基酸及肉豆蔻酸并检测通过后，抽干，向玻璃反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后玻璃反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，得到多肽树脂，将该多肽树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割。
2)多肽的切割
切割：将上述干燥后的多肽树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量配好的多肽切割液(1g/10ml)，放置于恒温摇床中25℃恒温振荡2小时。
过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉未溶解的多肽树脂，然后将滤液倒入100ml的离心管内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品。
洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入无水乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次。
干燥：将上述洗涤5次的后的白色固体放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量，待纯化。
3)多肽的纯化
制备条件：
仪器：高效液相色谱仪，配紫外检测器
波长：220nm
流速：1.0ml/min
制备柱：Gemini-NX 5μ C18 110A,4.6*250mm
流动相：A液：0.1％Trifluoroacetic in 100％Acetonitrile
B液:0.1％Trifluoroacetic in 100％Water
Figure PCTCN2019077271-appb-000001
粗品分析：
取少量多肽的粗品于0.5ml离心管中用纯水超声溶解至澄清，过滤进样，用梯度10-100％分析。
分离纯化：
a)溶解
称量200mg多肽的粗品于10ml的烧杯中，加入7.5ml纯水和2.5mlACN超声溶解， 待完全溶解后用0.45μ的滤膜过滤。
b.制备
高效液相色谱仪以制备条件平衡仪器约6分钟后停所有泵，将a)步骤过滤后的滤液用进样阀进样，运行制备梯度，先执行30-90％的梯度20min，再执行100-0％的梯度，收集馏分。收集结束后，停泵。将收集的馏分在分析仪器上检验纯度，纯度合格的馏分进行冻干。
c.冷冻干燥
将收集的馏分用旋转蒸发仪将溶液中的有机溶剂旋蒸掉之后上冷冻干燥机冷冻干燥。
d.称量检测
冻干两天后开冷冻干燥机，取出称量重量装入精品管中，送QC检测，待检测合格入库。
实施例2
用实验数据证明本发明的多肽对白血病细胞增殖的抑制效果
所选择实验细胞为：
K562细胞，人慢性髓系白血病细胞系(CML)；
Jurkat细胞，急性T淋巴细胞白血病细胞系(T-All)；
Thp-1细胞，急性髓细胞白血病细胞系(AML)；
Baf-3细胞，正常的小鼠造血干细胞。
本实验分组为，正常对照组、多肽对照组和实验多肽组。
首先将本发明的多肽与5*10 3个白血病肿瘤细胞共同培养38h，通过检测细胞的增殖(CCK-8)以及细胞计数两种方法来检测细胞的增殖速度，从而来观察多肽对肿瘤细胞的抑制作用。
第二，将多肽与细胞共育24h后重新收集计数加药培养38h,再检测细胞的增殖(CCK-8)速率。
第三，我们用正常的小鼠造血细胞进行上述同样的实验，以观察多肽对正常细胞的影响。
每组包括空白一个(Control)、对照肽一个(C-p)、目标肽三个(P-t,结果取平均值)
(1)K562细胞与多肽共育38h/24+38h
第一次实验
表2.1.A K562细胞与10uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000002
表2.1.B K562细胞与10uM多肽共育24+38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000003
表2.1.C K562细胞与15uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000004
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
第二次实验
表2.1.D K562细胞与15uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000005
表2.1.E K562细胞与15uM多肽共育24+38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000006
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
(2)Jurkat细胞与多肽共育38h/24+38h
第一次实验
表2.2.A Jurkat细胞与10uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000007
表3.2.B Jurkat细胞与15uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000008
表2.2.C Jurkat细胞与15uM多肽共育24+38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000009
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
第二次实验
表2.2.D Jurkat细胞与15uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000010
表2.2.E Jurkat细胞与15uM多肽共育24+38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000011
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
(3)Thp-1细胞与多肽共育38h/24+38h
第一次实验
表2.3.A Thp-1细胞与10uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000012
表2.3.B Thp-1细胞与15uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000013
表2.3.C Thp-1细胞与15uM多肽共育24+38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000014
第二次实验
表2.3.D Thp-1细胞与15uM多肽共育38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000015
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
表2.3.E Thp-1细胞与15uM多肽共育24+38h(％)
Figure PCTCN2019077271-appb-000016
Figure PCTCN2019077271-appb-000017
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
(4)Baf-3细胞与多肽共育38h/24+38h
第一次实验
表2.4.A Baf-3细胞与10uM多肽共育38h
Figure PCTCN2019077271-appb-000018
表2.4.B Baf-3细胞与10uM多肽共育24+38h
Figure PCTCN2019077271-appb-000019
第二次实验
表2.4.C Baf-3细胞与15uM多肽共育38h
Figure PCTCN2019077271-appb-000020
表2.4.D Baf-3细胞与15uM多肽共育24+38h
Figure PCTCN2019077271-appb-000021
*与control相比，p<0.01，**与control相比，p<0.01
以上三种白血病细胞所代表的白血病亚型已涵盖白血病发病人数的约70％以上，通过以上实验，可以看出该多肽可以明显抑制多种白血病细胞的增殖，并且与给药剂量及给药次数呈正相关性。同时对于正常细胞增殖没有抑制作用。

Claims (10)

  1. 一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，其特征在于，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：
    Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn。
  2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，多肽的N端与肉豆蔻酸连接，通过肉豆蔻酸修饰进入白血病细胞。
  3. 一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    1)多肽的合成
    a.将Fmoc-Asn(trt)wang Resin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡，抽干；
    b.加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动抽干；
    c.向玻璃反应柱中加入适量DMF，通氮气搅拌鼓动抽干；
    d.将氨基酸混合溶液或保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入NMM，通氮气搅拌鼓动抽干；
    e.加入适量DMF洗涤，氮气搅拌鼓动抽干，得到颗粒状物质；
    f.取适量颗粒状物质于小试管中，加入Kaiser test试剂的A、B、C液各两滴，放入干式加热器中，加热，若溶液颜色微黄，颗粒状物质无色透明则为反应完全，重复上述步骤b-e,连接下一个氨基酸，直到连完最后一个氨基酸及肉豆蔻酸；
    g.向完成步骤f)的反应柱中，加入适量甲醇，氮气鼓动抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动抽干，得到合成的多肽树脂，装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥；
    2)多肽的切割
    向多肽树脂中，加入多肽切割液，放置于恒温环境下振荡；之后进行过滤，在滤液加入无水乙醚，搅拌后析出白色固体；向白色固体中加入无水乙醚，离心洗涤，真空干燥后得到的白色粉末，即为多肽的粗品；
    3)多肽的纯化
    取适量多肽的粗品，加入纯水和ACN超声溶解，滤膜过滤后取滤液；将滤液用高效液相色谱仪进行正向色谱柱进行梯度检测分析；制备色谱柱吸附和洗脱收集馏分；将收集的馏分进行检测，纯度合格的进行冷冻干燥，得到纯化后的多肽。
  4. 根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述脱保护溶液由20％的六氢吡啶和80％的DMF配置而成。
  5. 根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc-Aa-oh形式的保护氨基酸，所述氨基酸混合溶液由保护氨基酸溶于DMF制成。
  6. 根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述Kaiser test试剂的A液为80％的苯酚和20％的无水乙醇，B液为重蒸吡啶，C液为5克茚三酮和100ML无水乙醇。
  7. 根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽切割液的组成成分为：87.5％TFA，5％苯甲硫醚，2.5％苯酚，2.5％EDT和2.5％H2O。
  8. 根据权利要求3所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述3)多肽的纯化步骤如下：
    制备条件
    波长：220nm
    流速：1ml/min
    制备柱：Gemini-NX 5μC18 110A,4.6*250mm
    流动相：A液：0.1％Trifluoroacetic in 100％Acetonitrile
    B液:0.1％Trifluoroacetic in 100％Water
    a)称量适量多肽的粗品于烧杯中，加入纯水和ACN超声溶解，待完全溶解后用0.45μ的滤膜过滤；
    b)取少量多肽的粗品于离心管中用纯水超声溶解至澄清过滤，用梯度10-100％检测分析；
    c)在制备条件下，平衡仪器约6分钟后停所有泵，将a)步骤过滤后的滤液用进样阀进样，先执行30-90％的梯度20min，再执行100-0％的梯度，收集馏分；
    d)将收集的馏分进行检测，纯度合格的进行冷冻干燥，得到纯化后的多肽。
  9. 一种权利要求1或2所述的多肽用于抑制白血病细胞的增殖。
  10. 一种权利要求1或2所述的多肽用于制备治疗白血病的药物。
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