JP7103702B2 - 白血病細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、生化学におけるポリペプチド薬物の技術分野に属し、特に白血病治療薬におけるポリペプチドの応用に関する。
白血病は造血幹細胞の悪性腫瘍である。臨床的には、その発症の緩急と病変細胞によって分類され、白血病の発症の分類と予後の階層化が複雑であるため、包括的な治療計画を作成する必要がある。近年、医療技術の発展に伴い、かなり多くの患者が治癒されるが、依然として一部の人が治療を受けることができず、又は治療薬に対する耐性、治療の副作用及び予後により、痛みを受けている。化学療法薬は、ほんの一部のタイプの白血病を治癒することができるほか、他のタイプの白血病の治療は、依然として多くの問題に直面している。例えば、急性骨髄性白血病細胞株（ＡＭＬ）や急性Ｔリンパ球性白血病細胞株（Ｔ－Ａｌｌ）など、現在、対応する標的薬はなく、化学療法の効果も非常に不十分であるため、新しい治療法の発見が急務である。
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒは、ＮＩＨ－３Ｔ３（マウス線維芽細胞）を血清飢餓の方法で処理し、ＧＡＳ２がメンバであるＧｒｏｗｔｈ－ａｒｒｅｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅｓ（成長特異的抑制遺伝子）と呼ばれる特異的高発現遺伝子群を同定した。
ＧＡＳ２は、複数の悪性血液腫瘍及び結腸癌において異常に高発現を示し、結腸癌細胞及びＢＣＲ－ＡＢＬ＋造血細胞を標的とし、いずれもそれらの増殖を効果的に抑制する作用を有することが文献で報告され、ＧＡＳ２が腫瘍細胞の増殖を促進／維持する機能を有することが示されている。ＧＡＳ２は、主にそのＮ－末端を介してＣａｌｐａｉｎ２（カルパイン）に結合し、Ｃ－末端がＣａｌｐａｉｎ２（カルパイン）の活性を抑制する機能を行使することにより、腫瘍細胞の増殖が促進される。
ＧＡＳ２の短縮型変異体ＧＡＳ２Δ１７１－３１３は、Ｎ－末端を介してＣａｌｐａｉｎ２（カルパイン）に結合することもできるが、Ｃ末端が欠落しており、Ｃａｌｐａｉｎ２（カルパイン）の活性を抑制する機能がないため、ＧＡＳ２のドミナントネガティブ変異体（ＧＡＳ２ＤＮ）である。しかしながら、Ｃａｌｐａｉｎ２は細胞内に存在するため、外活性ＧＡＳ２ＤＮは、細胞膜を通過して細胞内に入り込み、Ｃａｌｐａｉｎ２（カルパイン）に結合することはできない。
複数の研究では、複数の白血病におけるＧＡＳ２（ｇｒｏｗｔｈ－ａｒｒｅｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ２）の異常高発現が示され、ＧＡＳ２がＣＭＬを維持するＣＤ３４＋細胞の新しい調節因子であることも発見され、ＧＡＳ２を標的にすることで複数のタイプの白血病の治療を改善する可能性があり、白血病の幹／前駆細胞の除去に役立つ可能性もあることが示唆されている。結果が発表されている（Ｚｈｏｕ Ｘ，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１４；９：ｅ８６１９５；Ｓｕｎ Ｌ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），２０１５；４７：７９５．）。
研究では、ＲＮＡ干渉及び発現ＧＡＳ２ＤＮがいずれもＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のＩＭ感受性を高め得ることがさらに発見され、ＧＡＳ２を標的とすることで白血病細胞の化学療法感受性を高める可能性があることが示唆されている。
上記課題を解決するために、本発明によれば、Ｃａｌｐａｉｎ２（カルパイン）に特異的に結合するＧＡＳ２ＤＮにおける重要なポリペプチドを開発し、類似ＧＡＳ２ペプチド配列を特定し、白血病細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチドを提供することにより、ＧＡＳ２ＤＮタンパク質抑制機能を有し、白血病患者が治療効果を得るためのＧＡＳ２抑制剤として機能する。
白血病細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列がＬｙｓ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｓｎである３７個のアミノ酸からなるポリペプチド。
前記ポリペプチドは、Ｎ末端が、ミリスチン酸エステルに接続され、ミリスチン酸エステル修飾により白血病細胞に入り込み、白血球の増殖を抑制し、白血病治療薬を調製するために用いられる。
前記ポリペプチドの調製方法は、
ａ．反応カラムにＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ樹脂を注ぎ入れ、ＤＣＭを添加して浸漬し、排出させ、
ｂ．適量の脱保護溶液を添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｃ．ガラス反応カラムに適量のＤＭＦを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｄ．反応カラムにアミノ酸混合溶液又は保護アミノ酸及びＨＢＴＵを添加し、さらにＮＭＭを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｅ．粒子状物質が得られるように、適量のＤＭＦを添加して洗浄し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｆ．小試験管に適量の粒子状物質を取り、Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬のＡ、Ｂ、Ｃ液を二滴ずつ添加し、乾式ヒーターに入れ、加熱し、溶液色がわずかに黄色く、粒子状物質が無色透明である場合、反応は完全であり、上記ステップｂ－ｅを繰り返し、最後のアミノ酸及びミリスチン酸エステルが接続されるまで次のアミノ酸を接続し、
ｇ．合成ポリペプチド樹脂が得られるように、ステップｆ）が完了した反応カラムに、適量のメタノールを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、さらに適量のＤＣＭを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、適当な容器に充填し、真空乾燥機に入れて真空乾燥させる、
１）ポリペプチドの合成ステップと、
ポリペプチド樹脂に、ポリペプチド切断液を添加し、恒温環境下で振動させ、その後、ろ過し、ろ液に無水エーテルを添加し、攪拌した後に白色固体を析出させ、白色粉末、すなわちポリペプチドの粗品が得られるように白色固体に無水エーテルを添加し、遠心洗浄し、真空乾燥させる、
２）ポリペプチドの切断ステップと、
適量のポリペプチドの粗品を取り、純水とＡＣＮを添加して超音波溶解し、ろ膜でろ過した後にろ液を取り、ろ液を高速液体クロマトグラフで順方向カラムによる勾配検出分析し、カラムを調製して吸着・溶出することにより留分を収集し、精製されたポリペプチドが得られるように、収集された留分を検出し、純度が合格したものを冷凍乾燥させる、
３）ポリペプチドの精製ステップと、を含む。
ａ．反応カラムにＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ樹脂を注ぎ入れ、ＤＣＭを添加して浸漬し、排出させ、
ｂ．適量の脱保護溶液を添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｃ．ガラス反応カラムに適量のＤＭＦを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｄ．反応カラムにアミノ酸混合溶液又は保護アミノ酸及びＨＢＴＵを添加し、さらにＮＭＭを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｅ．粒子状物質が得られるように、適量のＤＭＦを添加して洗浄し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｆ．小試験管に適量の粒子状物質を取り、Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬のＡ、Ｂ、Ｃ液を二滴ずつ添加し、乾式ヒーターに入れ、加熱し、溶液色がわずかに黄色く、粒子状物質が無色透明である場合、反応は完全であり、上記ステップｂ－ｅを繰り返し、最後のアミノ酸及びミリスチン酸エステルが接続されるまで次のアミノ酸を接続し、
ｇ．合成ポリペプチド樹脂が得られるように、ステップｆ）が完了した反応カラムに、適量のメタノールを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、さらに適量のＤＣＭを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、適当な容器に充填し、真空乾燥機に入れて真空乾燥させる、
１）ポリペプチドの合成ステップと、
ポリペプチド樹脂に、ポリペプチド切断液を添加し、恒温環境下で振動させ、その後、ろ過し、ろ液に無水エーテルを添加し、攪拌した後に白色固体を析出させ、白色粉末、すなわちポリペプチドの粗品が得られるように白色固体に無水エーテルを添加し、遠心洗浄し、真空乾燥させる、
２）ポリペプチドの切断ステップと、
適量のポリペプチドの粗品を取り、純水とＡＣＮを添加して超音波溶解し、ろ膜でろ過した後にろ液を取り、ろ液を高速液体クロマトグラフで順方向カラムによる勾配検出分析し、カラムを調製して吸着・溶出することにより留分を収集し、精製されたポリペプチドが得られるように、収集された留分を検出し、純度が合格したものを冷凍乾燥させる、
３）ポリペプチドの精製ステップと、を含む。
さらに、前記脱保護溶液は、２０％のヘキサヒドロピリジンと８０％のＤＭＦとからなる。
さらに、前記保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ａａ－ｏｈ形態の保護アミノ酸であり、
前記アミノ酸混合溶液は、保護アミノ酸をＤＭＦに溶解することにより調製される。
前記アミノ酸混合溶液は、保護アミノ酸をＤＭＦに溶解することにより調製される。
さらに、前記Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬は、Ａ液が８０％のフェノール及び２０％の無水エタノールであり、Ｂ液が再蒸留ピリジンであり、Ｃ液が５グラムのニンヒドリン及び１００ＭＬの無水エタノールである。
さらに、前記ポリペプチド切断液の構成成分は、８７．５％のＴＦＡ、５％のチオアニソール、２．５％のフェノール、２．５％のＥＤＴ及び２．５％のＨ２Ｏである。
さらに、前記３）ポリペプチドの精製ステップは、
調製条件
波長：２２０ｎｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラムの調製：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μ Ｃ１８ １１０ａ， ４．６＊２５０ｍｍ
移動相：Ａ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｂ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ｗａｔｅｒ
ａ）ビーカーに適量のポリペプチドの粗品を計量し、純水とＡＣＮを添加して超音波溶解し、完全に溶解した後に０．４５μのろ過膜でろ過し、
ｂ）遠心管に少量のポリペプチドの粗品を取り、清澄まで純水で超音波溶解してろ過し、１０～１００％の勾配で検出して分析し、
ｃ）調製条件下で、計器を約６分間平衡化した後にすべてのポンプを停止させ、ａ）ステップにおいてろ過された後のろ液をサンプリングバルブでサンプリングし、まず３０～９０％の勾配を２０ｍｉｎ実行し、次に１００～０％の勾配を実行し、留分を収集し、
ｄ）精製されたポリペプチドが得られるように、収集された留分を検出し、純度が合格したものを冷凍乾燥させる。
調製条件
波長：２２０ｎｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラムの調製：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μ Ｃ１８ １１０ａ， ４．６＊２５０ｍｍ
移動相：Ａ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｂ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ｗａｔｅｒ
ａ）ビーカーに適量のポリペプチドの粗品を計量し、純水とＡＣＮを添加して超音波溶解し、完全に溶解した後に０．４５μのろ過膜でろ過し、
ｂ）遠心管に少量のポリペプチドの粗品を取り、清澄まで純水で超音波溶解してろ過し、１０～１００％の勾配で検出して分析し、
ｃ）調製条件下で、計器を約６分間平衡化した後にすべてのポンプを停止させ、ａ）ステップにおいてろ過された後のろ液をサンプリングバルブでサンプリングし、まず３０～９０％の勾配を２０ｍｉｎ実行し、次に１００～０％の勾配を実行し、留分を収集し、
ｄ）精製されたポリペプチドが得られるように、収集された留分を検出し、純度が合格したものを冷凍乾燥させる。
（１）本発明により調製されるポリペプチドは、ＧＡＳ２ＤＮタンパク質抑制機能を有し、ＧＡＳ２抑制作用を奏することができ、それにより白血病細胞の増殖を抑制する役割を果たすが、ＧＡＳ２ＤＮは細胞膜を通過して細胞内に入り込むことができないため、白血病細胞の増殖を抑制する機能を有するとしても、白血病細胞の増殖を抑制する効果が得られないが、本発明により調製されるポリペプチドは、ミリスチン酸エステルに接続されることにより、白血病細胞に入り込むことができ、白血病細胞の増殖を抑制する効果が得られる。（２）本発明により調製されるポリペプチドは、白血病細胞の増殖を抑制する作用を有すると同時に、正常な細胞に対する抑制作用がなく、当該ポリペプチドをコア成分とすることにより、白血病を治療するための新規標的治療薬を開発することができ、副作用を低減させ、患者の痛みを軽減させ、白血病の治癒率と生存率を向上させる新しい治療法が提供される。特に、例えば、急性Ｔリンパ球性白血病細胞株（Ｔ－Ａｌｌ）や急性骨髄性白血病細胞株（ＡＭＬ）などのある白血病サブタイプに対しては、現在の化学療法効果が不十分であり、適用される標的薬もないが、本発明のポリペプチドは、上記二つの白血病細胞を効果的に抑制することができ、当該ポリペプチドをコア成分として白血病を治療するための新規標的治療薬を開発するなど、これらの白血病治療分野における標的治療薬のギャップを埋めることができることが示唆されている。（３）ＲＮＡ干渉及び発現ＧＡＳ２ＤＮは、いずれもＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のＩＭ感受性を増強させ、ＧＡＳ２を標的とすることで白血病細胞の化学療法感受性を高める可能性があることが示唆されている。したがって、当該ポリペプチドをコア成分として開発された白血病を治療するための新規標的治療薬は、化学療法薬と組み合わせて使用することができ、治療効果が増強される。
本発明の目的は、ＧＡＳ２ＤＮにおける重要なポリペプチドを開発研究し、類似ＧＡＳ２ペプチド配列を特定し、白血病細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチドを提供することにより、ＧＡＳ２ＤＮタンパク質抑制機能を有し、白血病患者が治療効果を得るためのＧＡＳ２抑制剤として機能することである。
本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列がＬｙｓ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｓｎである３７個のアミノ酸からなる。
前記ポリペプチドは、Ｎ末端が、ミリスチン酸で修飾され、ミリスチン酸エステル修飾により白血病細胞に入り込み、その抑制機能を発揮し、白血球の増殖を抑制することができる。
ポリペプチドの調製方法は以下のとおりである。
原料及び必要な試薬の構成
保護アミノ酸：前記ポリペプチドに含まれる各種アミノ酸をＦｍｏｃ－Ａａ－ｏｈ形態の保護アミノ酸に調製する。
アミノ酸混合溶液：上記各種保護アミノ酸１ｍｍｏｌをそれぞれ６３．４ｍｌのＤＭＦ溶液に溶解し、０．３ｍｍｏｌ／ｍｌのアミノ酸混合溶液に調製して使用に備える。
出発樹脂：Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ
縮合剤及び有機塩基：ＨＢＴＵ、ＮＭＭ
溶媒：ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ヘキサヒドロピリジン
Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬の調製：
Ａ液：８０％のフェノール＋２０％の無水エタノール
Ｂ液：再蒸留ピリジン
Ｃ液：５グラムのニンヒドリン＋１００ＭＬの無水エタノール
脱保護溶液の調製：
２０％のヘキサヒドロピリジン＋８０％のＤＭＦ
ポリペプチド切断液の調製：
８７．５％のＴＦＡ、５％のチオアニソール＋２．５％のフェノール＋２．５％のＥＤＴ＋２．５％のＨ２Ｏ
保護アミノ酸：前記ポリペプチドに含まれる各種アミノ酸をＦｍｏｃ－Ａａ－ｏｈ形態の保護アミノ酸に調製する。
アミノ酸混合溶液：上記各種保護アミノ酸１ｍｍｏｌをそれぞれ６３．４ｍｌのＤＭＦ溶液に溶解し、０．３ｍｍｏｌ／ｍｌのアミノ酸混合溶液に調製して使用に備える。
出発樹脂：Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ
縮合剤及び有機塩基：ＨＢＴＵ、ＮＭＭ
溶媒：ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ヘキサヒドロピリジン
Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬の調製：
Ａ液：８０％のフェノール＋２０％の無水エタノール
Ｂ液：再蒸留ピリジン
Ｃ液：５グラムのニンヒドリン＋１００ＭＬの無水エタノール
脱保護溶液の調製：
２０％のヘキサヒドロピリジン＋８０％のＤＭＦ
ポリペプチド切断液の調製：
８７．５％のＴＦＡ、５％のチオアニソール＋２．５％のフェノール＋２．５％のＥＤＴ＋２．５％のＨ２Ｏ
１）ポリペプチドの合成
ａ．樹脂膨潤：ガラス反応カラムにＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ樹脂を注ぎ入れ、ＤＣＭを添加して３０分間浸漬し、排出させる。
ｂ．脱保護：適量の脱保護溶液をガラス反応カラムに添加し、窒素ガスで３０分間攪拌して排出させる。
ｃ．脱保護洗浄：ガラス反応カラムに適量のＤＭＦを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、６回繰り返して操作する。
ｄ．仕込：ガラス反応カラムに樹脂３倍モル量のアミノ酸混合溶液又は同量の保護アミノ酸及び２．８５倍モル量のＨＢＴＵを添加し、さらに樹脂６倍モル量のＮＭＭを添加し、窒素ガスで３０分間攪拌して排出させる。
ｅ．反応後洗浄：粒子状物質が得られるように、ガラス反応カラム内の溶液を排出させ、適量のＤＭＦを添加して洗浄し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、３回繰り返して操作する。
ｆ．検出：小試験管に適量（１０～２０粒）の粒子状物質を取り、Ａ、Ｂ、Ｃ液を二滴ずつ添加する。乾式ヒーターに入れ、３分間加熱する（１１０℃）。
取り出した後、溶液が青く見え、粒子状物質がまだらで不透明である場合、反応は不完全であり、再度反応させる必要がある。
溶液色がわずかに黄色く、粒子状物質が無色透明である場合、反応は完全であり、次のアミノ酸を接続することができ、最後のアミノ酸が接続されるまで上記ステップｂ－ｆを繰り返す。
ｈ．合成完了後の洗浄・乾燥：最後のアミノ酸及びミリスチン酸が接続され、検出に合格した後に排出させ、ガラス反応カラムに適量のメタノールを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、さらに適量のＤＣＭを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、３回繰り返して操作する。最後に、ポリペプチド樹脂が得られるように、ガラス反応カラムに適量のメタノールを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、２回繰り返して操作し、当該ポリペプチド樹脂を適当な容器に充填し、真空乾燥機に入れて１２時間真空乾燥させて切断に備える。
ａ．樹脂膨潤：ガラス反応カラムにＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ樹脂を注ぎ入れ、ＤＣＭを添加して３０分間浸漬し、排出させる。
ｂ．脱保護：適量の脱保護溶液をガラス反応カラムに添加し、窒素ガスで３０分間攪拌して排出させる。
ｃ．脱保護洗浄：ガラス反応カラムに適量のＤＭＦを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、６回繰り返して操作する。
ｄ．仕込：ガラス反応カラムに樹脂３倍モル量のアミノ酸混合溶液又は同量の保護アミノ酸及び２．８５倍モル量のＨＢＴＵを添加し、さらに樹脂６倍モル量のＮＭＭを添加し、窒素ガスで３０分間攪拌して排出させる。
ｅ．反応後洗浄：粒子状物質が得られるように、ガラス反応カラム内の溶液を排出させ、適量のＤＭＦを添加して洗浄し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、３回繰り返して操作する。
ｆ．検出：小試験管に適量（１０～２０粒）の粒子状物質を取り、Ａ、Ｂ、Ｃ液を二滴ずつ添加する。乾式ヒーターに入れ、３分間加熱する（１１０℃）。
取り出した後、溶液が青く見え、粒子状物質がまだらで不透明である場合、反応は不完全であり、再度反応させる必要がある。
溶液色がわずかに黄色く、粒子状物質が無色透明である場合、反応は完全であり、次のアミノ酸を接続することができ、最後のアミノ酸が接続されるまで上記ステップｂ－ｆを繰り返す。
ｈ．合成完了後の洗浄・乾燥：最後のアミノ酸及びミリスチン酸が接続され、検出に合格した後に排出させ、ガラス反応カラムに適量のメタノールを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、さらに適量のＤＣＭを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、３回繰り返して操作する。最後に、ポリペプチド樹脂が得られるように、ガラス反応カラムに適量のメタノールを添加し、窒素ガスで２分間攪拌して排出させ、２回繰り返して操作し、当該ポリペプチド樹脂を適当な容器に充填し、真空乾燥機に入れて１２時間真空乾燥させて切断に備える。
２）ポリペプチドの切断
切断：上記乾燥後のポリペプチド樹脂を適当な丸底フラスコに入れ、配合された適量のポリペプチド切断液（１ｇ／１０ｍｌ）を添加し、恒温振動台に２５℃で２時間恒温振動させる。
ろ過：未溶解のポリペプチド樹脂を５０ｍｌのフリット漏斗でろ過し、その後、ろ液を１００ｍｌの遠心管に注ぎ入れ、６～８倍の体積量の無水エーテルを添加し、添加しながら攪拌し、析出した白色固体を所望のポリペプチド粗品とする。
洗浄：遠心管を密閉して遠心分離機に入れ、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離して取り出し、上層清澄液を捨ててから無水エーテルを添加し、ガラス棒で均一に攪拌し、再度遠心分離し、このように５回繰り返して洗浄操作する。
乾燥：５回洗浄後の上記白色固体を真空乾燥機に入れ、２４時間真空乾燥する。最後に得られる白色粉末は、所望のポリペプチドの粗品であり、計量して精製に備える。
切断：上記乾燥後のポリペプチド樹脂を適当な丸底フラスコに入れ、配合された適量のポリペプチド切断液（１ｇ／１０ｍｌ）を添加し、恒温振動台に２５℃で２時間恒温振動させる。
ろ過：未溶解のポリペプチド樹脂を５０ｍｌのフリット漏斗でろ過し、その後、ろ液を１００ｍｌの遠心管に注ぎ入れ、６～８倍の体積量の無水エーテルを添加し、添加しながら攪拌し、析出した白色固体を所望のポリペプチド粗品とする。
洗浄：遠心管を密閉して遠心分離機に入れ、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離して取り出し、上層清澄液を捨ててから無水エーテルを添加し、ガラス棒で均一に攪拌し、再度遠心分離し、このように５回繰り返して洗浄操作する。
乾燥：５回洗浄後の上記白色固体を真空乾燥機に入れ、２４時間真空乾燥する。最後に得られる白色粉末は、所望のポリペプチドの粗品であり、計量して精製に備える。
３）ポリペプチドの精製
調製条件：
計器：ＵＶ検出器付き高速液体クロマトグラフ
波長：２２０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラムの調製：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μ Ｃ１８ １１０ａ， ４．６＊２５０ｍｍ
移動相：Ａ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｂ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ｗａｔｅｒ
Ａ Ｂ
０．０１ｍｉｎ ３０％ ７０％
２５ｍｉｎ ９０％ １０％
２５．１ｍｉｎ １００％ ０％
３０ｍｉｎ ＳＴＯＰ
粗品分析：
０．５ｍｌ遠心管に少量のポリペプチドの粗品を取り、清澄まで純水で超音波溶解し、ろ過してサンプリングし、勾配１０～１００％で分析する。
分離精製：
ａ）溶解
１０ｍｌビーカーに２００ｍｇのポリペプチドの粗品を計量し、７．５ｍｌの純水と２．５ｍｌのＡＣＮを添加して超音波溶解し、完全に溶解した後に０．４５μのろ過膜でろ過する。
ｂ．調製
高速液体クロマトグラフにより調製条件下で、計器を約６分間平衡化した後にすべてのポンプを停止させ、ａ）ステップにおいてろ過された後のろ液をサンプリングバルブでサンプリングし、まず３０～９０％の勾配を２０ｍｉｎ実行し、次に１００～０％の勾配を実行するように調製勾配を実行し、留分を収集する。収集が終了した後、ポンプを停止させる。収集された留分を分析計器で純度を検査し、純度が合格した留分を冷凍乾燥させる。
ｃ．冷凍乾燥
収集された留分をロータリーエバポレーターで溶液中の有機溶媒を回転蒸発させた後に、冷凍乾燥機で冷凍乾燥させる。
ｄ．計量検出
２日間冷凍乾燥させた後に冷凍乾燥機を開き、計量重量を取り出してブティック管に入れ、検出のためにＱＣに送り、検出が合格するのを待って保管する。
調製条件：
計器：ＵＶ検出器付き高速液体クロマトグラフ
波長：２２０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラムの調製：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μ Ｃ１８ １１０ａ， ４．６＊２５０ｍｍ
移動相：Ａ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｂ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ｗａｔｅｒ
Ａ Ｂ
０．０１ｍｉｎ ３０％ ７０％
２５ｍｉｎ ９０％ １０％
２５．１ｍｉｎ １００％ ０％
３０ｍｉｎ ＳＴＯＰ
粗品分析：
０．５ｍｌ遠心管に少量のポリペプチドの粗品を取り、清澄まで純水で超音波溶解し、ろ過してサンプリングし、勾配１０～１００％で分析する。
分離精製：
ａ）溶解
１０ｍｌビーカーに２００ｍｇのポリペプチドの粗品を計量し、７．５ｍｌの純水と２．５ｍｌのＡＣＮを添加して超音波溶解し、完全に溶解した後に０．４５μのろ過膜でろ過する。
ｂ．調製
高速液体クロマトグラフにより調製条件下で、計器を約６分間平衡化した後にすべてのポンプを停止させ、ａ）ステップにおいてろ過された後のろ液をサンプリングバルブでサンプリングし、まず３０～９０％の勾配を２０ｍｉｎ実行し、次に１００～０％の勾配を実行するように調製勾配を実行し、留分を収集する。収集が終了した後、ポンプを停止させる。収集された留分を分析計器で純度を検査し、純度が合格した留分を冷凍乾燥させる。
ｃ．冷凍乾燥
収集された留分をロータリーエバポレーターで溶液中の有機溶媒を回転蒸発させた後に、冷凍乾燥機で冷凍乾燥させる。
ｄ．計量検出
２日間冷凍乾燥させた後に冷凍乾燥機を開き、計量重量を取り出してブティック管に入れ、検出のためにＱＣに送り、検出が合格するのを待って保管する。
実験データによる本発明のポリペプチドの白血病細胞増殖に対する抑制効果の証明
選択される実験細胞は次のとおりである。
Ｋ５６２細胞、人慢性骨髄性白血病細胞株（ＣＭＬ）
Ｊｕｒｋａｔ細胞、急性Ｔリンパ球性白血病細胞株（Ｔ－Ａｌｌ）
Ｔｈｐ－１細胞、急性骨髄性白血病細胞株（ＡＭＬ）
Ｂａｆ－３細胞、正常なマウス造血幹細胞
本実験では、正常対照グループ、ポリペプチド対照グループ及び実験ポリペプチドグループにグループ分けする。
選択される実験細胞は次のとおりである。
Ｋ５６２細胞、人慢性骨髄性白血病細胞株（ＣＭＬ）
Ｊｕｒｋａｔ細胞、急性Ｔリンパ球性白血病細胞株（Ｔ－Ａｌｌ）
Ｔｈｐ－１細胞、急性骨髄性白血病細胞株（ＡＭＬ）
Ｂａｆ－３細胞、正常なマウス造血幹細胞
本実験では、正常対照グループ、ポリペプチド対照グループ及び実験ポリペプチドグループにグループ分けする。
まず、本発明のポリペプチドと５＊１０３（１０の三乗と表記する）の白血病腫瘍細胞とを３８ｈ共培養し、細胞の増殖（ＣＣＫ－８）の検出及び細胞計数の二つの方法で細胞の増殖速度を検出し、それにより腫瘍細胞に対するポリペプチドの抑制効果を観察する。
第２に、ポリペプチドと細胞とを２４時間共培養した後、再び収集して計数し、薬物を添加して３８時間を培養してから、細胞の増殖（ＣＣＫ－８）速度を検出する。
第３に、正常なマウス造血細胞を用いて上記と同様の実験を行うことにより、正常な細胞に対するポリペプチドの影響を観察する。
各グループは、一つのブランク（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、一つの対照ペプチド（Ｃ－ｐ）及び三つの標的ペプチド（Ｐ－ｔ、結果は平均値を取る）を含む。
（１）Ｋ５６２細胞とポリペプチドとを３８ｈ／２４＋３８ｈ共培養
１回目の実験
１回目の実験
２回目の実験
（２）Ｊｕｒｋａｔ細胞とポリペプチドとを３８ｈ／２４＋３８ｈ共培養
１回目の実験
１回目の実験
２回目の実験
（３）Ｔｈｐ－１細胞とポリペプチドとを３８ｈ／２４～３８ｈ共培養
１回目の実験
１回目の実験
２回目の実験
（４）Ｂａｆ－３細胞とポリペプチドとを３８ｈ／２４～３８ｈ共培養
１回目の実験
１回目の実験
２回目の実験
上記の三つの白血病細胞に代表される白血病亜型は、白血病の発症者数の約７０％以上をカバーしており、上記の実験により、当該ポリペプチドは、複数の白血病細胞の増殖を明らかに抑制することができ、投与量及び投与回数と正相関することが分かる。同時に正常な細胞の増殖を抑制する作用はない。
Claims (10)
- 白血病細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチドであって、
アミノ酸配列がＬｙｓ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｓｎである３７個のアミノ酸からなる、
ことを特徴とするポリペプチド。 - Ｎ末端が、ミリスチン酸エステルに接続され、ミリスチン酸エステル修飾により白血病細胞に入り込む、
ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。 - ａ．反応カラムにＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ樹脂を注ぎ入れ、ＤＣＭを添加して浸漬し、排出させ、
ｂ．適量の脱保護溶液を添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｃ．ガラス反応カラムに適量のＤＭＦを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｄ．反応カラムにアミノ酸混合溶液又は保護アミノ酸及びＨＢＴＵを添加し、さらにＮＭＭを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｅ．粒子状物質が得られるように、適量のＤＭＦを添加して洗浄し、窒素ガスで攪拌して排出させ、
ｆ．小試験管に適量の粒子状物質を取り、Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬のＡ、Ｂ、Ｃ液を二滴ずつ添加し、乾式ヒーターに入れ、加熱し、溶液色がわずかに黄色く、粒子状物質が無色透明である場合、反応は完全であり、上記ステップｂ－ｅを繰り返し、最後のアミノ酸及びミリスチン酸エステルが接続されるまで次のアミノ酸を接続し、
ｇ．合成ポリペプチド樹脂が得られるように、ステップｆ）が完了した反応カラムに、適量のメタノールを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、さらに適量のＤＣＭを添加し、窒素ガスで攪拌して排出させ、適当な容器に充填し、真空乾燥機に入れて真空乾燥させる、
１）ポリペプチドの合成ステップと、
ポリペプチド樹脂に、ポリペプチド切断液を添加し、恒温環境下で振動させ、その後、ろ過し、ろ液に無水エーテルを添加し、攪拌した後に白色固体を析出させ、白色粉末、すなわちポリペプチドの粗品が得られるように白色固体に無水エーテルを添加し、遠心洗浄し、真空乾燥させる、
２）ポリペプチドの切断ステップと、
適量のポリペプチドの粗品を取り、純水とＡＣＮを添加して超音波溶解し、ろ膜でろ過した後にろ液を取り、ろ液を高速液体クロマトグラフで順方向カラムによる勾配検出分析し、カラムを調製して吸着・溶出することにより留分を収集し、精製されたポリペプチドが得られるように、収集された留分を検出し、純度が合格したものを冷凍乾燥させる、
３）ポリペプチドの精製ステップと、を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの調製方法。 - 前記脱保護溶液は、２０％のヘキサヒドロピリジンと８０％のＤＭＦとからなる、
ことを特徴とする請求項３に記載のポリペプチドの調製方法。 - 前記保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ａａ－ｏｈ形態の保護アミノ酸であり、
前記アミノ酸混合溶液は、保護アミノ酸をＤＭＦに溶解することにより調製される、
ことを特徴とする請求項３に記載のポリペプチドの調製方法。 - 前記Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ試薬は、Ａ液が８０％のフェノール及び２０％の無水エタノールであり、Ｂ液が再蒸留ピリジンであり、Ｃ液が５グラムのニンヒドリン及び１００ＭＬの無水エタノールである、
ことを特徴とする請求項３に記載のポリペプチドの調製方法。 - 前記ポリペプチド切断液の構成成分は、８７．５％のＴＦＡ、５％のチオアニソール、２．５％のフェノール、２．５％のＥＤＴ及び２．５％のＨ２Ｏである、
ことを特徴とする請求項３に記載のポリペプチドの調製方法。 - 前記３）ポリペプチドの精製ステップは、
調製条件
波長：２２０ｎｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラムの調製：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μ Ｃ１８ １１０ａ， ４．６＊２５０ｍｍ
移動相：Ａ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｂ液：０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ｉｎ １００％ Ｗａｔｅｒ
ａ）ビーカーに適量のポリペプチドの粗品を計量し、純水とＡＣＮを添加して超音波溶解し、完全に溶解した後に０．４５μのろ過膜でろ過し、
ｂ）遠心管に少量のポリペプチドの粗品を取り、清澄まで純水で超音波溶解してろ過し、１０～１００％の勾配で検出して分析し、
ｃ）調製条件下で、計器を約６分間平衡化した後にすべてのポンプを停止させ、ａ）ステップにおいてろ過された後のろ液をサンプリングバルブでサンプリングし、まず３０～９０％の勾配を２０ｍｉｎ実行し、次に１００～０％の勾配を実行し、留分を収集し、
ｄ）精製されたポリペプチドが得られるように、収集された留分を検出し、純度が合格したものを冷凍乾燥させる、
ことを特徴とする請求項３に記載のポリペプチドの調製方法。 - 白血病細胞の増殖を抑制するための請求項１又は２に記載のポリペプチド。
- 白血病治療薬を調製するための請求項１又は２に記載のポリペプチド。
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