CN116715723A - 一种抑制血管生成的小分子短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
一种抑制血管生成的小分子短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抑制血管生成的小分子短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该抑制血管生成的小分子短肽的氨基酸序列如下所示：RPPLKRVRMSA。本发明中通过细胞实验发现，该小分子短肽能够抑制血管内皮细胞的生长，且通过动物体内实验发现，该小分子短肽能够抑制肿瘤的生长。因此，本发明中的小分子短肽能够成为一种有效的抗血管生成及抗肿瘤候选药物，为进一步的临床研究与应用奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种抑制血管生成的小分子短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
血管生成(Angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管生成对胚胎植入、胚胎发生和发育，以及创伤治愈等正常生理进程尤为重要，且血管生成也与非癌疾病的进展相关，如新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜炎、动脉粥样硬化、肥胖症、肝炎、肺炎、哮喘等疾病。此外，血管生成与肿瘤生长之间也具有紧密联系。
人体肿瘤大部分都是实体瘤，肿瘤组织是由肿瘤细胞和间质构成。间质成分主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎症细胞及细胞外基质等成分。其中，结缔组织和血管起营养、支持肿瘤细胞的作用。越来越多的研究表明，大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速，因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。
在所有分子中，VEGFR2(血管内皮细胞生长因子受体2)与内皮细胞的增殖和迁移密切相关，并且VEGFR2的mRNA表达水平几乎在所有人体肿瘤中上调，与肿瘤复发、转移和预后不良相关。研究表明，肿瘤细胞及其微环境中产生的VEGF(血管内皮细胞生长因子)与VEGFR2在血管通透性和新血管生成中起关键的作用。VEGF与VEGFR2的结合诱导VEGFR2自磷酸化并激活下游信号，从而影响生理和肿瘤血管生成以及血管通透性。如果使用各种类型的抗血管生成药物抑制肿瘤血管生成，就可以有效地抑制肿瘤生长。因此，VEGFR2可作为肿瘤靶向治疗的重要靶标。
目前，Sunitinib和Sorafenib等靶向VEGFR2的小分子抑制剂已经被批准用于治疗相关肿瘤，但目前上市的小分子药物主要针对胞内段，存在毒性大，靶点过多等缺点。蛋白药物如Ramucirumab(雷莫芦单抗)、Bevacizumab(贝伐珠单抗)等虽然可以通过阻断VEGF与VEGFR2结合达到抑制受体信号的作用，但使用一段时间后往往会产生抗药性，并且蛋白类药物由于分子量较大，注射到人体一般会有免疫原性。
一般来说，多肽是具有高选择性和高有效性的信号分子，可与特定的细胞表面受体结合，如G蛋白偶联受体(GPCR)或离子通道，在那里它们能够触发细胞内效应，因此多肽为密切模仿自然途径的治疗干预提供了机会。因此，肽类药物已被开发用于治疗各种疾病，包括癌症，免疫疾病，代谢紊乱，病毒感染，心血管疾病和骨质疏松症等。鉴于肽类药物具有良好的安全性、耐受性和疗效，迅速成为了设计新型治疗药物的良好选择，且与基于蛋白质的生物制药相比，多肽具有较低的生产复杂性，生产成本也较低，因此，开发治疗性多肽用于抗血管生成或治疗肿瘤重要现实意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抑制血管生成的小分子短肽。
本发明的另一目的在于提供所述抑制血管生成的小分子短肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抑制血管生成的小分子短肽，其氨基酸序列如下所示：RPPLKRVRMSA。
所述的抑制血管生成的小分子短肽可通过本领域常规方法合成得到，如Fmoc固相合成法等。
所述的抑制血管生成的小分子短肽在在制备抗血管生成和/或抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗血管生成的药物为抑制血管内皮细胞增殖的药物。
所述的血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
所述的肿瘤为血管组织高度发达的肿瘤细胞和/或肿瘤组织；优选为肝癌。
所述的肿瘤细胞包括人肝癌细胞，；优选为人肝癌细胞MHCC97L。
所述的抑制血管生成的小分子短肽的有效浓度为12.5～50μmol/L；优选为50μmol/L。
所述的药物可以含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂等。
所述的药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括汤剂、片剂、丸剂、胶囊剂、针剂(粉针剂)、颗粒剂(冲剂)、口服液和糖浆剂，或者采用微纳米技术制成的片剂、胶囊剂、针剂(粉针剂)和颗粒剂等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明先利用CCK8法对HUVEC细胞进行检测，从中筛选出对HUVEC细胞具有显著的抑制增殖效果的小分子短肽(命名为B4)；然后进一步进行了动物实验，通过对移植有肿瘤细胞(人肝癌细胞MHCC97L)的裸鼠进行治疗，观察到B4多肽能够显著抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的生长，提示B4多肽能够成为一种有效的抗血管生成及抗肿瘤候选药物。
2、本发明中的B4能够抑制体外血管生长并且抑制肿瘤的生长，因此，B4有望成为新型抗肿瘤血管生成和治疗其他血管疾病的良好药物，为进一步的临床研究与应用奠定坚实的基础。
3、本发明中的抑制血管生成小分子短肽B4能够抑制血管生成，达到抗肿瘤的效果，因此，可将其用于制备抗肿瘤药物，用于治疗肝癌。
附图说明
图1是本发明中的B4多肽抑制HUVEC细胞生长的结果图。
图2是本发明中的B4多肽对裸鼠移植瘤的治疗效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1B4多肽合成
本发明中的B4多肽的氨基酸序列如下所示：RPPLKRVRMSA，委托上海强耀生物科技有限公司采用Fmoc固相合成法。其主要涉及的合成原料、相关试剂、仪器设备以及合成过程简述如下：
1.1合成原料及相关试剂：①保护氨基酸原料：Fmoc保护氨基酸；②缩合试剂：O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)；③溶剂：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇，乙腈；④树脂：取代度为1.1mmol/g的2-ChlorotritylChloride resin；⑤脱保护试剂：哌啶；⑥检测试剂：苯酚试剂，吡啶试剂，茚三酮试剂；⑦切割试剂：三氟乙酸(TFA)，三异丙基硅烷(TIS)，1,2-乙二硫醇(EDT)，无水乙醚；⑧氮气；⑨精密电子天平。
1.2仪器设备：①十二通道半自动多肽合成仪；②高效液相色谱仪；③冻干机；④离心机。
1.3合成过程：
一、树脂溶涨：将树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DMF(15ml/g，即按每克树脂加入15ml溶剂，下同)，振荡60min。
二、接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸(C端第一个氨基酸)，再加入10倍摩尔量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。甲醇封头，静置30min。
三、脱保护：去掉DMF，加入含20％(v/v)哌啶的DMF溶液(15ml/g)，静置5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，静置15min。
四、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒脱保护的树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮试剂，KCN溶液，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
五、洗：用DMF(10ml/g)洗两次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。
六、缩合：加入3倍摩尔量Fmoc保护氨基酸，3倍摩尔量HBTU，再加入10倍摩尔量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡45min。
七、检测：取十几粒上述缩合后的树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮试剂、吡啶、苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，无色为阴性反应。
八、洗：用DMF(10ml/g)洗一次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。
九、重复上述第三至第八步的操作，从右到左依次链接序列中的氨基酸，直到最后一个氨基酸为止。
十、按照下列方法洗树脂，抽干，用DMF(10ml/g)洗两次，DCM(10ml/g)三次，甲醇(10ml/g)洗四次，抽干10min。
十一、切割：配制切割液：TFA 94.5％，水2.5％，EDT 2.5％，TIS 1％(质量分数)；然后加入切割液(10ml/g)对树脂进行切割，切割时间为180min。
十二、吹干洗涤：将上述切割后的裂解液用氮气尽量吹干，乙醚析出，离心去除上清，沉淀用乙醚洗六次，然后常温挥干得到中间体。
十三、氧化：将吹干的中间体使用水/乙腈溶解完全后，加入5％二甲基亚砜(DMSO)，pH＝8-9，室温磁力搅拌8h，期间采用Ellman试剂进行监控，直到氧化完全后，冻干得到氧化好的粗品。
十四、纯化制备：
①取少许粗品，H2O/乙腈溶解；②取少量样品在HPLC分析仪器上进行分析判断目标峰对应出峰时间；③利用C18反相色谱制备系统：波长：220nm；流速：15ml/min；体积(Inj.Vol)：20mL；柱温：25℃；洗脱：Buffer A:0.1％(v/v)TFA水溶液；Buffer B：含0.1％(v/v)TFA的乙腈溶液，收集目标峰溶液；④用1.5ml离心管取少许目标峰溶液进行质谱确认及纯度检测。
十五、将合格的目标峰溶液进行冻干，得到成品。
十六、鉴定：分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定和HPLC分析的纯度鉴定。
十七、将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。
实施例2B4多肽的细胞水平功能试验
(1)选择试验细胞株
由于本发明的目标是抑制血管生成，因此首先在HUVEC细胞株(购自上海细胞库)中利用Cell Counting Kit-8法以检测B4多肽对HUVEC细胞的增殖是否具有抑制作用。
(2)试验方法
在添加10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中培养HUVEC细胞至对数期，消化收集细胞，均匀铺在96孔板中，细胞密度为3000/孔，贴壁24小时后用无血清DMEM培养基饥饿培养12小时，之后更换培养基为添加5％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，并添加B4多肽处理48小时，每个浓度梯度设置6个复孔；其中，B4多肽的终浓度分别为12.5、25、50μM，以不添加B4多肽为对照。48小时后弃去培养液，更换含有10％(v/v)的CCK8溶液的DMEM培养基，37℃培养箱内孵育60min，在酶标仪下测量450nM波长的吸光度。
(3)试验结果
结果如图1所示：细胞增殖实验结果表明，B4多肽对于HUVEC细胞的增殖具有显著的抑制作用，在50μM的多肽浓度下，抑制效果可达25％，并且具有浓度依赖性。
实施例3B4多肽在动物体内的抗肿瘤作用
(1)选择试验动物
购买BALB/c裸鼠12只(6周龄，雌性)(购买自广东药康生物科技有限公司，D000521)，SPF级条件饲养，恒定温度(22～24℃)，恒定湿度(50％～70％)，饲养笼、垫料、饲料和水均经高压蒸汽灭菌。
(2)试验方法
a、腹腔注射0.5％的戊巴比妥钠麻醉裸鼠(按35mg/kg剂量计算)，然后用酒精棉球消毒裸鼠右侧腋下皮肤，用1ml注射器于皮下接种MHCC97L细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0497)悬液100μL(约1×107个)/只。接种两周后，裸鼠右侧背部皮肤会明显见到瘤体，开始进行给药实验。
b、将裸鼠随机分为3组，每组4只：①阴性对照组：PBS缓冲液0.2mL；②B4多肽组：20mg/kg、30mg/kg。然后进行给药处理，每天进行一次尾静脉注射给药，连续给药14天。按照给药频率在给药前用游标卡尺测量肿瘤的长径(x)，短径(y)和大小，根据体积公式：V＝π*x*y*y/6计算肿瘤体积。
c、给药14天后处死小鼠，分离肿瘤组织，拍照。
(3)试验结果
结果如图2所示：根据统计结果，给药后B4多肽能够显著抑制移植瘤的生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抑制血管生成的小分子短肽，其特征在于，其氨基酸序列如下所示：RPPLKRVRMSA。
2.权利要求1所述的抑制血管生成的小分子短肽在在制备抗血管生成和/或抗肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为血管组织高度发达的肿瘤细胞和/或肿瘤组织。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抗血管生成的药物为抑制血管内皮细胞增殖的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抑制血管生成的小分子短肽的有效浓度为12.5～50μmol/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的抑制血管生成的小分子短肽的有效浓度为50μmol/L。
9.根据权利要求2～8任一项所述的应用，其特征在于：
所述的药物含有一种或至少两种药学上可以接受的载体；
所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的药物采用本领域的常规方法制成汤剂、片剂、丸剂、胶囊剂、针剂、颗粒剂、口服液和糖浆剂。
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