CN116396365A - 一种抗肿瘤多肽thp-24及其制备方法和应用 - Google Patents

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李维远
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Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤多肽THP‑24及其制备方法和在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。该抗肿瘤多肽选自：(1)具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多肽；和(2)与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同源性至少为70％，且具有相同或相似功能的多肽。本发明提供的新型多肽THP‑24可以诱导肾脏肿瘤细胞死亡，同时对正常细胞的毒性较小，且可以明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移能力以及诱导肿瘤细胞死亡，为制备治疗肿瘤，特别是肾细胞癌的药物提供了新的策略。

Description

一种抗肿瘤多肽THP-24及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤多肽THP-24及其制备方法和应用。
背景技术
肾细胞癌(RCC)占所有恶性肿瘤的2.2％，是世界上第九大常见癌症。确诊年龄约为60岁，男性确诊为肾细胞癌的人数是女性的两倍。RCC主要分为透明细胞肾细胞癌组织学亚型(75-80％)和非透明细胞肾细胞癌组织学亚型，包括乳头状亚型、嫌色型亚型、集合管亚型和未分类亚型。近几十年来，RCC的发病率一直在增加。RCC的预后因诊断阶段而异。由于RCC的症状和体征是非特异性的，大部分患者表现为局限性疾病，只有约30％的患者通过偶然的腹部影像学诊断为晚期或转移性疾病。全身治疗是转移性肾细胞癌患者的唯一治疗选择。转移性肾细胞癌患者的5年生存率在0-20％之间，中位总生存期为10-15个月。局限性RCC可以通过手术成功治疗，而常规化疗对转移性肾细胞癌无效，因为它对放疗和化疗不敏感。目前可供选择的全身治疗方案有限，因此，我们迫切需要更好地了解RCC发病的详细机制，以确定更有效的治疗策略。
多肽是在生命科学中发挥关键作用的功能性生物分子，比如激素和信号分子。在如氢键、疏水键、静电力等分子间相互作用的驱动下，多肽可以自行组装成纳米粒子，这些纳米结构已经广泛用于癌症的诊断和治疗。肽-药物结合物是一种新兴的分子药物传递系统，在分子水平实现精准给药和肿瘤靶向释放。除了作为分子药物传递媒介，多肽本身也可以发挥抗肿瘤的作用。多肽在分子上处于小分子和大分子之间，然而，其生化性质和疗效却和其他分子药物有显著的差异。多肽是由氨基酸构成的短链，氨基酸个数小于50个，通常借助二硫键稳定其结构。多肽可以被设计成和特定的或者感兴趣的蛋白质相互作用，进而调节目标蛋白的功能，如致癌蛋白。不同多肽的抗癌机制不同，包括抑制血管生成，调节信号转导途径，抑制或促进基因表达和诱导肿瘤细胞凋亡等。多肽受到药物之间相互作用较少，对特定器官如肾脏或肝脏的毒副作用较低，还有相对较低的免疫原性和生化多样性，使治疗性多肽作为抗癌药物的潜能超过其他生物制剂和小分子。多肽主要有3个来源：1.天然的或生物活性肽(植物、动物或人类)；2.从基因或重组文库设计的多肽；3.从化学库中获得的多肽。分子量较小的多肽能以较高的亲和力穿透肿瘤组织。它们可以很容易地用化学方法合成，这在癌症治疗方面是一种经济有效的方法。
虽然抗肿瘤多肽具有许多优越的生物特性，但也有显著的缺点，比如体内稳定性差，对血清蛋白酶介导裂解的抵抗性很小。此外，短的半衰期导致多肽的生物利用度低。因此，针对肾细胞癌，目前亟需一种稳定性强、生物利用度高的多肽。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种抗肿瘤多肽THP-24及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种抗肿瘤多肽THP-24，选自：
(1)具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多肽；和
(2)与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同源性至少为70％，且具有相同或相似功能的多肽。
进一步地，上述抗肿瘤多肽为与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同源性至少为80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，且具有相同或相似功能的多肽。
进一步地，上述抗肿瘤多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
本发明的第二方面是提供上述抗肿瘤多肽的制备方法，包括采用固相合成法合成该抗肿瘤多肽的步骤。
进一步地，上述制备方法包括如下步骤：
(1)树脂溶胀：称氯树脂，加DMF/DCM溶胀30-60min，用DMF洗涤；
(2)接第一个氨基酸：将4-6倍摩尔过量的Leu用DMF溶解，将8-10倍摩尔过量DIEA转移至多肽合成管中，振荡反应过夜；
(3)封闭：过夜反应后，用DMF清洗，加甲醇封闭树脂；
(4)脱保护：封闭树脂后，同DMF洗涤，加哌啶脱保护两次中间用DMF洗涤；
(5)接下一个氨基酸Gly：脱保护后，称取4-6倍摩尔过量的Gly和4-6倍摩尔过量缩合试剂用DMF溶解，加入8-10倍摩尔过量DIEA进行反应；
(6)剩余氨基酸偶联：重复步骤(4)和步骤(5)，直到接最后一个氨基酸，脱保护；
(7)粗肽切割、层析并纯化。
本发明的第三方面是提供上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，该药物包括上述抗肿瘤多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，上述肿瘤为肾细胞癌。
本发明的第四方面是提供一种抗肿瘤的药物组合物，包括上述抗肿瘤多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，上述肿瘤为肾细胞癌。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的新型多肽THP-24可以诱导肾脏肿瘤细胞死亡，同时对正常细胞的毒性较小，且可以明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移能力以及诱导肿瘤细胞死亡，为制备治疗肿瘤，特别是肾细胞癌的药物提供了新的策略。
附图说明
图1为多肽THP-24的HPLC图谱；
图2为多肽THP-24的蛋白质谱检测图谱；
图3为不同浓度多肽THP-24处理人肾癌细胞786-O(图A)和人正常肾小管上皮细胞HKC(图B)24小时后用CCK-8方法测得的细胞活性曲线图；
图4为不同浓度多肽THP-24处理人肾癌细胞786-O后克隆形成实验的图，其中，图A为对照组，图B为浓度为20μg/ml的多肽THP-24处理组；
图5为不同浓度多肽THP-24处理人肾癌细胞786-O后划痕实验的图，其中，图A为对照组，图B为浓度为30μg/ml的多肽THP-24处理组；
图6为不同浓度多肽THP-24处理人肾癌细胞786-O后流式细胞术的图，其中，图A为对照组，图B为浓度为80μg/ml的多肽THP-24处理组。
具体实施方式
本发明提供了一种抗肿瘤多肽THP-24及其制备方法和在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，该多肽的氨基酸序列为RKKRRQRRR-RGPSWDPFRDWYPHSRLFDQAFGL(SEQ ID No.1)。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供了抗肿瘤多肽THP-24的制备方法，具体的步骤如下：
(1)称量10g氯树脂加入多肽合成管中，再加入100mL DCM溶胀60min，溶胀后抽干，再加入100mL DMF洗涤3次，最后抽干。
(2)称量Leu，与树脂的摩尔比为6:1，用DMF溶解；称量DIEA，与树脂的摩尔比为8:1，将上述2种材料加入到多肽合成管中，震荡反应过夜。
(3)过夜反应后，加入100mL DMF洗涤3次，随后在加入甲醇，用来封闭氯树脂。
(4)封闭完成后，加入100mL DMF洗涤4次，中间2次洗涤过程中加入Fmoc，起保护作用。
(5)脱去保护后，称量Gly，与树脂的摩尔质量比为6:1；称量缩合试剂，与树脂的摩尔质量比为6:1，用DMF溶解后，再加入DIEA，在合成管中反应40min，加入100mL DMF洗涤3次后抽干。
(6)重复步骤(4)、(5)，直到接最后一个氨基酸(Arg)，脱去保护基团Fmoc，加入100mL DMF洗涤3次后抽干，得到干燥肽树脂。
(7)每克干燥肽树脂中加入20mL切割试剂，室温密闭反应3h。
(8)抽滤后得到滤液，将滤液转移到EP管中，加入10倍体积的乙醚，多肽析出后离心得到沉淀，弃去上清，重复3次得到多肽粗品。
(9)用高效液相色谱仪(HPLC)纯化多肽，最后冻干，称量。
该抗肿瘤多肽THP-24经HPLC分析，纯度达到95％以上(图1)，并经ESI-MS鉴定结构如图2所示。
实施例2
本实施例探究多肽THP-24对人肾癌细胞786-O和人正常肾上皮细胞HKC活性的影响，具体的实验步骤和结果如下：
将处于对数生长期的786-O和HKC贴壁细胞用胰酶消化下来，待大部分细胞脱落时，加培养基终止消化，收集细胞转移到离心管中，1000r/min，5分钟离心。弃去上清，用完全培养基重悬后计数，调整细胞密度为5*104个/ml，按100μl每孔的体积种入96孔板，细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育过夜贴壁。第二天分别加入终浓度为0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的多肽THP-24，放回培养箱继续孵育22小时后取出，每孔加入10μlCCK-8试剂，继续培养2小时，之后用酶标仪检测450nm处的吸光度，整合数据，计算得到每组的细胞存活率。
结果如图3所示，多肽THP-24在0-100μg/ml的浓度范围内以梯度依赖的形式对人肾癌细胞786-O具有明显的抑制作用，而对人正常肾小管上皮细胞HKC无影响。
实施例3
本实施例探究多肽THP-21对人肾癌细胞786-O增殖能力的影响，具体的实验步骤和结果如下：
将处于对数生长期的786-O贴壁细胞用胰酶消化下来，待大部分细胞脱落时，加培养基终止消化，收集细胞转移到离心管中，1000r/mim，5分钟离心。弃去上清，用完全培养基梯度稀释，最终稀释成细胞密度为1*104个/ml，吸取200μl加入6孔板中，添加完全培养基至2ml，摇晃分散均匀，细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育过夜贴壁。种板24小时后，待细胞完全贴壁后，每孔加入一定浓度的多肽THP-24，培养一周后，弃去旧培养基，用甲醇固定20分钟，随后用0.2％结晶紫染色15分钟，PBS清洗后自然风干，拍照计数。
结果如图4所示，多肽THP-24处理后，人肾癌细胞786-O的增殖能力显著减弱。
实施例4
本实施例探究多肽THP-24对人肾癌细胞786-O迁移能力的影响，具体的实验步骤和结果如下：
将处于对数生长期的786-O贴壁细胞用胰酶消化下来，待大部分细胞脱落时，加培养基终止消化，收集细胞转移到离心管中，1000r/min，5分钟离心。弃去上清，用完全培养基梯度稀释，最终稀释成细胞密度为3*105个/ml，将2ml每孔的体积种入12孔板，细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育，待细胞长满后，用200μl黄色灭菌枪头，垂直于板底画一条竖线。用PBS洗两遍，每孔加入500μl的完全培养基，放到显微镜下拍照记录，弃去旧的培养基，每孔加入含不同浓度多肽的培养基(含1％胎牛血清)，放回培养基继续孵育，6小时后镜下拍照观察记录。
结果如图5所示，多肽THP-24处理后，人肾癌细胞786-O的迁移能力显著减弱。
实施例5
本实施例验证多肽THP-24诱导人肾癌细胞786-O凋亡，具体的实验步骤和结果如下：
将处于对数生长期的786-O贴壁细胞用胰酶消化下来，待大部分细胞脱落时，加培养基终止消化，收集细胞转移到离心管中，1000r/min，5分钟离心。弃去上清，用完全培养基梯度稀释，最终稀释成细胞密度为1*105个/ml，将2ml每孔的体积种入12孔板，细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育，待细胞长满后，弃去旧培养基，更换含有多肽THP-24的培养基，作用24小时。取出12孔板，收集上清，用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞沉淀。用预冷的PBS重悬细胞，1500r/min，5分钟离心收集细胞沉淀，根据凋亡检测试剂盒的说明书加入相应试剂，混匀后，避光室温孵育5分钟，随后用BD流式细胞仪检测凋亡细胞的比例。
结果如图6所示，多肽THP-24处理后，大量人肾癌细胞786-O发生凋亡。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，为多肽THP-24，选自：
(1)具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多肽；和
(2)与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同源性至少为70％，且具有相同或相似功能的多肽。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述抗肿瘤多肽为与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同源性至少为80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，且具有相同或相似功能的多肽。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述抗肿瘤多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
4.如权利要求1-3任一项所述抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，包括采用固相合成法合成该抗肿瘤多肽的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)树脂溶胀：称氯树脂，加DMF/DCM溶胀30-60min，用DMF洗涤；
(2)接第一个氨基酸：将4-6倍摩尔过量的Leu用DMF溶解，将8-10倍摩尔过量DIEA转移至多肽合成管中，振荡反应过夜；
(3)封闭：过夜反应后，用DMF清洗，加甲醇封闭树脂；
(4)脱保护：封闭树脂后，同DMF洗涤，加哌啶脱保护两次中间用DMF洗涤；
(5)接下一个氨基酸Gly：脱保护后，称取4-6倍摩尔过量的Gly和4-6倍摩尔过量缩合试剂用DMF溶解，加入8-10倍摩尔过量DIEA进行反应；
(6)剩余氨基酸偶联：重复步骤(4)和步骤(5)，直到接最后一个氨基酸，脱保护；
(7)粗肽切割、层析并纯化。
6.如权利要求1-3任一项所述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物包括所述抗肿瘤多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肾细胞癌。
8.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的抗肿瘤多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤为肾细胞癌。
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