CN115838436A - 靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤的靶向治疗药物领域,尤其涉及靶向ITGβ5‑14‑3‑3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5‑X及其制备方法与用途。本发明提供一种靶向ITGβ5‑14‑3‑3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5‑X,由27个氨基酸组成,包含TAT透膜序列(YGRKKRRQRRR),其余全部的氨基酸序列ELDGDVNGHKFVEGE,即:Glu‑Leu‑Asp‑Gly‑Asp‑Val‑Asn‑Gly‑His‑Lys‑Phe‑Val‑Glu‑Gly‑Glu,其通过抑制ITGβ5‑14‑3‑3ζ复合物的形成迅速高效地抑制胰腺癌细胞生长及转移能力,从而发挥特异性靶向肿瘤细胞的治疗作用。另外,该多肽易于在体外合成,方便临床应用。因此,多肽B5‑X(以下简称为B)具有潜在的商业产业价值,可广泛应用于肿瘤靶向治疗技术领域之中。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤的靶向治疗药物领域,尤其涉及靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X及其制备方法与用途。
背景技术
近几十年来,随着人类平均寿命的增长、生活环境以及生活方式的改变,癌症已成为威胁人类生命健康的第一大杀手。其中胰腺癌是消化系统最致命的恶性肿瘤,预后差,死亡率高,是世界上第四大常见的癌症相关死亡原因。现有研究报告胰腺癌的主要危险因素包括高龄、吸烟、高脂肪饮食、糖尿病、慢性胰腺炎(特别是遗传性胰腺炎)和胰腺癌家族史阳性。尽管胰腺癌疾病的生物学的整体认识在不断扩大,但由于症状非特异性和缺乏早期检测方法,胰腺癌经常在晚期被诊断出来。在胰腺癌的综合治疗中,手术是主要的治疗方式,但是胰腺癌早期症状不典型、易发生转移等特点,超过80%的胰腺癌患者就诊时已经处于病灶无法根治性切除的阶段。事实上,胰腺癌患者即使接受了手术治疗,大多数胰腺癌患者死于肿瘤复发和转移,5年生存率仅为20%左右。基于吉西他滨的化疗已被用作不可切除胰腺癌患者的标准治疗,然而,常规应用单药或多药联用的化疗方案并未大幅度改善胰腺癌患者的预后。其他治疗方法如去间质治疗、基因治疗以及分子靶向治疗等,大多处于临床试验阶段,尚无强有力的证据证实其临床疗效。胰腺癌的发病是个复杂的多阶段发展的过程,是由多个肿瘤基因和分子之间协调作用共同导致了肿瘤细胞的形成和发展。因此,亟需对胰腺癌发生发展过程中关键分子及分子机制进行更深入的研究,寻找潜在的抗胰腺癌治疗新靶点,并为临床治疗胰腺癌提供新的方法和思路。
整合素是一个大型跨膜糖蛋白受体家族,由非共价连接的α亚基和β亚基组成的异源二聚体。通常大多数α亚基仅能与一种特异性的β亚基固定结合,但有些α亚基能够识别并结合多种不同的β亚基。不同的异源二聚体组合具有配体结合的特异性,可与其他分子的识别、粘附和结合,作为双向信号转导介质介导细胞内外的信息传递。在正常情况下,整合素在上皮细胞中均有表达并且执行其正常的生理功能,如参与调节细胞粘附、扩散、迁移、生存和分化等关键发育过程。然而,许多实体肿瘤起源于上皮细胞,这一恶性转变过程伴随着细胞整合素分子表达水平的改变,并且随着组织类型和进展程度的不同而存在差异。产生这一现象的原因,可能是某一种致癌基因表达异常后,直接增加某一整合素的活性或降低其他整合素的活性造成的;或者,鉴于转移性癌细胞往往需要适应肿瘤微环境的选择性压力,肿瘤细胞选择性地削弱使其维持在静息和分化状态的整合素分子,而强化有助于肿瘤细胞生存和转移的整合素分子。此外,整合素和整合素依赖的生物学过程在介导肿瘤的形成、生长、耐药和复发中起着重要作用。
整合素β5属于整合素β亚基,仅与αV亚基组合,可结合到细胞外基质(ECM)结构蛋白上的不同生物活性区域,以提供细胞骨架的机械稳定性,并启动细胞质信号级联。目前,大量的研究表明,ITGβ5异常表达在多种恶性肿瘤的起始和进展中发挥着重要功能。ITGβ5被确定为骨肉瘤细胞中Hippo通路的负调控因子,过表达ITGβ5的骨肉瘤患者有较高的肺转移风险。在我们的前期研究结果中,ITGβ5在胰腺癌组织中表达显著上调,并与肿瘤分化程度,pT 分期,pN 分期,毗邻脏器浸润,pTNM 分期等较差的临床病理参数和不良预后密切相关。此外,ITGβ5高表达促进了胰腺癌细胞生长和转移等多种生物学行为,加速了胰腺癌恶性进展。由于在不同癌细胞之间存在较大异质性,致使ITGβ5影响癌症进展的分子机制更加复杂。在卵巢癌和宫颈癌中,上调ITGβ5可促进FAK的磷酸化,进而诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化,促进肿瘤细胞的侵袭和迁移,从而加剧疾病进展。而在乳腺癌和宫颈癌细胞中,ITGβ5过表达激活粘着斑信号通路,导致糖酵解代谢进程紊乱,进而诱导肿瘤细胞对顺铂产生耐药性。此外,ITGβ5通过活化转化生长因子(TGF)-β/Smad信号转导通路,促进结直肠癌细胞发生上皮-间质转化。然而,在癌症细胞中,ITGβ5表达水平的异常升高可能是由转录后或翻译后过程失调引起的。MiR-185作为肝细胞癌中的关键抑制因子,其表达发生显著下调,致使下游靶基因ITGβ5在肿瘤细胞中表达增加,通过增强β-连环蛋白的稳定性来促进肿瘤细胞的生长和迁移。 Huang等人研究结果表明,c-Met可能通过ITGβ5与KRT16部分结合,这三个蛋白可能共定位形成稳定的复合物,促进c-Met和ITGβ5介导的OSCC细胞信号转导。
至今为止,已经有多种以整合素作为药物靶点的针对不同疾病的抑制剂进行临床试验。Etaracizumab(MEDI-522),一种针对整合素ανβ3的靶向药物,抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长。人αν整合素特异性单克隆抗体intetumumab (CNTO-95),同时靶向整合素ανβ3和ανβ5,在移植瘤模型中也显示出抗肿瘤和抗血管生成作用。ATN-161(整合素ανβ1拮抗剂)以及Volociximab,一种阻断整合素α5β1功能的单克隆抗体,已被证明可以抑制体外血管生成和小鼠肿瘤生长。西仑吉肽(Cilengitide)是一种含RGD的环状五肽,被认为是αvβ3和αvβ5整合素介导的细胞-基质相互作用的选择性抑制剂。在许多体内模型中,西仑吉肽已被证明具有抗癌活性,包括抑制肿瘤细胞的侵袭和转移以及全面抑制血管生成。在CENTRIC临床试验中,肿瘤或内皮细胞中靶整合素的差异表达与西伦吉肽治疗的结果无关。然而,这种治疗策略在临床试验中遇到了挑战,无论是单独使用还是与放化疗联用,整合素选择性抑制剂均未达到预期效果,需进一步研究和开发更有效的整合素特异性靶向药物。
蛋白质通常以蛋白质复合物的形式在体内发挥关键作用,也称为蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)。PPI分析有助于从系统的角度研究疾病的分子机制,发现新的药物靶点,称为当前的热点研究方向。已建立的蛋白质-蛋白质相互作用实验的策略包括:免疫沉淀(IP)与随后的Western blotting或基于质谱的结合伙伴识别、谷胱甘肽-转移酶(GST)-融合蛋白拉下(PD)、酵母双杂交、荧光共振能量转移(FRET)、蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)等。首先,我们通过免疫沉淀的方式富集胰腺癌细胞中与ITGβ5相互作用的蛋白分子,SDS-PAGE凝胶电泳分离共沉淀的蛋白质,后续执行蛋白质谱分析(LC/MS),获取胰腺癌细胞中与ITGβ5的相互作用蛋白。进一步与来自BioGRID数据库的预测的ITGβ5互作蛋白进行取交集分析。14-3-3蛋白是一个高度保守的酸性二聚体蛋白家族,在真核生物的多种细胞过程中都有涉及。14-3-3蛋白是一个高度保守的酸性二聚体蛋白家族,作为磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸结合蛋白与转录因子、信号分子、凋亡因子和肿瘤抑制因子相关,参与真核生物的许多细胞过程。14-3-3ζ是14-3-3蛋白家族成员中的一员,被认为与细胞癌变相关。据文献报道,14-3-3ζ蛋白作为一种细胞内适配器蛋白,与靶蛋白上的磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基结合,以不同的方式影响其结合伙伴的功能,包括刺激或抑制蛋白质相互作用、调节活性,改变蛋白质结构、影响蛋白质亚细胞定位和稳定性等。研究发现,在多种不同肿瘤组织中14-3-3ζ表达水平显著增加,如胶质母细胞瘤,卵巢癌,乳腺癌,结直肠癌等,其高表达与肿瘤患者预后不良密切相关。此外,已有报道显示14-3-3ζ亚型蛋白能够促进胰腺癌的生长和转移,与胰腺癌疾病进展、不良预后和化疗耐药密切相关。
蛋白质-蛋白质相互作用通过影响酶活性、蛋白质稳定性、亚细胞定位、复合物的形成等方面,进而控制细胞的多种生理及病理功能,特异性靶向阻断蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂正作为一种新的癌症治疗策略被广泛研究。肽是短链氨基酸序列通过脱水缩合反应形成酰胺键或肽键相互连接的寡聚体,由于其低毒、易合成、消除快、副作用小等优点,使多肽抗肿瘤药物受到越来越多的关注,成为优于其他生物制剂和小分子药物的治疗选择。此外,据2010年报道,基于自体树突状细胞的sipuleucel-T疫苗降低了转移性去势抵抗性前列腺癌的死亡风险,是全球首个美国食品和药物监督管理局(FDA)批准的治疗性癌症疫苗。自此,世界各地大量研究人员探索了多肽疗法在黑色素瘤、恶性胶质瘤、乳腺癌和胃癌等众多恶性肿瘤中的作用。
综上所述,设计靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的多肽可能为肿瘤治疗研究提供新的思路和方法,有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明提供一种基于ITGβ5-14-3-3ζ复合物而设计的多肽药物B5-X,以及它们在包括胰腺肿瘤在内的众多肿瘤治疗药物中的应用,特别涉及B5-X通过干扰ITGβ5-14-3-3ζ复合物的形成,抑制肿瘤细胞的生长和转移,发挥肿瘤靶向治疗的作用。
本发明的第一目的在于提供一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X。
本发明的第二目的在于提供靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X在制备抗肿瘤产品中的用途。
本发明通过以下技术方案进行实现:
一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X,由27个氨基酸组成,包含TAT透膜序列(YGRKKRRQRRR),其余全部的氨基酸序列ELDGDVNGHKFVEGE,即::SEQ ID NO.1:Glu-Leu-Asp-Gly-Asp-Val-Asn-Gly-His-Lys-Phe-Val-Glu-Gly-Glu。
进一步的,所述的一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X的制备方法,包括如下步骤:
1)、称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g)于150 ml的反应器中,用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡;
2)、2小时后,用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂,然后抽干,如此重复四次,将树脂抽干后待用;
3)向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次,然后抽干;
4)、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),树脂有颜色,说明脱保护成功;
5)、称取C端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中,加入20ml的DMF将其溶解,然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min,待溶液澄清后加入到反应器中,然后将反应器置于30℃的摇床中反应;
6)、2小时后,用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA : DCM=1:1:2)半小时,然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次,抽干待用;
7)、向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次,然后抽干;
8)、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),树脂有颜色,说明脱保护成功;
9)、称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50 ml的离心管中,加入25 ml的DMF将其溶解,然后加入2.5 ml的DIC振荡摇匀1min,待溶液澄清后加入到反应器中,然后将反应器置于30℃的摇床中反应;
10)、1小时后,取少量树脂检测,用茚三酮法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),若树脂为无色,说明反应完全;若树脂有颜色,说明缩合不完全,继续反应;
11)、待反应完全后,用DMF洗涤树脂四次,然后抽干,向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次,然后抽干检测保护是否脱去;
12)、按照步骤9)-11)依次接剩余的氨基酸;
13)、待接上最后一个氨基酸后,脱去保护,用DMF洗涤四次,然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水=95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液),并用冰乙醚(切割液:乙醚=1:9)离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化,再冻干,得到一定纯度的多肽。
一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X在制备肿瘤诊断诊断产品中的应用,其特征在于,所述产品包括基因芯片、制剂、探针或试剂盒。
进一步的,所述多肽干扰肿瘤细胞中ITGβ5和14-3-3ζ的结合,用于肿瘤细胞特异性靶向。
一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X在制备治疗肿瘤药物中的应用。
进一步的,所述药物中的多肽为天然分离、化学合成或生物工程方法制备得到的。
一种药物组合物,包括所述靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X和能抑制肿瘤细胞生长及转移的制剂。
进一步的,所述靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X作为靶向多肽,与能抑制肿瘤细胞的生长及转移的制剂相缀合或混合;所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种;所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、抗血管新生药物/酪氨酸激酶受体抑制剂/西妥昔单抗/曲妥珠单抗等靶向药物、抗PD-1/PD-L1单抗等免疫抑制剂、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。
进一步的,所述载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种,或者由多种油性化合物组成的混合物。
上述所述肿瘤为肝癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、大肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌中的任意一种,优选为胰腺癌。
本发明的有益技术效果在于:本发明提供了一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的多肽B5-X,其通过抑制ITGβ5-14-3-3ζ复合物的形成迅速高效地抑制胰腺癌细胞生长及转移能力,从而发挥特异性靶向肿瘤细胞的治疗作用。另外,该多肽易于在体外合成,方便临床应用。因此,多肽B5-X(以下简称为B)具有潜在的商业产业价值,可广泛应用于肿瘤靶向治疗技术领域之中。
附图说明
图1为本发明多肽BX-5的高效液相色谱法分析图。
图2为本发明多肽BX-5的质谱分析图。
图3为共聚焦显微镜观察多肽B进入细胞图。
图4为Edu实验检测多肽B对人胰腺癌细胞系Capan-2增殖能力影响图。
图5为集落形成实验检测多肽B对人胰腺癌细胞系Capan-2克隆生长能力的影响图。
图6为Transwell实验检测多肽B对人胰腺癌细胞系Capan-2迁移及侵袭能力的影响。
图7为裸鼠皮下移植瘤模型腹腔注射实验检测多肽B在体内的肿瘤抑制作用图;其中A图为裸鼠皮下异种移植瘤模型腹腔注射示意图;B-D图为NC和B5-X两组裸鼠(n=5)的肿瘤结节图像(B)和肿瘤体重(C)以及肿瘤体积(D);E图为两组裸鼠实验期间体重变化;F图为NC和B5-X两组小鼠心脏、肝脏和肾脏组织的HE染色;G图为NC和B5-X两组裸鼠肿瘤组织的14-3-3ζ和ITGβ5的免疫组化染色。
图8为免疫共沉淀中多肽B抑制survivin与XIAP结合图;其中A图为免疫共沉淀检测肿瘤细胞中ITGβ5与14-3-3ζ结合情况的结果;B图为免疫共沉淀检测多肽B对ITGβ5与14-3-3ζ结合的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明,以助于对本发明的了解,但这些实施例仅为了对本发明加以说明,本发明并不限于这些内容。
一、多肽B的合成、纯化及分子量测定
本发明抗肿瘤多肽B是根据ITGβ5上与14-3-3ζ结合的具体氨基酸序列,并在氨基端加上TAT透膜序列所得,其最终序列为ELDGDVNGHKFVEGE。选择一段不表达在人类细胞中的肽段作为验证本发明多肽B具有特异性抗肿瘤作用的对照,记为多肽NC,其最终序列为:ELDGDVNGHKFVEGE。
多肽B和NC均采用Fmoc固相肽合成法合成,简述如下:根据多肽序列使肽链从羧基端向氨基端逐个残基依次延申,待多肽合成后,用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水=95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液),并用冰乙醚(切割液:乙醚=1:9)离心沉降四次,然后用HPLC(Nexera UHPLC,岛津公司)分离纯化,再冻干,得到一定纯度的多肽,并利用质谱仪(LC3000,岛津公司)进行分子量大小鉴定。
合成过程。
1)、称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g)于150 ml的反应器中,用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡;
2)、2小时后,用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂,然后抽干,如此重复四次,将树脂抽干后待用;
3)向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次,然后抽干;
4)、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),树脂有颜色,说明脱保护成功;
5)、称取C端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中,加入20ml的DMF将其溶解,然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min,待溶液澄清后加入到反应器中,然后将反应器置于30℃的摇床中反应;
6)、2小时后,用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA : DCM=1:1:2)半小时,然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次,抽干待用;
7)、向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次,然后抽干;
8)、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),树脂有颜色,说明脱保护成功;
9)、称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50 ml的离心管中,加入25 ml的DMF将其溶解,然后加入2.5 ml的DIC振荡摇匀1min,待溶液澄清后加入到反应器中,然后将反应器置于30℃的摇床中反应;
10)、1小时后,取少量树脂检测,用茚三酮法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),若树脂为无色,说明反应完全;若树脂有颜色,说明缩合不完全,继续反应;
11)、待反应完全后,用DMF洗涤树脂四次,然后抽干,向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次,然后抽干检测保护是否脱去;
12)、按照步骤9)-11)依次接剩余的氨基酸;
13)、待接上最后一个氨基酸后,脱去保护,用DMF洗涤四次,然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水=95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液),并用冰乙醚(切割液:乙醚=1:9)离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化,再冻干,得到一定纯度的多肽。
如图1所示为多肽B的质谱鉴定结果,经质谱检测线性肽分子量大小为3609.16Da。
如图2所示为多肽B的HPLC分析结果,纯度均大于95%。
二、共聚焦显微镜下观察多肽能够进入细胞
将DAPI以1:1000的比例、FITC标记的多肽B和以20μM的浓度处理人胰腺癌细胞系Capan-230min后,在共聚焦显微镜下观察多肽进入细胞的情况。
图3所示为共聚焦显微镜下观察到多肽B和NC均能够快速进入细胞内,说明多肽具有良好的膜通透性。
三、EdU实验检测多肽B对肿瘤细胞增殖的影响
向处理后的细胞培养板中加入50 uM EdU溶液,室温孵育2h。使用4%多聚甲醛在37℃下固定细胞10分钟,然后用PBS洗涤3次,0.2%TritionX-100对细胞进行通透化处理10min。在培养板中加入100ul 1×Apollo染色反应液,黑暗条件下室温孵育30 min。最后,加入Hoechst3334反应液,室温孵育5min,荧光显微镜下观察。镜下随机选择3个视野拍照,计数EdU染色细胞和Hoechst33342染色。
图4所示为多肽B对人胰腺癌细胞系Capan-2的增殖能力的影响。结果显示,与NC多肽相比,多肽B显著抑制肿瘤细胞增殖,说明多肽B具有靶向肿瘤细胞的特异性抗肿瘤作用。
四、集落实验检测多肽B对肿瘤细胞克隆生长的作用
将处理后的细胞按照每孔400个细胞密度接种到12孔板中。培养两周,待每个集落中细胞数大于50个,将培养基丢弃,用PBS小心地冲洗两次,75%乙醇固定细胞10分钟,Wright-Giemsa染色法染色并拍照,用Image J软件统计集落数量。
图5所示为多肽B对人胰腺癌细胞系克隆生长能力的影响。结果表明,多肽B处理组与对照组相比,显著抑制胰腺癌细胞在体外的克隆生长的能力。
五、Transwell实验检测多肽B对肿瘤细胞迁移与侵袭的作用
对于迁移实验:将处理后的细胞用0.25%的胰酶进行消化,并用双无培养基清洗两次。计数后将SW1990和Capan-2细胞分别以3×104/200 uL,5×104/200 uL无血清培养基接种到上室,下室中加入500ul含有10 %胎牛血清培养基,在37℃、5% CO2条件下继续细胞培养。对于侵袭实验:用预冷的无血清培养基按1:30的比例稀释基质胶,向上室中加入50 uL稀释后的基质胶。在37℃下孵育1小时,以使基质胶凝固。后续操作同迁移实验。24小时后,取出小室,用75%乙醇固定,再用瑞氏-吉姆萨染色方法染色。染色结束后冲洗干净,正置荧光显微镜观察并拍照记录。
图6所示为多肽B对人胰腺癌细胞系迁移及侵袭能力的影响。结果表明,与对照组NC肽相比,多肽B可显著抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭,再次说明了该多肽具有显著的抗肿瘤的作用。
六、利用裸鼠移植瘤模型检测多肽B在体内的抗肿瘤作用
裸鼠皮下移植瘤模型腹腔注射: SPF级BALB/C雌性Balb/c裸鼠10只(4周龄),体重10-14g,购自北京维通利华实验动物科技有限公司。所有动物实验程序均经中国医科大学实验动物福利与伦理委员会批准。将1×107个Capan-2细胞悬浮在100ul PBS中,并经皮下注射到裸鼠的右腋窝。当肿瘤体积达到50-75 mm3左右时,将荷瘤裸鼠随机分为两组(n=5),B5-X多肽或NC多肽以200mg/kg的剂量经腹腔注射,每天一次,持续10天。给药期间,每隔一天用游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤的长度和宽度,并记录小鼠的体重。
图7所示为多肽B能够在体内抑制肿瘤细胞生长而无明显毒性作用,其中与NC组相比,多肽B肿瘤显著较小,而对裸鼠体重的监测结果显示,B组裸鼠体重与NC组无明显差异,由此可推断多肽B无明显的毒副作用。这一结果表明,多肽S在体内能够特异性抑制肿瘤细胞生长而对正常细胞无毒副作用。
七、免疫共沉淀验证多肽B能够抑制ITGβ5与14-3-3ζ结合
免疫共沉淀:废弃细胞上清液,用RIPA裂解液(含有1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂)裂解细胞以提取总蛋白。取出40ul作为Input组,加入3×上样缓冲液,95℃煮沸5分钟。将CO-IP和IgG蛋白样品分别与一抗和对照IgG在4℃孵育6 h,然后加入琼脂糖磁珠,在4℃旋转装置上孵育过夜。利用基础裂解液清洗磁珠4次,每次1min,4℃条件转速1000g。收集上清液,并加入等量的2×上样缓冲液,煮沸10分钟,冷却至室温,进行Western blot分析。
Western blot:根据目的蛋白的分子量,使用合适浓度SDS-PAGE凝胶通过电泳分离蛋白,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(恒压,70V-120分钟),转印结束后用,5%脱脂牛奶封膜1小时。根据厂家抗体说明书所示的目标蛋白分子量,将膜切成适当大小,与相应的蛋白一抗孵育过夜。待一抗封闭结束,1×TTBS洗4次,每次10 min,然后加入辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠(1:2000)或山羊抗兔(1:2000)二抗室温30 min,再用1×TTBS洗膜4次,用ECL法观察。
图8所示为免疫共沉淀检测多肽B能够抑制ITGβ5与14-3-3ζ结合,其中图8-A为ITGβ5能够与14-3-3ζ结合形成ITGβ5-14-3-3ζ复合物,图8-B为多肽B抑制ITGβ5与14-3-3ζ结合。结果显示,多肽B确实能够抑制ITGβ5-14-3-3ζ复合物的形成。
Claims (10)
1.一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X,其特征在于:所述多肽氨基酸序列如下所示:ELDGDVNGHKFVEGE。
2.根据权利要求1所述的一种靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X的制备方法,包括如下步骤:
1)、称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g)于150 ml的反应器中,用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡;
2)、2小时后,用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂,然后抽干,如此重复四次,将树脂抽干后待用;
3)向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团,脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次,然后抽干;
4)、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),树脂有颜色,说明脱保护成功;
5)、称取C端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中,加入20ml的DMF将其溶解,然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min,待溶液澄清后加入到反应器中,然后将反应器置于30℃的摇床中反应;
6)、2小时后,用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA : DCM=1:1:2)半小时,然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次,抽干待用;
7)、向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4),放在脱色摇床上摇晃20 min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团,脱完保护后用DMF洗涤四次,然后抽干;
8)、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),树脂有颜色,说明脱保护成功;
9)、称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50 ml的离心管中,加入25 ml的DMF将其溶解,然后加入2.5 ml的DIC振荡摇匀1min,待溶液澄清后加入到反应器中,然后将反应器置于30℃的摇床中反应;
10)、1小时后,取少量树脂检测,用茚三酮法检测(检A、检B各两滴,100℃反应1min),若树脂为无色,说明反应完全;若树脂有颜色,说明缩合不完全,继续反应;
11)、待反应完全后,用DMF洗涤树脂四次,然后抽干,向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4),放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团,脱完保护后用DMF洗涤四次,然后抽干检测保护是否脱去;
12)、按照步骤9)-11)依次接剩余的氨基酸;
13)、待接上最后一个氨基酸后,脱去保护,用DMF洗涤四次,然后用甲醇将树脂抽干,然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水=95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液),并用冰乙醚(切割液:乙醚=1:9)离心沉降四次,最后用HPLC分离纯化,再冻干,得到一定纯度的多肽。
3.根据权利要求1所述的靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X在制备肿瘤诊断诊断产品中的应用,其特征在于,所述产品包括基因芯片、制剂、探针或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述多肽干扰肿瘤细胞中ITGβ5和14-3-3ζ的结合,用于肿瘤细胞特异性靶向。
5.根据权利要求1所述的靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X在制备治疗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X在制备治疗肿瘤药物中的应用,其特征在于:所述药物中的多肽为天然分离、化学合成或生物工程方法制备得到的。
7.一种药物组合物,包括所述靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X和能抑制肿瘤细胞生长及转移的制剂。
8.根据权利要求7所述一种药物组合物,所述靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X作为靶向多肽,与能抑制肿瘤细胞的生长及转移的制剂相缀合或混合;所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种;所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、抗血管新生药物/酪氨酸激酶受体抑制剂/西妥昔单抗/曲妥珠单抗等靶向药物、抗PD-1/PD-L1单抗等免疫抑制剂、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。
9.根据权利要求7所述一种药物组合物,还包括与所述的多肽相缀合或混合能制备靶向药物的载体,其特征在于,所述载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种,或者由多种油性化合物组成的混合物。
10.如权利1-9所述的肿瘤,其特征在于,所述肿瘤为肝癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、大肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌中的任意一种,优选为胰腺癌。
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