CN108727459B

CN108727459B - 雷公藤红素适配子偶合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN108727459B
Application number: CN201710266984.1A
Authority: CN
Inventors: 刘振丽; 张保亭; 刘彪; 鲁军; 吕诚
Original assignee: Beijing Heli Consulting Co ltd
Current assignee: Beijing Heli Consulting Co ltd
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: CN108727459A

Abstract

本发明涉及制药领域，具体涉及一种雷公藤红素适配子偶合物及其制备方法和应用，所述雷公藤红素适配子偶合物具有以下结构(I)：

其中，M为AS1411。本发明雷公藤红素适配子偶合物，具有更好的水溶性、更高的生物利用度、更低肝脏毒副作用、抗癌活性强的特点。其合成工艺更加简单，合成条件更为宽松，大大降低了合成难度，节约了成本，分离纯化相对容易，产率更高，更容易实现产业化，效果更好。

Description

雷公藤红素适配子偶合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种雷公藤红素适配子偶合物及其制备方法和应用。

背景技术

雷公藤，又名断肠草，卫矛科雷公藤属木质藤本植物，分布于长江流域以南及西南地区，性寒，味苦，有大毒。雷公藤红素(Celastrol)是从传统中药雷公藤的根皮部位分离得到的醌甲基三萜类物质，又名雷红素，是雷公藤中除了雷公藤甲素(Triptolide)之外的又一主要有效成分。

雷公藤红素(Celastrol)的化学结构式如下：

雷公藤红素为醌甲基三萜类化合物、红色针状晶体，不溶于水，易溶于多种有机溶剂，在二甲基亚砜中溶解度10g·L^-1，也可溶于无水乙醇、甲醇等有机溶剂；具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤等诸多活性，广泛应用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎和肿瘤等。

雷公藤红素还具有极其显著的抗肿瘤活性。研究表明，雷公藤红素可体外可诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌、胃癌等，体内可抑制肿瘤生长和肿瘤细胞转移，包括血液学肿瘤、恶性肿瘤和实体瘤。体外研究表明，雷公藤红素在极低浓度(2-10ng/ml)下即可有效抑制肿瘤细胞增殖。除此之外，雷公藤红素还可对抗肿瘤耐药，同时提高肿瘤细胞对其它抗癌药物的敏感性，与化疗药物和放射疗法相结合发挥协同效应。雷公藤红素对血管的生成有明显的抑制作用，有可能成为有效的血管生成抑制剂。有学者研究表明，红素可以通过下调bFGF的蛋白表达有效抑制血管内皮细胞株(ECV)增殖，从而抑制ECV体外迁移和小管形成；雷公藤红素(celastrol)可通过控制癌细胞的蛋白酶体进而诱发癌细胞凋亡的抑制剂，体外的抗癌机制研究证实：雷公藤红素能够使SHG-44细胞Bax表达增加，bcl-2表达下降，从而促进肿瘤细胞凋亡，有效地抑制裸鼠前列腺癌的增生；还有文献报道，雷公藤红素可将人结肠癌细胞、人急性早幼粒白血病细胞、多发性骨髓瘤细胞等细胞周期阻滞于G₀/G₁期，且有学者认为雷公藤红素是通过调P-Akt和Cyclin D₁蛋白表达而诱导细胞周期阻滞于G₀/G₁期，可见雷公藤红素是种有潜力的细胞周期特异性药物。

尽管雷公藤红素具有显著的抗肿瘤活性，但其本身水溶性差、生物利用度低、毒性较强、治疗窗窄等缺陷限制了其临床应用。

适配子(aptamer)是一类具有治疗作用的寡核苷酸，能与靶蛋白发生特异性、高亲和力的结合，其功能类似单克隆抗体。可通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)进行体外筛选、扩增和富集。适配子在实际应用中具有许多优点：高亲和力和高特异性；分子量小，稳定性好，对环境温度不敏感，易保存；易合成，易修饰，提高了其在临床诊断和治疗中的应用。适配子的易标记性使其在诊断中更具灵活性，可以利用核酸适配子检测蛋白、细胞及分子成像，具有良好的敏感性和特异性。适配子可直接作为药物治疗疾病，部分适配子在与其对应的靶序列特异结合时，结合位点为蛋白的功能区域，蛋白功能将会被抑制。适配子还可作为药物运输载体，将药物与适配子相连使之具有细胞选择性，避免对正常组织和细胞的毒副作用。

AS1411是一种富含鸟嘌呤结构的寡聚核苷酸(GROs)，能形成稳定的G-四联体结构，有效对抗细胞内核酸酶降解，序列为5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。

AS1411可与肿瘤细胞表面高表达的核仁素特异性结合，同时膜表面的核仁素又能促进肿瘤细胞对AS1411的大胞饮作用，增加摄取量。众多研究表明，AS1411具有广谱的抗肿瘤活性，通过研究其对80多种人类细胞系的抗增殖活性，发现几乎对所有的肿瘤细胞增殖都有很好的抑制作用，IC₅₀达到微摩尔级，该浓度对正常细胞的影响很弱。AS1411的抗肿瘤活性机制主要涉及入核后阻遏细胞DNA复制，使细胞周期停滞于S期，从而抑制肿瘤细胞增殖。作为目前研究最为深入的抗肿瘤核酸适配子之一，AS1411现已进入II期临床试验阶段。一系列临床前试验和临床试验数据证实，AS1411作为肿瘤靶向性配体的安全性和可行性毋庸置疑。在毒性实验中，通过尸检观察，组织病理学和临床化学分析，无论急慢性毒性动物模型，还是高低剂量给药，均未观察到毒性反应。药代动力学研究表明，AS1411通过肾脏代谢，以二相方式清除，一部分在5h内快速随尿液清除，另一部分在血浆和全血中的半衰期为2天。体内组织分布实验表明，AS1411可大量地选择性聚集于肿瘤部位。I期临床实验结果表明，AS1411具有很好的耐受性，接受低剂量连续给药数天的晚期肿瘤患者并未出现任何严重的不良反应。早期临床试验证实了AS1411的安全性后，II期临床试验进一步提高给药剂量并延长考察周期，结果证明当血药浓度达到峰值并且接近于癌细胞系体外IC₅₀的给药剂量时，毒性反应依然非常弱。

WO2015085447A公开了一种新的雷公藤甲素衍生物及其制备方法和用途，其公开了雷公甲素衍生物与适配子的偶合物。相对而言、雷公藤甲素适配子肝脏毒性较大、原料成本高、合成工艺复杂、条件苛刻。

目前尚未发现与雷公藤红素与适配子偶合的相关的记载或报道，虽然雷公藤红素和雷公藤甲素均为雷公藤的主要有效成分，但两种化合物不但化学结构上差距很大，其功效与作用部位也不同。

因此、有必要开发一种疗效好、肝脏毒性更低、结构更加简单、合成条件更加温和、成本更低的偶合物。

发明内容

针对以上技术现状，本发明提供一种新的雷公藤红素适配子偶合物，所述偶合物具有以下结构(Ⅰ)：

其中M为AS1411适配子，AS1411和雷公藤红素耦合后，AS1411氨基上失去一个氢。

本发明在不影响雷公藤红素本身活性的前提下对雷公藤红素进行结构修饰，以核酸适配子(Aptamer)与雷公藤红素(Celastrol)为起始物料，通过雷公藤红素上含有的羧基与核酸适配子的氨基进行缩合形成酰胺键链接，从而使雷公藤红素和适配子直接偶合，而无须桥接键，减少了化学结构修饰，节约原料，减低成本，简化了合成操作，并提高了其水溶性以及生物活性。

作为实施方案之一，本发明还提供一种雷公藤红素AS1411偶合物的制备方法，所述方法包括：以核酸适配子(Aptamer)与雷公藤红素(Celastrol)为起始物料，通过雷公藤红素上含有的羧基直接与适配子的氨基进行缩合形成酰胺键链接。

作为实施方案之一，本发明所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法包括：

将溶于dd-H₂O中的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称“Sulfo-NHS”)、N-羟基琥珀酰亚胺(简称“NHS”)或N-羟基苯并三氮唑(简称“HOBT”)加入溶有雷公藤红素与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称“EDC”)、二环己基碳二亚胺(简称“DCC”)或N,N-二异丙基碳二亚胺(简称“DIC”)的N,N-二甲基甲酰胺(简称“DMF”)、二甲基亚砜(简称“DMSO”)或四氢呋喃(简称“THF”)溶液中，在40℃条件下反应2小时，即得雷公藤红素活化酯溶液；

将适配子溶于Na₂CO₃/NaHCO₃或KH₂PO₄/K₂HPO₄溶液中，加入雷公藤红素活化酯溶液，保持在0～60℃条件下，反应18～48小时，离心沉淀后，通过RP-HPLC分离纯化，即得目标产物雷公藤红素适配子偶合物。

作为实施方案之一，所述Na₂CO₃/NaHCO₃或KH₂PO₄/K₂HPO₄为0.5M的Na₂CO₃/NaHCO₃或KH₂PO₄/K₂HPO₄的溶液。

作为另一实施方案之一，本发明所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法包括：将溶于dd-H₂O中的1.2eq.N-羟基硫代琥珀酰亚胺加入溶有1.0eq.的雷公藤红素与1.3eq.的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在40℃条件下反应2小时，得雷公藤红素活化酯溶液；

将0.04eq.的适配子溶于0.5M Na₂CO₃/NaHCO₃溶液中，加入活化后的雷公藤红素活化酯溶液，保持在37℃条件下，反应24小时，离心沉淀后，通过RP-HPLC分离纯化，即得目标产物雷公藤红素适配子偶合物。

作为实施方案之一，本发明还提供一种雷公藤红素适配子偶合物的制备方法，所述方法包括：

在室温条件下，将1.0eq.雷公藤红素溶于DMF中，然后加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称“HATU”)和二异丙基乙基(简称“DIPEA”)，在室温条件反应，加入溶于水中的适配子，继续反应过夜，离心沉淀后，通过RP-HPLC分离纯化，即得目标产物雷公藤红素适配子偶合物。

作为实施方案之一，所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法包括：在室温条件下，将1.0eq.雷公藤红素溶于DMF中，然后加入1.1eq.2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和1.5eq.二异丙基乙基，在室温条件反应0.5小时后，加入溶于水中的0.04eq.适配子，在37℃条件下继续过夜反应，离心沉淀后，通过RP-HPLC制备分离纯化。

作为另一实施方案之一，本发明所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法中RP-HPLC制备分离纯化条件为：流动相A为:0.15％乙酸三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱；检测器为UV检测器，波长260nm；流速为1.5ml/min，柱温为40℃。

作为另一实施方案之一，本发明所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法中梯度洗脱条件为:5分钟内乙腈从5％到40％，3分钟内乙腈从40％到95％，保持95％2分钟。

本发明还提供一种雷公藤红素适配子偶合物在制备治疗括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌或胃癌的药物中的应用。

本发明通过核酸适配子修饰雷公藤红素，不仅可以有效解决雷公藤红素水溶性差问题，而且体外/体内试验研究显示核酸适配子修饰可有效提高雷公藤红素对肿瘤靶细胞的毒性作用，肿瘤部位聚集浓度，从而降低其在正常组织的蓄积降低毒副作用。

因此、本发明雷公藤红素AS1411偶合物具有水溶性好、生物利用度高、毒副作用低、抗癌活性强的特点。本发明的工艺简单，质量可控，重现性好，适于生产。

虽然本发明中雷公藤红素和雷公藤甲素都是雷公藤的主要有效成分，但两种化合物不仅在化学结构上差距很大、生物活性不同、功效与作用部位也各不相同；且雷公藤红素成本远远低于雷公藤甲素，目前相同规格和纯度的雷公藤红素的市场报价约为雷公藤甲素的价格十分之一；另外，雷公藤红素-AS1411偶合物比雷公藤甲素-适配子偶合物的合成工艺更加简单，合成条件更为宽松，大大降低了合成难度，同时也降低了合成成本；因此、雷公藤红素-AS1411适配子偶合物的合成步骤少，分离纯化相对容易，产率更高，更容易实现产业化。

更重要的是实验证明：本发明雷公藤红素AS1411适配子与雷公藤甲素适配子相比雷公藤红素-AS1411偶合物的肝脏毒性远低于雷公藤甲素-AS1411偶合物。在保持药物疗效的同时、显著降低了药物的肝脏毒性。

附图说明

图1：实施例1雷公藤红素-AS1411偶合物的HPLC图谱表征；

图2：实施例1雷公藤红素-AS1411偶合物的MS图谱表征；

图3：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对胰腺癌细胞系MIA PaCa-2的生长抑制作用；

图4：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对胰腺癌细胞系PANC-1的生长抑制作用；

图5：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对胰腺癌细胞系AspC-1的生长抑制作用；

图6：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对胰腺癌细胞系BxPC-3的生长抑制作用；

图7：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对卵巢癌细胞系OVCAR-3的生长抑制作用；

图8：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对卵巢癌细胞系SKOV-3的生长抑制作用；

图9：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制作用；

图10：实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的生长抑制作用；

图11：实验例2雷公藤红素-AS1411偶合物体外稳定性研究；

图12：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物体内稳定性研究；

图13：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在血浆中的分布规律；

图14：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在心脏中的分布规律；

图15：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在肝脏中的分布规律；

图16：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在脾脏中的分布规律；

图17：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在肺脏中的分布规律；

图18：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在肾脏中的分布规律；

图19：实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物在肿瘤中的分布规律；

图20：实验例4雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-适配子偶合物体内抗肿瘤活性比较；

图21：实验例5雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-适配子偶合物长期用药对小鼠血浆ALT水平的影响；

图22：实验例5雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-适配子偶合物长期用药对小鼠血浆AST水平的影响。

具体实施方式

以下实施例和实施例仅用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

实施例1

将溶于dd-H₂O中的1.2eq.N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称“Sulfo-NHS”)加入溶有1.0eq.的雷公藤红素与1.3eq的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称“EDC”)的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在40℃条件下反应2小时。0.04eq.的适配子溶于0.5M Na₂CO₃/NaHCO₃溶液中，加入活化后的雷公藤红素活化酯溶液，保持在37℃条件下，过夜反应24小时，离心沉淀后，通过RP-HPLC制备分离纯化，制备分离条件为：流动相A为:0.15％乙酸三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱；检测器为UV检测器，波长260nm；流速为1.5ml/min，洗脱梯度5分钟内乙腈从5％到40％，3分钟内乙腈从40％到95％，保持95％2分钟，柱温为40℃，得到目标产物雷公藤红素-核仁素核酸适配子偶合物(参见图1～2)。

实施例2

在室温条件下，将雷公藤红素(1.0eq,)溶于DMF中，然后加入1.1eq，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称“HATU”)和1.5eq.的二异丙基乙基(简称“DIPEA”)，在室温条件反应0.5小时后，加入溶于ddH₂O中的0.04eq.适配子，在37℃条件下继续反应24小时，过夜反应，离心沉淀后，通过RP-HPLC制备分离纯化。

制备分离条件为：流动相A为:0.15％乙酸三乙胺水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱；检测器为UV检测器，波长260nm；流速为1.5ml/min，洗脱梯度5分钟内乙腈从5％到40％，3分钟内乙腈从40％到95％，保持95％2分钟，柱温为40℃，得雷公藤红素-核仁素核酸适配子偶合物。

实验例

实验例1雷公藤红素-AS1411偶合物体外抗肿瘤活性考察

1.实验材料：

药物：雷公藤红素(Celastrol)，来源：市购；AS1411(又称“核仁素适配子”)，来源：市购；雷公藤红素-AS1411偶合物来源：采用实施例1制备；细胞培养用培基(DMEM、McCoy’s、RPMI-1640)购买于GIBCO，胎牛血清购买于GIBCO；CCK-8用于检测细胞活性，购自Sigma；4株胰腺癌细胞(MIAPaCa-2、PANC-1、BxPC-3、ASPC-1)，2株卵巢癌细胞(SKOV-3和OVCAR-3)和2株乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)均从中科院上海细胞库购买。

2.实验方法

1)细胞培养：

MIA PaCa-2、PANC-1的培养基为DMEM，BxPC-3、ASPC-1培养基为RPMI 1640培基。SKOV-3和OVCAR-3培养基为McCoy‘s 5A，MCF-7和MDA-MB-231培养基为DMEM。向以上培养添加胎牛血清和双抗，配成最终含量为10％和1％的完全培基。将细胞置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的孵育箱中培养。

2)抗肿瘤活性考察：

胰腺癌细胞(MIAPaCa-2、PANC-1、BxPC-3、ASPC-1)，卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR-3)和乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)以较低密度(1×10³～1×10⁴，具体数据取决于细胞系，培养条件参照上海细胞库)，均匀铺于96孔板，在培养箱中过夜使之贴壁，倒掉旧培基，更换含药培基。雷公藤红素溶于DMSO配成浓度为10mM的储备液，雷公藤红素-AS1411偶合物和AS1411，均溶于无血清培基配成10mM溶液，现配现用。以无血清培基作为空白对照，雷公藤红素、雷公藤红素-AS1411偶合物、AS1411给药终浓度梯度为：0、25、50、100、200nM。在温度为37℃、CO₂浓度为5％的孵育箱培育24h、48h。用MTT检测细胞活性，平行操作3次。

3.实验结果：

和空白对照相比，在50nM-200nM浓度范围内，雷公藤红素、雷公藤红素-AS1411偶合物能显著抑制胰腺癌细胞生长，具有时间和剂量的依赖性，其体外抗肿瘤效果优于吉西他滨。AS1411对胰腺癌细胞无明显作用。与AS1411组相比，雷公藤红素-AS1411偶合物对胰腺癌细胞的作用具有显著统计学差异，具体参见图3-6。此外，在50nM-200nM浓度范围内，雷公藤红素、雷公藤红素-AS1411偶合物还能显著抑制卵巢癌细胞和乳腺癌细胞生长，具有时间和剂量的依赖性。且雷公藤红素-AS1411偶合物的体外抗肿瘤活性明显优于雷公藤红素，具体参见图7-10。

实验例2雷公藤红素-AS1411偶合物体外稳定性考察

1、实验材料：

实验药品及试剂：雷公藤红素(Celastrol)，来源：市场购买；AS1411(又称“核仁素适配子”)，来源：市场购买；雷公藤红素-AS1411偶合物，来源：采用实施例1制备；

胎牛血清，磷酸盐缓冲液(PBS)，无水乙醇，生理盐水，乙酸乙酯，乙腈等。

实验仪器：超净工作台，CO₂培养箱，倒置显微镜，高速离心机，超速离心机，真空干燥器，高效液相色谱仪。

2.实验方法

2.1不同pH值缓冲液的配制

取PBS粉末磷酸盐缓冲液，溶于1000ml超纯水中，超声5min，充分溶解。各取200ml加入5个广口瓶内，在实验室pH计的测定下加入冰醋酸和NaHCO₃溶液调节pH值，分别为pH7.5，pH 7.0，pH 6.0，pH 5.0，pH 4.0(模拟人体生理环境和肿瘤细胞微酸性环境)。不同pH值缓冲液配制好后置于室温环境备用。

2.2雷红素-AS1411偶合物待测液的配制

各取200ul雷红素-AS1411偶合物母液，分别加入800ul不同pH值缓冲液和大鼠空白血浆，配制成不同pH值和血浆雷红素-AS1411偶合物待测液。

2.3 HPLC法检测雷红素-AS1411偶合物体外稳定性

稳定性是考察靶向药物能否进行递送至靶部位的重要指标。当药物进入体内后，血液中的成分往往会影响偶联药物的稳定性，所以在此模拟体内环境，对偶合物的稳定性进行考察。

具体方法如下：取血浆和不同pH值缓冲液中的雷红素-AS1411偶合物溶液，分别在2h，4h，8h，12h，24h，36h，48h取样进行反相高效液相色谱检测游离雷红素含量。计算雷红素-AS1411偶合物断裂释放出的雷红素占偶合物总量的比例。

3实验结果

图11是雷红素-AS1411偶合物在血浆和不同pH值缓冲液中的稳定性曲线。由图可知，随着孵育时间延长，血浆中游离雷红素含量保持稳定，并且一直处于较低水平，而在酸性环境中，游离雷红素含量逐渐升高。在同一时间点，游离雷红素含量在血浆和pH 7.5、pH7.0和pH 6.0缓冲液中较低，随着pH值降低，游离雷红素含量升高，当pH值降至5.0时，有超过50％的雷红素从偶合物中释放。由此可推断，酰胺键可确保雷红素-AS1411偶合物在血浆的生理pH环境中稳定存在，而进入肿瘤的酸性环境后即断裂，释放出其中偶联的雷红素，发挥抗肿瘤作用(参见表1)。

表1雷红素-AS1411偶合物在血浆和不同pH值缓冲液中的含量

实验例3雷公藤红素-AS1411偶合物体内分布考察

1.实验材料：

实验药品及试剂：雷公藤红素(Celastrol)，来源：市场购买；AS1411(又称“核仁素适配子”)，来源：市场购买；雷公藤红素-AS1411偶合物，来源：采用实施例1制备；RPMI1640培养基，胎牛血清，青霉素-链霉素，基质胶，无水乙醇，生理盐水，乙酸乙酯，乙腈等。

细胞：人源胰腺癌细胞系MIA PaCa-2。

实验动物：雌性裸鼠。

2.试验方法：

2.1胰腺癌肿瘤模型构建：

2.1.1 MIAPaCa-2细胞系培养：人源胰腺癌细胞系MIAPaCa-2购自中国科学院上海细胞库。细胞用含有10％的胎牛血清(购自sigma公司)和1.2ml/1000ml的青霉素-链霉素(购自sigma公司)的RPMI 1640培养基(购自sigma公司)，于5％CO₂，37℃的孵箱中进行培养。倒置显微镜对细胞进行形态观察和计数，所有的实验取对数生长阶段的细胞进行。

2.1.2人源胰腺癌细胞系MIAPaCa-2原位荷瘤裸鼠模型的建立：雌性裸小鼠由香港浸会大学中医药学院动物房提供并饲养。取对数生长期的MIAPaCa-2细胞，用50:50的基质胶和无血清培养基重悬至浓度为2×10⁷个/ml。选取体重20g左右，6-8周龄的雌性裸小鼠，于右侧背部皮下注射100μl细胞悬液进行接种。每天用双向游标卡尺测量肿瘤的大小，肿瘤体积计算公式如下：V＝(长x宽²)/2，长取肿瘤最长的直径，宽取垂直于长的最短的直径，肿瘤生长至200mm³时，进行后续试验。

2.2实验动物分组及给药

2.2.1受试药物配置：雷公藤红素和雷公藤红素-AS1411偶合物。称取雷公藤红素溶于50:50乙醇/生理盐水溶液中，配置成浓度为0.6mg/ml的药物溶液，置于4℃冰箱备用；称取雷公藤红素-AS1411溶于50:50乙醇/生理盐水中，配置成浓度为22.0mg/ml的药物溶液，置于4℃冰箱备用。

2.2.2实验分组及处理：肿瘤生长至200mm³时，将30只荷瘤小鼠，随机分为A，B组。

其中A组按0.6mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤红素的乙醇/生理盐水溶液；B组按22.0mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤红素-AS1411偶合物的乙醇/生理盐水溶液。给药体积均为5ml/kg。分别于0.5，2，6，12，和24h时，对每组3只老鼠采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，采用心脏穿刺取血，摘取心、肝、脾、肺、肾、实体瘤等组织。血样于4℃以3000rpm离心20min，取血清备用；心、肝、脾、肺、肾、实体瘤等组织于-80℃保存备用。

2.3 HPLC检测组织中雷公藤红素/雷公藤红素-AS1411偶合物含量

称取一定重量的组织(心，肝，脾，肺，肾，肿瘤)，加入一定比例的pH7.5PBS溶液，匀浆。取0.2ml匀浆到eppendorf管中，1.2ml乙酸乙酯涡流萃取3分钟，8000rpm离心5min。取上层有机溶液层(1ml)转移到另一个eppendorf管中真空干燥处理，残留物再溶入0.1ml乙醇，4℃下20000rpm离心10min。取上清液(10μl)注入安捷伦1100型高效液相色谱仪。色谱条件为：分离柱Symmetry ShieldTM RP18column(4.6mm×250mm，5um)，保护柱ODS guid column(3.9mm×20mm，5um)；流动相：乙腈-水(23：77)；流速1.0mL/min；柱温35℃；检测波长219nm；进样体积20.0uL。

2.4雷公藤红素-AS1411偶合物体内稳定性考察

取2.2.2中B组样品。通过2.3中已建立起方法的HPLC分别检测每个时间点各组织中游离的雷公藤红素和雷公藤红素-AS1411的浓度，并计算出释放率。计算公式：释放率＝(雷公藤红素浓度)/(雷公藤红素浓度+雷公藤红素-AS1411浓度)，定量考察药物在组织内的稳定性。

2.5雷公藤红素-AS1411偶合物组织分布考察

取2.2.2中A，B组样品。通过2.3中已建立好的HPLC方法进行监测，定量考察药物在正常器官、肿瘤组织的分布情况。

2.6统计学分析

实验数据采用平均值±标准差(SD)表示，数据处理采用Graphpad Prism6.0统计软件。差异显著性检验采用t检验和方差分析法进行。

3.实验结果：

3.1雷公藤红素-AS1411偶合物体内分布：各时间点雷公藤红素-AS1411偶合物在各组织中的解离度由HPLC法确定。考察结果如下。雷公藤红素-AS1411偶合物经过24小时后在血浆及心，肝，脾，肺，肾等正常组织中几乎不解离或解离得很少；而在肿瘤组织中，雷公藤红素-AS1411偶合物大量解离，并且随着时间的累积，解离度不断增加。偶合物在正常组织中不断裂，减小毒性；在肿瘤组织中断裂，释放出雷公藤红素，发挥治疗作用，参见表2及图12。

表2_雷公藤红素体内组织释放率(％)_

3.2雷公藤红素-AS1411偶合物体内选择性分布：采用HPLC定量检测药物在正常器官、肿瘤组织的分布情况。考察结果见图13-19。给药后0.5小时内，实验组A和对照组B在给药0.5小时内血药浓度迅速升高到顶峰，但是实验组A在血中消除速度要比对照组B慢(图13)。实验组A和阴性对照组B相比，药物在心脏，脾脏，肺部三个组织部位的分布趋势在考察全时间段内都相似(都换算为雷公藤红素的浓度)。在给药后0.5-2小时内，雷公藤红素迅速向心，脾，肺三个组织分布，给药后4小时开始消除(图14-17)。

相反地，实验组A和阴性对照组B相比，药物在肝脏，肾脏和肿瘤三个组织部位的分布趋势有很大的不同(都换算为雷公藤红素的浓度)。实验组A分布在肝，肾组织的雷公藤红素的浓度明显要比对照组B低，而分布在肿瘤部位的雷公藤红素的浓度要比对照组B高出很多(图15-19)。以上结果说明AS1411的修饰作用能促使雷公藤红素选择性向肿瘤部位积聚，而避免了在其它组织，尤其是肝肾组织累积。参见表3及图13-19

表3雷公藤红素-AS1411偶合物体内选择性分布数据

实验例4雷公藤红素-AS1411偶合物体内药效评价

1.实验材料：

实验药品及试剂：雷公藤红素(Celastrol)，来源：市场购买；AS1411(又称“核仁素适配子”)，来源：市场购买；雷公藤红素-AS1411偶合物，来源：采用实施例1制备；雷公藤甲素-AS1411偶合物，由项目组制备；RPMI1640培养基，胎牛血清，青霉素-链霉素，基质胶，无水乙醇，生理盐水等。

细胞：人源胰腺癌细胞系MIAPaCa-2。

实验动物：雌性裸鼠。

实验仪器：超净工作台，CO₂培养箱，倒置显微镜，高速离心机，真空干燥器。

2.试验方法：

2.1胰腺癌肿瘤模型构建：

2.2实验动物分组及给药

2.2.1受试药物配置：称取雷公藤红素溶于50:50乙醇/生理盐水溶液中，配置成浓度为0.3mg/ml的药物溶液，置于4℃冰箱备用；分别称取雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-AS1411偶合物溶于50:50乙醇/生理盐水中，配置成浓度为11.0mg/ml的药物溶液，置于4℃冰箱备用。

2.2.2实验分组及处理：肿瘤生长至200mm³时，将24只荷瘤小鼠，随机分为A，B，C和D组。

其中A组按5ml/kg的剂量注射乙醇/生理盐水，B组按0.3mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤红素的乙醇/生理盐水溶液；C组按11.0mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤红素-AS1411偶合物的乙醇/生理盐水溶液；D组按11.0mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤甲素-AS1411偶合物的乙醇/生理盐水溶液。给药体积均为5ml/kg。给药时间为3天一次，给药次数为10次。给药期间，每天观察动物状态，每4天测量肿瘤大小并称量小鼠体重。末次给药3天后，采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉老鼠，摘取实体瘤等组织，称重。2.6统计学分析

3实验结果

药物治疗之后，与溶剂对照组(A组)相比，所有治疗组(B，C，和D组)肿瘤重量都小于A组，有统计学差异；雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-AS1411偶合物治疗组小鼠肿瘤重量都小于雷公藤红素组，有统计学差异，表明AS1411修饰能显著增强雷公藤红素的抗肿瘤疗效。但是雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-AS1411偶合物治疗组并无太大差异，表明二者的抗肿瘤活性相当。(参见图20及表4)

表4雷公藤红素-核仁素适配子偶合物体内药效评价肿瘤称重表

实验例5雷公藤红素-AS1411偶合物肝毒性评价

1.实验材料：

实验药品及试剂：雷公藤红素(Celastrol)，来源：市场购买；AS1411(又称“核仁素适配子”)，来源：市场购买；雷公藤红素-AS1411偶合物，来源：采用实施例1制备；雷公藤甲素-AS1411偶合物，由项目组制备；无水乙醇，生理盐水等。

实验动物：雌性Balb/C小鼠。

2.试验方法：

2.1受试药物配置：称取雷公藤红素溶于50:50乙醇/生理盐水溶液中，配置成浓度为0.9mg/ml的药物溶液，置于4℃冰箱备用；分别称取雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-AS1411偶合物溶于50:50乙醇/生理盐水中，配置成浓度为33.0mg/ml的药物溶液，置于4℃冰箱备用。

2.2实验分组及处理：将32只Balb/C小鼠，随机分为A，B，C和D组。

其中A组按5ml/kg的剂量注射乙醇/生理盐水，B组按0.9mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤红素的乙醇/生理盐水溶液；C组按33.0mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤红素-AS1411偶合物的乙醇/生理盐水溶液；D组按33.0mg/kg剂量尾静脉注射雷公藤甲素-AS1411偶合物的乙醇/生理盐水溶液。给药体积均为5ml/kg。给药时间为3天一次，给药次数为20次。给药期间，每天观察动物状态，每4天称量小鼠体重。末次给药3天后，采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉老鼠，心脏穿刺取血，用于检测ALT和AST水平；摘取肝脏组织，称重并完成组织病理学检查。

2.3统计学分析

实验数据采用平均值±标准差(SD)表示，数据处理采用Graphpad Prism 6.0统计软件。差异显著性检验采用t检验和方差分析法进行。

3实验结果

药物处理之后，雷公藤红素组血清ALT和AST水平明显高于溶剂对照组，有统计学差异；雷公藤红素-AS1411偶合物和雷公藤甲素-AS1411偶合物组小鼠血清中ALT和AST水平明显低于雷公藤红素组，有统计学差异，表明AS1411修饰能降低雷公藤红素和雷公藤甲素的肝脏毒性。

但是，值得注意的是，雷公藤红素-AS1411偶合物组血清ALT和AST水平显著低于雷公藤甲素-AS1411偶合物，且有显著地统计学差异，表明雷公藤红素-AS1411偶合物的肝脏毒性低于雷公藤甲素-AS1411偶合物。(参见图21-22及表5)

表5雷公藤红素-核仁素适配子偶合物肝毒性评价小鼠血样转氨酶水平

Claims

1.一种雷公藤红素适配子偶合物，其特征在于，所述偶合物具有以下结构(Ⅰ)：

其中M为AS1411。

2.权利要求1所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将溶于dd-H₂O中的N-羟基硫代琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三氮唑加入溶有雷公藤红素与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺的N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃溶液中进行反应，得雷公藤红素活化酯溶液；

将适配子溶于Na₂CO₃/NaHCO₃或KH₂PO₄/K₂HPO₄溶液中，加入雷公藤红素活化酯溶液，保持在0～60℃条件下，反应18～48小时，离心沉淀后，通过RP-HPLC分离纯化，即得雷公藤红素适配子偶合物，其中所述适配子为AS1411。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法中Na₂CO₃/NaHCO₃或KH₂PO₄/K₂HPO₄为0.5M的Na₂CO₃/NaHCO₃或KH₂PO₄/K₂HPO₄的溶液。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将溶于dd-H₂O中的1.2eq.N-羟基硫代琥珀酰亚胺加入溶有1.0eq.的雷公藤红素与1.3eq.的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在40℃条件下反应2小时，得雷公藤红素活化酯溶液；

将0.04eq.的适配子溶于0.5M Na₂CO₃/NaHCO₃溶液中，加入活化后的雷公藤红素活化酯溶液，保持在37℃条件下，过夜反应，离心沉淀后，通过RP-HPLC分离纯化，即得目标产物雷公藤红素适配子偶合物。

5.权利要求1所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

在室温条件下，将雷公藤红素溶于N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和二异丙基乙基，在室温条件反应，加入溶于水中的适配子，继续反应过夜，离心沉淀后，通过RP-HPLC制备分离纯化，即得目标产物雷公藤红素适配子偶合物。

6.根据权利要求5所述雷公藤红素适配子偶合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

在室温条件下，将1.0eq.雷公藤红素溶于DMF中，然后加入1.1eq.2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和1.5eq.的二异丙基乙基，在室温条件反应0.5小时后，加入溶于水中的0.04eq.适配子，在37℃条件下继续反应24小时，过夜反应，离心沉淀后，通过RP-HPLC分离纯化，即得目标产物雷公藤红素适配子偶合物。

7.根据权利要求2～6任一所述的方法，其特征在于，所述方法中RP-HPLC制备分离纯化条件为：流动相A为:0.15％乙酸三乙胺水溶液,流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱；检测器为UV检测器；波长260nm；流速为1.5ml/min；柱温为40℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中梯度洗脱条件为:5分钟内乙腈从5％到40％，3分钟内乙腈从40％到95％，保持95％2分钟。

9.权利要求1所述雷公藤红素适配子偶合物在制备治疗卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌或胃癌的药物中的应用。