CN105343888B - 箭根酮内酯环糊精包合物及其制备方法，以及一种药物组合物 - Google Patents

箭根酮内酯环糊精包合物及其制备方法，以及一种药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比为1：(3～100)。本发明通过将箭根酮内酯与环糊精化合物进行包合得到箭根酮内酯环糊精包合物，大大提高了箭根酮内酯的水溶性以及稳定性，对肿瘤细胞株A498、769‑P、Caki‑1、ACHN、A2780、HepG2、Hep‑3B、Huh‑7、HEK‑293和786‑O的增值活性均具有较强抑制作用。

Description

箭根酮内酯环糊精包合物及其制备方法，以及一种药物组 合物
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种箭根酮内酯环糊精包合物及其制备方法，以及一种药物组合物。
背景技术
20世纪90年代，以紫杉醇为代表的微管稳定剂是治疗乳腺癌、卵巢癌和其他实体瘤最有效的药物，它们可以通过促进微管蛋白聚集，阻断微管蛋白的解聚，从而破坏快速分化的肿瘤细胞的有丝分裂，最终使肿瘤细胞产生凋亡。但是，由于其水溶性差、易产生多药耐药性等问题，限制了其应用。于是，寻找新型微管稳定剂成了各国学者广泛关注的热点。
20世纪80年代，陈仲良等从广西产裂果薯的根茎中最先分离得到了一系列具有新型五环甾体28碳骨架的箭根薯酮内酯类化合物，其中，箭根薯酮内酯A的含量达到了0.15％。21世纪初美国学者Mooberry等研究发现箭根薯酮内酯类化合物具有稳定微管蛋白的作用，但是与紫杉醇类微管稳定剂相比，它们并不是直接作用于微管，而是具有一个特殊的作用靶点和完全不同的微管稳定作用机制[Tinley TL，et al.Cancer Research,2003,63:3211–3220.]，另外，体内药效学研究发现该类化合物对紫杉醇耐药瘤株具有较强的抑瘤活性，从而显示出一定的应用开发前景[Risinger AL,Mooberry SL,Cancer Letters,2010,291:14-19；Risinger AL,Giles FJ,Mooberry SL,Cancer Treatmen Reviews,2009,35:255-261]。
目前，箭根酮内酯类化合物已经分离得到30多个。箭根薯属植物在我国有六种，其中较常见并作药用的有长须果和裂果薯(又称水田七)。长须果生长于滇、桂、粵、琼沟谷热带雨林，药性苦辛、凉，有小毒，具有清热解毒、理气止痛等功效，用于治疗泻痢、胃痛、咽痛、肺炎、疟疾、疮伤、烧伤等。裂果薯产于滇、桂、粵、琼、湘南、赣南等地区，药性苦寒，具有清热解毒、散瘀止痛等功效，用于治疗咽喉痛、痈肿、牙痛、肠炎、肺癆、胃痛、跌打和烧伤等。
但是由于箭根酮内酯衍生物为脂溶性化合物，其制剂应用尤其是注射给药受到限制；并且箭根酮内酯类衍生物在水溶液中非常不稳定，进一步限制了其临床应用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种箭根酮内酯衍生物环糊精包合物及其制备方法，以及一种药物组合物，制备的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物具有良好的水溶性以及稳定性。
本发明提供了一种箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比为1：(3～100)。
优选的，所述箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比为1：(10～30)。
优选的，所述箭根酮内酯衍生物选自式(3)～式(5)所示化合物中的任意一种，
优选的，所述箭根酮内酯衍生物为式(4)所示化合物。
优选的，所述环糊精选自β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物中的任意一种。
优选的，所述环糊精为羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精。
本发明还提供了一种上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物的制备方法，包括：在40℃～78℃条件下，将环糊精化合物与箭根酮内酯衍生物在乙醇中混合、反应至溶液澄清，除去溶剂得到箭根酮内酯衍生物环糊精包合物。
优选的，除去溶剂得到箭根酮内酯衍生物环糊精包合物后，还包括对得到的包合物进行冷冻干燥。
本发明还提供了一种药物组合物，包括上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或上述制备方法制备得到的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
优选的，所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂或注射剂。
本发明还提供了一种上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照上述制备方法制备得到的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或上述药物组合物来制备用于稳定微管蛋白的药品的用途。
本发明还提供了一种使用上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照上述制备方法制备得到的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或上述药物组合物来制备用于治疗肾癌的药品的用途。
与现有技术相比，本发明提供了一种箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比为1：(3～100)。本发明通过将箭根酮内酯与环糊精化合物进行包合得到箭根酮内酯环糊精包合物，大大提高了箭根酮内酯的水溶性以及稳定性，对肿瘤细胞株A498、769-P、Caki-1、ACHN、A2780、HepG2、Hep-3B、Huh-7、HEK-293和786-O的增值均具有较强抑制活性。
附图说明
图1是0小时化合物4的20％乙醇溶液的蒸发光散射(HPLC-ELSD)图；
图2是6小时化合物4的20％乙醇溶液的蒸发光散射(HPLC-ELSD)图；
图3是0小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)在水中的HPLC-ELSD图；
图4是6小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)在水中的HPLC-ELSD图；
图5是0小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)在水中的HPLC-ELSD图；
图6是6小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)在水中的HPLC-ELSD图；
图7是实施例10给药期间各组动物相对肿瘤体积曲线图；
图8是实施例10试验结束时各组动物瘤重柱形图。
具体实施方式
本发明提供了一种箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，箭根酮内酯衍生物与环糊精的质量比为1：(3～100)。
本发明通过将箭根酮内酯与环糊精化合物进行包合得到箭根酮内酯环糊精包合物，大大提高了箭根酮内酯的水溶性以及稳定性，对肿瘤细胞株A498、769-P、Caki-1、ACHN、A2780、HepG2、Hep-3B、Huh-7、HEK-293和786-O的增值均具有较强抑制活性。
本发明所提供的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比优选为1：(3～100)，更优选为1：(10～30)，更优选为1：(20～30)，在一些具体实施例中，箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比优选为1:20或1:30。
本发明所述的箭根酮内酯衍生物优选为式(3)～式(5)所示化合物中的任意一种，更优选为式(4)所示化合物：
本发明上述箭根酮内酯化合物优选按照以下方法进行制备：
将水田七根部用甲醇水溶液浸提、大孔树脂分离纯化得到式(1)所示化合物和式(2)所示化合物。具体的，大孔树脂分离纯化步骤，选取80％甲醇/水洗脱液，浓缩后，大孔树脂吸附，甲醇洗脱，洗脱液浓缩即可得到式(1)所示化合物，以及式(2)所示化合物浸膏。优选的，式(2)所示化合物浸膏经过柱色谱分离，即可得到式(2)所示化合物。
然后将式(1)所示化合物与间氯过苯甲酸反应，即可得到式(3)所示化合物。所述反应的溶剂优选为二氯甲烷，反应温度优选为室温，反应时间优选为4h～8h，反应结束后，优选的，采用硅胶柱色谱法对反应产物进行分离纯化。
将式(2)所示化合物与间氯过苯甲酸反应，即可得到式(4)所示化合物。所述反应的溶剂优选为二氯甲烷，反应温度优选为室温，反应时间优选为4h～8h，反应结束后，优选的，采用硅胶柱色谱法对反应产物进行分离纯化。
将式(4)所示化合物与丁二酸酐、DABCO(三乙烯二胺)反应，得到白色固体；所述反应的溶剂优选为二氯甲烷，反应温度优选为室温，反应时间优选为0.2h～1h，反应结束后，优选的，采用硅胶柱色谱法对反应产物进行分离纯化。然后将得到的白色固体与HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，N-甲基哌嗪反应，即可得到式(5)所示化合物；所述反应的溶剂优选为二氯甲烷，反应温度优选为室温，反应时间优选为10min～30min，反应结束后，优选的，采用硅胶柱色谱法对反应产物进行分离纯化。
本发明所述的环糊精优选为β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物中的任意一种。其中，所述β-环糊精衍生物，γ-环糊精衍生物中的取代基独立的选自C1～6烷基或C1～6羟烷基。
在本发明的一些实施例中，所述环糊精为羟丙基β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精。
本发明还提供了一种上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物的制备方法，包括：在40℃～78℃条件下，将环糊精化合物与箭根酮内酯衍生物在乙醇中混合、反应至溶液澄清，除去溶剂，得到箭根酮内酯衍生物环糊精包合物。所述除去溶剂的方法可以为本领域公知的方法，本发明优选为减压浓缩。
所述环糊精化合物的物质的量与乙醇的体积比优选为1mmol：(5mL～15mL)。
本发明优选的，在上述得到箭根酮内酯衍生物环糊精包合物后，还可以对所述包合物进行冷冻干燥，具体的，在上述包合物中加入适量水搅拌直至澄清，然后进行冷冻干燥。
本发明还提供了一种药物组合物，包括上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照上述制备方法制备得到的包合物，还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
其中，本发明所提供的组合物可以是本领域公知的剂型，如片剂、胶囊剂、注射剂。
本发明还提供了一种使用上述箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照上述制备方法制备得到的包合物或上述药物组合物来制备用于稳定微管蛋白的药品的用途。
本发明提供的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物对于肾癌细胞786-O具有很好的抑制活性，可用于制备治疗肾细胞癌，尤其是有VHL缺失的肾细胞癌的药品。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物进行详细描述。
实施例1
将水田七根部30kg粉碎，用50％的甲醇/水浸泡7次，每次溶剂用量50L，每次浸泡两天。浸泡所得的提取液直接上30kg的D101型大孔树脂，分别用60％，70％，80％的甲醇/水洗脱。HPLC-ELSD检测目标化合物主要集中在80％甲醇/水洗脱液中。将80％甲醇/水洗脱液减压浓缩除掉部分甲醇，然后将该浓缩液上10kg大孔树脂吸附目标化合物，除水之后，用纯甲醇洗脱，浓缩之后得到箭根酮内酯1(20g)和2的粗品浸膏300g。将该粗品用5kg硅胶柱纯化，以石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱，得到箭根酮内酯2(11g)
采用核磁共振氢谱以及高效液相色谱法对产物结构进行检测，结果如下：
箭根酮内酯1：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.37(dd,J＝11.6,2.8Hz,1H),5.28(m,1H),5.22(d,J＝11.8Hz,1H),5.02(t,J＝8.5Hz,1H),4.73(d,J＝5.5Hz,1H),3.48(d,J＝5.1Hz,2H),3.45(t,J＝3.8Hz,1H),3.36(s,1H),2.88(m,3H),2.53(m,2H),2.28(s,1H),2.19(s,3H),2.13(s,3H),2.11(s,3H),2.00(s,3H),1.45(s,3H),1.18(s,3H),0.99(s,3H),0.83(d,J＝6.6Hz,3H)；
ESI-MS 703.3[M+H]+。
箭根酮内酯2：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.35(dd,J＝11.5,2.6Hz,1H),5.25(d,J＝2.6Hz,1H),5.18(d,J＝3.2Hz,1H),5.00(d,J＝1.6Hz,1H),4.68(d,J＝5.5Hz,1H),4.65(s,1H),4.50(d,J＝3.3Hz,1H),4.42(t,J＝7.9Hz,1H),4.14(d,J＝10.6Hz,1H),3.49(m,1H),3.40(s,1H),2.79(dd,J＝11.1,4.7Hz,1H),2.70(t,J＝11.5Hz,1H),2.41(m,1H),2.16(s,3H),2.12(s,3H),1.98(s,3H),1.66(s,3H),1.35(s,3H),0.95(s,3H),0.90(d,J＝7.0Hz,3H),0.84(s,3H)；
ESI-MS 661.3[M+H]+。
结果表明，箭根酮内酯1、2结构如下：
实施例2
在50mL圆底烧瓶中加入箭根酮内酯1(即反应方程式中的A)(200mg，0.28mmol)和5mL CH2Cl2，搅拌溶解后，加入间氯过苯甲酸(147mg，0.84mmol)，室温下搅拌6小时，TLC检测反应完全后，反应体系用水洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤1次，CH2Cl2层经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，经硅胶柱层析，得到白色固体化合物3(164mg，81％)。
反应方程式如下：
采用核磁共振氢谱以及高效液相色谱法对产物结构进行检测，结果如下：
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.51(t,J＝8.7Hz,1H),5.28(dd,J＝11.6,2.9Hz,1H),5.20(d,J＝2.7Hz,1H),4.72(d,J＝5.4Hz,1H),3.97(d,J＝10.4Hz,1H),3.85(s,1H),3.48(m,3H),3.39(dd,J＝3.5,1.9Hz,1H),3.27(s,1H),2.73(m,3H),2.42(dd,J＝10.8,8.9Hz,1H),2.18(S,3H),2.15(s,3H),2.02(S,3H),1.99(s,3H),1.75(s,3H),1.34(s,3H),1.21(m,2H),1.03(d,J＝7.4Hz,3H),0.88(s,3H),0.77(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ209.4,177.4,171.7,170.7,169.4,169.1,92.1,79.1,75.2,73.7,72.6,71.2,70.7,65.9,53.8,52.1,49.6,47.7,46.4,45.1,43.2,42.9,42.8,42.1,39.8,31.7,23.6,22.4,21.3,21.1,20.9,20.6,19.6,18.6,12.9,12.9；
ESI-MS 719.6[M+H]+。
结果表明，本申请制备得到了化合物3。
实施例3
在50ml圆底烧瓶中加入箭根酮内酯2(即反应方程式中的B)(200mg，0.303mmol)和5mL CH2Cl2，搅拌溶解后，加入间氯过苯甲酸(160mg，0.909mmol)，室温下搅拌6小时，TLC检测反应完全后，用5％碳酸氢钠水洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤1次，CH2Cl2层经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，经硅胶柱层析，得到白色固体化合物4(163mg，80％)。
反应方程式如下：
采用核磁共振氢谱以及高效液相色谱法对产物结构进行检测，结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.30(dd,J＝11.6,2.7Hz,1H),5.22(d,J＝3.3Hz,1H),5.16(d,J＝2.6Hz,1H),5.01(s,1H),4.66(d,J＝5.5Hz,1H),4.50(d,J＝3.4Hz,1H),4.32(d,J＝8.1Hz,1H),4.15(dd,J＝10.9,2.4Hz,1H),3.48(m,1H),3.39(s,1H),3.24(s,1H),2.79(dd,J＝11.5,4.1Hz,1H),2.69(t,J＝11.5Hz,1H),2.27(dd,J＝16.0,4.6Hz,1H),2.16(s,3H),2.13(s,3H),1.97(s,3H),1.75(s,3H),1.35(s,3H),1.01(d,J＝7.4Hz,3H),0.84(s,3H),0.82(s,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ208.2,174.4,170.7,169.5,169.2,91.1,78.6,75.9,73.6,72.4,71.3,70.3,65.7,56.6,52.0,49.7,47.2,46.5,44.5,43.8,43.1,42.3,42.19,39.2,32.2,24.8,21.3,21.1,20.8,20.5,19.8,18.5,12.9,12.7；
ESI-MS 677.6[M+H]+。
结果表明，本申请制备得到了化合物4。
实施例4
化合物4(100mg，0.148mmol)用2mL干燥CH2Cl2溶解于25mL圆底烧瓶中，加入丁二酸酐(29mg，0.296mmol)和1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)(33mg，0.296mmol)，室温下搅拌0.5小时，反应完全后，用水洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤1次，CH2Cl2层经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，经硅胶柱层析，得到白色固体(97mg，85％)。在氮气保护下，将得到的白色固体和HATU(73mg，0.193mmol)用2mL干燥CH2Cl2溶解于25mL圆底烧瓶中，加入N-甲基哌嗪(19mg，0.193mmol)，室温下搅拌20分钟，反应完全后，用水洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤1次，CH2Cl2层经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，经硅胶柱层析，得到白色固体5(94mg，85％)。
反应方程式如下：
采用核磁共振氢谱以及高效液相色谱法对产物结构进行检测，结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.89(d,J＝6.4Hz,1H),5.28(m,3H),5.14(d,J＝2.6Hz,1H),4.77(d,J＝5.5Hz,1H),4.53(m,1H),4.33(s,1H),3.48(m,4H),3.35(m,1H),3.23(s,1H),2.82(m,4H),2.31(s,3H),2.17(s,3H),2.11(m,3H),1.98(s,3H),1.75(s,3H),1.58(dd,J＝11.1,7.1Hz,1H),1.37(s,3H),0.98(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(s,3H),0.75(s,3H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ202.9,174.8,172.1,170.6,170.6,169.4,169.1,91.3,79.1,73.7,72.5,71.2,69.6,65.6,56.4,54.2,54.1,52.1,49.4,48.4,47.3,45.4,44.8,44.0,43.4,42.5,42.2,41.7,41.1,38.7,32.4,28.9,28.1,25.0,21.1,20.8,20.5,19.13,18.4,12.9,12.7；
ESI-MS 859.8[M+H]+。
结果表明，本申请制备得到了化合物5。
实施例5
分别将2mmol、3mmol、10mmol、20mmol、30mmol、50mmol、100mmol的羟丙基-β-环糊精溶于20mL、30mL、100mL、200mL、300mL、500mL、1000mL无水乙醇中得到羟丙基-β-环糊精乙醇溶液，在加热回流搅拌条件下分别将实施例2～4制备的化合物3～5(1mmol)溶于羟丙基-β-环糊精乙醇溶液中，然后，减压浓缩得到白色固体，即不同摩尔比的箭根酮内酯衍生物羟丙基-β-环糊精包合物(HP-β-CD)。
实施例6
按照实施例5的方法，分别制备不同摩尔比的箭根酮内酯的羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)包合物。
实施例7
箭根酮内酯衍生物环糊精包合物溶解度测定
对实施例5和实施例6制备的一系列箭根酮内酯衍生物环糊精包合物进行溶解度测定，具体的：
(1)使用万分之一天平称量样品瓶质量记为m1；
(2)向(1)中的样品瓶中装入一定量的环糊精包埋物，称量其总质量记为m2；
(3)向(2)中的样品瓶中逐滴加入蒸馏水，密封，室温下超声振荡溶解10分钟；
(4)如超声10分钟后仍有可见不溶物，则重复上述步骤(3)，直至溶液澄清透明，称量此事样品瓶质量记为m3；
(5)如样品瓶装满蒸馏水仍未溶解，则按满瓶算；
(6)计算包埋物的水溶解度为：(m2-m1)/(m3-m2)；
实验结果见表1，表1是本申请实施例7的溶解度测定实验结果。
表1本申请实施例7的溶解度测定实验结果
其中，比例为化合物与环糊精的摩尔比；
对未包合的箭根酮内酯水溶性进行相同的溶解度测定，结果表明未包合的箭根酮内酯的水溶性<0.01mg/mL。
实施例8
对箭根酮内酯衍生物环糊精包合物在水溶液中的稳定性进行评价，具体的：
(1)样品处理：样品用蒸馏水溶解，过滤，配制成待测的澄清溶液；
(2)用HPLC测定待测物在乙醇溶液中0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的稳定性；
(3)检测方法：
进样量：30μL；
流动相：20％乙腈-水→100％乙腈(0→20分钟)；
检测器：ELSD，214nm；
流速：1.5mL/min；
柱子：Weltech，RP-18,4.6X50mm，5um；
测定方法：峰面积法：a、测定主峰面积S1；b、测定杂峰总面积S2；c、计算杂峰面积占主峰面积的比例，杂峰积分面积：主峰积分面积＝S2：S1。
对未包合的化合物在水溶液中的稳定性进行评价，具体的：
1)配制50％乙醇溶液；
无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；
蒸馏水：广州屈臣氏食品饮料有限公司；
(2)向质谱瓶中称量入一定量的待测物，用(1)中的乙醇溶液，配制成待测物的饱和溶液；
(3)用HPLC测定待测物在乙醇溶液中0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的稳定性；
检测方法：
进样量：30μL；
流动相：20％乙腈-水→100％乙腈(0→20分钟)；
检测器：ELSD；
测定方法：峰面积法：
a、测定主峰面积S1；
b、测定杂峰总面积S2；
c、计算杂峰面积占主峰面积的比例，杂峰积分面积：主峰积分面积＝S2：S1。
1、化合物3及其环糊精包合物的稳定性测试结果
表2化合物3及其环糊精包合物的稳定性测试结果
其中，化合物3在20％乙醇溶液中溶解度极低，其饱和溶液低于HPLC检测限，无法观测到响应值，故溶于50％乙醇溶液中进行稳定性检测；
由表2中化合物3(50％乙醇溶解)的稳定性数据可见，其在50％乙醇中很不稳定，可以说明在20％乙醇中将更加不稳定。
2、化合物4及其环糊精包合物的稳定性测试结果
表3化合物4及其环糊精包合物的稳定性测试结果
图1是0小时化合物4的20％乙醇溶液的蒸发光散射(HPLC-ELSD)图，图2是6小时化合物4的20％乙醇溶液的蒸发光散射(HPLC-ELSD)图；图3是0小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)在水中的HPLC-ELSD图，图4是6小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)在水中的HPLC-ELSD图。
由表3以及图1～图4可以看出，化合物4在20％乙醇水溶液中不稳定，6小时降解4.56％，而化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物稳定性有较大提高。
3、化合物5及其环糊精包合物的稳定性测试结果
表4化合物5及其环糊精包合物的稳定性测试结果
其中，化合物5：HP-β-CD＝1:20的0h数据可见，当包合物一被溶解时，就迅速分解，杂质量甚至超过了其本身含量，故未进行后续稳定性试验；
化合物5：HP-γ-CD＝1:20基于同样的理由也未进行试验。
4、HP-β-CD 1:30在水中稳定性测试
对化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)在水溶液中的稳定性进行评价，测定结果如表5和图5～6所示，其中，表5是化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)在水中稳定性测试数据，图5是0小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)在水中的HPLC-ELSD图，图6是6小时化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)在水中的HPLC-ELSD图。
表5.化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:30)稳定性
由以上实验可以看出，箭根酮内酯化合物在20％乙醇溶液中不稳定。通过制备其羟丙基-β-环糊精包合物或羟丙基-γ-环糊精包合物(1:20和1:30)大大提高了水中稳定性和水溶性。
实施例9
化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)对人肾癌细胞的体外抗增殖活性
试验材料：
A498、769-P、Caki-1、ACHN、A2780、HepG2、Hep-3B、Huh-7、HEK-293和786-O细胞株购自中科院细胞库或ATCC。细胞均用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养。
试剂：MTS试剂盒(Promega(普洛麦格),Cat#G3581)，0.25％Trypsin-EDTA(胰酶-EDTA)(GIBCO,Cat#25200)，RPMI-1640(GIBCO,Cat#A10491-01)，Fetal bovine serum(胎牛血清，FBS)(GIBCO,Cat#10099141)，Penicillin-Streptomycin,liquid(青链霉素(双抗)溶液)(GIBCO,Cat#15140-122)，Dimethyl sulfoxide(二甲亚砜)(Sigma,Cat#D2650)。
试验方法：
化合物配制：受试化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)溶于生理盐水中，配成20mM储存液。在生理盐水中梯度稀释成200倍终浓度的储存液。加药时再用细胞培养基稀释成4倍终浓度的化合物溶液。
MTS细胞活力检测：胰酶消化对数生长期的贴壁细胞，按已优化的密度接种150μL于96孔板，24小时后加入培养基稀释的4倍浓度化合物50μL/孔。以加入同样体积的生理盐水的孔作为对照，生理盐水终浓度为0.25％。细胞继续培养72小时后，MTS检测细胞活力。具体方法如下：弃去培养基，每孔加入含20μL MTS和100μL培养基的混合液。放入培养箱继续培养1-4小时后检测OD490，以OD650值作为参考。GraphPad Prism软件制作量效曲线并计算IC50。
试验结果：
按照上文所述的方法分别对本发明实施例5提供的化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)(记为TB-4)，以及实施例1制备的化合物2(记为TB-2)进行A2780、A2780/TC1、786-O、ACHN、HepG2、Hep-3B、Huh-7、HEK 293、A498、769-P和Caki-1活性测定，以紫杉醇作为对照，结果参见表6，表6为本发明实施例9体外抗增殖活性测试结果。
表6本发明实施例9体外抗增殖活性测试结果
标“--”为未检测数据。
结果显示：化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)对体外培养的肿瘤细胞具有较强抑制活性，且活性与紫杉醇相当。
实施例10
化合物4的羟丙基-β-环糊精包合物(1:20)对人肾癌786-O裸鼠移植瘤的疗效
试验材料：
Balb/C裸小鼠：购自北京华阜康生物科技股份有限公司，雄性，6周龄。饲养于屏障环境，温度20～25℃，相对湿度30～70％，12：12h光暗照明；自由饮水及采食。
人肾癌细胞786-O：来源于中科院细胞库。
阳性对照：多西他赛(多烯紫杉醇)和舒尼替尼由桑迪亚医药技术(上海)有限责任公司提供。
试验方法：
786-O荷瘤鼠安乐死，皮肤消毒后剥取瘤块，剔除包膜，用生理盐水对瘤组织进行冲洗；将瘤组织切成约1mm3小块，用套管针接种到健康Balb/C裸小鼠前右肢腋窝皮下。定期观察动物及移植瘤生长情况；待瘤体积生长至100～300mm3左右时，淘汰体积过大、过小或肿瘤形状不规则的动物，采用随机区组法将动物分为5组，每组6只；各组动物按下表7方案开始给药，给药周期21天；给药期间，每周测量2次瘤径、称量动物体重，观察动物生活状态，对异常状况进行记录；试验结束时，动物安乐死，剥取瘤块称重，计算瘤重抑瘤率。
表7给药方案
注：QW表示一周给药一次，QD表示一天给药一次；
21d表示连续用药21天；
iv表示静脉注射给药；
ig表示口服灌胃。
溶剂对照组给予生理盐水，受试样品用生理盐水配成溶液，尾静脉注射给药。多西他赛用5％无水乙醇和5％Tween-80生理盐水配成溶液，尾静脉注射给药。舒尼替尼采用0.5％HPMC-K4M&0.2％SLS(0.5％羟丙基甲基纤维素(K4M)和0.2％十二烷基硫酸钠)混悬液灌胃给药。
肿瘤体积(TV)计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中，a表示肿瘤长径；b表示肿瘤短径。相对肿瘤体积(RTV)计算公式为：RTV＝Vt/Vo，其中，Vo为分组给药时(即do)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率T/C(％)计算公式为：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)；瘤重抑瘤率(IR)计算公式为：IR＝100％×(WC–WT)/WC，其中，WC表示对照组瘤重，WT表示治疗组瘤重。
试验数据用Microsoft Office Excel 2003软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±S.E)表示，两组间比较采用t-检验。
试验结果：
786-O接种22天后，肿瘤体积生长至约170mm3，采用随机区组法将荷瘤鼠分组并开始给药；至试验结束时，溶剂对照组肿瘤体积生长至1011.41±99.18mm3。阳性对照舒尼替尼80mg/kg QD组给药10天后，因药物毒性反应较大，剂量调整为舒尼替尼40mg/kg QD直至试验结束。
10.1、对786-O裸鼠移植瘤生长的影响
至实验结束时，受试样品1mg/kg QW和2mg/kg QW剂量组相对肿瘤增殖率(％T/C)分别为37.41％(P<0.01)和18.54％(P<0.01)，各组相对肿瘤体积与溶剂对照组比较，均存在极显著性差异。阳性对照多西他赛和舒尼替尼组相对肿瘤增殖率(％T/C)分别为：71.89％(P<0.05)和13.35％(P<0.01)。详细结果见图7，图7是给药期间各组动物相对肿瘤体积曲线图。
10.2、对786-O裸鼠移植瘤瘤重的影响
试验结束时，处死动物，剥取瘤块、称重，计算瘤重抑瘤率。受试样品低高剂量组瘤重抑瘤率分别为64.87％(P<0.01)和82.85％(P<0.01)。阳性对照多西他赛和舒尼替尼瘤重抑瘤率分别为：28.79％和83.50％(P<0.01)。详细结果见表8和图8，表8是试验结束时各组瘤重及抑瘤率数据汇总，图8是试验结束时各组动物瘤重柱形图。
表8试验结束时各组瘤重及抑瘤率
注：与溶剂对照组比较，**P<0.01。
10.3、对786-O荷瘤鼠体重的影响
阳性对照舒尼替尼(80mg/kg,QD)组给药10天后，动物体重下降14.06％；剂量调整为舒尼替尼(40mg/kg,QD)直至试验结束。试验结束时，溶剂对照组、阳性对照多西他赛(10mg/kg,QW)、阳性对照舒尼替尼80→40mg/kgQD、化合物4(1mg/kg,QW)和化合物4(2mg/kg,QW)组动物体重分别下降12.20％、31.01％、9.81％、2.59％和2.88％。
10.4、对786-O荷瘤鼠大体症状的影响及其它异常状态
阳性对照舒尼替尼(80mg/kg,QD)组小鼠连续给药4天后，肤色变黄，尿液发黄，连续给药10天后体重下降明显，动物消瘦，状态差；剂量调整为舒尼替尼(40mg/kg,QD)后动物体重有所恢复，精神状态好转，其他症状好转，逐渐恢复正常。
试验结束时，解剖各组动物，各组动物未发现肉眼可见明显异常。
由上述实施例可知，本发明制备的箭根酮内酯环糊精包合物，具有较高的水溶性以及稳定性，并且对肿瘤细胞A498、769-P、Caki-1、ACHN和786-O均具有较强抑制活性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，其特征在于，箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比为1：(3～100)；
所述箭根酮内酯衍生物选自式(3)～式(5)所示化合物中的任意一种，
2.根据权利要求1所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，其特征在于，所述箭根酮内酯衍生物与环糊精的摩尔比为1：(10～30)。
3.根据权利要求1所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，其特征在于，所述箭根酮内酯衍生物为式(4)所示化合物。
4.根据权利要求1～3任一项所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，其特征在于，所述环糊精选自β-环糊精或其衍生物，γ-环糊精或其衍生物中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，其特征在于，所述环糊精为羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精。
6.一种权利要求1所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物的制备方法，包括：在40℃～78℃条件下，将环糊精化合物与箭根酮内酯衍生物在乙醇中混合、反应至溶液澄清，除去溶剂得到箭根酮内酯衍生物环糊精包合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，除去溶剂得到箭根酮内酯衍生物环糊精包合物后，还包括对得到的包合物进行冷冻干燥。
8.一种药物组合物，包括权利要求1～5任意一项所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照权利要求6或7所述的制备方法制备得到的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂或注射剂。
10.一种使用权利要求1～5任意一项所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照权利要求6或7所述的制备方法制备得到的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或权利要求8所述的药物组合物来制备用于稳定微管蛋白的药品的用途。
11.一种使用权利要求1～5任意一项所述的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或按照权利要求6或7所述的制备方法制备得到的箭根酮内酯衍生物环糊精包合物或权利要求8所述的药物组合物来制备用于治疗肾癌的药品的用途。
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