CN100536862C

CN100536862C - 一种中药挥发油的医药用途

Info

Publication number: CN100536862C
Application number: CNB2006100379136A
Authority: CN
Inventors: 杨永安; 王衡奇; 徐宏江; 杨玲; 张来芳; 晏彩霞
Original assignee: Jiangsu Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Chia Tai Qingjiang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2026-01-20
Also published as: CN101002812A

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的中药挥发油，特别是藏木香挥发油及其药物组合物，还涉及它们的制备方法和作为抗肿瘤药物的用途。本发明具有抗肿瘤活性显著，安全性好的优点。

Description

一种中药挥发油的医药用途

技术领域

本发明属医药领域，涉及中药挥发油及其制剂，还包括它们的制备工艺和抗肿瘤医药用途；特别是由藏木香中提取的挥发油及其制剂，以及它们的制备工艺和抗肿瘤医药用途。

背景技术

中药挥发油(volatile oil)是一类具有生理活性的成分，亦称为精油(essentialoil)，它是从中药中提取的与水不相混溶的挥发性油状成分的总称，其所含的化学成分比较复杂，在临床上挥发油具有止咳、平喘、祛痰、发汗、解表、祛风、镇痛、解热、利尿、健胃、抗菌、消毒和杀虫等功效，个别挥发油尚有特殊的生理功效，如麝香酮挥发油具有兴奋中枢神经的作用，樟脑挥发油具有强心的作用等等。

《中国药典》2005年版一部收载的中药土木香，亦称藏木香，为菊科植物土木香Ilula helenium L.的干燥根。中药藏木香的传统功效是健脾和胃、调气解郁、止痛安胎，常用于胸胁、脘腹胀痛、呕吐泻痢、胸胁挫伤、岔气作痛、胎动不安，还用于治疗胃肠炎、支气管炎及结核性腹泻等，也具有驱虫作用。藏木香在欧洲被用于利尿、祛痰和健胃，在美国用于治疗肺部疾病和抗结核。现代中药化学研究表明藏木香的主要活性成分为土木香内酯、异土木香内酯等倍半萜内酯类化合物。

宗玉英等(药学实践杂志，Vol.18(2000)，No.5 290-291)将藏木香药材经过粉碎后，先用石油醚(30-60)提取，然后药渣再用90％乙醇提取，发现90％乙醇提取部位具有体外抗肿瘤活性(IC₅₀在3.0-5.0g/ml)。但由于藏木香含有毒性很强的蛋白，会使人产生四肢疼痛、吐、泻、眩晕及皮疹等不良反应，该毒性蛋白能够溶于极性溶剂和水，因而上述经过脱脂后的90％乙醇提取部位并不适宜作为药物应用。

Tenji Konishi等(Biological & Pharmaceutical Bulletin Vol.25(2002)，No.101370-1372Antiproliferative Sesquiterpene Lactones from the Roots of Inulahelenium)从藏木香中分离纯化得到了7个倍半萜内酯类化合物，发现其中4个化合物(包括土木香内酯)具有较强的体外抗肿瘤活性(GI₅₀在3.0-30M，5-Fu(5-氟尿嘧啶)对照的GI₅₀在1.1-19.2M)。

尽管有文献报道过藏木香挥发油的提取方法和成分检测，亦有文献对藏木香提取物和有效成分的体外抗肿瘤活性进行了描述，但一直未有文献对藏木香挥发油的抗肿瘤医药用途做详细描述，令人惊异的是，藏木香挥发油在具有很强抗肿瘤活性的同时也表现出较低的毒性，具有临床运用的前景。

即便藏木香挥发油已表现出令人兴奋的药理性质，然而由于挥发油天生具有的挥发性和不稳定性，需选择合理的提取工艺和制剂以保证药品的质量，加之作为抗肿瘤药品，其必须具备超乎寻常的稳定性和均一度。

发明内容

本发明的目的是提供藏木香挥发油及其药物组合物，此挥发油及药物组合物有优良的抗肿瘤活性，较低的毒性。

本发明的另一个目的是提供藏木香挥发油的提取方法和其制剂的制备方法，所述的制备方法可以方便，低成本的获得稳定的产品，有利于工业化生产，更有利于获得质量稳定可控的药品。

本发明的再一个目的是提供藏木香挥发油及其制剂在抗肿瘤方面的用途。

发明人对藏木香的提取物和多个主要活性成分的抗肿瘤活性和毒性进行了系统对比和综合分析，发现其中藏木香的挥发油提取物具有最适宜药用的性质，表现出优良的抗肿瘤活性和较低的毒性，特别适宜制备成为抗肿瘤药物。当挥发油中土木香内酯含量和异土木香内酯含量总和在20％～70％之间时，此挥发油便具有优良的抗肿瘤活性，优选含量总和在30％～60％之间，更优选含量总和在40％～50％之间。

上述的藏木香挥发油可由水蒸气蒸馏法获得，水蒸气蒸馏的方法为：将适度粉碎后的药材浸泡，用挥发油提取器加热回流，进行常规水蒸气蒸馏、提取，并经干燥剂干燥，得到藏木香挥发油。

发明人也尝试了使用如下所述的超临界萃取法、溶剂提取法对藏木香药材进行提取：

以超临界萃取法提取的工艺是：取干燥的藏木香药材，适度粉碎，装入超临界萃取器，调节萃取器压力在10-25MPa、温度20-40℃、分离器压力5-15MPa、温度40-65℃，连续萃取1～10小时，从分离器中得到藏木香提取物；

以溶剂提取法提取的工艺是：取干燥的藏木香药材，适度粉碎，装入提取罐，用5～15倍量的乙酸乙脂浸泡0.5～5小时，然后加热回流提取1～3次，每次1～3小时，过滤并合并两次提取液，减压除去溶剂，即得。

由以上的两种提取方法所得到的提取物，其成分相对于水蒸气蒸馏法所得到的挥发油更为复杂，在药理实验中表现出较为明显的毒性，这与藏木香中含有的毒性很强的蛋白有关，所以用以上两种提取方法获得的提取物还需经过水蒸气蒸馏或柱层析方法再处理。所述的柱层析的条件如下：填料可以是硅胶或氧化铝等常规填料，所用洗脱液为石油醚：乙酸乙酯体积比15：1至2：1的混合溶剂。优选洗脱液为石油醚：乙酸乙酯体积比10：1的混合溶剂。

发明人在对藏木香的研究过程中做了大量的提取分离工作，如挥发油的提取(水蒸气蒸馏法获得)，其中活性成分β-榄香烯，土木香内酯，异土木香内酯的提取，尤其是在土木香内酯，异土木香内酯的提取过程中，由于两者结构极为接近，性质相差极小，很难得到成分单一的提取物。不过在随后的动物实验中发明人惊奇的发现，相比于藏木香已知的抗肿瘤活性成分，其挥发油提取物具有更强的体外抗肿瘤活性，更低的毒性，显示出本发明的藏木香挥发油抗肿瘤作用不是所含已知成份作用的简单迭加，而是存在显著的协同作用。以上结论也意味着无需通过复杂的方法分离土木香内酯和异土木香内酯，只需要通过便捷、低成本，便于工业化生产的方法获得具有优良抗肿瘤活性的产品。

但是发明人发现并不是所有批次的挥发油都具有相同的抗肿瘤活性，个别批次甚至无法达到预期的抗肿瘤活性，这是中药研发中经常会遇到的质量控制问题，主要是由于藏木香药材的产地和采摘季节等因素的影响所造成的。随后发明人通过大量的研究，发现无需对挥发油中所有主要成分指标化，只要土木香内酯含量和异土木香内酯含量总和在20％～70％之间时，此挥发油就可具有期望的抗肿瘤活性。优选含量在30％～60％之间，更优选含量在40％～50％之间。对于无法达到以上标准的藏木香挥发油可以用柱层析方法再次纯化使其达到以上所述的标准即可。具体的柱层析实验条件如下：填料可以是硅胶或氧化铝等常规填料，所用洗脱液为石油醚：乙酸乙酯体积比为15：1至2：1的混合溶剂。优选洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比为10：1的混合溶剂。

土木香内酯、异土木香内酯的含量测定，采用气相色谱法，测定方法如下：

一、仪器与试剂

1.仪器

岛津GC-2010型气相色谱仪

DB-1701毛细管色谱柱(30.0m×0.32mm×0.25μm)

2.试剂

土木香内酯对照品(购自中国药品生物制品检定所)

异土木香内酯对照品(购自中国药品生物制品检定所)

二、对照品和样品溶液制备

1.对照品溶液的制备

取土木香内酯对照品适量加水溶解，并稀释制成每1ml含土木香内酯0.40mg的溶液，摇匀，作为1号对照品溶液。

取异土木香内酯对照品适量加水溶解，并稀释制成每1ml含异土木香内酯0.20mg的溶液，摇匀，作为2号对照品溶液。

2.样品溶液制备

取藏木香挥发油25mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为藏木香挥发油样品溶液。

三、色谱条件

柱温：程序升温，初始温度100℃，以15℃/min的速度升温至160℃，保持5min后再以15℃/min的速度升温至200℃，保持20min后终止；载气：N₂；分流比：10∶1；流速：恒定为1.5ml/min；进样口温度：180℃；FID检测器温度：250℃。

四、样品测定

取藏木香挥发油样品溶液1μl注入气相色谱仪，按外标法进行测定。

在以前的文献中，藏木香挥发油含量测定中最常使用的是归一化法，此法提供了一种方便的含量测定方法，然而由于无法给出其中组分的真实含量，在药品质量控制中无法提供一种稳定可靠的标准，进而无法进行有效的药品质量控制，因此本发明所述的含量都是用外标法测得的用质量分数表示的真实含量。

本发明的藏木香挥发油可直接加入药物可接受的载体，按常规的方法制备成为口服或注射制剂。其中口服制剂包括胶囊剂、丸剂、口服液；注射制剂包括注射液、注射用无菌粉末和注射用浓溶液。

其中所述的胶囊剂包括硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、控释胶囊；丸剂为滴丸；口服液包括口服溶液剂和口服乳剂；注射液包括无菌溶液型注射液、乳状液型注射液。以上这些剂型中特别优选的是软胶囊、缓释胶囊、滴丸、无菌溶液型注射液、乳状液型注射液和注射用无菌粉末。

鉴于藏木香挥发油的挥发性和不稳定性，更适宜制成环糊精包合物、磷脂复合物、脂质体后，再制备成适合口服或注射给药的制剂。

藏木香挥发油环糊精包合物可通过如下方法制得，将环糊精溶于适量水制成环糊精饱和溶液，搅拌状态下滴入溶于有机溶剂的藏木香溶液，在20～50℃下继续搅拌1～24h，优选3～6h，减压除去溶剂得藏木香挥发油环糊精包合物。以上所述得环糊精包括α-环糊精或其衍生物、β-环糊精或其衍生物、γ-环糊精或其衍生物；优选β-环糊精、烷基化β-环糊精衍生物、羟烷基化β-环糊精衍生物、支链β-环糊精衍生物、酰化β-环糊精衍生物、羧基β-环糊精衍生物、硫酸酯或磺烷基醚型β-环糊精衍生物、混合型β-环糊精衍生物。具体的例子有β-环糊精、2，6-二甲基β-环糊精、不定位甲基化β-环糊精、2-羟丙基β-环糊精、2-羟乙基β-环糊精、6-葡萄糖基β-环糊精、6-麦芽糖基β-环糊精、2，3-二己酰β-环糊精、6-羧甲基β-环糊精、羧甲基-乙基β-环糊精。所述的有机溶剂是对挥发油溶解性较好的可与水互溶的低熔点有机溶剂，包括低级醇和低级酮，具体的例子为甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或其中一种以上的混合溶剂。挥发油嵌入到环糊精筒状结构内形成超微粒分散物，分散效果好，易于吸收，同时释药缓慢，生物利用度较高，不良反应低。环糊精与挥发油包合是一种物理过程，不发生化学变化，挥发油仍保持原有的性质和作用；挥发油用环糊精包合可以增加挥发油的溶解度及溶出速度，可以提高挥发油的稳定性，使挥发油粉末化，降低其挥发性，提高挥发油的利用率，改善挥发油的不良臭味，减少挥发油的刺激性，降低其毒副反应，改变挥发油剂型，扩大应用途径。包合后可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂等，也可以注射剂型施用。

藏木香挥发油磷脂复合物可通过如下方法制得，在非质子传递溶剂中加入藏木香挥发油和卵磷脂，在20～50℃下搅拌至反应液澄明，减压除去溶剂。其中所述的非质子传递溶剂可为酮、醚、环醚、芳烃及卤素衍生物优选丙酮，乙醚和二氧六环。所述得磷脂为天然磷脂或合成磷脂，优选蛋黄卵磷脂、大豆磷脂。磷脂与藏木香挥发油进行复合反应的配比关系：以摩尔比1∶1的化学计量关系反应时的效果最佳。在形成磷脂复合物后由于亲酯性提高，生物利用度也明显提高，从而明显增强了藏木香挥发油的抗肿瘤活性。制得的磷脂复合物可制成用于口服的片剂、胶囊剂和颗粒剂。

藏木香挥发油脂质体的制备方法可选用公知的薄膜分散法、注入法、逆相蒸发法、熔融法、复乳法、冷冻干燥法等方法制备。在制成脂质体后制剂的稳定性提高，毒性降低，提高了药品的质量，并扩大了应用范围。

本发明还提供了藏木香挥发油及其药物组合物在抗肿瘤中的用途。

以下通过实施例形式对本发明的内容作进一步的详细说明，但不应就此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述技术措施前提下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改，均包括在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1 藏木香挥发油的制备

取干燥的藏木香药材20kg，适当粉碎，装入挥发油提取器，用10倍量的水浸泡1小时，然后加热回流提取4小时，静置1小时，经无水硫酸钠脱水，得藏木香挥发油170ml，25℃下相对密度0.803g/ml。GC(气相色谱)法测得其中土木香内酯、异土木香内酯含量总和为47.3％。

实施例2 藏木香挥发油的制备

取干燥的藏木香药材20kg，适当粉碎，装入挥发油提取器，用10倍量的水浸泡1小时，然后加热回流提取4小时，静置1小时，经无水硫酸钠脱水，得藏木香总挥发油185ml，25℃下相对密度0.810g/ml。GC法测得其中土木香内酯、异土木香内酯含量总和为18.5％。

取藏木香挥发油粗提物50ml，取氧化铝(100～200目)500g，干法装入玻璃层析柱，将所得藏木香粗提物上已装好的氧化铝柱，以石油醚：乙酸乙酯(2：1)为洗脱液进行洗脱。合并所需流份。减压回收溶剂，得藏木香挥发油23g。土木香内酯含量、异土木香内酯含量总和为30.7％。

实施例3 藏木香挥发油的制备

取实施例2中的藏木香挥发油粗提物50ml，取硅胶(100～200目)500g，干法装入玻璃层析柱，将所得藏木香粗提物上已装好的硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯(10：1)为洗脱液进行洗脱。合并所需流份。减压回收溶剂，得藏木香挥发油10g。土木香内酯、异土木香内酯含量总和为63.0％。

实施例4 藏木香挥发油的制备

取实施例2中的藏木香挥发油粗提物50ml，取氧化铝(100～200目)500g，干法装入玻璃层析柱，将所得藏木香粗提物上已装好的氧化铝柱，以石油醚：乙酸乙酯(15：1)为洗脱液进行洗脱。合并所需流份。减压回收溶剂，得藏木香挥发油13g，土木香内酯、异土木香内酯含量总和为56.6％。

实施例5 藏木香挥发油注射乳剂

在氮气保护下，称取注射用大豆油100g，加热至60℃，在高速搅拌下将蛋黄卵磷脂12g、藏木香挥发油2g加入注射用油中，搅拌均匀作为油相；另将甘油22.5g加入适量的注射用水中，混匀，充分搅拌溶解后用0.45μm的滤膜过滤作为水相；在高速搅拌下，将油相与水相混合并继续高速搅拌制成初乳，加注射用水至1000ml，混匀后经高压均质乳化，调节pH至7.0，混匀后经高压均质机匀化至乳粒合格，即乳粒粒径不得有大于5μm的粒子，1μm以上粒子不多于3％。过滤后，灌装、通氮、封口，置旋转式蒸汽灭菌器中灭菌，冷却后，包装，即得藏木香挥发油脂肪乳注射液。

实施例6 藏木香挥发油注射液

取藏木香挥发油5g，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，搅匀，加注射用水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，即得藏木香挥发油注射液。

实施例7 藏木香挥发油软胶囊

取藏木香挥发油20g、大豆油180g，充分混匀，作为内容物备用；分别取明胶、甘油和水，先将明胶中加入适量的水使其充分吸水膨胀，甘油及余下的水混匀后置入化胶桶中并加热至70～80℃，加入膨胀的明胶及对羟基苯甲酸丙酯适量，搅拌，60℃保温，作为囊材备用。调节装量至0.2g，将内容物和囊材在软胶囊机上压制成软胶囊、干燥定形，即得藏木香挥发油软胶囊。

实施例8 藏木香挥发油胶囊

取藏木香挥发油10g；加入淀粉400g，混匀，用70％乙醇制成颗粒，干燥，制成1000粒，即得藏木香挥发油胶囊。

实施例9 藏木香挥发油滴丸

取藏木香挥发油10g、羧甲基纤维素钠5g、PEG6000 80g及十二烷基硫酸钠5g，将以上原辅料粉碎混匀，于150℃加热熔化，使之成为熔融状态，然后滴制成20000粒，即得藏木香挥发油滴丸。

实施例10 β-环糊精包合藏木香挥发油

称取β-环糊精60g，加约800ml蒸馏水制成饱和溶液，保温50℃，加入含藏木香挥发油10g的无水乙醇溶液20ml，搅拌混合3h，冷却，冰箱冷藏24h，析晶，抽滤至干，用蒸馏水和无水乙醇交替洗涤至无挥发油味，置40℃烘箱中干燥至恒重，得白色粉末状藏木香挥发油β-环糊精包合物63g，包合物含油率12％。

实施例11 藏木香挥发油磷脂复合物

分别称取藏木香挥发油10g、大豆卵磷脂25g，溶于无水丙酮中，于60℃下减压蒸去丙酮后，即得。

实施例12 藏木香挥发油脂质体

分别称取蛋黄卵磷脂与胆固醇各20g、藏木香挥发油10ml，溶于乙醚中，然后将此药液经注射器缓缓注入加热至50℃(并用磁力搅拌)的磷酸盐缓冲液中，加完后，不断搅拌至乙醚除尽为止，即制得藏木香挥发油脂质体注射液。

实施例13 动物实验

以下通过体外对肿瘤细胞增殖的影响研究、体内抗肿瘤作用的研究，以及小鼠急性毒性试验来进一步说明本发明的有益效果。

一、体外对肿瘤细胞增殖的影响

1.细胞株

人肺癌细胞A549

人低分化胃腺癌细胞BGC-823

人肝癌细胞SMMC-7721

人早幼粒细胞白血病细胞HL-60

人宫颈癌细胞Hela

人肝癌细胞Hep G2

2.方法

取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，计数2-4×10⁴个/ml，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔，置恒温CO₂培养箱中培养24小时。换液，加入受试药物，20ul/孔，培养48小时。将MTT加入96孔板中，20ul/孔。培养箱中反应4小时。吸去上清液，加入DMSO，150ul/孔，平板摇床上振摇5分钟。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光度，并计算细胞抑制率。按表1进行抗肿瘤活性判断。

表1.抗肿瘤活性判断标准

3..实验结果

表2.对肿瘤细胞增殖的影响(n＝3，重复2次)

由表2可见，本发明提取物体外对A549、BGC-823、SMMC-7721、HL-60、Hela、Hep G2等肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用，显著高于已知成分土木香内酯、榄香烯。

二、体内抗肿瘤作用的研究

将BALB/C小鼠肝癌细胞系H22进行常规培养。取增殖期活性好的细胞，用生理盐水制成1×10⁶/ml的细胞悬液，按0.2ml/只剂量接种于ICR小鼠左肩外侧皮下。接种后次日将小鼠随机分成6组，每组10只。在接种H22细胞的第3天，开始腹腔注射药物。各药物的给药剂量为：实施例1所得藏木香挥发油、实施例2所得藏木香挥发油、土木香内酯以及榄香烯均为50mg/kg，5-Fu(5-氟尿嘧啶)25mg/kg，各药物的给药体积都为10ml/kg，对照组注射等量生理盐水。隔天注射一次，共5次。末次给药后2天，称取小鼠体重；将各组小鼠皆放血处死，进行尸体解剖取出瘤块称重，按下式计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝(C-T)/CX100式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。结果如表3所示。

表3 对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响(x±s，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	体重(g)	瘤重(g)	抑瘤率
组别	剂量(mg/kg)	体重(g)	瘤重(g)	抑瘤率	对照组	—	25.10±2.18	2.34±0.73
实施例1所得藏木香挥发油	50	24.40±3.17	0.64±0.28<sup>**</sup>	72.55％	对照组	—	25.10±2.18	2.34±0.73
实施例1所得藏木香挥发油	50	24.40±3.17	0.64±0.28<sup>**</sup>	72.55％	实施例2所得藏木香挥发油	50	24.70±2.62	0.98±0.32<sup>**</sup>	58.21％
土木香内酯	50	25.04±3.02	1.43±0.47<sup>**</sup>	38.89％	实施例2所得藏木香挥发油	50	24.70±2.62	0.98±0.32<sup>**</sup>	58.21％
土木香内酯	50	25.04±3.02	1.43±0.47<sup>**</sup>	38.89％	榄香烯	50	23.40±2.45	1.15±0.52<sup>**</sup>	50.85％
5-Fu	25	25.80±3.19	1.03±0.50<sup>**</sup>	56.14％	榄香烯	50	23.40±2.45	1.15±0.52<sup>**</sup>	50.85％

结果说明，对荷瘤小鼠使用本发明提取物和5-Fu治疗之后，能抑制肿瘤的生长，且抑制率较高(>50％)。本发明提取物在体内有显著的抑制肿瘤的效果。

三、小鼠急毒试验

实施例1所得藏木香挥发油的LD₅₀

土木香内酯的LD₅₀

急毒试验结果表明，本发明提取物的小鼠LD₅₀为218.0mg/kg，是抑瘤率达到72.55％有效剂量(50mg/kg)的4.4倍，与土木香内酯(2.2倍)相比安全性有显著提高。

Claims

1、一种藏木香Inula Helenium L.挥发油在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于挥发油中土木香内酯和异土木香内酯含量总和范围是20％～70％。

2、权利要求1所述的应用，特征在于挥发油中土木香内酯和异土木香内酯含量总和范围是30％～60％。

3、权利要求1所述的应用，特征在于挥发油中土木香内酯和异土木香内酯含量总和范围是40％～50％。

4、权利要求1-3所述的任一应用，特征是其中挥发油的制备方法是水蒸汽蒸馏法。

5、权利要求4所述的应用，特征是挥发油的制备方法还包括柱层析过程，柱层析条件如下：填料是硅胶或氧化铝，所用洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯体积比为15∶1至2∶1的混合溶剂。