CN102525929A - 甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂及其制备方法。逆向蒸发法制备的甘草次酸衍生物修饰的汉黄芩素脂质体，显著提高对肝肿瘤细胞的作用效力，提高对肝癌的治疗效果。

Description

甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂，本发明还公开了这种汉黄芩素脂质体制剂的制备方法。

背景技术

汉黄芩素为唇形科植物黄芩的主要活性成分之一，目前已从黄芩中发现41种黄酮类化合物，其中含量较高且具有明显药理作用的主要是黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩素、汉黄芩苷和千层纸素等。其中汉黄芩素具有影响药物代谢酶(抑制CYP2E1，3A，1A2和UGT的活性)，抑制肝肿瘤细胞的作用，对CCL4、β-半乳糖胺和酒精引起的肝损伤具有保护作用。

甘草的主要有效成分是甘草酸(glycyrrhizin，GL)，在临床上被广泛用于保护肝脏、防止肝硬化和治疗各种急慢性肝炎、支气管炎和艾滋病等。但值得注意的是：GL在体内是经代谢为甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)后发挥作用的，GA的药效活性明显强于GL。已有研究证实GA在肝细胞膜上的特异性结合部位较GL多得多。Negishi在20世纪90年代初证实了大鼠肝细胞膜组分中含有大量GA特异结合位点，GA与该位点的结合呈可饱和性、高度特异性，且该位点具蛋白质性质；国内也有研究证实了肝细胞表面确存在大量GA受体。国内顾云娣等也从超微水平原位证实GA和GL对离体大鼠肝细胞具有明显的生物膜效应；同时证实肝细胞膜上有与两者相结合的位点，并且GA对肝细胞的膜效应与结合位点均较GL更为显著。这说明以GA修饰脂质体实现主动靶向肝实质细胞是可行的。另外，GA修饰量对脂质体抗肿瘤效果具有较大影响，选择合适的修饰材料比例从而达到更好的靶向抗肿瘤效果有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的是制备甘草次酸衍生物修饰的汉黄芩素脂质体，显著提高对肝肿瘤细胞的作用效力，提高对肝癌的治疗效果。

本发明的目的是通过如下措施来达到：

本发明甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂，含下列组分，其重量比为：

本发明中18-GA-Suc的制备方法如下：

具体过程如下：称取一定量的甘草次酸溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)、硬脂醇以及少许4-二甲氨基吡啶(DMAP)，80℃下加热反应至完全。旋转蒸发除去DMF，残余物加水溶解，用有机溶剂萃取；萃取液除去有机溶剂，得到淡黄色固体。经质谱检测，确证该淡黄色固体物为18-GA。称取适量18-GA溶于吡啶，加入丁二酸酐以及少许DMAP，油浴下加热反应数小时，至反应完全。旋转蒸发除去吡啶，得褐色固体，重结晶后得白色固体。经¹H-NMR及质谱鉴定为目标产物18-GA-Suc。

本发明采用逆向蒸发法，制备步骤如下：

a.将处方量汉黄芩素溶于水中，形成水相，待用；

b.将大豆磷脂、胆固醇、18-GA-Suc溶解于二氯甲烷中，形成油相，步骤a中水相与油相体积比为1∶1～3；

c.在水浴50～100w超声下将水相缓慢滴加至油相中，超声形成水油均匀的分散乳液；

d.将步骤c乳液在30～40℃下于旋转蒸发仪上旋蒸去除二氯甲烷；待有机溶剂完全挥干后，用探头超声仪进行超声分散，即得到脂质体。

本发明中，汉黄芩素与磷脂、胆固醇的配比直接影响到脂质体的质量，水相与有机相的比例和所使用的缓冲溶液也对其质量有影响。

当固定处方和制备过程中的其他参数不变，仅考察药物和磷脂的比例时，汉黄芩素的平均粒径和包封率如表1所示。

表1.药物和磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响

从表可以看出，当汉黄芩素和磷脂重量比小于1∶30时，包封率过低；当汉黄芩素和磷脂重量比在1∶40～60范围内，包封率较高，粒径符合要求，因此本发明中药物/磷脂的比例优选为1∶40～60。

当固定处方和制备过程中的其他参数不变，仅考察胆固醇和磷脂的比例时，汉黄芩素的平均粒径和包封率如表2所示。

表2胆固醇和磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响

从表中可以看出，胆固醇和磷脂的重量比例在1∶5～12范围内，当胆固醇和磷脂的重量比小于1∶6时，包封率较低。当胆固醇和磷脂的重量比例在1∶7～12范围内，包封率和粒径均较好，因此本发明中胆固醇/磷脂的比例优选在1∶7～12。

当固定处方和制备过程中的其他参数不变，仅考察水相和有机相的比例时，汉黄芩素的平均粒径和包封率如表3所示。

表3水相与有机相的比例对脂质体粒径和包封率的影响

从表可以看出，当水相与有机相的重量比在1∶3～4范围内，包封率较高，粒径符合要求，因此本发明中水相/有机相的比例优选为1∶3～4。

一、采用HepG₂细胞对不同比例修饰脂质体体外抑瘤效果比较

制备不同修饰比例的修饰脂质体，处方中磷脂与18-GA-Suc的质量比范围为1∶0.025～0.20。采用MTT法考察未修饰的汉黄芩素脂质体(WG-LP)、GA不同修饰比例的汉黄芩素脂质体(GA-WG-LP)，脂质体中GA的修饰比例分别为1∶0.025、1∶0.05、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20(GA：磷脂，重量比)以及汉黄芩素水溶液(WG)对人肝癌HepG₂细胞的毒性。将指数生长期的HepG₂细胞用胰酶消化，制成细胞悬液，计数后按照没孔1.0*10⁵个/ml的细胞浓度接种于96孔板，每孔加100μL，培养24h后吸弃上层培养液；分别加入含上述脂质体的RPMI-1640培养基，每组设5个平行孔，37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，吸弃培养液；每孔加入100μLRPMI-1640培养基和20μLMTT溶液继续培养4h，每孔加入100μL二甲基亚砜，用酶标仪测量吸光度，计算细胞抑制率和IC₅₀值。

表4不同给药组的IC₅₀值

^*P＜0.05，^**P＜0.01，WG-LP vs WG；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，GA-WG-LP vs WG-LP 。

由表4可以表明，脂质体的抑瘤效果明显优于普通溶液，具有显著性差异。修饰脂质体的抑瘤效果则和载体的修饰量有关：当修饰量较低(1∶0.025)或较高(1∶0.20)时，与未修饰脂质体的IC₅₀值比较相差不大，无显著性差异；只有当修饰量在一定范围内(1∶0.05～0.15)时，抑瘤效果明显优于未修饰脂质体，具有显著性差异。所以处方中修饰材料GA的最优修饰量为1∶0.05～0.15。

二、不同比例的甘草次酸修饰汉黄芩素脂质体在荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性比较

取昆明种小鼠80只，按移植性肿瘤研究法接种HepG2实体瘤，接种24h后称重，并随即分为8组，每组10只，即WG、WG-LP、GA-WG-LP(修饰比例分别为1∶0.025、1∶0.05、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20)、生理盐水对照组。尾静脉注射给药，给药剂量为5mg/kg，每两天一次，共给药四次。隔天称重小鼠，于停药后第一天初四各组小鼠，完整剥离肿瘤并称重。按下式计算抑瘤率。

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/空白组平均瘤重)*100％

表5荷瘤小鼠抗肿瘤活性比较

^*P＜0.05，^**P＜0.01，WG-LP vs WG。ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，GA-WG-LP vs WG-LP。

由表5可见，汉黄芩素给药组和空白组之间有显著性差异。脂质体的抑瘤效果明显优于普通溶液，具有显著性差异。当修饰量较低(1∶0.025)或较高(1∶0.20)时，抑瘤效果与未修饰组比较无显著性差异；只有当修饰量在一定范围内(1∶0.05～0.15)时，抑瘤效果明显优于未修饰脂质体，具有显著性差异。所以处方中修饰材料GA的最优修饰量为1∶0.05～0.15。

本发明的优越性表现在：

本项目以甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体，证实了只有当靶向材料在一定的比例范围内时，脂质体具有良好的肝靶向治疗效果。本制剂综合了脂质体被动靶向和甘草次酸受体介导的主动靶向的优势，使其同时具有被动和主动双重靶向性，从而更有效地进行肝癌的靶向治疗。

从临床应用的角度而言，研制高效且安全的药物载体是靶向给药向更高水平发展的关键。本项目设计的甘草次酸修饰汉黄芩素脂质体，在高效递送药物至肝肿瘤细胞的同时，具有十分优越的安全性，脂质体的主要成分为磷脂，具有良好的生物降解性和生物相容性，而承担靶向弹头的甘草次酸，为甘草的主要有效成分，在食品等行业应用广泛，安全性高，因此使本项目设计的甘草次酸修饰汉黄芩素脂质体兼且安全性和高效性，且是一种适合工业化生产的靶向给药系统，有利于临床的应用。

具体实施方式

实施例1

称量4mgHHQS、24mgArg于25ml小烧杯，加入适量蒸馏水超声溶解，电炉加热煮沸，待全部溶解。转移至10ml量筒中加水定容至一定体积，为水相。称量200mg大豆磷脂、20mg胆固醇加入50ml茄形瓶，加入约8ml二氯甲烷超声溶解，为油相。在水浴超声下将水相缓慢滴加至油相中，呈乳状，较均匀，继续超声10min。旋蒸去除二氯甲烷，注意控制真空度，尽量避免起泡。待二氯甲烷基本去除后，瓶内先呈粘稠状、结块、后崩塌又形成液体。加入水合介质。30℃水合2h。探头超声，500w、7-10min，过0.22μm水系一次性滤头，即得汉黄芩素脂质体。

实施例2

称量4mgHHQS、24mgArg于25ml小烧杯，加入适量蒸馏水超声溶解，电炉加热煮沸，待全部溶解。转移至10ml量筒中加水定容至一定体积，为水相。称量200mg大豆磷脂、20mg胆固醇加入50ml茄形瓶，加入约8ml二氯甲烷超声溶解，为油相。称量10mg18-GA-Suc在油相中溶解。在水浴超声下将水相缓慢滴加至油相中，呈乳状，较均匀，继续超声10min。旋蒸去除二氯甲烷，注意控制真空度，尽量避免起泡。待二氯甲烷基本去除后，瓶内先呈粘稠状、结块、后崩塌又形成液体。加入水合介质。30℃水合2h。探头超声，500w、7-10min，过0.22μm水系一次性滤头，即得甘草次酸衍生物1∶0.05(磷脂：18-GA-Suc)修饰的汉黄芩素脂质体。

Claims (5)

1.甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂，其特征是含下列组分及重量比：

2.权利要求1甘草次酸修饰的的汉黄芩素脂质体制剂，其中磷脂与18-GA-Suc的重量比例在1∶0.05～0.15之间时，制剂的肝靶向治疗效果明显。

3.权利要求1甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂，其中18-GA-Suc化合物，其特征是运用化学合成方法将甘草次酸(GA)与硬脂醇酯化，生成甘草次酸十八醇酯(18-GA)，然后18-GA与丁二酸酐经酰化反应，合成两亲性导向分子甘珀酸十八醇酯(18-GA-Suc)。

4.权利要求1甘草次酸修饰的汉黄芩素脂质体制剂，其中磷脂是大豆磷脂。

5.权利要求1的制备方法，包括采用逆向蒸发法，制备步骤如下：

a.将处方量汉黄芩素溶于水中，形成水相，待用；

b.将大豆磷脂、胆固醇、18-GA-Suc溶解于二氯甲烷中，形成油相，步骤a中水相与油相体积比为1∶1～3；

c.在水浴50～100w超声下将水相缓慢滴加至油相中，超声形成水油均匀的分散乳液；

d.将步骤c乳液在30～40℃下于旋转蒸发仪上旋蒸去除二氯甲烷；待有机溶剂完全挥干后，用探头超声仪进行超声分散，即得到脂质体。